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CN108103243A - 一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用 - Google Patents

一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用 Download PDF

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CN108103243A
CN108103243A CN201810007565.0A CN201810007565A CN108103243A CN 108103243 A CN108103243 A CN 108103243A CN 201810007565 A CN201810007565 A CN 201810007565A CN 108103243 A CN108103243 A CN 108103243A
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CN
China
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virus
encephalitis
pig
genetic stability
detection method
Prior art date
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Pending
Application number
CN201810007565.0A
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余美伦
秦香芹
孟庆雪
李影
韩伟丽
孙均
赵丽
何佳
王春东
苑玉凤
王宁
闫增福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanbang Medical Science & Technology Co Ltd Harbin City
Original Assignee
Hanbang Medical Science & Technology Co Ltd Harbin City
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

本发明提供了一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用，属于生物工程领域。本发明通过复苏培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液，并进行连续多代的传代培养，间隔一定的代数取样并检测，通过检测人工保藏的含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌的遗传稳定性，为研究猪乙脑病毒提供可靠的支撑和保障；将上述检测方法应用到猪乙脑病毒培养中，也可以为猪乙脑病毒的研究和培养提供参考和借鉴，具有重要的应用价值。

Description

一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用。
背景技术
流行性乙型脑炎病毒简称乙脑病毒。流行性乙型脑炎的病原体。呈球状，核酸为单链RNA，外层具包膜，包膜表面有血凝素。低温条件下，能自下而上较长时间，在动物、鸡胚及组织培养细胞中均能增殖。幼猪是乙脑病毒的主要传染源和中间宿主，蚊子是乙脑病毒的传播媒介。
家畜和家禽在流行季节感染乙脑病毒，一般为隐性感染，但病毒在其体内可增殖，侵入血流，引起短暂的病毒血症，成为乙脑病毒的暂时贮存宿主，经蚊叮咬反复传播，成为人类的传染源。特别是当年生仔猪最为重要，对乙脑病毒易感，构成猪—蚊—猪的传播环节。目前很少有针对猪乙脑病毒人工保藏的稳定性的研究。
发明内容
本发明的第一目的在于提供猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，通过本检测方法，可以对猪乙脑病毒的遗传稳定性有较为可靠的认识，为猪乙脑病毒的研究提供可靠的支持。
本发明的第二目的在于提供上述猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法在猪乙脑病毒培养中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，包括：
于液体培养基中培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液；
连续传代培养宿主菌菌液；
间隔取样传代培养的宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。
上述猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法在猪乙脑病毒培养中的应用。
本发明的有益效果为：本发明通过复苏培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液，并进行连续多代的传代培养，间隔一定的代数取样并检测，通过检测人工保藏的含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌的遗传稳定性，为研究猪乙脑病毒提供可靠的支撑和保障；将上述检测方法应用到猪乙脑病毒培养中，也可以为猪乙脑病毒的研究和培养提供参考和借鉴，具有重要的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例4提供的第5代大肠杆菌的菌落形态图；
图2为本发明实验例4提供的第15代大肠杆菌的菌落形态图；
图3为本发明实验例4提供的第25代大肠杆菌的菌落形态图；
图4为本发明实验例4提供的第40代大肠杆菌的菌落形态图；
图5为本发明实验例4提供的PCR电泳结果图；
图6为本发明实验例4提供的PCR电泳结果图；
图7为本发明实验例4提供的第5代大肠杆菌生化实验结果图；
图8为本发明实验例4提供的第15代大肠杆菌生化实验结果图；
图9为本发明实验例4提供的第25代大肠杆菌生化实验结果图；
图10为本发明实验例4提供的第40代大肠杆菌生化实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
流行性乙脑病毒临床上表现为高烧、意识障碍、抽搐、颅内压升高以及脑膜刺激症。重症可能死于呼吸循环衰竭，部分患者病后遗留失语、强直性痉挛、精神失常等后遗症。
猪感染猪乙脑病毒后，严重影响其生长发育；对生猪养殖带来巨大的影响，另外，如果染病的生猪被宰杀后贩卖，对消费者也是一种不安全因素，因此对猪乙脑病毒的检测就是必要的；而猪乙脑病毒的遗传稳定性尤其是人工保藏条件的遗传稳定性也是必要的。
下面对本发明实施例的一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用进行具体说明。
一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，包括：
于液体培养基中培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液；
连续传代培养宿主菌菌液；
间隔取样传代培养的宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。
病毒通常需要宿主能生长繁殖，因此将感染了猪乙脑病毒的细胞进行培养和保存，实现间接的保存猪乙脑病毒；含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌在保藏过程中和传代中，有可能造成猪乙脑病毒质粒从宿主细胞中丢失，造成猪乙脑病毒质粒的保藏或传代的失败，因此对已经进行多代传代的含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌进行鉴定，可以了解含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌的遗传稳定性。
猪乙脑病毒质粒是将cccagtacgataccaaacttcagcagtgcagagagagcac
caagggaatgaaatagtggatgtgatgtgccatgccactctgacccacagattgatgtcaccgaacagagtgcccaactataacctatttgtcatggatgaagctcatttcaccgacccagccagtatagccgcacgaggatacatcgctaccaaggtggaattaggagaggcagcagccatctttatgacagcgaccccgcctggaaccacggatccttttcctgactcaaatgccccaatccatgatctacaagatgagataccagacagggcatggagcagtggatacgaatggatcacagaatatgcgggtaaaaccgtgtggtttgtggcgagcgtaaaaatggggaatgaaattgcaatgtgcctccaaagagcgggaaaaaaggtcatccaactcaaccgcaagtcctatgacacagaatacccaaaatg连接到pUC-57为载体上得到。
鉴定引物的上游序列SEQ NO.1为：5’-AGAGAGAGCACCAAGGGAATG-3’；
鉴定引物的下游序列SEQ NO.2为：5’-CTTGCGGTTGAGTTGGATGAC-3’；
检测引物扩增的片段长度为422bp。
进一步地，宿主菌菌液的接种量为液体培养基的体积的1％-10％。
宿主菌与液体培养基保持一个合理的接种比例，可以保证菌液能较快的复苏和进入对数期，可以较大的节约实验的时间，加快实验进程。
进一步地，宿主菌菌液为甘油菌液。
通常甘油菌为低温保藏，由于甘油有防冻的效果，通过添加甘油，可以有效的保护菌株在低温条件不被破坏；而且由于甘油具有保湿的效果，可以较好的保证菌液的水分，保证菌种的活性。
进一步地，甘油菌液的制备包括：
将含猪乙脑病毒的病毒质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过引物检测鉴定，得到阳性的重组大肠杆菌；
培养重组大肠杆菌，并添加甘油制成甘油菌种保藏。
进一步地，大肠杆菌感受态细胞为TOP10细胞、DH5α细胞和BL21(DE3)细胞中的一种。
由于大肠杆菌的生长迅速，将大肠杆菌作为宿主菌，通过简单的复苏培养和传代培养，可以较快获得大量的菌液，即可以获得大量的猪乙脑病毒的病毒质粒。
进一步地，含猪乙脑病毒的病毒质粒与大肠杆菌感受态细胞的体积比为1-4:100。
通过控制病毒质粒与大肠杆菌感受态细胞的比例，可以提高质粒的转化效率。
进一步地，含猪乙脑病毒的病毒质粒的浓度为0.1-10ng/μL。
进一步地，转化的方法为：混合含猪乙脑病毒的病毒质粒和大肠杆菌感受态细胞，冰上放置25-37min；热激60-100s，冰上放置2-3min。
进一步地，检测鉴定通过PCR反应实现，PCR反应的退火温度为52-58℃。
上述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法在猪乙脑病毒培养中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法包括将猪乙脑病毒的病毒质粒转化到宿主菌细胞中，然后将含有猪乙脑病毒的病毒质粒的宿主菌制成甘油菌，通过培养和传代甘油菌，鉴定传代甘油菌的遗传稳定性。
本实施例中选用DH5α的感受态细胞作为大肠杆菌感受态细胞，当然在其他的实施方式中也可以选用其他的大肠杆菌感受态细胞进行试验，如TOP10细胞或BL21(DE3)细胞。
质粒的转化具体步骤如下：
1.1取100μL大肠杆菌DH5α的感受态细胞加入到EP管中，并于冰上融化；
1.2取1μL浓度为0.1ng/μL的猪乙脑病毒的病毒质粒加入到EP管里已经融化的大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，冰上放置25min；
1.3将EP管于42℃的温度条件下热激60s，将EP管快速转移至冰上冷却2min；
1.4在EP管中加入200μL的不含抗生素的液体LB培养基，150rpm培养45min；
1.5取50μL的菌液均匀涂布到LB固体培养基(Amp+)上，37培养16h。
阳性宿主菌的鉴定
从步骤1.5的LB固体培养基(Amp+)上分别挑取10单斑，于LB液体培养基中培养，然后进行菌液PCR鉴定；采用21.5μL的反应体系：10×PCR Buffer2.5μL，dNTPs Mixture(2.5mM)2μL，上下游引物各0.25μL，菌液(模板)2μL，Taq DNA聚合酶1μL，并加入ddH2O13.5μL补足。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
PCR反应完成后，将反应产物用1.5％的琼脂糖(含0.5μg/mL的EB)凝胶电泳，每个电泳孔中加入扩增产物和加样缓冲液混合物6μL(其中PCR扩增产物与6×Loading buffer的体积为5:1)，另外上样DNA Marker 6μL，130V电压电泳40min，然后观察电泳条带。
将具有条带的阳性样本进行扩大培养。
制备甘油菌进行菌种保藏
2.1配制30％的甘油的备用；
2.2取对数生长期的菌液400μL，2000rpm离心收集菌体；
2.3加入200μL的新鲜LB液体培养基，将菌体吹散形成菌悬液；
2.4加入等体积的30％的甘油，混匀即可。
实施例2
本实施例提供一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法包括将猪乙脑病毒的病毒质粒转化到宿主菌细胞中，然后将含有猪乙脑病毒的病毒质粒的宿主菌制成甘油菌，通过培养和传代甘油菌，鉴定传代甘油菌的遗传稳定性。
本实施例中选用TOP10的感受态细胞作为大肠杆菌感受态细胞，当然在其他的实施方式中也可以选用其他的大肠杆菌感受态细胞进行试验，如DH5α细胞或BL21(DE3)细胞。
质粒的转化具体步骤如下：
1.1取100μL大肠杆菌TOP10的感受态细胞加入到EP管中，并于冰上融化；
1.2取4μL浓度为10ng/μL的猪乙脑病毒的病毒质粒加入到EP管里已经融化的大肠杆菌TOP10的感受态细胞中，冰上放置37min；
1.3将EP管于42℃的温度条件下热激100s，将EP管快速转移至冰上冷却3min；
1.4在EP管中加入200μL的不含抗生素的液体LB培养基，150rpm培养45min；
1.5取50μL的菌液均匀涂布到LB固体培养基(Amp+)上，37培养16h。
阳性宿主菌的鉴定
从步骤1.5的LB固体培养基(Amp+)上分别挑取10单斑，于LB液体培养基中培养，然后进行菌液PCR鉴定；采用21.5μL的反应体系：10×PCR Buffer2.5μL，dNTPs Mixture(2.5mM)2μL，上下游引物各0.25μL，菌液(模板)2μL，Taq DNA聚合酶1μL，并加入ddH2O13.5μL补足。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
PCR反应完成后，将反应产物用1.5％的琼脂糖(含0.5μg/mL的EB)凝胶电泳，每个电泳孔中加入扩增产物和加样缓冲液混合物6μL(其中PCR扩增产物与6×Loading buffer的体积为5:1)，另外上样DNA Marker 6μL，130V电压电泳40min，然后观察电泳条带。
将具有条带的阳性样本进行扩大培养。
制备甘油菌进行菌种保藏
2.1配制30％的甘油的备用；
2.2取对数生长期的菌液400μL，2000rpm离心收集菌体；
2.3加入200μL的新鲜LB液体培养基，将菌体吹散形成菌悬液；
2.4加入等体积的30％的甘油，混匀即可。
实施例3
本实施例提供一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法包括将猪乙脑病毒的病毒质粒转化到宿主菌细胞中，然后将含有猪乙脑病毒的病毒质粒的宿主菌制成甘油菌，通过培养和传代甘油菌，鉴定传代甘油菌的遗传稳定性。
本实施例中选用TOP10的感受态细胞作为大肠杆菌感受态细胞，当然在其他的实施方式中也可以选用其他的大肠杆菌感受态细胞进行试验，如DH5α细胞或BL21(DE3)细胞。
质粒的转化具体步骤如下：
1.1取100μL大肠杆菌TOP10的感受态细胞加入到EP管中，并于冰上融化；
1.2取2μL浓度为2ng/μL的猪乙脑病毒的病毒质粒加入到EP管里已经融化的大肠杆菌TOP10的感受态细胞中，冰上放置31min；
1.3将EP管于42℃的温度条件下热激75s，将EP管快速转移至冰上冷却3min；
1.4在EP管中加入200μL的不含抗生素的液体LB培养基，150rpm培养45min；
1.5取50μL的菌液均匀涂布到LB固体培养基(Amp+)上，37培养16h。
阳性宿主菌的鉴定
从步骤1.5的LB固体培养基(Amp+)上分别挑取10单斑，于LB液体培养基中培养，然后进行菌液PCR鉴定；采用21.5μL的反应体系：10×PCR Buffer2.5μL，dNTPs Mixture(2.5mM)2μL，上下游引物各0.25μL，菌液(模板)2μL，Taq DNA聚合酶1μL，并加入ddH2O13.5μL补足。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
PCR反应完成后，将反应产物用1.5％的琼脂糖(含0.5μg/mL的EB)凝胶电泳，每个电泳孔中加入扩增产物和加样缓冲液混合物6μL(其中PCR扩增产物与6×Loading buffer的体积为5:1)，另外上样DNA Marker 6μL，130V电压电泳40min，然后观察电泳条带。
将具有条带的阳性样本进行扩大培养。
制备甘油菌进行菌种保藏
2.1配制30％的甘油的备用；
2.2取对数生长期的菌液400μL，2000rpm离心收集菌体；
2.3加入200μL的新鲜LB液体培养基，将菌体吹散形成菌悬液；
2.4加入等体积的30％的甘油，混匀即可。
实施例4
本实施例提供一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，本实施例中取用实施例3中制备得到的含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的甘油菌作为菌种进行试验，具体步骤如下：
1.1在试管中加入3mL的LB液体培养基(含有100mg/L的氨苄青霉素)；
1.2按照1％的接种量将甘油菌菌种接种到试管中；
1.3于37℃的条件下120rpm振荡培养；
1.4进行连续传代培养，分别取第5代、第15代、第25代和第40代的样品进行试验。
连续传代的含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的遗传稳定性检测，包括菌落形态比较、革兰氏染色和PCR鉴定以及生化检测。
菌落形态比较
配制适量曙红亚甲蓝培养基，121℃高温高压灭菌15min，在无菌环境下制备平板，分别取5、15、25、40代菌液进行划线培养，37℃培养24h，观察菌落形态。
结果如图1到图4所示，从菌落形态观察，第5代、第15代、第25代和第40代的含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌样品的菌落形态一致，没有明显的差别，说明含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌依然保有活力。
革兰氏染色
通过革兰氏染色第5代、第15代、第25代和第40代含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌样品。
通过染色结果可知，本方法培养的5、15、25、40代基因工程菌染色后均为红色杆状或短棒状结构。
PCR分子鉴定
取第5代、第15代、第25代和第40代含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌样品分别进行PCR反应，PCR反应体系和反应程序参照实施例3的PCR反应体系和反应程序。
PCR反应结果如图5和图6所示，条带大小422bp，符合预期目的片段的大小，图中M表示DNA Marker，1为检测样本，2为阴性对照；图5中左图为传代5代的大肠杆菌的PCR产物电泳结果，右图为传代15代的大肠杆菌的PCR产物电泳结果；图6中左图为传代25代的大肠杆菌的PCR产物电泳结果，右图为传代40代的大肠杆菌的PCR产物电泳结果；传代5代、15代、25代和40代的大肠杆菌依然能检测到猪乙脑病毒质粒，说明含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌在传代5代、15代、25代和40代均能保持其遗传稳定性。
大肠杆菌的生化反应实验
将含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌在传代5代、15代、25代和40代后取样，进行靛基质实验、MR(甲基红)实验、VP实验和柠檬酸盐实验进行鉴定。
含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的第五代生化实验结果如图7所示，其中图左上方两张图为靛基质实验前后的对比图，右上方两张图为VP实验前后对比图；其中图左下方两张图为MR实验前后的对比图，右下方两张图为柠檬酸盐实验前后对比图；表明含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌在传代5代能保持其遗传稳定性。
含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的第十五代生化实验结果如图8所示，其中图左上方两张图为靛基质实验前后的对比图，右上方两张图为VP实验前后对比图；其中图左下方两张图为MR实验前后的对比图，右下方两张图为柠檬酸盐实验前后对比图；表明含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌在传代15代能保持其遗传稳定性。
含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的第二十五代生化实验结果如图9所示，其中图左上方两张图为靛基质实验前后的对比图，右上方两张图为VP实验前后对比图；其中图左下方两张图为MR实验前后的对比图，右下方两张图为柠檬酸盐实验前后对比图；表明含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌在传代25代能保持其遗传稳定性。
含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的第四十代生化实验结果如图10所示，其中图左上方两张图为靛基质实验前后的对比图，右上方两张图为VP实验前后对比图；其中图左下方两张图为MR实验前后的对比图，右下方两张图为柠檬酸盐实验前后对比图；表明含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌在传代40代能保持其遗传稳定性。
实施例5
本实施例提供一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，本实施例中取用实施例3中制备得到的含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的甘油菌作为菌种进行试验，具体步骤如下：
1.1在试管中加入3mL的LB液体培养基(含有100mg/L的氨苄青霉素)；
1.2按照10％的接种量将甘油菌菌种接种到试管中；
1.3于37℃的条件下120rpm振荡培养；
1.4进行连续传代培养，分别取第5代、第15代、第25代和第40代的样品进行试验。
连续传代的含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的遗传稳定性检测，包括菌落形态比较、革兰氏染色和PCR鉴定以及生化检测。
综上所述，本发明实施例通过将猪乙脑病毒转化到大肠杆菌，然后制成甘油菌，通过培养甘油菌并连续传代，测定不同代的含有猪乙脑病毒质粒的大肠杆菌的遗传稳定性，为猪乙脑病毒的研究提供可靠的保证。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司
<120> 一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法及应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagagagca ccaagggaat g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttgcggttg agttggatga c 21
<210> 3
<211> 477
<212> DNA
<213> Japanese encephalitis virus
<400> 3
cccagtacga taccaaactt cagcagtgca gagagagcac caagggaatg aaatagtgga 60
tgtgatgtgc catgccactc tgacccacag attgatgtca ccgaacagag tgcccaacta 120
taacctattt gtcatggatg aagctcattt caccgaccca gccagtatag ccgcacgagg 180
atacatcgct accaaggtgg aattaggaga ggcagcagcc atctttatga cagcgacccc 240
gcctggaacc acggatcctt ttcctgactc aaatgcccca atccatgatc tacaagatga 300
gataccagac agggcatgga gcagtggata cgaatggatc acagaatatg cgggtaaaac 360
cgtgtggttt gtggcgagcg taaaaatggg gaatgaaatt gcaatgtgcc tccaaagagc 420
gggaaaaaag gtcatccaac tcaaccgcaa gtcctatgac acagaatacc caaaatg 477

Claims (10)

1.一种猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，包括：
于液体培养基中培养含有猪乙脑病毒质粒的宿主菌菌液；
连续传代培养所述宿主菌菌液；
间隔取样所述传代培养的所述宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。
2.根据权利要求1所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述宿主菌菌液的接种量为所述液体培养基的体积的1％-10％。
3.根据权利要求1所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述宿主菌菌液为甘油菌液。
4.根据权利要求3所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述甘油菌液的制备包括：
将含猪乙脑病毒的病毒质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过鉴定引物检测鉴定，得到阳性的重组大肠杆菌；
培养所述重组大肠杆菌，并添加甘油制成甘油菌种保藏。
5.根据权利要求4所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为TOP10细胞、DH5α细胞和BL21(DE3)细胞中的一种。
6.根据权利要求4所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述含猪乙脑病毒的病毒质粒与所述大肠杆菌感受态细胞的体积比为1-4:100。
7.根据权利要求6所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述含猪乙脑病毒的病毒质粒的浓度为0.1-10ng/μL。
8.根据权利要求4所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述转化的方法为：混合所述含猪乙脑病毒的病毒质粒和所述大肠杆菌感受态细胞，冰上放置25-37min；热激60-100s，冰上放置2-3min。
9.根据权利要求4所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法，其特征在于，所述检测鉴定通过PCR反应实现，所述PCR反应的退火温度为52-58℃。
10.如权利要求1-9任一项所述的猪乙脑病毒遗传稳定性的检测方法在猪乙脑病毒培养中的应用。
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