KR100820482B1

KR100820482B1 - 탈수제 및 그것을 이용하는 함수물의 탈수 방법 및 그방법으로 얻어지는 탈수 물품

Info

Publication number: KR100820482B1
Application number: KR1020037009182A
Authority: KR
Inventors: 구보타미치오; 니시모토도모유키; 아가하지메; 후쿠다시게하루; 미야케도시오
Original assignee: 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2008-04-08
Also published as: JP4147109B2; AU2002228330B2; JPWO2002057011A1; KR20030071803A; WO2002057011A1; US20060008791A1; TWI265790B; DE60215310T2; CA2434284A1; US7186701B2; ATE342125T1; DE60215310D1; EP1360988A4; EP1360988A1; EP1360988B1; CN1209188C; CN1487854A

Abstract

비환원성 당질의 무수물을 탈수제로 해서, 품질의 열화를 일으킬 우려가 없고, 함수물을 탈수하는 것을 과제로 하며, 환상 4당을 유효성분으로 하는 탈수제 및 함수물에 환상 4당을 함유, 접촉 또는 공존시키는 것을 특징으로 하는 함수물의 탈수 방법, 및 그 방법으로 얻어지는 탈수 물품을 제공한다.

Description

탈수제 및 그것을 이용하는 함수물의 탈수 방법 및 그 방법으로 얻어지는 탈수 물품{DEHYDRATING AGENT AND METHOD FOR DEHYDRATING MOIST ARTICLE USING THE AGENT AND DEHYDRATED ARTICLE OBTAINED BY THE METHOD}

본 발명은 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 당질(이 당질을, 그 구조로 인해서 본 명세서에서는 이하, 「환상 4당」이라고 칭한다.)을 유효성분으로 하는 탈수제 및 그것을 이용하는 함수물의 탈수 방법 및 그 방법으로 얻어지는 탈수 물품에 관한 것이다.

당질을 이용하는 탈수 방법은 먼저, 본 발명자들이 일본국의 특개소62-136240호 공보, 특개소62-152536호 공보, 특개소62-152537호 공보, 특개평6-170221호 공보 등에서 개시한 바와 같이, 무수 당질이 수분을 포착해서 함수 결정으로 변환되는 도중에 탈수력을 발휘시키는 방법이다. 이 방법은 가열 건조 등과는 달리 가혹한 조건을 필요로 하지 않으므로 함수물을 변질, 열화시키는 일이 없이 탈수 물품으로 변환하는 특징을 가지고 있다.

그러나, 이들 방법 중에서 일본국 특개소62-152536호 공보에 개시한 무수 글루코오스, 무수 갈락토오스 등의 무수 알도헥소오스를 이용할 경우에는 탈수량이 비교적 크지만, 환원성 당질이기 때문에 반응성이 풍부하여 아미노산, 펩티드 등과 갈변반응을 일으키기 쉬워 탈수 물품의 보존 안정성이 불안하다는 것이 판명되었다. 또한, 무수 알도헥소오스는 비교적 고습도에 있어서도 함수 결정으로 변환하지 않아 탈수력이 부족한 것이 판명되었다. 그리고 일본국 특개소62-136240호 공보에 개시한 무수 말토오스를 이용할 경우나, 일본국 특개소62-152537호 공보에 개시한 무수 파라티노오스를 이용할 경우에는 그 환원력이 약하기는 하지만 기본적으로는 환원성 당질이어서, 탈수 물품의 장기 안정성에 여전히 불안이 남는 것이 판명되었다. 더욱이 포착할 수 있는 수분량이 어느 쪽의 경우도 당질의 약 5w/w%로서 비교적 적으므로, 탈수제로서 다량의 무수 말토오스 혹은 무수 파라티노오스를 필요로 하는 결점이 있는 것도 밝혀졌다.

한편, 일본국 특개소62-152537호 공보에 개시한 무수 라피노오스, 무수 에를로오스, 무수 멜레티토오스 등의 비환원성 무수 글리코실프룩토시드는 환원력을 가지지 않으므로 아미노산, 펩티드 등과의 갈변 반응도 없고, 장기보존 안정성이 우수하다고 생각된다. 그러나 그 분자 내에 내산성이 적은 프룩토시드 결합을 가지고 있으므로, 산성 함수물의 탈수제로서는 반드시 적합하지 않은 것이 상정되고, 얻어지는 탈수 물품의 안정성에도 불안이 남는다. 또한, 일본국 특개평6-170221호 공보에 개시한 무수 α, α-트레할로오스는 환원력을 가지지 않으므로 장기 보존 안정성이 우수하고, 더욱이 포착할 수 있는 수분량은 당질의 약 10w/w%로서 비교적 많으므로 탈수제로서 상기한 당질보다도 적합하다고 할 수 있다. 그러나, 여전히 다량의 무수 α, α-트레할로오스를 필요로 하고 있기 때문에, 탈수 및/또는 건조 효율이 더욱 높은 탈수제가 요구되고 있다.

본 발명자들은 당질을 이용하는 탈수 방법에 있어서의 결점을 해소하는 것을 목적으로 하여 천연형의 비환원성 당질의 무수물을 검색하고, 더욱이 우수한 탈수제의 확립과 그 이용에 대해서 예의 검토를 계속해 왔다.

한편, 본 발명자들은 먼저 실험실 레벨에서의 제조 방법이 알려져 있었던 환상 4당을 공업 레벨에서 전분질을 원료로 하여 비교적 염가로 대량 생산하는 방법을 확립하였다. 아울러, 환상 4당에는 적어도 함수형태로서의 5 내지 6함수 결정과 1함수 결정, 및 무수 형태로서의 무수 결정 및 무수 비정질의 형태가 존재하는 것을 밝히고, 그 후의 연구에 의해, 무수 결정, 1함수 결정 및 무수 비정질의 환상 4당은 수분을 흡수하여 함수형태인 5 내지 6함수 결정으로 용이하게 변환할 수 있는 것을 발견하였다.

이 특징을 탈수제에 이용하기 위해 더욱 연구를 거듭한 결과, 상기한 무수 결정, 1함수 결정 및 무수 비정질로부터 선택되는 환상 4당은 우수한 탈수 능력을 가지고 있고, 더욱이, 얻어지는 탈수 물품이 극히 안정하기 때문에 광범위하게 적용할 수 있어, 종래 알려져 있었던 당질보다도 탈수제로서 적합한 것을 발견하였다. 즉, 탈수 능력을 가진 환상 4당, 즉 무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당으로부터 선택되는 당질을 함수 식품, 함수 의약품 등의 함수물에 함유, 접촉 또는 공존시켜서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시킴으로써, 환상 4당의 결정수로서 다량의 수분을 포착하고, 또한 극히 강력한 탈수제로 서 작용하는 것, 및 안정성이 우수하므로 산성 함수물을 포함해서 광범위한 함수물에 적용할 수 있는 것을 발견하고, 풍미 양호한 고품질의 탈수 식품이나, 고활성이고 안정한 탈수 의약품 등의 탈수 물품을 용이하게 제조할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 종래에 탈수제로서 전혀 주목받지 않았던 환상 4당을 선택한 것이며, 특히 탈수 능력을 가진 환상 4당을 탈수제로서 함유, 접촉 또는 공존시켜 함수물을 탈수하는 방법은 본 발명을 효시(嚆矢)로 한다.

도 1은 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 당질을 고속액체 크로마토그래피로 처리했을 때의 용출 패턴을 나타내는 도면이다.

도 2는 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 환상 4당의 핵자기 공명 스펙트럼(¹H-NMR 스펙트럼)을 나타내는 도면이다.

도 3은 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 환상 4당의 핵자기 공명 스펙트럼(¹³C-NMR 스펙트럼)을 나타내는 도면이다.

도 4는 환상 4당의 구조가 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}인 것을 나타내는 도면이다.

도 5는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.

도 6은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.

도 7은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.

도 8은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.

도 9는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.

도 10은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.

도 11은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.

도 12는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.

도 13은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.

도 14는 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.

도 15는 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.

도 16은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.

도 17은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.

도 18은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.

도 19는 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.

도 20은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.

도 21은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토트리오스의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 22는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토테트라오스의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 23은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토트리오스의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 24는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토테트라오스의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 25는 5 내지 6함수 결정 환상 4당의 현미경 사진을 디스플레이 위에 표시한 중간조 화상이다.

도 26은 5 내지 6함수 결정 환상 4당상 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 27은 5 내지 6함수 결정 환상 4당상 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면이다.

도 28은 본 발명의 1함수 결정 환상 4당 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 29는 본 발명의 1함수 결정 환상 4당 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면이다.

도 30은 5 내지 6함수 결정 환상 4당 분말을 40℃에서 진공 건조해서 얻어지는 무수 결정 환상 4당 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 31은 5 내지 6함수 결정 환상 4당 분말을 120℃에서 진공 건조해서 얻어지는 무수 결정 환상 4당 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

도 32는 본 발명의 무수 결정 환상 4당 분말을 열중량 측정했을 때의 열중량 곡선을 나타내는 도면이다.

도 33은 환상 4당 수용액을 동결건조 및 진공 건조해서 얻어지는 무수 비정질 환상 4당 분말을 분말 X선 회절법으로 해석했을 때의 회절 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

본 발명에 있어서의 함수물의 탈수 방법은 수분을 함유하고 있는 것, 특히, 결정수와 같은 결합 수분과는 다른 유리 수분을 함유하고 있기는 하지만 탈수 방법으로서 바람직하고, 예를 들면, 본 발명의 탈수제를 건조 식품 등을 봉입한 방습용기 내에 공존시킴으로써, 분위기에 함유되는 수분을 저감하는 경우, 더욱이는, 예를 들면, 식품, 의약품, 화장품, 공업 화학품, 이들의 원재료 또는 가공 중간물 등의 각종 함수물에 함유시키거나 접촉시킴으로써, 함수물의 유리 수분을 저감시키는 경우 등에 유리하게 적용할 수 있다.

이들 함수물에 탈수 능력을 가진 환상 4당을 함유, 접촉 또는 공존시키면, 탈수 능력을 가진 환상 4당은 그 중량의 약 11 내지 15w/w%（이하, 본 명세서에서는 별달리 명시하지 않는 한, 「w/w％」을 단순히 「％」로 약기한다.)의 수분을 5 내지 6함수 결정 환상 4당의 결정수로 하여 함수물로부터 강력하게 흡수하여(이 값은 무수 말토오스의 경우의 2.2 내지 3배량, 혹은 무수 α, α-트레할로오스의 경우의 1.1 내지 1.5배량에 상당함.), 함수물의 수분을 실질적으로 저감하여 탈수 및/또는 건조할 수 있다.

예를 들면, 맛 김, 쿠키 등의 건조 식품을 봉입한 방습용기 안에 종이 등의 투습 봉지에 충전한 탈수 능력을 가진 환상 4당을 공존시켜 둠으로써 용기 내의 상대습도를 극도로 저감시켜, 건조 식품, 분말상물 등을 고품질로 안정하게 장기간 유지할 수 있는 것이 판명되었다. 이 경우, 탈수 능력을 가진 환상 4당은 수분을 포착해서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환되는 도중 및 변환된 후에도 끈적거리거나, 흐르거나 하는 일이 없고, 건조 식품이나 방습용기를 오염시킬 우려도 없다.

더욱이, 예를 들면, 브랜디, 식초, 로얄 젤리, 생크림, 마요네즈 등의 액상, 페이스트상 등의 고수분 식품의 경우에는 탈수 능력을 가진 환상 4당을 함유시켜서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시킴으로써, 실질적으로 수분이 저감된 고품질의 탈수 식품, 예를 들면, 매스키트상, 분말상 등의 식품을 극히 용이하게 제조할 수 있다.

이 경우, 탈수 능력을 가진 환상 4당이 식품 원재료 등에 함유되는 수분을 충분히 탈수할 수 있는 양 이상 더해지면, 탈수 능력을 가진 환상 4당의 일부가 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환된다. 이 결과, 본 발명에 의해 얻어진 탈수 식품은 유리 수분이 감소해 있으므로, 미생물 오염, 가수분해, 산패, 갈변 등에 의한 변질, 열화를 방지하여 양호한 풍미를 가진 고품질의 상품을 장기간에 걸쳐 안정하게 유지할 수 있다.

본 발명의 탈수 방법은 환상 4당이 비환원성 당질로서 안정하고, 또한, 가열 건조 등의 가혹한 조건을 필요로 하지 않으므로, 액상 또는 페이스트상의 고수분 식품을 변질, 열화시키지 않아 풍미양호하고, 수분이 저감된 탈수 식품으로 용이하게 변환할 수 있는 특징을 가지고 있다. 또한, 환상 4당 자체는 수크로오스의 약 20％의 감미도를 가진 무독, 무해한 감미료이어서 아무런 위험성은 없다.

그리고 림포카인, 항생 물질 등의 수용액, 약용 인삼 엑기스, 자라 엑기스 등의 페이스트상 의약품의 경우에도, 이들에 탈수 능력을 가진 환상 4당을 함유시켜서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시킴으로써, 실질적으로 수분이 저감된 고품질의 탈수 의약품, 예를 들면, 매스키트상, 분말상 등의 의약품을 극히 용이하게 제조할 수 있다. 이 방법은 가열 건조 등의 가혹한 조건을 필요로 하지 않고, 또한 탈수 능력을 가진 환상 4당이 탈수제로서 뿐만 아니라 의약품의 유효성분의 안정제로서도 작용하므로, 고품질의 안정한 탈수 의약품을 제조할 수 있다.

예를 들면, 바이알 병에 충분한 양의 탈수 능력을 가진 환상 4당을 채우고, 여기에, 예를 들면, 림포카인, 호르몬 등의 생리활성 물질을 함유하는 수용액을 첨가하여 마개로 밀봉해서 고형 제제 등을 제조하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 이 경우에는 탈수 능력을 가진 환상 4당이, 생리활성 물질을 함유하는 수용액을 탈수하는 것은 물론, 바이알 병 속의 분위기를 방습건조할 수 있다. 이렇게 하여 얻어지는 탈수 고형 의약품은 그 제조 공정이 용이할 뿐만 아니라, 그 고품질을 장기간에 걸쳐 안정하게 유지할 수 있는 외에, 사용시에 물에 신속하게 용해하는 등의 특징을 가지고 있다.

그리고 충분한 양의 탈수 능력을 가진 환상 4당을 교반하면서, 여기에 생리활성 물질을 함유하는 수용액의 소정량을 혼합하고, 얻어지는 분말을 그대로 용기에 봉입하여 고품질의 안정한 고체 제제로 하는 것도, 또한, 이 분말을, 통상적인 방법에 따라서 과립, 정제 등으로 성형해서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

본 발명의 탈수 능력을 가진 환상 4당을 이용하는 탈수제는 종래 알려져 있 는 실리카 겔, 산화 칼슘 등의 탈수제와는 달리 가식성(可食性)이고, 경구섭취되어 난(難)소화성이어서 무칼로리 내지 저칼로리의 당질 탈수제일 뿐만 아니라, 각종 생리활성 물질 등의 안정제로서도 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 환상 4당 및 탈수 능력을 가진 환상 4당은 그 유래, 제법에 대해서는 묻지 않는다. 또한, 탈수 능력을 가진 환상 4당으로서는, 다음에 설명하는 바와 같이, 환상 4당의 무수물인 무수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당이 수분을 흡수하여 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환되므로 바람직하다. 마찬가지로 1함수 결정 환상 4당도 또한 수분을 흡수하여 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환되어, 함수물의 탈수 작용을 발휘한다. 따라서 본 발명에서 사용하는 탈수 능력을 가진 환상 4당은 그 완전한 무수물에 한하지 않고, 예를 들면, 함수 결정물이더라도 탈수 능력을 가진 것이면 유리하게 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 탈수 능력을 가진 환상 4당을 정의하기 위해서는 거기에 함유되는 수분량으로 판단할 수 있고, 그 수분량은 카알·피셔법 등의 공지기술에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 탈수제의 유효성분인 환상 4당에 함유되는 수분량은 당연히 적을수록 좋고, 바람직하게는 4％ 미만, 더욱 바람직하게는 3％ 미만이다. 4 ％ 이상 10％ 미만의 수분을 함유하고 있을 경우는 탈수 능력을 가지고 있기는 하지만 탈수제로서의 기능 및 효율이 저하한다.

본 발명자들은 본 발명에 앞서 탈수 능력을 가진 환상 4당, 특히, 무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당, 및 무수 비정질 환상 4당의 제조 방법에 대해서 연구하였다.

우선, 환상 4당의 제조 방법으로서는 예를 들면, 『Europian Journal of Biochemistry』, 제226권, 641 내지 648(1994년)에 개시된 알테르난(alternan)에 가수분해 효소 알테르나나아제(alternanase)를 작용시키는 제조 방법 이외에, 본 발명자들이, 앞서 일본국 특원2000-229557호 명세서 및 일본국 특원2000-234937호 명세서에 개시한, 전분을 이용해서 제조한 파노오스를 α-이소말토실 전이효소에 의해 환상 4당으로 변환해서 제조하는 방법, 및 전분을 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소를 조합해서 환상 4당을 제조하는 방법 등의 전분질을 원료로 한 효소법에 의한 제조 방법이 있다. 또한, 이들 선출원(先出願) 명세서에 기재한 바와 같이, 본 발명자들은 환상 4당의 제조 방법으로서, 알테르난보다도 풍부하고 저렴한 전분질을 원료로 한 효소법에 의한 방법이, 고효율이며, 또한 염가로 제조할 수 있으므로, 공업적으로 유리하게 실시할 수 있음을 밝히고, 더욱이 환상 4당의 형태로서 5 내지 6함수 결정, 무수 결정, 1함수 결정, 무수 비정질 등이 존재하는 것도 처음으로 밝혔다.

그리고 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소를 생산하는 미생물로서, 일본국 평성 12년 4월 25일자로, 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목(東1丁目) 1번지 1 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 수탁 번호 FERM BP-7143으로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비스포루스 C9주, 및 일본국 평성 12년 4월 25일자로, 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목(東1丁目) 1번지 1 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 수탁 번호 FERM BP-7144로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비 스포루스 C11주를 들 수 있다.

이어서, 본 발명자들은 무수 결정 환상 4당 분말의 제조 방법에 대해서 검토하며, 그 방법을 확립하였다. 즉, 그 방법은, 예를 들면, 앞서 설명한 방법으로 전분질로부터 효소법에 의해 얻은 환상 4당 수용액을, 수분 약 15％ 미만, 바람직하게는 2.0％ 이상 12％ 미만의 고농도 시럽으로 하고, 이 시럽을 무수 결정 환상 4당의 종자결정(seed crystal: 種子結晶)이 공존하는 상태에서 50 내지 180℃의 온도범위로 유지하면서 무수 결정 환상 4당을 결정석출시켜 분말화해서 제조한다.

그리고 1함수 결정 환상 4당 분말을 제조하기 위해서는, 예를 들면, 5 내지 6함수 결정 환상 4당 분말을 다시 약 100 내지 180℃의 온도에서 적당히 건조해서 제조한다.

더욱이 무수 비정질 환상 4당 분말을 제조하기 위해서는, 예를 들면, 앞서 설명한 방법으로 얻은 환상 4당 수용액을, 예를 들면, 동결 건조 및 약 100 내지 180℃의 온도에서 상압 건조 또는 진공 건조한 후, 분쇄해서 제조한다. 또한, 이 환상 4당 수용액을 농도 약 40 내지 85％의 시럽으로 하고, 동결 건조 및 진공 건조한 후, 분쇄해서 제조하거나, 또는 고압 노즐법 또는 회전 원반법 등의 분무 건조법에 의해 분말을 직접 제조할 수도 있다.

분말화의 방법으로서는 상기한 분무 건조법 이외에도, 예를 들면, 블록 분쇄 방법, 압출 조립(造粒)방법, 유동 조립 방법 등의 공지의 방법을 적당히 채용하면 좋다.

이렇게 하여 제조되는 본 발명의 탈수 능력을 가진 환상 4당 분말은 상품의 낮은 감미를 가진 비환원성의 유동성을 가지는 백색분말이며, 그 수분함량은 낮아 실질적으로 무수이고, 카알·피셔법에 의해, 통상, 4％ 미만, 바람직하게는 3％ 미만이다. 또한 그 형태는 무수 결정 분말, 1함수 결정 분말 또는 무수 비정질 분말로 하는 것도 가능하다.

본 발명의 탈수 능력을 가진 환상 4당 분말은 용도에 따라서 입경을 사이즈 구분을 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 의약품과 같은 소량의 분봉(分封) 혹은 정제 등을 제조할 경우에는 입경이 작을수록 유효성분이 균일하게 분산되므로 바람직하다. 본 발명의 탈수제 분말의 입경은 메쉬 등을 사용한 통상적으로 실시되고 있는 분급(分級) 수단에 의해 적당히 선택할 수 있는데, 통상, 20㎛ 내지 500㎛, 바람직하게는 50㎛ 내지 200㎛도 유리하게 조제할 수 있다.

더욱이 본 발명에서 말하는 탈수 능력을 가진 환상 4당 분말은 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환되어 강력한 탈수 작용을 발휘하는 실질적인 무수물이면 좋은데, 예를 들면, 탈수 능력을 가진 환상 4당의 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로의 변환을 촉진해서 탈수제로서의 효과를 높이기 위해서, 종자결정으로 해서 될 수 있는 한, 소량, 보통 5％ 미만, 바람직하게는 1％ 미만의 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 탈수제에 혼합시킨 분말을 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

이렇게 하여 얻어지는 탈수 능력을 가진 환상 4당 분말은 이것을, 예를 들면, 식품, 의약품, 화장품, 공업 화학품 등의 함수물에 함유시키면, 거기에 함유되는 유리 수분을 5 내지 6함수 결정 환상 4당의 결정수로서 포착하여, 고정해서 함수물에 대하여 강력한 탈수제로서 작용한다.

본 발명의 탈수제가 유리하게 적용할 수 있는 경우로서, 방습 용기 속에 공존시켜서, 방습 용기 속의 분위기를 제습, 건조할 경우, 또는 가열 건조, 진공 건조 등의 공정에서 변질, 열화를 수반하기 쉬운 함수물 또는 건조 곤란한 함수물에 함유 혹은 접촉시킴으로써, 고품질의 매스키트상, 분말상, 고체상 등의 탈수 물품을 제조하는 경우 등이 있다.

본 발명의 탈수제를 제습, 건조할 경우에 적용하는 경우로서는 예를 들면, 맛 김, 쿠키 등의 흡습 방지에 이용할 수 있다. 더욱이는, 흡습해서 고결(固結)하기 쉬운 분말상물, 예를 들면, 쌀가루, 밀가루, 콩가루 등의 곡물 가루, 미숫가루, 볶은 콩가루, 참깨가루 등의 가공 곡물 가루, 푸딩 믹스 분말, 핫케이크 믹스 분말 등의 프리 믹스 분말, 식염, 설탕 등의 미세결정 조미료, 분말간장, 분말된장, 초밥용 분말초, 우려낸 국물 믹스의 분말, 분말 복합 조미료 등의 분말 조미료, 분말 파프리카, 분말 마늘, 분말 시나몬, 분말 너트메그, 분말 페퍼, 분말 세이지 등의 분말 향신료, 분말 효모 엑기스, 분말 밀크, 분말 요구르트, 분말 치즈, 분말 쥬스, 분말 허브, 분말 비타민, 과립 수프, 과립 부이욘, 어분, 혈분, 뼛가루, 분말 유산균제, 분말 효소제, 과립 소화제 등의 분말상 물품에 탈수 능력을 가진 환상 4당을 배합해서 포장 봉입함으로써, 포장 용기 내의 상대습도를 저감시켜 분말상 물품의 부착, 고결을 방지할 수 있으므로, 제조 직후의 유동성이 양호한 고품질을 장기간 유지하는 등의 목적으로도 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 탈수제를 함수물을 탈수할 경우에 적용시키는 경우로서는 예를 들면, 동물, 식물, 미생물 유래의 기관, 조직, 세포, 마쇄물, 추출물, 성분, 또는 이들로부터의 조제물 등, 각종 함수물을 탈수할 경우에 유리하게 이용할 수 있다.

예를 들면, 식품, 그 원재료 또는 가공 중간물의 경우에는 생과(生果), 쥬스, 야채 엑기스, 두유, 참깨 페이스트, 넛츠 페이스트, 생 팥소, 호화(糊化) 전분 페이스트, 밀가루 등의 농산품, 성게 페이스트, 굴 엑기스, 정어리 페이스트 등의 수산품, 날달걀, 레시틴, 우유, 유청, 생크림, 요구르트, 버터, 치즈 등의 축산품, 메이플 시럽, 벌꿀, 된장, 간장, 마요네즈, 드레싱, 가다랭이 엑기스, 미트 엑기스, 다시마 엑기스, 치킨 엑기스, 비프 엑기스, 효모 엑기스, 버섯 엑기스, 감초 엑기스, 스테비아 엑기스, 이들의 효소 처리물, 절인 야채용 조미액 등의 함수 조미료, 일본 술, 와인, 브랜디, 위스키, 약용술 등의 주류, 녹차, 홍차, 커피 등의 기호 음료, 박하, 고추냉이, 마늘, 겨자, 산초, 시나몬, 세이지, 로렐, 페퍼, 감귤류 등으로부터 추출되는 함수 향신료, 서양 꼭두서니, 베니노키, 우콘, 파프리카, 레드 비트, 잇꽃, 치자나무, 사프란, 홍국균 등으로부터 추출되는 함수 착색료, 수크로오스 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르 및 소르비탄 지방산 에스테르 등으로 조제되는 함수 유화제, 훈액(燻液), 발효액 등의 보존료 등의 액상 내지 페이스트상물로부터 안정하고 풍미 양호한 탈수 식품을 용이하게 제조할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 탈수 식품, 예를 들면, 분말 농수축산품, 분말 유지, 분말 향료, 분말 착색료, 분말 유화제, 분말 보존료 등은 풍미 양호한 천연형 벌크 플레이버 등으로 하여, 마요네즈, 수프 믹스 등의 조미료, 하드 캔디, 케이크 등의 과자류, 핫케이크 믹스, 즉석 쥬스 등의 프리 믹스 등도 각종 음식물의 가공 재료로서 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 탈수제를 의약품, 그 원료 또는 가공 중간물의 경우에 적용시키는 경우로서는 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β, 매크로파아지 유주(遊走)저지 인자, 콜로니 자극 인자, 트랜스퍼 팩터, 인터류킨 II 등의 림포카인 함유액, 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬 함유액, BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생 백신, 두묘, 파상풍 톡소이드, 허브 항독소, 인간 면역 글로블린 등의 생물제제 함유액, 페니실린, 에리드로마이신, 클로램페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 가나마이신 등의 항생 물질 함유액, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등의 비타민 함유액, 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소 함유액, 약용 인삼 엑기스, 자라 엑기스, 클로렐라 엑기스, 알로에 엑기스, 프로폴리스 엑기스 등의 엑기스류, 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균 페이스트, 로얄 젤리 등의 액상 내지 페이스트상물도, 그 유효성분이나 활성을 상실함이 없이 안정하고 고품질의 탈수 의약품, 탈수 건강식품 등을 용이하게 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 탈수제를 화장품, 그 원료 또는 가공 중간물의 경우에 적용시키는 경우에는 상기 식품, 의약품의 경우와 마찬가지로, 날달걀, 레시틴, 생크림, 벌꿀, 감초 엑기스, 향료, 착색료, 효소 등을 탈수하면 고품질의 탈수 화장품을 용이하게 얻을 수 있다. 이 화장품은 피부 미화제, 미모제(美毛劑), 육모제(育毛劑) 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

그리고 본 발명의 탈수제를 탈수 물품으로 하여 효소의 경우에 적용시키는 경우에는 식품, 의약품, 공업원료 등의 가공용 촉매로서, 또한, 치료제, 소화제 등으로서, 더욱이는 효소세제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.

함수물에 탈수 능력을 가진 환상 4당을 함유, 접촉 또는 공존시키는 방법으로서는 목표로 하는 탈수 물품이 완성될 때까지, 예를 들면, 혼화, 혼날, 용해, 침투, 살포, 도포, 분무, 주입 등의 공지의 방법이 적절히 선택된다.

함수물에 대한 탈수 능력을 가진 환상 4당을 함유, 접촉 또는 공존시키는 양은 함수물에 함유되는 수분량과 목적으로 하는 탈수 물품의 성상에 따라서도 변하고, 필요하면, 함수물을 다른 공지의 방법으로 부분적으로 탈수 또는 농축한 후에, 탈수 능력을 가진 환상 4당을 함유, 접촉 또는 공존시켜도 좋으며, 통상, 함수물 1 중량부에 대하여 0.001 내지 200 중량부, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량부이다.

본 발명에서 얻어지는 탈수 물품, 예를 들면, 식품, 의약품, 화장품 등은 품질을 더욱 향상시키기 위해서 적당한 착향료, 착색료, 정미료, 안정제, 증량제 등을 병용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 특히, 안정제에 대해서, 본 발명이 탈수 능력을 가진 환상 4당에 의한 강력한 탈수 방법이므로, 항산화제 등의 저분자 화합물에 한정할 필요는 없고, 종래, 건조가 곤란하던 수용성 고분자 화합물, 예를 들면, 가용성 전분, 덱스트린, 풀룰란, 엘시난, 덱스트란, 크산탄 검, 아라비아 검, 로커스트 빈 검, 구아 검, 트라가칸트 검, 타마린드 검, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 펙틴, 한천, 젤라틴, 알부민, 카제인 등의 물질도 안정제로서 유리하게 이용할 수 있다.

이들 수용성 고분자 화합물을 이용할 경우에는 예를 들면, 액상 내지 페이스트상 함수물에 미리 수용성 고분자 화합물을 균일하게 용해시킨 후, 여기에 탈수 능력을 가진 환상 4당을 혼화, 혼날 등의 방법으로서 균일하게 함유시킴으로써, 미세한 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 석출시킨 탈수 물품을 얻을 수 있다.

이 제품은 함수물 유래의 향기성분, 유효성분 등이 고분자 화합물의 피막으로 피막되어 있거나, 또는 이 피막으로 둘러싸인 마이크로캡슐 중에 미세한 5 내지 6함수 결정 환상 4당과 함께 내포되거나, 더욱이는 향기성분, 유효성분 등이 환상 4당과 포접 화합물을 형성해서 안정화되어 있어 그 휘산, 품질열화가 방지되므로, 함수물 유래의 향기성분, 유효성분의 안정 유지에 극히 우수하다. 이 경우, 필요하면 수용성 고분자로 하여 향기성분 등과 포접 화합물을 형성하는 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린을 병용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

시클로덱스트린으로서는 고순도의 것에 한정할 필요는 없고, 건조하기 어렵고 분말화가 곤란한 저순도의 시클로덱스트린, 예를 들면, 다량의 말토덱스트린과 함께 각종 시클로덱스트린을 함유한 물엿상의 전분 부분 가수분해물, 더욱이는 시클로덱스트린의 글루코오스 유도체 등도 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 탈수 물품, 특히, 분말상 물품을 제조하는 방법은 여러가지 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면, 식품, 의약품, 화장품, 그것들의 원재료 또는 가공 중간물 등의 비교적 고수분의 함수물에, 탈수 능력을 가진 환상 4당을 탈수 물품의 총 중량 당 수분 약 50％ 이하, 바람직하게는 10 내지 40％가 되도록 균일하게 함유시킨 후, 바트(vat) 등에서 약 0.1 내지 5일간, 약 10 내지 50℃, 예를 들면, 실온에서 방치하여 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜서, 예를 들면 블록상으로 고화하고, 이것을 절삭, 분쇄 등의 방법에 의해 제조하면 좋다. 필요하면, 절삭, 분쇄 등의 분말화 공정 후에 건조 공정, 분급 공정 등을 추가할 수도 있다.

또한, 분무하는 방법 등에 의해 직접, 분말품을 제조할 수 있다. 예를 들면, 탈수 능력을 가진 환상 4당 분말을 유동시키면서, 여기에 액상 내지 페이스트상의 함수물을 소정량 분무하고, 접촉시켜서 조립한 후, 필요에 따라서 약 30 내지 60℃에서 약 0.1 내지 10시간 숙성하여 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시키거나, 또는 탈수 능력을 가진 환상 4당을 액상 내지 페이스트상 함수물에 혼화, 혼날 등으로 한 후, 이것을, 즉시, 혹은 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로의 변환을 개시시키고, 분무해서 얻어지는 분말품을, 필요에 따라서 마찬가지로 숙성하여 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시키는 방법은 분말상 탈수 물품을 대량 생산하는 방법으로서 적합하다.

이렇게 하여 얻어진 분말상 탈수 물품은 그대로, 또는 필요에 따라서 증량제, 부형제, 결합제, 안정제 등을 병용하고, 더욱이는 과립, 정제, 캡슐제, 봉상, 판상, 입방체형 등의 적당한 형상으로 성형해서 이용하는 것도 자유롭게 할 수 있다.

그리고 일반적으로, 전분은 그 팽윤, 호화를 위하여 다량의 수분을 필요로 하고 있으므로, 호화 전분은 미생물 오염을 받기 극히 쉽다. 탈수 능력을 가진 환상 4당은 이러한 호화 전분의 탈수제로서도 유효하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 규히(求肥) 등의 호화 전분은, 여기에 탈수 능력을 가진 환상 4당을 함유시켜 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시킴으로써, 실질적으로 수분이 저감되어, 미생물 오염을 방지할 수 있다.

더욱이 탈수 능력을 가진 환상 4당은 호화 전분에 대하여 균일하게 혼화하기 쉽고, 다음에 설명하는 바와 같이 노화 방지제로서도 작용하므로, 호화 전분을 함유하는 각종 가공 식품의 상품수명을 대폭 연장할 수 있다.

또한, 탈수 능력을 가진 환상 4당은 예를 들면, 껍질을 제거한 바나나, 오렌지, 슬라이스한 찐 감자, 말린 전갱이, 꽁치, 생면, 숙면, 떡과자 등의 표면에 미생물 오염을 받기 쉬운 고수분 함유 식품에 이용될 경우에는 그 표면에, 예를 들면, 탈수 능력을 가진 환상 4당 분말을 부착하여 접촉시켜 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시킴으로써 그 표면의 수분을 실질적으로 저감하고, 이들 식품의 보존성을 향상시키며, 품질을 개량하므로 식품의 방부제, 안정제, 품질 개량제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다. 이 경우, 필요하면, 예컨대, 락트산, 시트르산, 에탄올 등을 병용하고, 또한, 진공 포장, 가스 충전 포장, 냉장 등에 의해 그 상품수명을 더욱 연장시키는 것도 자유롭다.

그리고 탈수 능력을 가진 환상 4당은 알코올에 대하여 높은 친화력을 나타낸다. 이 성질로부터, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 등의 알코올 또는 알코올 가용물 등에 함유되는 수분의 탈수제로서도 유리하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 청주, 소주, 와인, 브랜디, 위스키, 보드카 등의 주류를 탈수 능력을 가진 환상 4당으로 탈수하고, 생성한 5 내지 6함수 결정 환상 4당에 그 유효성분, 향기 등을 보유한 매스키트상, 분말상 등으로 하여 유리하게 제조할 수 있다. 이렇게 하여 제조한 분말 주류는 과자, 프리 믹스 등으로 사용할 수 있고, 물로 복원해서 음용(飮用)으로 사용할 수도 있다.

본 발명의 탈수 능력을 가진 환상 4당은 탈수제, 안정제로서 뿐만 아니라, 탈수 물품 중에 함유시킴으로써, 고상한 감미의 질, 보디, 적당한 점도 부여제 등으로서의 효과도 발휘할 수 있다.

그리고 요오드 등의 알코올 용액을 탈수 능력을 가진 환상 4당과 혼합하고, 여기에 수용성 고분자 등을 함유하는 수용액에 가해서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시킴으로써, 요오드 등의 유효성분을 휘발, 변질되게 함이 없이 안정하게 유지하고, 또한 적당한 점도, 퍼짐성, 부착성을 가진 매스키트상의 고약 등을 제조하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

또한 탈수 능력을 가진 환상 4당에 함수 유용성(油溶性) 물질, 유화물(乳化物), 라텍스 등을 함침, 혼합 등으로 하여 탈수 능력을 가진 환상 4당을 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜, 분말상의 유지, 향신료, 향료, 착색료 등의 식품, 화장품, 분말상 비타민, 호르몬 등의 의약품 등을 제조하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

이 경우에는 탈수 능력을 가진 환상 4당은 탈수제로서 뿐만 아니라, 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환한 후에도 안정제, 유지제, 부형제, 담체 등으로서도 작용한다.

또한, 초콜렛, 크림 등의 수분을 기피하는 유용성 물질 함유 식품의 경우에도, 탈수 능력을 가진 환상 4당은 유리하게 이용된다. 이 경우에는 탈수제로서 뿐만 아니라, 가공 적성, 입 속에서의 용해, 풍미 등이 양호해지는 것에 이용된다. 더욱이 얻어진 제품은 그 고품질을 장기간에 걸쳐 안정하게 유지할 수 있는 특징을 가지고 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 비환원성 당질인 탈수 능력을 가진 환상 4당이 각종 함수물의 수분을 강력하게 탈수하는데다가, 얻어지는 탈수 물품이 극히 안정한 것을 발견함으로써 달성된 것이며, 그 탈수 능력을 가진 환상 4당을 탈수제로서 이용함으로써 액상 내지 페이스트상 등의 함수물로부터, 환상 4당의 특징인 포접 작용에 의해, 그 풍미, 향기를 열화, 휘산시킴이 없이 수분이 저감된 고품질의 식품, 화장품이나, 또한, 그 유효성분, 활성을 분해 저하시킴이 없이 수분이 저감된 고품질의 의약품, 화장품 등을 유리하게 제조할 수 있다.

이어서 본 발명의 탈수제의 사용 예에 대해서 설명한다.

탈수 능력을 가진 환상 4당은 낮은 감미이며, 충치유발, 혈(血) 중 콜레스테롤 및/또는 혈당치의 상승 등의 우려가 없는 조미료로서도 사용할 수 있다. 필요하면, 예컨대, 가루엿, 포도당, 이성화당, 설탕, 맥아당, α, α-트레할로오스, 벌꿀, 메이풀 슈거, 소르비톨, 말티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 라칸카 감미물, 글리시리진, 소마틴, L-아스파르틸페닐알라닌메틸 에스테르, 아세술팜 K, 스쿠랄로오스, 사카린, 글라이신, 알라닌 등과 같은 기타의 감미료와, 또한 덱스트린, 전분, 락토오스 등과 같은 증량제와 혼합해서 사용할 수 도 있다.

탈수 능력을 가진 환상 4당은 비환원성 당질이며 환상 4당 본래의 상품의 저감미를 가지고, 신맛, 짠맛, 떫은 맛, 감미로움, 쓴맛 등의 기타의 정미를 가진 각종의 물질과 잘 조화하고, 내산성, 내열성도 크므로, 일반 식품에의 탈수제로서 뿐만 아니라, 단맛 부여에, 또한 정미개량, 품질개량, 풍미개선 등에 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

예를 들면, 간장, 분말간장, 된장, 분말된장, 모로미, 히시오, 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 초밥용 분말초, 츄카노모토, 텐츠유, 멘츠유, 소오스, 케첩, 불고기용 소오스, 커리루우, 스튜 믹스, 수프 믹스, 우려낸 국물의 믹스, 복합 조미료, 미린, 신미린, 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료에의 탈수제로서, 더욱이 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 풍미 개량제 등으로서 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

그리고, 예를 들면, 센배이, 아라래, 오코시, 규히, 떡류, 만두, 우이로, 팥소류, 양갱, 물양갱, 비단옥, 젤리, 카스테라, 눈깔사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스켓, 크래커, 쿠키, 파이, 푸딩, 버터 크림, 카스터드 크림, 슈크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉검, 캬라멜, 누가, 캔디 등의 각종 양과자, 아이스크림, 셔베트 등의 빙과, 과실의 시럽절임, 수밀도 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 후루츠 페이스트 등의 페이스트류, 잼, 마멀레이드, 시럽절임, 당과 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 후쿠진쯔케, 베타라쯔케, 센마이쯔케, 라쿄쯔케 등의 절인 야채류, 단무지 절임 믹스, 배추 절임 믹스 등의 절임 야채용 믹스류, 햄, 소시지 등의 축육제품류, 어육 햄, 피시 소시지, 가마보코, 치쿠와, 튀김 등의 어육제품, 성게 젓, 물오징어의 젓, 슈콘부, 말린 오징어, 복어의 조미말림, 대구, 도미, 새우 등의 각종 진미류, 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 해산물 조림류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품, 유제품, 어육, 축육, 과실, 야채의 병조림, 통조림, 합성 술, 증양주(增釀酒), 과실주, 술 등의 주류, 커피, 코코아, 쥬스, 탄산음료, 락트산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 푸딩 믹스, 핫케이크 믹스, 즉석 쥬스, 즉석 커피, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등의 즉석음료 등의 각종 식품에의 탈수제로서, 더욱이는 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 풍미개선 등으로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

이하, 본 발명에서 이용되는 환상 4당의 제조 방법 및 성질에 대해서 설명한다.

실험 1 배양물로부터의 환상 4당의 조제

전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #1』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조) 5w/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히미스트』, 일본국의 아사히 비루 주식회사 제조) 1.5w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨 12함수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘 7함수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체배지를, 500 ml 용량의 삼각 플라스크에 100 ml을 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕배양한 후, 원심분리해서 균체를 제거하여 배양 상청을 얻었다. 다시 이 배양 상청을 오토클레이브(120℃, 15분간)하고, 방냉한 후, 불용물을 원심분리해서 제거하여 상청을 회수하였다.

얻어진 상청중의 당질을 조사하기 위해서, 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물 혼합액(용량비 6:4:1), 박층 플레이트로서 메르크사제 『키젤 겔 60』(알루미늄 플레이트, 20×20cm)을 이용하여 2회 전개하는 실리카 겔 박층 크로마토그래피(이하, 「TLC」로 약칭함.)를 하여 상청중의 당질을 분리하였다. 검출법으로서, 분리한 전체 당질을 황산-메탄올법으로 발색하고, 또한, 환원당질을 디페닐아민-아닐린법으로 발색해서 조사한 결과, Rf값이 약 0.31인 위치에서 황산-메탄올법에서 양성, 또한 디페닐아민-아닐린법에서 음성인 비환원성 당질이 검출되었다.

앞서 얻은 상청 약 90 ml을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 주식회사 제조)를 고형물 1그램 당 1,500 단위와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사 제조)를 고형물 1그램 당 75 단위 첨가해서 24시간 처리하고, 계속하여 수산화 나트륨으로 pH를 12로 조정하여 2시간 펄펄 끓여, 잔존하는 환원당을 분해하였다. 불용물을 여과해서 제거한 후, 일본국의 三菱화학제 이온교환 수지 『다이아이온 PK 218』과 『다이아이온 WA30』을 사용해서 탈색, 탈염하고, 더욱이, 일본국의 三菱화학제 캐타이온 교환 수지 『다이아이온 SK-1B』와 일본국의 오르가노제 음이온 교환 수지 『IRA411』로써 다시 탈염하고, 활성탄으로 탈색하여 정밀여과한 후, 에바포레이터에서 농축하여 동결 진공 건조해서 고형물로서 약 0.6 g의 당질분말을 얻었다.

얻어진 당질의 조성을 고속액체 크로마토그래피법(이하, HPLC라 약칭함.)에 의해 조사한 결과, 도 1에 나온 바와 같이, 용출시간 10.84분에서 단일 피이크만이 검출되어, 순도는 99.9％ 이상으로서 극히 고순도인 것이 판명되었다. 또한, HPLC는 『Shodex KS-801 칼럼』(일본국의 昭和電工 주식회사 제조)을 사용하여 칼럼 온도 60℃, 유속 0.5 ml/min 물의 조건에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사 제조)를 사용해서 하였다.

그리고 환원력을 소모기-넬슨법으로 측정한 결과, 그 환원력은 검출한계 이하이며, 이 표품은 실질적으로 비환원성 당질이라고 판단된다.

실험 2 환상 4당의 구조해석

실험 1의 방법으로 얻어진 비환원성 당질에 대해서, 고속 원자 충격법에 의한 질량분석(통칭 「FAB-MS」)을 한 결과, 질량수 649의 프로톤 부가 분자 이온이 현저하게 검출되어 이 당질의 질량수가 648인 것이 판명되었다.

또한, 통상적인 방법에 따라, 황산을 사용하여 가수분해하고, 가스 크로마토그래피법으로 구성당을 조사한 결과, D-글루코오스만이 검출되어 이 당질의 구성당은 D-글루코오스인 것도 밝혀지고, 질량수도 고려하면 이 당질은 글루코오스 4분자로 된 환상 당질인 것으로 추측되었다.

더욱이 이 당질을 사용해서 핵자기 공명법(통칭 NMR)을 실시한 결과, 도 2에 나온 ¹H-NMR 스펙트럼과, 도 3에 나온 ¹³C-NMR 스펙트럼이 얻어지고, 이들 스펙트럼을 기지 당질의 것과 같거나 다른 점을 비교한 결과, 『Europian Journal of Biochemistry』, 641 내지 648 페이지(1994년)에 기재되어 있는 비환원성 환상 당질 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 스펙트럼과 일치하고, 이 당질의 구조가 도 4에 나온 환상 4당, 즉, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}인 것이 판명되었다.

실험 3 바실루스 글로비스포루스 C9로부터의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 생산

전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조) 4.O w/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히미스트』(일본국의 아사히 비루 주식회사 제조) 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨 12함수염 0.06w/v％,황산 마그네슘 7함수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500 ml 용량의 삼각 플라스크에 100 ml 씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕배양한 것을 종(種)배양으로 하였다.

용량 30 리터의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20 리터 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기교반 배양하였다. 배양 후, 배양액 중의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성은 약 0.45 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.5 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 0.95 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18 리터의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 약 0.45 단위/ml의 활성(총 활성 약 8,110 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.5 단위/ml의 활성(총 활성 약 26,900 단위)이며, 환상 4당 생성활성은 약 0.95 단위/ml(총 활성 약 17,100 단위)이었다.

그리고 효소활성은 다음과 같이 해서 측정하였다. 즉, α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성의 측정은 말토트리오스를 농도 2w/v％가 되도록 100 mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜서 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5 ml에 효소액 0.5 ml을 가하여 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액 중에 주로 생성하는 이소말토실말토오스와 말토오스 중에서 이 말토오스량을 실험 1에 기재한 HPLC법으로 정량함으로써 실시하였다. α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 활성 1 단위는 상기의 조건하에서 1분간에 1 μ몰의 말토오스를 생성하는 효소량으로 하였다.

또한, α-이소말토실 전이효소 활성의 측정은 파노오스를 농도 2w/v％가 되도록 100 mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5 ml에 효소액 0.5 ml을 가하여 35℃에서 30분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액 중에 주로 생성하는 환상 4당과 글루코오스 중에서 이 글루코오스량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량함으로써 실시하였다. α-이소말토실 전이효소의 활성 1 단위는 상기의 조건하에서 1분간에 1 μ몰의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 하였다.

환상 4당 생성활성의 측정은 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조)을 농도 2w/v％가 되도록 50 mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5 ml에 효소액 0.5 ml을 가하여 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 100℃에서 10분간 열처리해서 반응을 정지시킨 후, 더욱이, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 제조) 70 단위/ml와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사 판매) 27 단위/ml를 함유하는 50 mM 아세트산 완충액(pH 5.0) 1 ml를 가하고, 50℃에서 60분간 처리하고, 그 액을 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시킨 후, 환상 4당의 양을 실험 1에 기재한 HPLC법으로 정량함으로써 실시하였다. 환상 4당 생성활성 1 단위는 상기의 조건하에서 1분간에 1 μ몰의 환상 4당을 생성하는 효소량으로 하였다.

실험 4 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 효소의 조제

실험 4-1 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 효소의 정제

실험 3에서 얻어진 배양 상청 약 18 리터를 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하고, 10 mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 400 ml을 얻었다.

이 조효소액은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성을 8,110 단위와, α-이소말토실 전이효소 활성을 24,700 단위와, 환상 4당 생성활성을 약 15,600 단위 가지고 있었다. 이 조효소액을 일본국의 三菱화학 주식회사제 『Sepabeads FP-DA13』겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 1,000 ml)에 사용하였다. 이 경우, α-이소말토실글루코 당질생성 효소, α-이소말토실 전이효소 및 환상 4당 모두가 『Sepabeads FP-DA13』겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불순물을 제거하고, Amersham Pharmacia Biotechnology 주식회사제 『Sephacryl HRS-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500 ml)에 사용하였다.

효소활성 성분은 『Sephacryl HRS-200』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1 M로부터 O M의 리니어 그래디언트, 더욱 계속하여 말토테트라오스 O mM로부터 100 mM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 O M 부근에서 용출하고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30 mM 부근에서 용출하였다. 따라서, α-이소말토실 전이효소 활성획분과 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성획분을 따로따로 수집하여 회수하였다. 그리고 환상 4당 생성활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느 쪽의 획분에도 나타나지 않는 것을 알 수 있고, 또한, 얻어진 α-이소말토실글루코 당질생성 효소획분과 α-이소말토실 전이효소획분을 혼합한 효소액은 환상 4당 생성활성을 나타내는 것을 알 수 있으며, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 α-이소말토실 전이효소와 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 양쪽 효소활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 판명되었다.

이하, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 따로따로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.

실험 4-2 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 정제

실험 4-1에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소획분을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350 ml)에 사용하였다.

이 효소는 『Butyl-Toyopearl 650M』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1 M로부터 O M의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3 M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집해서 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HRS-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 1에 나타낸다.

[표 1]

공 정	α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량 (단위)	α-이소말토실글루코 당질생성 효소 비활성 (단위/mg 단백)	수 율 (%)
배양 상청	8,110	0.12	100
황산 암모늄 염석후의 투석액	7,450	0.56	91.9
이온교환 칼럼 용출액	5,850	1.03	72.1
어피니티 칼럼 용출액	4,040	8.72	49.8
소수 칼럼 용출액	3,070	10.6	37.8
어피니티 칼럼 용출액	1,870	13.6	23.1

정제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품(標品)을 7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.

실험 4-3 α-이소말토실 전이효소의 정제

실험 4-1에 기재한 어피니티 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질생성 효소획분과 분리한 α-이소말토실 전이효소획분을, 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650 M』겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350 ml)에 사용하였다.

이 효소는 『Butyl-Toyopearl 650 M』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1 M로부터 O M의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3 M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집해서 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HRS-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 2에 나타낸다.

[표 2]

공 정	α-이소말토실 전이효소 활성량 (단위)	α-이소말토실 전이효소 비활성 (단위/mg 단백)	수 율 (%)
배양 상청	26,900	0.41	100
황산 암모늄 염석후의 투석액	24,700	1.85	91.8
이온교환 칼럼 용출액	19,400	3.41	72.1
어피니티 칼럼 용출액	13,400	18.6	49.8
소수 칼럼 용출액	10,000	21.3	37.2
어피니티 칼럼 용출액	6,460	26.9	24.0

실험 5 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 성질

실험 5-1 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 성질

실험 4-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 140,000±20,000 달톤이었다.

정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2±0.5이었다.

이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 또한, 온도의 영향에 대해서는 Ca²⁺ 비존재하와 1 mM 존재하에서 측정하였다. 이들의 결과를 도 5(온도의 영향), 도 6(pH의 영향)에 나타내었다.

효소의 최적 온도는 pH 6.0, 60분간 반응에서 약 40℃（Ca²⁺ 비존재), 약 45℃（Ca²⁺ 1 mM 존재), 최적 pH는 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0 내지 6.5이었다.

이 효소의 온도 안정성은 효소용액(20 mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca²⁺ 비존재하 또는 1 mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다.

또한, pH 안정성은 이 효소를 각 pH 50 mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다.

각각의 결과를 도 7(온도 안정성), 도 8(pH 안정성)에 나타내었다.

이 효소의 온도 안정성은 약 35℃까지(Ca²⁺ 비존재), 약 40℃까지(Ca²⁺ 1 mM 존재)이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.

이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1 mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

[표 3]

금속 이온	상대 활성 (%)	금속 이온	상대 활성 (%)
무첨가	100	Hg²⁺	4
Zn²⁺	92	Ba²⁺	65
Mg²⁺	100	Sr²⁺	80
Ca²⁺	115	Pb²⁺	103
Co²⁺	100	Fe²⁺	98
Cu²⁺	15	Fe³⁺	97
Ni²⁺	98	Mn²⁺	111
Al³⁺	99	EDTA	20

표 3의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg²⁺, Cu²⁺, EDTA에 의하여 현저하게 저해되고, Ba²⁺, Sr²⁺에 의하여 저해되었다. Ca²⁺, Mn²⁺에 의하여 활성화되는 것도 밝혀졌다.

이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 프로틴 시퀀서 모델 473A(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다.

실험 5-2: α-이소말토실 전이효소의 성질

실험 4-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000±20,000 달톤이었다.

정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.5±0.5이었다.

이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 9(온도의 영향), 도 10(pH의 영향)에 나타내었다.

효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 45℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다.

이 효소의 온도 안정성은 효소 용액(20 mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은 이 효소를 각 pH 50 mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 11(온도 안정성), 도 12(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 약 4.0 내지 9.0이었다.

이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1 mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

금속 이온	상대 활성 (%)	금속 이온	상대 활성 (%)
무첨가	100	Hg²⁺	1
Zn²⁺	88	Ba²⁺	102
Mg²⁺	98	Sr²⁺	101
Ca²⁺	101	Pb²⁺	89
Co²⁺	103	Fe²⁺	96
Cu²⁺	57	Fe³⁺	105
Ni²⁺	102	Mn²⁺	106
Al³⁺	103	EDTA	104

표 4의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg²⁺에 의하여 현저하게 저해되고, Cu²⁺에 의해서 저해되었다. 또한, Ca²⁺에 의하여 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.

이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로틴 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 2에 나온 아미노산 서열의 이소로이신―아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-아스파라긴-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다.

실험 6: 바실루스 글로비스포루스 Cll로부터의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 생산

전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.O w/v％, 효모 추출물 『아사히미스트』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨 12함수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘 7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500 ml 용량의 삼각 플라스크에 100 ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 Cll(FERM BP-7144)을 접종하여 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.

용량 30 리터의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20 리터 넣고, 가열멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종한 다음에, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기교반 배양하였다. 배양 후, 배양액 중의 이 효소활성은 약 0.55 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.8 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 1.1 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간) 해서 회수한 상청 약 18 리터의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 약 0.51 단위/ml의 활성(총 활성 약 9,180 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.7 단위/ml의 활성(총 활성 약 30,400 단위)이며, 환상 4당 생성활성은 약 1.1 단위/ml(총 활성 약 19,400 단위)이었다.

실험 7: 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래 효소의 조제

실험 7-1: 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래 효소의 정제

실험 6에서 얻어진 배양 상청 약 18 리터의 효소를 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석하고, 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10 mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조효소액 약 416 ml을 얻었다. 이 조효소액은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 8,440 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 28,000 단위, 환상 4당 생성 활성을 약 17,700 단위를 가진 것이 판명되었다. 이 조효소액을, 실험 4-1에 기재한 『Sepabeads FP-DA13』 겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다.

α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성, α-이소말토실 전이효소 활성, 환상 4당 생성 모두가 『Sepabeads FP-DA13』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, Amersham Pharmacia Biotechnology 주식회사제 『Sephacryl HRS-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500 ml)에 사용하였다. 효소활성은 『Sephacryl HRS-200』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1 M로부터 O M의 리니어 그래디언트, 더욱 계속하여 말토테트라오스 O mM로부터 100 mM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실 전이효소와 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.3 M 부근에서 용출하며, α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30 mM 부근에서 용출하였다. 따라서, α-이소말토실 전이효소 활성획분과 α-이소말토실글루코 당질생성 효소획분을 따로따로 수집해서 회수하였다.

실험 4에 기재한 C9주(株)의 경우와 마찬가지로, 환상 4당 생성활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느 쪽의 획분에도 나타나지 않는 것을 알 수 있고, 또한, 얻어진 α-이소말토실 전이효소획분과 α-이소말토실글루코 당질생성 효소획분을 혼합한 효소액은 환상 4당 생성활성을 나타내는 것을 알 수 있으며, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 양쪽 효소활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 판명되었다.

실험 7-2: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 정제

α-이소말토실글루코 당질생성 효소획분을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350 ml)에 사용하였다. 이 효소는 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1 M로부터 O M의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3 M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집해서 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 『Sephacryl HRS-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 5에 나타낸다.

[표 5]

공 정	α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성량 (단위)	α-이소말토실글루코 당질생성 효소 비활성 (단위/mg 단백)	수 율 (%)
배양 상청	9,180	0.14	100
황산 암모늄 염석후의 투석액	8,440	0.60	91.9
이온교환 칼럼 용출액	6,620	1.08	72.1
어피니티 칼럼 용출액	4,130	8.83	45.0
소수 칼럼 용출액	3,310	11.0	36.1
어피니티 칼럼 용출액	2,000	13.4	21.8

정제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.

실험 7-3: α-이소말토실 전이효소의 정제

실험 7-1에 기재한 어피니티 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 획분과 분리한 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350 ml)에 사용하였다.

이 효소는 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1 M로부터 O M의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3 M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집해서 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1 M 황산 암모늄을 함유하는 10 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HRS-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 6에 나타낸다.

[표 6]

공 정	α-이소말토실 전이효소 활성량 (단위)	α-이소말토실 전이효소 비활성 (단위/mg 단백)	수 율 (%)
배양 상청	30,400	0.45	100
황산 암모늄 염석후의 투석액	28,000	1.98	92.1
이온교환 칼럼 용출액	21,800	3.56	71.7
어피니티 칼럼 용출액	13,700	21.9	45.1
소수 칼럼 용출액	10,300	23.4	33.9
어피니티 칼럼 용출액	5,510	29.6	18.1

실험 8: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 조제

실험 8-1: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 성질

실험 7-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 137,000±20,000 달톤이었다.

이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 또한, 온도의 영향에 대해서는 Ca²⁺ 비존재하와 1 mM 존재하에서 측정하였다. 이들의 결과를 도 13(온도의 영향), 도 14(pH의 영향)에 나타내었다.

효소의 최적 온도는 pH 6.0, 60분간 반응에서 약 45℃（Ca²⁺ 비존재), 약 50℃（Ca²⁺ 1 mM 존재), 최적 pH는 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이었다.

또한, pH 안정성은 이 효소를 각 pH 50 mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 15(온도 안정성), 도 16(pH 안정성)에 나타내었다.

이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지(Ca²⁺ 비존재), 약 45℃까지(Ca²⁺ 1 mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 10.0이었다.

이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1 mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.

[표 7]

금속 이온	상대 활성 (%)	금속 이온	상대 활성 (%)
무첨가	100	Hg²⁺	4
Zn²⁺	91	Ba²⁺	65
Mg²⁺	98	Sr²⁺	83
Ca²⁺	109	Pb²⁺	101
Co²⁺	96	Fe²⁺	100
Cu²⁺	23	Fe³⁺	102
Ni²⁺	93	Mn²⁺	142
Al³⁺	100	EDTA	24

표 7의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg²⁺, Cu²⁺, EDTA에 의하여 현저하게 저해되고, Ba²⁺, Sr²⁺에 의하여 저해되었다. Ca²⁺, Mn²⁺에 의하여 활성화되는 것도 밝혀졌다.

이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로틴 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열 N 말단 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다.

이 N 말단 아미노산 서열 결과를 실험 5-1의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 N 말단 서열과 비교하면 동일한 것이 밝혀지고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 공통되는 N 말단 아미노산 서열은 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산 서열인 것이 판명되었다.

실험 8-2: α-이소말토실 전이효소의 성질

실험 7-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 102,000±20,000 달톤이었다.

정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.6±0.5이었다.

이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 17(온도의 영향), 도 18(pH의 영향)에 나타내었다.

효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 5.5 내지 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은 효소용액(20 mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다.

또한, pH 안정성은 이 효소를 각 pH 50 mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 19(온도 안정성), 도 20(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.

이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1 mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.

[표 8]

금속 이온	상대 활성 (%)	금속 이온	상대 활성 (%)
무첨가	100	Hg²⁺	2
Zn²⁺	83	Ba²⁺	90
Mg²⁺	91	Sr²⁺	93
Ca²⁺	91	Pb²⁺	74
Co²⁺	89	Fe²⁺	104
Cu²⁺	56	Fe³⁺	88
Ni²⁺	89	Mn²⁺	93
Al³⁺	89	EDTA	98

표 8의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg²⁺에 의하여 현저하게 저해되고, Cu²⁺에 의해서 저해되었다. 또한, Ca²⁺에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.

이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로틴 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 3에 나온 아미노산 서열의 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-티로신-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다. 이 N 말단 아미노산 서열 결과를 실험 5-2의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 N 말단 서열과 비교하고, α-이소말토실 전이효소의 공통되는 N 말단 아미노산 서열은 서열표에 있어서의 서열 번호 4에 나온 아미노산 서열의 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린의 N 말단 아미노산 서열인 것이 판명되었다.

실험 9: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 아미노산 서열

실험 9-1: α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 내부 부분 아미노산 서열

실험 7-2의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품의 일부를 10 mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1 mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1 ml)에 10 ㎍의 트립신(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)을 가하고, 30℃, 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서, 역상(逆相) HPLC를 하였다. 마이크로본다팩 C18 칼럼(지름 2.1 mm × 길이 150 mm, 워터즈사제)을 사용하고, 유속 0.9 ml/분, 실온에서 0.1％ 트리플루오로아세트산-8％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-40％ 아세토니트릴 용액까지의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드는, 파장 210 nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 다른 펩티드와 잘 분리한 3 펩티드[P64(유지시간 약 64분), P88(유지시간 약 88분), P99(유지시간 약 99분)]를 분취(分取)하고, 각각을 진공 건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로틴 시퀀서에 사용하고, 각각 8 잔기(殘基)까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 5 내지 7에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 9에 나타낸다.

[표 9]

펩티드명	내부 부분 아미노산 서열
P64	아스파라긴산-알라닌-세린-알라닌-아스파라긴-발린-트레오닌-트레오닌
P88	트립토판-세린-로이신-글리신-페닐알라닌-메티오닌-아스파라긴-페닐알라닌
P99	아스파라긴-티로신-트레오닌-아스파라긴산-알라닌-트립토판-메티오닌-페닐알라닌

실험 9-2: α-이소말토실 전이효소의 내부 부분 아미노산 서열

실험 7-3의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실 전이효소 표품의 일부를 10 mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1 mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1 ml)에 10 ㎍의 리질엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃, 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 마이크로본다팩 C18 칼럼(지름 2.1 mm × 길이 150 mm, 워터즈사제)을 사용하고, 유속 0.9 ml/분, 실온에서 0.1％ 트리플루오로아세트산-8％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-40％ 아세토니트릴 용액까지의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드는 파장 210 nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 다른 펩티드와 잘 분리한 3 펩티드[P22(유지시간 약 22분), P63(유지시간 약 63분), P71(유지시간 약 71분)]를 분취하고, 각각을 진공 건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로틴 시퀀서에 사용하고, 각각 8 잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 8 내지 10에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 10에 나타낸다.

[표 10]

펩티드명	내부 부분 아미노산 서열
P22	글리신-아스파라긴-글루탐산-메티오닌-아르기닌-아스파라긴-글루타민-티로신
P63	이소로이신-트레오닌-트레오닌-트립토판-프롤린-이소로이신-글루탐산-세린
P71	트립토판-알라닌-페닐알라닌-글리신-로이신-트립토판-메티오닌-세린

실험 10: 각종 당질에의 작용

각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 기질이 될 수 있는가 아닌가를 시험하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 파노오스, 이소파노오스, α,α-트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, 세라기노오스, 말토실글루코시드, 이소말토실글루코시드를 함유하는 용액을 조제하였다.

이들 용액에, 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품, 또는 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 기질 고형물 1그램 당 각각 2 단위씩 가하고, 기질 농도를 2w/v％가 되도록 조정하여 이것을 30℃, pH 6.0에서 24시간 작용시켰다. 효소반응 전후의 반응액을, 실험 1에 기재한 TLC법으로 분석하고, 각각의 당질에 대한 효소작용의 유무를 확인하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.

[표 11]

기 질	효소 작용	기 질	효소 작용
기 질	C9 효소 C11 효소	기 질	C9 효소 C11 효소
말토오스	+ +	니게로오스	+ +
말토트리오스	++ ++	네오트레할로오스	+ +
말토테트라오스	+++ +++	셀로비오스	- -
말토펜타오스	+++ +++	겐티비오스	- -
말토헥사오스	+++ +++	말티톨	- -
말토헵타오스	+++ +++	말토트리이톨	+ +
이소말토오스	- -	락토오스	- -
이소말토트리오스	- -	수크로오스	- -
파노오스	- -	에를로오스	+ +
이소파노오스	++ ++	세라기노오스	- -
α,α-트레할로오스	- -	말토실글루코시드	++ ++
코지비오스	+ +	이소말토실글루코시드	- -

주) 효소반응 전후에서,

「-」는 변화 없음을 나타내고,

「+」는 기질의 스폿이 약간 감소하고, 다른 생성물이 나타남을 나타내며,

「++」는 기질의 스폿이 상당히 감소하고, 다른 생성물이 나타남을 나타내고,

「+++」는 기질의 스폿이 거의 소실하고, 다른 생성물이 나타남을 나타낸다.

표 11의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 시험한 많은 종류의 당질 중에서 글루코오스 중합도 3 이상이고, 비환원 말단에 말토오스 구조를 가진 당질에 잘 작용하는 것이 판명되었다. 또한, 글루코오스 중합도가 2인 당질에서는 말토오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로오스, 말토트리이톨, 에를로오스에도 약간 작용하는 것이 판명되었다.

실험 11: 말토올리고당으로의 생성물

실험 11-1: 생성물의 조제

농도 1％의 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스의 각각의 수용액에 실험 7-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를, 각각 고형물 1그램 당 2 단위(말토오스 및 말토트리오스), 0.2 단위(말토테트라오스), 0.1 단위(말토펜타오스) 가하고, 35℃, pH 6.0에서 8시간 작용시킨 후, 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 당조성을 HPLC법을 이용해서 측정하였다. HPLC는 『YMC Pack ODS-AQ303』 칼럼(주식회사 YMC 제조)을 사용하여 칼럼 온도 40℃, 유속 0.5 ml/min 물의 조건에서 실시하고, 검출은 사차(示差) 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사 제조)를 사용해서 하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.

[표 12]

반응에서 생성한 당질의 종류	기 질
반응에서 생성한 당질의 종류	말토오스	말토트리오스	말토테트라오스	말토펜타오스
글루코오스	8.5	0.1	0.0	0.0
말토오스	78.0	17.9	0.3	0.0
말토트리오스	0.8	45.3	22.7	1.9
말토테트라오스	0.0	1.8	35.1	19.2
말토펜타오스	0.0	0.0	3.5	34.4
말토헥사오스	0.0	0.0	0.0	4.6
이소말토오스	0.5	0.0	0.0	0.0
글루코실말토오스	8.2	1.2	0.0	0.0
글루코실말토트리오스	2.4	31.5	6.8	0.0
X	0.0	2.1	30.0	11.4
Y	0.0	0.0	1.4	26.8
Z	0.0	0.0	0.0	1.7
기타	0.6	0.1	0.2	0.0

표 중에서,

글루코실말토오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 6²-0-α-글루코실말토오스, 파노오스)이고,

글루코실말토트리오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 6³-0-α-글루코실말토트리오스)이며,

X는 실험 11-2에 기재한 α-이소말토실글루코트리오스(별명, 6⁴-0-α-글루코실말토테트라오스)이고,

Y는 실험 11-2에 기재한 α-이소말토실글루코테트라오스(별명, 6⁵-0-α-글루코실말토펜타오스)이며,

Z는 미확인의 당질이다.

표 12의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소의 작용의 결과, 기질 말토오스로부터는 주로 글루코오스와 α-이소말토실글루코오스(별명, 6²-0-α-글루코실말토오스, 파노오스)가 생성하고, 기질 말토트리오스로부터는 주로 말토오스와 α-이소말토실글루코오스(별명, 6³-0-α-글루코실말토트리오스)가 생성하며, 소량이지만 글루코오스, 말토테트라오스, α-이소말토실글루코오스(별명, 6²-0-α-글루코실말토오스, 파노오스), 생성물 X가 생성하는 것이 판명되었다.

기질 말토테트라오스로부터는 주로 말토트리오스와 생성물 X가 생성하고, 소량이지만 말토오스, 말토펜타오스, α-이소말토실글루코오스(별명, 6³-0-α-글루코실말토트리오스), 생성물 Y가 생성하는 것이 판명되었다.

기질 말토펜타오스로부터는 주로 말토테트라오스와 생성물 Y가 생성하고, 소량이지만 말토트리오스, 말토헥사오스, 생성물 X, 생성물 Z가 생성하는 것이 판명되었다.

기질 말토테트라오스로부터의 주생성물인 생성물 X, 및 기질 말토펜타오스로부터의 주생성물인 생성물 Y의 단리·정제를 하였다. 분취용 HPLC 칼럼 『YMC-Pack ODS-A R355-15S-15 12 A』(주식회사 와이에무시제)를 사용해서 정제하고, 상기의 말토테트라오스로부터의 반응물, 말토펜타오스로부터의 반응물 각각으로부터 순도 99.9％ 이상의 생성물 X 표품을 고형물 수율 약 8.3％로, 그리고 순도 99.9％ 이상의 생성물 Y를 고형물 수율 약 11.5％로 단리하였다.

실험 11-2: 생성물의 구조해석

실험 11-1의 방법으로 얻은 생성물 X 표품 및 생성물 Y 표품을 사용하고, 통상적인 방법에 따라서 메틸화 분석과 NMR 분석을 하였다. 메틸화 분석의 결과는 표 13에 정리하였다. NMR 분석의 결과에 대해서는 ¹H-NMR 스펙트럼을 도 21(생성물 X), 도 22(생성물 Y)에, ¹³C-NMR 스펙트럼 및 귀속을 도 23(생성물 X), 도 24(생성물 Y), 표 14에 정리하였다.

[표 13]

분석 메틸화물의 종류	조 성 비
분석 메틸화물의 종류	생성물 X	생성물 Y
2,3,4-트리메틸화물	1.00	1.00
2,3,6-트리메틸화물	3.05	3.98
2,3,4,6-테트라메틸화물	0.82	0.85

이들 결과로부터, α-이소말토실글루코 당질생성 효소에 의한 말토테트라오스로부터의 생성물 X는 말토테트라오스의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 글루코오스기가 α 결합한 5 당이고, 구조식 1로 표현되는 α-이소말토실말토트리오스(별명, 6⁴-0-α-글루코실말토테트라오스)인 것이 판명되었다.

구조식 1:

α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp

또한, 말토펜타오스로부터의 생성물 Y는 말토펜타오스의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 글루코실기가 α 결합한 6 당이고, 구조식 2로 표현되는 α-이소말토실말토테트라오스(별명, 6⁵-0-α-글루코실말토펜타오스)인 것이 판명되었다.

구조식 2:

α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp

[표 14]

글루코오스 번호	탄소 번호	NMR 화학 시프트값 (ppm)
글루코오스 번호	탄소 번호	생성물 X	생성물 Y
a	1a	100.8	100.8
	2a	74.2	74.2
	3a	75.8	75.7
	4a	72.2	72.2
	5a	74.5	74.5
	6a	63.2	63.1
b	1b	102.6	102.6
	2b	74.2	74.2
	3b	75.8	75.7
	4b	72.1	72.1
	5b	74.0	74.0
	6b	68.6	68.6
c	1c	102.3	102.3
	2c	74.2	74.2
	3c	76.0	76.0
	4c	79.6	79.5
	5c	73.9	73.9
	6c	63.2	63.1
d	1d	102.2	102.3
	2d	74.0(α), 74.4(β)	74.2
	3d	76.0	76.0
	4d	79.8	79.5
	5d	73.9	73.9
	6d	63.2	63.1
e	1e	94.6(α), 98.5(β)	102.1
	2e	74.2(α), 76.7(β)	74.0(α), 74.4(β)
	3e	75.9(α), 78.9(β)	76.0
	4e	79.6(α), 79.4(β)	79.8
	5e	72.6(α), 77.2(β)	73.9
	6e	63.4(α), 63.4(β)	63.1
f	1f		94.6(α), 98.5(β)
	2f		74.2(α), 76.7(β)
	3f		76.0(α), 78.9(β)
	4f		79.6(α), 79.5(β)
	5f		72.6(α), 77.2(β)
	6f		63.3(α), 63.3(β)

이상으로부터, α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 말토올리고당에 대한 작용은 아래와 같이 판단되었다.

(1) 이 효소는 기질로서, α-1, 4 결합으로 된 글루코오스 중합도가 2 이상의 말토올리고당에 작용하여 그 비환원성 말단의 글루코실 잔기를 다른 분자의 비환원성 말단의 글루코실 잔기의 6 위치에 전이하는 작용을 가진 분자간의 6-글루코실 전이를 촉매하여, 비환원 말단에 6-0-α-글루코실기를 가진 글루코오스 중합도가 1 증가한 α-이소말토실글루코 당질(별명, 6-0-α-글루코실말토올리고당)과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 생성한다.

(2) 이 효소는 4-글루코실 전이도 약간 촉매하여, 말토올리고당으로부터, 글루코오스 중합도가 1 증가한 말토올리고당과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 약간 생성한다.

실험 12: 환원력 생성시험

α-이소말토실글루코 당질생성 효소가 환원력 생성 능력을 가지는가 아닌가를 조사하기 위해서 아래의 시험을 하였다. 즉, 농도 1％의 말토테트라오스 수용액에 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 기질 고형물 1그램 당 0.25 단위 첨가하고 35℃, pH 6.0에서 작용시켜, 그 반응액의 일부를 경시적으로 채취하고, 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하여 반응액의 환원력을 측정하였다. 즉, 그 효소반응 전후의 용액의 환원당의 양을 소모기-넬슨법으로 측정하고, 또한, 동시에 그 효소반응 전후의 용액의 전체 당량(糖量)을 앤트론 황산법으로 측정하고, 환원력 생성율（％)은 아래의 계산식을 이용해서 산출하였다.

계산식:

그 결과를 표 15에 나타낸다.

[표 15]

반응 시간 (시간)	환원력 생성율 (%)
반응 시간 (시간)	C9 효소	C11 효소
0	0.0	0.0
1	0.0	0.1
2	0.1	0.0
4	0.1	0.1
8	0.0	0.0

표 15의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 말토테트라오스를 기질로서 작용시키면, 반응물의 환원력을 실질적으로 증가하지 않는 것, 즉, 이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 가수분해 작용을 나타내지 않거나 혹은 검출할 수 없을수록 약간인 것이 판명되었다.

실험 13: 덱스트란 생성시험

α-이소말토실글루코 당질생성 효소가 텍스트란 생성작용을 가지는가 아닌가를 조사하기 위해서, 『Bioscience Biotechnology and Biochemistry』, 제56권, 169 내지 173(1992년)에 기재한 방법에 준해서 시험을 하였다. 즉, 농도 1％의 말토테트라오스 수용액에 실험 4-2의 방법으로 얻은 C9주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 기질 고형물 1 그램당 0.25 단위 첨가하고, 35℃, pH 6.0에서 4시간 및 8시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 유지해서 반응을 정지하였다.

그 효소 반응액의 50㎕을 원심관에 넣고, 거기에 3배량의 에탄올을 가하여 충분히 교반한 후, 4℃에서 30분간 정치하였다. 이어서, 원심분리(15,000rpm, 5분간) 하고, 그 상청을 제거한 후, 1 ml의 75％의 에탄올을 가하여 교반하고 세정하였다.

다시 원심분리해서 그 상청을 제거하고, 진공 건조한 후, 1 ml의 탈이온수를 가하고 충분히 교반하였다. 그 액 중의 전체 당량(糖量)(글루코오스 환산)을 페놀 황산법으로 측정하고, 시험의 전체 당량(糖量)으로 하였다. 반응의 블랭크로서, 100℃에서 10분간 열처리하여 실활시킨 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 또는 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 사용해서 마찬가지로 하여 블랭크의 전체 당량으로 하였다. 덱스트란 생성량은 아래의 계산식으로 계산하였다.

계산식:

덱스트란 생성량(mg/ml) = [(시험의 전체 당량)-(블랭크의 전체 당량)] × 20

그 결과를 표 16에 나타낸다.

[표 16]

반응 시간 (시간)	생성 덱스트란 (mg/ml)
반응 시간 (시간)	C9 효소	C11 효소
4	0.0	0.0
8	0.0	0.0

표 16의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 말토테트라오스에 작용시켜도 덱스트란을 생성하지 않는 것, 즉, 이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 덱스트란 생성작용을 실질적으로 가지지 않거나, 그 생성량은 검출한계 이하인 것이 판명되었다.

실험 14: 전이 수용체 특이성

각종 당질을 사용하여 이 효소의 전이 수용체가 될 수 있는 것인가 아닌가의 시험을 하였다. 즉, D-글루코오스, D-크실로오스, L-크실로오스, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-만노오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, L-소르보오스, L-람노오스, 메틸―α-글루코시드, 메틸―β-글루코시드, N-아세틸-글루코사민, 소르비톨, α,α-트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 락토오스, 수크로오스, α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린의 용액을 조제하였다.

이들 수용체 용액(농도 1.6％)에, 당공여체로서 전분 부분 분해물 『파인덱스 #100』(농도 4％)를 가하고, 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품 또는 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 당공여체 고형물 1그램당 각각 1 단위씩 가하고, 이것을 30℃, pH 6.0에서 24시간 작용시켰다. 효소 반응 후의 반응액을, 수용체가 단당 또는 2당의 경우는 가스 크로마토그래피법(이하, 간단히 "GLC법"이라 함.)에 의하고, 수용체가 3당 이상의 경우는 HPLC법으로 분석하여, 각각의 당질이 이 효소의 전이 수용체가 되는가를 확인하였다.

또한, GLC에 있어서, GLC 장치는 『GC-16A』(일본국의 주식회사 島津제작소제), 칼럼은 지·엘·사이언스 주식회사제 『2％ 실리콘 OV-17/크로모조르브 W』를 충전한 스테인레스제 칼럼(3 mmΦ×2m), 캐리어 가스는 질소 가스를 유량 40 ml/분으로 160℃로부터 320℃까지 7.5℃／분의 속도로 승온하고, 검출은 수소염 이온화 검출기로 분석하였다.

HPLC에서는 HPLC 장치는 일본국의 Tosoh 주식회사제 『CCPD』, 칼럼은 『ODS-AQ-303』(주식회사 와이 에무 시사제), 용리액은 물을 유속 0.5 ml/분으로, 검출은 시차(示差) 굴절계로 분석하였다. 그 결과를 표 17에 나타낸다.

[표 17]

당 질	전이 생성물
당 질	C9 효소	C11 효소
D-글루코오스	+	+
D-크실로오스	++	++
L-크실로오스	++	++
D-갈락토오스	+	+
D-프룩토오스	+	+
D-만노오스	-	-
D-아라비노오스	±	±
D-푸코오스	+	+
L-소르보오스	+	+
L-람노오스	-	-
메틸―α-글루코시드	++	++
메틸―β-글루코시드	++	++
N-아세틸글루코사민	+	+
소르비톨	-	-
α,α-트레할로오스	++	++
이소말토오스	++	++
이소말토트리오스	++	++
셀로비오스	++	++
겐티비오스	++	++
말티톨	++	++
락토오스	++	++
수크로오스	++	++
α-시클로덱스트린	-	-
β-시클로덱스트린	-	-
γ-시클로덱스트린	-	-

표 중에서,

「-」은 수용체로의 당전이물이 검출되지 않은 것을 나타내고,

「±」은 수용체로의 당전이물이 검출되었지만, 그 생성량이 1％ 미만이었음을 나타내고,

「+」는 수용체로의 당전이물이 1 이상 10％ 미만이었음을 나타내고,

「++」은 수용체로의 당전이물이 10％ 이상이었음을 나타낸다.

표 17의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 전이 수용체로서 여러 가지 당질을 이용할 수 있고, 특히, D-/L-크실로오스, 메틸―α-글루코시드, 메틸―β-글루코시드, α,α-트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 락토오스 및 수크로오스에 잘 전이하고, 이어서, D-글루코오스, D-프룩토오스, D-푸코오스, L-소르보오스 및 N-아세틸-글루코사민에 전이하고, 더욱이는 D-아라비노오스에도 전이하는 것이 판명되었다.

이상에서 설명한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 성질에 대해서, 먼저 보고되어 있는 6-글루코실 전이작용을 가진 효소, 『Bioscience Biotechnology and Biochemistry』, 제56권, 제169 내지 173 페이지(1992년)에 기재한 덱스트린·덱스트라나아제 및 『일본 농예화학회지』, 제37권, 제668 내지 672 페이지(1963년)에 기재한 트란스글루코시다아제와 비교하였다. 그 결과를 표 18에 정리하였다.

[표 18]

성질	본 발명의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소		덱스트린·덱스트라나아제 (대조)	트란스글루코시다아제 (대조)
성질	C9 효소	C11 효소	덱스트린·덱스트라나아제 (대조)	트란스글루코시다아제 (대조)
가수분해 능력	가수분해 않음	가수분해 않음	가수분해 않음	주로 가수분해함
덱스트란 생성능력	생성하지 않음	생성하지 않음	생성함	생성하지 않음
최적 pH	6.0∼6.5	6.0	4.0∼4.2	3.5
EDTA에 의한 저해	저해됨	저해됨	저해되지 않음	저해되지 않음

표 18로부터 명확한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 기지의 덱스트린·덱스트라나아제나 트란스글루코시다아제와는 전혀 다른 신규의 이화학적 성질을 가지는 것이 판명되었다.

실험 15: 환상 4당의 생성

각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 작용에 의한 환상 4당 생성시험을 실시하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 아밀로오스, 가용성 전분, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제) 또는 글리코겐(굴 유래, 일본국의 和光純藥 주식회사 판매)의 용액을 조제하였다.

이들의 수용액(농도 0.5％)에, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1그램 당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1그램 당 10 단위를 가하고, 이들을 30℃, pH 6.0에서 작용시켰다. 작용 조건은 아래의 4가지의 계(系)에서 실시하였다.

(1) α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활하고, 계속하여 α-이소말토실 전이효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.

(2) α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.

(3) α-이소말토실글루코 당질생성 효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.

(4) α-이소말토실 전이효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.

이들 열실활시킨 반응액 중의 환상 4당의 생성량을 조사하기 위해서, 실험 1과 마찬가지의 α-글루코시다아제·글루코아밀라아제 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하여 HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다.

[표 19]

기 질	환상 4당 생성량 (%)
기 질	α-이소말토실글루코 당질 생성효소 작용후, α-이소말토실 전이효소를 작용	α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 작용	α-이소말토실 글루코 당질 생성효소만을 작용	α-이소말토실 전이효소만을 작용
말토오스	4.0	4.2	0.0	0.0
말토트리오스	10.2	12.4	0.0	0.0
말토테트라오스	11.3	21.5	0.0	0.0
말토펜타오스	10.5	37.8	0.0	0.0
아밀로오스	3.5	31.6	0.0	0.0
가용성 전분	5.1	38.2	0.0	0.0
전분 부분 분해물	6.8	63.7	0.0	0.0
글리코겐	10.2	86.9	0.0	0.0

표 19의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시험한 어느 쪽의 당질도 α-이소말토실글루코 당질생성 효소만의 작용 및 α-이소말토실 전이효소만의 작용에서는 환상 4당은 전혀 생성하지 않은 것에 대해서, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시 병용함으로써 환상 4당이 생성하였다. 그 생성량은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 작용시킨 후에 α-이소말토실 전이효소를 작용시켰을 경우에는 약 11％ 이하로서 비교적으로 낮은 것에 대해서, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 작용시키면 어느 쪽의 당질에서도 환상 4당의 생성량은 향상하고, 특히, 글리코겐에서는 약 87％로 증가하여 전분 부분 분해물에서는 약 64％로 증가하는 것이 판명되었다.

이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 동시 병용에 있어서의 환상 4당의 생성 메커니즘은 양쪽 효소의 반응 특성으로부터 아래와 같이 추측된다.

(1) α-이소말토실글루코 당질생성 효소는 글리코겐이나 전분 부분 분해물 등의 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기에 작용하여, 그 글루코오스기를 다른 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 6 위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인이 생성한다.

(2) α-이소말토실 전이효소는 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여, 그 이소말토실기를, 다른 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 3 위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인이 생성한다.

(3) 계속해서, α-이소말토실 전이효소는 그 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여, 분자 내 전이작용에 의해 이소말토실-1,3-이소말토실기를 α-1,4 글루칸 체인으로부터 떼어버리고 환상화해서 환상 4당이 생성한다.

(4) 떼어버려진 α-1,4 글루칸 체인은 다시 (1)로부터 (3)의 반응을 받음으로써 더욱 환상 4당이 생성한다.

α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 동시 병용으로, 상기한 바와 같이 양쪽 효소가 반복하여 작용해서 환상 4당의 생성량이 증가한다고 추측되었다.

실험 16: 전분액화 정도의 영향

옥수수 전분을 농도 15％ 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 첨가해서 pH 6.0으로 조정하고, α-아밀라아제[상품명 『터마밀 60L』(노보사제)]를 전분 1그램 당 0.2 내지 2.0％를 가하여 95℃에서 10분간 반응시킨 다음, 120℃에서 20분간 오토클레이브하고 약 35℃로 급냉하여 DE 3.2 내지 20.5의 액화 용액을 얻고, 여기에, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1그램 당 2 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1그램 당 20 단위를 가하고 35℃에서 24시간 반응시켰다. 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 계속해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 그 결과를 표 20에 나타낸다.

[표 20]

α-아밀라아제 사용량 전분 당(當) (%)	DE	환상 4당 생성율 (%)
0.2	3.2	54.5
0.4	4.8	50.5
0.6	7.8	44.1
1.0	12.5	39.8
1.5	17.3	34.4
2.0	20.5	30.8

표 20의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소에 의한 환상 4당의 생성은 전분의 액화의 정도에 의해 영향을 받고, 액화의 정도가 낮을수록, 즉, DE가 낮은 값 일수록, 전분으로부터의 환상 4당의 생성율은 높고, 반대로, 액화의 정도가 높을수록, 즉, DE가 높은 값 일수록, 전분으로부터의 환상 4당의 생성율이 낮은 것이 판명되었다. 구체적으로는 전분의 부분 분해의 정도는 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합하다는 것이 판명되었다.

실험 17: 전분 부분 분해물 농도의 영향

전분 부분 분해물 『파인덱스 #100』(DE 약 2 내지 5)의 최종농도 0.5 내지 40％의 수용액을 조제하고, 각각, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1그램 당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1그램 당 10 단위 가하고, 양(兩)효소를 동시 병용해서 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 계속해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 그것들의 그 결과를 표 21에 나타낸다.

[표 21]

파인덱스 농도 (%)	환상 4당 생성량(%)
0.5	63.6
2.5	62.0
5	60.4
10	57.3
15	54.6
20	51.3
30	45.9
40	39.5

표 21의 결과로부터 명백한 바와 같이, 전분 부분 분해물의 농도가 0.5％인 저농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 64％인 것에 대해, 농도 40％인 고농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 40％로서, 기질인 전분 부분 분해물의 농도에 의존해서 환상 4당의 생성량이 변화되는 것이 판명되었다. 이 결과로부터, 환상 4당의 생성량은 전분 부분 분해물이 저농도일 수록 높아지는 경향이 있는 것이 판명되었다.

실험 18: 시클로덱스트린글루카노트란스페라아제 첨가 효과

전분 부분 분해물 『파인덱스 #100』 수용액(농도 15％)을 조제하고, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1그램 당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 Cll주 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1그램 당 10 단위와, 바실루스 스테아로더어모필루스 유래의 시클로덱스트린글루카노트란스페라아제(CGTase)를 고형물 1그램당 0 내지 0.5 단위 가하고, 양(兩) 효소를 동시 병용해서 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 계속해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들의 결과를 표 22에 나타낸다.

[표 22]

CGTase 첨가량 (단위)	환상 4당 생성량 (%)
0	54.6
2.5	60.1
5	63.1
10	65.2

표 22의 결과로부터 명백한 바와 같이, CGTase를 첨가함으로써 환상 4당의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다.

실험 19: 환상 4당의 조제

옥수수 유래의 피토글리코겐(큐피 주식회사제)의 수용액(약 100 리터)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험 7-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 표품을 고형물 1그램 당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1그램 당 10 단위 가하고 48 시간 작용시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이 반응액의 일부를 취하고, HPLC에 의해서 환상 4당의 생성량을 조사한 결과, 당조성으로서 약 84％이었다. 이 반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해하고, 또한, 수산화 나트륨으로 pH를 5.8로 조정하여 온도 90℃에서 1시간 유지하고, 효소를 실활시켜 불용물을 여과하여 제거하였다. 이 여액을 역침투막을 사용해서 고형분 농도 약 16％까지 농축한 후, 통상적인 방법에 따라서 탈색, 탈염, 여과, 농축한 결과, 고형분 약 3,700g을 함유하는 당액 약 6.2 kg을 얻었다.

얻어진 당액을, 오르가노제 이온교환 수지 『앰버라이트 CR-1310 (Na형)』을 충전한 칼럼(겔량 약 225리터)에 사용하고, 칼럼 온도 60℃에서 유속 약 45 리터/h의 조건에서 크로마토 분리를 하였다. 용출액의 당조성을 실험 1에 기재한 HPLC법으로 모니터하여 환상 4당의 순도가 98％ 이상인 획분을 회수하고, 통상적인 방법에 따라서 탈염, 탈색, 여과, 농축한 결과, 고형분 약 2,500g을 함유하는 당액 약 7.5 kg을 얻었다. 얻어진 당액의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 약 99.5％ 이었다.

실험 20: 환상 4당의 수용액으로부터의 결정화

실험 19의 방법으로 얻어진 순도 약 98％ 이상의 환상 4당 획분을 에바포레이터에서 고형물 농도 약 50％로 농축한 후, 이 농축 당액 약 5kg을 원통상의 플라스틱 용기에 넣고, 완만하게 회전시키면서 약 20시간 동안 온도를 65℃로부터 20℃까지 강하시킴으로써 결정석출시킨 결과, 백색의 결정상 분말이 얻어졌다. 그 현미경 사진의 한가지 예를 도 25에 나타낸다. 계속해서, 원심 여과기를 이용해서 분밀(分蜜)하여 결정상물을 습중량으로서 1,360g을 회수하였다. 다시 60℃에서 3시간 건조해서 환상 4당 결정상 분말을 1,170g 얻었다. 얻어진 결정 분말의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 99.9％ 이상으로서 극히 고순도이었다.

이 환상 4당의 결정상 분말을 분말 X선 회절법으로 해석한 결과, 도 26에 나온 바와 같이, 주(主)회절각(2θ)으로서 10.1°, 15.2°, 20.3° 및 25.5°을 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 또한, 이 결정상 분말의 수분을 카알·피셔법으로 측정한 결과, 수분은 13.0％인 것이 확인되어, 환상 4당 1분자당 5 내지 6분자의 물을 함유하는 결정인 것이 판명되었다.

더욱이 이 환상 4당의 결정 분말을 열중량 측정한 결과, 도 27에 나온 열중량 곡선이 얻어지고, 그 중량변화와 온도의 관계로부터 온도 150℃까지의 상승에서 4 내지 5분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나고, 계속하여 온도 250℃ 부근에서 1분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나며, 또한, 온도 280℃ 부근에서 환상 4당 자체의 열분해로 생각되는 중량감소가 관찰되었다. 이들로부터, 5 내지 6함수 결정 환상 4당은 상압에서 온도를 150℃까지 상승시킴으로써 결정 분자당 4 내지 5분자의 물이 이탈해서 1분자의 물을 함유하는 결정이 되고, 더욱이 온도 250℃까지에서 1분자의 물이 결정에서 이탈해서 무수 결정으로 되는 것이 판명되었다.

실험 21: 1함수 결정 환상 4당으로의 변환

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당 분말을 유리 용기에 넣고, 미리 온도 140℃로 보온한 오일 바드(oil bath)중에서 그 유리 용기를 30분간 유지하였다. 얻어진 환상 4당 분말을 분말 X선 회절법으로 해석한 결과, 열처리 전의 5 내지 6함수 결정의 분말 X선 회절과는 전혀 다르고, 도 28에 나온 바와 같이, 주(主)회절각(2θ)으로서, 8.3°, 16.6°, 17.0° 및 18.2°를 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 또한, 이 결정상 분말의 수분을 카알·피셔법으로 측정한 결과, 수분이 약 2.7％인 것으로 확인되어, 환상 4당 1분자당 1분자의 물을 함유하는 것이 판명되었다. 더욱이 이 결정 분말을 열중량 측정한 결과, 도 29에 나온 열중량 곡선이 얻어지고, 그 중량변화와 온도의 관계로부터, 온도 270℃ 부근에서 1분자의 물에 상당하는 중량감소가 나타나고, 또한, 온도 290℃ 부근에서 환상 4당 자체의 열분해로 생각되는 중량감소가 관찰되었다. 이들로부터, 이 환상 4당 결정 상물은 1함수 결정인 것이 판명되었다.

실험 22: 무수 결정으로의 변환

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당 분말을 온도 40℃ 내지 120℃에서 각각 16시간 진공 건조하였다. 얻어진 환상 4당 분말의 수분을 카알·피셔법으로 측정한 결과, 진공 건조 온도 40℃의 경우는 수분이 약 4.2％이며, 진공 건조 온도 120℃의 경우는 수분이 약 0.2％로서, 실질적으로 무수인 것이 판명되었다. 이들 진공 건조한 환상 4당 분말을 분말 X선 회절법으로 해석한 결과, 진공 건조 전의 5 내지 6함수 결정의 분말 X선 회절 및 1함수 결정의 것과는 전혀 다르고, 도 30(진공 건조 온도 40℃), 도 31(진공 건조 온도 120℃)에 나온 바와 같이, 주(主)회절각(2θ)으로서, 10.8°, 14.7°, 15.0°, 15.7° 및 21.5°를 특징으로 하는 회절 스펙트럼이 얻어졌다. 이들 두 가지 회절 스펙트럼 사이에서의 피이크 강도의 강약은 나타나지만, 기본적으로 피이크의 회절각도는 동일하므로, 결정학적으로 동일 무수 결정이라고 추측되었다. 또한, 회절 스펙트럼의 베이스 라인은 산 모양을 나타내고, 진공 건조 전의 5 내지 6함수 결정 환상 4당의 것 및 1함수 결정의 것과 비교해서 결정화도가 저하하고 있어, 비결정 상태의 환상 4당이 존재하고 있는 것이 판명되었다. 이로부터, 진공 건조 40℃의 경우의 수분을 약 4.2％ 함유하는 환상 4당 분말은 그 수분을 함유하는 무수 비정질 환상 4당과 무수 결정 환상 4당이 혼재하는 분말이라고 추측되었다.

이상으로부터, 5 내지 6함수 결정 환상 4당 분말을 진공 건조함으로써, 5 내지 6함수 결정은 물분자를 잃어버리고, 무수 비정질과 무수 결정으로 변환하는 것을 알았다. 또한, 수분 0.2％의 무수 결정 환상 4당 분말에 대해서 실험 20과 마찬가지로 열중량 분석한 결과, 도 32에 나온 바와 같이 온도 270℃ 부근에서 환상 4당의 열분해로 생각되는 중량감소만이 관찰되었다.

실험 23: 환상 4당의 물에 대한 포화농도

온도 10 내지 90℃에서의 물에 대한 환상 4당의 포화농도를 조사하기 위해서, 밀봉마개 첨부 유리제 용기에 물 10 ml을 넣고, 거기에 실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 각 온도에서 완전히 용해하는 양 이상의 양을 가한 후, 유리 용기를 밀봉하고, 포화에 달할 때까지 온도 10 내지 90℃에서 보온하면서 2일간 교반하였다. 각각의 온도의 환상 4당 포화용액을 정밀여과해서 용해하지 않고 있는 환상 4당을 제거한 후, 그 여액의 수분을 건조 감량법으로 조사하여 각 온도에서의 포화농도를 구하였다. 그 결과를 표 23에 나타낸다.

[표 23]

온도 (℃)	포화 농도 (%)
10	30.3
30	34.2
50	42.6
70	53.0
90	70.5

실험 24: 열안정성

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 물에 용해하여 농도 10w/v％의 환상 4당 수용액을 조제하고, 그 용액 8 ml을 유리제 시험관에 넣고 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 방냉 후, 이들 용액의 착색도의 측정과 HPLC법에 의한 순도측정을 실시하였다. 착색도는 480nm에서의 1cm 셀에 있어서의 흡광도에 의해 평가하였다. 그 결과를 표 24에 나타낸다.

[표 24]

가열 시간 (분)	착색도 (A480nm)	순도 (%)
0	0.00	100
30	0.00	100
60	0.00	100
90	0.00	100

표 24의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당 수용액은 120℃의 고온가열에서도 착색은 없고, 당조성의 순도 저하도 없어 환상 4당은 열에 대하여 안정한 당질인 것이 판명되었다.

실험 25: pH 안정성

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 각종의 완충액(20 mM)에 용해하고, 환상 4당을 농도 4w/v％, pH 2 내지 10으로 조정한 환상 4당 용액을 조제하였다. 각각의 용액 8 ml을 유리제 시험관에 넣고 밀봉한 후, 100℃에서 24시간 가열하였다. 방냉 후, 이들 용액의 착색도의 측정과 HPLC법에 의한 순도측정을 실시하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도에 의해 평가하였다. 그 결과를 표 25에 나타낸다.

[표 25]

pH (완충액의 종류)	착색도(A_480nm)	순도 (%)
2.0 (아세트산)	0.00	93
3.0 (아세트산)	0.00	100
4.0 (아세트산)	0.00	100
5.0 (아세트산)	0.00	100
6.0 (트리스-염산)	0.00	100
7.0 (트리스-염산)	0.00	100
8.0 (트리스-염산)	0.00	100
9.0 (암모늄)	0.00	100
10.0 (암모늄)	0.00	100

표 25의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당 수용액은 120℃의 고온에서 24시간 가열해도 pH 2 내지 10의 넓은 범위에서 착색은 없고, pH 2에서 당조성의 순도는 약간 저하하지만, pH 3 내지 10의 범위에서는 전혀 당조성의 순도는 저하하지 않아, 환상 4당은 넓은 pH 범위, 바꾸어 말하면, pH 3 내지 5의 산성쪽, pH 6 내지 8의 중성쪽, pH 9 내지 10의 알칼리쪽에서 펄펄 끓여도 극히 안정한 당질인 것이 판명되었다.

실험 26: 아미노카르보닐 반응

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 물에 용해하고, 또한, 거기에 시판 시약 특급의 글리신과 인산 완충액을 가하고, 50 mM 인산 완충액으로 pH 7.0으로 조정한 1w/v％ 글리신을 함유하는 10w/v％ 환상 4당 용액을 조제하였다. 그 용액 4 ml을 유리제 시험관에 넣고 밀봉한 후, 100℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 실내에서 방냉 후, 이들의 착색도를 측정하여 아미노카르보닐 반응성을 조사하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도에 의해 평가하였다. 그 결과를 표 26에 나타낸다.

[표 26]

가열 시간 (분)	착색도(A_480nm)
0	0.00
30	0.00
60	0.00
90	0.00

표 26의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 글리신 공존하에서 가열해도 착색은 없고, 글리신과의 갈변을 발생시키지 않는 것, 바꾸어 말하면, 아미노카르보닐 반응(메일라아드 반응이라고도 한다)을 일으키기 어려운 안정한 당질인 것이 판명되었다.

실험 27: 아미노카르보닐 반응

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당과 시판 폴리펩톤(일본제약제)을 탈이온수에 용해하여 5w/v％ 폴리펩톤을 함유하는 10w/v％ 환상 4당 용액을 조제하였다. 이 용액 4 ml을 유리제 시험관에 넣고 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 실내에서 방냉 후, 그것들의 착색도를 측정하여 아미노카르보닐 반응성을 조사하였다. 동시에, 폴리펩톤만을 함유하는 용액을 블랭크로 하여 마찬가지로 가열하였다. 착색도는 480nm에 있어서의 1cm 셀에서의 흡광도로부터 블랭크의 흡광도를 뺀 값에 근거해서 평가하였다. 그 결과를 표 27에 나타낸다.

[표 27]

가열 시간 (분)	착색도(A_480nm)
0	0.00
30	0.00
60	0.00
90	0.00

표 27의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 폴리펩톤 공존하에서 가열하여도 폴리펩톤과의 갈변을 발생시키지 않는 것, 바꾸어 말하면, 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려운 안정한 당질인 것이 판명되었다.

실험 28: 포접작용

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 탈이온수에 용해하여 20％ 수용액을 조제하였다. 이 수용액 100 g 당, 메탄올은 2 g, 에탄올은 3 g, 아세트산은 4.6 g을 가해서 포접을 하였다. 그 후, 각각을 여과하고, 여액을 동결건조하여 미포접물(未包接物)을 제거하였다. 대조로서, 포접 능력을 가진 것으로 알려져 있는 분지(分枝) 시클로덱스트린(상품명 『이소엘리트 P』, 일본국의 마루하 주식회사 판매)을 사용해서 마찬가지로 하였다.

동결 건조 분말 중의 포접물의 양을 측정하기 위해서, 각각의 동결건조 분말 1g을 5 ml의 물에 용해하여, 거기에 5 ml의 디에틸 에테르를 가해서 추출을 하고, 다시, 추출을 반복한 후, 디에틸 에테르 중의 추출물을 가스 크로마토그래피법으로 정량하였다. 그 결과를 표 28에 나타낸다.

[표 28]

포접물	포접량 (mg/g-동결건조 분말)
포접물	환상 4당	이소엘리트 P (대조)
메탄올	6.71	2.92
에탄올	17.26	8.92
아세트산	67.74	30.57

표 28의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 포접 능력을 가지고 있고, 그 포접 능력은 분지 시클로덱스트린에 비해 중량당 약 2배나 높은 것이 판명되었다.

실험 29: 감미도

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 탈이온수에 용해하여 고형물 농도 10％ 수용액을 조제하고, 이 환상 4당 10％ 수용액을 기준으로 해서 수크로오스(시판 그래뉼라당)의 농도를 변경하여, 패널리스트 5명에 의해 관능시험을 하였다. 그 결과, 환상 4당의 감미도는 수크로오스의 약 20％이었다.

실험 30: 소화성 시험

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 사용하고, 『일본 영양식량학회지』, 제43권, 제23 내지 29 페이지(1990년)에 기재한 오카다 등의 방법에 준하여, 시험관 내에서의 타액 아밀라아제, 합성 위액, 췌액 아밀라아제, 소장점막 효소에 의한 환상 4당의 소화성을 조사하였다. 대조로서, 난(難)소화성 당질로 알려져 있는 말티톨을 사용해서 실시하였다. 그 결과를 표 29에 나타낸다.

[표 29]

소화 효소	소화효소에 의한 분해율 (%)
소화 효소	환상 4당	말티톨 (대조)
타액 아밀라아제	0.0	0.0
합성 위액	0.0	0.0
췌액 아밀라아제	0.0	0.0
소장점막 효소	0.74	4.0

표 29의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 타액 아밀라아제, 합성 위액, 췌액 아밀라아제에 의해 전혀 소화되지 않고, 소장점막 효소에 의해 간신히 소화되었지만, 그 정도는 0.74％로서 낮은 값이며, 대조인 난(難)소화성 당질 말티톨의 값과 비교하면 1/5 이하이어서, 환상 4당이 극히 소화되기 어려운 당질인 것이 판명되었다.

실험 31: 발효성 시험

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 사용하고, 『Journal of Nutritional Science and Vitamino1ogy』, 제37권, 제529 내지 544 페이지(1991년)에 기재한 Oku 등의 방법에 준하여 래트 맹장 내용물에 의한 환상 4당의 발효성을 조사하였다. 맹장 내용물은 위스타계 수컷 래트를 에테르 마취하에 도살하여 혐기적으로 채취하여 4배량의 0.1 M 탄산수소 나트륨 수용액에 현탁한 것을 사용하였다.

환상 4당은 맹장 내용물 중량 당 약 7％을 첨가하고, 첨가 직후 및 12시간 후에 잔존하는 환상 4당량을 가스 크로마토그래피법으로 정량하였다.

그 결과, 첨가 직후의 환상 4당 농도는 맹장 내용물 g 당 68.O mg, 12시간후의 환상 4당 농도는 맹장 내용물 g 당 63.0 mg이며, 93％가 발효되지 않고 잔존하고 있는 것이 확인되어, 환상 4당은 극히 발효되기 어려운 당질인 것이 판명되었다.

실험 32: 자화성(資花性) 시험

실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 사용하고, 『장내 플로라와 식물(食物)인자』, 光岡知足편, 학회출판 센터(1984년)에 기재한 방법에 준하여 각종 장내 세균의 자화성을 조사하였다. 즉, 미리 배양해 둔 신선한 균을, 환상 4당을 0.5％ 첨가한 PYF배지 5 ml에 약 10⁷ CFU 접종하고, 혐기 조건하에서 37℃에서 4일간 배양하였다. 대조로서, 자화되기 쉬운 당질 글루코오스를 사용해서 하였다. 자화성의 판정은, 배양 후의 배양액의 pH가 6.0 이상인 경우는 자화되지 않음(-)으로 하고, 6.0 미만인 경우는 자화됨(+)으로 하였다. 또한, 배양액 중에 잔존하는 당질을 안트론법으로 측정하여 당질의 감소량을 조사하여 자화성의 판정을 확인하였다. 그 결과를 표 30에 나타낸다.

[표 30]

장내 세균주	자화성
장내 세균주	환상 4당	글루코오스(대조)
Bacteroides vulgatus JCM5826	-	+
Bifidobacterium adolescentis JCM1275	-	+
Clostridium perfringens JCM3816	-	+
Escherichia coli IFO3301	-	+
Eubacterium aerofaciens ATCC25986	-	+
Lactobacillus acidophilus JCM1132	-	+

표 30의 결과로부터 명백한 바와 같이, 환상 4당은 시험한 장내 세균주의 어느 것에 의해서도 자화되지 않고, 대조인 글루코오스는 어느 것에 의해서도 자화되는 것이 확인되어, 환상 4당이 장내 세균에 의해 극히 자화되기 어려운 당질인 것이 판명되었다.

실험 33: 급성 독성시험

마우스를 사용하고, 실험 20의 방법으로 얻어지는 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 경구투여하여 급성 독성시험을 하였다. 그 결과, 환상 4당은 저독성의 물질로서 투여가능한 최대 투여량에 있어서도 사망예는 나타나지 않았다. 따라서, 정확한 값이라고는 말할 수 없지만, 그 LD50값은 50 g/kg 마우스 체중 이상이었다.

이상의 실험 30 내지 33의 결과로부터, 환상 4당은 경구섭취해도, 소화, 흡수되기 어렵고, 무칼로리 내지 저칼로리의 가식(加食)소재로 하여 다이어트 감미료, 고감미도 감미료의 부형제, 다이어트 음식물의 증점제, 증량제, 부형제, 더욱이는 식물(植物)섬유, 지방대체 식품재료 등으로서의 이용을 기대할 수 있다.

실험 34: 비환원성 당질에 의한 탈수량의 크기와 탈수 물품의 분말화의 비교 실험
실험에 사용한 비환원성 당질은 무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당, 무수 비정질 환상 4당, 5 내지 6함수 결정 환상 4당, 무수 결정 α,α-트레할로오스, 무수 비정질 α,α-트레할로오스 및 2함수 결정 α,α-트레할로오스이다. 5 내지 6함수 결정 환상 4당은 실험 20의 방법으로 조제하였다. 무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당은 각각 실시예 A-1, 실시예 A-2 및 실시예 A-3의 방법으로 조제하였다. 2함수 결정 α,α-트레할로오스는 시판의 것(상품명 『Treha』, 일본국의 주식회사 林原상사 판매)을 사용하였다. 무수 결정 α,α-트레할로오스 및 무수 비정질 α,α-트레할로오스는 시판의 2함수 결정 α,α-트레할로오스로부터 일본국 특개평6-170221호 공보의 참고예 1 및 참고예 3에 개시된 방법으로 조제하였다.

수분함량 약 77％의 플레인 요구르트 4 중량부에, 상기의 당질을 각각 11 내지 16 중량부를 혼합해서 얻어지는 혼합물을 바트(vat)에 넣고 25℃에서 실내에서 24시간 정치(靜置)한 후에 그 혼합물의 상태변화를 관찰하였다.

그 판정은, 충분히 탈수해서 고화하고, 이것을 절삭기에서 분말화가 용이할 경우를 ○, 탈수가 다소 불충분하고, 고화했지만 절삭기에 의한 분말화가 곤란할 경우를 △, 탈수가 불충분하고 고화하지 않았기 때문에 절삭기에서 분말화할 수 없었을 경우를 ×로 하였다. 그 결과를 표 31에 나타낸다.

[표 31]

당질	수분함량 (사용 전)	플레인 요구르트(수분 함량 약 77%) 4 중량부에 대한 당질의 중량부
당질	수분함량 (사용 전)	11 중량부	12 중량부	13 중량부	14 중량부	15 중량부	16 중량부
무수결정 환상 4당	0.2%	×	△	○	○	○	○
1함수결정 환상 4당	2.7%	×	×	×	△	○	○
무수 비정질 환상 4당	0.3%	×	△	○	○	○	○
5 내지 6 함수결정 환상 4당	13.0%	×	×	×	×	×	×
무수결정 α,α-트레할로오스	0.3%	×	×	×	×	△	○
무수 비정질 α,α-트레할로오스	0.8%	×	×	×	×	△	○
2함수 결정 α,α-트레할로오스	9.7%	×	×	×	×	×	×

표 31의 결과로부터, 무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당은 무수 결정 α,α-트레할로오스, 무수 비정질 α,α-트레할로오스 보다도 적은 중량부에서 고화할 수 있고, 절삭기에 의한 분말화가 용이한 것이 판명되었다. 또한, 얻어지는 분말의 성상도 우수하였다.

이 결과로부터, 무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당은 탈수 능력을 가진 환상 4당이어서 탈수제로서 적합하고, 특히, 무수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당이 탈수 능력이 우수한 것이 판명되었다.

실험 35: 탈수 능력을 가진 환상 4당에 의한 탈수 작용

무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당, 무수 비정질 환상 4당 및 5 내지 6함수 결정 환상 4당의 탈수 작용, 구체적으로는 당질에 대한 흡수량(吸水量)과 그 경시 변화에 대해서 상세히 실험하였다. 비교 실험으로는 당질로서 무수 결정 α,α-트레할로오스, 무수 비정질 α,α-트레할로오스 및 2함수 결정 트레할로오스를 사용하였다. 실험은, 실험 34에서 설명한 방법으로 조제한 각각의 환상 4당 및 α,α-트레할로오스를 선별해서 입경 약 100 내지 150㎛의 분말품으로 하여 지름 5 cm 의 플라스틱 샤알레에 각각 1g 씩 취하고, 상대습도 60％ 또는 75％로 조정된 데시케이터 속에 넣어 25℃의 분위기에서 1주간 방치하고, 당질 중에 함유되는 수분(％)을 경시적으로 카알·피셔법으로 측정하였다. 그 결과를 표 32에 나타낸다.

[표 32]

당 질	처리시의 상대습도 (%)	경과 일수
당 질	처리시의 상대습도 (%)	0	1	2	3	7
무수 결정 환상 4당	60	0.2	10.2	10.3	10.3	10.4
무수 결정 환상 4당	75	0.2	13.9	14.4	14.4	14.3
1함수 결정 환상 4당	60	2.7	2.7	2.8	2.8	2.9
1함수 결정 환상 4당	75	2.7	14.0	14.0	14.1	14.1
무수 비정질 환상 4당	60	0.3	13.7	13.8	13.9	14.1
무수 비정질 환상 4당	75	0.3	14.2	13.6	13.7	13.7
5 내지 6함수 결정 환상 4당	60	13.0	13.1	13.1	13.1	13.2
5 내지 6함수 결정 환상 4당	75	13.0	13.1	13.1	13.1	13.1
무수 결정 α,α-트레할로오스	60	-	-	-	-	-
무수 결정 α,α-트레할로오스	75	0.3	9.7	9.6	9.8	9.8
무수 비정질 α,α-트레할로오스	60	-	-	-	-	-
무수 비정질 α,α-트레할로오스	75	0.8	9.8	9.7	9.8	9.7
2함수 결정 트레할로오스	60	-	-	-	-	-
2함수 결정 트레할로오스	75	9.7	9.7	9.7	9.8	9.8

- : 시험않음.

표 32의 결과로부터, 상대습도 60％로 방치했을 경우, 1함수 결정 환상 4당 및 5 내지 6함수 결정 환상 4당은 1주간 방치한 후에도 거의 흡수는 나타나지 않았지만, 무수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당은 1일째에서 거의 흡수량이 포화에 달하였다. 흡수량은, 무수 결정 환상 4당에서는 그 중량의 약 10％인 것에 대해서, 무수 비정질 환상 4당에서는 그 중량의 약 14％의 값을 나타내었다.

1 주간 방치한 후의 각 시료를 분말 X선 회절법으로 해석한 결과, 주(主)회절각은 각각 방치 전의 시료와 동일한 회절 패턴을 나타내고, 결정형에 변화는 나타나지 않았다. 상대습도가 60％ 이하에서는 수분은 흡수하지만, 결정수로 하여 흡수하는 것이 아닌 것이 명백해졌다.

한편, 상대습도 75％에서 방치했을 경우, 무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당은 무수 결정 α,α-트레할로오스 및 무수 비정질 α,α-트레할로오스와 마찬가지로 방치 후 1일에서 거의 흡수량이 포화에 달하였다. 이 경우의 흡수량은 어느 환상 4당이라도 그 중량의 약 14％인 것에 대해, α,α-트레할로오스는 그 중량의 10％약(弱)이므로, 환상 4당 쪽이 탈수 능력으로서는 우수하다는 것이 판명되었다. 또한, 어느 시료라도 분말상태를 유지하고, 흡습에 의해 끈적거리거나, 흐르거나 하는 현상은 나타내지 않았다. 더욱이 1주간 방치 후의 무수 결정 환상 4당, 1함수 결정 환상 4당 및 무수 비정질 환상 4당은, 분말 X선 회절법으로 해석한 결과, 주(主)회절각은 각각 방치 전의 시료와 다른 회절 패턴을 나타내고, 모두 5 내지 6함수 결정 환상 4당의 회절 패턴에 일치하였다. 이로부터, 상대습도가 75％ 이상에서는 수분은 결정수로서 흡수하여 5 내지 6함수 결정으로 변환하고 있는 것이 명확해졌다.

상기한 바와 같이 우수한 탈수 능력을 가진 본 발명의 환상 4당은 식품, 의약품, 화장품, 이들 원재료 또는 가공 중간물 등의 함수물의 강력한 탈수제로서 유리하게 이용할 수 있는 것이 판명되었다.

실험 36: 호화 전분의 미생물 오염에 대한 무수 결정 환상 4당과 5 내지 6함수 결정 환상 4당의 효과의 비교

떡 가루 4 중량부를 물 6 중량부에 풀고, 젖은 포(布)를 깐 나무틀에 부어 넣고, 이것을 105℃에서 10분간 쪄서 호화(糊化) 전분으로 한다. 여기에 실험 20의 방법으로 조제한 5 내지 6함수 결정 환상 4당 또는 실시예 A-1의 방법으로 조제한 무수 결정 환상 4당 6 중량부를 믹서로 혼화하여 균일히 한 후에, 물엿 2 중량부를 가해 충분히 혼합하여 성형하고, 40℃의 온풍에서 2시간 가볍게 건조해서 규히(求肥)를 얻었다.

이 제품을 25℃의 실온에 개방해서 방치한 결과, 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 사용한 것은 15일 후에 검은 곰팡이의 콜로니의 발생을 나타내었지만, 무수 결정 환상 4당을 사용한 것은 30일 후에도 미생물의 오염이 나타나지 않았다.

그리고 30일 후의 것을 절단하고 그 단면을 관찰한 결과, 무수 결정 환상 4당을 사용한 것은 표층부가 다소 경화해서 결정이 석출해 있지만, 내부는 제조 직후와 마찬가지로 반투명해서 적당한 윤기, 점도를 가지고 있었다. 더욱이 표층부의 결정은 X선 회절 도형으로부터, 무수 결정 환상 4당이 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환하고 있는 것이 판명되었다.

이 결과, 탈수 능력을 가진 환상 4당은 호화 전분의 탈수제로서 작용하고, 미생물 오염을 방지하며, 더욱이 호화 전분의 노화를 방지하는 것이 판명되었다. 이 성질은 규히, 플라워 페이스트 등의 호화 전분을 이용하는 각종 제품에 대하여 유리하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 탈수 능력을 가진 환상 4당을 실시예 A에서, 그리고 그 용도를 실시예 B에서 구체적으로 설명한다.

실시예 A-1: 무수 결정 환상 4당의 제조 방법

바실루스 글로비스포루스 Cll(FERM BP-7144)을 실험 6의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양 후, SF 막(膜)을 이용해서 제균(除菌) 여과하여 약 18 리터의 배양 여액을 회수하고, 그 여액을 UF 막 농축하여 α-이소말토실글루코 당질생성 효소를 9.0 단위/ml과 α-이소말토실 전이효소를 30.2 단위/ml를 함유하는 농축 효소액 약 1 리터를 회수하였다.

타피오카 전분을 농도 약 25％ 전분유로 하고, 여기에 α-아밀라아제(상품명 『네오스비타아제』, 일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사제)를 전분 고형물 그램 당 0.2％ 가하고, 85 내지 90℃에서 약 20분간 반응시킨 다음 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 다시 약 35℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 상기의 방법으로 조제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 고형물 1그램 당 0.25 ml의 비율이 되도록 가하고, 또한 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)를 전분 고형물 1그램 당 10 단위가 되도록 가하여, pH 6.0, 온도 35℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 조정한 후, α-글루코시다아제제(劑)(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 주식회사제)를 고형물 1그램 당 300 단위 가하여 24시간 반응시키고, 더욱이 글루코아밀라아제제(劑)(상품명 『글리코치무』, 일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사제)를 고형물 1그램 당 30 단위 가하여 17시간 반응시켜, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어지는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 60％의 환상 4당 함유 시럽을 원료전분 고형물 당 수율 약 90％로 얻었다.

이 환상 4당 함유 시럽을 실험 19에 기재한 방법에 따라, 강산성 캐타이온 교환 수지(상품명 『앰버라이트 CR-1310(Na형)』, 오르가노 주식회사제)를 충전한 칼럼(겔량 225 리터)에 사용하고, 칼럼 온도를 60℃로 유지하면서, 유속 약 45 리터/h의 조건으로 크로마토 분리를 실시하였다. 용출액의 당조성을 실험 1에 기재한 HPLC법으로 모니터하여 환상 4당 고함유 획분을 채취하고, 정제하여 환상 4당 고함유액을 원료전분 고형물 당 수율 약 21％로 얻었다. 이 고함유액은 고형물당 약 98％의 환상 4당을 함유하고 있었다.

이 용액을 농도 약 90％로 농축한 후, 조정관(助晶罐)에 넣고, 종자결정으로서 무수 결정 환상 4당 약 2％을 첨가하고, 120℃에서 16시간 유지하면서 진공 건조하여 수분 약 0.2％의 무수 결정 환상 4당 분말을 얻었다.

이 제품은 강력한 탈수 능력을 가지고, 탈수제로서 함수물, 예를 들면 식품, 화학품, 의약품 또는 그 원료, 중간품 등의 함수물의 탈수 방법에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-2: 1함수 결정 환상 4당의 제조 방법

옥수수 전분을 농도 약 20％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1％을 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『터마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램 당 0.3 중량％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시킨 다음 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 다시 약 35℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 고형물 1그램 당 0.25 ml의 비율이 되도록 첨가하고, 더욱이 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)를 전분 고형물 1그램 당 10 단위가 되도록 가하여 pH 6.0, 온도 35℃에서 48시간 반응시켰다.

그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 조정한 다음에, α-글루코시다아제제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」, 일본국의 天野제약 주식회사 제조)를 고형물 1그램 당 300 단위 가하여 24시간 반응시키고, 더욱이 글루코아밀라아제제(상품명 『글리코치무』, 일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사제)를 고형물 1그램 당 30 단위 가하고 17시간 반응시켜, 그 반응액을 95℃로 가열해서 30분간 유지한 후 냉각하고, 여과해서 얻어지는 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 60％의 환상 4당 함유 시럽을 원료전분 고형물 당 수율 약 90％로 얻었다. 실시예 A-1에 기재한 방법에 따라서 크로마토 분리하여 환상 4당의 순도가 98％ 이상인 획분을 회수하였다.

이것을 실험 20의 방법에 따라, 에바포레이터에서 고형물 농도 약 50％로 농축한 후, 이 농축 당액 약 5 kg을 원통상의 플라스틱 용기에 넣고, 온화하게 회전시키면서 약 20시간 동안 온도를 65℃로부터 20℃까지 강하시킴으로써 결정석출시킨 결과, 5 내지 6함수 결정 환상 4당 분말이 얻어졌다. 이것을 유리 용기에 넣고, 미리 온도 140℃로 보온한 오일 바드(oil bath) 중에서 그 유리 용기를 30분간 유지하였다. 얻어진 건조물을 분쇄기에서 분쇄하여 수분 약 2.7％의 1함수 결정 환상 4당 분말을 얻었다.

실시예 A-3: 무수 비정질 환상 4당의 제조 방법

실시예 A-1에 기재한 방법에 따라서 얻어진 환상 4당의 순도가 98％ 이상인 획분을 통상적인 방법에 따라서 탈염, 탈색, 여과한 후, 그 농도를 50％로 하였다. 이것을 -80℃에서 급속히 동결한 후, 그 동결물을 동결 진공건조를 하고, 더욱이 80℃에서 3시간 진공건조하여 얻어진 건조물을 분쇄기에서 분쇄하여 수분 약 0.3％의 무수 비정질 환상 4당 분말을 얻었다. 이 X선 회절 도형을 도 33에 나타낸다.

이 제품은 강력한 탈수 능력을 가지고, 탈수제로서, 함수물 예를 들면 식품, 화학품, 의약품 또는 그 원료, 중간품 등의 함수물의 탈수 방법에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-4: 파노오스로부터 무수 결정 환상 4당의 제조 방법

전분으로부터 제조된 파노오스(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조)의 수용액(약 100 리터)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험 7의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 파노오스 1그램 당 2 단위 가하고 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시켰다.

이 반응액의 일부를 취하여 HPLC에 의해서 환상 4당 생성량을 조사한 결과, 당 조성으로서 약 44％이었다. 이 반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 주식회사제)를 고형물 1그램 당 1500 단위를 첨가하고, 또한 글루코아밀라아제제(상품명 『글리코치무』, 일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사제)를 고형물 1그램 당 75 단위를 첨가하여 24시간 반응시켜 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해하고, 또한 수산화 나트륨으로 pH 5.8로 조정하여 90℃에서 1시간 유지해서 효소를 실활시킨 후, 불용물을 여과해서 제거하였다. 이 여액을 역침투막을 이용해서 고형분 농도 약 16％까지 농축한 후, 통상적인 방법에 따라서 탈색, 탈염, 여과, 농축한 결과, 고형분 약 3,650g을 함유하는 당액 약 6.1kg을 얻었다.

얻어진 당액을 실시예 A-1에 기재한 방법에 따라서 크로마토 분리하여 환상 4당의 순도가 98％ 이상인 획분을 회수하고, 통상적인 방법에 따라서 탈색, 탈염, 여과, 농축한 결과, 고형분 약 1,000g을 함유하는 당액 약 3 kg을 얻었다. 얻어진 당액의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 약 99.2％이었다. 얻어진 환상 4당 수용액을 에바포레이터에서 농도 약 50％로 농축한 후, 얻어진 농축 당액 약 2 kg을 원통상의 플라스틱 용기에 넣고, 완만하게 회전시키면서 약 20시간 동안 온도를 65℃에서 20℃까지 내려서 결정석출시켜, 건조하여 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 얻었다. 얻어진 5 내지 6함수 결정 환상 4당을 다시 온도 120℃에서 16시간 진공 건조하여 수분 약 0.2％의 무수 결정 환상 4당을 얻었다.

이 제품은 강력한 탈수 능력을 가지고 있어, 탈수제로서, 함수물 예를 들면 식품, 화학품, 의약품 또는 그 원료, 중간품 등의 함수물의 탈수 방법에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-1: 탈수제

실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말을 사용하고, 종이로 된 투습성 봉지에 15g 씩 충전하여 탈수제를 제조하였다.

이 제품은 맛 김, 쿠키 등의 건조식품을 봉입한 방습용기 내 분위기의 탈수제로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 각종 건조식품, 유성(油性)식품 등에 대하여 이 탈수제와 함께 탈산소제 등을 병용하여 이들 식품들을 안정하게 보존하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

실시예 B-2: 탈수제 첨가 설탕

설탕 50 중량부에 실시예 A-4의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 1 중량부를 첨가하고, 고속회전 믹서로 혼합해서 얻은 혼합물을 각각 1kg 씩 폴리에틸렌 자루에 넣고, 탈기 후 폴리에틸렌 자루의 입구를 가열 시일해서 밀봉하여 탈수제 첨가 설탕을 제조하였다.

이 제품은 본 발명의 탈수제가 설탕의 미세결정 표면의 수분을 흡수하여 설탕의 고착 및 고결을 방지하므로 안정하게 보존된다. 또한, 이 제품은 조미료로서 각종 조리, 가공 식품의 제조 등에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-3: 탈수제 첨가 식염

식염 100 중량부에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 1 중량부를 첨가하고, 고속회전 믹서로 혼합해서 얻은 혼합물을 각각 1kg 씩 폴리에틸렌 자루에 넣고, 탈기 후 폴리에틸렌 자루의 입구를 가열 시일해서 밀봉하여 탈수제 첨가 식염을 제조하였다.

이 제품은 본 발명의 탈수제가 식염의 미세결정 표면의 수분을 흡수하여 식염의 고착 및 고결을 방지하므로 안정하게 보존된다. 또한, 이 제품은 조미료로서 각종 조리, 가공 식품의 제조 등에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-4: 쪄서 으깨어 말린 규히

떡 가루 4 중량부를 물 6 중량부에서 풀고, 젖은 포(布)를 깐 나무틀에 부어 넣고, 이것을 100℃에서 20분간 찐 후, 실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 6 중량부 및 설탕 1 중량부를 혼합한 다음, 물엿 2 중량부를 가해서 충분히 혼합한 후에 성형하고, 실내에서 16시간 방치하여 이 제품의 표층에서 무수 결정 환상 4당을 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜, 이것을 가볍게 롤에서 표면에 균열을 생기게 하여 쪄서 으깨어 말린 규히를 얻었다.

이 제품은 풍미 양호하고, 미생물 오염을 받기 어려우므로 고품질을 장기간에 걸쳐서 유지하였다.

실시예 B-5: 고구마 과자

고구마를 두께 약 1cm로 슬라이스하고, 이것을 찐 후 방냉하고, 여기에 실시예 A-3의 방법으로 얻은 무수 비정질 환상 4당 분말을 묻혀서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜서 탈수함으로써 표면에 5 내지 6함수 결정 환상 4당이 부착된 고구마 과자를 제조하였다. 이 제품은 풍미 양호하고 안정한 고구마 과자이다.

실시예 B-6: 분말 크림

생크림 1 중량부에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 3 중량부를 혼합한 후, 바트에 옮기고 2일간 방치해서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜 블록을 조제하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하고, 분급해서 풍미 양호한 분말 크림을 얻었다.

이 제품은 풍미 양호한 분말 크림으로서, 커피, 홍차의 맛을 내는데에, 또한, 프리믹스, 빙과, 케이크, 캔디류 등의 제과재료, 경관 유동식 등의 치료용 영양제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-7: 분말 브랜디

브랜디 2 중량부에 풀룰란 10 중량부를 혼합하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 7 중량부를 혼합한 후 바트에 옮기고 2일간 방치해서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜 블록을 조제하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하고, 분급해서 풍미 양호한 분말 브랜디를 얻었다.

이 제품을 입에 넣으면, 적당한 단맛을 가지고, 브랜디 향기가 충분한 분말 향료이다. 이 제품은 홍차용 향기 부여제로서, 또한, 프리믹스, 캔디류 등의 제과재료 등으로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 이 분말을 과립 성형기, 타정기에서 성형하여 과립, 정제로 하여 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

실시예 B-8: 분말된장

붉은 된장 2 중량부에 실시예 A-2의 방법으로 얻은 1함수 결정 환상 4당 분말 4 중량부를 혼합하고, 다수의 반구상 오목부를 형성한 금속판에 부어 넣고, 이것을 실온하에서 하룻밤 정치해서 고화하고, 이형해서 1개 당 약 4 g의 고형 된장을 얻어, 이것을 분쇄기에서 분쇄하여 분말된장을 얻었다.

이 제품은 즉석라면, 즉석국물 등의 조미료로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 고형된장은 고형 조미료로서 뿐만 아니라 된장과자 등으로서도 이용할 수 있다.

실시예 B-9: 분말간장

실시예 A-3의 방법으로 얻은 무수 비정질 환상 4당 분말 3.5 중량부 및 실험 20의 방법으로 얻은 5 내지 6함수 결정 환상 4당 0.02 중량부를 컨베이어 위에서 유동시키면서, 여기에 대하여 묽은 간장을 1 중량부의 비율이 되도록 분무하고, 이어서 숙성 탑에 옮겨 30℃에서 하룻밤 방치해서 무수 비정질 환상 4당을 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜 분말간장을 얻었다. 이 제품은 즉석라면, 즉석국물 등의 조미료로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-10: 분말난황

날달걀로부터 조제한 난황을 플레이트식 가열 살균기에서 60 내지 64℃에서 살균하여 얻어지는 액상난황 1 중량부에 대하여, 실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 3.5 중량부의 비율로 혼합한 후, 실시예 B-7과 마찬가지로 블 록화하여 분말화해서 분말난황을 얻었다.

이 제품은 프리믹스, 빙과, 유화제 등의 제과용 재료로서 뿐만 아니라, 경구유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다. 또한 피부 미화제, 육모제(育毛劑) 등으로서도 유효하게 이용할 수 있다.

실시예 B-11: 분말 요구르트

플레인 요구르트 1 중량부에 실시예 A-3의 방법으로 얻은 무수 비정질 환상 4당 분말 3.6 중량부를 혼합한 후, 실시예 B-7과 마찬가지로 블록화하고, 분말화해서 분말 요구르트를 얻었다. 이 제품은 풍미 양호할 뿐만 아니라, 유산균을 생균 상태로 하여 장기간에 걸쳐 안정화할 수 있다. 또한, 프리믹스, 빙과, 유화제 등의 제과용 재료로서 뿐만 아니라, 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서, 더욱이는, 예를 들면, 마가린, 휩 크림, 스프레드, 치즈 케이크, 젤리 등에 함유시켜 요구르트 풍미의 제품으로 하는 등으로 유리하게 이용할 수 있다. 더욱이 이 분말을 과립 성형기, 타정기 등으로 성형해서 유산균 제제로 하여 정장제 등으로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

실시예 B-12: 핫케이크 믹스

밀가루 200 중량부에 실시예 B-10의 방법으로 얻어진 분말난황 60 중량부, 버터 25 중량부, 설탕 10 중량부, 베이킹 파우더 12 중량부 및 식염 0.5 중량부를 배합해서 핫케이크 믹스를 얻었다. 이 제품은 물, 우유 등으로 풀어서 굽는 것에 의해 간단히 풍미 양호한 핫케이크를 조제할 수 있다.

실시예 B-13: 분말 약용 인삼 엑기스

약용 인삼 엑기스 0.5 중량부에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 1.2 중량부를 혼합한 후, 실시예 B-7과 마찬가지로 블록화하고, 분말화해서 분말 약용 인삼 엑기스를 얻었다. 이 제품을 적당량의 비타민 Bl 및 비타민 B2 분말과 함께 과립 성형기에서 과립으로 성형하여 비타민 함유 과립상 약용 인삼 엑기스로 하였다. 이 제품은 피로 회복제, 강장제, 강정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 육모제 등으로서도 이용할 수 있다.

실시예 B-14: 분말 프로폴리스 엑기스

프로폴리스를 95 v/v％ 에탄올 수용액으로써 통상적인 방법에 따라 추출하고, 이어서 잔류물을 소량의 물로 세정하고, 세액(洗液)을 합쳐서 얻어진 프로폴리스 조(粗)추출물 함유 80 v/v％ 에탄올(고형물 약 20w/w% 함유) 수용액에 물을 첨가해서 에탄올 농도 50v/v％로 저감하고, 50℃에서 1시간 유지하여 프로폴리스 유효성분을 함유하는 상층과 점착성 침전물인 하층을 형성시켜, 실온에서 하룻밤 방치하고, 이 상층을 분리해 채취하여 색조, 향미, 항균작용이 우수한 액상의 정제 프로폴리스 추출액을 조(粗)추출물 함유 용액에 대하여 고형물 당 약 48％의 수율로 얻었다.

이 정제 프로폴리스 추출액 1 중량부를 실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 10 중량부에 분무혼합하고, 더욱 건조시켜서 풍미 양호한 분말 프로폴리스엑기스를 얻었다.

이 제품은 항균제, 항산화제, 항염증제, 면역 조절제, 매크로파아지 활성화제 등으로서 직접 이용될 뿐만 아니라, 다른 적당한 재료와 배합하여 음식물, 항감 수성 질환제, 화장품 등에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-15: 분말 쪽(藍) 엑기스

여뀌과의 일년생 초본인 쪽(학명 「폴리고남·팅크토리움」)의 지상부 30 kg을 파쇄한 후, 90 v/v％ 에탄올 수용액으로써 통상적인 방법에 따라서 추출하고, 이어서 잔류물을 소량의 물로 세정하고, 세액을 합쳐서 얻어진 쪽 조(粗)추출물 함유 수용액에 물을 첨가해서 에탄올 농도 50v/v％로 저감하였다. 이 조(粗)추출액 1 중량부에 대하여, 실시예 A-2의 방법으로 얻은 1함수 결정 환상 4당 12 중량부의 비율로 혼합한 후 바트에 옮기고, 2일간 방치해서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜 블록을 조제하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하고, 분급해서 분말 쪽 추출액을 얻었다.

이 제품은 항균작용, 항바이러스 작용, 항종양 작용, 라디칼 포착 작용, 아포토시스 조정 작용, 사이토카인 조정 작용 등의 다채로운 생리작용을 구비하고 있어, 식품, 화장품 및 의약품에 배합하는 생약으로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-16: 분말 중국 파슬리 엑기스

세리과의 식물인 중국 파슬리[parsley; 영어 명칭: 코리안다, 분류: 코엥드로 속(屬)]의 지상부를 수세하고, 물기를 뺀 후, 블렌더를 이용해서 잘게 절단하였다. 잘게 절단된 중국 파슬리를 원심여과 분리기를 이용해서 150 메쉬를 통과한 추출액을 회수하고, 121℃에서 10분간 처리하여 고형물 함량 60 mg/ml의 중국 파슬리 추출액을 얻었다. 이 추출액 1 중량부에 대하여, 실시예 A-4에서 얻은 무수 결정 환상 4당 9 중량부의 비율로 혼합한 후 바트에 옮기고, 2일간 방치해서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜 블록을 조제하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하고, 분급해서 분말 중국 파슬리 추출액을 얻었다.

이 제품은 납 등의 금속의 침착을 억제하는 작용을 구비하고 있어, 직접 혹은 식품 또는 의약품에 배합해서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-17: 분말 로얄 젤리

미가공의 브라질산 로얄 젤리(수분 65 중량％）1 중량부에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 7 중량부의 비율로 혼합한 후 바트에 옮기고, 2일간 방치해서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜 블록을 조제하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하여 분말 로얄 젤리를 얻었다. 또한 이것을 100 메쉬 통과에 의해 분급(分級)한 후, 타정기를 이용해서 1정(錠) 당 300 mg의 정제를 제조하였다.

이 제품은 강장작용, 세포 부활(賦活) 작용을 구비하고 있고, 또한, 열화하기 쉬운 로얄 젤리를 상온하에서 장기간 보존할 수 있다. 또한, 풍미가 개선되어 있고, 부드러운 단맛과 적당한 신맛을 나타내므로, 일상적으로 이용하는 건강식품으로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-18: 유동식용 고형 제제

실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 분말 400 중량부, 실시예 B-7의 방법으로 얻어진 분말난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.85 중량부, 티아민 0.01 중량부, L-아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴산 아미드 0.04 중량부로 된 배합물을 조제하고, 이 배합물 25 g 씩을 방습성 라미네이트 봉지에 충전하고, 히이트 시일(heat seal)해서 유동식용 고형 제제를 제조하였다.

이 고형 제제는 봉지 내 분위기의 수분을 저감하고, 저온저장의 필요도 없이 실온하에서 장기간 안정하다. 또한, 물에 대한 분산, 용해는 양호하다. 이 고형 제제는 1 자루분을 약 150 내지 300 ml의 물에 용해하여 유동식으로 해서 경구적, 또는 비강, 위, 장 등에 대한 경관적 투여에 의해 사용된다.

실시예 B-19: 의약용 정제상(錠劑狀) 제제

신생아인 햄스터에게, 토끼로부터 공지의 방법으로 조제한 항혈청을 주사하여 햄스터의 면역반응을 약화시킨 후, 그 피하에 BALL-1 세포를 이식하고, 그 후 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다.

피하에 생긴 종류(腫瘤)를 적출해서 잘게 절단하여 생리 식염수에 분산시켜 풀었다. 얻어진 세포를 혈청 무첨가의 PRMI 1640배지(pH 7.2)에서 세정하고, 이 배지에 약 2×10⁶개/ml가 되도록 현탁하여 35℃로 유지하였다. 여기에 부분 정제한 인간 인터페론-α를 200 IU/ml의 비율로 가하고 약 2시간 유지한 후, 센다이 바이러스를 약 300 적혈구 응집값/ml의 비율로 첨가하고, 20시간 유지하여 인간 인터페론-α를 유도시켰다. 이것을 약 4℃, 약 1,000g에서 원심분리해서 침전물을 제거하고, 얻어진 상청을 더욱 정밀여과하고, 그 여액을, 공지의 방법에 따라 항(抗)인터페론-α항체를 고정화해 있는 칼럼에서 처리하여 비흡착 획분을 제거한 후, 그 흡착 획분을 용출하고, 막(膜) 농축해서 농도 약 0.001w/v％, 비활성 약 2×10⁸ IU/mg 단백질의 농축액을 햄스터 한마리 당 약 4 ml의 수득량으로 얻었다.

실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 1kg을 분말화하여 150 메쉬를 통과시키고, 먼저 얻어진 인터페론-α 농축액 0.25 ml(약 1×10⁶IU)을 증류수 100 ml에 희석한 후, 분무하면서 균일하게 혼합하고, 통상적인 방법에 따라 타정기를 이용해서 1정(錠; tablet)이 300 mg(150 IU/정)인 정제를 제조하였다.

이 제조 방법은 인터페론-α 함유액을 무수 결정 환상 4당 분말에 분무하는 것만으로 탈수되어 더욱 균일하게 혼합되어, 인터페론-α의 안정화에도 효과적이다.

이 제품은 물에 대하여 쉽게 용해하므로, 항바이러스제, 항종양제, 항류마티즘제, 항면역 질환제 등의 항감수성 질환제로서 내복용제, 구강용제로서 이용할 수 있다. 또한, 검사용의 시험약으로 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

실시예 B-20: 의약용 과립상 제제

인간 유래의 림프 아구(芽球) 세포 BALL-1 세포를, 소태아 혈청을 20％ 가한 Eagle의 최소 기본배지(pH 7.4)에 접종하고, 37℃에서 통상적인 방법에 따라 생체외(in vitro)에서 부유(浮遊) 배양하였다. 얻어진 세포를 혈청 무첨가의 Eagle 최소 기본배지(pH 7.4)로써 세정하고, 이 배지에 약 1×10⁷개/ml가 되도록 현탁하였다. 이 현탁액에 센다이 바이러스를 ml당 약 1,000 적혈구 응집값 첨가하고, 38℃에서 1일 유지하여 종양 괴사 인자-α을 유도 생성시켰다. 이것을 4℃, 약 1,000 g에서 원심분리하고, 얻어진 상청을 pH 7.2, 0.01 M 인산염 완충액을 함유하는 생리 식염수로 15시간 투석하고, 다시 정밀여과해서 얻은 여액을 통상적인 방법에 따라 항인터페론 항체의 칼럼에 통과시키고, 그 비흡착 획분을, 항종양 괴사 인자-α 모노클로날 항체의 겔 칼럼을 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제하고, 농축하여 농도 약 0.01w/v％, 비활성 약 2×10⁶ JRU/mg 단백질의 농축액을 얻었다.활성 수득량은 유도 생성시의 현탁액 1 리터당 약 5×10⁴ JRU이었다.

실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 1kg을 분말화하여 150 메쉬를 통과시키고, 먼저 얻어진 종양 괴사 인자-α 농축액 0.5 ml(약 1×10⁵ JRU) 증류수 100 ml에 희석한 후, 분무하면서 균일하게 혼합하고, 통상적인 방법에 따라 과립형성기에 의해 과립상의 종양 괴사 인자-α 제제(약 100 JRU/g)를 제조하였다. 이 제조 방법은 종양 괴사 인자-α 함유액을 무수 결정 환상 4당 분말에 분무하는 것만으로 탈수되어 더욱 균일하게 혼합되어, 종양 괴사 인자-α의 안정화에도 효과적이다.

실시예 B-21: 외상치료용 고약

실시예 A-1의 방법으로 얻은 무수 결정 환상 4당 400 중량부에 요오드 3 중량부를 용해하여 메탄올 50 중량부 가해서 혼합하고, 또한 10％ 풀룰란 수용액 200 중량부 및 말토오스 함수 결정 50 중량부를 가해서 혼합하고, 실온에서 하룻밤 방 치해서 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜, 적당한 퍼짐성, 부착성을 나타내는 외상치료용 고약을 얻었다.

이 제품은 창면(創面)에 도포하거나, 또는 거즈, 기름 종이 등에 도포하는 등으로 해서 사용함으로써, 벤 상처, 생채기, 화상, 무좀에 의한 상처 등의 외상을 치료할 수 있다.

상기한 바로부터 명확한 바와 같이, 본 발명은 비환원성의 환상 4당을 유효성분으로 하는 탈수제에 관한 것이며, 탈수 능력을 가진 환상 4당을 예를 들면, 건조식품 등을 봉입한 방습용기 내의 분위기에 함유되는 수분을 저감시킬 경우, 더욱이는 예를 들면, 식품, 의약품, 화장품, 공업 화학품, 이들의 원재료, 또는 가공 중간물 등의 각종 함수물의 수분을 저감시킬 경우 등에 유리하게 이용할 수 있다.

탈수 능력을 가진 환상 4당을 5 내지 6함수 결정 환상 4당으로 변환시켜서 탈수하여 실질적으로 수분을 저감시키는 본 발명의 방법은 가열 건조 등의 가혹한 조건을 필요로 하지 않고, 각종 함수물, 예를 들면, 풍미, 향기를 열화하기 쉬운 식품, 유효성분의 분해, 활성저하를 수반하기 쉬운 의약품 등의 품질을 저하시키는 일이 없이, 고품질의 탈수 물품을 용이하게 제조할 수 있다.

또한, 얻어진 탈수 물품은 미생물 오염이 방지되어 가수분해, 산패, 갈변 등의 변질, 열화가 방지되므로 그 상품의 수명을 장기간에 걸쳐 안정하게 유지할 수 있다.

본 발명은 이렇게도 현저한 작용 효과를 가진 발명이어서, 이 분야에 공헌하 는 바 실로 다대한 의의가 있는 발명이다.

<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120> Desiccant, Dehydration Therewith, And Dehydrated Product Obtainable Thereby <150> JP 010,991/01 <151> 2001-01-19 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 1 Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 2 Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 3 Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 4 Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 5 Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 6 Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 7 Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 8 Gly Asn Glu Met Arg Asn Gln Tyr 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 9 Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 10 Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser 1 5

Claims

사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 당질을 유효성분으로 하는 탈수제.
제1항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 당질이, 무수 결정, 1함수 결정 및 무수 비정질로부터 선택되는 탈수 능력을 가진 당질인 것을 특징으로 하는 탈수제.
제2항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 무수 결정이, 수분 15w/w% 미만의 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실 -(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 당질의 시럽을 종자결정(seed crystal: 種子結晶)이 공존하는 상태에서 50℃ 내지 180℃의 온도범위로 유지하면서 이 무수 결정을 결정석출시켜, 이것을 채취한 것을 특징으로 하는 탈수제.
제2항에 있어서, 1함수 결정이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)- α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 당질의 시럽 또는 5 내지 6함수 결정을 건조해서 채취한 것을 특징으로 하는 탈수제.
제2항에 있어서, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 당질이, 전분질 유래의 당질인 것을 특징으로 하는 탈수제.
함수물에, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 기재한 탈수제를 함유, 접촉 또는 공존시키는 것을 특징으로 하는 함수물의 탈수 방법.
제6항에 있어서, 함수물을 탈수함으로써, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 당질의 5 내지 6함수 결정을 생성하는 것을 특징으로 하는 탈수 방법.
제6항에 있어서, 함수물 1 중량부에 대하여, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 기재한 탈수제를 0.001 내지 200 중량부의 범위에서 함유, 접촉 또는 공존시키는 것을 특징으로 하는 함수물의 탈수 방법.
제6항에 있어서, 함수물이, 호화 전분, 알코올, 유용성(油溶性) 물질 또는 생리활성 물질을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 함수물의 탈수 방법.
함수물에, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 기재한 탈수제를 함유, 접촉 또는 공존시켜서 얻어지는 탈수 물품.
제10항에 있어서, 탈수 물품이, 식품, 의약품, 화장품, 이들 원재료 또는 가공 중간물인 것을 특징으로 하는 탈수 물품.