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KR100485479B1 - 금속 단백질 분해효소 저해제 - Google Patents

금속 단백질 분해효소 저해제 Download PDF

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KR100485479B1
KR100485479B1 KR10-2000-7004964A KR20007004964A KR100485479B1 KR 100485479 B1 KR100485479 B1 KR 100485479B1 KR 20007004964 A KR20007004964 A KR 20007004964A KR 100485479 B1 KR100485479 B1 KR 100485479B1
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Abstract

화합물 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드는 매트릭스 금속 단백질 분해효소 저해제이다.

Description

금속 단백질 분해효소 저해제 {Metalloproteinase inhibitors}
본 발명은 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시 -2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드 및 이의 약학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물과 용매 화합물에 관한 것이다.
국제 특허출원 WO 95/19956(브리티쉬 바이오테크 파마슈티칼스 리미티드)에는 매트릭스 금속 단백질 분해효소(MMP) 저해제이고, 세포로부터 종양 괴사인자 (TNF-α)를 방출하는 저해제인 화합물류가 기재되어 있고 특허 청구되어 있다. 특히, 이 출원은 다음 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 염, 수화물이나 용매 화합물에 관한 것이다.
상기 식에서,
X는 -CO2H 또는 -CONHOH 기이고;
R1은 수소; (C1-C6)알킬; ((C2-C6)알켄일; 페닐; 치환페닐; 페닐(C1-C6)알킬); 치환 페닐(C1-C6)알킬; 헤테로시클일; 치환 헤테로시클일; 헤테로시클일(C1-C 6)알킬; 치환 헤테로시클일(C1-C6)알킬; BSOnA- 기(여기서 n은 0, 1 또는 2 이고, B는 수소 또는 (C1-C6)알킬, 페닐, 치환 페닐, 헤테로시클일, (C1-C6)아실, 펜아실 또는 치환 펜아실기 이고, A는 (C1-C6)알킬을 나타낸다); 아미노; 보호 아미노; 아실아미노; OH; SH; (C1-C6)알콕시; (C1-C6)알킬아미노; 디-(C1-C 6)알킬아미노; (C1-C6)알킬티오; 아릴(C1-C6)알킬; 아미노(C1-C6)알킬; 히드록시(C1-C 6)알킬, 머캅토(C1-C6)알킬 또는 카르복시(C1-C6)알킬(여기서 아미노-, 히드록시-, 머캅토- 또는 카르복실기는 임의로 보호되거나 또는 카르복실기는 아미드화 된다); 카르바모일로 치환된 저급 알킬, 모노(저급 알킬)카르바모일, 디(저급 알킬)카르바모일, 디(저급 알킬)아미노 또는 카르복실-저급 알카노일아미노 이다.
R2는 (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C2-C 6)알킨일, 페닐(C1-C6)알킬, 헤테로아릴(C1-C6)알킬, 시클로알킬(C1-C6)알킬 또는 시클로알켄일(C 1-C6)알킬기, 이중 어느 하나는 (C1-C6)알킬, -O(C1-C6)알킬, -S(C1-C6 )알킬, 할로와 시아노(-CN)에서 선택한 하나 또는 그 이상의 치환기에 의하여 임의로 치환될 수 있다;
R3는 기능기가 보호될 수 있는 천연 또는 비-천연 α아미노산의 특성기이고;
R4는 벤젠 고리에 또는 5-, 6- 또는 7-원환 이종환식 고리에 임의로 융합될 수 있는 N-산화물로 고리 질소 원자가 산화되는 5- 또는 6-원환 헤테로아릴 고리 또는 페닐이고, 여기서 고리중 어느 것은
(a) 히드록실, 할로겐, -CN, -CO2H, -CO2(C1-C6)알킬, -(C 1-C6)알킬-CO2(C1-C6)알킬, -CONH2, CONH(C1-C6)알킬, -CON((C1-C 6)알킬)2, -CHO, -CH2OH, -(C1-C4)퍼플루오로알킬, -O(C1-C6)알킬, -S(C1-C6)알킬, -SO(C1-C 6)알킬, -SO2(C1-C6)알킬, -NO2, -NH2, -NH(C1-C6)알킬, -N((C1-C6)알킬)2와 -NHCO(C1-C6)알킬에서 독립적으로 선택한 하나 또는 그 이상의 치환기 또는
(b) 할로겐, 히드록실, 아미노, 카르복실, (C1-C4)퍼플루오로알킬, (C1-C6)알킬, -O(C1-C6)알킬 또는 -S(C1-C6)알킬에서 선택한 하나 또는 그 이상의 치환기로 임의로 치환할 수 있는 (C1-C6)알킬, (C2-C6)알켄일, (C 2-C6)알킨일, (C3-C8)시클로알킬, (C4-C8)시클로알켄일, 페닐, 벤질, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴메틸에서 선택한 기;
에 의하여 임의로 치환될 수 있다.
R5는 수소 또는 (C1-C6)알킬기 이다;
발명의 주요 설명
N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드는 WO 95/19956에 일반적으로 기재되고 청구되어 있는 일종이고, 그러나 이것이나 이것의 성질은 특별히 설명되어 있지 않다.
WO 95/19956에서는 기재된 화합물류에서 방향족 또는 헤테로아릴 R4 치환기는 유사한 구조를 가지지만 공지 화합물에 존재하는 R4 치환기(통상 메틸)과 다른 공지 화합물에 비하여 스트로멜리신에 대한 활성이 증가하는 일반적으로 예상외의 원하는 효과를 갖는 반면에, 콜라겐 분해효소와 젤라틴 분해효소에 대한 활성을 유지한다. 현재 선택된 화합물 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드는 종류중 한 가지로서 이러한 성질을 갖는다.
그러나 몇 가지 MMP 저해제의 부작용은 장기간 투약 후 몇몇 동물이나 환자에게서 관절, 예를 들면 어깨에서 근육 골격통증(때로는 건염이라고 한다)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 작용은 실질적으로 투약 중지에 반대적인 것으로 믿지만, 이는 바람직하지 못하다. 통증이 일어나는 메카니즘은 현재 알려져 있지 않고 있으며, 이는 특별한 구조적 특징이나 분자의 효소 저해 형상으로 통증을 유도하는 화합물의 성질과 상관이 있다는 것은 현재로서는 증명할 수가 없다. 따라서, 주어진 MMP 저해제가 이러한 부작용을 일으키는지 여부와 작용의 심도는 현재로서는 예견할 수 없고 실험적으로 시험해야 한다.
선택한 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드는 근육-골격 통증 부작용을 유도하는 경향이 매우 감소함을 알았다. 이러한 점에서 이는 근사한 구조적 유사체, 예를 들면 부작용을 더 유도하기 쉬운 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-3-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-히드록시-석신아미드와 다르다.
또한 WO 95/19956에는 기재된 종류의 아릴아미드 MMP 저해제에는 경구적으로 생체 이용성을 갖는 화합물이 있음을 설명하고 있다. WO 95/19956의 설명에 포함되는 화합물 모두가 유용한 정도로 경구적 생체 이용성이 있는 것은 아니며, 예를 들면 이는 경구 투약한 동물의 혈액에서 약제로 인한 시간 이상의 활성수준 또는 MMP 저해 활성의 정상수준("곡선 아래 부분")에 의하여 입증된다. 본 발명에 의하여 선택된 화합물, N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드는 사람과 기타 포유동물에 경구적 생체 이용성이 있음을 알았다.
이러한 경구적 생체 이용성과 건염 부작용에 대한 감소된 결함의 조합은 본 발명의 화합물이 MMP 저해제의 장기간 전신투여 또는 매체를 필요로 하는 질병을 치료하는데 비교적 넓은 치료적 수단을 제공함을 나타낸다. 그러므로 화합물은 예를 들어 류마티스성 관절염, 암, 다발성 경화증(MS), 기앵바레증후군과 건선을 치료할 수 있다.
본 발명은 다음 식(Ⅱ)의 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드와 이의 약학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물 및 용매 화합물을 제공한다.
본 발명의 화합물은 입체화학 배치가 화합물의 명칭에 명시된 바와 같고, 식(Ⅱ)에 표시된 바와 같은 세 개의 비대칭 탄소원자를 갖는다. 그러나, 본 발명에는 명시된 거울상 이성체가 우세하면, 화합물(Ⅱ)의 거울상 이성체의 혼합물을 포함함을 알 수 있다. 바람직하기로는 90 중량% 또는 그 이상의 이러한 거울상 이성체 혼합물이 명시된 거울상 이성체 일때이다.
또한 본 발명은 약학적으로 수용할 수 있는 담체와 함께 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드 또는 이의 약학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물 또는 용매 화합물을 함유하는 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 조성물에는 경구투여에 적합한 것이다.
더욱이, 본 발명은 사람을 포함한 포유류의 류마티스성 관절염, 암, 다발성 경화증(MS), 기앵-바레증후군(GBS) 또는 건선을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸 -3S-메톡시-석신아미드 또는 이의 약학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물 또는 용매 화합물을 사용하는 것을 포함한다.
또한 본 발명은 하기 질병의 증후학적 과/또는 병리학적 징조를 감소시키는데 유효한 양의 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드 또는 이의 약학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물 또는 이의 용매 화합물을 포유류에 투여하여서 하는 사람을 포함한 포유류의 류마티스성 관절염, 암, 다발성 경화증(MS), 기앵-바레증후군(GBS) 또는 건선의 치료방법을 포함한다.
본 발명 화합물의 염에는 생리학적으로 수용할 수 있는 산 부가염, 예를 들면, 염산염, 브롬화수소염, 황산염, 메탄술폰산염, P-톨루엔, 술폰산염, 인산염, 초산염, 시트르산염, 석신산염, 락트산염, 타르타르산염, 푸마르산염과 말레산염이 있다. 또한, 염은 염기, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘과 칼슘염으로 형성될 수 있다.
본 발명의 선택된 화합물은 다음 실시예에 기재된 방법에 의하여 제조할 수 있고, 이의 약동학적 성질로 구성되는 방법으로 투여할 수 있다. 경구적으로 투여할 수 있는 조성물은 정제, 캡슐, 분제, 입제, 함당정제, 경구, 국소 또는 살균 비경구 용액 또는 현탁액과 같은 액제 또는 겔제의 형태로 할 수 있다. 경구투여용 정제와 캡슐은 단위 투약 형태이고, 결합제; 충전제; 정제 윤활제; 분해제; 또는 수용할 수 있는 습윤제와 같은 일반적 부형제를 함유할 수 있다. 정제는 일반 약학계에서 잘 알려져 있는 방법에 따라 피복할 수 있다. 경구액제는 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀션, 시럽 또는 엘리서 형태이고, 또는 사용전에 물 또는 다른 적당한 부형제와 재구성하는 건조 생성물로서 존재할 수 있다. 이러한 액제는 현탁제; 유제; 비-수성 부형제(이는 식용유를 포함한다); 방부제; 필요에 따라 향미제 또는 착색제와 같은 통상의 첨가제를 함유할 수 있다.
또한 유효성분은 살균 매체로 비경구적으로 투여할 수 있다. 사용된 부형제와 농도에 따라서, 약제는 부형제에 현탁되거나 용해될 수 있다. 국부 마취제, 방부제와 완충제와 같은 보조제는 부형제에 용해할 수 있다.
주어진 투여방법에 의하여 부여되는 임상적 조치에 대한 본 발명 화합물의 투약량은 관계 당국이 정식 인가한 표준 규정에 따른 임상 시험에 의하여 측정할 수 있다. 일반적으로 화합물은 5∼100㎎의 투약 단위로 매일 2회 또는 3회 인체에 경구투여 하는 것으로 예상된다.
다음 실시예는 본 발명 화합물의 제조를 기술한 것이다. 출발물질, 2R-(2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4S-일)-4-메틸-펜타노산과 L-tert-류신-N-(2-피리딜)아미드는 WO 95/19961에 기재된 바와 같이 제조한다.
다음 내용의 약어를 실시예에서 사용한다:
DMF N,N-디메틸포름아미드
EDC N-에틸-N1-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드
HOBt 1-히드록시벤조트리아졸
NMM N-메틸몰포린
THF 테트라하이드로푸란
N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드
공정 A
2S-히드록시-3R-이소부틸-석신산 디메틸 에스테르
2R-(2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥소란-4S-일)-4-메틸-펜타노산(75.0g, 0.326 m㏖)을 메탄올(500㎖)에 용해시키고, 생성 용액을 염화수소 가스로 포화시킨다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 하룻밤 교반한다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔재를 디클로로메탄에 용해시키고, 포화 탄산수소나트륨과 염수로 계속하여 세척한다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과하고 감압하에 증발건조 하면 황색 오일의 제목의 화합물(53g, 75%)을 얻는다.
1H-NMR; δ(CDCl3), 4.10(1H, d, J=4.0 ㎐), 3.60(3H, s), 3.50(3H, s), 3.18(br s), 2.78(1H, m), 1.61-1.40(2H, m), 1.28(1H, m)과 0.76-0.73(6H, m).
공정 B
2R-이소부틸-3S-메톡시-석신산 디메틸 에스테르
2S-히드록시-3R-이소부틸-석신산 디메틸 에스테르(23.9g, 110m㏖)를 DMF(200㎖)에 용해시키고, 증류된 요오도메탄(8.2㎖, 132m㏖)을 가한 다음, 산화은(1) (27.95g, 121m㏖)을 가한다. 광선 없이 실온에서 7 일동안 교반한다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔재를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 용리제로서 디클로로메탄)하여 정제하면 점성의 황색유인 제목의 화합물(19.16g, 75%)을 얻는다.
1H-NMR; δ(CDCl3), 3.83(1H, d, J=7.5 ㎐), 3.71(3H, s), 3.62(3H, s), 3.30(3H, s), 2.85(1H, m), 1.65-1.39(2H, m), 1.10(1H, m)과 0.83-0.81(6H, m).
공정 C
2R-이소부틸-3S-메톡시-석신산 디리튬염
수산화 리튬(1.76g, 42.0m㏖)을 메탄올(30㎖)과 물(30㎖)에 용해시킨 2R-이소부틸-3S-메톡시-석신산 디메틸 에스테르(4.70g, 20.0m㏖) 용액에 가한다. 반응 혼합물을 2 시간동안 실온에서 교반한 다음, 용매를 감압하에 제거하면 황색 고체(4.40g, 정량)인 제목의 화합물을 얻는다.
1H-NMR; δ(CD3OD), 3.52(1H, d, J=5.1 ㎐), 3.27(3H, s), 2.65(1H, m), 1.56-1.53(2H, m), 1.31(1H, m)과 0.82-0.78(6H, m).
공정 D
2R-이소부틸-3S-메톡시-석신산 4-메틸 에스테르
2R-이소부틸-3S-메톡시-석신산 디리튬염(25.14g, 116m㏖)을 건조 THF(150㎖)에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시킨다. 트리플루오로초산 무수물(30㎖)을 가하고, 혼합물을 4 시간 더 0℃에서 교반한다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔재를 0℃에서 무수 메탄올(200㎖)에 용해시키고, 용액을 실온에서 하룻밤 교반한다. 용매를 감압하에 제거하면 황색유(54.3g, 2 당량의 트리플루오로초산 리튬 포함)인 제목의 화합물을 얻는데, 이는 공정 E에서 더 이상 정제하지 않고 사용한다.
1H-NMR; δ(CD3OD), 7.71(1H, d, J=7.5 ㎐), 3.65(3H, s), 3.24(3H, s), 2.72(1H, m), 1.56-1.42(2H, m), 1.06(1H, m)과 0.81-0.79(6H, m).
공정 E
3R-[2,2-디메틸-1S-(피리딜카르바모일)-프로필카르바모일]-2S-메톡시-5-메틸-헥사노산 메틸 에스테르
공정 D에서 나온 생성물(25.06g, 53.7m㏖ 2R-이소부틸-3S-메톡시-석신산 4-메틸 에스테르)을 DMF(200㎖)에 용해시키고, HOBt(8.70g, 53.7m㏖)을 첨가하는 동안 용액을 0℃로 냉각시킨 다음, EDC(12.35g, 64.4m㏖)를 가한다. 혼합물을 교반한 다음, 2 시간 이상 실온으로 가온한다. 여기서 형성된 활성 에스테르의 용액을 0℃로 냉각시키고, L-tert-류신-N-(2-피리딜)아미드 (11.11g, 53.7m㏖)를 가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반한다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔재를 초산에틸에 용해시킨다. 용액을 1M 탄산나트륨 용액과 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 여과하고 증발건조한다. 잔재를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 디클로로메탄에서 0∼5% 메탄올)하여 정제하면 백색 고체(13.41g, 61%)인 제목의 화합물을 얻는다.
1H-NMR; δ(CDCl3), 9.61(1H, s), 8.47(1H, m), 8.24(1H, d, J=8.4 ㎐), 7.74(1H, m), 7.07(1H, m), 6.97(1H, d, J=8.9 ㎐), 4.64(1H, d, J=8.9 ㎐), 4.01(1H, d, J=7.6 ㎐), 3.76(3H, s), 3.41(3H, s), 2.75(1H, m), 1.79(1H, m), 1.51(1H, m), 1.11(1H, m), 1.02(9H, s), 0.84(3H, d, J=6.3 ㎐)와 0.82(3H, d, J=6.3 ㎐).
공정 F
3R-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필카르바모일]-2S-메톡시-5-메틸-헥사노산 리튬염
3R-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필카르바모일]-2S-메톡시-5-메틸-헥사노산 메틸 에스테르(13.4g, 32.9m㏖)를 THF(265㎖)과 물(65㎖)의 혼합물에 용해시키고, 수산화리튬 일수화물(1.396g, 33.3m㏖)을 가한다. 용액을 2 시간동안 실온에서 교반한 다음, 감압하에 증발하면 황색유를 얻는데, 이를 톨루엔과 함께 끓여서 더 건조시킨다. 생성물(13.4g, 잔유 용매 함유)을 더 이상 정제하지 않고 즉시 사용한다.
1H-NMR; δ(CD3OD, 부분 입체 이성체의 3.5:1 혼합물), 8.31(1H, m), 7.99(1H, d, J=8.3 ㎐), 7.66(1H, m), 7.00(1H, m), 4.49(0.23H, s; 소수 부분 입체 이성체), 4.37(0.77H, s; 다수 부분 입체 이성체), 3.68(0.23H, d, J=7.6 ㎐; 소수 부분 입체 이성체), 3.52(0.77H, d, J=7.6 ㎐; 다수 부분 입체 이성체), 3.21(0.69H, s; 소수 부분 입체 이성체), 3.20(2.31H, s, 다수 부분 입체 이성체), 2.64(1H, m), 1.53(2H, br m), 1.18(1H, m), 1.01(9H, s), 0.85(3H, d, J=6.4 ㎐)와 0.81(3H, d, J=6.3 ㎐).
공정 G
N4-벤질옥시-N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드
공정 F에서 나온 생성물(13.4g, 약 33m㏖)을 건조 DMF(250㎖)에 용해시키고, 알곤하에 놓고 교반하면서 -10℃로 냉각시킨다. 클로로포름산 에틸(3.4㎖, 36m㏖)을 적하한 다음, NMM(1.8㎖, 16.5m㏖)을 가한다. 혼합물을 30 분동안 교반한 후 DMF(10㎖)의 O-벤질히드록실아민(6g, 49m㏖)을 적하한다. 반응 혼합물을 실온으로 가온한 다음, 하룻밤 교반한다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔재를 초산에틸과 염수 사이에 분별한다. 유기층을 1M 탄산나트륨 용액으로 세척하고, 황산 마그네슘으로 건조하고, 여과하고 증발시킨다. 잔재를 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 디클로로메탄의 5% 메탄올)하여 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 푸울하고 증발시킨다. 생성물을 디에틸에테르와 분쇄하여 약간의 유색 불순물을 제거한다. 수율 : 9.44g(58%, >10:1 부분 입체 이성체의 혼합물).
1H-NMR; δ(CDCl3, 다수 부분 입체 이성체), 10.26(1H, s), 9.93(1H, s), 8.32(1H, m), 8.23(1H, d, J=8.2 ㎐), 7.63(1H, m), 7.25(5H, m), 7.12(1H, d, J=9.2 ㎐), 7.02(1H, m), 4.94(1H, d, J=10.8 ㎐), 4.76(2H, d, J=3.8 ㎐), 3.88(1H, d, J=5.5 ㎐), 3.32(3H, s), 2.91(1H, m), 1.72(1H, m), 1.55(1H, m), 1.35(1H, m), 1.02(9H, s), 0.89(3H, d, J=6.5 ㎐)와 0.85(3H, d, J=6.5 ㎐).
공정 H
N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드
N4-벤질옥시-N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드를 메탄올(75㎖)과 에탄올(75㎖)의 혼합물에 용해시키고, 알곤 분위기하에 놓는다. 목탄상의 10% 팔라듐을 가하고, 수소가스를 2 시간동안 용액에 통과시켜 기포가 일게하고, 이때에 TLC 분석하면 출발물질 모두가 소모되었음을 나타낸다. 시스템을 알곤으로 정화하고, 촉매를 여과하여 제거한다. 용매를 감압하에 제거하면, 백색 고체(8.8g, 정량; 부분 입체 이성체의 12:1 혼합물)인 제목의 화합물을 얻는다. 융점 163∼164℃.
1H-NMR; δ((CD3)2SO), 10.67(1H, s), 10.13(1H, s), 8.90(1H, s), 8.15(1H, m), 7.89(1H, d, J=8.4 ㎐), 7.81(1H, d, J=8.8 ㎐), 7.60(1H, m), 6.93(1H, m), 4.53(0.12H, d, J=9.4 ㎐), 4.43(0.88H, d, J=8.8 ㎐), 3.74(0.12H, d, J=10.0 ㎐), 3.32(0.88H, d, J=9.8 ㎐), 2.98(0.3H, s), 2.96(2.64H, s), 2.78(1H, m), 1.23(2H, m), 0.84(10H, s와 m), 0.65(3H, d, J=6.5 ㎐)와 0.56(3H, d, J=6.3 ㎐). 13C-NMR; δ(CD3OD), 172.6, 170.0, 166.0, 151.5, 147.9, 136.0, 119.5, 113.6, 61.2, 60.6, 56.7, 46.2, 37.0, 34.0, 26.5, 25.2, 23.7과 21.7. IR; vmax (KBr), 3255, 2957, 1700, 1645, 1524, 1467, 1435, 1370, 1301, 1213과 1152 cm-1. 실측치: C 58.40, H 7.92, N 13.61%; C20H32N4O5. 0.2 H2O 이론치 C 58.29, H 7.92, N 13.60%.
생물학적 예 A
간질 콜라겐 분해효소의 저해제로서 본 발명 화합물의 효능은 카우스톤과 바렛트의 방법(Anal. Biochem., 99, 340-345, 1979)에 의하여 측정하며, 이는 시험될 화합물의 1mM 용액 또는 이의 희석물을 콜라겐과 콜라겐 분해효소(5mM Call2, 0.05% Brij 35와 0.02% NaN3를 함유하는 pH 7.5의 25mM Hepes로 완충된 것)로 16 시간동안 37℃에서 배양하여서 한다. 여기에 참고적으로 혼입되어 있는 콜라겐 카우스톤과 머피의 방법(Mehods in Enzymology, 80, 711, 1981)에 의하여 제조된 아세틸화 14C 콜라겐이다. 시료를 원심분리하여 비소화된 콜라겐을 침강시키고, 가수분해의 측정에 따라 섬광계수기로 분석하기 위하여 방사상 상청액의 분취량을 제거한다. 1mM의 시험 화합물, 또는 이의 희석물의 존재하에 콜라겐 분해효소 활성도를 저해제가 없는 비교물의 활성도와 비교하고, 그 결과는 콜라겐 분해효소 활성도의 50% 저해로서 작용하는 저해제 농도(IC50)로서 하기에 보고했다.
스트로멜리신-1의 저해제로서 본 발명 화합물의 효능은 카우스톤 등의 방법(Biochem. J., 195, 159-165, 1981)에 의하여 측정하고, 이는 시험될 화합물의 1mM 용액 또는 이의 희석물을 스트로멜리신과 14C 아세틸레이트 카제인(5mM CaCl2, 0.05% Brij 35와 0.02% NaN3을 함유하는 pH 7.5의 25mM Hepes로 완충된 것)으로 16 시간동안 37℃에서 배양한다. 카제인은 카우스톤 등의 방법(상기)에 의하여 제조된 아세틸화 14C 카제인이다. 1mM의 시험 화합물, 또는 이의 희석물의 존재하에서의 스트로멜리신 활성도를 저해제가 없는 비교물의 활성도와 비교하고 그 결과는 스트로멜리신 활성도의 50% 저해로 작용하는 저해제 농도(IC50)로서 하기에 보고했다.
72 kDa 젤라틴 분해효소의 저해제로서 본 발명 화합물의 효능은 셀러스 등의 방법, Biochem. J., 171, 493-496 (1979)을 기초로한 방법으로 측정한다. RPMI-7951 세포에서 유도한 72 kDa 젤라틴 분해효소는 젤라틴-아가로오스 크로마토그래피에 의하여 정제한다. 아미노페닐 초산 수은으로 효소를 배양하여 활성화 하고 37℃에서 16 시간동안 적당한 완충제에서 50㎍[14C]-방사성 표지 젤라틴으로 약 0.05 유니트를 배양한다. 배양 말기에 트리클로로초산(최종 농도 16%)과 함께 50㎍ 소혈청 알부민을 가하여 반응을 중지하고, 비분해된 기질을 침전시킨다. 반응관을 15 분동안 얼음 위에 놓은 후, 15 분동안 10,000g으로 원심분리 하여 침전된 기질을 침강시킨다. 200㎕ 분취량의 반응 상청액을 제거하고, 액제 섬광 계수에 의하여 방사성을 측정한다. 저해제의 효과는 투약 반응곡선을 기준으로 하여 측정된다. IC50(효소 활성도의 50% 감소에 요구되는 저해제 농도)는 데이타 곡선과 일치시켜서와 효소의 50% 저해를 성취하는데 필요한 저해제의 농도를 계산하여 얻는다. 각 IC50 측정에 있어, 저해제의 8 이상 농도의 젤라틴 분해효소 활성에 관한 효과를 시험한다. 저해제는 DMSO에 용해시키고 희석시킨다.
본 발명의 화합물로 한 상기 시험의 결과는 다음과 같다:
효소 IC50(nM)
콜라겐 분해효소 10
72 kDa 젤라틴 분해효소 70
스트멜리신 30
생물학적 예 B
시험 화합물의 투여에 따른 실험실 동물의 혈액에서 본 발명 화합물의 시간 이상 농도를 측정한다. 처리 그룹당 6 마리의 숫쥐의 섭식에 의하여 화합물을 투여한다. 투여후 0.5, 1.0, 2.0, 6.0과 24 시간에 꼬리 천자에 의하여 혈액 시료를 제거한다. 0.4㎖의 혈액을 항-응고제로서 0.1㎖산 시트레이트 덱스트로제(ACD)를 함유하는 4.5㎖ 관에 넣는다. 추출에 있어서, 3㎖ 메탄올을 첨가하고 침전된 혈액을 원심분리(3000 rpm으로 30 분)에 의하여 펠릿으로 한다. 2㎖ 분취량의 상청액을 제거하고 동결건조에 의하여 농축한다. 추출물을 200㎕ DMSO에 재용해시키고, 10㎕ 분취량으로 콜라겐 분해효소 저해 활성에 대하여 분석한다. 상기 생물학적 예 A에 기재된 콜라겐 분해효소 분석과 표준 곡선과 비교하여 얻은 저해제의 농도(이는 약제 플러스 활성 대사 물질이다)를 사용하여 추출물의 저해 활성도를 측정한다. 결과는 ng/㎖의 최고 농도, 0.5∼24 시간 이상의 ng/㎖×시간의 곡선하에서의 부분과 IC50's×시간 수치의 AUC로 표시한다.
결과
최고농도 AUC(0.5∼24 시간) AUC(0.5∼24 시간)
ng/㎖ ng/㎖×시간 n IC50's×시간
212 2966 674
또한, 본 발명의 화합물은 명주 원숭이와 건강한 사람 지원자에게 경구 투여하여 시험하고, 저해 활성도의 현저한 수준은 이와 같은 투여후 이러한 대상물들의 혈액에서 검출되었다.
생물학적 예 C
본 발명의 화합물을 암을 갖는 두 종류 동물 모델에서 시험하여, 다음과 같은 활성을 발견하였다:
B 16 마우스 흑색종 모델
이 모델 C57/BL6J 마우스에 105 B16 마우스 흑색종 세포를 피하에 접종한다. 종양을 18 일 이상 성장시키고, 캘리퍼 측정과 다음 식: 중량(㎎)-길이(㎜)×폭(㎜)÷4에 의하여 종양의 중량을 측정한다. 화합물을 받은 마우스 그룹(n=19)에 B16 종양의 반대편에서 피하로 주입한 미니-삼투압 펌프를 통하여 투약한다. 펌프는 종양 접종 전날에 주입하고, 화합물은 360 ㎍/일의 투약량으로 방출시킨다. 비교 그룹(n=17)에 적당한 체적의 부형제를 동일하게 주입된 펌프로부터 공급받게 한다.
18 일에 비교 종양의 평균 중량은 1145±97㎎(도 15)이었고, 화합물-처리 종양의 중량은 774±50㎎ 이었다. 이러한 감소(시험 화합물의 32%)는 중요한 것이다 (p<0.005). 연구 말기에 시료를 평가하면 혈장수준이 시험 화합물에 있어 26.8±3.2 ng/㎖임을 나타낸다.
MDA-435 유방 암종 모델
이 모델에서, 동물에 MDA-435 세포(106 세포/마우스)를 접종하고, 4 일동안 종양이 성장하도록 한 다음 동물을 종양 중량에 따라 세 종류 처리 그룹(그룹당 n=15)으로 무작위화 한다. 부형제 아니면 시험 화합물을 15 ㎎/㎖ 또는 60 ㎎/㎖(각기 180 또는 720 ㎍/마우스/일 방출)로 함유하는 5 일에 미니-펌프를 외과적으로 주입한다. 펌프를 19 일에 대체하고, 32 일에 연구를 종료한다. 종양 성장의 투약량-관련 저해에 있어, 180 ㎍/마우스/일에 19% 저해와 720 ㎍/마우스/일에 33% 저해가 있었다. 투약량이 더 높으면 저해는 통계적으로 더 우수했다(p<0.005). 연구 말기에 시료를 평가하면 혈장 수준은 낮은 투량량과 높은 투약량 그룹에서 각각 99±6 ng/㎖과 136±42 ng/㎖ 임을 나타낸다.
생물학적 예 D
본 발명 화합물의 성질을 시험하여 쥐에게 관찰할 수 있는 건염의 신호를 유도한다. 본 발명 화합물("화합물 A")의 쥐에서의 건염 효과를 근사한 구조적 이성체, 즉 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-3-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-히드록시-석신아미드("화합물 B")와 비교한다.
숫 루이스 쥐를 사용하고, 각 연구에서 30 이하의 쥐의 무게를 측정하고, 배당 그룹, n=6/그룹의 체중으로 무작위화 한다. 각 연구에서 해당 부형제 그룹을 운영하여 각 처리 그룹과 비교한다.
화합물 A는 이의 베실레이트 염으로 제제하고, 화합물 B는 유기 염기로 제제한다. 화합물 A에 있어서 @ 15 ㎎/㎖ 부형제는 50% DMSO, 37% 0.1M 메탄술폰산; 13% 살균수이고; @ 30 ㎎/㎖ 부형제는 50% DMSO, 37% 0.2M 메탄술폰산, 13% 살균수이다. 화합물 B에 있어서 @ 15 ㎎/㎖ 부형제는 50% DMSO 물이다.
Alzet(상표) 삼투압 미니 펌프(2ML2, 14 일, 5 ㎕/시간, 캘리포니아 94303 팔로알토의 알자 회사 제품)의 빈중량과 충전된 중량을 측정하여 정확한 충전된 체적을 확인한다. 주입하기 전에 충전된 펌프를 37℃의 배양기에 넣는다. 쥐 모두를 할로탄으로 마취한다. 일단 마취되면, 목덜미 털을 면도하고 소독한다. 세로 피부 봉입체, 약 2㎝ 길이를 준비된 부위에 놓고, 한 쌍의 지혈 핀셋을 사용하여 피부 아래에 피하 포켓을 만든다. 미니 펌프를 상처에서 떨어져 직면하고 있는 출구에 삽입한다. 봉입체 상처를 봉합으로 밀봉하고, 상처 부위를 재소독한다. 직후-유효량으로 진통제(Iemgesic-상표-렉키트와 콜만) 0.1 m/㎏ s.c.를 쥐 모두의 옆구리에 공급한다. 마취에서 회복하면, 동물을 건조 침구를 갖는 상자로 돌려보내어 치료전에 상처에 먼지가 없이 유지되도록 한다. 수술 다음 날에, 모든 쥐를 표준 침구로 되돌려 놓고 3 그룹으로 되게 하여 건염 신호를 더 정확하게 관찰할 수 있게 한다.
미니-펌프를 주입한 다음, 쥐의 중량을 측정하고 가능한 건염 징후를 감시한다. 건염 징후와 정도를 채점 시스템(하기 참조)을 기초로 한 관찰로 측정한다. 쥐는 16 일동안 매일 관찰한다. 평균 점수 >2는 우수한 것으로 생각된다. 사용된 채점 시스템은 다음과 같다:
기댄 모양 : 동물이 이동하도록 자극했을 때 표시
정상 0 정상이동 0
한 발 안정 1 이동에 대한 반항 1
모든 발 불안정 2 이동에 대한 중간 반항 2
이동에 대한 큰 반항 3
걷는 모양 :
정상 0
한 뒷발 사용 회피 1
두 뒷발 사용 회피 2
결과는 화합물 A(두 가지 15 ㎎/㎖와 30 ㎎/㎖)와 부형제만 투약한 쥐는 건염 신호를 뚜렷하게 나타내지 않은 반면에, 화합물 B를 투약한 쥐는 8 일 이후(8 일에 평균 점수>2) 15 일과 16 일에 약 6으로 상승하는 현저한 신호를 나타낸다.
상기 시험에서 화합물 A와 B를 투약한 쥐가 미니 펌프로부터 화합물에 노출되는 혈장을 받고 있음이 확인되었다. 꼬리 정맥을 통하여 할로탄으로 가볍게 마취한 쥐로부터 미니 펌프 주입후 3 일과 10 일에 혈액 시료를 얻는다. 혈액 시료(0.5㎖)를 3.0㎖ 메탄올을 함유하는 관에 넣어서 유리되고 결합된 화합물을 추출한다. 쿠마린 펩티드 기질 Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2(Mca=(7-메톡시쿠마린-4-일)아세틸, Dpa=N-3-(2,4-디니트로페닐)-L-2,3-디아미노프로필)(참조, 나이트 등., FEBS Lett. 1992. 296, 263-266)을 사용하여 형광 분석으로 화합물 A 또는 화합물 B의 혈액 농도를 측정한다. 주입후 16 일 아니면 17 일에 연구를 종료하고, 최종적으로 할로탄으로 쥐를 마취시키고, 심장 천공으로 혈액 시료(0.5㎖)를 채취하고, 화합물 A 또는 화합물 B의 혈액 농도를 측정한다.
생물학적 예 E
본 발명 화합물의 효과를 GBS의 동물 모델에서 시험한다.
실험적 자가면역 신경염(EAN)은 말초신경계의 T 세포 매개된 자가면역 질병이다. 모델은 운동실조, 허약 및 마비와 함께 GBS의 여러 가지 병리학적 특징을 나타낸다. 동물에 말초신경에서 미엘린을 또는 보조제로 단백질 O과 같은 미엘린의 단백질 성분을 주사했을 때, EAN을 주입할 수 있다. EAN 장애는 척추 뿌리와 말초신경에서 일어나고, 위관성 단핵 세포 침윤, 축삭돌기의 탈수초화와 신경 전도 부족의 특징을 갖는다. TNFα 수준은 GBS와 EAN의 병리에 영향을 미치고; TNFα 수준은 GBS 환자의 혈액에서 상승하고, 항-TNFα 항체는 EAN의 질병 심도를 감소시킨다 (하프퉁 에이치피. Annals of Neurology 1993; 33: 563-567).
본 발명의 화합물은 쥐 EAN 모델에서 시험하고 여기서 질병 증상은 보조제로 말초신경 미엘린을 주사하여 유도한다.
화합물은 수술로 주입한 미니 펌프에서, 각각 7과 14 ㎎/㎏/일을 방출하는 5 ㎕/시간의 속도(참고. 생물학적 예 D)로 15 또는 30 ㎎/㎖을 투여한다. 1∼15 일의 실험 과정동안 화합물로 처리하면 투약-의존형 방법에서 임상 증상의 발생을 현저히 감소시킨다. 또한 화합물은 각각 14 와 28 ㎎/㎏/일을 방출하는 10 ㎕/시간의 속도로 8-15 일에 15 또는 30 ㎎/㎖를 치료적으로 투여했을 때, EAN 모델의 투약 의존형 방법에서 임상 증상은 감소한다.
생물학적 예 F
MS의 실험 모델에서의 본 발명 화합물의 활성도:
방법
마티스자크와 페리에 의하여 기술된 MS의 지연형 과민성 모델을 사용한다(마티스자크 엠케이와 페리 브이에이치. 1995 칼메트-구에린균에 대한 지연형 과민성에 따르는 중추신경계의 탈미엘린화). 숫 루이스 쥐를 마취시키고, 좌측 반구의 선조체에 105 열치사 칼메트-구에린균(BCG)을 함유하는 1㎕ 인산염 완충염 용액을 주사한다. BCG를 27G, 10㎕ 용량의 주사기로 정위에 주사한다. 주사의 등위는 정수리점+1.2㎜, 측면+3.0㎜와 깊이 4.5㎜ 이다. 4 주후, 완전한 프로인트 보조제에 107 열 치사 BCG 유기물을 함유하는 200㎕ 용액 수족 후부의 피내에 주사한다. 추가로 15 일후, 타입 Ⅱ 고추냉이 과산화 효소(HRP)의 2750U를 정맥 주사한다. 30 분후 쥐를 펜토바르비톤나트륨으로 깊이 마취시키고, 5000 U/L 헤파린을 함유하는 100㎖의 0.9%(w/v) NaCl로 심장에 전달되어 관류되게 한 다음, 2% 파라포름알데히드와 0.05% 글루타르알데히드를 함유하는 200㎖의 파르포름알데히드-리신-과요오드산염 고정제(PLP)를 관류시킨다. 뇌를 제거하고, PLP에서 4 시간동안 더 후-고정시키고, 4℃에서 하룻밤 30% 수크로오스에 침지하여 동결방지한 후 티슈-테크 O.C.T.(미국 엘크하트의 마일)에 넣고, 액체 질소로 냉동시킨다. 치관 유리-부유 50㎛ 두께 섹션을 핸커-야트스 방법(페리 브이에이치 등 1992)에 의한 HRP 국부화로 절단한다. 이 공정은 다음의 BCG 특징을 갖는 정위주사 부위에서 지연형 과민성 반응이 발생한다: HRP의 관외 존재로 오염에 의하여 나타나는 혈액-뇌관 장벽의 국부 파손; 백혈구 공통 항원의 고분자 중량 형태에 특수한 항체 OX-22로 오염되어 나타나는 림프구의 침윤; 종류 Ⅱ 주요 조직화 합성 항원에 특수한 항체 OX-6으로 오염되어 나타나는 백혈구의 활성화; 미엘린 염기성 단백질에 대한 항체로 오염되어 나타나는 미엘린 파손. 이러한 특징들은 MS를 갖는 환자의 중추 신경계에 보이는 활성 장애 또는 플라크의 모든 특징이다. 림프구는 오염이 가장 심한 영역에서 OX-22 양성 세포의 수를 계산하여 열거한다. 목적하는 단일 분야에서 세포의 수는 세포/㎟으로 기록하고 표시한다. MHC 종류 Ⅱ 발현부분, 혈액 뇌관 장벽 누출과 탈미엘린화는 컴퓨터 보조 영상분석을 사용하여 계산하고, 출력 데이타는 ㎟로 표현한다.
본 발명 화합물의 효과는 BCG를 이차 주사한 후 5 일부터 시작하고, 15 일까지 계속하여 매일 2 회 30 ㎎/㎏을 경구투여 하여 쥐를 처리하여서 평가한다. 본 발명의 화합물은 0.01% Tween 80을 함유하는 인산염 완충염 부형제로 제제한다. 비교 동물에는 부형제만 투여한다.
본 발명의 화합물로 처리된 동물에서 혈액-뇌관 장벽 누출부분, MHC 종류 Ⅱ 발현, 탈미엘린화와 T 세포의 수는 연구자 T 시험을 사용하여 부형제로 처리된 비교물과 비교한다.
결과
부형제로 처리된 동물에서 DTH 반응은 혈액-뇌관 장벽의 파손, 림프구의 침윤, MHC 종류 Ⅱ 발현과 탈미엘린화의 특징을 나타낸다. 본 발명의 화합물로 처리된 동물에서는 혈액-뇌관 장벽 누출부분(p<0.05)과 침윤 T 세포수(p<0.0001)의 현저한 감소를 나타낸다. 탈미엘린화 부분과 MHC 종류 Ⅱ 발현의 감소는 관찰되지만, 통계적 의미에는 도달하지 못한다.
MS의 DTH 모델에서 본 발명 화합물의 효과:
부형제 화합물
혈액 뇌관 장벽 누출 6.235±1.953 2.042±0.487
T 세포 침윤 851.1±66.5 341.2±21.9
MHC 종류 Ⅱ 발현 1.763±0.370 1.318±0.300
탈미엘린화 0.960±0.329 0.708±0.227
값은 평균치±평균치의 표준오차이다.

Claims (5)

  1. 다음 식(Ⅱ)의 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드 또는 이의 약학적으로 수용할 수 있는 염 또는 수화물.
  2. 약학적으로 수용할 수 있는 담체와 함께 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드 또는 이의 약학적으로 수용할 수 있는 염 또는 수화물로 이루어지는, 류마티스성 관절염, 암, 다발성 경화증, 기앵 바레 증후군 또는 건선의 치료와 이러한 질병의 증후군과 병리적 발현을 경감시키는데 사용하는 약학적 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 류마티스성 관절염, 암, 다발성 경화증, 기앵 바레 증후군 또는 건선의 치료와 이러한 질병의 증후군과 병리적 발현을 경감시키는데 사용하는 조성물.
  4. 사람을 포함한 포유류의 류마티스성 관절염, 암, 다발성 경화증, 기앵 바레 증후군 또는 건선 치료용 약학적 조성물을 제조하는데 사용하는 N1-[2,2-디메틸-1S-(피리딘-2-일카르바모일)-프로필]-N4-히드록시-2R-이소부틸-3S-메톡시-석신아미드 또는 이의 약학적으로 수용할 수 있는 염 또는 수화물.
  5. 삭제
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