KR100337959B1

KR100337959B1 - 돌연변이체포스포에놀피루베이트카복실라제,이의유전자및아미노산의제조방법

Info

Publication number: KR100337959B1
Application number: KR1019960700741A
Authority: KR
Inventors: 마사카즈 스기모토; 도모코 스즈키; 히로시 마쓰이; 가쓰라 이즈이
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1993-08-24
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 2002-11-23
Also published as: SK20496A3; DE69430919D1; MY112250A; PL313119A1; AU682547B2; BR9407625A; US5876983A; EP0723011B1; HU219600B; CN1133615A; WO1995006114A1; ATE220099T1; CN1179043C; CZ289051B6; PL181380B1; KR960704029A; CZ52496A3; HUT73690A; US5919694A; HU9600240D0

Abstract

본 발명은 포스포에놀피루브산 카복실라제의 N-말단으로부터 625번 글루탐산을 리신으로 치환하는 변이, 또는 N-말단으로부터 438번의 아르기닌을 시스테인으로 치환하는 변이 등과 같은 변이를 갖는 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자를 에스케리키아 콜라이 또는 코리네형 세균에 도입히고, 아스파르트산에 의해 실질적으로 억제되지 않는 포스포에놀 피루브산 카복실라제를 생성하여 아미노산을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

돌연변이체 포스포에놀피루베이트 키복실라제, 이의 유전자 및 아미노산의 제조방법

포스포에놀피루베이트 카복실라제는 거의 모든 세균 및 모든 식물에서 발견되는 효소이다. 이 효소의 역할은 아스파르트 산과 글루탐산의 생합성, 및 시트르산 사이클에 C₄디카복실산을 공급하여 이의 전환(turnover)을 유지시키는데 있다. 그러나, 미생물을 사용하는 아미노산의 발효적 생산에 있어서, 당해 효소의 영향을 나타낸 보고서는 거의 없으며, 그의 중요성을 명백하지 않다[참조: Atsushi Yokota and Isamu Shiio. Agric. Biol. Chem., 52. 455-463(1988), Josef Cremer et al., Appl. Environ. Microbiol., 57. 1746-1752(1991). Petra. G. Peters-Weintisch. FEMS Microbiol. Letters. 112. 269-274(1993)].

한편, 아미노산은 단백질의 성분으로서 세포에 보편적으로 존재하는 화합물이지만, 경제적인 에너지 대사 및 물질 대사를 위해 이의 생산은 엄격히 조절된다. 이러한 조절은 주로 피이드백 조절이며, 이러한 조절에 있어 대사 경로의 최종 생성물은 경로의 선행 단계를 촉매하는 효소의 활성을 억제한다. 포스포에놀피루베이트 카복실라제도 또한 이의 활성의 발현에 있어 다양하게 조절된다.

예를 들며, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 포함되는 미생물의 포스포에놀 피루베이트 카복실라제의 경우, 활성은 아스파르트 산에 의해 역제된다. 따라서, 포스포에놀피루베이트 카복실라제가 관여하는 상술한 아미노산 생합성도 또한 아스파르트 산에 의해 억제된다.

선행 기술에 있어서, 아미노산 발효의 효율적인 생성을 위해 다양한 기술이 개발되어 왔으며, 피이드백 조절에 비민감성인 것으로 전환된 돌연변이 균주를 사용하여 류신, 이소류신, 트립토판 및 페닐알라닌의 발효적 생산이 수행되어 왔다. 그러나, 아스파르트 산에 의한 억제에 비민감성인 것으로 전환된 돌연변이체 포스포에놀 피루브산 카복실라제, 및 이를 아스프르트산 류와 글루탐산 류의 아미노산의 발효 생산에 이용한 어떠한 시도도 알려져 있지 않다.

한편, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 유전자인 ppc 유전자는 이미 클로닝되어 있으며, 또한 이의 뉴클레오티드 서열도 결정되어 있다[참조: Fujita, N., Miwa, T. Ishijima. S., lzui, K. and Katsuki. H., J. Biochem., 95. 909-916(1984)]. 그러나, 아스파르트 산에 의한 억제를 탈감작화시키는 돌연변이체에 대해서는 어떠한 보고도 없다.

본 발명은 상술된 관점에서 이루어졌으며, 본 발명의 목적은 아스파르트산에 의한 피이드백 억제가 실질적으로 탈감작화된 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 이를 암호화하는 유전자 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

발명의 기술

상기 목적을 달성하기 위해 집중적으로 연구한 결과, 본 발명자는 에스케리키아 콜라이의 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 특정 부위에 존재하는 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 아스파르트 산에 의한 억제가 실직적으로 탈감작화됨을 발견하였고, 이와 같은 돌연변이체 효소를 암호화하는 유전자를 수득하는데 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉. 본 발명은 에스케리키아 속에 속하는 미생물로부터 기원하고 아스파르트산에 의한 피이드백 억제를 탈감작화시키는 돌연변이를 갖는 돌연변이체 포스포에 놀피루베이트 카복실라제, 및 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 DNA 서열에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 DNA 단편을 함유하는 에스케리키아 속 또는 코리네포름 제균에 포함되는 미생물, 및 이들 미생물을 바람직한 배지에서 배양하고 이 배지로부터 L-리신, L-트레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글루탐산, L-아르기닌 및 L-프롤린 중에서 선택된 아미노산을 분리함을 포함하는 아미노산의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 명세서에서는 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 DNA 서열, 또는 여기에 프로모터를 함유하는 DNA 서열을 간단히 "본 발명의DNA 서열", "돌연변이체 유전자" 또는 "포스포에놀피루배이트 카복실라제 유전자" 로서 언급한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

<1> 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제

본 발명의 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제(이하, 간단히 "돌연변이체 효소"라 한다)는 에스케리키아 속에 속하는 미생물의 포스포에놀피루베이트 카복실라제이며, 이것은 아스파르트 산에 의한 피이드백 억제를 탈감작화시키는 돌연변이를 갖는다.

이와 같은 돌연변이는 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 효소 활성을 감소시키지 않으면서도 상기 피이드백 역제를 실질적으로 탈감작화시키는 모든 돌연변이일 수 있으며, 이에 대해서는 이러한 돌연변이를 갖는 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제가 에스케리키아 속에 속하는 미생물의 세포내에 존재하도록 하는 경우.

야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 생성하는 에스케리키아 속에 속하는 미생물에 대해 생육 억제 작용을 나타내고;

상기 생육 억제 작용이 L-글루탐산 또는 L-아스파르트 산의 존재에 의해 회복되며,

야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제 활성을 억제시키는 특성을 갖는 화합물에 대한 내성을 세포에게 부여하는 돌연변이가 예시될 수 있다.

더욱 구체적으로는, 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여

(1) 625번의 글루탐산이 리신으로 치환된 돌연변이.

(2) 222번의 아르기닌이 히스티딘으로, 및 223번의 글루탐산이 리신으로 각각 치환된 돌연변이.

(3) 288번의 세린이 페닐알라닌으로, 289번의 글루탐산이 리신으로 551번의 메티오닌이 이소류신으로, 및 804번의 글루탐산이 리신으로 각각 치환된 돌연변이.

(4) 867번의 알라닌이 트레오닌으로 치환된 돌연변이.

(5) 438번의 아르기닌이 시스테인으로 치환된 돌연변이 및

(6) 620번의 리신이 세린으로 치환된 돌연변이를 예시할 수 있다.

동시에, 에스케리키아 속에 속하는 미생물의 포스포에놀피루베이트 카복실라제로서 에스케리키아 콜라이의 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자로부터 유도되는 아미노산 서열[참조: Fujita. N.. Miwa, T.. Ishihima. S.. lzui. K. and Katsuki, H.. J. Biochem., 95. 909-916(1984)]을 서열 목록의 서열 확인 번호 : 2에 나타낸다. 또한, 에스케리키아 콜라이의 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 함유하는 플라스미드 pT2의 전체 뉴클레오티드 서열을 아미노산 서열과 함께 서열 확인 번호: 1에 나타낸다.

상기 돌연변이체 효소는 하기된 본 발명의 DNA 서열에 의해 암호화되며, 이 효소는 상기 DNA 서열을 에스케리키아 콜라이 등에서 발현시켜 제조한다.

(2) 본 발명의 DNA 서열 및 이를 포함하는 미생물

본 발명의 DNA 서열은 상기 돌연변이체 효소를 암호화한 DNA 서열이며, 에스케리키아 속에 속하는 미생물의 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 DNA 단편내 암호화 영역에 아스파르트 산에 의한 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 피이드백 억제를 탈감작화하는 돌연변이를 가진다.

구체적으로, 상기 (1) 내지 (6)중 어느 하나의 돌연변이를 갖는 포스포에놀 피루베이트 카복실라제를 암호화한 DNA 서열, 예를 들면, 서열 확인 번호: 1의 뉴클레오티드 서열과 관련하여

ⅰ) 염기 번호 2109 내지 2111의 GAA가 AAA 또는 AAG로 전환된 돌연변이.

ⅱ) 염기 번호 900 내지 902의 CGC가 CAT 또는 CAC로, 903 내지 905의 GAA가 AAA 또는 AAG로 각각 전환된 돌연변이.

ⅲ) 염기 번호 1098 내지 1100의 TCT가 TTT 또는 TTC로, 1101 내지 1103의 GAA가 AAA 또는 AAG로, 1887 내지 1889의 ATG가 ATT, ATC 또는 ATA로, 및 2646 내지 2648의 GAA가 AAA 또는 AAG로 각각 전환된 돌연변이.

ⅳ) 2835 내지 2937의 GCG가 ACT, ACC, ACA 및 ACG중 어느 하나로 전환된 돌연변이.

ⅴ) 1548 내지 1550의 CGT가 TGT 또는 TGC로 전환된 돌연변이 및

ⅵ) 2094 내지 2096의 AAA가 TCT, TCC, TCA 또는 TCG로 전환된 돌연변이중의 어느 하나를 갖는 DVA 서열이 예시될 수 있다.

이들 돌연변이체 유전자는, 야생형 효소 유전자로서 및 다른 돌연변이가 있는 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 숙주에 적합한 벡터 DNA와 연결하여 수득한 재조합 DNA를 돌연변이 처리하고, 재조합 DNA에 의해 형질전환체로부터 스크리닝하여 수득한다. 달리는, 야생형 효소를 생성하는 미생물을 돌연변이 처리하고, 돌연변이체 효소를 생성하는 돌연변이체 균주를 제조한 다음, 이 돌연변이체 균주로부터 돌연변이체 유전자를 스크리닝하는 것도 가능하다. 재조합 DNA의 돌연변이 처리에는 하이드록실아민 등을 사용할 수 있다. 또한, 미생물 자체를 돌연변이 처리할 경우, 통상 인공 돌연변이에 사용되는 약물 또는 방법을 사용할 수 있다.

또한, 상기 돌연변이체 유전자는 오우버래핑 연장 방법(overlapping extension method)[참조: Ho. S. N., Hunt, H. D., Horton. R. M., Pullen, J. K. and Pease. L. R.. Gene, 77, 51-59 (1989)]. 부위 특이적 돌연변이 방법[참조: Kramer. W. and Frits. H. J.. Meth. in Enzymol.. 154. 350 (1987); Kunkel. T. A. et al.. Meth. in Enzymol.. 154. 367 (1987)]등과 같은 방법에 따라, 야생형 효소 유전자로서 또는 다른 돌연변이를 갖는 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자내에 아미노산 치환, 삽입, 결실 등과 같은 돌연변이를 도입함으로써 수득할 수 있다. 이러한 방법은 돌연변이되지 않은 유전자 DNA를 주형으로 사용하고, 돌연변이점에 미스매취(mismatch)를 함유하는 합성 DNA를 하나의 프라이머로서 사용하여 상기 유전자 DNA의 상보성 쇄를 합성함으로써 돌연변이를 도입하는 원리에 근거하고 있다. 이러한 방법을 사용함으로써, 목적 부위에서 의도된 돌연변이를 유발시킬 수 있다.

한편, 양 말단에 제한 효소 절단 말단을 가지며 돌연변이점의 양측을 포함하는 서열을 합성하고, 돌연변이되지 않는 유전자의 상응하는 부분을 치환시킴으로써돌연변이를 도입할 수 있다[카세트 돌연변이 방법(cassette mutation method)].

돌연변이의 도입에 사용되는 야생형 효소 유전자이거나 다른 돌연변이를 갖는 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자는 에스케리키아 속에 포함되는 미생물의 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 유전자인 한 모든 유전자일 수 있으며, 염기 서열이 결정되어 클로닝된 유전자가 바람직하다. 클로닝되어 있지 않을 경우, PCR 방법등을 사용하여 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭 및 분리시킨다음, 적당한 벡터를 사용하여 클로닝을 수행할 수 있다.

상기 기술된 유전자의 예에는 클로닝되어 있고 서열이 결정되어 있는 에스케리키아 콜라이의 유전자[참조: Fujita, N., Miwa, T.. Ishihima, S., Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 95. 909-916 (1984)]가 예시될 수 있다. 이 유전자의 암호화 영역내의 서열은 서열 확인 번호; 1에 도시되어 있다(염기 번호 237 내지 2888).

돌연변이 유전자를 함유하는 숙주의 스크리닝은 아스파르트 산의 동족 화합물을 사용하여 수행할 수 있다. 동족 화합물은 하기 성질을 갖는 것이 바람직하다. 즉, 야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 생성하는 에스케리키아 속에 속하는 미생물에 대해 성장 억제 작용을 나타내고, 상기 성장 억제 작용이 L-글루탐산 또는 L-아스파르트 산의 존재에 의해 회복되며, 야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제 활성을 억제한다.

야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 생성하는 에스케리키아 속에 속하는 미생물(예: 에스케리키아 콜라이 HB101)로부터 미생물 성장 억제를 지표로서사용하여, 상기의 동족 화합물에 대해 내성이 있는 돌연변이 균주를 선택하는 경우, 아스파르트 산에 의한 피이드백 억제가 탈감작화된 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 생성하는 숙주 미생물을 수득할 가능성이 높다.

포스포에놀피루베이트 카복실라제 억제제의 일반적인 구조로서 C₄디카복실산 구조가 필수적으로 제공된이 제안되어 있다. 이와 같은 관점으로부터, 본 발명자들은 여러 가지 화합물을 스크리닝하였다. 에스케리키아 콜라이 HB101을 LB 배지에서 배양하고, DL-2-아미노-4-포스포노부티르산, 브로모 석신산, 메소-2,3-디브로모석신산, 2,2-디플루오로석신산, 3-브로모피루브산, α-케토라티르산 α-케토아디핀산, DL-트레오-β-하이드록시아스파르트산, L-아스파르트산 β-메틸 에스테르, α-메틸-DL-아스파르트산, 2,3-디아미노석신산 또는 아스파르트산-β-하이드라지드 중 어느 하나를 함유하는 M9 배지(티아민 20㎍/ml, Leu 및 Pro 각각 3㎍/ml을 함유)로 옮기고, 시간 경과에 따라 660nm에서의 배지 흡광도를 측정함으로써 성장을 모니터한다.

또한, 이들 화합물이 성장 억제 농도로 존재할 경우, 핵산(우리딘, 아데노신 각 10㎎/dl). 글루탐산 또는 아스파르트 산 족의 아미노산(Asp: 0.025%. Met. Thr. Lys 각 0.1%)을 첨가하여, 억제가 회복되는지를 조사한다.

그 결과로서. 3종의 화합물: 3-브로모피루베이트(3BP) (1), 아스파르테이트-β-하이드라지드(AHY) (2) 및 DL-트레오-β-하이드록시아스파르테이트(βHA)(3)을선택한다.

이들 동족 화합물에 의한 에스케리키아 콜라이의 성장 억제를 제1도 내지 제3도에 도시한다. 또한, 상기의 억제 회복 물질을 단독으로, 또는 2종 또는 3종의 혼합물로서 가할 경우 에스케리키아 콜라이의 성장 회복을 제4도 내지 제6도에 도시한다. 또한 대조군으로서 억제 물질의 부재하에 억제 회복 물질을 가한 경우의 성장을 제7도에 도시한다. 부수적으로 제4도 내지 제7도에서 첨가물 1,2 및 3은 헥산, 글루탐산 또는 아스파르트산 족의 아미노산을 각각 나타낸다.

추가로, 포스포에놀피루베이트 카복실라제에 대한 동족 화합물에 의한 활성억제를 조사한다. 문헌[참조: The Journal of Biochemistry. Vol. 67. No. 4 (1970)]에 기술된 방법에 따라 조효소를 에스케리키아 콜라이 HB101 균주로부터 제조하고, 문헌 [참조: Eur. J. Biochem.. 202. 797-803 (1991)]에 기술된 방법에 따라 효소 활성을 측정한다.

LB 배지에서 배양된 에스케리키아 콜라이 HB101을 분쇄하고, 현탁액을 원심 분리한 다음 상층액을 수득하여 조 효소 용액으로 사용한다. 효소 활성의 측정은, 2mM 칼륨 포스포에놀 피루베이트, 0.1mM NADH. 0.1M 트리스-아세테이트(pH 8.5). 1.5U 말레이트 데하이드로게나제 및 조 효소를 함유하는 측정계에서, 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 아세틸-조효소 A를 0.lmM의 농도로 존재시켜 340nm에서의 흡광도의 감소를 측정하여 수행한다. 그 결과를 제 8도에 도시한다.

상기의 결과로부터, 상기 3종류의 화합물은 에스케리키아 콜라이의 생육을 억제하고, 핵산만으로는 이러한 억제를 회복할 수 없지만 글루탐산 또는 아스파르트산 류의 아미노산을 첨가함으로써 당해 억제를 회복할 수 있음은 자명하다. 따라서, 이들 동족 화합물은 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 선택적 억제제인 것으로 추정된다. 하기 기술되는 실시예에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 이들 화합물을 사용하여 돌연변이체 포스포에놀 피루베이트 카복실라제를 생성하는 에스케리키아 콜라이를 선택하는데 성공하였다.

상기 화합물을 사용하여 목적하는 돌연변이체 효소 유전자를 지닌 형질전환체를 스크리닝하고 재조합 DNA를 회수할 경우, 돌연변이체 효소 유전자가 수득된다. 달리는 미생물 자체를 돌연변이 처리할 경우, 상술된 화합물을 사용하여 목적하는 돌연변이체 효소 유전자를 갖는 돌연변이체 균주를 스크리닝하고, 목적하는 돌연변이체 효소 유전자를 함유하는 DNA 단편을 당해 균주로부터 분리하여, 이를 적당한 벡터와 연결하면 돌연변이체 효소 유전자가 수득된다.

다른 한편으로, 본 발명자들은 에스케리키아 콜라이의 아스파르테이트 결합단백질에 존재하는 아르기닌 잔기의 중요성 [참조: Krikos. A. Mouth. N., Boyd. A. and Simon. M. I. Cell, 33, 615-622 (1983), Mowbray, S. L and Koshland, D. E. J. Biol. Chem., 264. 15638-15643 (1990), Milburn. M. V., Prive, G. G., Milligan. D. L., Scott, W. G., Yeh. J., Jancarik. J., Koshland. D. E. and Kim. S. H., Science. 254. 1342-1347 (1991)]에 주목하여 예의 연구한 결과, 포스포에놀 피루베이트 카복실라제의 438번의 아르기닌을 시스테인으로 전환함으로써 아스파르트산에 의한 억제가 실질적으로 탈감작화됨을 발견하였다. 438번의 아르기닌을 시스테인으로 전환시키기 위해, 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 유전자중 438번의 아르기닌의 코돈을 시스테인의 코돈으로 전환시킬 수 있다. 예를 들면, 서열 확인 번호: 1에서, 뉴클레오티드 번호 1548 내지 1550의 CGT를 TGT 또는 TGC로 전환시킬 수 있다.

또한, 본 발명자들은 단백질중의 리신 잔기를 화학적으로 변형시키는 화합물인 2.4.6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS)를 사용하여 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 리신 잔기의 화학적 변형을 수행하였다. 변형 반응을 수행하는 동안, 포스포 에놀피루베이트 카복실라제의 억제제로서 사용할 수 있는 말산을 함께 존재하게 할 수 있다. 즉, 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 결합 부분에 인접한 리신 잔기는 결합된 말산에 의해 보호될 것이며, 화학적으로 변형되지 않을 것이다. 결과적으로, 620번의 리신 잔기는 말산이 포스포에놀피루베이트 카복실라제와 결합하는데 중요함을 시사하며, 620번의 리신 잔기를 세린 잔기로 전환함으로써 포스포에놀피 루베이트 카복실라제의 효소 활성을 유지하지만, 아스파르트 산에 의한 피이드백억제는 탈감작화됨이 밝혀졌다. 620번의 리신 잔기를 세린 잔기로 전환시키기 위해, 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 유전자의 620번 리신의 코돈을 세린의 코돈으로 전환시킬 수 있다. 예를 들면, 서열 확인 번호: 1에서 뉴클레오티드 번호 2094 내지 2096의 AAA를 TCT, TCC, TCA, TCG, AGT 또는 AGC로 치환시킬 수 있다.

코돈의 전환은 오우버래핑 연장 방법[참조: Ho, S. N., Hunt. H. D., Horton. R. M., Pullen, J. K. and Pease, L. R., Gene. 77, 51-59 (1989)]. 부위 특이적 돌연변이 방법[참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987): Kunkel. T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)]등의 방법에 따라 야생형 효소 유전자 또는 다른 돌연변이를 갖는 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자내로 아미노산의 치환, 삽입, 결실 등과 같은 돌연변이를 도입함으로써 달성할 수 있다. 이러한 방법은 돌연변이되지 않은 유전자 DNA를 주형으로서 사용하고 돌연변이점에 미스매치를 함유하는 합성 DNA를 프라이머로서 사용하여 상기 유전자 DNA의 상보성 쇄를 합성함으로써 돌연변이를 도입한다는 원리에 근거하고 있다. 이들 방법을 사용함으로써 목적 부위에서 의도된 돌연변이를 유발시킬 수 있다.

한편, 두 말단에 제한 효소 절단 말단을 갖고 돌연변이점의 양 사이드를 함유하는 시열을 합성하여, 돌연변이 되지 않은 유전자의 상응하는 부위를 치환함으로써 돌연변이를 도입할 수 있다(카세트 돌연변이 방법).

상기한 바와 같이 돌연변이를 도입한 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 DNA 단편을 적당한 숙주-벡터 시스템을 사용하여 발현시킴으로써 돌연변이체 효소를 생성할 수 있다. 한편, 본 발명의 DNA 단편을 숙주 염색체 DNA 내로 통합함으로써 형질 전환을 수행할 경우에도 목적하는 돌연변이체 효소를 생성할 수 있다.

숙주로서는 에스케리키아 속에 속하는 미생물(예: 에스케리키아 콜라이. 코리네포름 세균 등)을 들 수 있다. 코리네포름 세균은 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 세균, 종래에 브레비 박테리움(Brevibacterium) 속으로 분류 되었지만 현재 코리네박테리움 속 세균으로 단일화된 브레비박테리움 속 세균, 및 코리네박테리움 속 세균과 밀접하게 관련된 브레비박테리움 속 세균을 포함한다. 또한 아미노산 제조에 바람직한 숙주는 후술한다.

한편, 벡터 DNA로서는 플라스미드 벡터가 바람직하며, 숙주의 세포 내에 자가 복제(self-replication)할 수 있는 플라스미드가 바람직하다. 숙주가 에스리키아 콜라이일 경우, 예를 들어 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 등이 예시된다. 또한 파아지 DNA의 벡터도 이용할 수 있다.

추가로, 숙주가 코리네포름 세균일 경우, 사용될 수 있는 벡터 및 그들을 포함하는 숙주는 하기 예시된다. 동시에, 국제 기탁 기관의 기탁 번호를 괄호에 표시한다.

pAJ655 에스케리키아 콜라이 AJ11882(FERM BP-136)

코리네박테리움 글루타미쿰 SR8201(ATCC 39135)

pAJ1844 에스케리키아 콜라이 AJ11883(FERM BP-137)

코리네박테리움 글루타미쿰 SR8202(ATCC 39136)

pAJ611 에스케리키아 콜라이 AJ11884(FERM BP-138)

pAJ3148 코리네박테리움 글루타미쿰 SR8023(ATCC 39137)

pAJ440 바시루스 서브틸리스 AJ11901(FERM BP-140)

이들 벡터는 기탁 미생물로부터 다음과 같이 수득할 수 있다. 대수 증식기상에서 수집한 세포를 리소자임 및 SDS를 사용하여 용균시키고, 30000 × g으로 원심분리하여 용해물로부터 수득한 상층액에 폴리에틸렌 글리콜을 가한 다음, 세슘클로라이드-에티듐 브로마이드 평형 밀도 구배 원심분리에 의해 벡터를 분리 및 정제한다.

본 발명의 DNA 서열을 상기 벡터내에 삽입하여 수득한 재조합 벡터로 에스케리키아 콜라이를 형질전환시키기 위해, 세포를 염화 칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 향상시키는 방법 [참조: Mandel. M. and Higa. A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)] 등과 같이 통상 에스케리키아 콜라이의 형질전환에 사용되는 방법을 사용 할 수 있다.

또한, 코리네포름 세균을 형질 전환시키는 방법으로서는 상기 세포를 염화칼슘으로 처리하는 방법, 또는 세포가 DNA를 혼입할 수 있는 특정한 성장 시기에 혼입을 수행하는 방법[참조: Duncan, C. H. et al.에 의한 바실루스 서브틸리스에 관한 보고]이 있다. 또한 플라스미드 DNA를 용이하게 혼입시키는 DNA 수용체의 프로토플라스트(protoplast) 또는 스페로플라스트(spheroplast)를 형성하여 세균 세포내로의 혼입을 수행할 수 있다. 이들은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis),액티노마이세스(Actinomyces) 및 효모의 경우 알려져 있다[참조: Chang. s. et al., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979), Bibb et al., Nature, 274, 398 (1978), Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75 1929 (1978)]. 그 외에, 코리네포름 세균을 형질전환시키는 방법이 일본국 특허 공개 공보 제2-207791호에 기술되어 있다.

본 발명의 DNA 서열을 상기 숙주내에서 발현시키기 위해서는 lac, trp, PL 등과 같이 미생물 내에서 효율적으로 작용하는 프로모터를 사용하거나, 본 발명의 DNA 서열이 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자의 프로모터를 함유할 경우, 그 자체로서 사용할 수 있다. 달리는, 코리네포름 세균을 숙주로서 사용할 경우, 브레비박테리움 속 세균으로부터 기원하는 공지의 trp 프로모터[참조: 일본국 특허 공개 공보 제62-244382호] 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 DNA 서열을 자가 복제 가능한 벡터 DNA에 삽입하고 숙주내에 도입하여 이를 플라스미드로서 숙주에 포함시킬 수 있으며, 트란스포손(transposon)[참조: Berg, D. E. and Berg, C. M., Biol/Technol., 1, 417(1983)], Mu 파아지[참조: 일본국 특허 공개 공보 제2-109985호] 또는 동종 재조합[참조: Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Lab. (1972)]을 사용한 방법으로 미생물의 염색체에 본 발명의 DNA 서열을 통합할 수 있다. 또한, 코로네포름 세균내에 본 발명의 DNA를 통합시키기 위해, 일본국 특허 공개 공보 제5-7491호에 기술된 온도 민감성 플라스미드를 사용할 수 있다.

상기에 기술된 바와 같이 발명의 DNA 서열로 형질전화시킨 미생물을 배양하여 이 DNA 서열을 발현시킬 경우, 돌연변이체 효소가 수득된다. 이와 같이 수득된 돌연변이체 효소가 아스파르트 산에 의한 피이드백 억제를 탈감작화사키는지는 효소 반응계에 아스파르트 산을 가하여 활성을 측정함으로써 명백해진다. 효소 활성의 측정에는 분광학적 방법[참조: Yoshinage, T., Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970)]등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA 서열은 아스파르트 산에 의한 피이드백 억제가 탈감작화된 돌연변이체 효소를 암호화하므로, 이 DNA을 포함하는 미생물은, 이하 기술된 바와 같은, 아스파르트산 족 또는 글루탐산 족의 아미노산 효율적인 발효 생성에 이용될 수 있다.

후술된 실시예에서 수득된 돌연변이체 효소 유전자를 포함하는 에스케리키아 콜라이 AJ12907, AJ12908, AJ12909 및 AJ12910은 1993년 8월 3일에 통상산업성 공업 기술원 생명공학 공업기술 연구소(National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Iudustrial Science and Technology) (우편 번호 305, 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1chap 1반 3고)에 각각의 차례대로 FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776 및 FERM P-13777로 기탁되었고, 원기탁으로부터 부다페스트 조약에 근거한 국제 기탁으로 이관하여 기탁번호 FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736 및 FERM BP-4737로 기탁되었다.

<3> 아미노산의 제조방법

본 발명의 DNA 서열을 포함하는 미생물을 적절한 배지에서 배양하고, 생성된 아미노산을 분리함으로써 아미노산을 제조할 수 있다. 그러한 아미노산으로서, L-리신, L-트레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글루탐산, L-아르기닌 및 L-프롤린이 예시될 수 있다.

본 발명의 DNA 서열을 도입하여 각각의 아미노산을 제조하는데 사용되는 바람직한 숙주 및 배양 방법을 하기 예시할 것이다.

(1) 본 발명의 아미노산 제조방법에 바람직한 숙주

(ⅰ) L-리신 제조에 바람직한 숙주

본 발명에 따른 L-리신의 제조에 사용되는 숙주로서, 에스케리키아 속 세균, 바람직하게는 L-리신-생성 에스케리키아 콜라이를 예로 들 수 있다. 구체적인 예에는 리신 동족체에 대해 내성을 갖는 돌연변이 균주가 있다. 이와 같은 리신 동족체는 에스케리키아 속 미생물의 성장을 억제하는 동족체이지만, 이러한 억제는 L-리신이 배지내에 공존한다면 전체적으로나 부분적으로 탈감작화된다. 예를 들면, 옥사리신, 리신 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-시스테인(이하 "AEC"로 약기한다), γ-메틸리신, α-클로로카프롤락탐 등이 있다. 이들 리신 동족체에 내성이 있는 돌연변이 균주는 통상의 인공 돌연변이 처리를 에스케리키아 속의 미생물에 적용하여 수득할 수 있다. 구체적으로는, L-리신 제조에 사용되는 균주로서 에스케리키아 콜라이 AJ11442(FERM P-5084로 기탁됨, 일본국 특허 공개 공보 제56-18596호의 471 페이지 좌측 하단 참조)가 예시된다.

한편, 코리네포름 세균의 다양한 인공 돌연변이 균주가 L-리신 생성 세균으로 사용되어 왔으며, 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 인공 돌연변이 균주는 다음과 같다: AEC 내성 돌연변이 균주; 이의 성장에 L-호모세린과 같은 아미노산을필요로 하는 돌연변이 균주(일본국 특허 공개 공보 제48-28078호 및 제56-6499호); AEC에 대해 내성을 나타내고, L-류신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌, L-발린 등과 같은 아미노산을 요구하는 돌연변이 균주(미합중국 특허 제3708395호 및 제3825472호); DL-α아미노-ε-카프롤락탐, α-아미노-라우릴락탐, 퀴노이드 및 N-라우로일류신에 대해 내성을 나타내는 L-리신-생성 돌연변이 균주; 옥살로아세테이트 데카복실라제 또는 호흡계 효소의 억제제에 대해 내성을 나타내는 L-리신-생성 돌연변이 균주(일본국 특허 공개 공보 제50-53588호, 제50-31093호, 제52-102498호, 제53-86089호, 제55-9783호, 제55-9759호, 제56-32995호 및 제56-39778호, 및 일본국 특허 공보 제53-43591호 및 제53-1833호); 이노시톨 또는 아세트산을 요구하는 L-리신-생성 돌연변이 균주(일본국 특허 공개 공보 제55-9784호 및 제56-8692호); 플루오로피루베이트 또는 34℃ 이상의 온도에 대해 민감성을 나타내는 L-리신-생성 돌연변이 균주(일본국 특허 공개 공보 제55-9783호 및 제53-86090호); 및 에틸렌 글리콜에 대해 내성을 나타내고 L-리신을 생성하는 브레비 박테리움 또는 코리네박테리움의 돌연변이 균주(미합중국 특허원 제333455호 참조).

리신 제조에 사용되는 구체적인 코리네포름 세균의 예는 다음과 같다:

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ12031(FERM-BP277). 일본국 특허 공개 공보 60-62994호 525 페이지 참조;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 39134. 일본국 특허 공개 공보 제60-62994호 473페이지 우측 하단 참조;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ3463(FERM-P 1987). 일본국 특허 공보 제51-34477호 참조.

또한, 이하 기술된 코리네포름 세균의 아생형 균주도 동일한 방법으로 본 발명에 사용할 수 있다.

코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870

(Corynebacterium acetoacidophilum)

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806

(Cortnebacterium acetoglutamicum)

코리네박테리움 칼루나에 ATCC 15991

(Corynebacrerium callunae)

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032

(Corynebacterium glutamicum)

ATCC 13060

브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020

(Brevibacterium divaricatum)

브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869

(Brevibacterium lactofermentum)

코리네박테리움 리리움 ATCC 15990

(Corynebacterium lilium)

코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965

(Corynebacterium melassecola)

브레비박테리움 사카로리티쿰 ATCC 14066

(Brevibacterium saccharolyticum)

브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC 14068

(Brevibacterium immariophilum)

브레비박테리움 로세움 ATCC 13825

(Brevibacterium roseum)

브레비박테리움 플라붐 ATCC 13826

(Brevibacterium flavum)

브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC 19240

(Brevibacterium thiogenitalis)

마이크로박테리움 암모니아필룸 ATCC 15354

(Microbacterium ammoniaphilum)

(ⅱ) L-트레오닌 제조에 바람직한 숙주

에스케리키아 콜라이 B-3996(RIA 1867), 일본국 특허 공개 공보 제3-501682호(PCT) 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ12349(FERM P-9574), 일본국 특허 공개 공보 제2-458호 887 페이지 좌측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ12351(FERM P-9576), 일본국 특허 공개 공보 제2-458호 887 페이지 우측 하단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ12352(FERM P-9577), 일본국 특허 공개 공보 제2-458호 888 페이지 좌측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11332(FERM P-4898), 일본국 특허 공개 공보 제2-458호 889 페이지 좌측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ12350(FERM P-9575), 일본국 특허 공개 공보 제2-458호 889 페이지 좌측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ12353(FERM P-9578), 일본국 특허 공개 공보 제2-458호 889 페이지 우측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이∼u AJ12358(FERM P-9764), 일본국 특허 공개 공보 제2-458호 890 페이지 좌측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ12359(FERM P-9765), 일본국 특허 공개 공보 제2-458호 890 페이지 좌측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11334(FERM P-4900), 일본국 특허 공개 공보 제1-29559호 201 페이지 6란 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11333(FERM P-4899), 일본국 특허 공개 공보 제1-29559호 201 페이지 6란 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11335(FERM P-4901), 일본국 특허 공개 공보 제1-29559호 202 페이지 7란 참조.

코리네포름 세균으로서 하기 세균 균주가 예시된다:

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ11188(FERM P-4190), 일본국 특허 공개 공보 제60-87788호 473 페이지 우측 상단 참조;

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11682(FERM BP-118), 일본국 특허 공보 제2-31956호 230 페이지 8란 참조;

브레비박테리움 플라붐 AJ11683(FERM BP-119), 일본국 특허 공보 제2-31956호 231 페이지 10란 참조.

(ⅲ) L-메티오닌 제조에 바람직한 숙주

L-메티오닌 제조에는 하기 세균 균주가 예시된다:

에스케리키아 콜라이 AJ11457(FERM P-5175), 일본국 특허 공개 공보 제56-35992호 552 페이지 우측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11458(FERM P-5176), 일본국 특허 공개 공보 제56-35992호 552 페이지 우측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11459(FERM P-5177), 일본국 특허 공개 공보 제56-35992호 552 페이지 우측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11539(FERM P-5479), 일본국 특허 공개 공보 제56-144092호 435 페이지 좌측 하단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11540(FERM P-5480), 일본국 특허 공개 공보 제56-144092호 435 페이지 좌측 하단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11541(FERM P-5175), 일본국 특허 공개 공보 제56-144092호 435 페이지 좌측 하단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11542(FERM P-5482), 일본국 특허 공개 공보 제56-144092호 435 페이지 좌측 하단 참조.

(ⅳ) L-아스파르트산 제조에 바람직한 숙주

L-아스파르트 산의 제조에는 하기 세균 균주가 예시된다:

브레비박테리움 플라붐 AJ3859(FERM P-2799), 일본국 특허 공개 공보 제51-61689호 524 페이지 좌측 상단 참조;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ3860(FERM P-2800), 일본국 특허 공개 공보 제51-61689호 524 페이지 좌측 상단 참조;

코리네박테리움 아세토아시도필룸 AJ3877(FERM P-2803), 일본국 특허 공개 공보 제51-61689호 524 페이지 좌측 상단 참조;

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ3876(FERM P-2802), 일본국 특허 공개 공보 제51-61689호 524 페이지 좌측 상단 참조.

(ⅴ) L-이소류신 제조에 바람직한 숙주

에스케리키아 속 세균으로서는 에스케리키아 콜라이 KX141(VKPM-B4781)(일본국 특허 공개 공보 제4-33027호의 45번째 문장 참조)가, 코리네포름 세균으로서는 브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ12404(FERM P-10141)(일본국 특허 공개 공보 제2-42988호 603 페이지 좌측 하단 참조) 및 브레비박테리움 플라붐 AJ12405(FERM P-10142)(일본국 특허 공개 공보 제2-42988호 524 페이지 좌측 하단 참조)가 예신된다.

(ⅵ) L-글루탐산 제조에 바람직한 숙주

에스케리키아 속 세균으로서는 하기의 세균 균주가 예시된다:

에스케리키아 콜라이 AJ12628(FERM P-12380), 프랑스 특허 공보 제2 680 178호(1993) 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ12624(FERM P-12379), 프랑스 특허 공보 제2 680 178호(1993) 참조;

코리네포름 세균으로서는 하기 세균 균주가 예시된다:

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ12745(FERM BP-2922), 일본국 특허 공개 공보 제3-49690호 561 페이지 우측 하단 참조;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ12746(FERM BP-2923), 일본국 특허 공개 공보 제3-49690호 562 페이지 좌측 상단 참조;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ12747(FERM BP-2924), 일본국 특허 공개 공보 제3-49690호 562 페이지 좌측 상단 참조;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ12748(FERM BP-2925), 일본국 특허 공개 공보 제3-49690호 562 페이지 좌측 상단 참조;

브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067, 일본국 특허 공개 공보 제5-3793호 3 페이지 표 1 참조:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21492, 일본국 특허 공개 공보 제5-3793호 3페이지 표 1 참조.

(ⅶ) L-아르기닌 제조에 바람직한 숙주

에스케리키아 콜라이 AJ11593(FERM P-5616), 일본국 특허 공개 공보 제57-5693호 468 페이지 좌측 상단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11594(FERM P-5617), 일본국 특허 공개 공보 제57-5693호 468 페이지 우측 상단 참조.

코리네포름 세균으로서는 하기 세균 균주가 예시된다:

브레비박테리움 플라붐 AJ12144(FERM P-7642), 일본국 특허 공보 제5-27388호 174 페이지 4란 참조;

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ12145(FERM P-7643), 일본국 특허 공보 제5-27388호 174 페이지 4란 참조;

브레비박테리움 플라붐 ATCC 21493, 일본국 특허 공개 공보 제5-3793호 3 페이지 표 1 참조;

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21659, 일본국 특허 공개 공보 제5-3793호 3 페이지 표 1 참조.

(ⅷ) L-프롤린 제조에 바람직한 숙주

에스케리키아 속 세균으로서는 하기 세균 균주가 예시된다;

에스케리키아 콜라이 AJ11543(FERM P-5483), 일본국 특허 공개 공보 제56-144093호 435 페이지 좌측 하단 참조;

에스케리키아 콜라이 AJ11544(FERM P-5484), 일본국 특허 공개 공보 제56-144093호 435 페이지 좌측 하단 참조.

코리네포름 세균으로서는 하기 세균 균주가 예시된다;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ11225(FERM P-4370), 일본국 특허 공개 공보 제60-87788호 473 페이지 좌측 하단 참조;

브레비박테리움 플라붐 AJ11512(FERM P-5332), 일본국 특허 공보 제62-36679호 185 페이지 2란 참조;

브레비박테리움 플라붐 AJ11513(FERM P-5333), 일본국 특허 공보 제62-36679호 185 페이지 2란 참조;

브레비박테리움 플라붐 AJ11514(FERM P-5334), 일본국 특허 공보 제62-36679호 185 페이지 2란 참조;

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11522(FERM P-5342), 일본국 특허 공보 제62-36679호 185 페이지 2란 참조;

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11523(FERM P-5345), 일본국 특허 공보 제62-36679호 185 페이지 2란 참조.

배양 방법

상기 숙주를 배양하는 방법은 선행 기술의 아미노산-생성 미생물의 배양 방법과 특별히 상이하지는 않다. 즉, 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기 이온, 및 임의의 미량의 유기 영양소(예: 아미노산, 비타민 등)를 함유하는 배지를 통상 사용한다.

탄소 공급원에는 글루코즈, 수크로즈, 락토오즈 등 뿐만 아니라, 그들을 함유하는 전분 가수분해액, 유장, 당밀 등이 사용될 수도 있다. 질소 공급원에는 암모니아 가스, 수성 암모늄, 암모늄 염 등이 사용될 수 있다. 또한, 이미노산 등에 대한 영양 요구성 돌연변이 균주를 숙주로서 사용할 경우, 그 균주가 요구하는 아미노산 등의 영양소를 배지에 적절히 가할 필요가 있다. 아미노산 제조에 사용되는배지로서 리신 제조용 배지의 일예를 하기 표 1에 도시한다. 또한, 탄산 칼슘은 별도로 살균시킨 후 기타 성분에 가한다.

표 1

배양은 호기 조건하에 배지의 pH 및 온도를 적절히 조절하면서 실질적으로 아미노산의 생성 및 축적이 정지될 때까지 수행한다. 이렇게 하여 배양 배지중에 축적된 아미노산을 수집하는데는 통상의 방법을 적용할 수 있다.

본 발명은 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복식라제, 이를 암호화하는 유전자 및 아미노산의 제조방법에 관한 것이며, 특히 아스파르트 산에 의한 피이드백 억제(feedback inhibition)를 탈감작화시키는 돌연변이를 갖는 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

제 1 도는 3-브로모피루베이트에 의한 성장 억제를 도시한다.

제 2 도는 아스파르테이트-β-하이드라지드에 의한 성장 억제를 도시한다.

제 3 도는 DL-트레오-β-하이드록시아스파르테이트에 의한 성장 억제를 도시한다.

제 4 도는 3-브로모피루베이트에 대한 억제 회복 물질의 효과를 도시한다.

제 5 도는 아스파르테이트-β-하이드라지드에 대한 억제 회복 물질의 효과를 도시한다.

제 6 도는 DL-트레오-β-하이드록시아스파르테이트에 대한 억제 회복 물질의 효과를 도시한다.

제 7 도는 성장에 미치는 성장 회복 인자의 영향을 도시한다.

제 8 도는 성장 억제 물질에 의한 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 억제를 도시한다.

제 9 도는 아스파르트 산에 의한 본 발명의 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 억제를 도시한다.

제 10 도는 아스파르트 산에 의한 본 발명의 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 억제를 도시한다.

제 11 도는 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자에 돌연변이를 도입하는 방법을 도시한다.

제 12 도는 야생형 및 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제(N 말단으로부터 438번째 아르기닌이 시스테인으로 치환됨)의 활성에 아스파르트 산이 미치는 영향을 도시한다.

제 13 도는 야생형 및 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제(N-말단으로부터 620번째 리신이 세린으로 치환됨)의 활성에 아스파르트 산이 미치는 영향을 도시한다.

발명을 수행하는 최선의 양태

이하의 실시예와 관련하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

실시예 1: 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자의 수득

클로닝되고 이의 염기 서열이 결정된 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 벡터 폴라스미드 pBR322의 SalⅠ 부위에 삽입시켜 수득한 플라스미드 pS2를 사용하여 돌연변이체 유전자를 제조한다. pS2는 약물 내성 마커 유전자로서 앰피실린 내성 유전자를 가진다[참조: Sabe. H. et al., Gene, 31, 279-283 (1984)]. pS2에 포함된 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 상기된 플라스미드 pT2에 포함된 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자와 동일하다.

pS2 DNA를 하이드록실아민 처리 용액(20㎍/ml pS2 DNA, 0.05M 인산 나트륨 (pH 6.0), 1mM EDTA. 0.4M 하이드록실아민)으로 75℃에서 2시간 동안 처리한다. 하이드록실아민 처리는 pH의 영향을 받기 때문에, 수산화나트륨으로 pH를 6.0까지 조절한 1M 하이드록실아민 · HCl 및 1mM EDTA 용액 80μl. 0.1M 인산 나트륨(pH 6.0) 및 1mM EDTA 용액 100μl, 및 2㎍의 pS2 DNA를 함유하는 TE(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA) 완충액을 합하고, 최종적으로 물로 200μl를 만든다.

상기 조건은 처리 후 pS2로 에스케리키아 콜라이 HB101을 형질전환시켰을 때, 앰피실린 함유 배지내의 형질전환체의 생존률이 처리전 상태를 기준으로 0.2%인 조건이다.

하이드록실아민으로 처리한 pS2로 에스케리키아 콜라이 HB101을 형질전환시키고, 앰피실린을 함유하는 고형 평판 배지에 도포하여 약 10000개 콜로니의 형질 전환체를 수득한다. 이들을 액체 배지에 현탁시키고, 아스파르트 산의 동족 화합물로서 3-브로모피루브산(3BP), 아스파르트산-β-하이드록사메이트 (AHX), 아스파르트산-β-하이드라지드(AHY) 및 DL-트레오-β-하이드록시아스파르테이트(BHA) 중 어느 하나를 최소 억제 농도 근처의 농도로 함유하는 고형 평판 배지에 배지 1평판당 10³내지 10⁵세포를 제공하도록 도포하고, 성장하는 콜로니를 선택한다.

이와 같이 수득된 동족 화합물 내성 균주의 100개 균주로부터, 문헌[참조; The Journal of Biochemistry. Vol. 67. No. 4 (1970)]에 기술된 방법에 따라 이들 각각에 의해 제조된 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 부분 정제하고, 동족 화합물에 의한 효소 활성의 억제를 조사한다. 효소 활성의 측정은 상술된 방법과 동일한 방법으로 수행한다.

또한, 동족 화합물에 의해 활성이 억제되지 않은 돌연변이체 효소를 생성하는 세균 균주로부터 플라스미드를 분리하고, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 결실 균주로서 에스케리키아 콜라이 PCRl[참조: Sabe. H. et al., Gene. 31. 279-283 (1984)]에 도입하여 돌연변이체 효소의 생성을 확인한다.

따라서, 돌연변이체 효소 유전자를 포함하는 5개의 형질전화체를 수득한다. 이들 유전자의 염기 서열을 결정한 결과, 2개의 균주는 동일한 돌연변이를 포함하였고, 4종류의 돌연변이체 유전자가 수득되었다. 이들을 포함하는 형질전환체를 AJ12907, AJ12908, AJ12909 및 AJ12910으로 명명하고, 1993년 8월 3일 통상 산업성 공업 기술원 생명공학공업기술 연구소(우편 번호 305, 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 차례대로 기탁번호 FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776 및 FERM P-13777로 기탁하였으며, 1994년 7월 11일에 원기탁으로부터 부다페스트 조약에 근거한 국제기탁으로 이관하여 기탁번호 FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, FERM BP-4737를 부여 받았다. 또한, 이들이 포함하는 플라스미드는 각각 pBP5, pHA19, pBP122 및 pR6으로 명명한다. 각각의 플라스미드에 함유된 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자가 있는 돌연변이를 표 2에 도시한다. 표에서 수치는 서열 확인 번호: 1에서 뉴클레오티드 번호 또는 아미노산 번호를 나타낸다.

표 2

동시에, AJ12907 및 AJ12909는 500㎍/ml의 3BP를 함유하는 배지에서, AJ12908은 1000㎍/ml의 βHA를 함유하는 배지에서, 및 AJ12910은 500㎍/ml의 AHY를 함유하는 배지에서 선택을 수행한다.

실시예 2

돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제

상기 4개의 형질전환체에 의해 생성된 포스포에놀피루베이트 카복실라제에 대해서 아스파르트산에 대한 민감성을 조사한다. 이들 세균 균주는 숙주 기원의 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 결실하여, 생성된 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 플라스미드로부터 기원한다.

아스파르트산에 대한 민감성은 공지 방법[참조: Yoshinaga. T., Izui. K. and Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970)]에 따라 조사한다. 즉, 활성 측정계에서 활성에 영향을 미치는 것으로 알려진 아세틸-조효소 A를 0.1mM 또는 1mM의 농도의 존재하에 각 형질전환체 또는 pS2를 포함하는 에스케리키아 콜라이가 생성한 효소 활성을 측정한 결과로서, 아스파르트산에 대한 민감성을 제9도 및 제10도에 도시한 바와 같이 측정한다.

그 결과로부터, 아스파르트산이 고농도로 존재할 경우, 야생형 효소는 그의 활성을 상실하는 반면, 본 발명의 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 실질적으로 자체의 활성을 계속 유지함이 명백해진다.

실시예 3

돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 도입시킨 에스케리키아 콜라이에 의한 L-트레오닌의 발효적 생산

에스케리키아 콜라이의 트레오닌-생성 세균으로서는 B-3996 균주[일본국 특허 공개 공보 제3-501682(PCT)]가 현재 공지된 균주 가운데 가장 높은 생성 능력을 가진다. 따라서, 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 평가를 수행하면서, 숙주로서 B-3996을 사용한다. 이 B-3996 균주는 Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding에 등록번호 RIA 1867로 기탁되었다. 또한, 평가되는 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제로서 pBP5를 선택하여 실험에 적용시킨다.

돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 함유하는 플라스미드 pBP5를 에스케리키아 콜라이 B-3996에 Hanahan [참조: J. Mol. Biol., Vol. 106, p 577 (1983)]의 방법에 따라 도입하고, 형질전환체를 분리한다. 대조군으로서, 야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 발현하는 플라스미드로서 pS2를 사용하여 에스케리키아 콜라이 B-3996을 동일한 방법으로 형질전환시킨다.

표 3의 조성을 갖는 배지 20ml를 주입한 Sakaguchi 플라스크 500ml에 에스케리키아 콜라이 B-3996 및 형질전환체를 각각 접종시키고, 37℃에서 40시간 동안 배양하여 L-트레오닌의 생성량을 조사한 다음, 표 4에 도시된 결과를 수득한다. 동시에, 전술한 배지를 글루코즈와 MgSO₄· 7H₂O, 및 기타 성분으로 양분하고, KOH로 pH 7.0까지 조절한 다음, 115℃에서 10분간 오토클레이빙하여 그들을 혼합한 후에 별도로 멸균된 CaCO₃을 30g/ℓ 첨가한다.

표 3

표 4

상기 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 DNA 서열을 갖는 돌연변이체 효소 발현 플라스미드를 포함하는 에스케리키아 콜라이 B-3996/pBP5는 야생형 효소를 발현하는 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜라이 B-3996/pS2와 비교하여 트레오닌-생산 능력이 향상되었다.

실시예 4

돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 도입시킨 에스케리키아 콜라이에 의한 L-글루탐산의 발효적 생산

에스케리키아 콜라이의 글루탐산 생성 세균으로서는 일본국 특허 공개 공보 4-11461호에 기술된 에스케리키아 콜라이 AJ-12628이 현재 공지된 세균 중에서 가장 높은 생산 능력을 가진다. 따라서, 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 평가 AJ-12628을 숙주로서 사용한다.

AJ-12628 균주는 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 등록번호 FERM BP-385로 기탁되었다. 또한, 평가되는 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제로서 pBP5를 선택하여 실험에 적용한다.

D[T,Z[F;Z;이 컬링; AJ-12628에 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 포함하는 플라스미드 pBP5를 Hanagan [참조: J. Mol. Biol., Vol. 106. p 577 (1983)]의 방법에 따라 도입하고, 형질전환체를 분리한다. 동일한 방법으로, pS2를 지닌 에스케리키아 콜라이 AJ-12628의 형질전환체를 분리한다.

표 5의 조성을 갖는 배지 20ml를 부은 500ml의 Sakaguchi 플라스크에 에스케리키아 콜라이 AJ-12628 및 이의 형질전환체를 각각 접종시키고, 37℃에서 36시간 동안 배양하여 L-글루탐산의 생산량을 조사하면, 표 6에 도시된 결과가 수득된다. 동시에, 상기 배지를 글루코즈와 MgSO₄· 7H₂O 및 기타 성분으로 양분하고, KOH로 pH 7.0까지 조절한 다음, 115℃에서 10분간 오토클레이빙하여, 그들을 혼합한 후에별도로 멸균시킨 CaCO₃을 30g/ℓ 첨가한다.

표 5

표 6

이 결과로부터 명백해진 바와 같이, 본 발명의 DNA 서열을 지닌 돌연변이체 효소 발현 플라스미드를 포함하는 에스케리키아 콜라이 AJ-12628/pBP5는 야생형 효소를 발현하는 플라스미드를 포함하는 에스케리키아 콜라이 AJ-12628/pS2와 비교하여 글루탐산-생성 능력이 개선되었다.

실시예 5

돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 도입시킨 코리네포름 세균에 의한 L-리신의 생산

돌연변이체 유전자를 코리네포름 세균에 도입하여 발현시키기 위해, 브레비박테리움 속 세균 기원의 프로모터를 수득하고, 돌연변이체 유전자와 연결하여 발현형 플라스미드를 제조한다. 또한, 그것을 브레비박테리움 속 세균에 도입하여 L-리신의 생산을 수행한다.

<1> 브레비박테리움 속 세균 기원의 아스파르토키나제(AK) 유전자의 수득

브레비박테리움 락토퍼멘툼(코리네박테리움 글루타미쿰) 야생형 균주(ATCC13869)로부터 통상의 방법에 따라 염색체 DNA를 제조한다. 염색체 DNA로부터 PCR[폴리머라제 쇄 반응: White. T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989) 참조]에 의해 AK 유전자를 증폭시킨다. 증폭에 사용된 DNA 프라이머에 대해 코리네박테리움 글루타미쿰에서 공지된 서열[참조: Molecular Microbiology (1991) 5(5). 1197-1204, Mol. Gen. Genet. (1990) 224, 317-324]을 기준으로 하여 AK 유전자를 암호화한 약 1643bp의 여역을 증폭하기 위해 23머의 올리고뉴클레오티드(서열 확인 번호: 3) 및 21머의 올리고뉴클레오티드(서열 확인 번호: 4)를 합성한다.

DNA의 합성은 Applied Biosystems 사에서 제조한 DNA 합성기 모델 380B를 사용하여 통상의 포스포아미디트 방법[참조: Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859]에 따라 수행한다. PCR 반응에서 다카라 스조 사(Takara Shuzo Co., Ltd.)에서 제조한 DNA Thermal Cycler PJ2000 형태를 사용하고, Tag DNA 폴리머라제를 사용하여공급자에 의해 지정된 방법에 따라 유전자 증폭을 수행한다.

증폭된 1643kb의 유전자 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 확인한 다음, 겔로부터 절단한 단편을 통사의 방법으로 정제하고, 제한 효소 Nru I(다카라 스조사에서 제조) 및 EcoRI(다카라 스조사에서 제조)으로 분해한다. 유전자 단편의 클로닝용 벡터는 pHSG399[참조: Takeshita. S. et al.: Gene (1987). 61. 63-74]를 사용한다. pHSG399를 제한 효소 SmaI(다카라 스조사에서 제조) 및 제한 효소 EcoRI로 분해하고, 증폭된 AK 유전자 단편과 연결시킨다.

DNA의 연결은 DNA 연결 키트(다카라 스조사에서 제조)를 사용하여 지정된 방법에 따라 수행한다. 그 방법으로, pHSG399에 브레비박테리움 염색체로부터 증폭된 AK 유전자 단편을 연결시킨 플라스미드를 제조한다. 야생형 균주로서 ATCC 13869 기원의 AK 유전자를 갖는 플라스미드를 p399AKY로서 명명한다.

<2> 브리비박테리움 락토퍼멘툼의 AK 유전자의 염기 서열의 결정

AK 플라스미드, p399AKY를 제조하고, AK 유전자의 염기 서열을 결정한다. 염기 서열의 결정은 생거 등의 방법[참조: F. Sanger et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74. 5463 (1977) 등]에 따라 수행한다. 그 결과를 서열 확인 번호: 5 및 서열 확인 번호: 7에 도시한다. 이 DNA 단편은 2개의 개방 판독 프레임(open reading frame)을 가지며, 이것은 각각 AK의 α-아단위 및 β-아단위에 상응한다. 서열 확인 번호: 5 및 서열 확인 번호: 7에 각각의 개방 판독 프레임에 상응하는 아미노산 서열을 뉴클레오티드 서열과 함께 도시한다. 또한, 각각의 개방 판독 프레임에 상응하는 아미노산 서열만을 서열 확인 번호: 6 및 서열 확인 번호: 8에 도시한다.

<3> 포스포에놀피쿠베이드 카복실라제 발현 플라스미드의 제조

야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 함유하는 플라스미드로서 pS2 및 수득된 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 함유하는 플라스미드로서 pBP5로부터 포스포에놀 피루브산 카복실라제 유전자를 함유하는 약 4.4kb의 SalI 단편을 추출하고, 에스케리키아 콜라이에 일반적으로 사용되는 플라스미드 벡터 pHsG 399의 SalI 부위에 삽입한다. 작제된 플라스미드는 야생형을 pHS2로 및 돌연변이제를 pHBP5로 명명한다.

pHS2 및 pHBP5를 브레비박테리움내에서 발현하는 플라스미드로 전화시키기 위해, 브레비박테리움내에서 기능하는 프로모터 및 플라스미드의 복제 오리진을 도입시킨다. 프로모터로서는 클로닝된 AK 유전자의 프로모터 영역으로 추정되는 염기 서열의 1번 NruI 내지 207번 ApalI 부위중 하나를 함유하는 유전자 단편을 p399AKY로부터 추출하고, pHS2 및 pHBP5의 구조 유전자의 약 60bp 앞에 위치한 AvaI 부위에 전사 방향이 순방향으로 존재하도록 삽입한다.

또한, 브레비박테리움내로 플라스미드의 자가 복제를 가능케하는 유전자 단편, 즉 플라스미드의 복제 오리진을 벡터상에 위치한 부위에 도입한다. 플라스미드의 복제 오리진을 함유하는 유전자 단편은 브레비박테리움용 벡터 pHC4(일본국 특허 공개 공보 제5-7491호의 10 단락 참조; 동일한 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜라이 AJ12039는 통상 산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소에 기탁하였고, 기탁번호 FERM p12215를 부여받았다)로부터 추출하고, 양 말단의 제한 효소부위를 링커의 도입에 의해 PstI 부위로 변형시킨다.

이 단편을 브레비박테리움으로부터 기원한 프로모터를 부가시킨 플라스미드의 벡터 부분에서 PstI 부위에 도입한다. 작제된 포스포에놀피루베이트 카복실라제-발현 플라스미드는 pS2로부터 기원하는 야생형 포스포에놀피루베이트 카복실라제 플라스미드를 pHS2B로서, 및 pBP5로부터 기원하는 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제 플라스미드를 pHBP5B로 각각 명명한다.

<4> 포스포에놀피루베이트 카복실라제 발현형 플라스미드를 사용한 L-리신의 생산

제조된 pHS2B 및 pHBP5B를 각각 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 L-리신 생산 세균으로서 AJ3463(일본국 특허 공보 제51-34477호 참조)에 도입한다. 유전자의 도입에 전기 펄스를 사용한 형질전환 방법을 사용한다[참조: 일본국 특허 공개 공보 제2-207791호]. 숙주 및 형질전환체는 표 7의 조성을 갖는 리신 생산 배지에서 72시간 동안 31.5℃에서 진탕 배양한다.

상기 배지는 표에 기재된 성분들 가운데 CaCO3를 제외한 것을 1ℓ의 물에 가하고, KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절한 후, 115℃에서 15분 동안 오토클레이빙하고, 가열 멸균시킨 CaCO3을 가하여 제조한다. 배양후에 배지중 L-리신의 축적량을 표 8에 도시한다.

표 7

표 8

상기 결과에 도시된 바와 같이, 본 발명의 DNA 서열을 갖는 돌연변이체 효소 발현 플라스미드를 포함하는 브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ3463/pHBP5B는 야생형 효소를 발현하는 플라스미드를 포함하는 브레비박테리운 락토퍼멘튬 AJ3463/ pHS2B와 비교하여 리신 생산 능력이 개선되었다.

실시예 6

본 발명의 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제 및 이의 유전자에 대한 또 다른 예

<1> 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자의 제조

돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화한 DNA를 제조할 경우, 재료로서 플라스미드 pT2에 클로닝된 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자를 사용한다.

플라스미드 pT2를 포함하는 숙주는 플라스미드 기원의 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 활성만을 검출하기 위해 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자가 결실된 숙주가 바람직하다. 이와 같은 결손 균주로서 에스케리키아 콜라이F15(Hfr. recAI. met. △(ppc-argECBH), Tn10)을 사용한다. F15 균주에 pT2를 함유하는 에스케리아 콜라이 AJ-12873은 1993년 7월 15일 통상 산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(우편 번호 305: 일본국 아바라키켄 쓰쿠바시 하가시 1초메 1반 3고)에 FERM p-13752로 기탁하였고, 1994년 7월 11일 이의 원기탁으로부터 부다페스트 조약을 근거로 한 국제 기탁으로 이관하여, 기타버호 FERM BP-4732를 부여받았다. 또한, pT2의 전체 염기 서열을 서열 확인 번호: 1에 도시한다.

pT2를 사용하여 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 438번 아르기닌의 코돈을 시스테인의 코돈으로 전환하는데는 PCR(폴리머라제 쇄 반응)을 이용한 오우버래핑 연장 방법 [참조: Ho. S. N., Hunt. H. D., Horton. R. M., Pullen. J. K. and Pease, L. R., Gene. 77. 51-59 (1989)]을 사용한다.

동시에, PCR 방법은 이본쇄 DNA의 일본쇄 DNA로의 열 변성, 증폭될 목적 부위의 양 말단의 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 전술된 열 변성된 DNA의 어닐링, 및 전술된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 폴리머라제 반응을 포함하는 증폭 사이클을 반복하여 상기 DNA 서열을 지수 함수적으로 증폭시키는 방법이다.

PCR 방법에 의해 부위 특이적 돌연변이를 수행한 영역을 제11도에 도시한다. 본 발명에 사용된 프라이머는 438번 아르기닌의 코돈과 인접한 서열을 갖는 프라이머 C(서열 확인 번호: 11. 서열 확인 번호: 1에서 염기 번호 1535 내지 1554에 상응), 프라이머 C와 상보적 서열을 갖는 프라이머 b(서열 확인 번호: 10). 그로부터 하부 서열을 갖는 프라이머 a(서열 확인 번호: 9. 서열 확인 번호: 1에서 염기 번호 1185 내지 1200에 상응), 하부 서열과 상보적인 서열을 갖는 프라이머 d(서열 확인 번호: 12, 서열 확인 번호: 1에서 염기 번호 2327 내지 2342에 상응)의 4종류가 있다.

프라이머 b 및 프라이머 c에서 438번 아르기닌의 코돈(CGT)는 시스테인의 코돈(TGT)으로 치환되어 있다. 이러한 치환은 시스테인의 또 다른 코돈으로 존재하는 TGC를 사용할 수도 있다. 또한, 435번 아스파라긴의 코돈(AAC)의 3문자중 C는 T로 치환되어 있으며, 아미노산이 치환되지 않고 내부적으로 EcoRI 부위가 도입되어 있으므로 그것을 지표로서 사용하여 돌연변이 플라스미드를 선택할 수 있다. 그러나, 이 돌연변이는 본 발명에 필수적인 것은 아니다.

pT2 DNA를 주형으로 사용하고 프라이머 a 및 프라이머 b를 프라이머로 사용하여 PCR 반응을 수행할 경우, 돌연변이 부위의 상부로부터 돌연변이 부위까지의 단편(제11도에서 AB 단편)이 증폭된다. 또한, 프라이머 c 및 프라이머 d를 사용하여 PCR 반응을 수행할 경우, 돌연변이 부위로부터 하부인 단편(제11도에서 CD 단편)이 증폭된다. 각각의 증폭된 생성물(AB, CD)를 열변성시킨 후 어닐링시켜서 폴리머라제 반응을 수행하는 경우, 그들을 연결시켜 단편(제11도에서 AD 단편)을 수득한다. 동시에, PCR 반응은 94℃에서 1분간 가열한 후, 변성(94℃, 1.5분), 어닐링(50℃, 2분), 폴리머라제에 의한 신장 반응(72℃, 3.5분) 각각을 포함한 사이클을 30회 반복하여 수행한다. 또한, 반응조성을 표 9에 도시한다.

표 9

*: PCR 단편 AB 및 CD는 PCR 반응후, 그의 10μl를 폴리 아크릴아미드 겔로부터 회수하고, TE[10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA(pH 8.0)] 5μl에 용해시켜 제조한다.

상기한 바와 같이 수득된 AD 단편에서 상부의 BssHII 부위 (서열 확인 번호: 1에서 1231 내지 1236) 및 하부의 SplI 부위(서열 확인 번호: 1에서 2249 내지 2254)가 존재하므로 이들 효소로 완전히 분해시켜 플라스미드 pT2의 상응하는 영역을 치환시킨다(제11도).

<2> 억제 탈감작화된 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 선택

상기된 바와 같이 수득한 플라스미드로 에스케리키아 콜라이를 형질전환시키고, 형질전환된 균주를 배양하여 플라스미드를 회수하여 EcoRI로 분해한 것을 선택한다. 선택된 DNA에 대해서는, 상술된 PCR 방법으로 증폭시킨 영역의 염기 서열을 디데옥시 방법으로 결정하고, 정확히 목적한 염기 치환이 도입된 것을 확인한다. 이 플라스미드를 pT2R438C로 명명한다. 이 플라스미드를 상술한 에스케리키아 콜라이 F15에 도입하여 수득한 균주(AJ12874)는 1993년 7월 15일 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305: 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 FERM p-13753으로 기탁하였고, 1994년 7월 11일 원기탁으로부터 부다페스트 조약에 근거한 국제 기탁으로 이관하여 기탁번호 FERM BP-4733을 부여 받았다.

pT2R438C의 염기 서열은 서열 확인 번호: 1에서 1541번 및 1550번 뉴클레오티드가 C에서 T로 치환된 서열이다.

<3> 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 아스파르트 산에 의한억제의 탈감작화의 확인

상술된 pT2R438C를 포함하는 에스케리키아 콜라이 AJ12874에 의해 생산된 포스포에놀피루베이트 카복실라제에 대해서 아스파르트산에 대한 민감성을 조사한다. 동시에, 상기된 바와 같이 에스케리키아 콜라이 F15는 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 결손하고 있기 때문에, AJ12874에 의해 생산된 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 플라스미드로부터 기원한 것이다.

아스파르트산에 대한 민감성은 공지 방법[참조: Yoshinaga. T., Izui. K. and Katsuki, H, J. Biochem., 68. 747-750 (1970)]에 따라 조사한다. 즉, 활성 측정계 내에서 활성에 영향을 미치는 것으로 알려진 아세틸-조효소 A의 1mM 또는 2mM 농도의 존재하에 효소 활성을 측정한 결과로서 아스파르트산에 대한 민감성을 표 12에 도시한 바와 같이 측정한다.

아스파르트산이 고농도로 존재할 경우, 야생형 효소는 활성을 실질적으로 상실하는 반면에, 본 발명의 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 활성을 계속 유지함이 명백해진다.

<4> 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자의 제조(Ⅱ)

플라스미드 pT2 상에 존재하는 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자에서 620번 리신의 코돈을 세린의 코돈으로 치환하는데는 PCR 방법(폴리머라제 쇄 반응)을 이용하는 오우버래핑 연장 방법[참조: Ho., S. N., Hunt. H. D. Horton. R. M., Pullen. J. K. and Pease. L. R., Gene. 77. 51-59 (1989)]을 사용한다. 구체적인 공정은 <1>에 기술된 방법에 준한다. 목적하는 치환으로 작제된 돌연변이체 유전자를 지닌 플라스미드를 pT2K620S로 명명한다. 또한, 수득된 돌연변이체 효소를 K620S 돌연변이체 효소로 명명한다.

<5> 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제에 대하여 아스파르트 산에 의한 억제의 탈감작화의 확인

플라스미드 pT2K620S를 상술된 에스케리키아 콜라이 F15에 도입하여 수득한 형질전환체에 의해 생성된 포스포에놀피루베이트 카복실라제에 대해서, 아스파트산에 대한 민감성을 조사한다. 동시에, 상기된 바와 같이, 에스케리키아 콜라이 F15는 포스포에놀피루베이트 카복실라제 즉 결실하고 있기 때문에, 형질전환체에 의해 생산된 모든 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 플라스미드로부터 기원한 것이다.

아스파르트산에 대한 민감성은 공지 방법[참조: Yoshinaga. T., Izui. K. and Katsuki. H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970)]에 따라 조사한다. 즉, 활성 측정계 중에서 활성에 영향에 영향을 미치는 것으로 알려진 아세틸-조효소 A의 1mM 또는 2mM 농도의 존재하에 효소의 활성을 측정한 결과로서, 아스파르트산에 대한 민감성을 제13도에 도시된 바와 같이 측정한다.

아스파르트산이 고농도로 존재할 경우, 야생형 효소는 자체 활성을 실질적으로 상실하는 반면에, 본 발명의 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 활성을 계속 유지함이 명백하다.

제13도에는 650번 리신이 세린으로 치환되어 있는 돌연변이체 포스포에놀피 루베이트 카복실라제(K650A 돌연변이체 효소) 및 491번 리신이 세린으로 치환되어 있는 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제(K491A 돌연변이체 효소)의 아스파르트산에 대한 민감도가 또한 도시되어 있다. 이들 돌연변이체 효소는 아스파르트산에 의한 억제가 탈감작화되지 않았다.

본 발명의 DNA 서열은 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화하고, 이 DNA 서열을 포함한 미생물은 상술된 효소를 생산한다.

본 발명의 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제는 실질적으로 아스파르트산에 의한 활성 억제를 격지 않으므로, 아스파르트산에 의해 생합성의 조절을 받는 아미노산의 발효적 생산 등에 사용할 수 있다.

서열목록

(1) 일반 정보

(ⅰ) 출원인: 아지노모토 코포레이티드

(ⅱ) 발명의 명칭: 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제. 이의 유전자 및 아미노산의 제조방법

(ⅲ) 서열 수: 12개

(ⅳ) 통신 주소:

(A) 주소:

(B) 거리:

(C) 도시:

(D) 주:

(E) 나라:

(F) 우편번호:

(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 형태: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: Patentln Release #1.0. 버전 #1.25

(ⅵ) 현 출원 자료:

(A) 출원 번호:

(B) 출원인:

(C) 분류 기호:

(ⅶ) 선행 출원 자료:

(A) 출원 번호:

(B) 출원일:

(ⅷ) 변호인/대리인 정보:

(A) 성명:

(B) 등록 번호:

(C) 참조/도켓 번호:

(ⅸ) 통신 정보:

(A) 전화:

(B) 팩스:

(2) 서열 확인 번호: 1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 5186

(B) 형태: 핵산

(C) 본쇄형: 이본쇄

(D) 위상: 환형

(ⅱ) 분자형: 다른 게놈 DNA 및 벡터 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(ⅳ) 안티-센스: 무

(ⅵ) 기원:

(A) 생물명: 에스케리키아 콜라이

(ⅸ) 특성:

(A) 명칭/키: CDS

(B) 위치: 237..2888

(xi) 서열 기술: 서열 확인 번호: 1:

(2) 서열 확인 번호: 2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 883개 아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 단백질

(xi) 서열 기술: 서열 확인 번호: 2:

(2) 서열 확인 번호: 3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 23

(B) 형태: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 다른 합성 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(xi) 서열 기술: 서열 확인 번호: 3:

(2) 서열 확인 번호: 4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 21

(B) 형태: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 다른 합성 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(xi) 서열 기술: 서열 확인 번호: 4:

(2) 서열 확인 번호: 5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 1643

(B) 형태: 핵산

(C) 본쇄형 : 이본쇄

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 게놈성 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(ⅳ) 안티-센스: 무

(ⅵ) 기원:

(A) 미생물: 코리네박테리움 글루타미쿰

(C) 균주: ATCC 13869

(ⅸ) 특성:

(A) 명칭/키: 매트(mat) 펩티드

(B) 위치: 217..1482

(xi) 서열 기술: 서열 확인 번호: 5:

(2) 서열 확인 번호: 6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 421개 아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 단백질

(ix) 서열 기술: 서열 확인 번호: 6:

(2) 서열 확인 번호: 7에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 1643

(B) 형태: 핵산

(C) 본쇄형: 이본쇄

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 게놈성 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(ⅳ) 안티-센스: 무

(ⅵ) 기원:

(A) 미생물: 코리네박테리움 글루타미쿰

(C) 균주: ATCC 13869

(ⅸ) 특성:

(A) 명칭/키: 매트 펩티드

(B) 위치: 964..1482

(xi) 서열 기술: 서열 확인 번호: 7:

(2) 서열 확인 번호: 8에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 172개 아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 단백질

(ix) 서열 기술: 서열 확인 번호: 8:

(2) 서열 확인 번호: 9에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 16

(B) 형태: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 다른 합성 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(ix) 서열 기술: 서열 확인 번호: 9:

(2) 서열 확인 번호: 10에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 20

(B) 형태: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 다른 합성 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(ix) 서열 기술: 서열 확인 번호: 10:

(2) 서열 확인 번호: 11에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 20

(B) 형태: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 다른 합성 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(ix) 서열 기술: 서열 확인 번호: 11:

(2) 서열 확인 번호: 12에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 16

(B) 형태: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 위상: 선형

(ⅱ) 분자형: 다른 합성 DNA

(ⅲ) 가설: 무

(ix) 서열 기술: 서열 확인 번호: 12:

Claims

ⅰ) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여 625번 글루탐산이 글루탐산 이외의 아미노산으로 치환된 돌연변이;

ii) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여, 222번 아르기닌이 아르기닌 이외의 아미노산으로 치환되고 223번 글루탐산이 글루탐산 이외의 아미노산으로 각각 치환된 돌연변이;

ⅲ) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여, 288번 세린이 세린 이외의 아미노산으로 치환되고 289번 글루탐산이 글루탐산 이외의 아미노산으로 치환되고, 551번 메티오닌이 메티오닌 이외의 아미노산으로 치환되고 804번 글루탐산이 글루탐산 이외의 아미노산으로 각각 치환된 돌연변이;

iv) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여 867번 알라닌이 알라닌 이외의 아미노산으로 치환된 돌연변이;

v) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여 438번 아르기닌이 아르기닌 이외의 아미노산으로 치환된 돌연변이; 및

vi) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여 620번 리신이 리신 이외의 아미노산으로 치환된 돌연변이로 이루어진 군중에서 선택된 돌연변이로서 아스파르트산에 의한 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 피이드백 억제를 탈감작화시키는 돌연변이를 갖는, 에스케리키아 속 미생물로부터 기원하는 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제.
제 1 항에 있어서, 돌연변이가

ⅰ) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여 625번 글루탐산이 리신으로 치환된 돌연변이;

ii) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여 222번 아르기닌이 히스티딘으로 치환되고 223번 글루탐산이 리신으로 각각 치환된 돌연변이;

ⅲ) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여, 288번 세린이 페닐알라닌으로 치환되고 289번 글루탐산이 리신으로 치환되고, 551번 메티오닌이 이소류신으로 치환되고 804번 글루탐산이 리신으로 각 각 치환된 돌연변이;

iv) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여, 867번 알라닌이 트레오닌으로 치환된 돌연변이;

ⅴ) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여 438번 아르기닌이 시스테인으로 치환된 돌연변이; 및

ⅵ) 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 N-말단으로부터 계수하여 620번 리신이 세린으로 치환된 돌연변이로 이루어진 군중에서 선택된, 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화하는 DNA 단편.
제 3 항 따른 DNA 단편을 염색체 DNA 내로 삽입시켜 형질 전환시킨 에스케리키아 속 또는 코리네형 세균에 속하는 미생물.
제 3 항에 따른 DNA 단편과, 에스케리키아 속 또는 코리네형 세균에 속하는 세포내에서 자가복제능이 있는 벡터 DNA가 연결되어 형성된 재조합 DNA.
제 5 항에 따른 재조합 DNA로 형질전환시킨 에스케리키아 속 또는 코리네형 세균에 속하는 미생물.
제 4 항 또는 제 6 항에 따른 미생물을 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배지로부터 L-리신, L-트레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글루탐산, L-아르기닌 및 L-프롤린으로 이루어진 군중에서 선택된 아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, 아미노산의 제조 방법.
3-브로모피루베이트, 아스파르트산-β-하이드라지드 및 DL-트레오-β-하이드록시아스파르트산 중에서 선택된 화합물 존재하에서 에스케리키아 콜라이를 배양하는 단계를 포함하는, 아스파르트산에 의한 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 생산하는 에스케리키아 콜라이를 선택하는 방법.
제 8 항에 있어서, 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제가 제1항 또는 제2항에 따른 카복실라제인 방법.
제 8 항에 따라 선택된 에스케리키아 콜라이를 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배지로부터 L-리신, L-트레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글루탐산, L-아르기닌 및 L-프롤린으로 이루어진 군중에서 선택된 아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, 아미노산의 제조 방법.
제 8 항에 따라 선택된 에스케리키아 콜라이로부터 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 분리하는 단계를 포함하는, 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제의 제조 방법.
제 8 항으로부터 선택된 에스케리키아 콜라이로부터 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화하는 DNA 단편을 분리하는 단계를 포함하는, 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 암호화하는 DNA 단편의 제조 방법.
제 12 항에 따라 제조된 DNA 단편을 에스제리키아 속 또는 코리네형 세균에 속하는 미생물내로 도입하는 단계를 포함하는, 돌연변이체 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 함유하는 미생물의 제조 방법.
제 13 항에 따른 미생물을 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배지로부터 L-리신, L-트레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글루탐산, L-아르기닌 및 L-프롤린으로 이루어진 군중에서 선택된 아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, 아미노산의 제조 방법.