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KR0176693B1 - 조절요소를 사용한 내인성 유전자의 발현을 변형시키는 방법 - Google Patents

조절요소를 사용한 내인성 유전자의 발현을 변형시키는 방법 Download PDF

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KR0176693B1
KR0176693B1 KR1019920701467A KR920701467A KR0176693B1 KR 0176693 B1 KR0176693 B1 KR 0176693B1 KR 1019920701467 A KR1019920701467 A KR 1019920701467A KR 920701467 A KR920701467 A KR 920701467A KR 0176693 B1 KR0176693 B1 KR 0176693B1
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KR
South Korea
Prior art keywords
gene
dna
cell line
genome
expression
Prior art date
Application number
KR1019920701467A
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English (en)
Inventor
스코트 씨. 채펠
Original Assignee
레지널드 디. 쇼트보그; 제롬 반 쥘렌
어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23806064&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR0176693(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 레지널드 디. 쇼트보그; 제롬 반 쥘렌, 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. filed Critical 레지널드 디. 쇼트보그; 제롬 반 쥘렌
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Abstract

세포에서 정상적으로 발현된 유전자 산물의 발현을 촉진할 수 있는 DNA조절 요소를 삽입시킴으로써 세포주 또는 미생물에서 정상적으로는 전사시에 불활동성인 유전자를 활성화시킬 수 있다. 이 조절 요소는 정상적으로는 불활동성인 유전자에 발현 가능하게 연결되도록 삽입된다. 삽입과정은 상동성 재조합의 수단에 의하여 정상적으로 불활동성인 유전자의 DNA 단편을 갖는 단편(표적화 DNA)및 전사를 유도하는 DNA 조절 요소를 함유한 DNA 구조물을 창조함으로써 수행된다. 이 기법은 또한 주어진 세포주 또는 미생물의 내인성 유전자의 발현 특성을 변형시키는 데에도 사용될 수 있다.

Description

조절요소(regulatory element)를 사용한 내인성 유전자(endogenous gene)의 발현을 변형(modification)시키는 방법
생물체(organism) 내의 각각의 세포가 그 생물체 내에서 발견되는 모든 단백질을 암호화하는 유전정보를 함유한다는 사실은 잘 알려져 있다. 그러나, 주어진 세포형 내에 존재하는 유전자들중 매우 적은 비율의 유전자들만이 실제로 전사된다. 죽 늘어선 유전자들을 조절하는 세포내 기작이 현재 밝혀졌다. 핵 내에 존재하는 세포 특이성 단백질은 특정 유전자들과 연결된 DNA 조절 단편들과 상호작용한다. 이러한 핵단백질과 DNA 조절 서열(DNA regulatory sequence)과의 상호 작용이 유전자 전사에 필요하다. 이는 mRNA 생합성 및 암호화된 단백질의 궁극적인 발현을 초래한다(Mitchell and Tjian, Science, 245:371, 1989 참조).
각각의 유전자에 대한 이들 DNA 조절단편 또는 요소(element)들은 암호화 영역들의 상류단에, 몇몇 경우에 있어서는, 그 내부에 또는 심지어는 하류단에 위치한다. 세포 특이성 핵단백질들과의 상호작용을 통하여, DNA 조절단편은 단백질 발현에 있어서 속도를 제한하는 효소인 RNA 폴리머라아제의 능력에 영향을 미침으로서, RAN 폴리머라아제가 유전자의 본체(the body of the gene)에 접근할 수 있게 하여 mRNA 전사체를 합성하도록 한다. 따라서, 이러한 DNA 단편들 및 내재성 핵단백질들은 특정 유전자의 발현의 조절에 있어서 결정적인 역할을 한다(Johnson and Mcknight, Ann. Rev. Biochem., 58:799, 1989 참조).
DNA 조절단편들은 핵단백질의 결합부위이다. 이들 핵단백질은 DNA나선에 붙으며 그의 구조를 가시적으로 변형시켜 목적 유전자가 RNA폴리머라아제에 의해 인식되게 함으로써 유전자 전사를 촉진시킨다. 이러한 세포 특이성 조절 단백질들의 발현은 어느 유전자가 세포내에서 발현되고 이 발현이 어떤 속도로 일어날 것인가를 결정한다. 이 시스템의 특이성에 대한 예로서, 뇌하수체 세포는 뇌하수체의 단백질들을 발현하고, 뇌하수체의 단백질들에 대한 유전자들이 모든 간 세포내에 존재하지만 간 세포는 뇌하수체의 단백질들을 발현하지 못한다. 간 세포 내에 존재하는 뇌하수체 유전자의 요소들과 상호작용하는 특정 DNA결합 단백질을, 간세포의 핵은 함유하고 있지 아니한다.
[재조합 DNA기법을 사용하여 단백질을 발현시키는데 이용되는 현재의 방법]
특정 DNA 조절서열들이 특정 세포형 안에서 유전자 전사를 활성화시키는데 필요한 지식과 함께, 과학자들은 유전자공학을 통하여 특정 세포형 내에서 외래 유전자들(foreign genes)을 발현시켜 왔다. 일반적으로, 세포의 핵단백질에 의해 인식되는 DNA 조절단편들은, 발현될 외래 유전자의 암호화 영역의 상류단에 놓여있다. 이런 식으로, 세포 내에 삽입된 후에 세포의 핵 조절 단백질들이 상기 DNA 조절서열들을 인식하여 외래 DNA가 발현될 수 있다. 이 기법은 전통적인 정제 전략에 의해 천연적인 출처(natural sources)로부터 수득 또는 정제하기 어려웠던 단백질들을 생산하는데 이용되어 왔다.
인식가능한 DNA 서열 및 목적 유전자에 부가하여, 선별 마커가 DNA 구조물에 결합된다. 이런 식으로, 선별 배지에서 배양된 후 DNA를 흡수한 세포들만이 생존한다. 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자를 발현 벡터에 함유시킬 수 있다. 형질 감염 후, 포유류 세포에 치명적인 네오마이신 항생물질인 G418에서 세포들을 배양한다. 그러나, 세포가 네오마이신 내성유전자를 획득했다면 이들은 이 약제의 독성 효과를 견뎌낼 수 있을 것이다. 이런 식으로, 형질감염된 DNA를 흡수한 세포들만이 배양배지에서 유지된다. 어떠한 선별마커도 이것이 형질감염된 DNA를 흡수한 세포의 선별할 수 있는 한 이용될 수 있다고 이해된다. 세포내에 삽입된 유전물질의 특정위치에 대해서는 중요성이 없다고 이해되고 있다. 단지 중요한 점은 (선별 마커뿐만 아니라) 조절 단편 및 외래 유전자 모두가 함께 삽입되는 경우에 핵 내의 어딘가에 흡수되어야 한다는 것이다.
[유전자 발현의 현재 방법에 있어서의 결점]
상기의 기법들은 유전공학의 능력을 개발하는 도구들이었지만, 항상 유전자를 발현시키는 가장 효율적인 방법인 것은 아니었다. 이는, DNA가 세포주 핵 내로 삽입될 때 형질감염으로 알려진 기술을 통해 일반적으로 수행된다는 사실때문이다. 관심있는 세포주에서 발현되도록 조작된 DNA를 침전시키고 세포막을 용해시켜 DNA가 들어갈 수 있도록 하였다. 앞서 지적한 바와 같이, DNA가 게놈 내로 통합되는 정확한 부위는 결코 예측할 수 없다; 실제로 DNA는(게놈 내로 통합되지 않고) 에피솜(episome)으로 남아 있을 수도 있다. 이것은 생산되는 단백질의 발현 수준 및 세포주의 안정성 모두에 있어서 불예측성을 초래한다.
이 기술의 두번째 결점은 목적 유전자가 비교적으로 클 경우(5-10 킬로베이스 이상인 경우), 발현 벡터의 작제가 극히 어렵다는 것이다. 재조합 DNA 기술에 의해 발현된 대다수의 단백질은 훨씬 더 큰 게놈성 클론이기 보다는 cDNA에 의해 암호화되어 왔다. 이것은 삽입체의 전체 크기를 줄이기 위해서이다. cDNA을 사용하면 유전적 조작이 보다 편리하게 되지만, 유전자 전사 및 단백질 생산의 속도는 결과적으로 낮을 수 있다. 최근 cDNA삽입체 보다는 게놈을 사용하면 발현수준이 어느 정도 크게 증대된다고 한다(Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:836-840, 1988 및 Chung and perry, Mol. Cell. Bio1., 9:2075-2082, 1989 참조). 이 관찰에 관여하는 기작은 잘 이해되지 않고 있지만, 어떤 상황하에서 인트론 내에 있는 인헨서(enhancer)요소들이 유전자의 전사 효율을 증가시킨다고 알려져 있다. 또한, 인트론, 또는 인트론의 존재로 부터 초래되는 스플라이싱 현상이, 전사의 개시 후에 일어나는 RNA 프로세싱(processing) 현상에 영향을 미칠 수도 있다는 증거도 있다(Buchman and Berg, Mol, Cell. Biol., 8:4395-4405, 1988 참조). 이것은 전사체를 안정화시켜 mRNA 축적율을 증대시킬 수 있다. 또한 상기 인용한 브린스터(Brinster)등의 문헌에 있어서, 유전자 내의 인트론의 위치가 프로모터와 관련있는 뉴클레오솜의 패이징(phasing)에 중요할 것이라고 가정되었다.
진핵성 유전자의 전사에 대한 여러가지 조절 요소들이 미치는 영향이 다음의 문헌에서 논의된 바 있다: Khoury et al., Cell, 33:313-14(1983), Maniatis et al, Science, 236:1237-45(1987) 및 Muller et al., Eur. J. Biochem., 176:485-95(1988).
세번째, 핵 내로 들어가기 위해서는 외래 유전자의 전체 암호화 영역을 포함하는 형질감염된 DNA는 투과 가능하게 된 세포의 세포질막을 통과하여 들어온 후에 세포질을 가로질러야만 한다. 이 시간 동안에 DNA는 DNA의 본래의 모습을 변경하거나 완전히 파괴하는 라이소좀의 효소와 접촉하게 될 수도 있다. 따라서, DNA의 암호화 영역은 형질감염된 것의 DNA와 동일하지 않을 수도 있다.
본 발명자들이 후술하는 유전자 활성화 및/또는 유전자 변형의 신규방법은, 목적 유전자의 암호화 영역이 효소적 변형을 받지 않기 때문에 목적 단백질의 변이형을 생산하지 않는다.
요약하자면, 종래의 기법을 사용하여 세포 내로 형질감염시킨 대부분의 DNA 및 특히 이것의 암호화 영역은 충실하게 전사되지 않을 것이다. 이것은 핵 내로 들어오기 전에 분해되고 효소적으로 불안정하게 되어, 이것이 전체 목적 단백질을 암호화하지 않거나 또는 전사되는데 필요한 모든 필수 조절요소들을 포함하지 않을 수도 있다. 이것은 게놈중 전사를 방해하는 부위에 삽입될 수도 있다. 만일 cDNA가 전사되더라도, 인헨서를 함유하거나 효율적인 mRNA프로세싱을 가능케하는 인트론의 결실로 인하여, 관심있는 단백질이 효율적으로 생산되지 않을 수 있다. 마지막으로, 이것이 에피솜으로 남아 있어, 단백질의 생산을 촉진하지만 세포 집단이 세포분열을 통해 성장할 때 불안정할 수 있다.
종래방법의 장점을 갖고 있으며 어느 정도 결점을 회피한 세포주가 생산하는, 유전자 발현의 유도방법을 발전시키는 것이 가장 바람직하다. 또한 선택된 세포형 내에서 특정 유전자를 발현시키거나 특정 유전자의 내인성 발현을 변형할 수 있는 것도 바람직하다. 더욱이, 적절한 뉴클레오솜 페이징에 적절한 인트론의 배치 또는 보다 효율적인 mRNA 프로세싱 단계들에 의해, 인트론에 있는 숨어있는(cryptic) 전사성 인헨서를 포함할지도 모르는 완전한 게놈 서열에 의해 제공되는 잠재적인 잇점을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 잇점들은 일반적으로 유전자의 크기 때문에 재조합 DNA 발현방법에서는 향유할 수 없다. 게놈안에 이미 존재하는 유전자, 즉 내인성 유전자를 발현시킬 수 있다면 세포주 안정성 및 발현율은 보다 일률적이고 예측 가능하게 될 것이다.
본 발명은 안정된 세포주 또는 클로닝된 미생물의 게놈 내에 천연적으로 존재하는 유전자의 발현 특성을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 안정된 세포주내에 존재하고 정상적으로는 전사시 발현되지 않거나(transciptionally silent) 불활성인(inert) 유전자를 활성화 및 발현시키는 방법에 관한 것이다. 그 결과로서, 그 유전자의 단백질 산물이 발현된다. 이 현상은 단백질 산물을 암호화하는 DNA로 세포를 형질감염시키는 과정이 없이 일어난다. 오히려, 목적 산물을 암호화하는 내인성 유전자가, 세포내에서 동정되고, 상동성 재조합이라는 기술을 통하여 적절한 조절 단편(regulatory segment)이 삽입됨으로서 활성화된다. 양성 및/또는 음성 선별 마커들도 또한 삽입시켜 적절한 상동성 재조합 현상이 일어난 세포를 선별할 수 있도록 할 수 있다. 추가의 실시예로서, 특정 유전자가 정상적으로는 전사되지 않고(transciptionally silent) 본 발명의 방법에 의해 활성화되었든지, 또는 내재적으로 단백질 산물을 발현하든지 간에, 상기 유전자는 증대된 발현율도 증폭될 수 있다.
제1도는 본 발명에 따른 DNA구조물의 일반개요도를 보여준다.
제2a도는 비-상동성 또는 무작위 재조합의 경우 게놈 내로 DNA구조물이 통합되는 방식을 보여준다.
제2b도는 상동성 재조합의 경우 게놈 내로 DNA구조물이 통합되는 방식을 보여준다.
제3도는 본 발명에 따른 바람직한 상동성 재조합 벡터의 구조도를 보여준다.
제4도는 오직 한 개의 DNA 표적 단편을 사용하는 경우 상동성 재조합에 의한 환상 DNA단편이 통합되는 방식을 보여준다.
제5도는 그의 제한효소위치를 포함한 pRSVCAT 플라스미드를 보여준다.
제6도는 그의 제한효소위치를 포함한 pRSV 플라스미드의 구조도를 보여준다.
제7도는 그의 제한효소위치를 포함한 pSV2NEO 플라스미드를 보여준다.
제8도는 그의 제한효소위치를 포함한 pSVNEOBAM 플라스미드의 구조도를 보여준다.
제9도는 그의 제한효소위치를 포함한 pRSVNEO 플라스미드의 구조도를 보여준다.
제10도는 그의 제한효소위치를 포함한 pRSVCATNEO 플라스미드의 구조도를 보여준다.
제11도는 쥐 TSHβ유전자의 15.3kb 단편 및 그의 여러가지 제한 단편들을 보여준다.
제12도는 그의 제한효소위치를 포함한 pRSVCATNEOTSHB3 플라스미드의 구조도를 보여준다.
제13도는 그의 제한효소위치를 포함한 pRSVCATNEOTSHB3-5Xbai 플라스미드의 구조도를 보여준다.
제14도는 PCR 증폭을 위한 각각의 프라이머가 대응하는 영역과 함께 TSHβ의 뉴클레오티드 서열의 일부를 보여주고 있다. 엑손 2 및 3은 대문자로 나타나 있으며, 247 염기쌍의 증폭된 단편은 별표(*)로 밑줄쳐져 있다.
제15도는 여러가지 세포 집단으로부터 추출된 RNA로부터 합성된 cDNA, 및 존재하는 경우 PCR에 의해 증폭된 TSHβ cDNA의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 결과들을 보여주고 있다. 제15도에는 다양한 레인을 나타내는 세포들의 특성은 제15도의 겔의 하부에 나타나 있다.
[발명의 요약]
따라서, 본 발명의 목적은 종래 기술에 있어서 상기 지적한 결점들은 없애는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 유전자 기법의 장점을 갖으며 바람직하지 못한 특성을 제거한 유전자 발현의 조절 및/또는 증폭방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 선택된 세포주에 존재하지만 정상적으로는 전사되지 않는 특정 유전자를 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 mRNA 축적 및/또는 전사에 관여하는 완전한 게놈 서열의 모든 잇점을 이용하여 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 관심있는 천연 유전자의 상류단에, 또는 그 내부나 그 근처에서 안정된 세포주 또는 클로닝된 미생물의 게놈 내로 DNA 조절 단편 및/또는 증폭 단편을 삽입시킴으로서 관심있는 유전자의 발현 특성을 변형시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 추가의 목적은 안정된 세포주 또는 클로닝된 미생물의 게놈내에 천연적으로 존재하는 유전자의 발현특성을 변형시키는 방법을 제공하고 동시에 적절히 변형된 세포들을 선별하는데 도움이 되는 특성들을 삽입시키는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 관심있는 유전자의 암호화 영역 또는 엑손 근처에, 천연적으로 나타나지 않는 조절 단편 또는 증폭 단편을 지닌 게놈을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 상동성 재조합 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 DNA 구조물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 본 발명에 따른 게놈을 함유하는 세포주 및 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 또는 기타 목적들은 상동성 재조합 기술이라는 수단을 통해 수행되는데, 상동성 재조합 기술을 통해 당업계에서 통상의 기술을 지닌 자에 의해 내재하기는 하지만 전사되지 않는 유전자들의 발현 및 바람직하게는 증폭을 유발할 수 있다. 이 기술을 통해 또한 당업자는, 안정된 세포주의 게놈내에 천연적으로 존재하고 있지만 항상 전사되지는 않거나 불활성이지는 않은 유전자의 특성들을 변형할 수 있으며, 예컨대, 발현을 조건성 즉, 억제성 또는 유도성 발현을 하게 하거나, 발현율을 증대시킬 수 있다.
본 발명은 세포주 또는 미생물의 게놈 내 유전자의 발현 특성을 변형시키는 방법을 제공한다. DNA 구조물은 상동성 재조합 기법에 의해 그 게놈 내로 삽입된다. 이 구조물은, 숙주 세포주 또는 미생물 내에 작동가능하게 결합되는 임의의 유전자의 발현 특성을 변형시킬 수 있는 DNA 조절단편 뿐만 아니라, DNA 조절 단편이 삽입되기 원하는 위치의 게놈 영역과 상동성이 있는 표적 단편(targeting segment)을 포함한다. 새로운 DNA 조절 단편이 원하는 유전자에 작동가능하게 결합되도록 구조물 및 삽입기술이 고안된다. 따라서, 반드시 임의의 새로운 암호화 엑손을 삽입하지 않고도 그 유전자의 발현특성이 변형된다. 바람직한 실시예에 있어서, 유전자는 숙주 세포주 또는 미생물 내에서 정상적으로는 전사되지 않거나 불활성인 것이며, 상동성 재조합에 의해 상기 유전자에 대해 적절한 위치에 DNA 조절 영역으로 직접 표적화됨으로서, 상기 유전자는 그의 유전자 산물의 발현하도록 활성화된다.
DNA구조물은 바람직하게는 두 개의 표적 단편을 포함하는데, 이들은 구조물에서는 게놈내로 삽입되는 요소들에 의해 서로 분리되어 있는 반면 천연 유전자 내에서는 인접하여 있는 것이 바람직하다.
더 나아가 이 구조물은, 네오마이신 내성을 제공하는 유전자와 같이, 발현 가능한 선별 마커 유전자를 적어도 하나 포함하는 것이 바람직하다. 이 마커 유전자는 프로모터를 포함하며, 또한 구조물의 두 개의 표적 영역 사이에 배치된다.
다른 실시예에 있어서, 구조물은 관심있는 유전자의 발현을 증폭시키기 위하여 발현 가능한 증폭 유전자를 포함한다. 상기 유전자는 프로모터를 포함하며, 또한 구조물의 두 개의 표적 영역 사이에 배치된다. 몇몇 경우에, 선별 마커 및 증폭 마커도 마찬가지이다.
본 발명의 추가의 실시예에 있어서, DNA 구조물이 적절히 삽입된 세포에서는 발현되지 않는 음성 선별 마커 유전자를 DNA가 포함한다. 이러한 음성 선별 마커 유전자는 두 개의 표적 영역의 바깥쪽에 배치되어, 구조물이 상동성 재조합에 의해 유전자 내로 적절히 결합되었을 때 제거된다. 이러한 음성 선별 마커 유전자의 예로는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 유전자가 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 관심있는 세포주 또는 미생물에서 이미 그 생산물이 발현되고 있는 특정 유전자의 발현 특성을 변형시키는 것이 가능하다. 이것은 (1) 세포주 또는 미생물이 증폭 조건들하에 놓여있을때 관심있는 유전자의 복제수(copy number)를 증가시키는 발현 가능한 증폭 유전자 및/또는 (2) 예를 들면 전사 속도를 증가시키거나, 해독(translation) 효율을 증가시키거나, mRNA 축적을 증가시키거나 또는 발현이 유도 가능하게 만드는 등과 같이, 관심있는 유전자의 발현을 변형시키는 프로모터/인헨서 요소(또는 기타 조절요소)를 포함하는 DNA구조물을 상동성 재조합 기술에 의하여 삽입시킴으로서 수행될 수 있다. 이 방식으로 변형된 유전자 발현은, 천연 발현이거나 또는 세포주나 미생물에 대한 이전의 유전학적 조작에 의해 유발되는 발현일 수 있다.
이전의 유전학적 조작(genetic manupulation)은 통상의 기법에 의하거나 또는 본 발명에 따른 상동성 재조합의 수단에 의해 행해질 수 있다. 후자의 경우에 있어서, 발현특성의 변형을 초래하는 DNA 삽입은, 유전자의 발현을 결과로 초래하는 동일한 유전학적 조작의 일부로서 수행되거나 다음의 단계로서 수행될 수 있다.
본 발명은, 또한 전술한 바에 따라 제조된 구조물 뿐만 아니라, 이러한 구조물로 적절하게 상동성 재조합된 게놈들, 및 이러한 게놈들을 포함하는 세포주와 미생물들을 포함한다. 더 나아가 본 발명에 따라 형질전환된 세포를 배양시킴으로서 원하는 생산물을 준비하는 방법도 포함된다.
[바람직한 실시예들의 상세한 설명]
상동성 재조합은, 전사적으로 활성인 유전자에 돌연변이를 유발 또는 교정하고자 유전자를 표적화하려고 과거 몇년 전에 개발된 기법이다[kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36:301(1989) 참조]. 이러한 상동성 재조합의 기법은 특정 돌연변이를 포유류 게놈의 특정영역에 도입시키거나 [Thomas et al., Cell, 44:419-428, 1986; Thomas and Capecchi, Cell, 51:503-512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8585-8587, 1988 참조] 또는 결손 유전자의 특정 돌연변이를 교정하기 위한 방법[Doetschman et al., Nature, 330:576-578, 1987 참조]으로서 개발되었다.
이 기술을 통하여, 게놈 내로 삽입되기를 원하는 DNA 조각은, 이것을 표적 DNA(targeting DNA)에 연결함으로써 관심있는 유전자의 특정 영역에 안내될 수 있다. 표적 DNA는 게놈의 DNA영역과 상보성(상동성)이 있는 DNA이다. 만일 한 가닥의 DNA(single strand DNA)로 된 상동성 있는 두 개의 조각(즉, 표적화 DNA와 게놈성 DNA)이 아주 근접해 있을 경우, 이들은 하이브리드화되어 이중 가닥의 나선을 형성한다. 게놈내로 삽입되기 원하는 DNA서열은 표적 DNA에 결합된다.
상동성 재조합이 일어날 수 있는 다수의 방법이 있다. 한 예는 세포내 유사 분열 동안 DNA의 복제과정 동안 일어난다.
완전히 이해되지는 않은 기작을 통하여, 이중가닥의 모 DNA(parental double-stranded DNA)가, 복제버블(replication bubble)이라는 국소 영역에서 세포분열 바로 전에 열린다. 두 개의 분리된 DNA 가닥은 이제 새로운 가닥의 DNA가 합성되는 주형으로서 작용한다. 복제 포크(replication fork)의 한쪽 팔(arm)은 5' →3' 방향의 DNA 코드를 갖고 있어서 효소 DNA폴리머라아제가 해독할 수 있는 적절한 방향이다. 이 효소는 단일 가닥 DNA의 5' 부위에 부착하여 이 가닥을 주형으로 사용하여 상보성 DNA가닥을 합성하기 시작한다. 다른 모 DNA가닥은 3' → 5'방향으로 암호화되어 있다. 이것은 이 방향으로 DNA폴리머라아제에 의해 읽혀질 수 없다. 이 DNA가닥이 복제되기 위해서는 특수한 기작이 일어나야 한다.
특수화된 효소인 RNA 프라이마아제(primase)가 3' 에서 5'로 DNA 가닥에 결합되어 가닥을 따라 간격을 두고 짧은 RNA 프라이머를 합성한다. 프라이머로써 이러한 RNA 단편들을 사용하여 DNA 폴리머라아제는 프라이밍된 DNA에 부착되어, 5' 에서 3' 방향으로 상보성있는 DNA 조각을 합성한다. 새로이 합성된 이러한 DNA 조각은 오카자키 단편(Okazaki fragments)으로 불린다. 전체 반응을 개시하는데 관여하는 RNA 프라이머는 DNA폴리머라이제의 엑소뉴클리아제 기능에 의해 제거되고 DNA로 대체된다. 이 현상은 폴리머라아제가 프라이밍되지 않는 DNA 신장물(stretch of DNA)에 도달할 때까지 계속되며 DNA신장물에서 부분적 합성과정이 중단된다. 따라서 상보적인 모가닥은 전체적으로 3' 에서 5' 방향으로 합성되지만, 이것은 실질적으로 5' 에서 3' 방향으로 역바늘질(backstitching)에 의해 합성된다. 이 역바늘질 과정 동안에 DNA에 일어날 수 있는 틈(nick)들이 DNA 리가아제라고 불리우는 효소에 의해 채워진다.
DNA 암호의 절대적인 신뢰도를 유지시키기 위해 교정(proofreading) 기능이 DNA 폴리머라아제 내에 존재한다. DNA 폴리머라아제는 새로운 가닥의 DNA를 합성하기 위해 프라이밍된 DNA단편을 필요로 한다. 앞서 언급한 바와 같이, 이것은 RNA로 프라이밍된 단일 가닥 DNA일 수도 있고 상보성있는 단일 가닥의 DNA일 수도 있다. DNA 폴리머라아제가 잘못 짝지어진 상보성 DNA 조각들을 찾으면, 이것은 엑소뉴클레아제로서 작용하여 완전한 결합이 재차 이루어질때까지 3' 에서 5' 방향으로 DNA염기를 제거할 수 있다.
이러한 배경하에, 이제는 본원에 기재되어 있는 기법의 기초를 이해하는 것이 가능하다. 게놈의 특정 영역과 상보성이 있는 표적 DNA의 작은 조각들은, DNA 복제과정동안 모가닥과 접촉하게 놓여진다. 세포 내로 삽입되어 하이브리드되고 공유된 상동성 영역을 통해 다른 DNA 조각과 재조합되는 것은 바로 DNA의 일반적인 특성이다. 만약 이 상보성 가닥이 돌연변이나 또는 다른 서열의 DNA를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 결합되면, 이것 역시 재조합의 결과로서 새로이 합성된 가닥으로 통합된다. 교정기능의 결과로서, 새로운 DNA서열이 주형으로서 작용하는 것이 가능하다. 따라서, 형질감염된 DNA가 게놈 내로 통합된다.
특정 유전자의 서열이 알려져 있을 경우, 상기 유전자의 선택된 영역에 상보적인 DNA 조각은, 합성될 수 있거나, 그렇지 않다면 관심있는 영역을 둘러싼 특정 인식 부위에서 천연 DNA를 적절한 제한효소로 절단하여 얻을 수 있다.
이 조각은 세포내로 삽입되었을 때 표적 도구로 작용할 것이며, 게놈 안에 있는 상동성 영역에 하이브리드될 것이다. 만일 이러한 하이브리드화가 DNA 복제동안에 일어난다면, 상기 DNA 조각 및 여기에 결합된 임의의 부가 서열은 오카자키 단편으로 작용할 것이며, 새로이 합성되는 자 가닥(daughter strand)의 DNA내로 역바늘질 될 것이다.
본 발명의 기법에 있어서, 세포내에 존재하는 핵 조절 단백질과 상호작용하는 것으로 알려진 DNA의 영역 및, 선택적으로 증폭 및 선별 가능한 DNA마커들이, 표적 DNA의 상기 조각들에 결합된다. 따라서, 특정 단백질의 발현은, 가장 흔히 있는 바와 같이 유전자 그 자체 및 마커 DNA를 암호화하는 DNA를 형질감염시킴으로서 이루어지는 것이 아니라, 전사를 위한 인식 가능한 신호를 유전자에 제공하는 DNA 조절 단편들과 표적 DNA(관심있는 내재성 유전자와 상동성이 있는 영역들)를 짝을 이루어 사용함으로써 이루어질 수 있다. 이 기술을 사용하여, 실제로 그 유전자를 형질감염시키지 않고도 임의의 세포형 내에 존재하는 임의의 동계의 유전자(cognate gene)를 발현시키고 증폭시키는 것이 가능하다.
또한, 상기 유전자의 발현은 유전자 또는 cDNA의 부분들에 의해서이기보다는 전체 게놈 DNA에 의해서 제어되므로, 전사속도 및 mRNA 프로세싱의 효율이 증대된다. 더욱이, 한 세포형 내에 존재하는 임의의 동계의 유전자의 발현 특성은 관심있는 유전자의 전체 암호화 부위들을 삽입하지 않고도 DNA조절 단편을 적절히 삽입시킴으로서 변형시킬 수 있다.
본 발명의 이러한 관점에 따르면, 분화된 세포주 내에서 정상적으로는 전사되지 아니하는 목적 유전자들을 발현시키거나 또는 내재적으로 발현하는 목적 유전자의 발현을 변형시키는 신규방법이 제공된다. 발현되기 원하거나 또는 그들의 발현이 변형되기를 원하는 동계의 게놈성 서열들에, 필요한 세포 특이성 DNA서열들(조절 및/또는 증폭단편들)을 제공하여, 세포내에서 상기 유전자의 발현을 지시하거나 또는 변형시킬 것이다. 결과물 DNA는, (동계의 DNA서열에 대해) 이형성(heterologous)인 조절 및/또는 증폭 단편들에 작동가능한 방식으로 직접적으로 연결된, 목적 단백질을 암호화하는 DNA서열을 포함할 것이다. 선택적으로 양성의 선별 마커가 구조물내에 포함되어, 결과로 생기는 세포를 스크리닝하기가 용이하게 된다. 어떠한 선별 마커를 사용해도 좋지만, 네오마이신 내성 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 선택적으로 음성 선별 마커도 사용할 수도 있다. 예컨대, 단순 바이러스 티미딘 키나아제(HSVtK) 유전자를 마커로서 사용하면, 무작위적으로 통합된 벡터 DNA를 선별할 수 있다. 표적 DNA가 증폭가능한 마커에 연결되면, 융합된 DNA 또는 현존하며 발현하는 DNA는 증폭될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 따라, 특정 진핵세포주, 특히 분화된 세포주 내에 존재하는 경우 정상적으로 발현되는 임의의 유전자는, 그것에 특이성이 없는 세포주 즉 상기 유전자가 전사되지 않는 형식으로 있는 세포주에서 발현될 수 있다. 이것은 실제로 상기 유전자의 전체 DNA서열을 삽입시키지 않고도 일어난다. 또한, 상기 유전자 또는 정상적으로 발현하는 유전자는 증대된 발현율로 증폭될 수 있다. 더욱이, 전혀 전사되지 아니하는 것은 아닌 유전자들의 발현 특성은, 미생물 내에서 유전자의 발현 특성을 변형하는 것과 마찬가지로 변형될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 관심있는 특정 유전자를 함유하기는 하나 정상적으로 전사하지 못하는 진핵세포들은 본 명세서에 기술한 기법에 의해 전사되도록 유도된다. 후술하는 상동성 재조합 벡터를 클론성 세포주 내에 삽입시키고, 화학적으로 선별 한 후, 예를 들면 새로이 활성화된 유전자로부터 전사된 mRNA의 탐지하는 방법에 의해서, 또는 특정 유전자 산물의 면역학적 탐지하는 방법에 의해서, 또는 특정유전자 산물에 대한 기능적 분석과 같은 적절한 수단에 의해서 특정유전자 산물의 생산여부를 관찰한다.
상동성 재조합에 의해 내인성 유전자가 전사되도록 활성화시키는데 사용되는 DNA구조물의 일반개요는 제1도에 나타나있다.
일반적으로, 이 DNA 구조물은 적어도 2개 내지 6개 이상의 분리된 DNA 단편들로 이루어진다. 이 DNA단편은, 적어도 한 개 바람직하게는 2개의, 발현되기 원하는 유전자의 내부 또는 이것에 근접한 세포 게놈의 영역에 상동성이 있는, DNA표적 단편(A 및 B)과, 양성 선별 유전자(C)와, 증폭 가능한 유전자(D)와, 음성 선별 유전자(E)와, 형질감염될 세포에서 전사할 수 있도록 활성인 DNA 조절단편(F)로 구성된다. 본 발명의 가장 기본적인 실시예에 있어서는 단지 하나의 표적 단편(B)과 조절 단편(F)가 존재해야만 한다. 다른 모든 기타의 영역들은 선택적이며 바람직한 구조물을 제공한다.
영역 A 및 B는, 전사될 수 있도록 활성이 있게 만들고자 하는 관심있는 내인성 유전자의 영역들에 상동성이 있는 DNA 서열들이다. 내인성 유전자의 특정 영역 A 및 B를 선별하여, 조절 단편이 삽입되기 원하는 특정 위치의 상류단 및 하류단에 각각 위치하도록 한다. 비록 이들 영역들이 구조물에서는 분리되어 있지만, 내인성 유전자 내에서는 인접해 있는 것이 바람직하다. 게놈에서 인접해 있지 아니하는 부분들이 표적 단편으로 이용되는 경우들이 있을 수 있는데, 예를 들면, 음성조절 요소와 같이 게놈의 일부에서 결실시키는 것이 바람직할 경우이다.
두 개의 표적 영역 A 및 B는 전체 상동성 영역을 증가시키고, 따라서 재조합 효율을 증가시키기 위해 바람직하나, 본 발명의 방법은 또한 오직 하나의 표적 영역의 사용도 포함한다. 가장 단순한 형태(오직 조절 단편 F 및 선별 가능한 마커 유전자 C 및 프로모터 C' 가 삽입되는 경우)에서는, 표적 DNA와 함께 이러한 요소를 포함하는 환상의 DNA 조각을 사용한다(제4도 참조). 이러한 방식으로, 상동성 영역(B)는 게놈에 있는 그의 상대부(counterpart)와 하이브리드된다. 단편 C', C 및 F는 교차 반응(crossover event)된 후에 동계의 유전자의 B 부분 내에 삽입된다.
DNA 조절 서열이 관심있는 유전자의 상류단에 삽입되는 것이 바람직할 경우, 예컨대 정상적으로는 전사되지 않는 유전자를 활성화시키고 발현시키는 것이 바람직한 경우에는, 상동성 영역은 관심있는 유전자의 암호화 부위의 상류단에 있는 게놈의 비암호화 부위에 상동성이 있는 것이 바람직하다. 두 개의 표적 영역이 존재할 경우, 하류단 영역(A)은 암호화 영역의 일부를 포함할 수 있으며, 또한 전체가 모두 암호화 영역의 상류단에 있는 것도 바람직하다. 상동성 영역이 관심있는 유전자에 대한 천연 프로모터의 하류단에 삽입되도록 선택하는 것이 더욱 바람직하며, 특히 천연 프로모터가 작동되지 않는 양성 프로모터이기보다는 음성 프로모터일 경우에 그러하다.
표적 영역, 즉 상동성 영역의 크기는 중요하지 않으나, 상기 영역이 짧으면 짧을수록 이들이 적절한 상동성 영역을 발견하고 목적하는 지점에서 재조합하는 확률은 작아진다. 따라서, 상동성 영역이 짧아질수록 상동성 재조합의 효율이 낮아진다. 즉 재조합된 클론을 성공적으로 얻을 수 있는 비율이 작아진다.
서열 상동성을 위한 최소 한도는 25염기쌍이라고 제안되어 있다(Ayares et al., PNAS, USA, 83:5199-5203, 1986 참조). 더욱이, 구조물에 있는 임의의 다른 요소들이 또한 숙주세포의 게놈에서도 발견된다면, 잘못된 곳에서 재조합이 일어날 가능성이 있다. 그러나, 본 발명에 있어서 뛰어난 양성 및 음성 선별능력(selectability)에 비추어 볼때, 효율이 낮다 하더라도 이것은 성공적으로 수행될 수 있다. 표적 영역 모두를 포함하여 전체 상동성 있는 영역이 큰 경우, 예컨대, 1 내지 3kb일 때 최적의 결과가 얻어진다. 조절가능한 단편 F가 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있는 한, 표적 영역 및 특히 상류단의 표적 영역 B의 크기에는 제한이 없다.
표적 영역들이 너무 큰가, 또는 조절가능한 단편 F가 작동가능하게 연결될 유전자의 암호화 영역으로부터 너무 멀리 위치해 있는가의 여부는 경험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 이 경우에 있어서, 영역 A 및 B는 관심있는 유전자의 상이한 부분에 상동성이 있게 할 수 있으며, 이 과정은 조절 단편 F가 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결되도록 적절히 삽입될때까지 반복될 수 있다. 예를 들면, 내인성 유전자중 조합된 영역 A-B의 제한효소 위치는 변경될 수 있으며 이 과정은 반복될 수 있다. 본 발명의 개념이 본 명세서에 기재된 기법과 함께 일단 알려지면 당업계에서 통상의 기술을 가진 자는 과도한 실험을 행하지 않고도 임의의 세포주 또는 미생물에서 임의의 주어진 목적 유전자에 대하여 본 발명을 수행하고 사용할 수 있을 것이다.
영역 C는 양성 선별 마커 유전자로서, 형질 감염된 세포주가 일반적으로 독성이 있는 환경에 대해 내성을 갖게하는 것이다. 이러한 유전자의 예로서는 아데노신 디아미나아제(ADA), 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제(neo), 디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR), 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라아제(HPH), 티미닌 키나아제(tk), 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(gpt), 다약제 내성 유전자(MDR), 오르니틴 데카르복실라아제(ODC) 및 N-(포스폰아세틸)-L-아스파르테이트 내성(CAD)을 들 수 있다.
양성의 선별 마커 유전자에 부가하여, 증폭 유전자(amplifiable gene)도 선택적으로 영역 D에서 구조물에 포함된다. 증폭 유전자들은 선택압(selective pressure) 하에서 복제수를 증가하도록 하는 유전자이다. 증폭 유전자에 인접하여 위치해 있는 유전자의 복제수 또한 증가될 것이다. 이용할 수 있는 증폭 유전자는 DHFR, MDR, ODC, ADA 및 CAD를 포함한다. 양성 선별 마커 유전자 군의 일원과 증폭 유전자 군의 일원들은 중복되어 있으므로, 이론적으로는 두 개의 유전자, 즉 양성 선별용의 유전자 및 증폭용 유전자를 사용하는 대신에 하나의 유전자가 두가지 목적을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 대부분의 세포주는 이들 증폭 유전자가 내재적인 사본(copy)들을 함유하고 있으므로, 세포들은 이미 선별조건에 대해 어느 정도는 내성이 있으므로, 형질감염된 DNA를 가진 세포와 형질감염된 DNA를 수용하지 않은 것을 구별하는 것은 어려울 수 있다. 따라서, 증폭 유전자를 원할 경우, HPH, gpt, neo 및 tk(tk-세포에 있어서)와 같이 우성인 양성 선별 유전자도 구조물 내에 포함시켜야 한다. 몇가지 응용에 있어서 증폭 마커를 생략하는 것이 가능하거나 또는 바람직하다. 예를 들면, 이형성 DNA 조절 서열에 의해 전사되도록 활성화가 증폭없이도 충분할 경우, 관심있는 유전자를 증폭시킬 필요가 없을 수도 있다. 또한, 만일 상동성 재조합 효율에 매우 낮을 경우, 상동성 DNA에 대한 비-상동성 DNA의 비율이 상동성 재조합 효율과 직접적으로 관계가 있기 때문에, 증폭 유전자를 생략할 필요도 있다(Letsou, Genetics, 117:759-770, 1987 참조). 또한, 양성의 선별 유전자를 제거하여 오직 원하는 단백질 또는 mRNA의 생산 여부를 스크리닝함으로써 세포를 선별하는 것도 가능하다. 그러나, 대부분의 경우 적어도 양성 선별 유전자를 함유시키는 것이 바람직하다.
구조물의 영역 E는 음성의 선별 마커 유전자이다. 이러한 유전자는 DNA 구조물이 상동성 재조합에 의해 적절히 삽입된 세포에서는 발현되지 않고 DNA 구조물이 무작위 통합과 같이 부적합하게 삽입된 세포에서는 발현된다. 이러한 유전자 중 하나는 단순 포진 바이러스 티미닌 키나아제 유전자(HSVtK)이다. 이 HSVtK는 뉴클레오티드에 대한 낮은 엄격성(stringency)을 가지며 정상 포유류 세포가 인산화할 수 없는 뉴클레오티드 유사체들을 인산화할 수 있다. HSVtK가 세포내에 존재할 경우, 아사이클로비르(acyclovir) 및 간사이클로비르(gancyclovir)와 같은 뉴클레오티드 유사체가 인산화되어 숙주 세포의 DNA내로 통합되어 세포를 죽인다. 음성 선별마커 유전자의 존재는, 마소우르 등(Mansour et al)에서 기술한 바와 같이 상동성 재조합에 대한 양성-음성 선별마커의 사용을 가능하게 한다(Nature, 336-348-352, 1988 참조). 카페치(Capecchi)는 무작위 통합에 의해 삽입될 때와 비교하여, 상동성 재조합에 의해 선형화된 벡터 DNA가 삽입될 때 일어나는 다른 통합의 방식의 장점을 이용한 방법을 사용하였다. 만일 벡터 DNA가 무작위적으로 삽입되면, 대부분의 삽입체는 말단을 통해 삽입된다(Folget et al, Mol Cell Biol., 2:1372-1387, 1982; Roth et al, Mol. Cell. Biol., 5:2599-2607, 1985; 및 Thomas et al, Cell, 44:419-428, 1986 참조). 이와는 반대로 벡터가 상동성 재조합에 의해 삽입되는 경우에는, 벡터는 상동성 영역을 통하여 재조합되고 상동성 영역의 바깥쪽에 있는 서열의 손실을 초래한다.
제1도에 나타낸 구조물을 하나의 예로서 사용하여, 상동성 재조합에 대한 통합 대 무작위 통합의 양상을 제2a도 및 제2b도에 나타냈다. 비상동성 재조합의 경우(제2a도)에, 벡터는 구조물의 말단을 통하여 삽입된다. 이로 인하여 영역 E가, 이 경우 HSVtK유전자가 게놈 내로 삽입된다. 그러나, 상동성 재조합이 일어날 경우(제2b도)에는, HSVtK유전자는 손실된다. 선별의 첫번째 단계는 구조물 내에 존재하는 양성 선별에 적절한 약제 또는 조건을 사용한다. 상동성 재조합 또는 무작위 통합 중 어느 하나에 의해 통합된 DNA를 갖는 세포는 이 선별 단계에서 생존할 것이다. 이어서 생존한 세포는 HSVtK 유전자를 함유하는 모든 세포를 죽일 간사이클로비르와 같은 약제에 노출된다. 이 경우에, 무작위 통합을 통하여 벡터가 통합된 대부분의 세포는 HSVtK 유전자를 함유하여 약제에 의해 치사되는 반면, 상동성 재조합에 의해 벡터가 통합된 세포들은 HSVtK유전자를 잃어서 생존하게 된다. 이로서 무작위적으로 통합된 DNA를 함유하는 대부분의 세포는 제거되고 상동성 재조합에 의해 통합된 DNA를 함유하는 대부분의 세포들은 생존하게된다. 이는 올바르게 재조합된 것의 동정을 매우 쉽게 하도록한다.
음성의 선별 단계 역시 필요시 생략할 수 있다. 이 경우 스크리닝 단계는 폴리머라아제 사슬 반응(PCR) 또는 면역학적 스크리닝과 같은 기법을 필요로 하게 하므로 더욱 힘들게 된다.
여섯번째 영역(F)는 관심있는 유전자가 전사될 수 있도록 활성화시키는데 사용될 DNA 조절 단편을 함유한다. 적절한 DNA 조절 단편은 사용할 세포형에 따라 선택된다. 바람직하게 사용되는 조절 단편은 분화된 숙주 세포주에서 주어진 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로 알려진 것이다. 예를 들면, 세포주가 성장 호르몬 및 프로락틴과 같은 단백질을 천연적으로 발현하는 뇌하수체 세포로 이루어져 있을 경우, 이들 유전자 중 어느 하나에 대한 프로모터가 DNA 조절 단편 F로서 사용될 수 있다. 조절 단편이 본 발명의 방법에 따라 삽입되는 경우, 조절 단편은 정상적으로는 전사되지 않는 목적 유전자에 작동가능하게 연결되어, 숙주 세포에서 그 유전자의 전사 및 발현이 자극될 수 있다. 또한 로우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터와 같이 세포형을 가로질러 작용하는 변덕스러운 DNA 조절 단편도 사용가능하다. 조절단편이 본 발명의 방법에 의하여 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결되도록 숙주세포주 내로 삽입된 후, 조절 단편이 관심있는 유전자의 전사 및/또는 발현을 촉진시키거나 또는 전사 및/또는 발현을 촉진하도록 유도될 수 있는 한, 조절단편은 본 발명에 사용될 수 있다. 조절 단편 F를 표적 단편에 결합시킬 때, 개시코돈이 서열내로 우발적으로 유입되지 않는 것이 중요한데, 왜냐하면 이러한 경우에 발현되기 원하는 유전자의 해독 프레임이 변형될 수 있기 때문이다. 물론 조절 요소 F가 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결되도록 이 구조물을 작제하고 삽입하여야 한다.
관심있는 세포주에서 이미 발현되고 있는 유전자의 전사를 증대시키거나 증폭시키고자 할 경우에는 DNA 조절 단편인 영역 F는 존재할 필요가 없다. 왜냐하면, 이것이 상기 세포주에서 천연적으로 발현되거나 또는 세포주가 이러한 발현을 유발하도록 조작된 그의 DNA를 이미 가졌기 때문이다. 이러한 경우에, 바람직하게는 양성 선별 마커 유전자인 영역 C와 또한 선택적으로 음성 선별 마커 유전자인 영역 E와 함께, 증폭 유전자인 영역 D가 삽입되면, 관심있는 유전자의 복제수가 증가되고 따라서 전체 전사된 양이 증가되기에 충분하다. 또다른 방법으로, 관심있는 유전자에 대한 기존의 조절 영역에 비하여 증가된(또는 달리 변형된) 전사 속도를 본질적으로 촉진시키는 새로운 조절 단편인 영역 F를 포함시키면, 기존의 발현되는 목적 유전자의 전사를 더욱 증대시킬 수 있다. 이러한 새로운 조절 단편은 전사 효율을 증대시키는 프로모터나 인헨서를 포함할 수 있다.
영역 C', D' 및 E' 는 각각 영역 C, D 및 E에서 유전자들을 구동시키는데 사용되는 프로모터 영역이다. 이러한 프로모터들은 선택된 세포주에서 전사적으로 활성이 있으며, 관심있는 내인성 유전자를 구동하는데 사용되는 영역 F에 있는 프로모터와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 제1도에 나타낸 전사의 특정 방향은 중요하지 않다. 어떠한 방식으로도 동시에 관심있는 유전자 또는 구조물 중의 임의의 다른 유전자의 발현을 파괴시키지 않고, 프로모터들이 그들과 관련된 유전자들의 발현을 촉진할 수 있도록, 당업계의 통상의 기술을 가진 자는 유전자 C, D 및 E와 이들 프로모터 C', D' 및 E'의 적절한 배치를 결정할 수 있다.
본 발명은 GH1(ATCC CCL 82), GH3(ATCC CCL 82.1) 또는 GH4Cl 세포주들(GH)에서 쥐의 타이로트로핀 베타 소단위(TSHβ)를 활성화시키는 것을 참고로 하여 설명될 수 있다. GH 세포주는, MtT/W5로 명명된 쥐(Takemoto, Cancer Res., 22:917, 1962)에서 방사선으로 유발되는 뇌하수체 종양으로부터 유래되었으며 타슈이안 등(Tashjian et al., Endocrinology, 82:342-352, 1968)에 의한 배양배지에서 성장될 수 있도록 적응되어 있다. 이러한 세포주는 서브클로닝하여 성장호르몬 및 TSHβ를 생산하는 능력으로 스크리닝될 수 있다. 쥐 성장 호르몬 유전자에 대한 mRNA가 존재하는지를 결정하고, TSHβ 유전자에 대한 mRNA가 존재하는지에 대해 결정하기 위해서는, 노던 블럿 분석을 사용하여 스크리닝하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 게놈 내에 존재하는 TSHβ 유전자가 적어도 하나 존재하는지를 결정하기 위해 세포주를 써던 분석으로 스크리닝 할 수도 있다. 성장호르몬을 생산하고 TSHβ를 생산하지 않지만 TSHβ 유전자를 한 개 함유하고 있는 GH세포주만을 사용한다.
GH세포에서 사용하기 위한 특정 상동성 재조합 벡터를 다음의 방식으로 설계할 수 있다(제3도 참조). 영역 A는 HindIII단편으로 정의되는 TSHβ유전자의 5' 상류단의 비번역 영역, 즉 -74와 -2785사이에 펼쳐진 영역으로 구성될 수 있으며, 카르 등(Carr et al., J. Biol. Chem., 262:981-987, 1987 참조) 및 크로일 등(Croyle et al, DNA 5:299-304, 1986 참조)에서 기술된 바와 같이, 영역 B는 -2785 HindIII위치로 부터 약 2.1kb 더 상류단에 위치한 Ncol 위치까지 펼쳐진 DNA 단편을 함유할 수 있다. 양성 선별 유전자(영역 C)는 플라스미드 pSV2neo로 부터 유래된 1067 bp BglII-Sma I 단편(ATCC No. 37,149)(Southern et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:327-341, 1982 참조)이 될 수 있다. 네오 유전자는 플리스미드 pRSVcat의 Nde I -HindIII단편으로 부터 유래된 로우스 육종 바이러스(RSV)프로모터(영역 C')에 의해 얻어질 수 있다(ATCC No. 37,152)(Gorman et al. PNA, 79:6777-6781, 1982). 이러한 실시예에 있어서는, 증폭 마커가 필요없으므로 상동성 재조합의 효율을 극대화시키기 위해 영역 D는 필요없다. 효율은 구조물 내에 존재하는 상동성 서열에 대한 비상동성 서열의 비율에 반비례한다(Letsou et al, Genetics, 117:759-770, 1987 참조). 영역 E 또는 음성 선별 유전자는, 플라스미드 pMCITK(Capecchi et al., Nature, 336:348-352, 1988 참조)로부터 획득된 2kb Xho 단편인 HSVtK 유전자로 구성될 수 있다. 토마스 등 (Thomas et al., Cell, 51:503-512, 1987 참조)에 의해 작제된 폴리오마 바이러스 프로모터 및 인헨서(영역 E')에 의해 상기 구조물에 있는 HSVtK 유전자가 구동될 수 있다. 두번째 DNA 구조물에 있어서 폴리오마 프로모터를 상기한 RSV프로모터로 대체해도 좋다. TSHβ 유전자를 활성화시키는데 사용되는 DNA 조절 서열은, RSV프로모토 또는 쥐 성장호르몬 프로모터 중 하나일 수 있다. 쥐 성장호르몬 프로모터는 플라스미드 pRGH237CAT(Larson et al., PNAS, 83:8283-8287, 1986)로 부터 얻은 Sac I - EcoR I 단편으로 이루어진다. 이 RSV 프로모터는 GH세포 이외에 다른 세포주에서도 사용될 수 있는 잇점을 갖는 반면에, GH 프로모터는 GH세포에서 활성이 있으며 특이성 있게 유도될 수 있다고 알려져 있다(Brent et al, J. Biol. Chem., 264:178-182, 1989). 쥐 성장호르몬 프로모터 및 RSV프로모터는 분리된 구조물들에서 위치F에 삽입될 수 있다.
상기 구조물을 GH세포주에 형질감염시킨 후, 이 세포를 G418을 함유한 배지에서 성장시킬 수 있다. 이것은 상동성 재조합 또는 무작위 통합에 의해 플라스미드 DNA가 게놈 내에 통합된 세포들만이 성장하도록 한다. 생존 세포들은 간사이클로비르를 함유하는 배지에서 성장시킬 수 있다. 상기 단계의 선별에서 생존한 대다수의 세포들은 벡터 플라스미드 DNA가 상동성 재조합에 의하여 통합된 것들일 것이다. 이러한 세포들이 TSHβ유전자에 대응하는 mRNA를 생산하는지 그리고 TSHβ 단백질을 생산하는지를 결정하기 위해 상기 세포들을 스크린할 수 있다. 적절한 재조합이 일어났는지를 확인하기 위해 이형성 프로모터(heterologous promoter)의 삽입 부분 주위의 게놈성 DNA를 서열화할 수 있다.
[실시예-쥐 뇌하수체 세포에서 TSHβ 유전자의 활성화]
다음 프로토콜을 사용하여, 정상적으로 쥐 GH3뇌하수체세포주에서는 발생하지 않는 타이로트로핀 베타 소단위(TSHβ) 유전자의 전사를, TSHβ 암호화 영역의 상류단에 있는 활성화 요소를 목표로 삼는 상동성 재조합 과정을 사용하여, 이들 세포에서 활성화시켰다. 로우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터는 GH3 세포에서 효과적으로 작용하는 것으로 알려져 있으며[Christian Nelson et al., Nature, 322:557-562 (1986); Zheng-Sheng et Ye et al., The Journal of Biological Chemistry, 263:7821-7829 (1988) 참조], 따라서, 활성화 요소로서 선택되었다. 형질감염된 세포 집단을 단리하기 위하여, RSV 활성화 요소, TSHβ 유전자좌의 5' 플랭킹 영역의 부분들 및 선별용 약제 마커인 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제 유전자(neo)를 함유한 플라스미드 벡터를 작제하였다. 리보핵산(RNA)를 모아진 약제 내성 GH3세포 집단으로 부터 추출하여, 상보성있는 데옥시리보핵산(cDNA)로 전환시켰다. 이어서 TSHβ cDNA의 존재에 대하여 폴리머라아제 사슬반응(PCR)의 기법에 의해 상기 cDNA를 스크리닝하였다. 상동성 재조합 벡터 및 조절 벡터의 작제는 실험적 절차 및 결과와 함께 아래에 기술되어 있다.
[플라스미드 작제]
[상동성 재조합(HR) 기본 벡터(pRSVCATENO)]
플라스미드 pRSVCAT [Cornelia M. Gorman et al., Proceedings of The National Academy of Science, 79: 6777-6781 (1982) 참조](제5도)로 부터, 기능성 프로모터 단위를 함유하는 580염기쌍(bp)의 Nde I - HindIII 단편을 단리함으로써 로우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터를 추출하였다.
상기 단편의 말단들을 DNA 폴리머라아제 I 클레나우 단편을 사용하여 평활화시키고, Xba I 링커들을 상기 평활 말단(blunt ends)에 연결시켰다. Xba I 제한효소로 분해 및 겔 정제시킨 후, 결과물 단편을 pUC18의 Xba I 부위에 연결시켰다. 제6도에 나타난 방향으로 RSV삽입체를 가진 플라스미드를 함유하는 세균 콜로니를 pRSV로 명명하였다. pSV2NEO[P.J. Southern et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 1:327-341(1982) 참조]로 부터 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제 유전자(NEO)를 클로닝하기 위해, BglII 및 BamHI 단편(제7도)을 단리하고 상기 단편을 pRSV(제6도)의 BamHI 위치에 연결시켰다. 제8도에 나타난 방향으로 NEO 유전자를 함유하는 플라스미드를 선별하여 pRSVNEOBAM이라 명명하였다. pRSVNEOBAM을 Sma I 으로 분해하여, RSV 프로모터 영역, 대부분은 NEO유전자 및 puc18을 함유한 4328 bp 단편을 전기 영동에 의해 단리하였다. 상기 단편의 Sma I 말단에 Xho I 링커를 연결시키고 Xho I 제한 효소로 절단한 후 플라스미드를 연결하여 다시 환형화시켰다. 결과물 플라스미드가 제9도에 나타나 있으며 pRSVNEO로 명명하였다. 상기 마지막 클로닝 단계에 의해, 기능성 있는 발현에 필요하지 않은, NEO 단편의 3' 말단으로부터 786 bp 단편이 결실되었다. 이러한 작제에 의해 NEO유전자가 RSV프로모터에 의해 전사될 수 있는 플라스미드가 만들어졌다.
이어서, pRSVCAT(제5도)에 있는 RSV 프로모터의 5' 에 위치한 Nde I 위치를 Sal I 위치로 전화시켰다. 이를 위해 pRSVCAT를 Nde 1으로 분해하고, DNA폴리머라아제 I 클레나우 단편을 사용하여 말단들을 채우고, Sal I 링커를 결과물로 생긴 평활 말단에 연결시켰다. 링커들은 Sal I 으로 분해하여 완성시킨 후 플라스미드를 연결하여 재환형시켰다. RSV프로모터 및 NEO 유전자를 함유하는 pRSVNEO(제9도)로 부터 Sal I -Xho I 단편을 새로이 작제된 Sal I 위치안으로 클로닝시켰다. 제10도에 나타나 있는 방향으로 RSV 프로모터와 NEO 단편을 갖는 플라스미드를 단리하여 pRSVCATNEO로 명명하였다. 이 플라스미드는 GH3세포내로 형질감염 되면 G418내성을 세포에 제공할 수 있는데, 이는 NEO 유전자의 전사를 유도하는 RSV프로모터의 능력 및 기능성 단백질로 번역될 그 RNA의 능력을 보여준다(데이타로 나타내지는 않음). 상기 안정된 형질감염체로 부터 나온 전체 RNA를 폴리머라아제 사슬 반응(PCR)으로 분석하여, CAT유전자가 전사되고 있는지를 결정하였다. PCR결과를 통해, 시험된 모든 G418 내성 콜로니들이 실제로 전사되고 있음을 알 수 있었으며(데이타로 나타내지 않음), 이는 CAT 유전자의 5'에 있는 RSV 프로모터가 이것의 3'에 위치한 유전자의 전사를 유도할 수 있음을 보여주고 있다. 하기의 TSHβ HR벡터가 상동성 재조합을 통하여 GH3게놈내로 통합될 때, 상기 RSV프로모터가 TSHβ 유전자의 전사를 유도하는데 관여할 것이기 때문에, 상기와 같은 사실은 중요하다.
[TSHβ HR 벡터]
타이로트로핀 베타 소단위(TSHβ) 유전자의 5' 플랭킹 영역의 두 신장물(stretchs)을 pRSVCATNEO(제10도)에 함유된 단 하나의 Sal I 및 HindIII 위치내로 삽입시킴으로서, 상동성 재조합에 의해 GH3게놈 내로 통합될 수 있는 벡터를 작제하였다. 람다 DASH 내로 클로닝된 15kb이상의 삽입체를 함유하는 쥐 비장의 게놈성 라이브러리를 캘리포니아주 샌디아고 소재의 스트라타진(Stratagene)으로 부터 구입하였다. 표준 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology, pp.1.9.1 - 1.13.6, 6.1.1. - 6.4.10 참조)을 사용하여, 첫번째 엑손의 5' 에 위치한 9kb의 서열을 포함하는, 쥐 게놈성 TSHβ유전자의 15.3 kb 클론을 단리하였다. 15.3 kb 단편은 두개의 Xba I 단편, 15.3kb 단편의 5' 말단에 대응하는 10.6kb단편 및 15.3kb단편의 3' 영역에 대응하는 4.7kb 단편으로 이루어져 있다(제11도 참조).
상기 두 Xba I 단편 모두를 pUC18내로 서브클로닝시켜 양쪽 방향으로 삽입체를 함유하고 있는 플라스미드를 단리하였다. 4.7kb Xba I 단편(제11도)에 포함되어 있는 2.3 kb X0ba I - HindIII을 정제하고, 상기 단편의 Xba I 위치를 HindIII링커들에 연결시킴으로서 HindIII 위치로 전화시켰다. 상기 단편을 pRSVCATNO(제10도)이 갖고 있는 단 하나의 HindIII 위치내로 연결시켰다. 제12도에 나타나 있는 바와 같이 올바른 방향으로 2.3kb삽입체를 지닌 플라스미드에 대응하는 단리물을 pRSVCATNEOTSHB3으로 명명하였다.
쥐 TSHβ 클론(제11도)으로 부터 나온 서브클로닝된 10.6kb Xba I 단편을 단리하고, DNA폴리머라아제 I 클레나우 단편으로 상기 단편의 말단을 평활화 시킨 후 Sal I 링커를 첨가시킴으로서 Xba I 말단을 Sal I 위치로 전환시켰다. 이어서 상기 10.6kb Sal I 단편을 pRSVCATNEOTSHB3(제12도)의 Sal I 위치 안으로 클로닝시켰다. 올바른 방향으로 삽입체를 함유한 플라스미드를 동정하여 pRSVCATNEOTSHB3-5Xba I 으로 명명하였다(제13도). 후자의 플라스미드를 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁하여 기탁번호 ATCC 40933를 부여받았다. 이 기탁을 위하여 이 플라스미드를 pHRTSH로 재명명하였다. 이 기탁은 부다페스트 조약의 모든 규정에 따라서 행하였다.
[세포주]
GH3세포들은, 방사선에 의해 유도된 쥐 뇌하수체 종양[B.K. Takemoto, Cancer Research, 22:917(1962) 참조]으로 부터 유래된 MtT/W5의 서브클로닝된 집단이며, 타슈이안 등[Tashjian et al, Endocrinology, 82:342-352 (1968) 참조]에 의한 배양배지에 성장할 수 있도록 적응되어 있는 것이다. GH3세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC) 세포은행으로부터 입수하여 둘베코의 변형 이글의 배지(DMEM) + 15% 말 혈청(HS) + 2.5% 태아 송아지 혈청(FBS) + 1% L-글루타민(GH3배지)중에서 5% CO2중의 37℃에서 성장시킴으로서 배지안에 유지시켰다.
[DNA 작제]
[플라스미드 DNA 대량 작제]
안정된 형질감염에 사용되는 모든 플라스미드들을 Current Protocls in Molecular Biology, Vol, 1, pp. 1.7.1 - 1.7.2.에 기술된 바와 같이 플라스미드 DNA를 대량으로 정제하기 위한 알킬리 분해법을 사용하여 정제하였다. 알칼리 분해법에 의해 단리한 DNA를, Current Protocls in Molecular Biology, Vol, 1, pp. 1.7.5 - 1.7.7.에 또한 기술된 바와 같이 세슘 클로라이드 구배에서 2중 밴드화함으로써 더 정제하였다.
형질감염에 앞서 HR벡터를 AatII 또는 Apa I 중 하나로 분해시켰다. Apa I는 대조군 플라스미드인 pRSVCATNEO을 선형화시키는데 사용하였고, AatII는 HR플라스미드인 pRSVCATNOTSHB3 - 5Xba I 를 선형화시키는데 사용하였다. Apa I 및 AatII의 절단 부위의 위치는 각각 도면 제10도 및 제13도에서 볼 수 있다. 적절한 제한 효소로 분해시킨 후, 반응물을 페놀/클로로포룸 추출, 클로로포룸 추출, 에탄올 침전시킨 후 70% 에탄올로 1회 세척하였다. 이어서, 이 플라스미드를 OD260에서 측정했을 때 1㎍/㎕의 농도까지 살균 탈이온수(dH2O)중에 현탁시켰다. 형질감염 효율 및/또는 무작위 통합에 기인한 양성반응에 대한 상동성 재조합 양성반응의 비율을 증가시키려는 의도에서, pRSVCATNEOTSH3-5Xba I 를 Apa I 로 분해시켰다. Apa I 으로 절단시키면 pRSVCATNEOTSHB3-5Xba I 에서는 3개의 분리된 위치에서 절단되며, 상동성 재조합에 필요한 부분을 제외한 벡터의 모든 영역이 제거된다.(제13도). Apa I 으로 절단한 후, 반응물을 0.8% 아가로스겔 상에서 전기영동시킨 후, TSHβ유전자의 두 5' 플랭킹 영역과, RSV프로모터-NEO영역과 TSHβ유전자-활성화 RSV프로모터를 함유하는 10,992 bp에 해당하는 상부밴드를, 투석 튜브 내로 전기용출시킴으로서 겔로 부터 단리하였다. 전기용출된 DNA를 일루팁 미니컬럼(elutip minicolum) (Schleicher 및 Schuell)을 사용하여 제조업자가 추천한 표준 프로토콜에 따라 더 정제시켰다. DNA를 컬럼으로부터 용출하고, 에탄올 침전시키고, 70%에탄올로 세척한 후 1㎍/㎕의 농도까지 현탁시켰다.
[안정된 형질감염]
[인산 칼슘 형질감염]
형질감염 48시간 전에 3 × 106GH3세포들을 10㎝접시상에 플레이팅시켰다. 각각의 접시에, 초음파처리한 연어 정자 DNA 30㎍과 함께 벡터 DNA 10㎍을 형질 감염 완충액 0.5㎖에 첨가하였다. 형질감염 완충액은 4g NaCl, 0.185g KCl, 0.05g Na2HPO4, 0.5g 덱스트로오스, 2.5g HEPES 및 dH2O를 최종용적 500㎖㎗ 되게 혼합하고 pH를 7.5가 되게 하여 준비하였다. 2몰 CaCl231㎕를 DNA+형질감염 완충액 0.5㎖에 첨가하여 와동시켰다. 이 용액을 실온에서 45분 동안 정치시켰다. DNA-CaCl2-형질 감염 완충액이 준비되었을때, GH3배지를 GH3세포에서 제거하고 DNA-CaCl2-형질감염 완충액을 세포위에 가하였다. 이 세포를 실온에서 20분 동안 정치시켰다. 20분후, GH3배지 5㎖을 가한 후 플레이트들은 37℃에서 6시간동안 항온배양시켰다. 이어서 세포들을 배지에 흡인시켜 쇼크시킨 후 15% 글리세롤을 함유한 신선한 형질 감염 완충액 5㎖을 3.5분에 걸쳐서 첨가하였다. 세포를 PBS로 2회 세정한 후 GH3배지 10㎖로 보충하였다. 48시간 동안 후-형질감염시킨 후 배지를 제거하고 400㎕/㎖ G418을 함유한 GH3배지 10㎖을 첨가하였다.
[전기천공법(Electroporation)]
전기천공법은 3.5㎜ 갭 전극을 가진 BTX300 트랜스펙터를 사용하여 수행하였다. 대수기(log phase)에서 성장하는 1 × 107GH7세포를 트립신화함으로써 이들의 플레이트로부터 제거한 후, 원심분리하여 팰릿화하고(pelleted), PBS로 1회 세척하였다. 세포들을 PBS 1.0㎖중에 현탁시킨 후 얼음상에서 초-자외선 처리가능한 2.9㎖ 큐벳(American Scientific Products 제품)으로 옮겼다. DNA 10㎕을 세포에 첨가하여 혼합한 후 다시 얼음상에 5분 동안 두었다. 5분후에 전극을 챔버안에 넣고 세포들을 200볼트 펄스 및 750 마이크로패러드로 셋팅시켜서 전기천공을 수행하였다. 큐벳을 얼음으로 10분동안 복귀시켰다. 세포들을 큐벳에서, 상온에서 15㎖ 원추형 튜브 안에 있는 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신을 함유한 9㎖의 GH3배지로, 옮긴 후 10분 동안 정치시켰다. 1 × 107세포의 전체 전기천공물을, 플레이트 당 약 3×106세포를 갖는 3개의 10㎝ 플레이트로 이동시켰다. 48시간 후, 400㎕/㎖ G418을 함유한 GH3배지를 첨가하였다.
[pRSVCATNEOTSHB3 - 5Xba I (Aat II 절단), pRSVCATNEOTSHB3 - 5Xba I (Apa I 절단) 및 pRSVCATNEO(Apa I 절단)으로 GH3세포의 형질감염하기]
pRSVCATNEOTSHB3 - 5Xba I (AatII 절단), pRSVCATNEOTSHB3 - 5Xba I (Aat I 절단) 및 pRSVCATNEO(Apa I 절단) 플라스미드들을, 인산칼슘 프로토콜 및 전기천공법 프로토콜을 사용하여 DNA가 없는 대조군과 함께 GH3세포내로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에 세포들을 G418 선별시켰다. 대략 14 내지 21일후에 콜로니들이 10㎝접시 상에 가시화되어 계수되었다. DNA가 없는 대조군 모두에서는 가시적인 콜로니가 없었는데 이는 G418 선별이 작용하였으며, RSV-NEO 영역을 함유하는 플라스미드의 존재가 G418 내성을 부여하는데 필요하다는 것을 입증한다. 이때에, 콜로니들을 선발하여 17㎜넓이의 클로닝링을 사용하여 10㎝접시 상에서 영역들을 단리함으로써 모았다. 이들 큰 클로닝 링들은 플레이트 당 콜로니의 밀도에 따라서 10 내지 70콜로니를 포함하였으며 그 단리된 영역에서 GH3세포를 제거되어 동시에 트립신화하여 모았다. 각각의 링에서 트립신화된 콜리니들을 6웰 플레이트로 옮기고 G418을 함유한 GH3배지에서 성장시켰다. 70% 내지 80%융합(confluence)에 이른 후, 80,000 콜로니들을 24웰 플레이트로 옮긴후 잔여 세포들은 후일에 더 시험하기 냉동보관시켰다. 24웰 플레이트에 있는 세포들을 50% 내지 80% 융합될 때까지 성장시켰다. 이어서 전체 RNA를 다음의 절차에 의해 이들 GH3세포로부터 수확하였다.
[24웰 플레이트에서 성장한 형질감염된 GH3세포로부터의 RNA단리]
다음의 것들은 콤친스키 및 사찌[Chomczynski and Sacchi, Anal. Bio chem., 162:156-159 (1987) 참조]에 의해 기술된 프로토콜을 변형시킨 것이다. 24웰 플레이트에 있는 GH3세포를 덮는 배지를 제거하고, 세포들을 PBS 1㎖로 세척하였다. GTC 용액 1㎖을 첨가하여 세포들을 실온에서 5분 동안 항온배양하였다. dH2O 293㎖안에 있는 구아니듐 티오시아네이트(Fluka) 250g을 용해시키고 이어서 0.75 M Na 시트레이트(pH 7.0) 17.6㎖ 및 10% 사르코실(L-라우릴 사르코실) 26.4㎖을 첨가함으로써 GTC용액을 제조하였다. 사용하기 바로 전에. GTC 용액 50㎖당 β-메르캅토에탄올 360㎕을 첨가하였다. 실온에서 5분 후에, GTC-세포 용해물 1㎖를 GCT 용액 2㎖을 함유한 Sarstedt 55.518 스냅-캡 튜브로 옮겼다. 각각의 튜브에 2M 아세테이트나트륨(pH4.0) 300㎕을 첨가한 후 튜브를 와동시켰다. 다음에, dH2O 포화된 페놀 3㎖을 첨가한 후 튜브를 재차 와동시켰다. 각각의 튜브에 클로로프롬:이소아밀 알콜(49:1) 600㎕을 첨가하고 튜브를 손으로 10초 동안 흔든 후 얼음에 15분 동안 두었다. 이어서 튜브를 Sorval RC-5B에서 SM24로터를 사용하여 4℃에서 20분 동안 8000 rpm으로 원심분리시켰다. 수용층을 이소프로판올 3㎖를 함유한 신선한 Sarstedt 튜브에 옮긴 후 -20℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 1시간 후에 튜브를 Sorval RC-5B에서 SM24로터를 사용하여 4℃에서 20분 동안 8000rpm으로 원심분리시켰다. 상층액을 제거한 후 펠릿을 GTC용액 500㎕중에 현탁시켰다. 현탁시킨 RNA를 1.5㎖ 에펜돌프 튜브로 옮기고 여기에 이소프로판올 500㎕을 첨가하였다. 이 튜브를 다시 한번 -20℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 에펜돌프 튜브를 소형원심분리기에서 5분동안 회전시킨 후 상층액을 버렸다. 펠릿을 70% 에탄올로 2회 세척한 후 에탄올이 완전히 증발할 때까지 건조시켰다. 펠릿을 디에틸 파이로카보네이트(depc)처리한 물에 현탁시키고 5분 동안 65℃까지 가열시켰다. 이어서 이 RNA를 후술하는 두절차 중 하나를 사용하여 cDNA를 형성시켰다.
[cDNA]
[방법 1]
10-20㎕의 반응 용적에서 전체 RNA 중 2.5 - 6.0㎕(약 0.5-6㎕)으로부터 제1가닥 cDNA를 합성하였다. 전체 RNA는 상기의 추출방법에 의해서 얻었으며, 70℃에서 5-10분 동안 변성시킨 후 반응 성분들을 첨가하기에 앞서 급냉시켰다. 반응조건은 50mM Tris-HCl(pH 8.3), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 각각의 dCTP, dATP, dGTP, 및 dTTP(Pharmacia사 제품) 0.5mM, 40mM CKl, 500단위/㎖ RNasin(Promega Biotech사 제품), 85㎕/㎖ 올리고(dT)12-18(Collaborative Research, Inc. 제품) 및 37℃에서 60분 동안 항온배양된 15,000 - 20,000 단위/㎖ 몰로니 쥐 백혈구 바이러스 역전사효소(Bethesda Research Lavoratories)이었다. EDTA를 40mM까지 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 0.3M 농도까지의 아세테이트나트륨 및 2 용적의 에탄올을 첨가하여 핵산을 침전시켰다. 0℃에서 30분 동안 침전물을 형성시킨 후, 소형 원심분리기에서 30분동안 14,000rpm으로 원심분리시킴으로서 펠릿화시켰다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 건조시킨 후 depc처리된 물 15-25㎕ 용적에 현탁시켰다.
[방법 2]
RNA로 부터 제1가닥의 cDNA를 합성하는 조건을, 문헌 Carol A, Brenner et al, BioTechniues, Vol. 7, No. 10, pp. 1096-1103 (1989)로부터 채택하였다. 상기 기재된 RNA 제조 과정으로부터의 전체 RNA의 1㎕을 0.5㎖ 에펜돌프 튜브에 있는 반응 완층액 9㎕에 첨가하였다. 반응완충액은 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소(MMLVRT Bethesda Research Labs 제품) 200 단위 및 최종 농도의 다음 시약들로 구성하였다: 70mM Tris-HCl(pH 8. 8), 40mM KCl, 0.1% Triton X-100, 각각의dNTP 1mM, 4mM MgCl2및 무작위 헥사머(Pharmcia) 0.45 OD260단위. 혼합시킨 후, 튜브를 실온에서 10분동안 항온배양한 후 이어서 42℃에서 1시간 동안 놓아두었다. 1시간 후 튜브를 90℃까지 1분 동안 가열하여 MMLVRT를 불활성화시킨 후 이어서 실온까지 냉각시켰다.
[GH3세포로부터 RNA의 폴리머라아제 사슬반응(PCR)증폭]
상동성 재조합에 의해 내인성 TSHβ 유전자를 활성화시키는 HR 플라스미드의 결과물로서, GH3세포에 의해 생성된 RNA 전자물로부터 합성된 TSHβ cDNA를 PCR에 의해 증폭시키는데 다음의 프라이머들을 사용하였다.
제14도는 각 프라이머에 대응하는 TSHβ 유전자의 영역들을 나타내고 있다.
[PCR 반응 조건]
모든 PCR 반응은 에리콤프 트윈블록 써모사이클러(Ericomp Twinblock thermocycler)에서 수행하였다. PCR 증폭을 방법 2에 의해 제조한 cDNA상에서 수행할 경우에는, 부가 반응 혼합물 40㎕을 cDNA 반응물 10㎕에 직접 첨가하여 전체 용적이 50㎕이 되게 하였다. 50㎕중의 시약의 최종농도는 70mM Tris-HCl(pH 8.8), 40mM KCl, 0.1% Triton X-100, Taq 폴리머라아제(Pharmacia) 2.25단위, 각 프라이머 0.2㎛, 각 dNTP 200㎛, 및 0.8 mM MgCl2이었다.
PCR을 상기 방법 1에 의해 제조한 cDNA상에서 수행할 경우에는, 현탁시킨 cDNA 5 내지 10㎕을 다음의 최종 농도를 함유한 40 내지 45㎕에 첨가하였다: 70mM Tris-HCl(pH 8. 8), 40mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.25단위의 Taq 폴리머라아제, 각 프라이머 0.2㎛, 각 dNTP 200㎛ 및 0.8mM MgCl2.
이어서 다음의 PCR 사이클 반응을 행하였다.
94℃에서 1분
55℃에서 30초
72℃에서 2분
상기 사이클을 30 내지 40회 반복하였다. 각 반응 혼합물 10㎕를 6%폴리아크릴아미드 겔 상에서 이동시킨 후, 적절히 스플라이스된 TSHβ에 대한 mRNA의 존재를 나타내는 247 염기쌍 PCR 단편의 존재를 스크리닝하였다.
[GH3세포로부터의 TSHβ RNA 및 쥐 뇌하수체 전체 RNA의 증폭에 대한 PCR결과]
GH3세포가 TSHβ RNA를 정상적으로 합성하는가를 결정하기 위하여, 비감염됨 GH3세포로부터의 cDNA 뿐만아니라 쥐의 뇌하수체로부터의 cDNA를 상기 PCR 증폭 조건하에 두었다. TSHβ mRNA의 존재를 나타내는 정확한 247 염기쌍의 밴드가, 쥐의 뇌하수체 시료의 양성 대조군에서는 나타났으나, 60사이클 후에도 GH3세포 전체 RNA 시료로 부터는 밴드가 가시화되지 않았다(데이타로 나타내지 않음).
[형질감염 결과]
10㎝ 접시에 존재한 G418 내성 콜로니의 수가 G418을 배지에 첨가한 후 14 내지 21일 사이에 표식화하였다.
전체 RNA를 상기한 바와 같이 24웰 플레이트 중에 포함된 콜로니 집단으로 부터 수확하였다. cDNA를 상기 RNA 제조물로 부터 제조하여 PCR증폭시켰다. TSHβ mRNA를 생산하는 양성 콜로니의 수는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 가시화되는 247 bp 단편의 존재로서 결정되었다. 스크리닝한 각각의 집단은 10 내지 70 콜로니를 함유하였다. 형질감염 당 각 집단(pool)에 대한 콜로니의 측정수가, TSHβ 유전자 전사가 활성화된 G418 내성 GH3세포 클론의 수를 계산하는데 사용되었다. 시험결과 집단이 양성인 경우, 이것은 상기 특정 집단에 존재하는 하나의 양성 클로니를 나타내는 것으로 추정되었다.
이들 결과에 통해 본 발명의 방법이 정상적으로는 전사되지 않는 TSHβ유전자를 성공적인 활성화시킬 수 있음을 입증한다. TSHβ전사에 대해 양성인 콜로니의 수가 G418내성인 콜로니의 수에 비하여 적으며(매 103G418 내성콜로니마다 약 1개), 이 결과는 다른 상동성 재조합 실험에 대하여 보고된 비율과 일반적으로 일치한다[Michael Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY (1990), pp. 56-60 참조]. 상동성 재조합율은 표적 유전자의 전사율에 비례하는 것으로 일반적으로 관찰되어 왔다[M. Frohman and G. Martin, Cell, 56:145 (1989); S.L. Mansour et al., Nature, 336:348 (1988) 참조]. 입증된 비율은 TSHβ유전자를 활성화시키는 무작위 돌연변이에 대해 예측되었던 것 보다 3제곱이 더 높다는 사실에 주목해야 한다.
각 콜로니 집단에 대한 결과가 재현 가능하고, RNA전사의 활성화가 안정되었다는 것을 확인하기 위하여, 첫번째 스크리닝 시험에서 양성반응의 집단에 대응하는, 전에 동결시켰던 콜로니 집단을 해동시켜 배양물에 펼쳤다. 새로이 해동된 GH3양성 집단을 T 25 조직 배양 플라스크에서 조직배양시킨 후 세포가 70% 내지 80% 융합에 도달할 때까지 팽창시켰다. 이어서 80,000 세포를 각 플라스크로부터 24웰 플레이트에 플레이팅시키고 이들이 50% 내지 80% 융합에 이를 때까지 성장시켰다. RNA를 세포로부터 추출하여 cDNA로 전환시킨 후, 6%폴리아크릴아미드 겔 상에 각각의 10㎕의 PCR 증폭반응을 수행시킴으로서 TSHβ RNA의 존재에 대해 재차 스크리닝하였다. 제15도는 에티듀 브로마이드 염색 및 형광에 의하여 폴리아크릴 아미드 겔 상에서 가시화된, 두번째 스크리닝으로부터의 대표적인 PCR반응의 결과를 나타낸다. 레인 1, 2 및 3은 pRSVCATNEO에 의해 형질감염된 GH3세포로부터의 cDNA 상에서 수행된 PCR 반응물을 함유한다. pRSVCATNEO는 TSHβ에 상동성이 있는 영역을 포함하지 않으며, 따라서 상동성 재조합에 의해 TSHβ 유전자를 활성화시킬 수 없다. 제15도의 겔상에서 알 수 있는 바와 같이, 이러한 레인에서 247bp에 해당하는 밴드가 보이지 않는데, 이는 TSHβ 유전자가 활성화되지 않았음을 의미한다. 레인 6은 또한 음성 대조군을 함유한다. 상기 레인에서는, pRSVCATNEOTSHB3-5Xba I(Apa I 절단)으로 형질감염되었으나 처음의 스크리닝에서 TSHβ유전자의 전사에 대해서는 음성인, GH3세포의 시료로부터 3개의 집단이 합쳐졌다. 레인 6에서 247bp 단편의 부재는, 게놈 내로 무작위적으로 통합된 형질감염된 pRSVCATNEOTSHB3-5Xba I (Apa I 절단) 플라스미드의 존재가 247 bp TSHβ PCR 단편을 생산할 수 없음을 입증한다. 레인 7, 8, 9 및 10은 각각 25ng, 200ng, 및 400ng 반응당 양으로 쥐 뇌하수체에서 수확한 전체 RNA로 부터 제조한 cDNA에서 수행된 PCR반응들을 포함한다. 정상적으로 TSHβ를 발현하는 쥐 조직으로부터 준비된 cDNA로부터 생산된, 예측된 247 bp 밴드가 이들 레인에 존재한다는 것은, PCR 반응 조건이 정확하게 최적화되었으며 양성의 상동성 재조합 TSHβ를 함유한 레인 4 및 5에서 얻은 PCR밴드가 정확한 크기임을 보여주는 것이었다. 첫번째 스크리닝에서 양성이었던 pRSVCATNEOTSH3-5Xba I (Apa I 절단)으로 형질전환된 두 집단인, 레인 4의 Apa I -107 및 레인 5의 Apa I -136을 TSHβ유전자 활성화에 대해 양성으로 재차 시험하여, 이들 집단의 전체 RNA로부터 제조된 cDNA로부터 증폭된 정확한 TSHβ PCR밴드의 존재에 의해 입증된 바와 같이, TSHβ유전자의 전사가 안정되게 활성화되었음을 증명하였다. 전에 양성반응을 보인 Apa I -107 및 Apa I -136의 RNA를 함유한 레인 4 및 5에서 247 bp 밴드가 존재하는 것과, 그리고 레인 1-3에서 pRSVCATNEO 형질감염된 GH3세포의 음성대조군과 레인 6에서 음성반응인 pRSVCATNEOTSHB3-5Xba I (APA I 절단)에서 상기 밴드가 존재하지 않는다는 것은, 정상적으로는 TSHβ RNA를 생산하지 않는 세포주에서 TSHβ RNA의 생산이 상동성 재조합에 의해 안정되게 개시되었음을 입증한다.
본 발명은 본원에서 기술된 세포주에 제한되지 않는다. 모든 세포주는 정상적으로는 전사되지 않거나 또는 불활성인 유전정보를 지니고 있다. 대부분의 세포주는 특정 유전자만을 발현할 수 있다. 그러나, 정상적으로는 전사되지 않거나 또는 불활성인, 임의의 상기 세포주의 유전자가 본 발명에 의해 그 유전자 산물을 발현하도록 활성화될 수 있으며, 게놈의 임의의 유전자는 본 발명에 따라서 변형된 발현특성을 지닐 수도 있다. 이전에 형질전환된 세포주 조차도 이전의 형질전환이 관심있는 유전자를 파괴시키지 않는 한 사용될 수 있다. 세포주의 출처는 중요하지 않다. 세포주는 동물 또는 식물, 일차적, 연속적 또는 영구적인 것일 수 있다. 물론, 그러한 세포주가 안정되고 영속적이어서, 본 발명에 따른 기법으로 처리된 후에 발현이 상업화될 수 있는 것이 바람직하다. 원핵이건 진핵이건간에 클로닝된 미생물도 역시 본 발명의 기법으로 처리할 수 있다.
한편 본 발명은 정상적으로는 전사되지 않거나 또는 불활성인 유전자의 발현에 대하여 바람직하게 기술되어 있으나, 본 발명의 기법은 숙주 세포주에서 천연적으로 발현되는 유전자의 발현 특성을 변형시키는 것에도 적용될 수 있다. 예컨대, 유전자의 발현을 배양조건이나 그 유사한 것에 따라 의지하는 대로 개시 또는 중단시키기를 바란다면, 조절가능한 프로모터와 같은 적절한 DNA 조절 단편을 삽입시키므로서 억제 가능성 또는 유도 가능성과 같은 특성을 부여할 수 있다. 예컨대, 에스트로겐, 테스토스테론 또는 글루코코티코이드와 같은 핵 스테로이드 수용체 또는 티록신 수용체를 특정 세포형이 함유한다고 알려져 있다면, 스테로이드 또는 티록신 반응성 요소들을 영역 F로 사용할 수 있다. 이러한 반응성 요소는 전사에 대해 양성 반응을 보이는 상기 수용체에 결합하는 임의의 DNA이다. 예컨대, 세포가 자연적으로는 글루코코티코이드에 반응성이 없을지라도, 글루코코티코이드 수용체를 암호화하는 DNA 조각을 구조물에 첨가하거나 또는 그렇지않다면 게놈의 어딘가에 삽입하여, 상기 세포가 글루코코티코이드에 반응하도록 만들수 있다. 관심있는 유전자가 정상적으로는 전사될 수 있는지 여부에 상관없이, 조절성 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 적절한 DNA 조절 단편을 관심있는 정확한 위치에 표적화시킴으로서 다른 종류의 조절도 얻어질 수 있다.
따라서, 정상적으로는 전사되지 않는 유전자의 발현을 자극하는 것이 본 발명의 바람직한 응용이나, 보다 넓은 의미에서 본 발명은 숙주 세포주에 내재하는 임의의 유전자의 발현 특성을 변경시키는데도 적용될 수 있다.
상동성 재조합의 특수한 기법은 그 자체로는 본 발명의 새로운 부분은 아니다. 그러한 기법은 공지되어 있으며, DNA조절 서열을 관심있는 유전자에 대하여 바람직한 위치에 표적화시킬 수 있는 한, 당업계에서 통상의 기술을 가진자들은 임의의 상기 기법들을 본 발명에 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 삽입되는 서열들의 어느 한 말단에 상동성 영역을 갖는 선형화된 구조물을 사용한 바람직한 기법을 개시하였으나, 상기 기능을 수행할 수 있는 임의의 다른 기법도, 예를들면, 환상의 구조물을 사용함으로써, 역시 본 발명에 의해 이해되는 것으로 의도된다. 본 발명의 중요한 점은, 세포주의 게놈에 있는 유전자, 바람직하게는 정상적으로는 전사되지 않는 유전자에 작동가능하게 연결되어, 사용되는 세포주 또는 미생물에서 발현 특성의 변형을 유발할 수 있는 DNA 조절 서열을 삽입하기 위해, 또는 세포주의 게놈에 있으면서 이미 전사되고 있는 유전자를 증폭 서열의 증폭시에 증폭을 유발하도록 상기 유전자에 충분히 근접하도록, 조절서열을 사용하지 않고, 증폭 서열을 삽입하기 위해, 상동성 재조합 기법을 사용한다는 점이다. 선별 마커를 함유시키는 것이 절대적으로 필요한 것은 아니다. 선별은 DNA 구조물의 삽입후 배지 또는 세포에서 관심있는 유전자 산물 또는 mRNA의 탐지에만 사용할 수 있다. 게다가, 조절 서열을 삽입시키는 실시예에 있어서, 원하는 경우 증폭은 바람직하기는 하지만 작동성에는 중요하지 않다. 스크리닝을 더 용이하게 하는 음성 선별 마커에 대해서도 마찬가지이나, 본 발명의 성공 여부에는 중요하지 않다. 따라서, 근본적인 실시예에서는 DNA 조절 단편 또는 증폭용 단편을 목적하는 특수한 위치에 삽입시키는 것만이 필요하다. 그러나, 선별 기법에 사용하기 위하여 양성 및/또는 음성 선별 마커 유전자를 첨가하는 것이 바람직하며, 조절단편이 첨가되는 실시예에서 증폭 유전자를 첨가하는 것도 바람직하다.
본 명세서 및 특허청구의 범위 전반에 걸쳐서 사용된 발현의 변형은, 상동성 재조합을 통해 돌연변이, 결실, 정지 코돈, 또는 전체 유전자를 포함한 다른 뉴클레오티드 서열을 관심있는 유전자에 삽입시킴으로써, 관심있는 산물의 발현을 방해하는 발현의 종결을 제외한 것으로 정의한다. 선행기술은 특정 돌연변이를 삽입시키는데 상동성 재조합의 사용을 교시하고 있으며, 세포 산물의 발현은 이 방법에 의해 본질적으로 종결될 수도 있다[예컨대, Schwartzberg et al, PNAS(USA), 87:3210-3214(1990) 참조]. 본 발명은 이러한 절차는 포괄하려고 의도하는 것은 아니다. 본 발명에 있어서 발현의 변형은 상동성 재조합에 의해 원하는 특정의 위치에 조절 및/또는 증폭영역을 삽입하므로서 수행된다. 바람직한 변형은 관심있는 산물의 발현을 활성화시키거나 증대시키는 것이다.
본 명세서에서 DNA 조절 단편을 유전자에 작동가능하게 연결시킨다는 문구는, 관심있는 유전자의 전사가 DNA 조절단편에 의해 조절되도록 상기 유전자에 대하여 DNA 조절단편이 배치되는 것을 의미한다. 이 조절단편은 유전자의 상류단에 있는 것이 바람직하나 이것이 어떠한 방식으로도 유전자의 발현을 조절하도록 작동하는 한 유전자의 하류단이나 그 내부에 존재해도 좋다. DNA조절단편은 프로모터, 터미네이터, 오퍼레이터, 인헨서, 사일렌서, 어테뉴에이터 등 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서 및 특허청구의 범위에서 사용되는 상류단 또는 하류단은, 관심있는 유전자의 암호화 가닥(coding strand)에 대하여 각각 5' - 방향 또는 3' - 방향을 의미한다.
상기 구체적인 실시예의 기재는 다른 사람이 포괄적인 개념을 벗어남이 없이도 다양한 응용을 위해 구체적인 실시예를 용이하게 변형시키거나 채택할 수 있도록 본 발명의 일반적인 본질을 충분히 개시한다. 임의의 그러한 채택 및 변형은 기재된 실시예의 균등물의 의미 및 범위내에 포함되도록 의도하였다. 본 명세서에서 사용된 문구 및 용어는 기재의 목적으로 사용된 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다.

Claims (29)

  1. 세포주(cell line)의 게놈 안에 있는 유전자의 발현 특성(expression characteristics)을 활성화 또는 그렇지 않으면 변형(modifying)시키는 방법에 있어서, 상기 유전자가 정상적으로는 전사되지 않는 유전자(transcriptionally silent gene)인 경우에는 상기 유전자의 유전자 산물을 상기 세포주가 발현할 수 있게 하거나, 상기 유전자가 내재적으로 활성(endogenouly active)인 경우에는 상기 유전자의 발현 특성을 상기 세포주가 변형시킬 수 있도록 하기 위해, 상동성 재조합(homologous recombination)을 통해 DNA 구조물(DNA construct)을 상기 게놈안으로 삽입시키는 단계를 포함하되, 상기 DNA 구조물은, 상기 유전자에 작동가능하게 연결되는(operatively linked) 경우, 상기 유전자의 발현을 자극할 수 있거나 그렇지 않다면 상기 유전자의 발현 특성을 변형시킬 수 있는 DNA 조절 단편(DNA regulatory segment) 및/또는 상기 유전자에 충분히 근접하게 삽입되는 경우, 상기 유전자를 증폭(amplify)시킬 수 있는 발현가능한 증폭 유전자(an expressible, amplifiable gene) 및, 상기 유전자의 내부 또는 근처에 있는 상기 게놈의 영역(region)과 상동성이 있는 DNA 표적 단편(DNA targeting segment)을 포함하는 것으로서, 상기 조절 단편이 관심있는 상기 유전자에 작동가능하도록 연결되도록 또는 상기 증폭 유전자가 관심있는 상기 유전자에 충분히 근접하여 상기 증폭 유전자가 증폭될 때 상기 유전자의 증폭을 야기시키도록 상기 구조물을 삽입시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포주의 게놈 안에 있는 것으로서 정상적으로는 전사되지 않는 유전자를 활성화하여 상기 세포주가 상기 유전자의 유전자 산물을 발현하도록 하는 방법으로, 상동성 재조합을 통해 DNA 구조물을 상기 게놈안으로 삽입시키는 단계를 포함하되, 상기 DNA 구조물은 상기 유전자에 작동가능하게 연결되는 경우 상기 유전자의 발현을 자극할 수 있는 DNA 조절 단편 및 상기 유전자의 내부 또는 근처에 있는 상기 게놈의 영역과 상동성이 있는 DNA 표적 단편을 포함하는 것으로서, 상기 DNA 조절 단편이 관심있는 상기 유전자에 작동가능하게 연결되도록 상기 구조물을 삽입시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포주의 게놈 안에 있는 유전자의 발현 특성을 변형시키는 방법으로, 상동성 재조합을 통해 DNA 구조물을 상기 게놈안으로 삽입시키는 단계를 포함하되, 상기 DNA 구조물은 상기 유전자의 현존하는 DNA 조절 단편과 비교해 볼 때, 상기 유전자에 작동가능하게 연결되는 경우 상기 유전자의 발현 특성을 변형시킬 수 있는 DNA 조절 단편 및 상기 유전자의 내부 또는 근처에 있는 상기 게놈의 영역과 상동성이 있는 DNA 표적 단편을 포함하는 것으로서, 상기 DNA 조절 단편이 관심있는 상기 유전자에 작동가능하게 연결되도록 상기 구조물을 삽입시키는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 세포주의 게놈 안에 있는 유전자의 발현 특성을 변형시키는 방법으로, 상동성 재조합을 통해 DNA 구조물을 상기 게놈안으로 삽입시키는 단계를 포함하되, 상기 DNA 구조물은 상기 유전자에 충분히 근접하게 삽입되는 경우, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 발현가능한 증폭 유전자 및 상기 유전자의 내부 또는 근처에 있는 상기 게놈의 영역과 상동성이 있는 DNA 표적 단편을 포함하는 것으로서, 상기 증폭 유전자가 관심있는 상기 유전자에 충분히 근접하여 상기 증폭 유전자가 증폭될 때 상기 유전자의 증폭을 야기시키도록 상기 구조물을 삽입시키는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 DNA 구조물은, 상기 발현가능한 증폭유전자와 함께 삽입되도록 배열된 적어도 하나의 발현가능한 선별 마커 유전자(selectable marker gent)을 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 DNA 구조물은 두 개의 DNA 표적 단편을 포함하되, 상기 DNA 표적 단편 각각은 상기 유전자의 내부 또는 근처에 있는 상기 게놈의 영역과 상동성이 있으며, 상기 DNA 표적 단편중 하나는 상기 DNA 조절 단편의 상류단(upstream)에 위치하고 상기 DNA 표적 단편중 다른 하나는 상기 DNA 조절 단편의 하류단(downstream)에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 DNA 구조물은, 상기 DNA 조절 단편과 함께 삽입되도록 배열된 적어도 하나의 발현가능한 선별 마커 유전자를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 DNA 구조물은, 상동성 재조합을 통해 상기 DNA 구조물이 적당하게 삽입되는 경우, 삽입되지 않도록 배치되는 음성 선별 마커 유전자(negative selectable marker gene)를 부가적으로 포함하되, 음성 선별 마커 유전자는 상기 DNA 구조물이 적당하게 삽입된 세포에서는 발현되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 DNA 구조물은 상기 DNA 조절 단편과 함께 삽입되도록 배치된 발현가능한 증폭 유전자를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 세포주는 진핵생물 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포주는 동물 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 세포주는 포유동물 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 세포주는 식물 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 유전자 산물의 발현을 야기시키기 위해 상기 삽입단계후에, 상기 선별 마커 유전자의 산물을 발현하는 상기 세포주의 클론을 선별하는 단계, 상기 유전자 산물의 발현을 충분히 할 수 있는 조건하에서 선별된 클론들을 배양하는 단계 및, 상기 유전자 산물을 수집하는 단계를 더 부가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 선별 마커 유전자는 네오마이신 내성 유전자(neomycin resistance gene)이고, 상기 선별단계는 네오마이신 내성을 갖는 클론들을 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 DNA 구조물은, 상동성 재조합을 통해 상기 DNA 구조물이 적당하게 삽입되는 경우, 삽입되지 않도록 배치되는, 상기 DNA 표적 단편에 대한 음성 선별 마커 유전자를 부가적으로 포함하되, 상기 음성 선별 마커는, 상기 DNA 구조물이 적당하게 삽입된 세포들에서 발현되지 않고, 상기 선별단계는 상기 음성 선별 마커 유전자를 발현하지 않는 클론들을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 음성 선별 마커 유전자는 단순포진 바이러스 티미딘 키나아제 유전자(Herpes Simplex Virus thymidine kinase gene)이고, 상기 선별단계는, 상기 유전자를 발현하는 세포를 치사시키는 배지에 노출시켰을 때, 생존하는 클론들을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 세포주의 게놈에 있어서, 상기 게놈은, 예정된 DNA 서열에 의해 특징지워진 삽입 위치(insertion site)에서 자연적으로 존재하는 유전자에 작동가능하게 연결된 DNA 조절 단편을 가지되, 상기 DNA 조절 단편은 게놈의 상기 위치에 자연적으로는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 세포주의 게놈.
  19. 세포주에 있어서, 상기 세포주는 상기 세포주의 게놈 내부에 있으면서 정상적으로는 전사되지 않는 유전자에 의한 유전자 산물을 발현할 수 있거나, 또는 상기 세포주는 그것이 유래한 세포주와 비교하면 유전자 산물의 증대된 발현을 나타낼 수 있되, 상기 유전자 산물은 상기 세포의 게놈내부에 있는 내인성 유전자(endogenous gene)의 발현산물이고, 상기 게놈은, 1) 상기 세포주에 의해 유전자 산물의 발현을 촉진(promoting)할 수 있는 DNA 조절 단편이 그 안에 삽입되었거나 2) 상기 세포주에 의해 상기 유전자 산물의 발현을 증대시킬 수 있는, 외인성(exogenous) DNA 조절 단편 및/또는 증폭 유전자가, 상기 내인성 유전자에 또는 그 근처에서, 작동가능한 방법으로 게놈안에 삽입된 것을 특징으로 하는 세포주.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포주는 세포주의 게놈 내부에 있으면서 정상적으로는 전사되지 않는 유전자 산물을 발현할 수 있되, 상기 게놈은, 정상적으로는 전사되지 않는 상기 유전자에 작동가능하게 연결되게 DNA 조절부위가 그 안에 삽입된 것으로서, 상기 DNA 조절 단편은 상기 세포주에 의해 유전자 산물의 발현을 촉진할 수 있는 것을 특징으로 하는 세포주.
  21. 제19항에 있어서, 상기 세포주는 그것이 유래한 세포주와 비교하면 유전자 산물의 발현을 증대할 수 있되, 상기 유전자 산물은 상기 세포의 게놈 내부에 있는 내인성 유전자의 발현산물이고, 상기 게놈은, 상기 세포주에 의해 상기 유전자 산물의 발현을 증대시킬 수 있는, 외인성 DNA 조절 단편 및/또는 증폭 유전자가, 상기 내인성 유전자에 또는 그 근처에서, 작동가능한 방법으로 게놈안에 삽입된 것을 특징으로 하는 세포주.
  22. 제21항에 있어서, 상기 외인성 DNA 조절 단편 및/또는 증폭 유전자는 외인성 DNA 조절 단편인 것을 특징으로 하는 세포주.
  23. 제21항에 있어서, 상기 외인성 DNA 조절 단편 및/또는 증폭 유전자는 외인성 DNA 증폭 유전자인 것을 특징으로 하는 세포주.
  24. 제20항 또는 제22항에 있어서, 상기 DNA 조절 단편은 상기 세포주 또는 미생물에 의해 정상적으로 발현되는 유전자 산물의 발현을 촉진시킬 수 있는 것임을 특징으로 하는 세포주.
  25. 제24항에 있어서, 삽입된 DNA 조절 단편은, 상기 DNA 조절 단편 및 적어도 하나의 선별 마커 유전자를 포함하는 DNA 구조물의 일부인 것임을 특징으로 하는 세포주.
  26. 제25항에 있어서, 상기 DNA 구조물은 부가적으로 증폭 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주.
  27. 세포주로부터 유전자 산물을 수득하는 방법에 있어서, 상기 유전자 산물을 발현할 수 있게 하는 조건하에서 제19항 내지 제23항 중 임의의 한 항에 따른 분화된 세포주를 배양하는 단계 및 상기 유전자 산물을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 예정된 숙주 세포주안으로 삽입시키기 위한 DNA 구조물에 있어서, 작동가능하게 연결될 경우 숙주 세포주에서 유전자들의 발현 특성을 변형할 수 있는 DNA 조절 단편 및 숙주 세포주 안에서 미리 선별된 유전자의 게놈 영역과 상동성이 있는 DNA 표적 단편을 포함하는 DNA 구조물.
  29. 예정된 숙주 세포주안으로 삽입시키기 위한 DNA 구조물에 있어서, 충분히 근접하게 연결될 경우 숙주 세포주에 있는 유전자를 증폭시킬 수 있는 발현가능한 증폭 유전자 및, 숙주 세포주 안에서 미리 선별된 유전자의 게놈 영역과 상동성이 있는 DNA 표적 단편을 포함하는 DNA 구조물.
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