JP2002533693A

JP2002533693A - 苦味応答のインヒビター

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Publication number: JP2002533693A
Application number: JP2000590498A
Authority: JP
Inventors: マルゴルスキー，ロバート，エフ．; ミン，ディン
Original assignee: マウントシナイスクールオブメディシンオブニューヨークユニバーシティー
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2002-10-08
Also published as: WO2000038536A2; CA2356533A1; WO2000038536A3; EP1139793A2; USRE40594E1; PT1139793E; AU2378600A; ATE445335T1; US6540978B1; DK1139793T3; CA2356533C; ES2337322T3; DE69941544D1; EP1139793B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、苦味応答のインヒビターを同定する方法、およびそのようなインヒビターを用いる方法により苦味の知覚を阻止し、および/または甘味の知覚を増大することに関する。本発明のインヒビターは、食品および医薬品の風味向上剤として使用されうる。さらに、本発明の方法を用いて、新規の味覚物質の味覚知覚を特徴づけることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】１. 緒言本発明は、苦味応答のインヒビターを同定する方法、およびそのようなインヒ
ビターを用いる方法により苦味の知覚を阻止し、および/または甘味の知覚を増
大することに関する。本発明のインヒビターは、食品および医薬品の風味向上剤
として使用されうる。さらに、本発明の方法を用いて、新規の味覚物質の味覚知
覚を特徴づけることができる。

【０００２】２. 発明の背景味覚は、意味深い生物学的な重要性を有している。味覚は単に人類にとって料
理を楽しいものとするだけではなく、より広範にわたるさまざまな事象が味覚に
より派生する。味覚は、さまざまな生物学的な信号をヒトおよび他の動物にもた
らし、汚染されたまたは腐った食品の特定、および、カロリーまたは栄養価に応
じているであろう快楽応答をもたらす。

【０００３】一般に、基本的な味のカテゴリーは４種または５種だけであると考えられてい
る。即ち、甘味、酸っぱさ、苦味、酸味、および「旨み」（グルタミン酸一ナト
リウムの味を日本語で表現したもの；Herness M.S. および Gilbertson, T.A.,
1999, Annu. Rev. Physiol. 61:873-900)である。これらは、栄養素を含む食品
と関連している、塩辛さ、甘さおよび旨みなどの食欲をそそる味、および、毒性
成分により誘発される苦味および酸っぱさにさらに分類できる。後述の２つは嫌
悪反応を起こし、それにより、健康に悪い、または危険な食品を摂取する意欲を
失わせることにより生物体を保護する。苦味と結びつく望ましくない成分は、カ
フェイン、ストリキニーネおよびキニーネなど植物アルカロイド、シアン化物、
並びに尿素などの代謝老廃産物である（Lindemann, B., 1996, Physiol. Rev.76
: 719-766)。最近、最も熱量の濃度が高い栄養素である脂肪は、味覚の信号を有
しているのではないかと提唱されている(Gilbertson T.A.ら、1997、Am. J. Phi
siol、272:C1203-1210、およびGilbertson, T.A., 1998, Curr. Opin. Neurobio
l. 8:447-452を引用)。

【０００４】味覚の最初の事象の解剖学的な基礎は、味覚受容細胞(「TRC」)であり、これ
は、「味蕾芽」と呼ばれる塊の中に位置している（Lindemann、前述）。味蕾芽
は、舌並びに唇舌以外を含む口腔内全体に分布している(ＨermessおよびGilbert
son参照）。ヒトの舌では、味蕾芽は、特有の３種類の独特の構造、即ち、茸状
乳頭、葉状乳頭、および有郭乳頭として組織されている。それぞれの味蕾芽は、
直径２０〜４０マイクロンの塊の中に集まった約５０〜１００個の細胞を含む。
神経繊維が、味覚芽の基底部から侵入し、いくつかの味覚受容細胞の上にシナプ
ス形成している。典型的には、１つのTRCは複数の感覚神経繊維に接しており、
各感覚神経繊維は、同一の味蕾芽内にある複数のTRCを支配している。

【０００５】被験者が味覚物質を摂取し、その味覚物質が適切な濃度で味覚受容細胞と出会
うと、活動電位が生まれ、一次感覚神経につながるシナプスを通り、受容体によ
り記録されたシグナルを求心性神経を介して脳の感覚皮質の適当な領域に伝達し
、その結果、被験者に特定の味覚の知覚がもたらされる。高価な食品は、中脳の
ドーパミン作動性ニューロンの活性化（Lindemann、上述、そこに引用されてい
るMirenovicz., Ｊ.,およびSchultz, W, 1996, Nature (London ) 379:449-451)
および、内因性オピエートの放出（Lindemann、上述、そこに引用されている、D
renowski, A.ら、1992、Phisiol. Behav. 51: 371-379; Dum, J. ら、1983、Pha
rmacol. Biochem. Bhav. 18:443-447)を含む快楽応答を増大させうる。

【０００６】多くの研究が味覚生理学の解明を目指してきた。全てではなくとも大部分の脊
椎動物のTRCは、電位作動性のナトリウムイオンチャネル、カリウムイオンチャ
ネル、およびカルシウムイオンチャネルを有しており、これらは、神経の該イオ
ンチャネルと同じ性質を有する(Kinnamon, S.C.およびMargolskee, R. F., 1996
, Curr.Opin. Neurobiol. 6:506-513)。異なるタイプの一次味覚は、異なるタイ
プの伝達機構を利用することが分かっており、あるタイプの味覚は、種における
さまざまな栄養素の欲求を反映する、多様な機構を利用しうる（Kinnamon およ
びMargolskee, 上述）。例えば、酸味は、ハムスターでは、アミロライド感受性
ナトリウムイオンチャネルを介する水素イオンの流入に関与し（上述、そこに引
用しているGilbertson, T.A.ら、1993、Neuron 10: 931-942)、ホライモリにお
いては、舌先の細胞膜でのカリウムイオンチャネルの水素イオンブロックが関与
している（KinnamonおよびMargolskee、前述、そこに引用している、KinnamonS.
C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7023-7027)。塩辛いという味覚は、
典型的にはアミロライド感受性ナトリウムチャネルを介してナトリウムイオンが
浸透することにより伝達される。

【０００７】甘味は、味覚物質が天然のものであるか、または人工甘味料であるかに応じて
異なる、２次メッセンジャー系と関連している。前者はcAMPを用い、後者はイノ
シトール三リン酸（IP₃； Herness M.S. およびGilbertson, T.A., 1999, Annu.
Rev. Physiol. 61:873-900)を用いると考えられてきた。G_sおよびアデニル酸シ
クラーゼに関係しているような膜結合型受容体が甘味の知覚に関与しているであ
ろうことが示されている（上述)。

【０００８】苦味の知覚にも、cAMPおよびIP₃が関与していると考えられている(Kinnamonお
よびMargolskee、前述)。苦味成分であるデナトニウム (denatonium)は、ラット
のTRCからカルシウムイオンが放出され、齧歯動物の味覚組織においてIP₃レベル
が急激に上昇をもたらす(上述、そこに引用されている、Berhards、SJ.ら、1996
、J. Physiol. (London) 490:325-336、および、Akabas, M.H.ら、1988、Scienc
e 242:1047-1050)。デナトニウムは細胞膜を通過できないので、Ｇタンパク質共
役型受容体を活性化し、その際、αおよび/またはβγＧタンパク質サブユニッ
トがホスホリパーゼＣを活性化し、IP₃の産生およびカルシウムイオンの放出が
誘導されると考えられてきた（KinnamonおよびMargolskee、前述）。

【０００９】近年、網膜のＧタンパク質であるトランデューシンと相同性のある「ガストデ
ューシン」と呼ばれる味覚特異的Ｇタンパク質がクローニングされ、特性解析さ
れた（上述、そこに引用されているMcLaughlin, S. ら、1992, Nature (London)
357: 563-569)。αガストデューシン遺伝子がノックアウトされたマウスは、特
定の苦味（および特定の甘味）味覚物質に対する応答が減縮しており、ガストデ
ューシンはTRC IP₃応答を制御していることが示唆された（KinnamonおよびMargo
lskee、そこに引用されているWong, G. T. ら、1996、Nature (London) 381:796
-800)。野生型のラットαガストデューシンをコードするcDNAを、αガストデュ
ーシンの無いマウスに導入すると、苦味および甘味成分に対する応答性が回復し
た（Ming, D. ら、1998, Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8933-8938, そこに
引用しているWong、G.T.ら、1996、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 61
:173-184)。ガストデューシンのγサブユニット(γ₁₃）は、苦味成分であるデナ
トニウムに応答してホスホリパーゼＣの活性化を媒介することが近年示された（
Huang, L. ら、1999、Nature Neurosci. 2: 1055-1062）。

【００１０】桿状および錐状トランスデューシンは、脊椎動物の網膜の光受容細胞のみに特
異的に存在するＧタンパク質と考えられてきたが（Lochrie, M.A.ら、1985、Sci
ence 228: 96-99; Medynsk,D.C.ら、1985、Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4
133-4315; Tanabe, T. ら、1985、Nature (London) 315: 242-245; Yatsunami K
. およびKhorana、H.G.、1985、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 4316-4320
)、桿状トランスデューシンは脊椎動物の味覚細胞にも存在し、味覚組織から単
離されたホスホジエステラーゼを特異的に活性化することが見い出された(Ruiz-
Avila, L. ら、1995、Nature (London) 376: 80-85)。トリプシン感受性アッセ
イを用いて、苦味成分デナトニウムは、味覚細胞の細胞膜の存在下で、トランス
デューシンを活性化するがＧタンパク質Ｇ_iは活性化しないことが示された(上述
)。この活性化は、ロドプシン-トランスデューシン相互作用を競合的に阻害する
トランスデューシンのＣ末端領域に由来するペプチドにより阻害できた(上述、
およびHamm,H.E.ら、1988、Science 241:832-8359)。Ruiz-Avilaら(前述)は、ト
ランスデューシンは、視覚知覚の際に起こるのと同様の経路を介して苦味伝達に
関与し、即ち、刺激を受けた苦味レセプターは味覚細胞トランスデューシンを活
性化でき、それによりさらにホスホジエステラーゼが活性化する。活性化された
ホスホジエステラーゼは、その後、細胞内の3',5'-環状ヌクレオチドのレベルを
減らし、その結果、「環状ヌクレオチオ抑制性伝導」と呼ばれる機構により、環
状ヌクレオチドのレベルが下がることでTRCの脱分極が起こりうる(上述、ここで
引用されている、Kolesnikov, S.およびMargolskee, R.F., 1995, Nature(Londo
n) 376:85-88)。

【００１１】より最近になって、Ming, D.ら、1998, Proc.Natl. Acad. Sci.U.S.A. 95:893
3-8938において、ガストデューシンおよびトランスデューシンの双方は、ウシ味
覚細胞の細胞膜の存在下で、デナトニウム、キニーネ、およびストリキニーネを
含む多くの苦味成分により特異的に活性化されることが報告された。この活性化
は、ガストデューシンのＣ末端との相互作用に依存し、かつ、Ｇタンパク質βγ
サブユニットの存在を必要とし、そして、ロドプシンとトランスデューシンが相
互作用する部位に由来するペプチドにより競合的に阻害されうることが分かった
。

【００１２】３. 発明の概要本発明は苦味の感覚的知覚を阻害する化合物を同定する方法に関する。このこ
とは、少なくともその一部は、苦味物質刺激を受けた味覚レセプターによるトラ
ンスデューシンの活性化を阻害するアデノシン一リン酸(AMP)およびそれに関連
する化合物が、上記味覚物質による神経刺激を減少させ、そして、苦味知覚が大
幅に低減したことを示す反応応答をもたらしたという知見に基づく。

【００１３】本発明のインヒビターを用いて苦味物質の苦味の知覚を減少または排除するこ
ともでき、その能力により該インヒビターを「苦味インヒビター」と称する。関
連する実施形態おいて、本発明は、１種以上の苦味インヒビターを同時に投与す
ることにより味覚物質に関連する苦味知覚を減少させる方法を提供し、また、苦
味物質および苦味インヒビターを含む組成物を提供する。

【００１４】本発明のインヒビターはまた、他の味覚物質が存在または不存在の場合におい
ても、甘味知覚を伝達しうることも分かっており、この能力により、該インヒビ
ターを「インヒビター甘味料」と称する。様々な実施形態において、本発明は、
インヒビター甘味料を被験者に投与した場合に甘味知覚を生み出す方法を提供し
、また、インヒビター甘味料を含む組成物も提供する。

【００１５】本発明のインヒビターを用いて、苦味の特徴を減少または除去することにより
、食品、飲料、および医薬品の風味を向上することができる。食品を摂取する者
の満足感を増加させることに加えて、本発明インヒビターは、保存期間または栄
養価を増大させる苦味物質を食品および医薬品に組み込むことを可能にする。本
発明のインヒビターは、ヒトまたは家畜の食物摂取を増加させうる。さらに、本
発明のインヒビターは、苦い組成物を含む医学的処方をより口当たりよくし、特
に子供に投与する際には、苦味物質を含む薬剤の処方における順応性を向上させ
る。

【００１６】さらなる実施形態においては、本発明は、既知の苦味成分と同様の味覚応答を
誘発する苦味物質を同定する、および/またはこれを特性解析する方法を提供す
る。このような方法で同定された非毒性の苦味成分は、所望の嫌悪応答を刺激す
る添加剤として用いることができ、即ち、例えば、子供または動物がこれらの成
分を含む組成物を摂取する意欲を低減させることができる。

【００１７】４. 図面の簡単な説明図面の簡単な説明については、後述する。

【００１８】５. 本発明の説明説明を明確化するために、しかし限定するものとしてではなく、本発明の詳細
な説明を下記のサブセクションに分ける： (a) インヒビターを同定する方法； (b) インヒビターを含有する組成物およびその使用；ならびに (c) 苦味物質の同定。

【００１９】５．１．インヒビターを同定する方法本発明は、苦味のインヒビターを同定する方法を提供するが、その方法は(i)
トランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択したGタンパク
質を有する味覚レセプターを、苦味物質によるGタンパク質の活性化に適した条
件下で苦味物質と接触させ、Gタンパク質の活性化レベルを測定すること；(ii)
別の実験において、トランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から
選択したGタンパク質を有する味覚レセプター、苦味物質、および試験インヒビ
ターとを接触させ、Gタンパク質の活性化レベルを測定すること、その際Gタンパ
ク質は(i)で用いたものと同じものを用い、実験条件は本質的に(i)と同じものと
し；次いで(iii)上記の(i)で測定したGタンパク質の活性化レベルを(ii)で測定
したGタンパク質の活性化レベルと比較すること、その際、試験インヒビターの
存在下での活性化Gタンパク質のレベルがより低ければ、そのことは味覚物質に
よって誘発される苦味の知覚を阻害する試験インヒビターの能力と正の相関を有
する。

【００２０】前述の方法はin vivoもしくはin vitroで実施することができる。

【００２１】味覚レセプターとGタンパク質は同種もしくは異種の動物に由来してよい。好
ましいが非限定的な実施形態においては、味覚レセプターおよびGタンパク質は
哺乳動物由来のものである。

【００２２】本明細書で用いている「味覚レセプター」という用語は味覚受容細胞の膜にあ
り、苦味もしくは甘味物質に対する応答の伝達に作用する分子もしくは分子複合
体として定義される。味覚レセプターは生細胞中にあるもの、または細胞もしく
は組織抽出物の一部であってもよく、他の膜もしくは組織エレメントから必ずし
も単離されている必要はない。特定の非限定的実施形態においては、味覚レセプ
ターは例えば下記および第6節に記載の味覚受容細胞から由来する膜調製物中に
ある。味覚レセプターは天然のタンパク質もしくは遺伝子組換えクローンから再
構成されたものでよい。

【００２３】「トランスデューシン」とは、例えば、Ming, D.ら, 1998, Proc. Natl. Acad
. Sci. U.S.A. 95:8933-8938に記載されているように、例えば網膜の桿体細胞お
よび/または味覚受容細胞に見られるトランスデューシンヘテロ3量体分子中に含
まれているα-トランスデューシンユニットを含んでいる多量体の、好ましくは
ヘテロ3量体の分子を意味する。非限定的な実施形態においては、トランスデュ
ーシン分子はさらに1個のβサブユニット及び1個のγサブユニットを含むことが
でき、例えば天然のヘテロ3量体トランスデューシンもしくは別のヘテロ3量体G
タンパク質分子、例えば天然のヘテロ3量体ガストデューシンなどに見られると
おり組み合わされたβγサブユニットの形を含むことができる。いくつかのトラ
ンスデューシン遺伝子およびタンパク質のヌクレオチド配列および/またはアミ
ノ酸配列は既知であり、例えばMedynski, D.C.ら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 82:4311-4315およびTanabe, T.ら, 1985 Nature(London) 315:242-24
5中に記載されている。本発明の方法に使用するためには、トランスデューシン
は天然の供給源から精製することができ、または既知の技法を用いて遺伝子組換
えで発現させることによって得ることができる。

【００２４】「ガストデューシン」という用語は、例えばガストデューシンの最初のクロー
ニングについて記載している文献、例えばMcLaughlin, S.K.ら, 1992, Nature(L
ondon) 357:563-569; McLaughlin, S.K.ら, 1993, "The Molecular Basis of Sm
ell and Taste Translation", CIBA Foundation Symposium 179, Chadwick, D.
ら編, Chichester, UK; Wiley, pp186-200; およびMcLaughlin, S.K.ら, 1994,
Physiol. Behav. 56:1157-1164に記載されているとおり、例えば味覚受容細胞お
よび/もしくは胃および腸の化学受容体細胞に認められるガストデューシンヘテ
ロ3量体分子などに含まれているようなα-ガストデューシンユニットを含む多量
体の、好ましくはヘテロ3量体の分子を意味する。非限定的な実施形態において
は、ガストデューシン分子はさらに1個のβサブユニット及び1個のγサブユニッ
トを含むことができ、例えば天然のヘテロ3量体ガストデューシンまたは別のヘ
テロ3量体Gタンパク質分子、例えばトランスデューシンなどに見られるとおり組
み合わされたβγサブユニットの形を含むことができる。さらに別のガストデュ
ーシン遺伝子のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列は、例えばMing, D
.ら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8933-8988およびHuang, L.ら,
1999, Nature Neurosci. 2:1055-1062中に記載されている。本発明の方法に使用
するためには、ガストデューシンは天然の供給源から精製でき、もしくは既知の
技法を用いて遺伝子組換えで発現させることによって得ることができる。

【００２５】「苦味物質(bitter tastant)」という用語は本明細書では、被験者中における
苦味の知覚を誘導するような分子もしくは分子複合体と定義される。とりわけ、
苦味物質は、例えば、限定するものではないが、Ming, D.ら, 1998, Proc. Natl
. Acad. Sci. U.S.A. 95:8933-8988(例えばこの文献の図3を参照せよ)に記載さ
れているようなアッセイにおいて、ガストデューシンおよび/またはトランスデ
ューシンの活性化をもたらす。苦味物質の例としては限定はされないが、安息香
酸デナトニウム(「デナトニウム」；「DEN」とも呼ぶ)、塩酸キニーネ (「キニ
ーネ」；「QUI」とも呼ぶ)、塩酸ストリキニーネ(「ストリキニーネ」；「STR」
とも呼ぶ)、ヘミ硫酸ニコチン (「ニコチン」；「NIC」とも呼ぶ)、塩酸アトロ
ピン(「アトロピン」；「ATR」とも呼ぶ)、スパルテイン、ナリンギン、カフェ
イン酸(「カフェイン」；「CAF」とも呼ぶ)、キナクリン、およびエピカテキン
が挙げられる。Mingら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:9903-9908を
参照のこと(この文献は本明細書中に参照により組み入れることとする)。

【００２６】「苦味物質によるGタンパク質の活性化に適した条件」という語句は、その条
件下でエレメントの組み合わせ、すなわち味覚レセプター、Gタンパク質、およ
び苦味物質がインヒビター不在下でGタンパク質の活性化をもたらすような条件
を意味する。適切な条件の例としては、in vivoの味覚受容細胞内であるような
条件、もしくはin vivoで見られる条件と類似のin vitroの条件が挙げられ、そ
のin vivoの条件としてはほぼ中性のpH値(例えばpH-6.5-8.5)および50-150mM Na
Clと同等の塩濃度を含む。

【００２７】実際、いかなる成分についてもその苦味の伝達を阻害する能力を試験すること
ができ、従って「試験インヒビター」とすることができる。例えば、ペプチド、
ペプチド類似体、炭水化物、糖タンパク質、脂質、脂肪酸、核酸、およびこれら
のエレメントの組み合わせを試験することができる。試験に好ましいインヒビタ
ーの非限定的な例としては(より好結果が得られると思われるインヒビター)、ア
デノシン5'-一リン酸(「AMP」)の構造的類似体を挙げることができる。そのよう
な構造的類似体とは、糖部分、好ましくはグアニンでなく、好ましくはアデニン
もしくはアデニン誘導体であるヌクレオシド塩基、および陰イオン性有機分子（
例えば、限定はされないが、リン酸塩およびその誘導体、硫酸塩およびその誘導
体、ならびにコハク酸及びその誘導体からなる群から選択したもの）からなる化
合物として定義される。これらの分子が全て効果的なインヒビターとなりうるわ
けではなく、好ましい「試験インヒビター」に該当するということである。試験
化合物が構造的に下記の化合物、それらはGタンパク質活性化によって測定する
とき苦味の伝達をうまく阻害することが示されたもので：チミジン5'-一リン酸
、アデノシン5'-二リン酸、アデノシン3'-一リン酸(3'-AMP)、アデノシン5'-コ
ハク酸、アデノシン5'-三リン酸(ATP)、アデノシン2'-一リン酸、5'-シチジル酸
、およびイノシン酸であるが、それらの化合物と関連したものであることが特に
好ましいであろう。

【００２８】本発明の方法においては、阻害もしくは阻害の欠如を示すためおよび力価を定
量するためには、苦味物質および/もしくは試験インヒビターの量を変えて行う
ことが望ましいであろう。天然に存在している苦味物質は典型的には10-500mMの
範囲で活性を有するが、特に強力な味覚物質では10-100mMという低い濃度でも検
出することができる。第6節に記載のとおり、苦味物質であるデナトニウムがin
vitroアッセイで5mM存在する場合、同定されるインヒビターは1mMの低レベルで
、通常は5mMのレベルでも活性を示した。

【００２９】 Gタンパク質の活性化が起こっているか否かを測定するためには、行動学的、
生理学的、もしくは生化学的方法を用いることができる。行動学的および生理学
的方法はin vivoで実施することができる。行動学的測定法の1例として、試験動
物がインヒビターの存在もしくは不在の状態で苦味物質を含む組成物を自発的に
摂取する傾向を測定することができる。もしその苦味物質が動物体内でGタンパ
ク質を活性化するならば、その動物は苦味を体験するものと期待され、そのこと
によってその動物がその組成物をさらに摂取しようとしなくなるであろう。その
動物が苦味物質のみを含有する組成物(活性化されたGタンパク質を伴う)と、苦
味物質と苦味インヒビターとを共に含む組成物(活性化されたGタンパク質はより
低いレベルにある)のいずれかを選択することができるようになっていれば、苦
味インヒビターを含有する組成物を摂取することを好むことが期待される。従っ
てそれらの動物によって示される相対的な嗜好性はGタンパク質の活性化と逆相
関する。そのような行動観察実験の例については下記の第6節を参照せよ。

【００３０】生理学的方法としては神経応答の研究が挙げられ、その方法は味覚受容細胞を
含んでいる組織と機能しうる形でにつながっている神経を用いてin vivoもしく
はin vitroで行うことができる。Gタンパク質の活性化をもたらすような苦味物
質への暴露によって味覚受容細胞中に活動電位をもたらし、次いで末梢神経を通
じて伝播されるが、苦味物質に対する神経の応答の測定は、とりわけ、Gタンパ
ク質活性化の間接的な測定である。舌咽神経を用いて行う神経応答の研究の1例
は下記の第6節に示している。舌咽神経応答の記録についてもNinomiya, Y.ら, 1
997, Am. J. Physiol. (London) 272:R1002-R1006中に述べられている。

【００３１】好ましい実施形態においては、本発明は苦味のインヒビターを同定する方法を
提供し、該方法は、(i) in vitroで味覚レセプターを、トランスデューシンおよ
びガストデューシンからなる群から選択されるGタンパク質、および苦味物質か
らなる溶液と、苦味物質によるGタンパク質の活性化に適した条件下で接触させ
、Gタンパク質の活性化レベルを測定すること；(ii)別の実験において、トラン
スデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択したGタンパク質、苦
味物質、および試験インヒビターと接触させ、Gタンパク質の活性化レベルを測
定すること、その際Gタンパク質は(i)で用いたものと同じものを用い、実験条件
は本質的に(i)と同じものとし；次いで(iii)上記の(i)で測定したGタンパク質の
活性化レベルを(ii)で測定したGタンパク質の活性化レベルと比較すること、そ
の際、試験インヒビターの存在下での活性化Gタンパク質のレベルがより低けれ
ば、そのことは味覚物質によって誘発される苦味の知覚を阻害する試験インヒビ
ターの能力と正の相関性がある。

【００３２】その味覚レセプターは他の分子から完全にもしくは部分的に単離されたもので
よく、またはそれは粗抽出物もしくは半精製抽出物の一部分として存在するもの
でもよい。非限定的な1例としては、その味覚レセプターは味覚受容細胞膜の調
製物中に存在するものとすることができる。本発明の特定の実施形態においては
、そのような味覚受容細胞膜は、Ming, D.ら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U
.S.A. 95:8933-8938(この文献は本明細書中に参照により組み入れる)に記載され
ているように調製することができる。詳細に述べれば、ウシ輪状有郭乳頭(「味
覚組織」、これは味覚受容細胞を含んでいる)は用手的に切除し、液体窒素中で
凍結し、使用するまで−80℃に保存しておくことができる。集めた組織は、10mM
Tris pH7.5、10%v/v グリセロール、1mM EDTA、1mM DTT、10μg/μl ペプスタ
チンA、10μg/μl ロイペプチン、10μg/μl アプロチニン、および100μM 4-(2
-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩を含有するバッファー中で
Polytronホモジナイザーでホモジナイズすることができる(25000RPM, 1回20秒で
3回)。1500 x gで10分間遠心して微粒子を除去した後、味覚膜は45,000 x gで60
分間遠心することによって集めることができる。次いでペレット化した膜を2回
洗い、プロテアーゼインヒビターを含まないホモジナイズバッファー中に再懸濁
し、25ゲージの注射針を20回通すことによってさらにホモジナイズした。次いで
、そのアリコートを急速凍結するかもしくは使用まで氷上で保存した。別の非限
定的な1例として、味覚レセプターは遺伝子組換えクローンから由来させること
ができる(Hoon, M.R.ら, 1995, Biochem. J. 309(part2):629-636を参照せよ)。

【００３３】本アッセイで用いられるガストデューシンおよびトランスデューシンは味覚細
胞抽出物中に存在する分子もしくは外因性に供給される分子とすることができる
。特定の非限定的実施形態においては、α-ガストデューシンもしくはα-トラン
スデューシンサブユニットを用いる場合には、β及びγユニットを例えばβγサ
ブユニットの組み合わせた形で反応混合液中に添加してヘテロ3量体の活性化が
行われるようにすべきであり、α-ガストデューシンおよびα-トランスデューシ
ンは、その他のGタンパク質から得たβγサブユニットと組み合わせることもで
きるということは注記すべきである。βγサブユニットは天然の供給源から調製
でき、もしくは遺伝子組換えで発現させることができる。非限定的な1例として
は、βγサブユニットは、Fung, B.K.ら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
. 78:152-156および/もしくはBubis, J.とKhorana, H.G., 1990, J. Biol. Chem
. 265:12995-12999に記載の方法によって調製することができる。αおよびβγ
サブユニットは、例えばMing, D.ら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95
:8933-8938に記載のようにin vitroで翻訳されたα-ガストデューシンがウシの
網膜から得たβγサブユニットと、10mM Tris pH8.0/10mM 3-[(3-コラミドプロ
ピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸エステル(CHAPS)中で室温で15
分間インキュベートすることができるように組み合わせることができる。

【００３４】味覚レセプターは試験インヒビターの存在下もしくは不在の条件下でガストデ
ューシンもしくはトランスデューシンおよび味覚物質と、そこに存在するGタン
パク質の活性化に適した条件下で接触させる。特定の、非限定的な1例としては
、味覚膜調製物は、インキュベーションバッファー中にタンパク質濃度が約0.25
-1mg/mLの味覚レセプターを含むものとすることができ、そのインキュベーショ
ンバッファーは25mM Tris pH7.5; 2mM MgCl₂; 5mM ジチオスレイトール； 100mM
NaCl; 100μM GDP; 0.5μM グアノシン5'-[γ-チオ]三リン酸(GTP[γS])である
。ガストデューシン(例えばin vitroで翻訳されたガストデューシン)をこの混合
液に添加して最終濃度を20-200pM、好ましくは約40pMとすることができ、または
トランスデューシン(例えば天然のトランスデューシン)を添加して最終濃度を0.
2-1.0μM、好ましくは約0.4μMとすることができる。特定の非限定的実施形態に
おいては、トランスデューシンもしくはガストデューシンのαサブユニットはこ
のステップの前に、上述のとおりβγサブユニットと組み合わせることができる
。味覚レセプターおよびガストデューシンまたはトランスデューシンからなる反
応混合液に、試験インヒビターおよび/もしくは苦味物質を添加することができ
、その結果得られた溶液を、各エレメントの相互作用が行われるようにインキュ
ベートした。ガストデューシン含有の混合液ではインキュベーションは好ましく
は冷却された温度、例えば氷上で約1〜3時間行われる。トランスデューシンでは
インキュベーションは好ましくは室温もしくは室温よりわずかに高い温度、例え
ば30℃で約1時間行われる。

【００３５】味覚レセプター、Gタンパク質、試験インヒビターおよび/または苦味物質を適
切な時間接触させた後、Gタンパク質の活性化を測定することができる。好まし
い実施形態においては、活性化はトリプシン消化アッセイによって評価される。
そのようなトリプシン消化アッセイの生成物をSDS-PAGEに供すると、不活性ガス
トデューシン(GDP結合型)は約23-25キロダルトンのバンドとなるが、活性化され
たガストデューシン(GTPγS結合型)は約37キロダルトンのバンドとなり、不活性
のトランスデューシン(GDP結合型)は約23-25キロダルトンの2量体のバンドとな
るのに対し、活性化されたトランスデューシン(GTPγS結合型)は約32キロダルト
ンのバンドとなることは、すでにわかっている。特定の、非限定的な例において
は、本発明のトリプシン消化アッセイを行うためにTPCK処理トリプシン(反応混
合液中のトリプシン対総タンパク質の比が1:25)を添加し、消化は室温で約15分
間で行い、ダイズトリプシンインヒビター(インヒビターとトリプシンの比が6:1
モル/モル)を添加して反応を停止することができる。トリプシン消化後、サン
プルをLaemmliバッファー(Laemmli, U.K., 1970, Nature(London) 227:680-685)
で希釈し、4-20%ゲルおよびTris-グリシンバッファーを用いてSDS/PAGEで分離す
ることができる。分離したポリペプチドを電気ブロッターで、ポリ(ビニリデン
ジフルオリド)膜に移し、5% BLOTTO[50mM Tris-HCl, pH7.4/100mM NaCl/5% 無脂
肪乳]を添加してブロックした(30分)。Gタンパク質ペプチドは、トランスデュー
シンまたはガストデューシンに対する抗体と結合させ、その後、例えば、検出可
能な標識を有する二次抗体と結合させることによって可視化することができる。
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化二次抗体を用いる場合には、結合はビシンコ
ニン酸染色試薬で現像し、X線フィルムに露光させることによって可視化するこ
とができる。37キロダルトンのバンドの存在は活性化ガストデューシンの存在に
関連し、32キロダルトンのバンドの存在は活性化トランスデューシンの存在と関
連する。

【００３６】ガストデューシンまたはトランスデューシンに対する抗体は当業界で公知の方
法を用いて調製することができる。例えば、抗ガストデューシン抗体は、キーホ
ールリンペットヘモシアニンとコンジュゲートしたラットα-ガストデューシン
のアミノ酸95から109からなるペプチドを適切な動物に接種することによって調
製することができる(Takami, S.ら, 1994, Mol. Brain Res. 22:193-203)。モノ
クローナル抗体TF15(American Qualex, La Mirada, 米国カリフォルニア州)はト
ランスデューシンに対するものであるが、ガストデューシンと交差反応すること
がわかっている。Ming, D.ら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8933-
8938; およびRuiz-Avila, L.ら, 1995, Nature(London) 376:80-85を参照せよ。

【００３７】 Gタンパク質の苦味物質による活性化を阻害する上記の方法のいずれかで同定
された試験インヒビターを、次いでその阻害活性を確認するかおよび/もしくは
それらが苦味インヒビターとしてのみならずインヒビター甘味料としても作用す
るか否かさらに試験することができる。活性を確認するために、上述の3種類の
方法(行動学的、生理学的、in vitro法)のうちの1つの結果を、上記に開示した
方法のうちの他の方法を用いてその結果を試験して確認することができる。例え
ば、in vitro法の結果は生理学的および/または行動学的研究によって確認する
ことができる。

【００３８】あるインヒビターがインヒビター甘味料として作用するか否かを決めるために
、その成分の甘味知覚を誘導する能力を、上述の行動学的、生理学的、もしくは
in vitro法で評価できる。インヒビター甘味料の非限定的な例としては、サッカ
リン、アセサルファムK、シクラミン酸ナトリウム、アスパルテーム、D-トリプ
トファン、およびD-フェニルアラニンが挙げられる。

【００３９】例えば、行動学的研究は、インヒビター甘味料と推定されるものを含む組成物
を摂取するか、同じ組成でその添加された化合物を含まないものを摂取するか、
という選択を試験動物ができるような形で行うことができる。試験成分を含む組
成物を、例えばより多く摂取することによって嗜好が示されれば、そのことはイ
ンヒビター甘味料の活性と正の相関性を有するものであろう。この試験に用いら
れる組成物の基礎的組成は苦味インヒビターとインヒビター甘味料活性との混同
を避けるために、知覚しうる量の苦味物質を含まないものが好ましい。

【００４０】甘味の伝達にはcAMPなどの二次メッセンジャー分子の増加を伴うので、苦味イ
ンヒビターがインヒビター甘味料として作用する能力はその化合物での暴露にと
もなう二次メッセンジャーのレベルの変化を測定することによって評価すること
ができ、それらのレベルの増加は甘味と相関する。そのような測定は例えば当業
界で既知のクエンチフローシステムで行うことができる。Huang, L.ら, 1999, N
ature Nurosci. 2:1055-1062を参照せよ。

【００４１】５.２インヒビターを含む組成物およびその使用本発明は、有効量の苦味インヒビター、たとえば、上記5.1節に記載したG-タ
ンパク質活性化の測定により同定される苦味インヒビターを被験体に投与するこ
とを含む、被験体の味覚組織に苦味物質が接触することによって生じる苦味味覚
を阻害する方法を提供する。本発明はまた、有効量の苦味インヒビターを組成物
に配合することを含む、組成物の苦味を阻害する方法を提供する。苦味インヒビ
ターの「有効量」は、苦味の知覚を実質的に減少させる、および/または上記の
アッセイの１つにより測定されるようなG-タンパク質活性化の検出可能な減少を
伴う量である。本発明の具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビタ
ーは、アデノシン5'一-(“AMP”)、チミジン5'-一リン酸、アデノシン5'-二リン
酸、アデノシン3'-一リン酸(3'-AMP)、アデノシン5'-コハク酸、アデノシン5'-
三リン酸(“ATP”)、アデノシン2'-一リン酸、5'-シチジル酸、およびイノシン
酸からなる群より選択される。

【００４２】本発明はまた、甘味を誘発ことに加えて苦味インヒビターとして作用する化合
物からなる組成物を被験体に投与することを含む、被験体における甘味の知覚を
生み出す方法を提供する。上記組成物は、被験体に甘味として認識される味覚を
作り出すのに有効な量のインヒビター甘味料を含む。

【００４３】したがって、本発明は、インヒビター甘味料として作用する苦味インヒビター
を含む、苦味インヒビターを含む組成物を提供する。このような組成物は、これ
らに限定されないが、食品、医薬品、歯科用製品、化粧品、および封筒および切
手に用いられている湿らせて使用する糊などの、被験体の味覚組織に接触する可
能性のあるいかなる物質をも含む。

【００４４】実施形態の１セットにおいて、苦味インヒビターは、同時に存在する苦味物質
による苦味の知覚を相殺するために用いられる。これらの実施形態において、本
発明の組成物は苦味物質および苦味インヒビターを含み、苦味インヒビターは苦
味の知覚を阻害する濃度で存在する。たとえば、組成物中の苦味物質濃度および
組成物中の苦味インヒビター濃度を上記5.1節に記載した方法によりアッセイす
る場合、苦味インヒビターは苦味物質によるG-タンパク質の活性化を阻害する。

【００４５】好ましい苦味インヒビターには、アデノシン5'-一リン酸、チミジン5'-一リン
酸、アデノシン5'-二リン酸、アデノシン3'-一リン酸、アデノシン5'-コハク酸
、アデノシン5'-三リン酸、アデノシン2'-一リン酸、5'-シチジル酸、およびイ
ノシン酸が含まれるが、これらに限定されない。苦味物質を含む組成物に加える
苦味インヒビターの量は、存在する苦味物質の量、組成物中に存在する他の化合
物、およびその組成物を味見する動物の種に依存して変化する。本発明の具体的
で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターは約0.01から50mMの濃度で存
在しうる。

【００４６】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとしてAMPを用いる
場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好ましくは約1から5mM
の濃度のAMPを含みうる。

【００４７】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとしてチミジン5'-
一リン酸を用いる場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好ま
しくは約1から5mMの濃度のチミジン5'-一リン酸を含みうる。

【００４８】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとしてアデノシン5'
-二リン酸を用いる場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好
ましくは約1から5mMの濃度のアデノシン5'-二リン酸を含みうる。

【００４９】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとしてアデノシン3'
-一リン酸を用いる場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好
ましくは約1から5mMの濃度のアデノシン3'-一リン酸を含みうる。

【００５０】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとしてアデノシン5'
コハク酸を用いる場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好ま
しくは約1から5mMの濃度のアデノシン5'コハク酸を含みうる。

【００５１】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとしてアデノシン5'
-三リン酸を用いる場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好
ましくは約1から5mMの濃度のアデノシン5'-三リン酸を含みうる。

【００５２】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとしてアデノシン2'
-一リン酸を用いる場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好
ましくは約1から5mMの濃度のアデノシン2'-一リン酸を含みうる。

【００５３】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとして5'-シチジル
酸を用いる場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好ましくは
約1から5mMの濃度の5'-シチジル酸を含みうる。

【００５４】具体的で非限定的な実施形態において、苦味インヒビターとしてイノシン酸を
用いる場合、苦味物質を含む組成物は、さらに約0.01から20mM、好ましくは約1
から5mMの濃度のイノシン酸を含みうる。

【００５５】本発明の化合物がインヒビター甘味料である場合、これを苦味物質を含む組成
物、または含まない組成物のいずれにも含有させることができる。組成物が苦味
物質を含む場合、インヒビター甘味料は、苦味物質による苦味の導入を減少させ
るまたは除去するような濃度で存在する。この濃度は、苦味物質の濃度に依存す
る場合があるが、上記の節に記載したG-タンパク質の活性化を阻害するために必
要なインヒビター甘味料の量を決定するための方法を用いて決定することができ
る。これに限定されないが、好ましくは、存在するインヒビター甘味料の量は、
組成物を摂取する被験体における甘味の知覚をもたらす量である。

【００５６】組成物が苦味物質を含まない場合、インヒビター甘味料の濃度は、甘味の知覚
をもたらす濃度であればいかなる濃度であってもよい。この量は、主観的および
/または心理物理的方法（たとえば、フォーカスグループでの味覚試験）により
、または上記のような行動の研究により決定することができる。具体的で非限定
的な実施形態において、存在するインヒビター甘味料の濃度は、約0.001から20m
Mである。

【００５７】本発明は、苦味物質の嫌悪を誘発する効果を減少させるまたは除去することに
より食品の味覚を改善するために用いることができる。インヒビターがインヒビ
ター甘味料である場合、これらは甘味を作り出すことにより食品の風味を改善す
るために用いられる。苦味物質が食品保存料である場合、本発明のインヒビター
により、それを食品に配合することが可能、または容易になるので、食品の安全
性が向上する。栄養補助食品として投与される食品では、本発明のインヒビター
の配合は、摂取を促進し、それによりこれらの組成物の栄養またはカロリーを被
験体に供給する効果を増大させることができる。

【００５８】本発明のインヒビターは、医療用および/または歯科用組成物に配合すること
ができる。診断のための処置で用いられる組成物には、対比材料および局所口腔
麻酔薬のように、不快な味を有するものがある。本発明のインヒビターを、組成
物の味を改善することにより、このような処置を受ける被験体の快適性を改善す
るために用いることができる。さらに、本発明のインヒビターは、錠剤および液
剤を含む医薬組成物に、その風味を改善し、患者の協力を改善するために（特に
患者が子供またはヒト以外の動物である場合）配合することができる。

【００５９】本発明のインヒビターは、化粧品に含有させて、その味の特徴を改善すること
ができる。たとえば、これらに限定されないが、本発明のインヒビターは顔用ク
リームおよび口紅に配合することができる。

【００６０】さらに、本発明のインヒビターは、伝統的な食品、医薬品、または化粧品では
ないが、味覚膜に接触し得る組成物に配合することができる。例として、石鹸、
シャンプー、練り歯磨き、義歯接着剤、切手および封筒の表に付ける糊、および
有害小動物駆除に用いられる毒性組成物（たとえば、ネズミまたはゴキブリ用毒
物）が含まれるが、これらに限定されない。

【００６１】５.３苦味物質の同定苦味物質を同定および/または特性解析するために5.1節に記載の方法を用いる
ことができる。そのような情報の入手は、新規の苦味物質を同定するために用い
ることができるのみならず、ある味覚物質がどのように認識されるか、また、そ
れをどのように調節することができるかについて、よりよく予見するために用い
ることができる。苦味物質を同定/特性解析するために、公知の苦味インヒビタ
ーを5.1節に記載の方法に用い、苦味物質と推定された物質を試験物質とする。
試験する味覚物質の、ガストデューシンまたはトランスデューシンのようなG-タ
ンパク質を活性化する能力、およびその活性化が苦味インヒビターにより阻害さ
れることは、この味覚物質が苦味として知覚され、デナトニウムおよびキニーネ
のような公知の苦味物質と同様の伝達メカニズムを有することを示す。

【００６２】６. 実施例：味覚レセプターによるガストデューシンの活性化をブロックする
と、苦味成分に対する味覚応答が阻害される６.１材料および方法 Gタンパク質活性化アッセイ地方の屠殺場から牛 (Bos primigenius)の舌の新鮮なものを入手し、氷上にお
いて実験室に運んだ。有郭乳頭を手で切り裂き、液体窒素中で凍結させ、使用す
るまで-80℃で保存した。回収した味覚組織をホモジネートし、遠心分離により
微粒子を除去し、記載の方法で(Ming. D., et al., 1998, Proc. Natl. Acad. S
ci. U. S. A. 95: 8933-8938) 濃縮された味覚細胞膜を回収した。ペレットにな
った膜を２回すすぎ、プロテアーゼインヒビターの入っていないホモジナイズ用
バッファー中に再懸濁し、25ゲージの注射針を20回通過させることによりさらに
ホモジネートした。アリコートを急速冷凍するか、または使用するまで氷上で保
存した。膜調製物中のタンパク質の濃度は、マイクロローリー（micro Lowry）
法のパターソンによる変法 (Peterson, G. L., 1977, Anal. Biochem. 83: 346-
356) により測定した。トランスデューシンの活性化は、公開されているトリプ
シン感受性法に基づいて行った (Ming. D., et al., 1998, Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 95: 8933-8938, Neer, E. J., et al., 1994, Methods Enzymol.
237 : 226-239)。トリプシン消化の後、サンプルをLaemmliバッファー (Laemml
i. U. K., 1970, Nature (London) 227: 680-685) で希釈し、SDS/PAGEにより、
4〜20％ゲルおよびTris-グリシンバッファーを用いて分離した。分離したポリペ
プチドは、エレクトロブロッターによりポリ（ビニリデンジフルオリド）膜に移
した。これを5% BLOTTO [50 mM Tris-HCI、pH 7.4 / 100 mM NaCl / 5% 無脂肪
粉乳]を添加することによりブロックし(30分間)、次いでトランスデューシンペ
プチドをトランスデューシン抗血清および西洋ワサビペルオキシダーゼで標識し
たヤギ抗ウサギ第２抗体の結合により可視化し、次いで、Bio-Radのビシコニン
酸染色剤で現像し、X線フィルムに暴露した。

【００６３】化学物質すべての苦味物質およびバッファー化学物質は、可能な限り高純度のものであ
り、特に記載しない限り、SigmaまたはBoehringer Mannheimから購入した。ロド
プシンを、公開された手順 (Mazzoni. M. R, et al., 1991, J. Biol. Chem. 26
6: 14072-14081) を用いて、6M 尿素で洗浄したウシ桿状外節から明るい中で精
製した。ウシトランスデューシンヘテロ三量体は標準的方法で精製した (Fung,
B. K.-K., ら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 78: 152-156)。ウサギ
ポリクローナル抗トランスデューシン抗体は、Mel SimonおよびJohn Watson (Ca
lifornia Institute of Technology, Pasadena, CA) から好意により提供を受け
た。

【００６４】行動アッセイ Jackson Laboratoryから入手した雄C57BL/6Jマウスの複数のセットを試験した
。各セット(n = 10)を、味覚物質にAMPもしくはGMPを加えてまたは加えずに、試
験した。試験の間、約２週間にわたり、マウスに酸性の水（pH 4.5）を与えた。
8〜20週齢の範囲のマウスを試験した。マウスは個々に収容し、餌 (Pico Lab Mo
use Diet 20 no. 5058; PMI Feeds, St. Louis, MO)を自由摂取させ、試験の前4
8時間、２つのすすり瓶（sipper bottle）に入った蒸留水を与えた。48時間の各
テスト期間の間、所定の濃度の味覚物質を一方のすすり瓶に与え、もう一方には
蒸留水を与えた。24時間後、消費された量を記録し、瓶を再度満たし、その位置
に保持した (位置による手がかりを調節するため)。味覚物質を濃度を上昇させ
ながら与えた。好ましい割合は、消費された味覚物質の割合、すなわち、消費さ
れた液体の総体積のパーセントとして計算した。平均の嗜好比およびスチューデ
ント試験は、収集したデーター全体から計算した。

【００６５】神経記録舌咽神経応答は、以前に記載されているように (Ninomiya, Y., et al., 1997
, Am. J Physiol. (London) 272: R1002-RI006)、雄C57BL/6Jマウスから記録した。各マ
ウスは、ペントバルビタールナトリウム (40〜50 mg/kg)を腹腔内注射すること
により麻酔し、該薬物を補充注射して外科手術レベルの麻酔を維持した。気管に
カニューレを挿入し、次いで、マウスをヘッドホルダーで背位に固定して、舌咽
神経の切開が実施できた。舌下神経を左右に切り裂き、偶発的な舌の動きを防い
だ。右側の舌咽神経を、顎二腹筋および舌骨の後角を除去することにより露出さ
せた。続いて、舌咽神経を下の組織から切りはなし、舌咽神経が頸静脈孔に入る
付近で切断した。全神経を記録するために、神経全体を銀のワイヤー電極上に置
いた。不関電極を傷の中付近に配置した。味覚物質の舌への局所的塗布によって
得られる神経応答を増幅器に送り、オシロスコープスクリーン上に表示させた。
全神経応答を、RMS-DCコンバーター (Hendrick, Tallahassee, FL)を用い、0.5
秒の時定数で積分した。有郭乳頭および葉状乳頭の化学的刺激のために、動物の
顔のそれぞれの側を、口角から顎の角のすぐ上まで切開し、乳頭を露出させ、そ
の溝を舌の先端に縫いつけた小さな縫い目を介して加えられるわずかな張力によ
って開いた。味覚物質溶液は、重力流動によって舌に送達され、期間を制御して
、舌の上に流した。各調製物の安定性は、0.1 M NH₄Clを定期的に添加すること
によってモニターした。記録は0.1 M NH₄Cl応答が最初に最大になり、各連続刺
激の最後のずれが15％未満であるときに、安定であるとみなした。データ分析に
おいては、安定な記録に由来する応答のみを使用した。全神経応答の分析におい
ては、刺激の開始の20、25、30、35および40秒後における積分された応答の絶対
値を測定し、平均して持続応答を出した。持続応答とは、味覚レセプター細胞の
、継続的味覚物質刺激に対する持続的神経応答を表す。各刺激に対する相対的持
続応答は、0.1 M NH₄Clからの応答に対して基準化することによって得られた（0
.1 M NH₄Clの持続応答を1.0と定義した）。統計的分析のために、スチューデン
ト試験を使用した。

【００６６】６.２結果ガストデューシンおよびトランスデューシンなどのGタンパク質の活性（GTP結
合型）形態は、制限的トリプシン消化によって不活性（GDP結合型）形態と区別
できる (Fung. B. K.-K. & Nash, C. R., 1983, J. Biol. Chem. 258: 10503105
10; Halliday, K. R., et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 516-525)。このin
vitroアッセイにおいて、トランスデューシンをレポーターとして使用し、本発
明者らは、苦味成分に対する味覚応答を阻害する成分を同定した。苦味成分であ
る安息香酸デナトニウム（DEN）および塩酸キニーネ（QUI）によるトランスデュ
ーシンの味覚膜による活性化は、AMPにより用量依存的に阻害された(図1Aおよび
1B)。AMPの阻害効果は味覚膜の存在下でトランスデューシンを活性化するすべて
の苦味成分に対して生じた。このような苦味成分としては、DEN、QUI、ストリキ
ニーネ、ニコチン、アトロピン (図1 C)、スパルテイン、ナリンギン、カフェイ
ン酸およびキナクリンなどがある。AMPの阻害効果は特異的で、味覚レセプター
を必要とする。なぜなら、AMPは、ロドプシンが媒介するトランスデューシンの
活性化を阻害しないからである（図1D）。GMPは、DEN（図１E）またはその他の
苦味物質に応答するトランスデューシンの味覚膜による活性化を阻害せず、これ
によりは結合特異性が示唆される。いくつかのAMP関連化合物は、トランスデュ
ーシンのDEN/味覚レセプターによる活性化を強力に阻害した。このような化合物
には、チミジン5' -一リン酸、ADP、3'AMP、アデノシン5'コハク酸、ATP(図2)お
よびアデノシン2'-一リン酸がある。5'-シチジル酸およびイノシン酸は、トラン
スデューシンのDEN/味覚膜による活性化を部分的に阻害した（図２）。GMPと同
様に（図1E）、アデノシン5'-カルボン酸、アデノシン5'一硫酸、テオフィリン
、アデニン、アデノシン、cAMPおよびカフェインはDENが刺激した味覚膜による
トランスデューシンの活性化をブロックしなかった(図2)。

【００６７】 AMPが、GMPとは異なり、苦味成分に対する味覚応答を減ずるかどうかを判定す
るために、２つのボトルを用いたマウスにおける嗜好試験(Harder, D. B., et a
l., 1989, Chem. Senses 14: 547-564)を、種々の味覚物質にAMPまたはGMPを加
えてまたは加えずに与えて、実施した。AMPは、マウスのDEN(図3Aおよび3B)およ
びQUI（図3Cおよび3D）に対する嫌悪応答を阻害したが、GMPは阻害しなかった。
AMPの阻害効果は苦味物質の濃度が上昇するに従ってだんだん減少し、DENおよび
QUIが試験した最大濃度 (それぞれ5.0および1.0 mM) に達すると消滅した(図3A
〜D)。ヒトが、苦味[スパルテインおよび (-)-エピカテキン(Glendinning, J. 1
., 1994, Physiol.Behav. 56: 1217-1227)]、甘味[スクロースおよび高力価人工
甘味料SC45647 (Nofre, C., et al., inventors, Universit Claude Bernard, L
yon 1, France, assignee,"Sweetening Agents", 米国特許 4,921,939, May 1,1
990)]、酸っぱ味(HC1)、または塩辛味(NaCl)として特徴づけるいくつかのその他
の味覚物質についても、AMPを加えてまたは加えずに試験した。AMPは２種の苦味
成分（スパルテインおよびエピカテキン）に対する嫌悪応答を阻害したが、スク
ロース、SC45647、NaClまたはHClに対する行動応答に影響を与えなかった(図3E)
。

【００６８】苦味成分に対する嫌悪応答のAMPによる阻害が、（図１および２の生化学的デ
ータによって予想されるように）末梢味覚阻害によるものであるか否かを判定す
るために、本発明者らは各種味覚物質±AMPまたはGMPに対するマウスの総和舌咽
神経応答（Ninomiya,Y.ら, 1997, Am. J Physiol. (London) 272:R1002-R1006）
を記録した。舌咽神経は後舌の味覚受容細胞を神経支配し、マウスでは塩辛味刺
激、甘味刺激、酸味刺激、および苦味刺激に応答する（Ninomiya,Y.ら, 1984, B
rain Res. 302:305-314）。AMP（0.1 mM）は、DEN、QUI、スパルテイン、ストリ
キニーネ、およびアトロピンに対する上記神経応答を有意に阻害した（図4A-F）
。GMP（0.1 mM）は、これらの苦味成分のどれに対する舌咽応答に対しても影響
を及ぼさなかった（図4C）。QUIまたはDEN濃度が上昇するにつれて舌咽応答は増
大したが、AMP（0.1および1.0 mM）はこれらの神経応答を有意に阻害した（図4D
-H）。一方、AMPは、NH₄Cl、HCl、NaCl、またはスクロースに対する上記神経応
答には影響を及ぼさず（図4I）、これは行動応答とも一致した。興味深いことに
、AMPは人工甘味料SC45647に対する舌咽応答をやや阻害した（図4I）が、この化
合物に対する行動応答は低減させなかった（図3E）。

【００６９】６.３考察 AMPおよびその類似化合物は、味覚膜＋DEN、QUI、および他のいくつかの苦味
成分によるトランスデューシンの活性化をin vitroで阻害した。この作用は、苦
味応答性の７回膜貫通型受容体（おそらく味覚膜に存在する）に特異的であり、
ロドプシン様受容体の非特異的または普遍的活性化によっては誘発されなかった
。またAMPおよび類似化合物は、DEN、QUI、および他の苦味成分に対する行動応
答ならびに味覚神経応答をブロックしたが、NaCl、HCl、またはスクロースに対
する応答には影響を及ぼさなかった。AMPは、強力な甘味料SC45647に対する行動
応答には影響を及ぼさなかったが、該化合物に対する舌咽応答は低減させた。AM
P、ADP、ATP、チミジン5'-一リン酸、5'-シチジル酸、およびイノシン酸は全て
、味覚レセプター応答をin vitroで阻害したが、GMPはこれを阻害しなかった。
このことは、これらの化合物の結合選択性を示唆している。電気生理学的アッセ
イにおけるAMP作用の迅速性は、作用部位が細胞内であるということには合致せ
ず、したがってAMPがおそらく細胞表面受容体にて作用していることを示唆して
いる。しかしながら、本発明のデータは、該受容体におけるAMP作用が競合的様
式のものか非競合的様式のものかを区別できるものではない。

【００７０】高濃度のDEN、QUI、および他の苦味物質は、嫌悪応答のAMPによる阻害を克服
した。このことは、AMPが競合インヒビターとして作用しているか、または苦味
物質が、ガストデューシン／トランスデューシン媒介経路に加えて他のAMPに対
する耐性のある苦味伝達経路を活性化したか、のいずれかを示唆するものであり
、シグナル伝達を断絶してしまう突然変異形態のガストデューシンを発現してい
るガストデューシン・ノックアウト・トランスジェニックマウス（Wong.G.T.ら,
1996, Nature (London) 381:796-800; Ming.D.ら, 1998, Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 95:8933-8938）における、苦味成分への残存応答性と一致する結果
である。複数の苦味伝達経路の存在は、QUIの濃度の増大すると、、QUIに対する
舌咽応答のAMPによる阻害がプラトーに達し、QUIに対する舌咽応答がそれ以上低
減しなくなるという観察によっても、支持される。

【００７１】近年の研究で、ある種の人工甘味料が、DEN、QUI、および他の苦味成分による
味覚レセプターの活性化をin vitroで阻害することが判明した。それらの甘味料
は、これらのガストデューシン／トランスデューシンと共役する苦味成分に対す
る行動応答および味覚神経応答をも阻害した。この甘味-苦味の「混合抑制」現
象（Bartoshuk,L.M., 1975, Physiol. Behav. 14:643-649; Formaker.B.K.およ
びFrank,M.E., 1996, Brain Res. 727:79-90）は、部分的には、苦味成分が結合
するのと同じ標的受容体に甘味料がアンタゴニストとして結合することによって
説明し得る。さらにこの現象は、強力な甘味料および強力な苦味成分の化学的類
似性についての以前の観察とも関連しうる（Lee.C.K., 1987, Adv. Carbohydr.
Chem. Biochem. 45:199-351; Benedetti,E.ら, 1995, J Pept. Sci. 1:349-359;
Shin,W.ら, 1995, J. Med. Chem. 38:4325-4331 21-23）。列挙される複数の証
拠が、苦味伝達におけるガストデューシン／トランスデューシン、それらと共役
する受容体、およびエフェクター酵素（例えばホスホジエステラーゼおよびホス
ホリパーゼC）を示す（総説として、Kinnamon,S.C.およびMargolskee,R.F., 199
6, Curr. Opin. Neurobiol. 6:506-513; Lindemann,B., 1996, Physiol.Rev. 76
:719-766）。ガストデューシンおよびトランスデューシン以外にも、Gタンパク
質、G_s、G_i3、およびG₁₄も味覚受容細胞に存在し（Kinnamon,S.C.およびMargols
kee,R.F., 1996, Curr. Opin. Neurobiol. 6:506-513; McLaughlin S.K.ら, 199
2, Nature (London) 357:563-569）、味覚伝達に関与している。生化学的研究お
よび電気生理学的研究により、環状ヌクレオチド、イノシトール三リン酸、ジア
シルグリセロール、およびCa⁺が苦味および／または甘味の味覚伝達における二
次メッセンジャーとして示唆されている（Tonosaki,K.およびFunakoshi,M., 198
8, Nature (London) 331:354-356; Behe,P.ら, 1990 J. Gen. Physiol. 96:1061
-1084; Bernhardt.S.J.ら, 1996, J Physiol. (London) 490:325-336; Cummings
,T.A.ら, 1996, J. Neurophysiol. 75:1256-1263; Spielman.A.I.ら, 1996, Am.
J. Physiol. 270:C926-C931 24-28）。生化学的データおよび遺伝学的データは
、苦味および甘味味質の双方の伝達におけるガストデューシンを明確に示唆して
いる：(i)ガストデューシンを欠失したマウスでは苦味および甘味成分の双方に
対する行動応答ならびに味覚神経応答が顕著に低減する（Wong.G.T.ら, 1996, N
ature (London) 381:796-800）；（ii）受容体との相互作用を断絶する突然変異
型のガストデューシンは、苦味および甘味応答の双方をin vivoでブロックする
ドミナントネガティブとして作用する；(iii) in vitro研究は、ウシ味覚レセプ
ターを含有する膜および可溶化味覚レセプターが、DEN、QUI、および他のいくつ
かの苦味成分の存在下でガストデューシン／トランスデューシンを活性化するこ
とを示している（Ming.D.ら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8933-8
938）；(iv)甘味成分はこのアッセイではガストデューシン／トランスデューシ
ンを活性化しないが、一方ある種の甘味料はガストデューシン／トランスデュー
シンの活性化をin vitroでブロックし、それにより甘味-苦味の「混合抑制」が
生ずることを本発明者らのデータは示している。

【００７２】味覚Gタンパク質の生化学的研究および遺伝学的研究は、甘味および苦味伝達
経路の分子的性質について新たな知見をもたらしたが、苦味および甘味伝達に関
与する味覚レセプターの物理学的研究（Cagan,R.H.およびMorris,R.W., 1979, P
roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:1692-1696; Shimazaki.K.ら, 1986, Biochim
. Biophys. Acta. 884:291-298）は、材料不足と高親和性リガンドが無いことか
ら、限定された有用性を有するのみである。典型的な天然の苦味および甘味物質
は、10〜500 mMの範囲にて活性を有し、最も強力な甘味または苦味物質は10〜10
0 nMの検出閾値を有する。受容体ファミリーおよび複数の別個の経路の可能性が
あることにより、化合物について味覚レセプターを特徴付ける困難性が助長され
る。強力な甘味料についての構造-活性相関の解析から、受容体の結合ポケット
の物理的性質に関するワーキングモデルが導かれた（総説として、Roy.G., 1992
, Crit. Rev Food Sci. Nutr. 31:59-77; Schiffman S.S.およびGatlin.C.A., 1
993, Neurosci. Biobehav. Rev. 17:313-345）。しかしながら、これらのアプロ
ーチは、甘味料が作用する受容体の不均一性および複数の別個の経路の可能性に
よって、厳しく限定される。本発明者らが提供するアプローチは、苦味受容体の
特異的サブタイプ、ならびに苦味味覚の選択的ブロッカーとして作用する天然成
分および合成化合物を同定するために使用することができる。

【００７３】本明細書では様々な刊行物を引用したが、それらはその全体を参照により本明
細書に組み入れるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１A〜Eは、AMPは苦味刺激によるトランスデューシンの活性化をウシ味覚受
容細胞膜の存在下で阻害することを示す。(A) 不活性(GDP結合型)トランスデュ
ーシン(一番右側のレーン)は、トリプシンで消化すると、23kDaの断片が生じる
。DEN＋味覚膜によって活性化された活性(GTP-γS結合型)トランスデューシン(
右から2番目のレーン)は、トリプシン処理によって32kDaの断片が生じる。32kDa
断片から23kDa断片へのシフトを測定すると、AMPの濃度の増加(0.25, 0.5, 1.25
, 2.5, および5.0mM)に応じてDEN＋ウシ味覚レセプター膜によるトランスデュー
シンの活性化が阻害される。(B) AMPの濃度の増加(0.01, 0.05, 0.10, 0.50, 1.
0, 1.5, 2.0, および2.5mM)に応じて1.0mM QUI＋ウシ味覚膜によるトランスデュ
ーシンの活性化が阻害される。(C) AMP(2.5mM)はDEN(5.0mM)、QUI(1.0mM)、塩酸
ストリキニーネ(STR, 5.0mM)、ヘミ硫酸ニコチン(NIC, 5.0mM)、および塩酸アト
ロピン(ATR, 5.0mM)による味覚膜依存性のトランスデューシンの活性化を阻害す
る。(D) AMP(0.25, 0.5, 1.25, 2.5, および5.0mM)は0.001mMのロドプシンによ
るトランスデューシンの活性化を阻害しない。(E) GMP(0.25, 0.5, 1.25, 2.5,
および5.0mM)はDEN(5.0mM)＋ウシ味覚膜によるトランスデューシンの活性化を阻
害しない。

【図２】図２は、特定のAMP類似体のみがDEN＋味覚膜によるトランスデューシンの活性
化をブロックすることを示す。DEN(5.0mM)による味覚膜に依存するトランスデュ
ーシンの活性化はアデノシン5'カルボン酸(ACA, 5.0mM)、アデノシン5'一硫酸(A
MS, 5.0mM)、テオフィリン(THE, 5.0mM)、塩酸アデニン(ADE, 5.0mM)、塩酸アデ
ノシン(ADO, 5.0mM)、cAMP(5.0mM)、もしくはカフェイン(CAF, 5.0mM)によって
阻害されない。DEN/味覚膜によるトランスデューシンの活性化はチミジン5'-一
リン酸(TMP, 5.0mM)、5'-シチジル酸(CMP, 5.0mM)、イノシン酸(IMP, 5.0mM)、A
DP(5.0mM)、3'-AMP(5.0mM)、アデノシン5'-コハク酸(ASU, 5.0mM)、およびATP(5
.0mM)によって阻害される。H₂Oとロドプシン(RHO)レーンは非特異的受容体非依
存性の影響を調べるための対照である。

【図３】図３A〜Eは、AMPは数種の苦味成分に対するマウスの嫌悪応答をブロックする
ことを示す。(A) C57BL/6Jマウス(n＝10)のDEN単独、AMP単独、DEN＋AMP(0.1お
よび1.0mM)、およびDEN＋GMP(0.1および1.0mM)に対する48時間かけて2つの瓶を
比較して嗜好性応答を調べたものである。AMP(0.1および1.0mM)はDENの0.05、0.
10、0.50、および1.0mMに対しての嫌悪応答を阻害した。^**P<0.001。(B) AMPの
濃度を増加させると(0.1, 1.0, 5.0mM)、投与量−嫌悪性曲線を右側へシフトさ
せる。AMP単独ではその濃度が0.5mMに達するまでは行動応答は見られない。(C)
C57BL/6Jマウス(n＝10)のQUI単独、AMP単独、QUI＋AMP(0.1および0.5mM)、なら
びにQUI＋GMP(0.1および0.5mM)に対する嗜好的応答を示す。AMP(0.1および0.5mM
)はQUIの0.05、0.10、および0.50mMに対する嫌悪応答を阻害する(P<0.001)。GMP
(0.1および0.5mM)はQUIに対する嫌悪応答を阻害しない^**P<0.001。(D) AMPの濃
度を増加させると、投与量−嫌悪性曲線を右側へシフトさせる。(E) 2種類の異
なる濃度の味覚物質±0.1mM AMPに暴露されたC57BL/6Jマウス(n＝10)の嗜好応答
を示す。AMPは苦味物質であるスパルテイン(SPA)の0.05および0.10mM(P<0.001)
：ならびに(−)-エピカテキンの0.05mMおよび0.10mM(P<0.01)に対する嫌悪応答
を阻害する；AMPはNaCl(0.1および0.3M)、HCl(0.01および0.10mM)、ショ糖(SUC)
(5.0および150mM)、もしくは高力価の人工甘味料SC45647(SC)(0.01および0.10mM
)に対する行動応答に変化を与えない。^**P<0.001、^*P<0.01。

【図４】図４A〜Iは、AMPは苦味物質による舌刺激に対してのマウスの舌咽神経応答を
低減させることを示す。(A) 0.1M NH₄Cl、5.0mM DEN、1.0mM スパルテイン(SPA)
、1.0mM ストリキニーネ(STR)、および1.0mM アトロピン(ATR)に対する舌咽神経
応答を示す。(B) 上記の化合物を0.1mM AMPと混合したものに対する舌咽神経応
答を示す。(C) 上記の化合物を0.1mM GMPと混合したものに対する舌咽神経応答
を示す。(D) 一連の濃度のAMP(0.01, 0.1, 1.0, 5.0mM)単独およびQUI(0.1mMお
よび1.0mM)との組み合わせに対する舌咽神経反応(それぞれEおよびF)を示す。(G
)DEN(0.1, 0.5, 1.0, 5.0, および10.0mM)±AMP(0.1および1.0mM)の舌への適用
によって刺激されたマウス(n＝5から7)の舌咽神経から記録された相対的持続性
応答を示す。^**P<0.001；^*P<0.01。(H) QUI(0.1, 0.3, および1.0mM)ならびにそ
れのAMP(0.1および1.0mM)との混合物の舌への適用によって刺激されたマウス(n
＝6から8)の舌咽神経から記録された相対的持続性応答を示す。^**P<0.001。(I)
5.0mM HCl、0.1M NaCl、3.0mM SC45467、0.5M ショ糖(SUC)、1.0mM SPA、または
0.1mM AMPを含むもしくは含まない水の舌への適用によって刺激されたマウス(n
＝4から7)の舌咽神経により記録された相対的持続性応答を示す。^**P<0.001；^*P
<0.01。AMPは1.0mM SPA(P<0.001)および3.0mM SC45467(P<0.01)の相対的持続性
応答を阻害するが、その他の化合物のその応答は阻害しない。^**P<0.001：^*P<0.
01。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/02 Ａ６１Ｐ 1/02 43/00 １０１ 43/00 １０１Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/68 33/68 (72)発明者ミン，ディンアメリカ合衆国 10549 ニューヨーク州マウントキスコ，ボルティスストリート 70 Ｆターム(参考） 2G045 CB01 DA36 DA80 FB01 FB03 JA20 4B047 LB08 LE06 LG35 4C084 AA17 MA01 ZA662 ZB212 ZC422 ZC542 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA66 ZB21 ZC42 ZC54

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】苦味のインヒビターを同定する方法であって、 (i) 味覚レセプターを、苦味物質によるＧタンパク質の活性化に好適な条件下
で、トランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択されるＧタ
ンパク質および苦味物質と接触させ、Ｇタンパク質の活性化レベルを測定し、 (ii) 別の実験において、(i)と本質的に同一の条件で、味覚レセプターを、ト
ランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択されるＧタンパク
質、苦味物質、および試験インヒビターと接触させ、Ｇタンパク質の活性化レベ
ルを測定し、この際、Ｇタンパク質は(i)で用いたものと同一のものを用い、か
つ、試験インヒビターはアデノシン一リン酸の構造類似体とし、そして、 (iii) (i)で測定したＧタンパク質の活性化レベルを、(ii)で測定されたＧタン
パク質の活性化レベルと比較し、この際、試験インヒビターの存在下におけるＧ
タンパク質の活性化レベルの方が低いと、その試験インヒビターの、該味覚物質
に関連する苦味の知覚を阻害する能力と正の相関を有すること、を含む上記方法。
【請求項２】味覚レセプターが味覚受容細胞の抽出物を含む、請求項１記
載の方法。
【請求項３】抽出物が味覚細胞の細胞膜を含む組成物である、請求項２記
載の方法。
【請求項４】上記(i)および(ii)におけるＧタンパク質の活性化レベルが
、トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を検出することにより測定され
る、請求項２記載の方法。
【請求項５】上記(i)および(ii)におけるＧタンパク質の活性化レベルが
、トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を検出することにより測定され
る、請求項３記載の方法。
【請求項６】トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を、Ｇタンパ
ク質をトリプシンに暴露することにより得られるＧタンパク質のフラグメントの
大きさを検出することにより評価する、請求項４記載の方法。
【請求項７】トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を、Ｇタンパ
ク質をトリプシンに暴露することにより得られるＧタンパク質のフラグメントの
大きさを検出することにより評価する、請求項５記載の方法。
【請求項８】味覚レセプターが動物の味覚受容細胞に含まれる、請求項１
記載の方法。
【請求項９】Ｇタンパク質の活性化が、神経応答の増大がＧタンパク質の
活性化と相関する神経記録によって測定される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】Ｇタンパク質の活性化が、苦味物質を含む組成物の消費量
により測定され、該組成物に対する嫌悪応答がＧタンパク質活性化と正の相関を
有する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】ステップ(iii)が、試験インヒビターの存在下の方が活性
化されたＧタンパク質のレベルが低いことを同定し、さらに該試験インヒビター
が甘味の知覚を誘発することを測定する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】苦味のインヒビターを同定する方法であって、 (i) 味覚レセプターを、in vitroで、苦味物質によるＧタンパク質の活性化に
好適な条件下で、トランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選
択されるＧタンパク質を含む溶液および苦味物質と接触させ、Ｇタンパク質の活
性化レベルを測定し、 (ii) 別の実験において、(i)と本質的に同一の条件で、味覚レセプターを、ト
ランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択されるＧタンパク
質、苦味物質、および試験インヒビターと接触させ、Ｇタンパク質の活性化レベ
ルを測定し、この際、Ｇタンパク質は(i)で用いたものと同一のものを用い、か
つ、試験インヒビターはアデノシン一リン酸の構造類似体とし、そして、 (iii) (i)で測定したＧタンパク質の活性化レベルを、(ii)で測定されたＧタン
パク質の活性化レベルを比較し、この際、試験インヒビターの存在下におけるＧ
タンパク質の活性化レベルの方が低いと、その試験インヒビターの、該味覚物質
に関連する苦味の知覚を阻害する能力と正の相関を有すること、を含む上記方法。
【請求項１３】味覚レセプターが味覚受容細胞の抽出物を含む、請求項１
２記載の方法。
【請求項１４】抽出物が味覚細胞の細胞膜を含む組成物である、請求項１
３記載の方法。
【請求項１５】上記(i)および(ii)におけるＧタンパク質の活性化レベル
が、トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を検出することにより測定さ
れる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】上記(i)および(ii)におけるＧタンパク質の活性化レベル
が、トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を検出することにより測定さ
れる、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を、Ｇタン
パク質をトリプシンに暴露することにより得られるＧタンパク質のフラグメント
の大きさを検出することにより評価する請求項１５記載の方法。
【請求項１８】トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を、Ｇタン
パク質をトリプシンに暴露することにより得られるＧタンパク質のフラグメント
の大きさを検出することにより評価する請求項１６記載の方法。
【請求項１９】苦味のインヒビターを同定する方法であって、 (i) 味覚レセプターを、in vitroで苦味物質によるＧタンパク質の活性化に好
適な条件下で、トランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択
されるＧタンパク質を含む溶液および苦味物質と接触させ、Ｇタンパク質の活性
化レベルを測定し、 (ii) 別の実験において、(i)と本質的に同一の条件で、味覚レセプターを、ト
ランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択されるＧタンパク
質、苦味物質、および試験インヒビターと接触させ、Ｇタンパク質の活性化レベ
ルを測定し、この際、Ｇタンパク質は(i)で用いたものと同一のものを用い、か
つ、試験インヒビターはペプチド以外のものとし、そして、 (iii) (i)で測定したＧタンパク質の活性化レベルを、(ii)で測定されたＧタン
パク質の活性化レベルを比較し、この際、試験インヒビターの存在下におけるＧ
タンパク質の活性化レベルの方が低いと、その試験インヒビターの、該味覚物質
に関連する苦味の知覚を阻害する能力と正の相関を有すること、を含む上記方法。
【請求項２０】味覚レセプターが味覚受容細胞の抽出物を含む、請求項１
９記載の方法。
【請求項２１】抽出物が味覚細胞の細胞膜を含む組成物である、請求項２
０の方法。
【請求項２２】上記(i)および(ii)におけるＧタンパク質の活性化レベル
が、トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を検出することにより測定さ
れる、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】上記(i)および(ii)におけるＧタンパク質の活性化レベル
が、トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を検出することにより測定さ
れる、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を、Ｇタン
パク質をトリプシンに暴露することにより得られるＧタンパク質のフラグメント
の大きさを検出することにより評価する請求項２２記載の方法。
【請求項２５】トリプシン消化に対するＧタンパク質の感受性を、Ｇタン
パク質をトリプシンに暴露することにより得られるＧタンパク質のフラグメント
の大きさを検出することにより評価する請求項２３記載の方法。
【請求項２６】 in vivoで苦味のインヒビターを同定する方法であって、
(i) 味覚レセプターを、トランスデューシンおよびガストデューシンからなる
群から選択されるＧタンパク質および苦味物質と、苦味物質によるＧタンパク質
の活性化に好適な条件下で接触させ、Ｇタンパク質の活性化レベルを測定し、 (ii) 別の実験において、(i)と本質的に同一の条件で、味覚レセプターを、ト
ランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択されるＧタンパク
質、苦味物質、および試験インヒビターと接触させ、Ｇタンパク質の活性化レベ
ルを測定し、この際、Ｇタンパク質は(i)で用いたものと同一のものを用い、そ
して、 (iii) (i)で測定したＧタンパク質の活性化レベルを、(ii)で測定されたＧタン
パク質の活性化レベルを比較し、この際、試験インヒビターの存在下におけるＧ
タンパク質の活性化レベルの方が低いと、その試験インヒビターの、該味覚物質
に関連する苦味の知覚を阻害する能力と正の相関を有すること、を含む上記方法。
【請求項２７】 in vivoで苦味のインヒビターを同定する方法であって、
(i) 試験動物に、(a) 苦味物質を含む組成物、または(b) 苦味物質ならびに試
験インヒビターを含む組成物、のいずれかを摂取するよう選択を与え、そして、
(ii)(a)または(b)における組成物の摂取量を比較し、この際、(b)の組成物の摂
取の方が大きいと、その試験インヒビターの、該味覚物質に関連する苦味の知覚
を阻害する能力と正の相関を有すること、を含む上記方法。
【請求項２８】試験インヒビターが苦味物質によりＧタンパク質の活性化
を阻害することが分かっているものである、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】試験インヒビターが甘味の知覚を誘発する、請求項２７記
載の方法。
【請求項３０】有効量の苦味インヒビターを被験体に投与することを含む
、被験体の味覚組織と苦味物質を接触させることにより、苦味を阻害する方法。
【請求項３１】苦味インヒビターがアデノシン5'-一リン酸である、請求
項３０記載の方法。
【請求項３２】苦味インヒビターがチミジン5'-一リン酸である、請求項
３０記載の方法。
【請求項３３】苦味インヒビターがアデノシン5'-二リン酸である、請求
項３０記載の方法。
【請求項３４】苦味インヒビターがアデノシン3'--一リン酸である、請求
項３０記載の方法。
【請求項３５】苦味インヒビターがアデノシン5'コハク酸である、請求項
３０記載の方法。
【請求項３６】苦味インヒビターがアデノシン5'-三リン酸である、請求
項３０記載の方法。
【請求項３７】苦味インヒビターがアデノシン2'-一リン酸である、請求
項３０記載の方法。
【請求項３８】苦味インヒビターが5'-シチジル酸である、請求項３０記
載の方法。
【請求項３９】苦味インヒビターがイノシン酸である、請求項３０記載の
方法。
【請求項４０】有効量の苦味インヒビターを組成物に組み込むことを含む
、組成物の苦味を阻害する方法。
【請求項４１】苦味インヒビターがアデノシン5-'一リン酸である、請求
項４０記載の方法。
【請求項４２】苦味インヒビターがチミジン5'-一リン酸である、請求項
４０記載の方法。
【請求項４３】苦味インヒビターがアデノシン5'-二リン酸である、請求
項４０記載の方法。
【請求項４４】苦味インヒビターがアデノシン3'-一リン酸である、請求
項４０記載の方法。
【請求項４５】苦味インヒビターがアデノシン5'-コハク酸である、請求
項４０記載の方法。
【請求項４６】苦味インヒビターがアデノシン5'-三リン酸である、請求
項４０記載の方法。
【請求項４７】苦味インヒビターがアデノシン2'-一リン酸である、請求
項４０記載の方法。
【請求項４８】苦味インヒビターが5'-シチジル酸である、請求項４０記
載の方法。
【請求項４９】苦味インヒビターがイノシン酸である、請求項４０記載の
方法。
【請求項５０】甘味を誘発することに加えて、苦味インヒビターとして作
用する成分を含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体により甘味知覚
を生じさせる方法。
【請求項５１】苦味知覚を阻害する濃度で苦味インヒビターが存在する、
苦味物質と苦味インヒビターを含む組成物。
【請求項５２】苦味インヒビターがアデノシン5'-一リン酸である、請求
項５１記載の組成物。
【請求項５３】苦味インヒビターがチミジン5'-一リン酸である、請求項
５１記載の組成物。
【請求項５４】苦味インヒビターがアデノシン5'-二リン酸である、請求
項５１記載の組成物。
【請求項５５】苦味インヒビターがアデノシン3'-一リン酸である、請求
項５１記載の組成物。
【請求項５６】苦味インヒビターがアデノシン5'-コハク酸である、請求
項５１記載の組成物。
【請求項５７】苦味インヒビターがアデノシン5'-三リン酸である、請求
項５１記載の組成物。
【請求項５８】苦味インヒビターがアデノシン2'-一リン酸である、請求
項５１記載の組成物。
【請求項５９】苦味インヒビターが5'-シチジル酸である、請求項５１記
載の組成物。
【請求項６０】苦味インヒビターがイノシン酸である、請求項５１記載の
組成物。
【請求項６１】苦味知覚を阻害し、かつ甘味知覚を誘発する濃度で苦味イ
ンヒビターが存在する、苦味物質と苦味インヒビターを含む組成物。
【請求項６２】甘味知覚を誘発する濃度で苦味インヒビターが存在する、
苦味インヒビターを含む組成物。
【請求項６３】苦味物質を同定する方法であって、 (i) 味覚レセプターを、該試験味覚物質によるＧタンパク質の活性化に好適な
条件下で、トランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択され
るＧタンパク質および試験味覚物質と接触させ、Ｇタンパク質の活性化レベルを
測定し、 (ii) 別の実験において、(i)と本質的に同一の条件で、味覚レセプターを、ト
ランスデューシンおよびガストデューシンからなる群から選択されるＧタンパク
質、試験味覚物質、および苦味インヒビターと接触させ、Ｇタンパク質の活性化
レベルを測定し、この際、Ｇタンパク質は(i)で用いたものと同一のものを用い
、そして、 (iii) (i)で測定したＧタンパク質の活性化レベルを、(ii)で測定したＧタンパ
ク質の活性化レベルと比較し、この際、苦味インヒビターの存在下におけるＧタ
ンパク質の活性化レベルの方が低いと、該試験味覚物質の、苦味知覚を誘発する
能力と正の相関を有すること、を含む上記方法。