JPWO2019230878A1 - 蛍光観察装置及び蛍光観察方法 - Google Patents

Abstract

本技術の一形態に係る蛍光観察装置は、ステージと、励起部と、分光イメージング部とを具備する。前記ステージは、蛍光染色された病理標本を支持可能に構成される。前記励起部は、それぞれ異なる波長で構成された異軸かつ一軸方向に平行な複数のライン照明を、前記ステージ上の前記病理標本に照射する。前記分光イメージング部は、前記複数のライン照明によって励起された蛍光を個々に受光可能な少なくとも１つの撮像素子を有する。【選択図】図２

Description

本技術は、例えば、病理画像の診断に用いられる蛍光観察装置及び蛍光観察方法に関する。

定量性や多色性に優れた手法として、蛍光染色による病理画像診断法が提案されている（例えば特許文献１参照）。蛍光手法によると、着色染色に比べて多重化が容易で、詳細な診断情報が得られる点で有利である。病理診断以外の蛍光イメージングにおいても、色数の増加は、サンプルに発現するさまざまな抗原を一度に調べることを可能とする。

一般の蛍光撮影法は、色素の吸収波長（励起波長）の励起光を照射し、それによって発光する色素スペクトルをバンドパスフィルタによって選択的に取り込む。複数色ある場合には、色素によって吸収波長（励起波長）が様々であるため、色素ごとにフィルタを切り替えて撮影する方法が採られる。しかしながら、色素の吸収スペクトルも発光スペクトルもブロードで重なりがあるため、複数色染色した場合には、一つの励起波長において、複数の色素を励起してしまう。さらにバンドパスフィルタにも隣接する色素の蛍光が漏れ込み、混色が生じる。

一方、時分割的に励起光の波長及び検出する蛍光の波長を切り替えて撮影する方法が知られている（例えば非特許文献１）。しかしながら、この方法は、色が増えると、リニアに撮影時間も増加するという問題がある。

特許第４４５２８５０号公報

Edward C. Stack, "Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis", Methods 70 (2014) 46-58

以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、観察対象の色素数の増加に伴う撮影時間の増加を抑えることができる蛍光観察装置及び蛍光観察方法を提供することにある。

本技術の一形態に係る蛍光観察装置は、ステージと、励起部と、分光イメージング部とを具備する。
前記ステージは、蛍光染色された病理標本を支持可能に構成される。
前記励起部は、それぞれ異なる波長で構成された異軸かつ一軸方向に平行な複数のライン照明を、前記ステージ上の前記病理標本に照射する。
前記分光イメージング部は、前記複数のライン照明によって励起された蛍光を個々に受光可能な少なくとも１つの撮像素子を有する。

これにより、観察対象の色素数の増加に伴う撮影時間の増加を抑えることができる。

前記励起部は、前記複数のライン照明として、それぞれ異なる波長の組み合わせで構成された複数のライン照明を前記病理標本に照射するように構成されてもよい。

前記分光イメージング部は、前記複数のライン照明によって励起された蛍光を分光する波長分散素子をさらに有してもよい。

前記分光イメージング部は、前記複数のライン照明によって励起された蛍光がそれぞれ通過可能な複数のスリット部を有する観測スリットをさらに有してもよい。

前記蛍光観察装置は、前記ステージに対して前記複数のライン照明を前記一軸方向に垂直な方向に走査する走査機構をさらに具備してもよい。

前記蛍光観察装置は、前記複数のライン照明の波長と前記撮像素子で受光された蛍光との相関を表す分光データを記憶する記憶部を有する処理ユニットをさらに具備してもよい。

前記処理ユニットは、前記記憶部に記憶された分光データと、前記複数のライン照明の間隔とに基づいて、前記病理標本の蛍光画像を形成する画像形成部をさらに有してもよい。

前記画像形成部は、前記蛍光画像として、前記複数のライン照明の間隔に相当する値で前記撮像素子の検出座標が補正された画像を形成するように構成されてもよい。

前記処理ユニットは、前記記憶部に記憶された分光データを校正するデータ校正部をさらに有してもよい。

前記記憶部は、前記病理標本に関する自家蛍光の標準スペクトル及び前記病理標本を染色する色素単体の標準スペクトルをあらかじめ記憶し、前記画像形成部は、前記自家蛍光及び前記色素単体の標準スペクトルを基に、前記分光データの成分分布を出力するように構成されてもよい。

前記撮像素子は、前記観測スリットを通過した蛍光をそれぞれ受光可能な複数の撮像素子を含んでもよい。

前記蛍光観察装置は、前記ステージ上の前記病理標本を照明する光源と、前記病理標本の非蛍光画像を取得する撮像部とを有する非蛍光観察部をさらに具備してもよい。

前記蛍光観察装置は、複数のライン照明ごとに、前記複数のライン照明によって励起された蛍光スペクトルを分けて表示する表示部をさらに具備してもよい。

前記表示部は、前記複数のライン照明の波長と出力とを設定可能な操作領域を有してもよい。

前記表示部は、前記蛍光スペクトルの検出波長範囲を表示する表示領域を有してもよい。

本技術の一形態に係る蛍光観察方法は、
それぞれ異なる波長で構成された異軸かつ一軸方向に平行な複数のライン照明を、ステージ上の病理標本に照射し、
前記複数のライン照明によって励起された蛍光を個々に受光する。

前記蛍光観察方法は、さらに、前記ステージに対して前記複数のライン照明を前記一軸方向に垂直な方向に走査してもよい。

前記複数のライン照明として、それぞれ異なる波長の組み合わせで構成された複数のライン照明が用いられてもよい。

以上のように、本技術によれば、観察対象の色素数の増加に伴う撮影時間の増加を抑えることができる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。

本技術の一実施形態に係る蛍光観察装置の概略ブロック図である。 上記蛍光観察装置における光学系の一例を示す図である。 観察対象である病理標本の概略図である。 上記観察対象に照射されるライン照明の様子を示す概略図である。 上記蛍光観察装置における撮像素子が単一のイメージセンサで構成される場合の分光データの取得方法を説明する図である。 図５で取得される分光データの波長特性を示す図である。 上記撮像素子が複数のイメージセンサで構成される場合の分光データの取得方法を説明する図である。 上記観察対象に照射されるライン照明の走査方法を説明する概念図である。 複数のライン照明で取得される３次元データ（Ｘ、Ｙ、λ）を説明する概念図である。 上記蛍光観察装置における励起部の波長の構成例を示す図である。 上記蛍光観察装置における分光イメージング部の他の構成例を示す概略図である。 上記蛍光観察装置における処理ユニットにおいて実行される処理の手順の一例を示すフローチャートである。 上記蛍光観察装置における表示部の画面を説明する図である。 上記表示部における励起部の設定領域の画面構成の一例を示す図である 上記表示部における一のライン照明由来の蛍光スペクトルの検出設定領域の画面構成の一例を示す図である。 上記表示部における他のライン照明由来の蛍光スペクトルの検出設定領域の画面構成の一例を示す図である。 蛍光スペクトルデータと表示部に表示される蛍光画像との関係を概念的に示す模式図である。 上記処理ユニットにおいて実行される処理の手順の一変形例を示すフローチャートである。 上記処理ユニットにおいて実行される処理の手順の他の変形例を示すフローチャートである。 上記蛍光観察装置の一変形例を示す概略ブロック図である。 上記蛍光観察装置の他の変形例を示す概略ブロック図である。

以下、本技術に係る実施形態を、図面を参照しながら説明する。

図１は、本技術の一実施形態に係る蛍光観察装置の概略ブロック図、図２は、蛍光観察装置における光学系の一例を示す図である。

［全体構成］
本実施形態の蛍光観察装置１００は、観察ユニット１を備える。観察ユニット１は、異軸平行に配置された波長の異なる複数のライン照明を病理標本（病理サンプル）に照射する励起部１０と、病理標本を支持するステージ２０と、ライン状に励起された病理標本の蛍光スペクトル（分光データ）を取得する分光イメージング部３０とを有する。

ここで、異軸平行とは、複数のライン照明が異軸かつ平行であることをいう。異軸とは、同軸上にないことをいい、軸間の距離は特に限定されない。平行とは、厳密な意味での平行に限られず、ほぼ平行である状態も含む。例えば、レンズ等の光学系由来のディストーションや製造公差による平行状態からの逸脱があってもよく、この場合も平行とみなす。

蛍光観察装置１００は、処理ユニット２をさらに備える。処理ユニット２は、観察ユニット１によって取得された病理標本（以下、サンプルＳともいう）の蛍光スペクトルに基づいて、典型的には、病理標本の画像を形成し、あるいは蛍光スペクトルの分布を出力する。ここでいう画像とは、そのスペクトルを構成する色素やサンプル由来の自家蛍光などの構成比率、波形からＲＧＢ（赤緑青）カラーに変換されたもの、特定の波長帯の輝度分布などをいう。

ステージ２０に対して、対物レンズ４４などの観察光学系４０を介して、励起部１０と分光イメージング部３０が接続されている。観察光学系４０はフォーカス機構６０によって最適な焦点に追従する機能を持っている。観察光学系４０には、暗視野観察、明視野観察などの非蛍光観察部７０が接続されてもよい。

蛍光観察装置１００は、励起部（ＬＤやシャッターの制御）、走査機構であるＸＹステージ、分光イメージング部（カメラ）、フォーカス機構（検出器とＺステージ）、非蛍光観察部（カメラ）などを制御する制御部８０と接続されていてもよい。

励起部１０は複数の励起波長Ｅｘ１，Ｅｘ２，・・・の光を出力することができる複数の光源Ｌ１，Ｌ２，・・・を備える。複数の光源は、典型的には、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザダイオード（ＬＤ）、水銀ランプなどで構成され、それぞれの光がライン照明化され、ステージ２０のサンプルＳに照射される。

サンプルＳは、典型的には、図３に示すような組織切片等の観察対象Ｓａを含むスライドで構成されるが、勿論それ以外であってもよい。サンプルＳ（観察対象Ｓａ）は、複数の蛍光色素によって染色されている。観察ユニット１は、サンプルＳを所望の倍率に拡大して観察する。図３のＡの部分を拡大すると、照明部は図４に示すように、ライン照明が複数（図示の例では２つ（Ｅｘ１，Ｅｘ２））配置されており、それぞれの照明エリアに重なるように分光イメージング部３０の撮影エリアＲ１，Ｒ２が配置される。２つのライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２はそれぞれＺ軸方向に平行であり、Ｙ軸方向に所定の距離（Δｙ）離れて配置される。

撮影エリアＲ１，Ｒ２は、分光イメージング部３０における観測スリット３１（図２）の各スリット部にそれぞれ対応する。つまり、分光イメージング部３０のスリット部もライン照明と同数配置される。図４では照明のライン幅の方がスリット幅よりも広くなっているが、これらの大小関係はどちらであってもよい。照明のライン幅がスリット幅よりも大きい場合、分光イメージング部３０に対する励起部１０の位置合わせマージンを大きくすることができる。

１つめのライン照明Ｅｘ１を構成する波長と、２つめのライン照明Ｅｘ２を構成する波長は相互に異なっている。これらライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２により励起されるライン状の蛍光は、観察光学系４０を介して分光イメージング部３０において観測される。

分光イメージング部３０は、複数のライン照明によって励起された蛍光がそれぞれ通過可能な複数のスリット部を有する観測スリット３１と、観測スリット３１を通過した蛍光を個々に受光可能な少なくとも１つの撮像素子３２とを有する。撮像素子３２には、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）などの２次元イメージャが採用される。観測スリット３１を光路上に配置することで、それぞれのラインで励起された蛍光スペクトルを重なりなく検出することができる。

分光イメージング部３０は、それぞれのライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２から、撮像素子３２の１方向（例えば垂直方向）の画素アレイを波長のチャンネルとして利用した蛍光の分光データ（ｘ、λ）を取得する。得られた分光データ（ｘ、λ）は、それぞれどの励起波長から励起された分光データであるかが紐づけられた状態で処理ユニット２に記録される。

処理ユニット２は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory）等のコンピュータに用いられるハードウェア要素および必要なソフトウェアにより実現され得る。ＣＰＵに代えて、またはこれに加えて、ＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）等のＰＬＤ(Programmable Logic Device)、あるいは、ＤＳＰ（Digital Signal Processor）、その他ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等が用いられてもよい。

処理ユニット２は、複数のライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２の波長と撮像素子３２で受光された蛍光との相関を表す分光データを記憶する記憶部２１を有する。記憶部２１には、不揮発性半導体メモリ、ハードディスクドライブ等の記憶装置が用いられ、サンプルＳに関する自家蛍光の標準スペクトル、サンプルＳを染色する色素単体の標準スペクトルがあらかじめ格納されている。撮像素子３２で受光した分光データ（ｘ、λ）は、例えば、図５及び図６に示すように取得されて、記憶部２１に記憶される。本実施形態では、サンプルＳの自家蛍光及び色素単体の標準スペクトルを記憶する記憶部と撮像素子３２で取得されるサンプルＳの分光データ（測定スペクトル）を記憶する記憶部とが共通の記憶部２１で構成されるが、これに限られず、別々の記憶部で構成されてもよい。

図５及び図６は、撮像素子３２が観測スリット３１を通過した蛍光を共通に受光する単一のイメージセンサで構成される場合の分光データの取得方法を説明する図である。この例において、ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２によって励起された蛍光スペクトルＦｓ１，Ｆｓ２は、分光光学系（後述）を介して、最終的にΔｙ（図４参照）に比例する量だけずれた状態で撮像素子３２の受光面に結像される。

図５に示すように、ライン照明Ｅｘ１から得られる情報はRow_a，Row_bとして、ライン照明Ｅｘ２から得られる情報はRow_c、Row_dとして、それぞれ記録される。これらの領域以外のデータは読み出さない。それによって撮像素子３２のフレームレートはフルフレームで読み出す場合の、Row_full／(Row_b−Row_a＋Row_d−Row_c)倍早くすること出来る。

図２に示すように、光路の途中にダイクロイックミラー４２やバンドパスフィルタ４５が挿入され、励起光（Ｅｘ１，Ｅｘ２）が撮像素子３２に到達しないようにする。この場合、撮像素子３２上に結像する蛍光スペクトルＦｓ１には間欠部ＩＦが生じる（図５、図６参照）。このような間欠部ＩＦも読出し領域から除外することによって、さらにフレームレートを向上させることができる。

撮像素子３２は、図２に示すように、観測スリット３１を通過した蛍光をそれぞれ受光可能な複数の撮像素子３２ａ，３２ｂを含んでもよい。この場合、各ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２によって励起される蛍光スペクトルＦｓ１，Ｆｓ２は、撮像素子３２ａ，３２ｂ上に図７に示すように取得され、記憶部２１に励起光と紐づけて記憶される。

ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２は単一の波長で構成される場合に限られず、それぞれが複数の波長で構成されてもよい。ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２がそれぞれ複数の波長で構成される場合、これらで励起される蛍光もそれぞれ複数のスペクトルを含む。この場合、分光イメージング部３０は、当該蛍光を励起波長に由来するスペクトルに分離するための波長分散素子を有する。波長分散素子は、回折格子やプリズムなどで構成され、典型的には、観測スリット３１と撮像素子３２との間の光路上に配置される。

観測ユニット１はさらに、ステージ２０に対して複数のライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２をＹ軸方向、つまり、各ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２の配列方向に走査する走査機構５０を備える。走査機構５０を用いることで、サンプルＳ（観察対象Ｓａ）上において空間的にΔｙだけ離れた、それぞれ異なる励起波長で励起された色素スペクトル（蛍光スペクトル）をＹ軸方向に連続的に記録することができる。この場合、例えば図８に示すように撮影領域ＲｓがＸ軸方向に複数に分割され、Ｙ軸方向にサンプルＳをスキャンし、その後、Ｘ軸方向に移動し、さらにＹ軸方向へのスキャンを行うといった動作が繰り返される。１回のスキャンで数種の励起波長によって励起されたサンプル由来の分光スペクトルイメージを撮影することができる。

走査機構５０は、典型的には、ステージ２０がＹ軸方向に走査されるが、光学系の途中に配置されたガルバノミラーによって複数のライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２がＹ軸方向に走査されてもよい。最終的に、図９に示すような（Ｘ、Ｙ、λ）の３次元データが複数のライン照明Ｅｘ１、Ｅｘ２についてそれぞれ取得される。各ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２由来の３次元データはＹ軸についてΔｙだけ座標がシフトしたデータになるので、あらかじめ記録されたΔｙ、または撮像素子３２の出力から計算されるΔｙの値に基づいて、補正され出力される。

ここまでの例では励起光としてのライン照明は２本で構成されたが、これに限定されず、３本、４本あるいは５本以上であってもよい。またそれぞれのライン照明は、色分離性能がなるべく劣化しないように選択された複数の励起波長を含んでもよい。またライン照明が１本であっても、複数の励起波長から構成される励起光源で、かつそれぞれの励起波長と、撮像素子で所得されるRowデータとを紐づけて記録すれば、異軸平行ほどの分離能は得られないが、多色スペクトルを得ることができる。例えば図１０に示すような構成がとられてもよい。

［観測ユニット］
続いて、図２を参照して観測ユニット１の詳細について説明する。ここでは、図１０における構成例２で観測ユニット１が構成される例について説明する。

励起部１０は、複数（本例では４つ）の励起光源Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４を有する。各励起光源Ｌ１〜Ｌ４は、波長がそれぞれ４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ及び６４５ｎｍのレーザ光を出力するレーザ光源で構成される。

励起部１０は、各励起光源Ｌ１〜Ｌ４に対応するように複数のコリメータレンズ１１及びレーザラインフィルタ１２と、ダイクロイックミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃと、ホモジナイザ１４と、コンデンサレンズ１５と、入射スリット１６とをさらに有する。

励起光源Ｌ１から出射されるレーザ光と励起光源Ｌ３から出射されるレーザ光は、それぞれコリメータレンズ１１によって平行光になった後、各々の波長帯域の裾野をカットするためのレーザラインフィルタ１２を透過し、ダイクロイックミラー１３ａによって同軸にされる。同軸化された２つのレーザ光は、さらに、ライン照明Ｅｘ１となるべくフライアイレンズなどのホモジナイザ１４とコンデンサレンズ１５によってビーム成形される。

励起光源Ｌ２から出射されるレーザ光と励起光源Ｌ４から出射されるレーザ光も同様にダイクロイックミラー１３ｂ，１３ｃによって同軸化され、ライン照明Ｅｘ１とは異軸のライン照明Ｅｘ２となるようにライン照明化される。ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２は、各々が通過可能な複数のスリット部を有する入射スリット１６（スリット共役）においてΔｙだけ離れた異軸ライン照明（１次像）を形成する。

この１次像は、観察光学系４０を介してステージ２０上のサンプルＳに照射される。観察光学系４０は、コンデンサレンズ４１と、ダイクロイックミラー４２，４３と、対物レンズ４４と、バンドパスフィルタ４５と、コンデンサレンズ４６とを有する。ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２は、対物レンズ４４と対になったコンデンサレンズ４１で平行光にされ、ダイクロイックミラー４２，４３を反射して対物レンズ４４を透過し、サンプルＳに照射される。

サンプルＳ面においては図４のような照明が形成される。これらの照明によって励起された蛍光は、対物レンズ４４によって集光され、ダイクロイックミラー４３を反射し、ダイクロイックミラー４２及び励起光をカットするバンドパスフィルタ４５を透過し、コンデンサレンズ４６で再び集光されて、分光イメージング部３０へ入射する。

分光イメージング部３０は、観測スリット３１と、撮像素子３２（３２ａ，３２ｂ）と、第１プリズム３３と、ミラー３４と、回折格子３５（波長分散素子）と、第２プリズム３６とを有する。

観測スリット３１は、コンデンサレンズ４６の集光点に配置され、励起ライン数と同じ数のスリット部を有する。観測スリット３１を通過した２つの励起ライン由来の蛍光スペクトルは、第１プリズム３３で分離され、それぞれミラー３４を介して回折格子３５の格子面で反射することにより、励起波長各々の蛍光スペクトルにさらに分離される。このようにして分離された４つの蛍光スペクトルは、ミラー３４及び第２プリズム３６を介して撮像素子３２ａ，３２ｂに入射し、分光データとして（ｘ、λ）情報に展開される。

撮像素子３２ａ，３２ｂの画素サイズ（ｎｍ／Pixel）は特に限定されず、例えば、２ｎｍ以上２０ｎｍ以下に設定される。この分散値は、回折格子３５のピッチや光学的に実現しても良いし、撮像素子３２ａ，３２ｂのハードウェアビニングをつかって実現しても良い。

ステージ２０及び走査機構５０は、Ｘ−Ｙステージを構成し、サンプルＳの蛍光画像を取得するため、サンプルＳをＸ軸方向及びＹ軸方向へ移動させる。ＷＳＩ（Whole slide imaging）では、Ｙ軸方向にサンプルＳをスキャンし、その後、Ｘ軸方向に移動し、さらにＹ軸方向へのスキャンを行うといった動作が繰り返される（図８参照）。

非蛍光観察部７０は、光源７１、ダイクロイックミラー４３、対物レンズ４４、コンデンサレンズ７２、撮像素子７３などにより構成される。非蛍光観察系においては、図２では、暗視野照明による観察系を示している。

光源７１は、ステージ２０の下方に配置され、ステージ２０上のサンプルＳに対して、ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２とは反対側から照明光を照射する。暗視野照明の場合、光源７１は、対物レンズ４４のＮＡ（開口数）の外側から照明し、サンプルＳで回折した光（暗視野像）を対物レンズ４４、ダイクロイックミラー４３及びコンデンサレンズ７２を介して撮像素子７３で撮影する。暗視野照明を用いることで、蛍光染色サンプルのような一見透明なサンプルであってもコントラストを付けて観察することができる。

なお、この暗視野像を蛍光と同時に観察して、リアルタイムのフォーカスに使ってもよい。この場合、照明波長は、蛍光観察に影響のない波長を選択すればよい。非蛍光観察部７０は、暗視野画像を取得する観察系に限られず、明視野画像、位相差画像、位相像、インラインホログラム（In-line hologram）画像などの非蛍光画像を取得可能な観察系で構成されてもよい。例えば、非蛍光画像の取得方法として、シュリーレン法、位相差コントラスト法、偏光観察法、落射照明法などの種々の観察法が採用可能である。照明用光源の位置もステージの下方に限られず、ステージの上方や対物レンズの周りにあってもよい。また、リアルタイムでフォーカス制御を行う方式だけでなく、あらかじめフォーカス座標（Ｚ座標）を記録しておくプレフォーカスマップ方式等の他の方式が採用されてもよい。

図１１は、分光イメージング部の他の構成例を示す概略図である。同図に示す分光イメージング部１３０は、単一の撮像素子３２を有する。励起ライン数と一致したスリット部を有する観測スリット３１を抜けたそれぞれの蛍光は、リレー光学系（第１プリズム３３、ミラー３４，３７）とその途中に配置された波長分散素子（プリズムなど）３８を介して撮像素子３２上へ再結像し、（ｘ、λ）データへと展開される（図５参照）。このとき励起光間隔Δｙをpixelに換算した値は、分散したスペクトルが、撮像素子３２上で重ならないように決定される。

［処理ユニット］
撮像素子３２（３２ａ，３２ｂ）で取得された蛍光スペクトルは、処理ユニット２に出力される。処理ユニット２は、記憶部２１と、記憶部２１に記憶された分光データを校正するデータ校正部２２と、当該分光データと複数のライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２の間隔Δｙとに基づいて、サンプルＳの蛍光画像を形成する画像形成部２３をさらに有する。

図１２は、処理ユニット２において実行される処理の手順の一例を示すフローチャートである。

記憶部２１は、分光イメージング部３０で取得した分光データ（蛍光スペクトルＦｓ１，Ｆｓ２（図５，７参照））を記憶する。（ステップ１０１）。記憶部２１には、サンプルＳに関する自家蛍光や色素単体の標準スペクトルがあらかじめ格納されている。

記憶部２１は、撮像素子３２の波長方向の画素アレイから注目波長領域のみを抽出することによって、記録フレームレートを向上させる。注目波長領域とは、例えば、可視光の範囲（３８０ｎｍ〜７８０ｎｍ）、あるいは、サンプルを染色した色素の発光波長によって決まる波長範囲に相当する。

注目波長領域以外の波長領域としては、例えば、不要な波長の光があるセンサ領域や明らかに信号のないセンサ領域、光路途中にあるダイクロイックミラー４２やバンドパスフィルタ４５でカットされるべき励起波長の領域などが挙げられる。さらに、そのセンサ上の注目波長領域は、ライン照明の状況によって切り替えられてもよい。例えば、ライン照明に使われる励起波長が少ないときは、センサ上の波長領域も制限され、制限した分、フレームレートを高速化させることができる。

データ校正部２２は、記憶部２１に記憶された分光データを、ピクセルデータ（ｘ、λ）から波長に換算し、全てのスペクトルデータが共通の離散値を持った波長単位（［ｎｍ］、［μｍ］など）に補完されて出力されるよう校正する（ステップ１０２）。

ピクセルデータ（ｘ、λ）は、撮像素子３２のピクセル列に綺麗に整列すると限られず、僅かな傾きや光学系のディストーションによって歪められている場合がある。したがって、例えば波長既知の光源を用いてピクセルから波長単位に変換すると、すべてのｘ座標において異なる波長（ｎｍ値）に換算されてしまう。この状態ではデータの扱いが煩雑であるため、データは補完法（例えば、線形補完やスプライン補完）によって整数に整列されたデータに変換される（ステップ１０２）。

さらに、ライン照明の長軸方向（Ｘ軸方向）の感度ムラが発生する場合がある。感度ムラは照明のムラや、スリット幅のバラつきによって発生し、撮影画像の輝度ムラに繋がる。そこで、データ校正部２２は、このムラを解消するため、任意の光源とその代表スペクトル（平均スペクトルや光源の分光放射輝度）を用いて、均一化して出力する（ステップ１０３）。均一化することによって機差がなくなり、スペクトルの波形解析において、個々の成分スペクトルを毎回測定する手間を削減することができる。さらに、感度校正された輝度値から蛍光色素数の概算定量値も出力することができる。

校正されたスペクトルに分光放射輝度［Ｗ／（ｓｒ・ｍ^２・ｎｍ）］を採用すれば、各波長に相当する撮像素子３２の感度も補正される。このように、基準となるスペクトルに校正することによって、色分離計算に用いる基準スペクトルを機器毎に測定する必要がなくなる。同じロットで安定的な色素であれば、１度撮影すれば流用が可能になる。さらに、色素１分子あたりの蛍光スペクトル強度が予め与えられていれば、感度校正された輝度値から換算した蛍光色素分子数の概算値を出力できる。この値は自家蛍光成分も分離されており、定量性が高い。

以上の処理は、Ｙ軸方向に走査されるサンプルＳにおけるライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２による照明範囲について同様に実行される。これにより、サンプルＳの全範囲について各蛍光スペクトルの分光データ（ｘ、ｙ、λ）が得られる。得られた分光データ（ｘ、ｙ、λ）は、記憶部２１に保存される。

画像形成部２３は、記憶部２１に記憶された分光データ（あるいはデータ校正部２２によって校正された分光データ）と、励起ラインＥｘ１，Ｅｘ２の軸間距離（Δｙ）に相当する間隔とに基づいて、サンプルＳの蛍光画像を形成する（ステップ１０４）。本実施形態において画像形成部２３は、蛍光画像として、複数のライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２の間隔（Δｙ）に相当する値で撮像素子３２の検出座標が補正された画像を形成する。

各ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２由来の３次元データは、Ｙ軸についてΔｙだけ座標がシフトしたデータになるので、あらかじめ記録されたΔｙ、または撮像素子３２の出力から計算されるΔｙの値に基づいて補正され、出力される。ここでは、各ライン照明Ｅｘ１、Ｅｘ２由来の３次元データが同一座標上のデータとなるように、撮像素子３２での検出座標の相違が補正される。

画像形成部２３は、撮影した画像を繋げて１つの大きな画像（ＷＳＩ）にするための処理（スティッチング）を実行する（ステップ１０５）。これにより、多重化されたサンプルＳ（観察対象Ｓａ）に関する病理画像を取得することができる。形成された蛍光画像は、表示部３に出力される（ステップ１０６）

さらに画像形成部２３は、記憶部２１にあらかじめ記憶されたサンプルＳの自家蛍光及び色素単体の各標準スペクトルを基に、撮影された分光データ（測定スペクトル）からサンプルＳの自家蛍光及び色素の成分分布を分離計算する。演算方法としては、最小二乗法、重み付け最小二乗法などが採用可能であり、撮影された分光データが上記標準スペクトルの線形和になるような係数を計算する。算出された係数の分布は、記憶部２１に記憶されるとともに、表示部３へ出力されて画像として表示される（ステップ１０７，１０８）。

［まとめ］
以上のように本実施形態によれば、観察対象の色素数が増えても撮影時間が増加しない多重蛍光スキャナを提供することができる。

つまり、多重蛍光スキャナで取り込まれるデータは(ｘ、ｙ、λ)の３次元データになる。したがって、面撮影の場合、一度にすべてのデータ（ｘ、ｙ、λ）を取得することができないため、λを時系列的に切り替えて撮影する必要がある。さらに、面光源（ｘ、ｙ）を照射して励起する場合、物理的な制約から時系列的に励起波長を切り替える方法が必須になる。これらの課題を解決するため、本実施形態では異軸平行に配置された波長の異なる複数のライン照明で蛍光を励起する。ライン状に励起された蛍光スペクトルは、それぞれ、（ｘ、λ）に分光され、２次元のセンサ（撮像素子）によって１度に撮影する。この構成によって、時間ではなく、空間的に励起波長を分離することが出来るので、観察対象の色素数が増えても撮影時間が増加することがない。

この方法は２次元データを取得するのに１次元のスキャン（Ｙ方向）を要するため、一見、面励起にくらべて撮影時間が遅くなるように見える。しかし、蛍光の特性上、色素のエネルギー吸収が飽和するまでは、励起パワー密度に対してリニアに蛍光強度が増加するため、仮に、面励起と同じ光源出射パワーを使えるとすると、ライン照射の場合は、面積が小さい分高いパワー密度が得られるので、蛍光を明るく励起することが出来る。その結果、露光時間が短くなるので、原理上の最速条件で（ｘ、ｙ、λ）を撮影することが出来る。（励起した蛍光を捨てることがないため、エネルギー効率が高く、高速なデータ取得を行うことができる。）さらに本手法は定速でスキャンすることが出来るのでＳｔｏｐ＆Ｇｏを繰り返す必要がある面励起方式よりも大面積撮影に優れているという利点がある。

さらに本実施形態によれば、時間分割方式の面励起分光イメージング機器と比較して、エネルギー効率のよい蛍光色素の高速撮影が可能になる。また、色分離計算に用いる基準スペクトルを機器毎に測定する必要がなくなるため、同じロットで安定的な色素であれば、１度撮影すれば次回の測定にそれを流用することができる。さらに、色素分子を定量的に測定することにより、組織、細胞表面の抗原数を定量的に評価することができる。

［表示部］
続いて、表示部３について説明する。

図１３は、表示部３の画面を説明する図である。表示部３は、処理ユニット２に一体的に取り付けられたモニタで構成されてもよいし、処理ユニット２に接続された表示装置であってもよい。表示部３は、液晶デバイスあるいは有機ＥＬデバイス等の表示素子と、タッチセンサとを備え、撮影条件の入力設定や撮影画像等を表示するＵＩ（User Interface）として構成される。

表示部３は、図１３に示すように、主画面３０１と、サムネイル画像の表示画面３０２と、スライド情報の表示画面３０３と、撮影済みスライドリストの表示画面３０４とを有する。主画面３０１には、撮影用の操作ボタン（キー）類の表示領域３０５、励起レーザ（励起部１０）の設定領域３０６、ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２由来の蛍光スペクトルの検出設定領域３０７，３０８等を有する。これらの表示領域３０５〜３０８は常に少なくとも１つあればよく、また、１つの表示領域に他の表示領域が含まれていてもよい。

蛍光観察装置１００は、図示しないスライドラックからのスライド（サンプルＳ）の取り出し、スライド情報の読み取り、スライドのサムネイル撮影、露光時間の設定などを順に行う。スライド情報には患者情報、組織部位、疾患、染色情報等が含まれており、スライドに付されたバーコードやＱＲコード（登録商標）などから読み取られる。サンプルＳのサムネイル画像及びスライド情報は、表示画面３０２，３０３にそれぞれ表示される。表示画面３０４には、撮影済みのスライド情報がリストとして表示される。

主画面３０１には、サンプルＳの蛍光画像のほか、現在撮影中のスライドの撮影状況が表示される。励起レーザ（ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２）は、設定領域３０６において表示あるいは設定され、励起レーザに由来する蛍光スペクトルは、検出設定領域３０７，３０８において表示あるいは設定される。

図１４は、励起レーザの設定領域３０６の画面構成の一例を示す図である。ここには、各励起光源Ｌ１〜Ｌ４の出力のＯＮ／ＯＦＦがチェックボックス８１へのタッチ操作により選択、切り替えられる。また、各光源の出力の大きさは操作部８２を介して設定される。この例では、ライン照明Ｅｘ１が励起光源Ｌ１の単一波長に設定された例を示している。

図１５は、ライン照明Ｅｘ１由来の蛍光スペクトルの検出設定領域３０７の画面構成の一例を示す図である。図１６は、ライン照明Ｅｘ２由来の蛍光スペクトルの検出設定領域３０８の画面構成の一例を示す図である。縦軸は輝度、横軸は波長を示している。

図１５及び図１６において、指標８３は、励起光源（Ｌ１，Ｌ２，Ｌ４）が点灯していることを表しており、指標８３の長さが大きいほど光源のパワーが大きいことを示している。蛍光スペクトル８５の検出波長範囲は設定バー８４によって設定される。

蛍光スペクトル８５の表示方法は特に限定されず、例えば、撮像素子３２の全画素平均スペクトル（波長×強度）で表示される。蛍光スペクトル８５は、励起光源の波長やパワーに応じて設定可能である。蛍光スペクトル８５は、現在の平均、または最後に撮影した波形から設定変更分を加味して計算される波形で表示される。

また、蛍光スペクトル８５は、図１５及び図１６に示すように、値の頻度情報を濃淡で表現するヒートマップ方式で表示されてもよい。この場合、平均値ではわからなかった信号の分散も可視化することができる。

なお、蛍光スペクトル８５を表示するグラフの縦軸は、線形軸に限られず、対数軸やハイブリッド軸（バイエクスポーネンシャル軸）であってもよい。

表示部３は、励起ライン（Ｅｘ１，Ｅｘ２）ごとに蛍光スペクトルを分けて表示することが可能に構成される。また、表示部３は、それぞれの励起ラインに照射される光源波長とパワーを明示的に表示する操作領域を有するＵＩを備えている。さらに、表示部３は、それぞれの蛍光スペクトルに対して、検出波長範囲を表示するＵＩを備えている。つまり、その設定波長範囲に基づいて、撮像素子３２の読み出し領域が変化するように構成される。

これにより、異軸励起方式の蛍光観察装置において、撮影条件をユーザへ分かりやすく提示することができる。特に、表示部３に蛍光スペクトルの検出設定領域３０７，３０８を設けることで、異軸励起の場合においても、励起ラインと励起波長の関係、励起波長と撮影波長範囲の関係を分かりやすく表示することができる。

表示部３は、画像形成部２３から出力されたサンプルＳの蛍光画像を主画面３０１に表示する。画像形成部２３から表示部３へ出力される蛍光画像は、異軸スリット（観測スリット３１の各スリット部）間の検出座標の違いに相当する値（ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２の間隔Δｙ）を補正された状態でユーザへ提示される。このため、ユーザは、異軸検出位置の違いを意識することなく、それぞれの分解画像データが多重表示された画像を認識することができる。

例えば図１７に示すように、複数のライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２由来のスペクトルデータから複数の分解画像（色素１に関する画像、色素２に関する画像）を生成し、それぞれの画像を異なる色で重ね合わせた状態で主画面３０１に表示される。ここでは、色素１に関する画像が、Δｙに相当するＹ座標の相違が補正されることで、色素２に関する画像と重ね合わされる。

各分解画像は、分離計算に用いた標準スペクトル、すなわち染色色素に対応している。主画面３０１には、各分解画像が重なり合った色素画像のほか、表示色素の選択画面が表示されてもよい。この場合、色素選択と連動して画像表示が切り替わり、図１７に示すように色素１，２を選択したときにそれらの画像に相当するものだけが表示される。

上記Δｙの補正値は、記憶部２１に格納され、内部情報として管理される。表示部３は、Δｙに関する情報を表示可能に構成されてもよいし、表示されたΔｙを変更可能に構成されてもよい。補正値（Δｙ）は、スリット間の距離（あるいはライン照明の間隔）の補正だけでなく、光学系におけるディストーションのような歪量等を含んでもよい。また、各色素のスペクトルを異なるカメラ（撮像素子）で検出する場合には、各カメラにおけるＹ軸方向の検出座標に関する補正量を含んでいてもよい。

＜変形例＞

以上の実施形態では、処理ユニット２において、Δｙ画像合わせ処理（図１２におけるＳ１０４）とスティッチング処理（同Ｓ１０５）とがそれぞれ色分離計算処理（同Ｓ１０７）の前に実行されたが、これに限られない。この手順によれば、色分離画像だけでなく、スペクトルデータ（分光データ）のスティッチデータが得られるという利点がある一方で、記憶部２１に格納されるデータ量が巨大になる。このため、Δｙ画像合わせ処理及びスティッチング処理の少なくとも一方は、図１８及び図１９に示すように、色分離計算処理後に実行されてもよい。

図１８は、スティッチング処理（Ｓ１０５）が色分離計算処理（Ｓ１０７）の後に実行される処理手順例を示す。この例では、データの大きいスペクトルデータでのスティッチングを行わず、色分離計算した画像のみスティッチングが行なわれる。この場合、Δｙ画像合わせ処理（Ｓ１０４）は、色分離計算前のスペクトルデータの時点で行われる。本例によれば、複数の励起ラインのスペクトルデータを連結したデータで色分離することで、分離画像のＳＮ比の改善を図ることができる。

一方、図１９は、Δｙ画像合わせ処理（Ｓ１０４）及びスティッチング処理（Ｓ１０５）が色分離計算処理（Ｓ１０７）の後に実行される処理手順例を示す。この例では、スペクトルデータに対してはスティッチングを行わないため分離画像のＳＮ比の改善は望めないが、データ量の小さい分離画像に対してΔｙ画像合わせ処理を行うため、サブピクセルを考慮するなどより高度な位置合わせ補正が可能となる。

続いて、上述した蛍光観察装置１００の構成の変形例について説明する。

図２０は、変形例１に係る蛍光観察装置１０１の概略ブロック図、図２１は、変形例２に係る蛍光観察装置１０２の概略ブロック図である。蛍光観察装置１０１，１０２は、観察ユニット１と、処理ユニット２と、表示部３と、制御用プログラム８１とを有する。

制御用プログラム８１は、前述した蛍光観察装置１００の制御部８０が行う制御機能と同様の機能を、蛍光観察装置１０１，１０２に実行させるプログラムである。図２０に示す蛍光観察装置１０１において、制御用プログラム８１は、例えば、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、フラッシュメモリ等の記録媒体に格納された状態で提供され、これを蛍光観察装置１０１に接続された電子計算機Ｃ等にダウンロードして用いられる。

一方、図２１に示す蛍光観察装置１０２においては、インターネット等のネットワークを介して、外部から配信された制御用プログラム８１を、電子計算機Ｃ等にダウンロードして用いられる。この場合、蛍光観察装置１０２と、制御用プログラム８１を取得するためのコードと、がパッケージされた状態で提供される。

制御用プログラム８１がダウンロードされた電子計算機Ｃは、励起部１０、分光イメージング部３０、走査機構５０、フォーカス機構６０、非蛍光観察部７０などを制御する各種のデータを取得し、ダウンロードされた制御用プログラム８１の制御アルゴリズムが実行され、蛍光観察装置１０１，１０２の制御条件が算出される。電子計算機Ｃが、算出された条件に基づいて、蛍光観察装置１０１，１０２へ指令を出すことにより、蛍光観察装置１０１，１０２の条件が自動制御される。

なお、本技術は以下のような構成もとることができる。
（１） 蛍光染色された病理標本を支持可能なステージと、
それぞれ異なる波長で構成された異軸かつ一軸方向に平行な複数のライン照明を、前記ステージ上の前記病理標本に照射する励起部と、
前記複数のライン照明によって励起された蛍光を個々に受光可能な少なくとも１つの撮像素子を有する分光イメージング部と
を具備する蛍光観察装置。
（２）上記（１）に記載の蛍光観察装置であって、
前記励起部は、前記複数のライン照明として、それぞれ異なる波長の組み合わせで構成された複数のライン照明を前記病理標本に照射する
蛍光観察装置。
（３）上記（２）に記載の蛍光観察装置であって、
前記分光イメージング部は、前記複数のライン照明によって励起された蛍光を分光する波長分散素子をさらに有する
蛍光観察装置。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の蛍光観察装置であって、
前記分光イメージング部は、前記複数のライン照明によって励起された蛍光がそれぞれ通過可能な複数のスリット部を有する観測スリットをさらに有する
蛍光観察装置。
（５）上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の蛍光観察装置であって、
前記ステージに対して前記複数のライン照明を前記一軸方向に垂直な方向に走査する走査機構をさらに具備する
蛍光観察装置。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の蛍光観察装置であって、
前記複数のライン照明の波長と前記撮像素子で受光された蛍光との相関を表す分光データを記憶する記憶部を有する処理ユニットをさらに具備する
蛍光観察装置。
（７）上記（６）に記載の蛍光観察装置であって、
前記処理ユニットは、前記記憶部に記憶された分光データと、前記複数のライン照明の間隔とに基づいて、前記病理標本の蛍光画像を形成する画像形成部をさらに有する
蛍光観察装置。
（８）上記（７）に記載の蛍光観察装置であって、
前記画像形成部は、前記蛍光画像として、前記複数のライン照明の間隔に相当する値で前記撮像素子の検出座標が補正された画像を形成する
蛍光観察装置。
（９）上記（６）に記載の蛍光観察装置であって、
前記処理ユニットは、前記記憶部に記憶された分光データを校正するデータ校正部をさらに有する
蛍光観察装置。
（１０）上記（７）〜（９）のいずれか１つに記載の蛍光観察装置であって、
前記記憶部は、前記病理標本に関する自家蛍光の標準スペクトル及び前記病理標本を染色する色素単体の標準スペクトルをあらかじめ記憶し、
前記画像形成部は、前記自家蛍光及び前記色素単体の標準スペクトルを基に、前記分光データの成分分布を出力する
蛍光観察装置。
（１１）上記（４）に記載の蛍光観察装置であって、
前記撮像素子は、前記観測スリットを通過した蛍光をそれぞれ受光可能な複数の撮像素子を含む
蛍光観察装置。
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の蛍光観察装置であって、
前記ステージ上の前記病理標本を照明する光源と、前記病理標本の非蛍光画像を取得する撮像部とを有する非蛍光観察部をさらに具備する
蛍光観察装置。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか１つに記載の蛍光観察装置であって、
複数のライン照明ごとに、前記複数のライン照明によって励起された蛍光スペクトルを分けて表示する表示部をさらに具備する
蛍光観察装置。
（１４）上記（１３）に記載の蛍光観察装置であって、
前記表示部は、前記複数のライン照明の波長と出力とを設定可能な操作領域を有する
蛍光観察装置。
（１５）上記（１３）又は（１４）に記載の蛍光観察装置であって、
前記表示部は、前記蛍光スペクトルの検出波長範囲を表示する表示領域を有する
蛍光観察装置。
（１６） それぞれ異なる波長で構成された異軸かつ一軸方向に平行な複数のライン照明を、ステージ上の病理標本に照射し、
前記複数のライン照明によって励起された蛍光を個々に受光する
蛍光観察方法。
（１７）上記（１６）に記載の蛍光観察方法であって、さらに、
前記ステージに対して前記複数のライン照明を前記一軸方向に垂直な方向に走査する
蛍光観察方法。
（１８）上記（１６）又は（１７）に記載の蛍光観察方法であって、
前記複数のライン照明として、それぞれ異なる波長の組み合わせで構成された複数のライン照明を用いる
蛍光観察方法。

１…観察ユニット
２…処理ユニット
３…表示部
１０…励起部
２０…ステージ
２１…記憶部
２２…データ校正部
２３…画像形成部
３０，１３０…分光イメージング部
３１…観測スリット
３２，３２ａ，３２ｂ…撮像素子
３５…回折格子
３８…プリズム
５０…走査機構
７０…非蛍光観察部
８０…制御部
８１…制御用プログラム
１００，１０１，１０２…蛍光観察装置
Ｅｘ１，Ｅｘ２…ライン照明
Ｓ…サンプル

Claims (18)

1. 蛍光染色された病理標本を支持可能なステージと、
   それぞれ異なる波長で構成された異軸かつ一軸方向に平行な複数のライン照明を、前記ステージ上の前記病理標本に照射する励起部と、
   前記複数のライン照明によって励起された蛍光を個々に受光可能な少なくとも１つの撮像素子を有する分光イメージング部と
   を具備する蛍光観察装置。
2. 請求項１に記載の蛍光観察装置であって、
   前記励起部は、前記複数のライン照明として、それぞれ異なる波長の組み合わせで構成された複数のライン照明を前記病理標本に照射するように構成される
   蛍光観察装置。
3. 請求項２に記載の蛍光観察装置であって、
   前記分光イメージング部は、前記複数のライン照明によって励起された蛍光を分光する波長分散素子をさらに有する
   蛍光観察装置。
4. 請求項１に記載の蛍光観察装置であって、
   前記分光イメージング部は、前記複数のライン照明によって励起された蛍光がそれぞれ通過可能な複数のスリット部を有する観測スリットをさらに有する
   蛍光観察装置。
5. 請求項１に記載の蛍光観察装置であって、
   前記ステージに対して前記複数のライン照明を前記一軸方向に垂直な方向に走査する走査機構をさらに具備する
   蛍光観察装置。
6. 請求項１に記載の蛍光観察装置であって、
   前記複数のライン照明の波長と前記撮像素子で受光された蛍光との相関を表す分光データを記憶する記憶部を有する処理ユニットをさらに具備する
   蛍光観察装置。
7. 請求項６に記載の蛍光観察装置であって、
   前記処理ユニットは、前記記憶部に記憶された分光データと、前記複数のライン照明の間隔とに基づいて、前記病理標本の蛍光画像を形成する画像形成部をさらに有する
   蛍光観察装置。
8. 請求項７に記載の蛍光観察装置であって、
   前記画像形成部は、前記蛍光画像として、前記複数のライン照明の間隔に相当する値で前記撮像素子の検出座標が補正された画像を形成する
   蛍光観察装置。
9. 請求項６に記載の蛍光観察装置であって、
   前記処理ユニットは、前記記憶部に記憶された分光データを校正するデータ校正部をさらに有する
   蛍光観察装置。
10. 請求項７に記載の蛍光観察装置であって、
    前記記憶部は、前記病理標本に関する自家蛍光の標準スペクトル及び前記病理標本を染色する色素単体の標準スペクトルをあらかじめ記憶し、
    前記画像形成部は、前記自家蛍光及び前記色素単体の標準スペクトルを基に、前記分光データの成分分布を出力する
    蛍光観察装置。
11. 請求項４に記載の蛍光観察装置であって、
    前記撮像素子は、前記観測スリットを通過した蛍光をそれぞれ受光可能な複数の撮像素子を含む
    蛍光観察装置。
12. 請求項１に記載の蛍光観察装置であって、
    前記ステージ上の前記病理標本を照明する光源と、前記病理標本の非蛍光画像を取得する撮像部とを有する非蛍光観察部をさらに具備する
    蛍光観察装置。
13. 請求項１に記載の蛍光観察装置であって、
    複数のライン照明ごとに、前記複数のライン照明によって励起された蛍光スペクトルを分けて表示する表示部をさらに具備する
    蛍光観察装置。
14. 請求項１３に記載の蛍光観察装置であって、
    前記表示部は、前記複数のライン照明の波長と出力とを設定可能な操作領域を有する
    蛍光観察装置。
15. 請求項１３に記載の蛍光観察装置であって、
    前記表示部は、前記蛍光スペクトルの検出波長範囲を表示する表示領域を有する
    蛍光観察装置。
16. それぞれ異なる波長で構成された異軸かつ一軸方向に平行な複数のライン照明を、ステージ上の病理標本に照射し、
    前記複数のライン照明によって励起された蛍光を個々に受光する
    蛍光観察方法。
17. 請求項１６に記載の蛍光観察方法であって、さらに、
    前記ステージに対して前記複数のライン照明を前記一軸方向に垂直な方向に走査する
    蛍光観察方法。
18. 請求項１６に記載の蛍光観察方法であって、
    前記複数のライン照明として、それぞれ異なる波長の組み合わせで構成された複数のライン照明を用いる
    蛍光観察方法。

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