JPS62259595A - 生理活性ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、産業上有用な生理活性ペプチドの製造法に関
する。さらに詳しくは、リジン（Ｌｙｓ）残基を有しな
い真核生物由来の生理活性ペプチド、例えばヒト心房由
来のナトリウム利尿活性を有するペプチドを、組換えＤ
ＮＡ技術を用いて効率よく生産するための製造法に関す
る。

〔従来の技術〕

これまで、組換えＤＮＡ技術を用いて、真核生物由来の
生理活性ペプチドまたは蛋白質を大腸菌等の微生物で生
産させようとする試みが多くなされている。

例えば、大腸菌等の微生物内で分解を受は易い比較的分
子量の小さいペプチドを生産しようとする場合、目的と
するペプチドを他の蛋白又はポリペプチドとの融合蛋白
として生産させた後、化学的あるいは酵素的な処理を行
い、その融合蛋白から目的とするペプチドを切り出し精
製する方法が、一般に用いられている。

融合蛋白から目的のペプチドを切り出す方法としては、
目的のペプチドがメチオニン残基を含まない場合には、
目的ペプチドをメチオニン残基を介した融合蛋白として
生産した後、臭化シアン（ＣＮＢｒ）処理によりメチオ
ニン残基を開裂させて目的のペプチドを切り出す方法（
Ｓｃｉｅｎｃｅ　１皿、１０５９（１９７７）、　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、、　７６
、１０６（１９７８））が用いられており、目的のペプ
チドにアルギニン（Ａｒｇ）やリジン（Ｌｙｓ）残基を
含まない場合には、アルギニンやリジン残基のＣ末端（
カルボキシ末端）を特異的に切断するトリプシン処理で
目的のペプチドを切り出す方法（Ｎａｔｕｒｅ　、　２
８５　、４５６（１９８０））などが用いられている。

また、リジン残基のＣ末端を特異的に切断する酵素（リ
シルエンドペプチダーゼ）として知られているアクロモ
バクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｈａｃ　ｔｅｒ）プロテアー
ゼＩ　（以下ＡＰＩと略す：特公昭５４−１３５７８９
参照）も、場合により目的ペプチドの切り出しに用いる
ことができる。

目的のペプチドとの融合の相手となるポリペプチドには
、用いる宿主微生物が本来的に生産する蛋白質の断片が
よく用いられている。この場合、通常、用いる宿主微生
物で高生産する蛋白質のＮ末端（アミノ末端）からの適
当な大きさく長さ）をもつポリペプチド断片が用いられ
ているが、そのポリペプチド断片の大きさが、目的のペ
プチドの生産性に影響を及ぼすことが考えられる。例え
ば、該ポリペプチド領域を小さく　（短かく）シて融合
蛋白質に対する目的ペプチドの割合をふやして生産性を
向上させることが考えられるが、必ずしも該ポリペプチ
ド領域を小さくしても目的ペプチドの生産性が向上する
とは限らない。例えば、大腸菌β−ガラクトシダーゼを
融合蛋白の相手として使用するインスリン生産の場合、
β−ガラクトシダーゼ領域の縮少により、目的ペプチド
の生産量が一旦上昇するが、さらに小さくすると生産量
が低下することが報告されている（Ｇｅｎｅ　、　２９
．２５１　（１９８４））。このように、融合蛋白とし
である特定のペプチドを生産しようとする場合、融合の
相手となるポリペプチドがどれくらいの大きさであれば
よいかという定説はない。

本発明の製造法を具体的に説明するために、以下に述べ
る生理活性ペプチドは、松属・寒用らによりヒト心房よ
り抽出・精製された、次の式（Ｉ）：を含まない）から
なるペプチド（α−ｔｙｐｅ　ｈｕｍａｎａｔｒｉａｌ
　ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　
；以下αｈＡＮＰと略す）であり、顕著なナトリウム利
尿作用や血圧降下作用を有する（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂ　１ｏｐｈｙｓ　、Ｒｅｓ、Ｃｏｎ＋ｎ＋ｕｎ。

１１８．１３１〜１３９．１９８４）。また、αｈＡＮ
Ｐは、生体内では大きなペプチドからなる前駆体（ｒ　
ｈＡＮＰと呼ばれるＣ末端部にαｈＡＮＰ構造をもつ１
２６個のアミノ酸からなるポリペプチド：　Ｋａｎｇａ
ｗａ　％　Ｋ。

ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１３．３９７（１９８５））が、
プロセシングを受けて生成されることが知られており、
その前駆体（γｈＡＮＰ）をコードするｃ［ＩＮ八も組
換えＤＮＡ技術を用いてクローニングされ（Ｏｉｋａｗ
ａ　％　Ｓ、　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０９．７２４　（
１９８４））、大腸菌や動物細胞で発現もされている。

これらヒト心房由来の利尿及び降圧作用を有するペプチ
ド（これらのペプチドを総称して単にｈＡＮＰと呼ばれ
ることもある）の物理化学的、生化学的また薬理学的性
質について、多くの研究が活発に行われており総説も出
されている（代謝ｖｏ１．２２、Ｎ１１６、ｐ、４９９
〜５５９．１９８５）。

２８個のアミノ酸からなるαｈＡＮＰ　（式（１）参照
〕は、化学合成により製造されうるが、大量に最終精製
品を得るには多くの労力と時間を要する。

従って、αｈＡＮＰの医薬品としての有用性（利尿・降
圧剤の他生体内の水分調節ペプチドとしての薬剤も期待
される）を考えた場合、より簡便で大量に製造できる方
法の確立が強く望まれる。

一方、組換えＤＮＡ技術を用いてαｈＡＮＰを製造しよ
うとする試みもなされている（昭和６０年体化学会大会
要旨：生化学５７（８）　、８５４　（１９８５））。

そこでは、αｈＡＮＰを大腸菌ＴｒｐＥ蛋白との融合蛋
白として発現させ、菌体破砕液から粗抽出した融合蛋白
をリシルエンドペプチダーゼや血液凝固因子ファクター
Ｘａで処理して、融合蛋白からαｈＡＮＰを遊離させて
いるか、■　融合蛋白を菌体破砕懸濁液から尿素を用い
て抽出しているため該抽出液に多くの夾雑蛋白が存在し
、目的とする融合蛋白を得るのにＤＰ、へＥカラムなど
を用いた精製の工程が必要であること、■　融合蛋白の
一部として用いているＴｒｐＥポリペプチド断片には、
αｈＡＮＰを融合蛋白から遊離するために用いる酵素が
作用する部位（例えばＬｙｓ残基）が多いこと、また該
ポリペプチド断片が大きい（３２０〜３４０個のアミノ
酸残基からなる）ため、目的ペプチドであるαｈＡＮＰ
の融合蛋白に対する割合が小さいこと、■　融合蛋白遺
伝子の発現にＴｒｐＥプロモーターを用いているため、
培養時（後期）に誘導剤（例えばインドールアクリル酢
酸（ｒＡＡ））を添加する必要があること、また■　融
合蛋白の発現量が少ないこと、など融合蛋白や目的ペプ
チドαｈＡＮＰの分離に複雑な工程を要し、又回収効率
が悪いことなどの欠点があり、αｈＡＮＰを工業的に大
量且つ簡便に製造する方法としては適さない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、上記のような種々の問題を解決すべく組
換えＤＮＡ技術を駆使し鋭意研究した結果、リジン残基
を有しない生理活性ペプチド、なかんずくαｈＡＮＰの
簡便で効率の良い大量生産可能な製造法を見出し、本発
明を完成するに至った。

尚、実施例においては、リジン残基を有しない真核生物
由来の生理活性ペプチドとしてαｈＡＮＰを例にとりそ
の製造法について述べるが、本発明の製造法は、リジン
残基を有しないペプチド、例えば血圧降下および平滑筋
収縮作用を有するヒトブラチキニンや血管収縮、血圧上
昇作用を有するアンジオテンシン、子宮収縮、乳汁分泌
促進作用を有するオキシトシンなどの製造のためにも使
用することができることは当然である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、１）誘導剤を添加することなく目的とするペ
プチドを含有する融合蛋白を大腸菌で大量に発現させ、
２）できるだけ融合蛋白の分子量を小さくし、融合蛋白
に対する目的とするペプチドの占める割合を大きくし、
３）大腸菌体内で産生された融合蛋白を簡便な方法で効
率よく回収し、４）夾雑物が少なくなるよう融合蛋白か
ら目的のペプチドを効率的に切り出し、その後の工程で
ある目的ペプチドの精製を容易にすることにより、真核
生物由来の生理活性ポリペプチドを効率よく製造するこ
とができる方法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の目的は、リジン残基を有しない目的とするペプチ
ド、例えばαｈＡＮＰが、大腸菌β−ガラクトシダーゼ
由来のポリペプチド断片を含む９０乃至２２０個のリジ
ン残基を含まないアミノ酸からなるポリペプチドの下流
すなわちＣ末端にリジン残基を介して連結された融合蛋
白として、大腸菌又はファージ由来遺伝子のプロモータ
ー支配下に高発現されうるプラスミドにより形質転換さ
れた大腸菌を培養し、該形質転換体の培養菌体を破砕し
く１１） て得られる懸濁液の不溶画分に１的に看移行した融合蛋
白を可溶化剤例えば尿素溶液を用いて可？容化・抽出し
、リシルエンドペプチダーゼ（ＥＣ。

３．４．２１．５０）で処理し、目的ペプチド（αｈＡ
ＮＰ）を融合蛋白から遊離させ、通常の方法で精製する
ことを特徴とする方法により達成される。

〔具体的な説明〕

本発明の製造法において、目的のペプチド、例えばαｈ
ＡＮＰの融合蛋白の相手となるポリペプチドは、リジン
残基を含まない適当な大きさのポリペプチドであれば特
に限定する必要はないが、好ましくは大腸菌β−ガラク
トシダーゼ由来のポリペプチド断片を含む９０乃至２２
０個のアミノ酸からなるポリペプチドがよい。このポリ
ペプチドのＣ末端領域には、他のペプチド、例えば、制
限酵素切断部位を挿入するためのリンカ−ＤＮＡに対応
するペプチドが連結されていてもよい。

リジン残基を介して形成された融合蛋白は、融合の相手
となるポリペプチド、例えばβ−ｇａｌ断片をコードす
るＤＮＡ配列と目的ペプチドをコードするＤＮＡ配列と
の間に、翻訳開始コドンからの読み枠が合うようにデザ
インされたリジンのコドンを含む合成リンカ−（二重鎖
ＤＮＡ）を挿入した遺伝子を発現させることにより得ら
れる。この場合、該リンカ−には、リジンのコドンのす
ぐ下流に目的ペプチドのＮ末端の一部のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列を有し、両端には連結しやすい塩
基配列、例えば適当な制限酵素サイトを含んでいるのが
好ましい。

β−ガラクトシダーゼ蛋白の遺伝子の縮小化は、β−ｇ
ａｌ構造遺伝子配列を適当な制限酵素で切断するか、或
いは該切断部位からＢ　ａ１３１エキソヌクレアーゼで
消化していくことにより行うことができる。前者の場合
、既にβ−ｇａｌ遺伝子の塩基配列がわかっているので
（ＥＭＢＯＪ、、童、５９３〜５９７　（１９８３）　
）翻訳開始コドンからの読み枠が合うようにして、目的
とするペプチドを融合蛋白として発現しうる。

後者の場合、翻訳開始コドンからの読み枠が合わないた
めに目的ペプチドが得られないこともあるが（理論的に
は２／３の割合）、実用上はとんど問題はない。

本発明の製造法における融合蛋白からの目的ペプチドの
切り出しには、リジン残基のＣ末端を特異的に切断する
酵素、すなわちリシルエンドペプチダーゼが用いられる
。特に、アクロモバクタ−・リティカス（Ａｃｈｒｏｍ
ｏｈａｃｔｅｒ　　Ｉｙｔｉｃｕｓ）由来のアクロモバ
クタ−プロテアーゼＴ（ＡＰＩと略す）と呼ばれる酵素
が好ましい〔和光純薬■より発売されている。〕 大腸菌内で生産される融合蛋白は、菌体破砕懸濁液の上
清から抽出される場合と、沈澱（不溶）画分から抽出さ
れる場合とが考えられるが、本発明では、目的融合蛋白
以外の夾雑蛋白又はペプチドの混在が少ない不溶画分か
ら可溶化剤、例えば６Ｍ〜８Ｍ（好ましくは８Ｍ）濃度
の尿素溶液で抽出される。不溶画分からの融合蛋白の抽
出（不溶化）にはＳＤＳや塩酸グアニジンなどの試薬も
考えられるが、４Ｍの濃度でも融合蛋白が可溶化された
状態であり且つＡＰＩ酵素活性が失われない尿素の溶液
で抽出するのが好ましい。例えば、８Ｍ尿素溶液で不溶
画分から目的融合蛋白を可溶化後、適当な緩衝溶液で２
倍に希釈するだけで、何ら精製工程を経ることなくＡＰ
Ｉを作用させ、目的ペプチド、例えばαｈＡＮＰを遊離
させることができる。遊離された目的ペプチドは、通常
の方法で精製される。

本発明では上記のように、■目的融合蛋白を不溶画分か
ら抽出するため、該抽出液にはほとんど目的融合蛋白以
外の夾雑蛋白が存在しないこと、■液抽出液に含まれる
目的融合蛋白を何ら精製することなくＡＰＴ処理し目的
ペプチドを遊離させうろこと、■融合蛋白にはリジン残
基が唯一個しかないため、目的ペプチドを遊離するため
のＡＰＩ量が少なくてよく、また不要の夾雑ペプチドが
ほとんどないこと、さらに■融合蛋白分子中に占める目
的ペプチド分子の割合が高いことなどから、従来の方法
に比べ、はるかに簡便で且つ効率よく目的ペプチドとす
る生理活性ペプチドを製造できる。

融合蛍白遺伝子を高発現させるためのプロモーターとし
ては、大腸菌或いはファージで高生産できる蛋白質の遺
伝子のプロモーターであれば限定はされないが、本発明
では、特に大腸菌ラクトース遺伝子のプロモーター（ｐ
ｌａｃ）或いはλフアージ遺伝子由来のＰ、プロモータ
ーが好ましい。これらのプロモーター領域は、公知のプ
ラスミドから通常の遺伝子組換え手法により容易に得る
ことができる。例えば、本発明では、プロモーターｐ　
］　ａ　ｃ、はｐαＮＥ２から（第１図参照）、ＰＬプ
ロモーターはｐＳ２２４−３から（第７図参照）容易に
導入することができる。これらのプラスミドについては
、各々特開昭５８−６３３９５、および同６０−２６２
５９２に記載され、ｐαＮＨ２が組込まれた大腸菌（Ｗ
Ａ８０２／ｐαＮＥ２）はＦＥＲＭ　Ｐ−６０３１とし
て、ｐＳ２２４−３の材料となるプラスミドｐｓ２０が
組込まれた大腸菌（Ｎ４８３０／　ｐｓ２０）はｌ’ｌ
ｔ！ＲＭ　ＢＰ−５３５として各ｌ工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。

融合蛋白は、その遺伝子が挿入されている発現プラスミ
ドに依存するプラスミドＤＮＡの複製を制御する遺伝子
（ｒｏｐと略す）の機能を欠除することにより、さらに
高発現させることができる。例えば、実施例に示すよう
に（第５図参照）　ｐｌａｃプロモーター支配下に融合
蛋白を発現するプラスミドｐＧＨα２１０からｒｏｐ機
能を欠失させることにより（ｐＧｌ（α２１．０ｒｏｐ
−）　、目的とする融合蛋白の生産性を大巾に向上させ
ることができる。

目的の生理活性ペプチドをコードする遺伝子は化学的に
合成してもよいし、そのペプチド（或い、はそのペプチ
ドの前駆体）を産生じている細胞から得られるｍＲＮＡ
を逆転写してつくられるｃＩＩＮＡを用いてもよい。

以下、本発明の製造法について、αｈＡＮＰの製造法を
例にとり実施例をもって説明する。

ｐＢＲ３２２５１！　ｇを旧ｎｄｌｌｒ　ｂｕｆｆｅｒ
（５０ｍＭ　ＮａＣｌ　。

５０ｍＭ　）リス−塩酸（ａｌ１８．０　）　、１０ｍ
ＭＭｇＣＩｇ）　５０μβ中で１６ユニツトのＥｃｏＲ
１により完全分解しく１７） た後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、次に、２
５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＴＴＰを含む）２μｌを含むＴＡ緩衝液〈３３ＩＩ
ＩＭトリス酢酸ｐＨ７，９，６６ｎ＋Ｍ酢酸カリウム、
１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｎ＋Ｍジチオスレイ
トール）１００μβ中で４ユニツトのＴ４ｒｌＮＡポリ
メラーゼによりＥｃｏｌｌ　Ｔ粘着末端を平滑末端とし
た。その後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、５
ａ１１リンカ− （５′〜ＧＧＧＴＣＧＡＣＣＣ−３’ ３　’　−ＣＣＣＡＧＣＴＧＧＧ−５”０．５μｇを加
えたライゲージジン反応液（２０ｎ＋Ｍトリスー塩酸ｐ
ｌ＋７．４．１０ｍＭ　ＭｇＣｌｔ　１０ｍＭジチオス
レイトール、１　ｍＭ　ＡＴＰ）　　２０μｐ中、１ユ
ニツトのＴ４ＤＮ＾リガーゼとともに１５℃１８時間反
応させた。

この反応液を大腸菌Ｗ　３１．１０に形質転換し、アン
ピシリン、テトラサイクリン薬剤耐性（Ａｐ’　＋　Ｔ
ｃ’）クローンを得た。次に、これらのクローンからプ
ラスミドを分離して制限酵素による解析を行ない、Ｅｃ
ｏＲＩサイトが５ａｌｌサイトに変わったｐＲＲ３２２
−３ａｌ　　１を得た。

Ｂ、Ｊ咀１♂埠し！材Ｌ１ ５．ｕｇのｐＢＲ３２２−３ａｔ　ＴをＳａｌ　Ｉ緩衝
液（１５０ｍＭＮａＣ１６ｍＭ　）リス−塩酸Ｐ）１７
．９．６　ｍＭＭｇｃＩｇ）　５０μβ中で、８ユニツ
トの５ａｌｌで部分消化した後、２４ユニツトのＢａｒ
ｎＨＴで完全消化を行ない、寒天ゲル電気泳動により、
２番目に大きいテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ター領域を含むＤＮＡ断片（第１図の■）を分離、回収
した。また、ｐヶＮＥ２　（本プラスミドは特開昭５８
−６３３９５に開示されている。さらに本プラスミドに
よって形質転換された大腸菌−Ａ８０２／ｐヶＮＢ２株
は、３８Ｍ１０２と命名、工業技術院微生物工業技術研
究所に受託番号ＥＥＩＩＭＰ−６０３１で寄託されてい
る）５μｇを５ａｌｌ緩衝液１００μｌ中で、２４ユニ
ツトのＢａｍＨＩ　％及び２４ユニツトのＦｃｏＲｌで
完全消化した後、電気泳動的に一番大きいｌａｃプロモ
ーターにて発現するβ−ｇａｌ１００７　、及びアンピ
シリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片（第１図の■）を分
離、回収した。さらにＴｈＡＮＰ遺伝子（その３′末側
に。ｈＡＮＰ構造遺伝子をもつ）を含むｐＳ２２４　（
特開昭６０−２６２５９２に開示）５μｇを５ａｌｌ緩
衝液１００μβ中で２４ユニツトのＰｖｕＴＩ、及び８
０ユニツトのＳａｌ　Ｉで完全消化した後、Ｎ末端を欠
（、、ｈＡＮＰ遺伝子を含む電気泳動的にもっとも小さ
いＤＮＡ断片（第１図の■）を分離、回収した。前述の
■〜■のＤＮＡ断片及びＬｙｓ残基と。ｈＡＮＰＯＮ末
＠領域の一部をコードする遺伝子を含み且つ各々の末端
にそれぞれＢｃｏＲＩ粘着部位およびＰｖｕＴＩ平滑部
位を有する以下の塩基配列で示される化学合成りＮＡ断
片（第１図の■）： １、ｕｇを混合し、前述の方法でライゲージジンした後
、Ｗ３１１０への形質転換を行ないアンピシリン及びテ
トラサイクリン耐性のクローンを得た。常法に従ってこ
れらのクローンからプラスミドを分離して解析し、目的
とするｐＧＨｙ　２０１を得た。

尚、本プラスミドが導入された大腸菌Ｗ３１１０／ｐＧ
Ｈｙ　１００７は５８Ｍ２８４と命名されＦＥＲＭ　Ｐ
−８７２８の受託番号のもとに工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。

Ｃ−ｐＧＨａ　１００７の作製 ５μｇのｐＧＨｙ　２０１をＳａｌ■緩衝液５０μβ中
で２４ユニツトのＤｒａＩで完全消化した後、電気泳動
的に一番大きいＤＮＡ断片を分離、回収した。

次に前述の方法でライゲーションした後、大腸菌Ｗ３１
１０への形質転換を行ない、アンピシリン感受性でテト
ラサイクリン耐性のクローンを得た。常法に従って解析
し、目的とするｐＧＨｙ　１００７を得た。

このｐＧＨ＆　１００７は、β−ｇａｌ　（１００７個
のアミノ酸からなる蛋白）のＣ末端にＬｙｓを介して。

ｈＡＮＰが連結された融合蛋白（βｇａＴ１００７　ｃ
ｔ　ｈＡＮＰと呼ぶ）がラクトースプロモーター（ｐｌ
ａｃ）支配下に発現されるプラスミドである。

５μｇのｐＧＨＩｙ１００７をＴＡ緩衝液５０／ｊＪ中
で８ユニツトの［！ｃｏＲＩ及び２４ユニツトの５ａｃ
ｌで完全消化した後、電気泳動的に一番大きいＤＮＡ断
片を分離、回収した。次に前述のようにしてＥｃｏＲＩ
及び５ａｃｌ粘着末端を平滑末端とした後、ライゲーシ
ョンし、大腸＠Ｗ３１１．０への形質転換を行ない、テ
トラサイクリン耐性のクローンを得た。

常法に従って解析し、目的とするρＧｌｌ＆６５０を得
た。

ｐＧＨヶ４３９、及びｐＧＨａ　２１０の作製は、ＴＡ
緩衝液を旧ｎｄｌｌ＋緩衝液に、２４ユニツトの５ａｃ
ｌをそれぞれ２４ユニツトのＭｌｕｌ及び２４ユニツト
のＡａｔＵに換え、同様に行なった。

尚、ｐＧＨｔｘ　６５０、ｐＧＨｃｔ４３９、及びｐＧ
Ｈα２１０は、各々β−ｇａｌ蛋白のＮ末端から６５０
個〜　４３９個、２１０個のアミノ酸からなるポリペプ
チドのＣ末端にＧｌｕ−Ｐｈｅの２アミノ酸とＬｙｓ残
基を介して、　ｈＡＮＰが連結された融合蛋白（各々β
ｇａｌ　６５０ｒｘ　ｈＡＮＰ、βｇａ１４３９ｚ　ｈ
ＡＮＰ、及びβｇａ１２１０＊　ｈＡＮＰと呼ぶ）をコ
ードするＤＮＡ断片が含まれているプラスミドであるこ
とを示す。

害旅勇１　融合　白βｇａ＋１００７＆ｈＡＮＰ、βｇ
ａ１６５０６ｔｈＡＮＰの精製 前述の４つのプラスミドにより形質転換された大腸菌形
質転換株Ｗ３１．１０／ｐＧｌ鴎１００７、Ｗ３１１０
／ｐｃｎα６５０　、Ｗ３１１０／ｐＧＨヶ４３９及び
Ｗ３１１０／ｐＧＨｙ２１０をそれぞれテトラサイクリ
ンを含む培地（０，５％グリセリン、２．４％酵母エキ
ス、１．２％トリプトン、０．５％リン酸水素カリウム
、ｐ）１７．４．）で、３７℃１６時間培養した。次に
、遠心集菌した菌体をＰＢＳ緩衝液（０，８％ＮａＣ］
、　０．０２％ＭＣＩ、０．１１５％Ｎａ２）ＩＰＯ４
，０，０２％ＫＨｚＰＯｔ　　ｐＨ７，４）に懸濁し、
高圧ホモジナイザー（’Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓｕｒ
ｅ　ｃｅｌｌｐｒｅｓｓ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔ　ｃｏｍｐａｎｙ製）を用いて、１００
０（ｌｐｓ＋で破砕後１００００ｇ、、Ｉ　０分の遠心
により得た上清及び沈澱について常法に従いｓｎｓ　−
ＰＡＧＥを行なった。その結果、第３図に示すようにβ
ｇａｌｌＯ０７ｙ　ｈＡＮＰ、βｇａ１６５０ｃｖ　ｈ
ＡＮＰは遠心の上清（Ｓ）及び沈澱（Ｐ）の両方に分か
れるが（第３図でＳとＰの両両分に融合蛋白のバンドが
みられる）、βｇａ１４３９＆ｈＡＮＰ及びβｇａ１２
１０ｙ　ｈＡＮＰは、特異的に沈澱へ移行した （融合蛋白がＰ画分にみられＳ画分にはほとんどみられ
ない。）。このことからβｇａ１４３９ｅｔ　ｈＡＮＰ
及びβｇａ１２１０ｙ　ｈＡＮＰの方が前者の２つの融
合蛋白より回収率よく精製できることが強く示唆された
。

βｇａ１４３９ｚ　ｈＡＮＰ及びβｇａ１２１０αｈＡ
ＮＰはともに、破砕菌体の遠心沈澱画分から８Ｍ尿素で
可溶化されＡＰＩの作用できる４Ｍ尿素まで尿素の濃度
を下げても融合蛋白は、はとんど沈澱しなかった。

一方、ＡＰＩ切断部位（Ｌｙｓ残基）は、βｇａ１４３
９＆　ｈＡＮＰに４ケ所あるが（β−ｇａｌ断片中に３
ケ所と、　ｈＡＮＰとの結合部位に１ケ所）、βｇａ１
２１０＆　ｈＡＮＰには、β−ガラクトシダーゼと、Ｍ
ｈＡＮＰの結合部位に１ケ所あるのみなので、βｇａ１
２１０Ｉ２ｈＡＮＰの方がβｇａ＋４３９ｙ　ｈＡＮＰ
に比べて、ａ　ｈＡＮＰの切り出しに必要なＡＰＩ量が
少量ですみ、また、ＡＰＩ切断後の。ｈＡＮＰの精製が
容易になるという利点がある。さらにβｇａ１２１０．
．　ｈＡＮＰは、βｇａ１４３９ｚ　ｈＡＮＰに比べる
とβ−ガラクトシダーゼ部分が約半分以下と小さく、大
腸菌内で生産できる蛋白量の限度を考慮すると１．ｙ　
ｈＡＮＰの産生量は、βｇａ１２１０ｙ　ｈＡＮＰの方
が多くなると考えられた。

そこで、次にβｇａ１２１０ｙ　ｈＡＮＰ発現プラスミ
ドＣｐＧＨ＆２１．０）の改良による。　ｈｌｌＮＰの
生産性の向上を検討した。

５ｔｔｇのｐＢＩ？３２２をＢａ１ｌ緩衝液（１０ｍＭ
トリス塩酸ｐＨ７，６，１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）　５０
μβ中で、１０．：Ｉ−ニットのＢａ１ｌで完全に消化
した後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。次に
ＤＮＡを５ａｌＴ緩衝液５０μｌに溶解して２４ユニツ
トのＰｖｕｌｌで完全消化した後、電気泳動的に一番大
きいＤＮＡ断片（Ｂａｌ　Ｉ及びＰｖ＋＋Ｈ消化により
ＤＮＡ断片の両端は、平滑末端となっている）を分離、
回収した。前述のようにライゲーション及び形質転換を
行ない、テトラサイクリン及びアンピシリン耐性のクロ
ーンを得、Ｐｖｕ　Ｈ−Ｂａｌ　ｌ　６２２塩基ＤＮＡ
断片の欠失したプラスミドｐＢＲ３２２ＡＢａｌ　Ｔを
得た。

Ｂ　）　　ｐＧＨｙ　２１０ｒｏｐ−の作製５μｇのＩ
）ＢＲ３２２ＡＢ　ａｌ　Ｉを５ａｉｌ緩衝液５０μＡ
中で、２４ｔニソ）　（Ｄ　Ｄｒａ　Ｔ　及ヒ２４ユニ
ツトのＥｃｏＲＶで完全消化後、複製起点を含む電気泳
動的に一番大きいＤＮＡ断片を分離、回収した。

次ニ５．ｃｒｇ（７）　ｐＧＨｚ２１０　ｔ”５ａ１１
緩衝液５０ｔｔｌｌ中で２４ユニツトのＥ　ｃｏＲＶで
完全消化した後、電気泳動的に２番目に大きいβｇａ１
２１０ｚ　ｈＡＮＰ融合蛋白をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を分離、回収した。これらのＤＮＡ断片を前
述のようにライゲーションした後、大腸菌Ｗ３１１０へ
の形質転換を行ない、テトラサイクリン耐性のクローン
を得た。常方に従って解析し、目的のクローンＷ３１１
０／ｐＧＨ＊　２１０ｒｏｐ−を得た。本プラスミドｐ
ＧＩＩ　ｃｔ　２１０ｒｏｐ−はプラスミドの複製を制
御（抑制）する領域（ｒｏｐと呼ばれる）の機能が欠如
したプラスミドである。

ｐＧＨｙ４３９についても同様にしてｒｏｐ機能を欠如
したプラスミドｐＧＨα４３９ｒｏｐ−を作製し、その
プラスミドによって形質転換された大腸１ｌＷ３１１０
／ｐＧシ４３９ｒｏｐ−およびＩ）Ｇｌｌ＆　２１０ｒ
ｏｐ−にょって形質転換された大腸菌Ｗ３１１０／ｐＧ
ｔｌｙ　２１０ｒｏｐ−について各々の融合蛋白すなわ
ちβｇａ１４３９ヶｈＡＮＰとβｇａ＋２１０＆　ｈＡ
ＮＰ、の生産性をＳＯ３ＰＡＧＥによって調べた。

その結果、第５図に示すように、特にｐＧ）ｌｙ２１０
において、ｒｏｐ機能を欠失させることにより、融合蛋
白の生産性の大巾な上昇が観察された。尚、第５図中の
−９士は、各々培養において誘導剤ＩＰＴＧを加えた（
＋）か、加えなかった（−）ことを示す。生産量が少な
い場合、ｒＰＴＧ添加効果が顕著に現われるが、ｒｏｐ
機能を欠損させプラスミドコピー数を増加させるとその
効果はあまりないことがわかる。

ニジｋＬ）シ【Ｌ」ン横り一ξリヨ　ｆｌＰ＋、１ａｃ
Ｚ’２１０ｙｈＡＮＰ　のイｙ次に、ｆｌＧＨｙ　２１
０のｌａｃプロモーターをλフアージ由来のＰＩ、プロ
モーターに変換したプラスミドｐＰＬｌａｃＺ　’　２
１０ｙ　ｈＡＮＰの作製を行った。

Ａ　）　　ｌ１ＩＧＨ＆　２１０−ＥｃｏＲＴの作製（
第６図）Ｍｏｒｉｎａｇａ、Ｙ、　　ら（旧ｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　２　：　６３６．１９８４）の方法に準
じてｐにｌ（＆２１０上の］ａｃＺ　’遺伝子の直前に
ＥｃｏＲＩサイトを挿入したプラスミドコピー数２１０
−ＥｃｏＲＴを作製した。即ち、まず、５μｇのｐＧｌ
＋。

２１０をＴＡ１ｙｉ衝液５０μｌ中で、２４ユニツトの
Ｈｐａｌにより完全消化した後、電気泳動的に一番大き
いαｈＡＮＰ構造遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝
子（Ｔｃ’）を含むＤＮＡ断片（第６図中の■）を分離
、回収する。その後、１００ｍＭ　）リス−塩Ｍ　（ｐ
Ｈ８，０）　５０μβ中でアルカリ性フォスファーター
ゼ処理により、５′末端のリン酸を除く。次に５μｇの
ｐＧＨａ＋２１０を５ａｌｌ緩衝液５０μβ中で、８０
ユニツトの５ａｌｌで完全消化した後、電気泳動的に一
番大きいテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を欠失した
ＤＮＡ断片（第６図中の■）を分離、回収した。この両
ＤＮＡ断片■及び■と、ＥｃｏＲＩサイトを有し、かつ
以下の塩基配列を有する５′末端がリン酸化された化学
合成−末鎖ＤＮＡ　（第５図中の■）： ５　　’　　ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧ
ＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＴＧ八ＴＴＡＣＧＧ
　　３　　’ とを混合し、９５℃で二重鎖ＤＮＡを変性させて一へ鎖
のＤＮＡとした後、ゆっくり冷却し、アニ一リング（対
合）させることにより二重鎖形成を行なった。この反応
液にｄＮＴＰ、とＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断
片）、およびＴ４ＤＮＡ　リガーゼとＡＴＰを加えて反
応させることにより完全な環状二重鎖ＤＮＡとした。こ
の反応液を用いて大腸菌Ｗ３１１０を形質転換し、テト
ラサイクリン耐性を示すクローンを得た。常法に従って
解析しＩａｃＺ　’遺伝子の直前に！！ｃｏＲＩ部位が
挿入された目的のプラスミドｐＧＨｙ　２１０−［！ｃ
ｏＲＴを得た。

Ｂ　）　　Ｐｔ１ａｃＺ　’　２１０ｙ　ｈＡＮＰの乍
＋　（７ヌ）前述のプラスミドｐＧＨ＆２１０−Ｅｃｏ
ＲＩ　５μｇをＨｌｎｄｌ［１緩衝液５０１！中で０．
２ユニツトのｆｉｃｏＲＩで部分消化した後、電気泳動
的にリニアーのＤＮＡ断片を分離、回収した。さらに、
このＤＮＡを５ａｌＩ緩衝液１００μβ中で、８０ユニ
ツトの５ａｌｌで完全消化した後、電気泳動的に２番目
に大きい、βｇａ１２１０１ｙｈＡＮＰ構造遺伝子を含
むＤＮＡ断片（第７図中の■）を分離、回収した。次に
５μｇのｐＳ２２４−３　（前述）を旧ｎｄＩＩ＋緩衝
液５０ｐｌ中で１６ユニツトのＢｃｏＲＩ及び２４ユニ
ツトのＡｖａＴで完全消化した後、λファージのＰＬプ
ロモーター及びアンピシリン耐性遺伝子を含む電気泳動
的に一番大きいＤＮＡ断片（第７図中の■）を分離、回
収した。この両ＤＮＡ断片■及び■と、各々の末端に５
ａｌｌ粘着部位及びＡｖａＩ粘着部位を有し、かつ以下
のＤＮＡ塩基配列を有する化学合成りＮＡ断片（ターミ
ネータ−ｔｒｐａ）　（第７図中の■）： をライゲーションした後、大腸菌Ｗ３１１０／　Ｃｔに
形質転換、アンピシリン及びカナマイシン耐性のクロー
ンを得た。常法に従って解析し、目的のクローンを得た
。

大旌桝６．　　ａ　ｔ＋ＡＮｐＯ）！！実施例５で作製
されたｐＧＩ（ｙ　２１０ｒｏｐ−によって形質転換さ
れた大腸菌Ｗ３１１０／ｐＧＨｙ　２１０ｒｏｐ−株を
テトラサイタリンを含む培地（４％グリセリン、２％カ
ザミノ酸、０．３％酵母エキス、２＋ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ
。

０．５％リン酸カリウム、ｐＨ７，４）で３７℃、１６
時間、３β容量（実容量２Ｉｌ）のジャーファーメンタ
−を用いて培養した。次に、遠心集菌した菌体ＰＢＳ緩
衝液（０，８％ＮａＣ１、０，０２％ＭＣＩ、０．１１
５％Ｎａｚ１１Ｐ０４．０．０２％Ｋ）１２ＰＯ４、ｐ
ｌ＋７．４）６００ｍｌに懸濁し、高圧ホモジナイザー
（Ｍａｎ　ｔｏｎＧａｕｌｔｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｉｌｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ　１５Ｍ−８ＴＡ）を用い
、８０００ｐｓ　ｉで破砕した後、遠心して沈澱画分を
得た。

沈澱画分を８Ｍ尿素６０ｍＭトリスー塩酸（ｐｔ＋　９
．４　）１００ｍ７！に懸濁して溶解させた後、等量の
６０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９，４）を加え、４Ｍ尿素溶
液にした。これに５ｍｇのＡＰＩ（和光純薬工業株式会
社から購入）で３０℃、３０分間処理したのち、２Ｎ塩
酸を加えてｐＨ６，７とし、１０ｍＭギ酸アンモニウム
で平衡化したＣＭＩ−ヨバール６５０　Ｍカラムにかけ
た。（ＭｈＡＮＰは、１００〜４５０ｍＭの直線的濃度
勾配をもつギ酸アンモニウムを流すことにより溶出した
（第８図）。ａ　ｈＡＮＰをさらにコスムジル５ｃ、、
ｐカラム（牛丼化学側製）を用いた逆相高速液体クロマ
トグラフィー（１＋Ｉａｔｅｒｓ社製）により、精製し
た。第８図中−・７はＣＭ）ヨバール６５０Ｍの溶出画
分の吸光度を示し、−・−はこれらの溶出画分のｓｃ、
８ｐカラムにおけるピーク面積を示す。

最終的に得られた。　ｈＡＮＰ標晶は、マイクロボンダ
パックＣｌ１ｌカラム（Ｗａ　ｔｅｒｓ社製）を用いた
逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ社製）
の結果一本のピークであった（第９図）。また、自動ア
ミノ酸分析器（日立製作所製８３５−５０型）による、
アミノ酸分析の結果得られたａ　ｈＡＮＰ標晶のアミノ
酸組成は。ｈＡＮＰのアミノ酸配列から予想される値と
一致し、さらに、気相プロテインシークエンサーＭｏｄ
ｅ＋　４７０Ａ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ社ＩＩ）により得られた標品のアミノ酸配列は３．　
ｈＡＮＰのそれに完全に一致した。

本法により、１７！の培養液から約１ｇの融合蛋白を得
た。尚、これはａｈＡＮＰ／２０μｇに相当する。

この生産性は本発明の製造法が如何に秀れているかを物
訪っている。

尚、実施例５で作製したプラスミドｐＰＬｌａｃＺ　’
２１０ｙ　ｈＡＮＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１．
０／Ｃ＋　／ｐＰ１−１ａｃＺ　’　２１０ｚ　ｈＡＮ
Ｐを用いた場合、菌体総蛋白量の３０〜４０％に当るβ
ｇａ１２１０ｙ　ｈＡＮＰ融合蛋白が、その菌体破砕遠
心沈澱（不溶）画分から回収され、又１βの培養から１
００ｍｇ以上の生物学的には＼純粋なａｔ　ｈＡＮＰを
得ることができた。

尚、前述のＷ３１１０／ｐＧＨｙ　２１０ｒｏｐ−の場
合も、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる解析で、菌体蛋白量の２
０〜３０％に当るβｇａ１２１０゜ｈＡＮＰを、沈澱（
不溶）画分から得ることができた。

続いて、ｐＧＨｏｔ　４３９ｒｏｐ−を用いて融合蛋白
中のβ−ｇａｌ領域が縮小化したプラスミドを作製し、
β−ｇａ１ｗ４域の大きさがどれくらいであればβｇａ
ｌ、　ｈＡＮＰ融合蛋白の生産に有効であるかを検討し
た。

（Ａ　）　　ｐＧＨｏｔ　Ｂａｌの作製（第１０図）１
０ｚｇのｐＧＨｏｔ４３９ｒｏｐ−を旧ｎｄＴＩＩ緩衝
液１００μβ中で、１００ユニツトのＡａｔｌＴで完全
に消化した後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した
。

次に、ＤＮＡをＢａ１３１緩衝液（１２ｍＭ　ＣａＣ１
ｚ、１２ｍＭＭｇＣ１，，０，２Ｍ　　ＮａＣｌ　、、
２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　　、　　１ｍＭＥＤＴＡ
（ｐＨ８，０））　１００μｐに溶解して１０ユニツト
のＢ　ａ１３１で５分、１０分、２０分後に各々３０ｔ
ｔ／の溶液ヲとり同量のフェノール−クロロホルム１：
１溶液で処理することによりＢ　ａ１３１の反応を停止
させた。次にフェノール層（下層）を除いた後、残留す
るフェノールをエーテルで抽出し、さらにエタノール沈
澱によりＤＮＡを回収した。続いて各々のＤＮＡをＴＡ
緩衝液３０μ！に溶かしたのち、１５ユニツトの［！ｃ
ｏＲＩで完全に消化し、そのうち１０Ｉｉｌ！を２％ア
ガロースゲル電気泳動を行った。

このうち４００塩基対以下のＤＮＡ断片が生じた１０分
、２０分処理のサンプルの残りの２０μｌにＴＡ緩衝液
１（Ｊμｌ及び２５ｍＭ　ｄＮＴＰ　２　Ｉｌｌ、１０
０ｍＭジチオスレイトール５μＮ、４ユニツトのＴ４Ｄ
Ｐａｓｅを加え反応させることによりＤＮＡ末端を平滑
末端とした。次に、エタノール沈澱により各々のＤＮＡ
を集めた後、前述のようにライゲーション及び大腸菌Ｗ
３１１．Ｏ株への形質転換を行ない５４株のＢａ１１０
／ｐＧＨｙ　Ｂａｌ　クローンを分離した。

上記で得られたクローンをテトラサイクリンを含む培地
（２，４％酵母エキス、１．２％トリプトン、０．５％
グリセロール、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，６
））で培養し、遠沈菌体をフレンチプレスで破砕後５Ｏ
３−ＰＡＧＦ！によりβｇａｌ　ｙ　ｈＡＮＰ融合蛋白
の産生について検討した。その結果、５４クローンのう
ち２２クローンがβｇａ１２１Ｌｙ　ｈＡＮＰより小さ
い融合蛋白を産生し、またこれらはずべてβｇａ１２１
０ｙ　ｈＡＮＰと同様、菌体破砕液の沈澱（不溶）画分
から８Ｍ尿素溶液により可溶化（抽出）されることがわ
かった。また、８Ｍ尿素抽出液を２倍に希釈し４Ｍ尿素
溶液とした後、Ａ、ＰＩ処理を行ったところ、これら２
２クローンの内１６クローン由来の融合蛋白について。

ｈＡＮＰに相当する分子量だけ小さくなったポリペプチ
ドが検出された。

さらにこれらのうち４クローンすなわち、Ｂａ１１０／
ｐＧＨ，Ｂａ１２Ｂ　、Ｂａ１１０／ｐＧＨ６Ｂａ１３
５　、Ｂａ１１０／ｐＧｎ、、　Ｂａ１３６　、および
Ｗ３１１．０／ｐＧＦｌｙ　Ｂａ１４３から得られる各
々のβｇａｌ　ａ−ｈＡＮＰ融合蛋白のＡＰＩ処理サン
プルについて １１ＰＬＣによる解析を行った結果、標準の。ｈＡＮＰ
に相当する位置にピークが得られた。また、これらのピ
ークが、ｙｈＡＮＰであることをアミノ酸分析により確
認した。また、これらのクローンには、実施例５および
６に記したＢａ１１０／ｐＧＨ＊　２１０ｒｏｐ−やＷ
３１．１０／ｐｌａｃＺ　’　２１０ｙ　ｈＡＮＰと同
様に目的とする融合蛋白を高生産している株もあり、こ
れらのクローンも。ｈＡＮＰの生産に有用であることが
示された。

また、上記の４クローンから得られる融合蛋白における
β−ｇａｌｆｉｌ域について、該当する融合蛋白をコー
ドするＤＮＡ配列の解析から訓べた結果、ｐＧＨｙ　Ｂ
ａ１２８は１３９個、ｐＧＨ＋ｙ　Ｂａ＋３６は１２４
個、ｐＧＨｙ　Ｂａ１４３は９７個、ＰＧＨ＆　Ｂａ１
３５は９２個のアミノ酸残基からなるＮ末端からのβ−
ｇａｌ断片を有していることがわかった。

参考としてＷ３Ｌ１０／ｐＧＨｙ　Ｂａ１２Ｂクローン
の培養後の菌体破砕溶液についてのＳ［ｌ５−ＰＧＡ［
！の結果を第１１図に示した。図中、Ｔはトータル、Ｓ
は上清両分、Ｐは沈澱画分を示す。沈澱画分に融合蛋白
（矢印）が特異的に存在している。また、沈澱画分から
抽出される該融合蛋白をＡＰＩ処理した後のＩＩＰＬＣ
パターンを第１２図に示した。図中、保持時間１４．４
５分のピークは。ｈＡＮＰのピークと一致する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、βｇａｌｙ　ｈＡＮＰ融合蛋白発現プラスミ
ドの１つρＧ１１０１００７の造成プロセスの概略を示
す。 図中Ｚ部はヶｈＡＮＰをコードするＤＮＡ領域を示す。 第２図は、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｐ）が縮小
化された３種のβｇａｌ　ｃｔ　ｈＡＮＰ融合蛋白発現
プラスミドの造成プロセスの概略を示す。 第３図は、実施例２および３で得られた４株のβｇａｌ
　、、　ｈＡＮＰ産生形質転換株の培養菌体処理物につ
いての５ｒｌＳ−ＰＡＧＥを示す。図中、Ｔは破砕培養
菌体全体、Ｓはその上清両分、Ｐは沈澱（不溶）画分の
結果を示す。 第４図は、ｐＧＩＩ＋ｙ　２１０ｒｏＰ−の造成プロセ
スの概略を示す。 第５図は、βｇａｌヶｈＡＮＩ”発現プラスミド上のｒ
ｏｐ機能を欠如させることによる融合蛋白の産生能への
効果を示す５ｒ）Ｓ−ＰＡＧＦ！である。 第６図は、ｐＧＨ，ｙ　２１０　［１ｃｏＲＩの造成プ
ロセスの概略を示す。 第７図は、融合蛋白がλファージのｐｔプロモーター支
配下に発現されるプラスミドｐｌａｃＺ　’　２１０、
、　ｈＡＮＰの造成プロセスの概略を示す。 第８図は、ＡＰＩ処理された融合蛋白βｇａ＋２１．０
、　ｈＡＮＰの０Ｍトヨパール６５０　Ｍカラムクロマ
トグラフィーを示す。 第９図は、βｇａ１２１０ｚ　ｈＡＮＰをＡＰＩ処理し
た後精製した。ｈＡＮＰの逆相高速液体クロマトグラフ
ィー　（）ＩＰＬＣ）の結果を示す。 第１０図は、βｇａ１ｗ４域を縮小したプラスミドｐＧ
ＩＩｙＢａｌの造成プロセスの概略を示す。 第１１図は、Ｂａ１１０／ｐＧＨ＊　Ｂａ１２８の培養
菌体処理物についての５Ｏ３−ＰＡＧＥを示す。図中、
Ｔは破砕培養菌体全体、Ｓはその上清両分、Ｐは沈澱（
不溶）画分の結果を示す。 第１２図は、第１１図のＰ画分から得られる融合蛋白を
ＡＰＴ処理した後の逆相高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リジン（Ｌｙｓ）残基を有しない真核生物由来の生
   理活性ペプチドの製造法であって、 Ａ）該生理活性ペプチドが、大腸菌β−ガラクトシダー
   ゼ由来のリジン残基を有しないポリペプチド断片を含む
   ９０乃至２２０個のアミノ酸からなるポリペプチドのＣ
   末端にリジン残基を介して融合して成る融合蛋白として
   、大腸菌またはファージ由来遺伝子のプロモーター支配
   下に発現されうるプラスミドにより形質転換された大腸
   菌を培養し、 Ｂ）該大腸菌形質転換体の培養菌体を破砕して得られる
   不溶画分から、上記融合蛋白を可溶化剤溶液で可溶化・
   抽出し、 Ｃ）リシルエンドペプチダーゼ処理により、上記融合蛋
   白から目的とするペプチドを得る、ことを特徴とする生
   理活性ペプチドの製造法。 ２、前記生理活性ペプチドが、ヒト心房由来のナトリウ
   ム利尿活性を有するペプチドである特許請求の範囲第１
   項記載の製造法。 ３、生理活性ペプチドが、次の式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表わされるアミノ酸配列を有するペプチド（αｈＡＮ
   Ｐ）である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の製造
   法。 ４、前記大腸菌β−ガラクトシダーゼ由来のポリペプチ
   ド断片が、該蛋白質のＮ末端から２１０個、１３９個、
   １２４個、又は９７個のアミノ酸からなるポリペプチド
   である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ５、前記プロモーターが、大腸菌ラクトース遺伝子由来
   のプロモーター、又はラムダ（λ）ファージ遺伝子由来
   のＰ＿Ｌプロモーターである特許請求の範囲第１項記載
   の製造法。 ６、前記プラスミドが、ｐＧＨα２１０ｒｏｐ＾−で表
   わされるプラスミドである特許請求の範囲第１項記載の
   製造法。 ７、前記プラスミドが、ｐＰ＿ＬｌａｃＺ′２１０αｈ
   ＡＮＰで表わされるプラスミドである特許請求の範囲第
   １項記載の製造法。 ８、前記プラスミドが、ｐＧＨαＢａ１２８、ｐＧＨα
   Ｂａ１３６、ｐＧＨαＢａ１４３またはｐＧＨαＢａ１
   ３５で表わされるプラスミドである特許請求の範囲第１
   項記載の製造法。