KR900001014B1 - 소 성장 호르몬 유도체 발현 벡터의 제조방법 - Google Patents
소 성장 호르몬 유도체 발현 벡터의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용 없음.
Description
제1 내지 4도는 플라스미드 pNM 575의 제조 프로토콜 모식도이다.
제5 내지 8도는 플라스미드 pNM 789 B의 제조 프로토콜 모식도이다.
제9도는 플라스미드 pCZ1920 및 pJR1의 제한 부위도이다.
제10도는 플라스미드 pCZ112의 제한부위도이다.
제11도는 티모신 α1 합성 유전자를 나타낸다.
제12도는 뉴클레오티드 단편 T15의 합성 프로토콜이다.
제13도는 플라스미드 pThα1의 합성 프로토콜이다.
제14도는 프로인슐린 합성 유전자를 나타낸다.
제15도는 플라스미드 pHI7△4△1의 제조 프로토콜이다.
제16도는 플라스미드 pHI104의 제조 프로토콜이다.
본 발명은 생활성 소 성장 호르몬(bGH) 유도체를 코드하는 유전자의 판독 대중에 존재하는 전사 및 해독 활성화 뉴클레오티드 서열 및 유도된 조건하에서 카피 수 조절능을 상실하는 레플리콘으로 이루어진 신규의 선별가능하며 자발적으로 복제하는 재조합체 DNA 발현 벡터의 제조방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 전술된 벡터의 신규 형질전환체 및 소 성장 호르몬 유도체의 제조방법에도 관련된다.
유전자 발현 문제로 인해 bGH 생성을 위한 재조합체 DNA기술의 개발은 많은 제약을 받았다. 이와 같은 유전자 발현 문제중 몇가지는 유럽 특허 공보 제0075444호에 기술되어 있는데 여기에는 기능적으로 최적이 아닌 mRNA의 전사가 포함된다. 이 mRNA는 정상적인 리보솜 결합을 방해함으로써 bGH 발현을 현저하게 감소시키거나 방지하는 줄기 및 고리 2차 구조를 갖는다. 본 발명은 고수준의 bGH 유도체 발현 벡터를 제공함으로써 상기와 같은 문제점을 극복하게 한다.
본 명세서에서 기술된 하기 용어에 대한 정의는 다음과 같다.
재조합체 DNA 클론화벡터-자발적으로 복제하는 벡터를 뜻하며 하나 이상의 DNA 단편이 추가될 수 있거나 추가된 DNA분자를 함유하는 플라스미드가 포함되나 이것만을 의미하는 것은 아니다.
재조합체 DNA 발현 벡터-하나 이상의 전사 및 해독 활성화제 서열이 삽입된 재조합체 DNA 클론화 벡터를 의미한다.
전사 활성화 서열-DNA의 mRNA 전사체로의 전사를 지시하거나 DNA를 mRNA 전사체로 전사시키는 DNA 서열을 의미한다.
해독 활성화 서열-mRNA 전사체의 펩타이드 또는 폴리펩타이드로의 해독을 지시하거나 mRNA 전사체를 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 해독하는 DNA서열을 의미한다.
해독 개시 시그널-해독 개시 코돈을 코드화하는 DNA 트리플리트를 의미한다.
해독 종결 시그널-해독 종결 코돈을 코드화하는 DNA 트리플리트를 의미한다.
형질전환-유전자형을 변화시키는 숙주 세포에 DNA를 도입시키는 것을 의미한다.
형질전환체-형질전환된 숙주 세포를 의미한다.
제한 단편-하나이상의 제한 효소에 의해 생성된 직쇄 DNA 서열을 의미한다.
레플리콘-재조합체 DNA 클론화 및 발현 벡터의 복제를 조절하는 DNA 서열을 의미한다.
런어웨이 레플리콘-카피 수 조절능을 상실하거나 상실할 수 있어서 무한정하게 복제시킴으로써 이 레플리콘이 삽입된 DNA의 카피 수를 현저하게 증가시키는 레플리콘을 의미한다.
작용성 폴리펩타이드-회수가능한 생활성 이종 폴리-펩타이드 또는 전구체; 이종 폴리펩타이드 및 동종 폴리펩타이드의 일부 또는 전체를 함유하는 회수가능한 생활성 폴리펩타이드; 또는 이종 폴리펩타이드 및 선택적으로 전달될 수 있는 생불활성화 폴리펩타이드로 이루어진 회수 가능한 생불활성 융합 폴리펩타이드를 의미한다.
융합된 유전자 생성물-동종 폴리펩타이드의 일부 또는 전체를 함유하는 회수 가능한 이종 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명은 a) 런어웨이 레플리콘(runaway replicon)과 b) 생활성 소 성장 호르몬 유도체를 코드화하는 하기 유전자 (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) 또는 (8)의 판독대중에 존재하는 전사 및 해독 활성화 서열을 연결시켜 선별가능하며 자발적으로 복제하는 재조합체 DNA 발현 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기에서 A는 데옥시아데닐이고 G는 데옥시구아닐이며 C는 데옥시시토실이고 T는 티미딜이며 R은 소 성장 호르몬의 아미노산 9(로이신) 내지 191(페닐알라닌)을 코드화하는 DNA 서열이고 R1은 하기의 해독 정지 서열을 코드화하는 DNA 서열이다.
또한 본 발명은 전술된 벡터의 신규 형질전환체, 화합물, 과립의 제조방법에도 관련된다.
본 발명 벡터는 하기 (a), (b) 또는 (c)의 XbaI-HgiAI DNA 링커 서열을 플라스미드 pCZ101의 ~10.2kb BamHI-XbaI 및 ~0.6kb BamHI-HgiAI 단편에 각각 연결시켜 제조할 수 있다.
플라스미드 pCZ1920, pJR1 및 pAT 2로 각각 명명된 생성된 플라스미드는 각각 1) 생활성 소 성장 호르몬 유도체의 코드화 서열의 판독대중에 이.콜라이 리포프로테인 유전자 전사 및 해독 활성화 서열(Nakamura and Inouye. 1979, cell18 : 1109 참조); 2) 적절하게 위치한 해독 종결 시그널 및 3) 런어웨이 레플리콘을 함유한다. 플라스미드 pCZ1920, pJR 1 및 pAT 2에 의해 형질전환된 세포는 각각 MET-LYS-GLY-ASPN-SER-MET-ALA-bGH, MET-PHE-PRO-ALA-MET-ALA-R2 및 MET-bGH를 발현한다.
(여기에서 MET는 메티오닌이고; LYS는 라이신이며; GLY는 글리신이고; ASPN는 아스파라긴이며; SER은 세린이고; ALA는 알라닌이며; PHE는 페닐알라닌이고; PRO는 프롤린이며; bGH는 N-말단(개시) 페닐알라닌으로 시작되는 소 성장 호르몬의 천연 아미노산 서열이고; R2는 N-말단에서부터 6번째 아미노산(로이신)으로 시작되는 소 성장 호르몬의 천연 아미노산서열이다.)
플라스미드 pCZ1920 및 pJR1의 제한 부위도는 제9도에 나타내었다.
본 발명의 범위내에 포함되는 또 다른 플라스미드는 하기 a), b), c), d), e), f) 및 g)의 TagI-HgiAI DNA 링커 서열을 각각 플라스미드, pCZ10101~10kb EcoRI-BamHI 및 ~0.6kb Bam HI-HgiAI 단편 및 플라스미드 pNM 608의 ~0.29kb EcoRI-ClaI 단편에 연결시켜 제조할 수 있다.
상기식에서 A는 데옥시아데닐이고; G는 데옥시구아닐이며; C는 데옥시시티딜이고; T는 티미딜이다.
플라스미드 pCZ112, pAT1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 및 pCZ156으로 각각 명명되는 생성된 플라스미드 1) 생활성 소 호르몬 유도체에 대한 코드화 서열의 판독대중에 이.콜라이 트립토판 유전자 전사 및 해독 활성화 서열; (Hallewell and Emtage 1980, Gene 9 : 27 참조) 2) 적절히 위치한 해독 종결 시그널; 및 3) 런어웨이 레플리콘을 함유한다.
플라스미드 pCZ112, pAT1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 및 pCZ156에 의해 형질전환된 세포는 각각 MET-ASP-ASP-LYS-bGH, MET-bGH, MET-ASP-bGH, MET-ASP-bGH, MET-VAL-bGH, MET-ALA-PHE-PRO-ALA-MET-SER-LEU-SER-VAL-b'GH 및 MET-ASP-bGH를 발현한다.
(여기에서 MET는 메티오닌이고; ASP는 아스파르트 산이며; LEU는 로이신이고; SER은 세린이며; PRO는 프롤린이고; PHE는 페닐알라닌이며; LYS는 라이신이고; VAL는 발린이며; ALA는 알라닌이고; b'GH는 9번째 아미노산인 로이신으로 시작되는 소 성장 호르몬의 천연 아미노산 서열이며; bGH는 N-말단(개시) 페닐알라닌으로 시작되는 소 성장 호르몬의 천연 아미노산 서열이다) 폴리스미드 pCZ112의 제한 부위도는 제10도에 나타내었다.
플라스미드 pCZ1이 출발물질은 ∼10.8kb이며, 플라스미드 pNM789B의 ∼0.6kb XbzI-BamHI 단편을 유사하게 분해된 플라스미드 pIM-I'-A3에 연결시켜 제조한다. 유사하게 분해된 플라스미드 pIM-I'-A3는 이.콜라이의 전사 및 해독 활성화서열 및 런어웨이 레플리콘을 함유하며 NRRL에 기탁된 균주인 이.콜라이 K12 RV308/pIM-I'-A3(KFCC-10167, 한국종균협회(KFCC), 1985년 9월 7일)로부터 수득할 수 있다. 이 균주는 바람직한 소스로 이용할 수 있으며 수리번호 NRRL B-15733으로 플라스미드 기탁기관에 기탁되어 있다. 플라스미드 pNM789B 출발물질은 제1 내지 8도 및 실시예 1에 기술된 바에 따라 플라스미드 pKEN111로부터 유도된다. 플라스미드 pKEN111은 NRRL에 기탁된 이.콜라이 K12 CC620/pKEN111(KFCC-10168, 한국종균협회(KFCC), 1985년 9월 7일)로부터 수득할 수 있다. 이 균주는 바람직한 소스로 이용할 수 있으며 수리번호 NRRL B-15011로 플라스미드 기탁기관에 기탁되어 있다. 또한 플라스미드 pNM789B는 이.콜라이 리포프로테인 유전자의 전사 및 해독 활성화 서열, bGH 및 bGH N-말단에 9원 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질의 적절히 위치한 해독 종결 시그날을 함유하는 코드화 서열을 함유한다. XbaI-BamHI 단편에 함유된 융합 단백질-코드화 서열을 적절히 분해된 플라스미드 pIM-I'-A3에 연결시켜 전술된 플라스미드 pCZ101의 출발물질을 생성한다.
플라스미드 pNM608 출발물질은 ∼4.6kb이며, 플라스미드 pHI7△4△1의 EcoRI-ClaI 단편을 Eco RI-claI로 분해된 플라스미드 PBR322에 연결시켜 제조한다. 플라스미드 pHI7△4△1은 후술되는 실시예 5에 따라 제조할 수 있다. 플라스미드 pHI7△4△1중에 TgaI 제한 부위가 여러군데 존재하므로 목적하는 EcoRI-TagI 단편은 pHI7△4△1 EcoRI-HpaI 및 HpaI-TagI 그 단편을 서브클론화하여 가장 양호하게 생성할 수 있다. 플라스미드 pNM608은 이.콜라이 트립토판 전사 활성화 서열을 함유하므로 본 발명의 벡터를 제조하는 데에 유용하다.
본 분야에서 숙련된 사람은 전술된 여러가지 DNA 링커가 본 발명의 중요한 성분임을 인식하게 될 것이다. 이들 서열은 통상 완전히 보호된 디데옥시 리보뉴클레오티드 구성 블록을 사용하여 변형된 포스포트리에스테르 법에 의해 제조할 수 있다. 이 합성법은 본 분야에 잘 알려져 있으며 이다구라 등의 방법[Itakura et al., 1977, Sciemce 198 : 1056 참조]과 크레아등의 방법[Crea et al, 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75 : 5765 참조]에 따라 수행할 수 있다. 또한, 특히 바람직한 방법은 허슁 등의 방법[Hsiung et al., 1983, Nucleic Acid Research 11 : 3227 참조] 및 나랑등의 방법[Narany et al., 1980, Methods in Enzymology 68 : 90 참조]에 기술되어 있다. 전술된 링커는 해독 활성화 서열 및 전술된 bGM 유도체 화합물의 개시 부분(N-말단 부위)을 함유하는 아미노산을 코드화 한다(적절히 위치한 해독 종결 시그널을 포함하는) bGH 코드화 서열의 잔여분 및 전사 활성화 서열은 플라스미드 pCZ101의 적절한 단편을 연결함으로서 제조할 수 있다. 상기와 같이 연결시켜 본 발명의 대표적인 소 성장 호르몬 유도체를 발현시킨다.
플라스미드 pCZ101의 ∼900bp BstEII제한 단편을 제거한 다음 다시 폐환시키면 플라스미드 pCZ103이 생성된다. BstEII의 제거는 플라스미드 pCZ101중 bGH 코드화 부위에 영향을 주지 않는다. 플라스미드 pCZ101 대신 플라스미드 pCZ103을 사용하면 pCZ103과 유사하나 900bp의 보다 작은 플라스미드가 생성된다. 그러므로 pCZ103-유도화 플라스미드에 의해 발현된 bGH 유도체는 pCZ101 유도화 상응부위에 의해 발현된 유도체와 동일하다.
따라서 전술된 플라스미드 pJR1 및 pAT2 제조공정에서 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-XbaI 및 0.6kb BamHI-HgiAI 제한 단편 대신 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-XbaI 및 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한 단편을 이용하면 유도체 플라스미드 pJR1.3 및 pAT2.3이 각각 생성된다. 또한 전술된 플라스미드 pAT1, pASR1, pASP2, pCZ154, pCZ155 및 pCZ156의 제조공정에서 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-EcoRI 및 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한 단편 대신 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-EcoRI 및 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한 단편을 사용하면 유도체 플라스미드 pAT1.3, pASP2.3, pCZ154.3, pCZ155.3 및 pCZ156.3이 각각 생성된다.
본 발명을 수행하는데에 있어서 특정한 서열을 선택해야 하는 것이 중요한 문제는 아니기 때문에 특정한 전사 활성화 서열을 사용해야 하는 것은 아니다. 전술된 리포-프로테인 및 트립토판 활성화 서열 대신 사용할 수 있는 전사 활성화 서열에는 이.콜라이 락토즈(lac), 박테리오파아지 λPLOL및 박테리오파아지 λPROR전사 활성화 서열이 포함되나 이것에만 제한되는 것은 아니다. 또한 하나 이상의 전사 활성화 서열 또는 이들 서열의 일부를 trp 및 lac 또는 tac 전사 활성화 서열과 같이 직렬로 사용할 수 있다. 전술한 서열 모두는 앞서 설명되었으며 합성하거나 공지된 플라스미드로부터 제조할 수 있다.
본 명세서에서 기술되는 특정한 공정에서는 플라스미드 복재를 영국 특허 공보 제1,557,774호 및 우흘린 등[Uhlin et al 1979, Gene 6 : 91]의 문헌에 기술된 열 유도성 런어웨이 레플리콘에 의해 측정한다. 30℃이하, 특히 25℃에서 레플리콘은 세포당 카피수 약 10 내지 15로 비교적 낮은 카피수를 유지한다. 온도가 37℃로 상승하면 카피수 조절능이 상실되며 이 레플리콘을 함유하는 플라스미드는 세포당 카피수가 1000 내지 2000으로 증가된다. 본 명세서에서 예시된 특정한 런어웨이 레플리콘은 전술된 플라스미드 pIM-I'-A3 출발 물질에 함유되어 있다. 본 분야의 숙련가들은 본 발명이 특정한 런어웨이 레플리콘 또는 카피수 돌연변이체를 사용하는 방법에만 제한되지 않음을 알 수 있을 것이다. 기타 유도성 런어웨이 레플리콘 또는 카피수가 많은 레플리콘은 적절히 선택하거나 국제 특허 공보 제WO82/02801호에 기술된 방법으로 제조할 수 있다. 이와 같은 레플리콘은 본 발명의 범위내에 포함되는 발현 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
유도 및 카피수 조절능 상실하에 외래성 유전자를 런어웨이 레플리콘을 함유하는 벡터를 클론화하면 단백질 합성속도가 현저히 증가되고 신규이며 미확인된 세포내 단백성 과립이 부수적으로 생성된다. 본 발명에 포함되는 이와 같은 과립은 단백 조성에 있어서 매우 균일하며, 따라서 재조합체 DNA-함유 숙주 세포에서 가끔 나타나는 공지된 고분자 집합체 및 포합물과 구별된다.
재조합체 DNA-함유 숙주 세포에서 가끔 나타나는 공지된 고분자 포함물은 통상 핵산, 탄수화물, 지질 및 펩타이드와 같은 세포 성분을 함유하는 불균일 물질이며 특정한 단백 생성물의 단지 10 내지 20%만을 차지한다. 본 발명의 과립은 50% 이상, 빈번하게는 80% 이상의 과립을 함유하는 목적 단백 생성물과 매우 균질하다.
본 발명의 신규한 과립은 세포 분해물로부터 용이하게 분리할 수 있으며 저농도의 요소 또는 세제 중에서 세척할 때에도 안정하다. 이와 같이 세척하면 과립에 비선택적으로 결합되는 단백질이 제거된다. 선택적 활성이 높은 물질을 생성하는 분리 공정은 외래성 단백의 정제시 1단계로 이용된다. 그러므로, 정제공정의 모든 차후 단계는 간단해진다. 특히 유리한 점은 세포벽 성분이 과립으로부터 용이하게 분리될 수 있다는 점이다.
본 발명의 과립이 생성됨으로써 외래성 단백이 분리되어, 정상 세포 대사가 방해되거나 미숙한 세포가 사멸되지 않도록 하는 것으로 믿어진다. 인체 프로인슐린과 같은 몇가지 단백질은 이.콜라이에서 급속히 감소되며 축척되지 않는다. 그러나, 이와 같은 단배질이 런어웨이 레플리콘을 함유하는 벡터에서 코드화되면 프로인슐린은 통상의 불안정한 단백이 단백분해되는 것을 막을 수 있는 불용성 과립을 생성한다. 그러므로, 본 발명의 과립 형성은 축적되는 불안정한 단백질 뿐만 아니라 유전자 생성물의 분리 및 정제 공정을 간략하는데 유용하다.
또한 본 발명은 캄피턴트(Competent)세포를 a) 런어웨이 레플리콘 및 b) 작용성 폴리펩타이드의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오티드 트리플리트에 인접하여 하부에 위치한 해독정지 시그널을 함유하는 작용성 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독대 중에 존재하는 전사 및 해독 활성화 서열로 이루어진 선별가능하고 자발적으로 복제하는 재조합체 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 후, 유전자 발현 및 런어웨이 레플리콘의 활성화 또는 유도체 적절한 증식 조건하에서 형질전환된 세포를 배양시킴을 특징으로 하여 세포내 균질성이 높은 외래성 단백과립을 제조하는 방법에도 관련된다.
전술된 바와 같이 모든 런어웨이 레플리콘 및 전사 및 해독 활성화 서열, 작용성 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 융합된 유전자 생성물은 상기 기술된 방법에 사용하기 위한 벡터를 제조하는데에 사용할 수 있다. 이와 같은 코드화 서열에는 소 성장 호르몬(bGH), 인체 성장 호르몬(hGH), 인체 전-성장 호르몬(pre-hGH), 돼지의 성장 호르몬(pGH), 포유동물 성장 호르몬, 조류 성장 호르몬, 성장 호르몬 유리인자, 인체 인슐린 A쇄, 인체 인슐린 B쇄, 인체 프로인슐린, 인체 프리-프로인슐린(pre-proinsulin), 인체 및 비인체 인터페론, 유로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인터루킨(interleukin)II, 모든 폴리펩타이드 호르몬, 모든 폴리펩타이드 효소 및 모든 연구적 또는 상업적 가치가 있는 생활성 폴리펩타이드를 코드하는 서열이 포함되나 이것에만 제한되는 것은 아니다.
전술한 방법에 따른 배양조건하에서 본 발명의 과립을 생성하는 형질전환된 세포의 예로는 이.콜라이 K12 RV308/pCZ1920, 이.콜라이 K12 RV308/pJR1, 이.콜라이 K12 RV308/pASP1, 이.콜라이 K12 RV108/pCZ112, 이.콜라이 K12 RV308/pASP2, 이.콜라이 K12 RV308/pAT1, 이.콜라이 K12 RV308/pAT2, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ154, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ156, 이.콜라이 K12 RV308/pJR1.3, 이.콜라이 K12 RV308/pASP1.3, 이.콜라이 K12 RV308/pAT2.3, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ1.3, 이.콜라이 K12 RV308/pAT2.3, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ154.3 및 이.콜라이 K12 RV308/pCZ156.3를 들 수 있으나 여기에만 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 균질성이 높은 과립 제조방법은 소 또는 인체 성장 호르몬을 코드하는 전술된 플라스미드를 사용하는 방법에만 제한되는 것은 아니다. 또한 인체 프로인슐린 과립은 전술된 방법에 따라 인체 프로인슐린 코드화 서열로 이루어진 벡터를 함유하는 세포를 배양시켜 제조할 수도 있다. 이와 같은 벡터는 제15도에 제시된 바와 같이 trp LE'-프로인슐린 융합 서열을 함유하는 EcoRI-BamHI 단편을 플라스미드 pCZ101의 거대 EcoRI-BamHI 단편에 연결시켜 제조할 수 있다.
플라스미드 pCZ201로 명명된 생성된 플라스미드는 통상의 형질전환에 따라 이.콜라이 K12 RV308과 같은 이.콜라이를 형질전환시킬 수 있다. 이 경우에 인체 프로인슐린을 함유하는 본 발명의 과립은 37℃에서 이.콜라이 K12 RV308/pCZ201 형질전환체를 배양시켜 수득할 수 있다.
본 발명에서 기술된 대표적인 DNA 서열 및 플라스미드를 다양하게 변형시킬 수 있다. 예를 들어 유전자코드를 분해시켜 전술된
해독 종결 시그널을
또는
해독 종결 시그널로 치환시킬 수 있을 뿐만 아니라 폴리펩타이드 코드화 부위를 뉴클레오티드로 치환시킬 수 있다. 그러므로 R은 전술한 바와 같이 bGH의 9번째 아미노산(로이신) 내지 191번째 아미노산(페닐알라닌)을 코드하는 DNA 서열중의 하나일 수 있다. 이들 서열은 bGH의 공지된 아미노산 서열로부터 추리할 수 있으며 통상의 합성법에 의해 제조할 수 있다. 그러나, 뉴클레오티드 트리플리트는 mRNA중에 상보적 염기가 생성되지 않도록 하기 위해 공지된 이론 및 주커 및 스티에글러의 문헌에 기술된 외삽법에 따라 선택하여야 한다[참조 Zuker and stiegler, 1918, Nucleic Acids Research 9(1) : 133]. 상보적 염기간의 수소결합은 해독 효율을 감소시키는 줄기 및 고리 구조와 접힘을 초래한다. 본 분야의 숙련가들은 전술한 합성법에 따라 전술된 모든 변형체를 제조할 수 있음을 알게 될 것이다. 그러므로 본 발명은 예시된 DNA 서열 및 플라스미드에만 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현벡터 및 방법을 이.콜라이, 이.콜라이 K12, 이.콜라이 K12 RV308, 이.콜라이 K12 HB101, 이.콜라이 K12 C600, 이.콜라이 K12 C600 RK-MK-, 이.콜라이 K12 RR1, 이.콜라이 K12 MM294 등의 그람 음성 원핵 미생물과 같은 광범위한 숙주 미생물에 이용할 수 있다. 본 발명의 태양 모두가 유용하나 그중에서도 특히 몇가지 벡터 및 형질전환체가 바람직하다. 바람직한 벡터에는 pCZ1920, pJR1, pJR1.3, pCZ112, pAT1, pAT1.3, pAT2, pAT2.3, pASP1, pASP1.3, pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, pCZ156.3, pASP2.3, 및 pASP2가 포함되며 바람직한 형질전환체에는 이.콜라이 K12 RV308/pCZ1920, 이.콜라이 K12 RV308/pJR1, 이.콜라이 K12 RV308/pJR1.3, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ112, 이.콜라이 K12 RV308/pAT1, 이.콜라이 K12 RV308/pAT1.3, 이.콜라이 K12 RV308/pAT2, 이.콜라이 K12 RV308/pAT2.3, 이.콜라이 K12 RV308/pASP1, 이.콜라이 K12 RV308/pASP1.3, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ154, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ154.3, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ156, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ156.3, 이.콜라이 K12 RV308/pASP2.3 및 이.콜라이 K12 RV308/pASP2가 포함된다. 이들 중에서 플라스미드 pCZ112, pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, pCZ156.3, pASP2.3, 및 pASP2가 특히 바람직한 벡터이며 이.콜라이 K12 RV308/pCZ112, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ154, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ154.3, 이.콜라이 K12, RV308/pCZ156, 이.콜라이 K12 RV308/pCZ156.3, 이.콜라이 K12 RV308/pASP2.3, 및 이.콜라이 K12 RV308/pASP2가 특히 바람직한 형질전환체이다.
본 분야의 숙련가들은 소 성장 호르몬 유도체 생성물은 표준 발효 조건을 이용하여 발현시키는 것처럼 본 발명의 발현벡터를 적절한 숙주 미생물을 형질전환시키는데 사용할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 고도로 균질한 과립으로 발현되고 통상의 방법에 의해 생성된 세포 분해물로부터 분리시킨 생성물은 우유의 증산과 소의 성장을 전체적으로 촉진시키는데 유용된다. 소에 대한 사용형태, 투여 방법 및 적용량은 유럽 특허 공보 제0085036호의 7 내지 9페이지에 기술되어 있다. 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하는 것이다. 본 발명에 대한 설명 및 본 발명은 수행하는 실제적인 공정이 기술된다.
[실시예 1]
[플라스미드 pNM 789의 제조]
A. 플라스미드 pKEN 021 및 그의 XbaI-BamHI 단편의 제조
플라스미드 pKEN 021을 XbaI-BamHI 분해시켜 생성된 ∼5'.1Kb단편(제3도의 106)을 출발물질로 사용한다. 플라스미드 pKEN 021은 pKEN 111(제1도의 101, Lee, et al.,; 1981, J. Bact. 146 : 861-866 and Zwiebel, et al., 1981, J-Bact-145 : 654-656 참조)의 유도체이고 이.콜라이의 리포프로테인 유전자를 함유하는 ∼2.8kb 단편을 갖는다. 이 단편에 대해서는 문헌[Nakamura and Inouye, 1979, Cell 18 : 1109∼1117]에 기술되어 있다. pKEN 021에서 pBR 322의 유일한 EcoRI과 SalI 제한 부위간의 650 bp 서열은 이.콜라이의 리포프로테인 유전자에서 유도된 서열로 치환하였다. 리포프로테인 유전자 서열(Nakamura and Inouye 1979)은 프로모터, 5' 비해독부위 및 리보솜 결합 부위를 함유하는 리포프로테인 유전자의 제1트리플리트(메티오닌)에서 상향으로 462bp Alu 단편을 포함한다. 유일한 XbaI 제한 부위는 해독 개시 메티오닌 시그널 전의 리보솜 결합 부위 16bp내에 위치한다. 구조 유전자의 해독종결 코돈에서 105bp 상향에 위치한 pvuII 베한부위는 합성 DNA 링커(5'CCGGATCCGG3', Collaborative Research에서 수득)를 첨가함으로써 BamHI 제한부위로 변했다. 리포프로테인의 마지막 35개 아미노산에 대한 코드화서열, 해독종결 시그널 및 mRNA의 3'비해독 부위에 상응하는 서열은 BamHI 부위 다음에 위치한다. 또한 플라스미드 pKEN 021은 리포프로테인 유전자와 무관하며 이.콜라이 염색체 중에 리포프로테인 유전자의 하향에 위치한 외래성 서열의 850bp를 포함한다. 이 서열은 유전자의 초기 분리에 사용된 방법 및 제한 효소부위에 따라 포함된다.
제1, 2 및 3도에서 플라스미드 pKEN 021은 하기와 같은 방법으로 pKEN 111에서 유도된다 : 약 50㎍의 pKEN 111(제1도의 101)을 37℃에서 2시간동안 20mM Tris, Hcl, pH 7.4, 10mM MgCl2및 6mM β-머캅토 에탄올을 함유하는 300㎕의 완충액중에서 25단위의 HpaII 제한효소로 분해 시킨다. 반응혼합물을 페놀과 클로로포름의 50 : 50 혼합물 300㎕로 2회 추출한 후 수층을 2.5용적부의 에탄올 및 0.1용적부의 3M 아세트산나트륨으로 침전시킨다. DNA 펠릿을 100㎕의 전기영동 완충액에 용해시킨 후 5% 폴리아크릴아미드 겔(별도의 지시가 없는 한 겔 중의 아크릴아미드 : 비스의 비는 29 : 1)상에 획분한다. 이 겔을 0.5㎍/ml의 에티듐 브로마이드를 함유하는 용액중에서 염색시키고 장파장의 자외선 광하에서 밴드를 가시화한다. 겔에서부터 전기 용출에 의해 950bp 밴드를 분리시키고 회수하여 투석백으로 옮긴다. 페놀/CHCl3추출 및 에탄올 침전후 회수된 DNA(약 2.5㎍)를 25㎕의 TEN(10mM NaCl, 10mM Tris, HCl pH 7.4 및 1mM 나트륨 에틸렌디니트릴로테트라아세테이트(EDTA, pH 8.0)에 용해시킨다.
약 2㎍의 950bp HpaII 단편을 37℃에서 2시간동안 50mM NaCl, 6mM Tris, HCl(pH 7.6), 6mM MgCl2및 6mM β-머캅토에탄올을 함유하는 200㎖의 완충액 중에서 AluI 제한 효소로 분해시킨다.
DNA를 6% 폴리아크릴아미드 겔 상에 획분한 후 생성된 462bp AluI 단편을 회수하여 전술한 방법에 의해 정제한다. 462bp AluI 단편(약 1㎍)을 150피코몰의 인산화 EcoRI 링커(5'GGAATTCC3', Collaborative Research로부터 수득) 및 2단위의 T4DNA 리가아제를 함유하는 10μl의 T4DNA 리가아제 완충액(66mM Tris, HCl pH 7.6, 10mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨, 0.4mM ATP)에 용해시킨다. 4℃에서 16시간동안 배양시킨 후 반응혼합물을 65℃에서 10분간 가열한 다음 EcoRI 완충액(100mM Tris-HCl pH 7.2 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올) 및 40단위의 EcoRI 효소를 가하여 100μl로 희석시킨다.
37℃에서 2시간동안 유지시킨 후 샘플을 통상적으로 페놀/CHCl3추출하고 에탄올 침전시킨다. 다음에 DNA를 0.1 단위의 T4DNA 리가아제와 EcoRI으로 분해한 후 알칼리 포스파타아제로 처리한 0.1μg pBR 322(제1도의 102)를 함유하는 20μl의 T4DNA 리가아제 완충액에 용해시킨다. 4℃에서 16시간동안 연결시킨 후, 생성된 DNA를 사용하여 통상의 방법에 따라 이.콜라이 K 12 HB 101을 형질전환시킨다.
12μg/ml의 테트라사이클린 및 문헌[Birnboim and Doly, 1979, Nucleic Acids Research 7 : 1513-1523에 기술된 급속한 알칼리 추출법에 의해 내성 콜로니에서 분리된 플라스미드를 함유하는 한천 판 상에서 형질전환체를 선별한다. 466bp XbaI-BamHI 단편을 함유하는 플라스미드(제1도의 103)를 선별하여 하기 단계에서 출발물질로 사용한다.
약 2μg의 플라스미드(제2도의 103)를 37℃에서 1시간동안 50μl의 HindIII 완충액(60mM NaCl, 100mM Tris, HCl, pH 7.4, 10mM MgCl2및 6mM β-머캅토에탄올)중에서 2단위의 Hind III 효소로 분해시키고 300mM NaCl, 30mM 아세트산나트륨 pH 4.25, 1mM ZnCl2및 200 단위의 Sl 뉴클레아제(Miles Laboratories)를 함유하는 200μl의 완충액에 DNA를 용해시킨다. 페놀/CHCl3추출 및 에탄올 침전에 의해 반응을 중지시킨다. 생성된 DNA를 20피코몰의 인산화 BamHI 링커(5'CCGGATCCGG3'. Collaborative Research로에서 수득) 및 2단위의 T4 DNA 리가아제를 함유하는 10μl의 T4DNA 리가아제 완충액에 용해시킨다. 4℃에서 16시간동안 유지시킨 후 반응혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 리가아제를 불활성화시킨 후 20단위의 BamHI 효소를 함유하는 BamHI 완충액(150mM NaCl, 20mM Tris, HCl, pH 8.0, 10mM MgCl2및 6mM β-머캅토 에탄올)으로써 100μl로 희석시킨다. 37℃에서 2시간동안 유지시킨 후, 혼합물을 1% 아가로오즈겔상에서 정제한다. 겔을 염색한 후 동결시킨 후 용출시켜 큰 단편(∼4.5kb)을 회수한 다음 페놀/CHCl3추출 및 에탄올 침전에 의해 정제한다. BamHI 점착 말단을 함유하는 회수된 단편을 0.1 단위 T4DNA 리가아제를 함유하는 20μl의 T4 DNA 리가아제 완충액에 용해시킨다. 4℃에서 16시간동안 유지시킨 후 DNA를 사용하여 이.콜라이 HB 101을 형질전환시킨다.
100μg/ml의 암피실린에 대한 내성(APr)으로 형질전환체를 선별하고 10μg/ml의 테트라사이클린에 대한 감수성(Tcs)에 따라 선별한다. APrTcs인 ＂콜로니＂에서 전술된 Birnboim 법에 의해 제조된 몇가지의 플라스미드의 HindIII 부위의 부재 및 단일 BamHI 부위의 존재에 대해 검사한다. EcoRI, SalI 서열을 분해시켜 466bp 및 305bp 단편을 수득한다. 이와 같은 특징을 갖는 플라스미드(제2도의 104)를 선택하여 1pp 프로모터 상부에 위치하는 EcoRI 부위로 전환시킨 후 HindIII 제한 부위로 전환시킨다.
2μg의 플라스미드(제2도의 104)를 37℃에서 10분간 0.2단위의 EcoRI를 함유하는 100μl의 EcoRI 완충액중에서 분해시킨다. 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중지시킨 후 페놀/CHCl3추출시킨 다음 DNA를 에탄올 침전시키고 12℃에서 1시간동안 100단위/ml의 Sl 뉴클레아제를 함유하는 200μl의 뉴클레아제 완충액에 용해시킨다. 페놀/CHCl3추출 및 에탄올 침전에 의해 반응을 중지시킨다. 생성된 DNA를 20피코몰의 인산화 HindIII 링커(5'CCAAGCTTGG3', Collaborative Research) 및 2단위의 T4DNA 리가아제를 함유하는 10μl의 T4DNA 리가아제 완충액에 재현탁시킨다. 4℃에서 16시간동안 유지시킨 후, 혼합물을 10분간 65℃에서 가열하고 10단위의 HindIII 효소를 함유하는 HindIII 완충액을 가하여 150μl로 희석시키고 37℃에서 2시간동안 배양시킨 후 1% 아가로오즈 겔 상에 획분한다. 가장 긴 밴드(단일 절단 플라스미드에 상응)를 통상적으로 회수하고 정제한 후 0.2단위의 T4리가아제를 함유하는 20μl의 T4리가아제 완충액에 용해시키고 4℃에서 16시간동안 배양시킨 다음 이.콜라이 HB 101을 형질전환시키기 위해 사용한다. 암피실린 내성으로 형질전환체를 선별하고 제한효소 분석에 의해 통상적으로 플라스미드를 분리한다. 500bp의 EcoRI-HindIII 단편을 함유하는 플라스미드(제2도의 105)를 선별하여 1pp 유전자의 3'부위를 첨가하기 위한 클로닝 벡터로 사용한다.
약 2μg의 플라스미드(제3도의 105)를 50μl의 SalI 제한 완충액(150mM NaCl, 6mM Tris HCl, pH 7.9, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에서 2단위의 SalI으로 37℃에서 1시간동안 분해시킨 후 2단위의 BamHI을 함유하는 BamHI 완충액을 가하여 150μl로 희석시킨다. 37℃에서 1시간동안 유지시킨 후 2.5단위의 알칼리 포스파타아제를 가한 다음 65℃에서 1시간동안 배양을 계속한다. 반응혼합물을 페놀/CHCl3추출하고 에탄올 침전시킨 후 TEN에 용해시켜 1pp 3'단편에 대한 클로닝 벡터로 사용한다.
1pp 3'부위를 함유하는 단편을 수득하기 위해 10μg의 pKEN 111(제3도의 101)을 200μl의 HpaI 완충액(20mM KCl, 10mM Tris HCl, pH 7.4, 10mM MgCl2및 6mM β-머캅토에탄올)중에서 10단위의 HpaI으로 37℃에서 2시간동안 분해시킨다. 페놀/CHCl3추출 및 에탄올 침전 후, DNA를 20피코몰의 인산화 SalI링커(5'GGTCCACC3', Collaborative Research) 및 2단위의 T4DNA 리가아제를 함유하는 10μl의 T4DNA 리가아제 완충액에 용해시켜 4℃에서 16시간동안 배양시킨다. 65℃에서 10분간 가열하여 리가아제를 불활성화시킨다. 생성된 물질에 10단위의 SalI을 함유하는 SalI 완충액을 가하여 10μl로 희석시키고 37℃에서 1시간 배양시킨 후 10단위의 PvuII 제한효소를 함유하는 PvuII 완충액(60mM NaCl, 6mM Tris, HCl, pH 7.5, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)을 가하여 300μl로 희석한다. 37℃에서 1시간 유지시킨 후 DNA를 5% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 획분한다.
약 0.5μg의 950bp 단편이 수득되며 이를 정제하여 TEN 중에 용해시킨다. 20μg의 단편을 20 피코올의 인산화 BamHI 링커(5'CCGGATCCGG3') 및 2단위의 T4DNA 리가아제를 함유하는 T4DNA 리가아제 완충액을 가하여 20μl로 희석시킨 후 4℃에서 16시간동안 배양시킨다. 다음에 생성된 DNA를 65℃에서 10분간 가열한 후 20단위의 BamHI을 함유하는 BamHI 완충액을 가하여 100μl로 희석하고 37℃에서 2시간동안 배양시킨 다음 5% 폴리아크릴아미드 겔 상에 획분하여 과량의 링커 분자를 제거한다. BamHI 및 SalI 점착 말단을 함유하는 생성된 950bp 단편을 통상의 방법으로 정제하여 0.2μg의 전술된 클로닝 벡터 및 0.2단위의 T4DNA 리가아제를 함유하는 20μl의 T4DNA 리가아제 완충액중에 용해시킨다. 4℃에서 16시간동안 배양시킨 후 DNA를 사용하여 이.콜라이 K 12 HB 101를 형질전환시킨다. 암피실린 내성형질전환체로부터 플라스미드를 제조하여 통상적으로 SalI-BamHI 단편인자를 분석한다. 생성된 플라스미드(∼5.2kb)를 pKEN 021(제3도의 106)로 명명한다.
pKEN 021 10μg을 200μl의 XbaI/BamHI 완충액(150mM NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 8, 10mM MgCl2및 6mM β-머캅토에탄올)중에서 10단위의 BamHI을 사용하여 37℃에서 분해시킨 후 다시 1시간동안 10단위의 XbaI으로 37℃에서 분해시킨다. 다음에 목적하는 XbaI-BamHI-분해된 DNA를 65℃에서 2.5단위의 알칼리 포스파타아제로 처리하고 페놀/CHCl3추출한 후 에탄올 침전에 의해 수집하여 50μl의 TEN에 용해시켜 다음단계에 사용한다(제3도의 107).
B. 플라스미드 pNM 575의 제조
플라스미드 Ptrp ED 50 ChGH 800(제4도의 108, Martial et al., 1979, Science 205 : 602-607 참조)을 인체 성장 호르몬 유전자 부위에 대한 코드화 서열을 함유하는 DNA 단편 생성원으로 사용한다. 또한 이 단편은 합성할 수 있다(Itakura et al.,1977 and Crea et al., 1978 참조). 공지된 방법(Goodman et al., 1979, Methods in Enzymology 68 : 75-90 참조)에 따라 인체 뇌하수체에서 인체 성장 호르몬을 코드하는 mRNA를 분리하여 수득할 수 있다. 플라스미드 ptrpED 50ChGH 800의 인체 성장 호르몬 유전자 부위는 이 유전자의 해독 종결 코돈의 아래쪽 방향으로 단일 SmaI 제한부위 6bp를 함유한다. 이 제한부위는 하기 방법에 따라 BamHI 부위로 변화시킨다 : 6μg의 플라스미드를 200μl의 SmaI 제한 완충액(150mM Tris, HCl, pH 8.0, 6mM MgCl215mM KCl 및 6mM β-머캅토에탄올)중에서 6단위의 SmaI으로 37℃에서 1.5시간동안 분해시킨다. 분해가 완결된 후, 페놀/CHCl3추출을 수행하고 에탄올 침전시켜 DNA를 회수한 후 24μl의 TEN에 용해시킨다. 2단위의 T4DNA 리가아제를 함유하는 16μl의 리가아제 완충액중 0.5μg(0.2피코몰의 말단)의 상기 기술에서 분해시킨 플라스미드에 40피코몰의 인산화 BamHI 에뎁터 단편을 가한다. 반응 혼합물을 22℃에서 2시간동안 배양시키고 4℃에서 16시간동안 배양시킨 후 65℃에서 10분간 배양시킨다.
제한 효소로 통상의 방법에 의해 분해시켜 BamHI 점착말단을 생성한다. BamHI제한 효소는 클론화된 인체 성장 호르몬 CDNA서열의 개시부위에 위치한 BamHI 부위 및 링커 서열을 분해시킨다. 그러므로 6% 폴리아크릴-아미드겔 상에 분리되어 통상적으로 회수된 BamHI 점착말단을 갖는 691bp 단편이 수득된다. 회수된 DNA단편을 0.2μg의 BamHI-분해 및 알칼리 포스파타아제-처리 pBR 322(제4도의 102)과 전술된 조건하에서 20μl의 완충액 중의 0.2단위의 T4DNA리가아제를 사용하여 연결시킨다. 4℃에서 16시간동안 유지시킨 후 이 물질을 사용하여 이.콜라이 JA 221(NRRL No, B-15014)를 형질전환시킨다[참조 Wensink et al., 1974, Cell 3 : 315-325]. 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 한천 판상에서 형질전환체를 선별한 후 플라스미드를 통상적으로 분리하고 제한 효소 및 겔 전기영동분석을 확인한다. pNM 575(제4도의 109)로 명명된 목적 플라스미드는 약 700bp의 BamHI 단편을 함유하며 다음 단계에 사용하기 위해 통상적으로 증폭시킨다.
C. 플라스미드 pNM702의 제조
숙성한 인체 성장 호르몬의 DNA서열은 제1뉴클레오티드에서부터 47번째 bp인 FnuDII부위를 함유한다. 25μg의 PNM 575를 250μl의 BamHI 완충액중에서 25단위의 BamHI으로 37℃에서 1시간동안 분해시킨다. BamHI 점착말단을 함유하는 691bp 단편을 6% 폴리아크릴아미드겔에서 통상적으로 분리한 후 정제한다. 이 단편을 정제한 후 단편의 1/3(8μg에 해당)을 100μl의 FunDII완충액(6mM NaCl, 6mM Tris, HCl, pH 7.4, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에서 2.5단위의 FunDII로 37℃에서 1.5시간동안 분해시킨다. 6%폴리아크릴아미드 겔상에서의 전기영동 및 표준 회수공정에 따라 해독 중지 시그널 앞에 오는 유전자의 마지막 175 아미노산의 코드화 서열을 함유하는 538bp DNA단편을 분리시킨다.
이중나선 DNA단편(제5도의 110)을 포스포-트리에스테르법에 의해 합성하여 1pp 프로모터 부위를 인체성장 호르몬 코드화부위와 결합시킨다. 이중 나선 DNA 단편(제5도의 110)의 서열은 다음과 같다 :
상기 단편은 공지된 포스포트리에스테르 법에 의해 제조하며 하기와 같은 단편이 제조된다.
상기에서 제조된 단편을 사용하여 하기와 같은 방법으로 T4리가아제 촉매화 결합 반응을 단계적으로 수행한다 :
a) 5'-인산화 단편 9존재하에 T4리가아제를 사용하여 5'-비인산화 단편 1을 5'-인산화 단편 2에 결합시켜 DNA 듀플렉스 1(참조 Brown et al., Methods in Enzymology 68 : 109-151)을 생성한다. 이 듀플렉스를 15% 폴리아크릴아미드상에서의 겔 전기영동으로 분리한다.
b) 5'-인산화 단편 3은 5'-인산화 단편 존재하에 T4리가아제를 사용하여 5'인산화 단편 4에 연결시켜 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제된 DNA 듀플렉스 2를 생성한다.
c) 5'-인산화 단편 5는 5'-인산화 단편 12 및 13 존재하에 T4리가아제를 사용하여 5'-인산화 단편 6에 연결시켜 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제된 DNA 듀플렉스를 형성한다.
d) 5'-인산화 단편 7은는 5'-인산화 단편 14 및 5'-비인산화 단편 15 존재하에 T4리가아제를 사용하여 5'-인산화 단편에 연결시켜 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제된 DNA 듀플렉스를 형성한다.
e) 다음에 DNA 듀플렉스 2, 3 및 4를 T4리가아제에 의해 서로 연결시켜 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제된 DNA 듀플렉스 5를 형성한다.
f) T4리가아제 존재하에 DNA 듀플렉스 1에 5'-인산화 단편 10과 DNA 듀플렉스 5를 가한다. 생성된 DNA 듀플렉스(제5도의 110)는 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제한다. 다음에 DNA 듀플렉스는 다음의 공지된 방법에 따라 T4폴리뉴클레오티드 키나아제 및 [r-3xP]ATP를 사용하여 효소적으로 인산화시킨다.
발현 플라스미드 pNM 702는 플라스미드 pKEN 021(제5도의 107)의 XbaI-BamHI 단편 0.1피코몰(0.4μg), 합성 DNA 단편(제5도의 110) 0.025피코몰 및 538bp 단편(제5도의 109) 0.3피코몰(0.08μg)을 24μl의 연결 완충액중에서 1.5단위의 T4 DNA리가아제를 사용하여 효소적으로 결합시켜 제조한다. 4℃에서 16시간 동안 배양시킨 후 혼합물을 사용하여 전술한 바와 같이 이.콜라이 JA 221을 형질전환시킨다. 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 한천 판 상에서 형질전환체를 선별하고 목적하는 발현 플라스미드의 바람직한 생성원으로 통상 배양시킨다.
인체 성장 호르몬의 발현을 표준 방사면역분석법(Twomey et al., 1974, Clin chem. 20 : 389-391)에 의해 탐지하면 세포당 최소한 2백만 분자로 측정된다.
D. 플라스미드 pNM 789의 제조
인체 성장 호르몬의 발현 플라스미드인 플라스미드 pNM 702(제6도의 111)를 Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-bGH를 발현시키는 플라스미드의 제조를 위한 출발물질로 사용한다.
플라스미드 pBP 348(제6도의 112, Miller et al., 1980, J, Biol. chem, 255 : 7521-7524 참조)을 소 성장 호르몬 유전자 부위의 코드화 서열을 함유하는 두 개의 DNA 단편 생성으로 사용한다. 이 플라스미드는 pBR 322의 pst I 제한 부위에 클론화된 831bp 소 성장 호르몬-코드화 서열을 함유한다. 상기 참조 문헌에 기술된 방법과 다른 방법으로서 소 성장 호르몬의 서열을 합성하여 제조하거나(Itakura et al., 1977 and Crea et al., 1978참조) 소 뇌하수체로부터 문헌[Goodman et al., 1979]에 기술된 통상의 방법에 의해 분리된 mRNA에서 수득할 수 있다.
인체 성장 호르몬의 코드화 서열과 소 성장 호르몬의 코드화 서열은 매우 유사하며 많은 상동성이 있다. 소 성장 호르몬의 발현 플라스미드 제조시 특히 유용한 것은 제한 효소 PvuII로 분해시켜 생성된 단편이다. 생성된 단편의 크기는 인체 성장 호르몬은 497bp이고 소 성장 호르몬은 494bp이며 양 서열의 같은 판독대에 상응하는 제한 부위가 존재한다.
10μg의 pNM 702(제6도의 111)는 특히 37℃에서 10분간 200μl의 PvuII제한완충액(60mM NaCl, 6mM Tris, HCl, pH 7.5, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에서 1단위의 PvuII로 분해시킨다. 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 중지시킨 후 DNA를 알칼리 포스파타아제로 처리하고 1% 아가로오즈 겔 상에 단편을 분리시킨다. 결손 497bp PvuII단편을 함유하는 DNA(단일 절단 플라스미드보다 약간 빨리 진행)와 같은 크기의 직쇄 DNA단편(제6도의 113)을 통상의 방법으로 검출하여 정제하고 중간체 플라스미드(제6도의 114)제조에 사용한다.
플라스미드 pBP 348의 494bp PvuII단편은 10μg의 플라스미드를 10단위의 PvuII를 함유하는 200μl의 PvuII완충액 중에서 1시간동안 37℃에서 분해시켜 제조한다. 이 단편은 6% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고 목적하는 494bp 단편(제6도의 112)을 통상의 방법으로 가시화하여 정제한다.
중간체 플라스미드(제6도의 114)는 0.2μg의 플라스미드 pNM 702 PvuII단편을 2단위의 T4DNA리가아제를 함유하는 T4DNA리가아제 완충액 20μl중에서 0.5μg의 494bp단편과 4℃에서 16시간동안 반응시켜 제조한다. 암피실린 내성으로 형질전환체의 형질전환 및 선별을 수행한 후 플라스미드에 대해 494bp PvuII단편의 존재 및 적절한 배치인지를 통상의 방법으로 분석한다. 494bp PvuII단편을 함유하는 플라스미드 및 440bp XbaI-SmaI 단편을 함유하는 플라스미드를 다음 단계에 사용하기 위해 선별한다.
중간체 플라스미드(제7도의 114)10μg을 200μl의 PvuII완충액중에서 1단위의 PvuII로 37℃에서 5분간 분해시킨다. 65℃에서 10분간 가열한 후 혼합물을 1% 아가로즈 겔 상에 펴서 분자당 단일 PvuII절단만을 갖는 직쇄 DNA를 회수하고 정제한다. 회수한 물질(약 3μg)을 5단위의 XbaI으로 완전히 분해시켜 알칼리 포스파타아제로 처리한다. 이 단편을 1% 아가로즈 겔 상에 펴서 가장 긴 단편(인체 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬의 XbaI 부위 및 제1 PvuII부위간의 109bp 단편을 결손)을 통상의 방법으로 회수한다(제7도의 115).
제1 PvuII 부위에 대한 소 성장 호르몬의 제1 2 3 아미노산(69bp)의 DNA서열은 2개의 HpaII제한 부위를 함유하는데 이중 1개는 코드화 서열의 제1뉴클레오티드에서부터 23bp이다. 63bp단편(제7도의 116)은 포스포트리에스테르법에 의해 합성한다. 이 단편은 1PP 리보솜 결합부위 중 XbaI 부위에서 Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-(24bp)및 소 성장 호르몬의 코드화 서열의 20개 뉴클레오티드(Phe부터 제1 HpaII부위까지)앞에 오는 ATG해독 개시시그널을 통해 Xba I 부위에서 19bp서열에 상응한다. 이 단편의 서열은 다음과 같다 :
63bp 단편을 제조함에 있어서, 하기의 9개 단편을 제조한다 :
상기 제조된 단편을 사용하여 T4리가아제 촉매화 결합 반응을 하기와 같이 수행한다 :
a) 5'-비인산화 단편 1을 5'-인산화 단편 6존재하에 T4리가아제를 사용하여 5'-인산화 단편에 결합시켜 15% 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 정제된 DNA 듀플렉스 1을 형성시킨다.
b) 5'-인산화 단편 3, 4 및 5를 5'-인산화 단편 7 및 8과 5'-비인산화 단편 9존재하에 T4리가아제를 사용하여 결합시켜 15% 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 정제된 DNA듀플렉스 2를 형성시킨다.
c) 듀플렉스 1과 2를 T4리가아제에 의해 결합시켜 15% 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 정제된 DNA듀플렉스(제7도의 116)를 형성시킨다. 다음에 DNA듀플렉스를 하기 공정에 따라 T4폴리뉴클레오티드 키나아제와 [γ-32P]ATP를 사용하여 효소적 인산화시킨다.
상기 HpaII 부위에서 PvuII 부위까지의 46bp DNA 단편은 합성하거나 원 pBP 348 플라스미드에서부터 수득할 수 있다. 그러므로 100μg의 플라스미드 pBP 348을 400μl의 PvuII 완충액중에서 50단위의 PvuII로 37℃에서 2시간동안 분해시킨다. 페놀 추출 및 에탄올 침전을 수행한 후 DNA를 50단위의 Pst I 을 함유하는 400μl의 Pst I 완충액(50 NaCl, 6mM Tris HCl, pH 7.4, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에 2시간동안 37℃에서 용해시킨다. DNA 단편을 6% 폴리아크릴아미드겔상에 펴서 목적하는 46bp 서열을 함유하는 135bp 단편을 회수하고 표준법으로 정제한다. 회수된 DNA의 1/3(33μg)을 100μl의 HpaII 완충액(20mM Tris HCl, pH 7.4, 7mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에서 1단위의 HpaII 제한 효소로 37℃에서 40분간 제한 분해시킨다. 65℃에서 10분간 가열한 후, DNA 단편을 적절한 크기의 마커와 함께 5% 폴리아크릴 아미드겔(아크릴아미드 : 비스의 비=19 : 1) 상에 분산한다. 135bp 단편(제7도의 112)을 HpaII 부분 분해시켜 수득된 목적하는 46bp 단편을 표준법으로 정제한다.
플라스미드 벡터(제7도의 115)의 Xba I-PvuII 단편
μg, 3.2피코몰의 합성 63bP 단편(제7도의 116) 및 0.5 피코몰의 46bp 단편(제7도의 112)을 그 단위의 T4DNA리가아제를 함유하는 10μl의 연결 완충액중에서 16시간동안 4℃에서 배양시킨다.
연결 혼합물을 사용하여 이.콜라이 JA 221을 형질전환시킨 후 목적 플라스미드 pNM 789를 함유하는 생성된 형질전환체를 암피실린 내성에 의해 선별한다. 494bp PvuII 및 109bp XbaI-PvuII 단편의 존재에 대한 통상의 스크리닝으로 플라스미드 pNM 789(제7도의 117)를 동정한다.
E. 플라스미드 pNM 789B의 최종 제조
소 성장 호르몬으로 완전히 전환시키기 위해 플라스미드 pNM 789(제8도의 117)의 아미노산 코돈 1개를 변화시켜야 한다. 이 공정은 pNM 789의 28bp PvuII 내지 BamHI 단편을 제거하고 하기 서열(제8도의 118)의 합성 이중 나선 단편으로 치환시켜 수행한다 :
10μg의 pNM 789를 200μl의 PvuII 완충액중에서 1단위의 PvuII로 370℃에서 5분간 분해시킨다. 65℃에서 10분간 가열한 후, BamHI 완충액을 가하여 300μl로 희석하고 37℃에서 1시간 동안 10단위의 BamHI로 완전히 분해시킨다. DNA 단편을 1% 아가로즈 겔 상에서 분리시키고 단일 절단 플라스미드 pNM 789과 거의 같은 크기의 DNA 단편(제8도의 119)을 통상적으로 정제한다. 이 단편
㎍을 20μl의 리가아제 완충액중에서 2단위의 T4리가아제를 사용하여 5피코몰의 합성 단편과 연결시킨다. 이 연결 공정은 4℃에서 철야로 수행한다. 형질전환을 수행한 후, 플라스미드를 분리하여 적절한 PvuII(494bp) 및 XbaI-BamHI(628bp) 단편을 선별한다. 상기 단편을 함유하는 플라스미드를 목적 플라스미드 pNM 789B(제8도의 120)로 한다.
[실시예 2]
[플라스미드 pCZ101 및 이.콜라이 K12RV308/pCZ101의 제조]
A. 플라스미드 pIM-I'-A3의 분리
이.콜라이 K12/pIM-I'-A3(NRRLB-15733)을 50μg/ml을 가나마이신을 함유하는 TY육즙(1% 트립토판, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨, pH 7.4)중에서 통상의 미생물학적 방법에 따라 25℃에서 배양시킨다. 새로운 육즙을 가하여 배양물을 1 : 10으로 희석한 후 37℃에서 3시간동안 배양시킨 후 약 5ml의 배양물을 1.5ml의 에펜도르프 관에 옮기고 약 15초간 원심분리시킨다. 별도의 언급이 없는 한 주위 온도에서 증폭시킨다. 생성된 상청액을 끝이 미세한 흡출기로 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 약 100μl의 2mg/ml의 라이소자임, 50mM 글루코즈, 10mM EDTA(디아민테트라아세테이트) 및 25mM Tris, Hcl pH8을 함유하는 새로 제조된 라이소자임용액(2mg/ml)에 재현탁시킨다. 약 200μl의 알칼리 SDS(나트륨도데실설페이트)용액(0.2N NaOH, 1% SDS)을 가하여 완화하게 전화시킨 후 분해가 완결될때까지 (∼5분)0℃에서 유지킨다. 다음에 약 150μl의 3M 아세트산 나트륨을 가하고 튜브 내용물을 수초간 전화시켜 완화하게 혼합한다.
0℃에서 60분 이상동안 유지시킨 후 15분간 원심분리시켜 거의 투명한 상청액을 수득한다. 상청액을 제2원심분리관에 옮겨 3용적부의 냉 100% 에탄올을 가한다. 튜브를 무수 냉 에탄올 중에서 5분간 유지시킨 후 생성된 침전을 원심분리(5분)에 의해 합치고 상청액을 흡출시켜 제거한다. 합친 펠릿을 100μl의 TE(10mM Tris, HCl pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해시키고 목적 pIM-I'-A3플라스미드 DNA로 한다.
B. 플라스미드 pNM 789B의 XbaI - BamHI 분해 및 ∼0.6kb XbaI -BamHI 단편의 생성
50μl의 Hi염 완충액*(*Hi염 완충액은 통상적으로 하기 조성을 갖도록 제조한다 : 100mM NaCl, 20mM Tris, HCl, pH8.0, 10mM MgCl2, 5mM β-머캅토에탄올)중 약 5μg의 플라스미드 pNM 789B DNA를 10단위의 BamHI 제한효소 및 10단위의 XbaI 제한효소와 같이 37℃에서 약 1시간동안 배양시킨다. pH7.0의 3M 아세트산 나트륨 5μl를 가한 후 2용적부의 100%에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. 목적 DNA분해물을 100μl의 TE완충액에 용액시켜 다음 단계에 사용하기 위해 0℃에서 보관한다.
C. 플라스미드 pIM-I'-A3의 XbaI-BamHI 분해
플라스미드 pNM 789B 대신에 플라스미드 pIM-I'-A3을 사용하여 실시예 2B의 공정에 따라 분해를 수행한다. 목적 DNA를 약 100μl의 TE완충액을 용해시킨 후 다음 단계에 사용하기 위해 0℃에서 보관한다.
D. 연결 및 형질전환
약 1μg의 플라스미드 pIM-I'-A3분해물, 1μg의 플라스미드 pNM789 XbaI-BamHI 분해물, 40μl의 물, 5μl(5mM)의 ATP, 5μl의 연결 혼합물*(연결 혼합물의 조성도 다음과 같다 : 500mM Tris HCl, pH 7.8, 200mM 디티오트레이톨, 100mM MgCl2) 및 5단위의 T4DNA리가아제를 20℃에서 약 2시간동안 배양시킨다 . 65℃에서 2분간 배양시킨 후 빙냉시키고 생성된 연결혼합물을 웬신크의 형질전환법(Wensink, 1974, Cell 3 : 315, E, Coli K12 RV308)에 따라 50μg/ml의 가나마이신을 함유하는 TY판(1% 트립토판, 0.5%효모 추출물, 0.5%NaCl, 1.5%한천, pH7.4)상에서 사용하여 형질전환시킨다. 이.콜라이 K12 RV308은 수리번호 NRRLB-15624로 기탁되어 대중에게 이용되고 있다.
아가로즈 겔 전기영동(Maniatis et al., 1982) 및 기타 시험에 의해 통상 확인된 바와 같이 생성된 형질전환 체중 몇가지는 목적 ∼10.8kb 플라스미드만을 함유한다. 본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pCZ101로 명명된 상기 형질전환체를 적절한 항생제를 함유하는 TY한천판상에서 선별한 후 통상의 미생물학적 기술을 사용하여 배양시킨다. 생성된 세포를 사용하여 실시예 2A의 공정에 따라 플라스미드 pCZ101을 분리한다.
[실시예 3]
[플라스미드 pCZ1920 및 이.콜라이 K12 RV308/pCZ1920의 제조]
A. 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-XbaI 단편의 제조
플라스미드 pNM 789B 대신 플라스미드 pCZ101을 사용하여 실시예 2B의 기술에 따라 목적 단편을 제조한다. 목적 ∼10.2kb BamHI XbaI 제한단편을 통상적으로 분리하고 아가로즈겔 전기영동(Maniatis et al., 1982참조)법으로 분리하여 약 100μl의 TE완충액에 용해시킨 후 다음 단계에 사용하기 위해 0℃에서 보관한다.
B. 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI HgiAI단편의 제조
플라스미드 pNM 789B 및 XbaI 제한효소 대신 플라스미드 pCZ101 및 HgiAI 제한효소를 각각 사용하여 실시예 2B의 기술에 따라 목적 단편을 제조한다. 목적 ∼0.6kb BamHI HgiAI 제한단편을 통상적으로 분리하고 아가로즈겔 전기영동(Maniatis et al., 1982)에 의해 분리한 다음 약 100μl의 TE완충액에 용해시키고 다음 단계에 사용하기 위해 0℃에서 보관한다.
C. DNA 링커 서열의 제조
목적 링커 서열은 이다구라 등의 방법[Itakura et al., 1977 and Crea et al., 1978]에 따라 변형된 포스포트리에스테르법에 의해 통상 합성한다. 상기 합성법은 실시예 1에 상세히 설명되어 있다.
D. 연결 및 형질전환
실시예 3C의 DNA링커 약 20피코몰, 1μg의 플라스미드 pCZ101∼10.2kb BamHI-XbaI 단편 및 0.5μg의 플라스미드 pCZ101∼0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결하고 생성된 플라스미드를 사용하여 실시예 2D의 기술에 따라 이.콜라이 K12 RV308을 형질전환시킨다.
생성된 형질전환체 몇몇은 아가로즈겔 전기영동(Maniatis et al., 1982)및 기타 시험에 의해 통상 확인되는 바와 같이 목적 ∼10.8Kb 플라스미드만을 함유한다. 본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pCZ1920으로 명명된 이 형질전환체를 적절한 항생체를 함유하는 TY한천판상에 선별하고 통상의 미생물학적 기술에 의해 배양한다. 생성된 세포는 SDS겔 전기영동, PIA 및 기타 시험에서 확인되는 바와 같이 고농도에서 전술된 MET-LYS-GLY-ASPN-SER-MET-ALA-bGH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pCZ1920은 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하며 약 37℃의 배양온도에서 목적 bGH유도체 생성물의 발현이 최고로 나타난다.
[실시예 4]
[플라스미드 pJR1 및 이.콜라이 K12 RV308/pJR1의 제조]
실시예 3C의 링커 서열 대신 하기의 DNA링커 서열을 사용하여 실시예 3의 방법에 따라 목적 플라스미드를 제조한다 :
상기의 링커 서열은 통상의 방법[Itakura et al., 1977 and Crea et al., 1978]에 따라 제조할 수 있다. 전술된 합성법은 실시예 1에도 상술되어 있다.
본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pJR1로 명명된 목적 형질전환체는 적절한 항생제를 함유하는 TY한천 판상에서 선별한 후 차후의 플라스미드 pJR1의 생성 및 분리에 사용하기 위해 통상적으로 배양시킨다. SDS겔 전기영동법, RIA 및 기타시험에 상기 형질전환체는 고농도에서 전술된 MET-PHE-PRO-ALA-MET-ALA-R2소 성장 호르몬 유도체를 발현한다. 플라스미드 pJR1은 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 배양온도 약 37℃에서 목적 bGH유도체 생성물이 최고로 발현된다.
[실시예 5]
[플라스미드 PHI 7△ 4△ 1의 제조]
플라스미드 pHI 7△ 4△ 1의 부분제조 도식은 제15도에 나타내었다.
A. 플라스미드 pBRHtrp의 제조
플라스미드 pGM1은 △LE1413결손을 포함하는 이.콜라이 트립토판 오페론[Miozzari, et al., 1978, J, Bacteriology, 1457-1466]을 함유하므로 trp 프로모터-오퍼레이터 계의 조절하에 trp 리더의 처음 6개 아미노산, 마지막 3번째 trp E 폴리펩타이드(이후부터는 LE'과 결부시켜 언급) 및 trp D 폴리펩타이 전체로 이루어진 융합 단백질을 억제한다. 이.콜라이 K12 W3110 tna 2trp △102/pGM 1은 ATTCNo, 31622호로 기탁되어 있으며 후술되는 공정에 사용하기 위해 이 균주로부터 pGM 1을 통상적인 방법으로 회수 할 수 있다.
약 20μg의 플라스미드를 5개의 부위에서 플라스미드를 절단하는 제한 효소 PvuII로 분해시킨다. 다음에 유전자 단편을 EcoRI 링커(서열 PCATGAATTCATG의 자가 상보 올리고뉴클레오티드로 이루어짐)와 결합시켜 EcoRI부위를 함유하는 플라스미드에 차후 클론화하기 위한 EcoRI절단부위를 생성한다. pGM 1에서 수득된 20μg의 DNA 단편을 200피코몰의 5'-인산화 합성 올리고뉴클레오티드 PCATGAATTCATG 존재하에 20μl의 T4DNA 리가아제 완충액(20mM Tris, pH 7.6, 0.5mM ATP, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨)중에서 철야 10단위의 T4DNA 리가아제로 4℃에서 처리한다. 다음에 이 용액을 70℃에서 10분간 가열하여 연결을 중지한다. EcoRI 분해로 링커를 절단하고, EcoRI 말단을 함유하는 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(＂PAGE＂)을 이용하여 분리한다. 먼저 에티듐 브로마이드로 염색하고 자외선을 조사한 후 목적부위를 겔에서 절단하여 3개의 가장 긴 단편을 분리한다. 300μ1의 0.1×TBE를 함유하는 각각의 겔 단편은 투석 백에 넣어 0.1×TBE완충액(TBE완충액은 10.8g의 Tris염기, 5.5mg의 붕산, 0.09g의 Na2EDTA를 11의 H2O에 함유시킴)중에서 1시간동안 100V에서 전기영동시킨다. 투석 백에서 부터 수용액을 합쳐서 페놀 추출하고 클로로포름 추출한 후 NaCl을 기준으로 0.2M로 만든다. 에탄올 침전후 DNA를 물중에 회수한다. EcoRI 점성 말단을 함유하는 trp 프로모터/오퍼레이터-함유 단편을 프로모터/오퍼레이터 삽입하에서는 테트라사이클린 내성으로 되는 테트라사이클린 감수성 플라스미드에 삽입하여 동정한다. 후술되는 실시예에서 모든 DNA단편의 분리는 전술된 전기용출법에 의해 PAGE를 사용하여 수행한다.
B. trp 프로모터/오퍼레이터 조절하에 테트라사이클린 내성을 나타내는 플라스미드 pBRHtrp의 제조 및 A항에서 분리된 trp 프로모터/오퍼레이터 함유 DNA 단편의 확인 및 증폭
플라스미드 pBRH1(Rodriguez, et al., 1979, Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 and ATCC No,. 37070)은 암피실린 내성을 나타내며 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하나 관련된 프로모터가 없기 때문에 테트라사이클린 내성을 나타내지 않는다. 따라서 이 플라스미드를 함유하는 세포는 테트라사이클린 감수성이다. EcoRI 부위에 프로모터/오퍼레이터계를 도입시키면 테트라사이클린 내성을 나타낸다.
플라스미드 pBRH1은 EcoRI으로 분해시킨다. 이 효소는 페놀추출 및 클로로포름 추출에 의해 제거하고, 에탄올 침전 후 DNA를 물에 재현탁시킨다. 생성된 DNA를 실시예 5A에서 수득된 3개의 DNA 단편 각각과 혼합하고 전술된 바와 같이, T4DNA 리가아제와 연결한다. 반응 혼합물 중에 존재하는 DNA를 사용하여 캄피턴트 이.콜라이 K12 294(NRRL B-15625)를 표준기술[Hershfield et al., 1974, Proc. Nat. Acad. sci. USA 71 : 3455-3459]에 의해 형질전환시킨 후 20μg/ml의 암피실린 및 5μg/ml의 테트라사이클린을 함유하는 LB판(Maniatis et al., 1982)상에 편다.
수개의 테트라사이클린 내성 콜로니를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여 pBRHtrp로 명명한다. 제환 효소 분석에 의해 목적 단편의 존재를 확인한다. 플라스미드 pBRHtrp는 β-락타마제를 발현시키고 암피실린 내성을 전달하며 trp 프로모터/오퍼레이터를 함유하는 DNA 단편을 함유한다. 이 DNA 단편은 trp 리더의 처음 6개 아미노산 및 거의 마지막 3번째 trp E 폴리펩타이드의 융합물로 이루어진 제1단백질(LE'로 명명); trp D 폴리펩타이드의 처음 1/2에 거의 상응하는 제2단백질(D'로 명명) 및 테트라사이클린 내성 유전자에 의해 코드화된 제3단백질을 코드화한다.
C. 플라스미드 pSOM 7△ 2의 제조
EcoRI 제한 효소로 플라스미드 pBRHtrp를 분해시킨 후 생성된 단편을 PAGE 및 전기용출에 의해 분리하고 EcoRI-분리된 플라스미드 pSOM11(Itakura et al., 1977, Sci. 198 : 1056, 미합중국 특허 4,366,246호; 영국 특허 공보 2,007,676A호)과 혼합한다. 이 혼합물을 T4DNA 리가아제로 연결하고 생성된 DNA를 전술한 바와 같이 이.콜라이 K12 294를 형질전환시킨다. 암피실린-함유판상에서 형질전환균을 선별하고 생성된 암피실린-내성 콜로니를 콜로니 혼성법(Gruenstein et al., 1975, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 : 3951-3965)에 의해 선별한다.
pBRHtrp에서 분리되어32P로 방사활성 표시된 trp 프로모터/오퍼레이터-함유 단편을 상기 공정에서 소식자로 사용한다. 그러므로 콜로니 혼성법에서 양성으로 확인된 수개의 콜로니가 선별된다. 플라스미드 DNA를 분리하고 삽입된 단편의 배위는 BglII 및 BamHI 이중 제한효소 분해에 의해 측정한다. 적합한 배위의 trp 프로모터/오퍼레이터 단편을 함유하는 목적 플라스미드르 함유하는 콜로니 10μg/ml을 암피실린 함유 LB매질중에서 증식시킨다. 목적 플라스미드는 pSOM 7△2로 명명하고 하기 공정에 사용한다.
D. 플라스미드 ptrp 24의 제조
1. 코드화 나선의 5' 및 3'말단에서 각각 BglII 및 EcoRI 제한부위를 갖는 LE'폴리펩타이드의 말단 부위를 코드화하는 유전자 단편의 제조
플라스미드 pSOM 7△2를 HindIII 분해시킨 후 LE'코드화 부위내에 BglII 제한부위 하부를 분해시키도록 선택된 조건하에 λ엑소뉴클레아제(5' 내지 3'엑소뉴클레아제)로 분해시킨다. 약 20μg의 HindIII-분해 pSOM 7△2를 완충액(20mM 글리신 완충액, pH 9.6, 1mM MgCl21mM β-머캅토에탄올)중에 용해시킨다. 생성된 혼합물을 실온에서 60분간 5단위의 λ엑소뉴클레아제로 처리한다. 수득된 반응혼합물을 페놀 추출, 클로로포름 추출한 후 에탄올 침전시킨다.
LE' 유전자 단편의 말단에 EcoRI 잔기를 만들기 위해 개량 포스포트리에스테르 법(Crea et al., 1978)에 의해 프리머32P CCTGTGCATGAT를 합성하고 λ엑소뉴클레아제 분해에 의해 생성된 LE' 유전자 단편의 단일 나선 말단에 하이브리드화한다. 플라스미드 pSOM 7△2의 λ엑소뉴클레아제-처리 HindIII 분해 생성물 20μg을 물 20μl에 용해시킨 후 전술한 바와 같이 약 80피코몰의 5'-인화산 올리고뉴클레오티드를 함유하는 6μl의 용액과 합쳐 하이브리드화를 수행한다. 합성 단편은 LE'코드화 서열의 3'말단에 하이브리드화되고 남은 LE'단편의 단일 나선부위는 dATP, sTTP, dGTP 및 dCTP를 사용하여 클레노(klenow) 폴리머라아제 I에 의해 채워진다. 클레노 폴리머라아제 I은 DNA 폴리머라아제 I을 단백분해시켜 수득한다. 클레노 폴리머라아제 I은 5'→3' 중합 활성, 3'→5' 엑소뉴클레오라이틱 활성을 가지나 모 효소의 5'→3' 엑소뉴클레오라이틱 활성은 없다(참조 Kornberg, 1974, W, H.Freeman and Co., SFO, 98).
반응 혼합물은 50℃까지 가열한 후 10℃까지 서서히 냉각시키고 4μl의 클레노 효소를 가한다. 실온에서 15분간 배양시킨 후 37℃에서 30분간 배양시키고 5μl의 0.25몰 EDTA를 가하여 반응을 중지시킨다. 반응 혼합물을 페놀 추출하고 클로로포름 추출한 후 에탄올 침전시킨다. DNA를 제한 효소 BglII로 분해시킨 후 PAGE에 의해 단편을 분리한다. 겔에서 수득된 자동방사능 사진에서 예측된 길이가 약 470bp인32P 표지 단편이 나타나며 이는 전기용출에 의해 회수한다. 개략한 바와 같이 상기 단편 LE'(d)는 Bg1II 말단 및 프라이머의 개시부위에 부합되는 평활 말단을 함유한다.
2. 플라스미드 pTHα1의 제조
플라스미드 pThα1은 플라스미드 pBR322에 티모신 α1에 대한 합성 유전자를 삽입하여 제조한다. 티모신 α1코드화 DNA의 합성에는 제11도의 2개의 화살표가 모인 부분으로 표시된 16올리고뉴클레오티드(T1내지 T16)를 합성한 다음 연결시키는 공정이 포함된다.
met ATG가 N-말단에 삽입되고 5'말단은 단일 나선 점착 말단과 같이 설계하여 EcoRI 및 BamHI으로 절단된 플라스미드에의 결합을 용이하게 한다. 쉽게 추측할 수 있는 바와 같이 유전자 중심의 Bg1II부위는 재조합 플라스미드의 분석시 도움이 된다.
변형 포스포트리에스테르법[Itakura et al., 1977 and Crea et al., 1978]에 의해 올리고데옥시리보-뉴클레오타이드 T1내지 T16을 합성한다. 다양한 올리고-데옥시리보뉴클레오타이드는 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
티모신 α1유전자의 합성 올리고뉴클레오티드
* 주위온도에서
상기 합성은 제12도에 요약된 바와 같이 단편 T15의 제조방법으로 대표될 수 있다. T15의 합성에 사용되는 여러가지 뉴클레오티드 단편은 제12도에 번호로 지정되어 있다. 제12도에서 사용된 약어에 대한 설명은 다음과 같다 :
TPSTe : 2,4,6-트리이소프로필 벤젤설포닐 테트라졸
BSA : 벤젠설폰산
TLC : 박층 크로마토그라피
HPLC : 고성능 액체 크로마토그라피
DMT : 4,4'-디메톡시트리틸
CE : 2-시아노에틸
R :
-클로로페닐
Bz : 벤조일
An : 아니소일
iBu : 이소부틸
Py : 피리딘
ACOH : 아세트산
Et3N : 트리에틸아민
완전히 보호된 트리데옥시리보뉴클레오티드
(85mg, 0.05밀리몰) 및
(180mg, 0.1밀리몰)는 0℃에서 10분간 7 : 3(용적/용적)클로로포름/메탄올중의 2% BSA 각각 10 및 20ml씩으로 처리하여 5'하이드록실을 탈차단한다. 포화수성중 탄산암모늄(2ml)을 가하여 반응을 중지시키고 클로로포름(25ml)으로 추출한 물(2×10ml)로 세척한다. 유기층을 건조(황산 마그네슘)시키고 농축(약 5ml로)시킨 후 석유에테르(35℃ 내지 60°분획)를 가하여 침전시킨다. 원심분리시켜 무색침전을 합쳐서 진공하에 데시케이터중에서 건조시켜 각각
및
을 수득하면 실리카겔 tlc(Merck 60 F254, 클로로포름/메탄올, 9 : 1)에 의해 각각은 균질함에 나타난다.
트리머
및
(270mg, 0.15밀리몰; 145mg, 0.075밀리몰)을 트리에틸아민/피리딘/물(1 : 3 : 1, 용적/용적, 10ml)로 대기온도에서 25분간 처리하여 그의 포스포디에스테르(
및
)로 전환시킨다. 회전 증발에 의해 시약을 제거하고 무수 피리딘(3×10ml)과 같이 회전증발시켜 잔사를 건조시킨다. 트리머
(0.05밀리몰) 및 트리머
을 무수피리딘(3ml)중에서 TPSTe(50mg, 0.15밀리몰)와 합친 후 진공하에 2시간동안 주위온도에서 방치한다. TLC분석에서 95%의 트리머
이 헥사머로 전환되었음이 나타난다(10% 수성황산을 분무하고 60℃에서 가열하여 DMT그룹을 검출시켜 확인)반응 혼합물에 물(1ml)을 가하여 반응을 중지시킨 후 감압하에 용매를 증발시킨다. 톨루엔과 같이 증발시켜 피리딘을 제거한 후 트리머
및
에서 기술한 바와 같이 2% BSA(8ml)를 가하여 헥사머의 5'위치를 탈차단 시킨다. 생성물(
)은 실리카겔 컬럼(Merck 60H, 3.5×5cm) 상에서 클로로포름/메탄올(98 : 2 내지 95 : 5 용적/용적)로 단계적 구배 용출시켜 정제한다. 생성물
을 함유하는 분획을 증발건고시킨다. 이와 유사하게 트리머를
를
에 커플링시키고 실리카겔상에서 완전히 보호된 생성물을 직접 정제한다. 이 화합물의 3'말단을 트리에틸아민/피리딘/물로 전술한 바와 같이 처리하여 단편
로 전환시킨다.
최종적으로 헥사머
및
을 무수피리딘(2ml)중에서 축합제로 TPSTe(75mg, 0.225밀리몰)를 사용하여 커플링시킨다. 반응을 종결(4시간, 주위온도)시키고 회전증발시킨 후 잔사를 실리카겔상에서 크로마토그라피한다. 석유 에테르로 침전시켜 생성물
(160mg)을 수득하고 TLC상에서 검사하면 균질함이 확인된다. 피리딘(0.5ml)중 화합물
(20mg)을 농수산화 암모늄(7ml, 8시간, 60℃)으로 처리한 다음 80% 아세트산(15분, 주위온도)중에서 처리하여 완전히 탈차단시킨다. 아세트산을 증발시킨 후 고형 잔사를 4% 수성 수산화 암모늄(용적/용적, 4ml)중에 용해시켜 에틸에테르(3×2ml)로 추출한다. 수층을 1 내지 2ml로 농축시키고
의 정제를 위해 일부를 HPLC에 적용한다. 주 피이크에 상응하는 분획을 모아(약 2A254단위) 약 5ml로 농축시킨다. 최종 생성물
를 BiO-gel P-2(1.5×100cm)상에서 20% 수성에탄올로 용출시켜 탈염시키고 건고시킨 후 물(200μl)에 재현탁시켜 A254=10용액을 수득한다. 서열
를 2차원 서열 분석에 의해 확인한다.
스마토스타틴에서 상술한 바와 같은 방법[Itakura et al., 1977), insulin(Goeddel et al.,1979), and growth hormone(Goeddel et al.,1979, Nature 281 : 544)]에 따라 16개의 합성 올리고-뉴클레오티드에서 완전한 티모신 α1유전자를 합친다. 올리고뉴클레오티드 T2내지 T1510μg을 T4폴리뉴클레오티드 키나아제(Goeddel et al., 1979) 존재하에 [γ-32P]-ATP(New England Nuclear)로 정량적 인산화시켜 선택적 활성 약 1Ci/밀리몰을 얻는다. 20% 폴리아크릴아미드/7M 요소겔 전기영동에 의해 방사표지 단편을 정제하고 용출된 단편의 서열을 부분적 뱀독 분해물의 2차원 전기영동/호모크로마토그라피(Jay et al., 1974, Nucleic Acids Res 1 : 331)에 의해 확인한다. 후속 연결 반응동안 불필요한 중합을 최소화하기 위해 단편 T1및 T16은 비인산화시킨 채로 둔다. 이들 올리고뉴클레오티드(각 2μg)를 공지된 방법(Goeddel et al., 1979)을 사용하여 T4DNA리가아제에 의해 4개의 단편으로 이루어진 4그룹에 결합시킨다[제13도 참조]. 7M요소를 함유하는 15% 폴리아크릴아미드겔상의 겔 전기영동에 의해 반응 생성물을 정제한다[Maxam and Gilbert, 1977, Proc, Nat, Acad, Sci, USA 71 : 3455]. 4개의 분리된 생성물을 연결시키고 반응 혼합물을 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석한다. 티모신 α1 유전자(90 내지 105염기쌍) 크기의 DNA를 전기용출시킨다.
플라스미드 pBR322(0.5μg)를 BamHI 및 EcoRI제한 엔도뉴클레아제로 처리하고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 단편을 분리한다. 전기 용출에 의해 겔에서 긴 단편을 회수한 후 합성 DNA에 연결시킨다[Goeddel et al., Nature 281 : 544, 1979]. 이 혼합물을 사용하여 이.콜라이 K12 294를 형질전환시킨다. 5%의 형질전환 혼합물을 20μg/ml의 암피실린 함유 LB판상에 편다. 수득된 4개의 암피실린 내성 콜로니는 테트라사이클린 감수성이며 이는 테트라 사이클린 내성 유전자에 삽입되었음을 나타낸다. 상기 4개의 콜로니에서 얻어진 플라스미드의 분석결과 pThα1으로 명명된 플라스미드는 (a) pBR 322자체에서는 발견되지 않는 Bg1II 부위를 함유하므로 제11도에 나타난 바와 같이 티모신 α1 유전자의 존재를 시사하며, (b) BamHI/EcoRI 분해에 의해 생성된 약 105bp단편을 함유한다. 플라스미드 pThα1의 제조방법은 제13도에 나타내었으며 두꺼운 점은 5'-인산그룹을 나타낸다.
3. 처리된 pThα1과 LE'(d) 단편의 반응
플라스미드 pThα1은 암피실린 내성을 나타내는 유전자 및 5' 코드화 나선 말단에서 EcoRI 부위에 클론화되고 3'말단에서 BamHI 부위에 클론화된 티모신 α1을 나타내는 구조 유전자를 함유한다. 티모신 유전자는 Bg1II 부위도 함유한다. 상기에서 제조된 LE'(d) 단편을 받아들일 수 있는 플라스미드를 제조하기 위해 pThα1을 EcoRI 분해시킨 후 dTTP 및 dATP와 클레노 폴리머라이제 그 반응시켜 EcoRI 잔기를 평평하게 만든다. 생성물을 Bg1II 분해시켜 암피실린 내성을 나타내게 하는 유전자와 그 반대쪽 말단에 점착 BalII 잔기 및 평활말단을 함유하는 직쇄 DNA단편을 생성한다. 생성물은 Bg1II 점성 말단 및 평활 말단을 함유하는 LE'(d) 단편과 T4리가아제 존재하에 반응시킴으로써 다시 폐환시켜 플라스미드 ptrp 24를 형성한다. 이때 EcoRI 부위는 평활말단 연결이 일어나는 부위에서 생성된다.
E. 플라스미드 pSOM7△2△4의 제조
ptrp 24를 Bg1II으로 분해시키고 이어서 EcoRI으로 분해시킨 후 PAGE 및 전기용출시키면 3'코드화 말단에 인접한 Bg1II 접착 말단 및 EcoRI 접착 말단을 함유하는 LE'(d)폴리펩타이드에 대한 코돈을 갖는 단편이 수득된다. LE'(d) 단편은 플라스미드 pSOM7△2의 Bg1II 부위에 클론화되어 트립토판 프리모터/오퍼레이터의 조절하에 발현된 LE'폴리-펩타이드/소마토스타틴 융합 단백질이 생성될 수 있다. 이와 같이 할 경우 (1) 트립토판 프로모터/오퍼레이터에 대해 말단인 EcoRI 부위를 분해하기 위해 pSOM7△2를 부분적으로 EcoRI 분해시키고 (2) 코돈 판독대를 적절히 유지시키고 EcoRI 절단 부위를 다시 만들기 위해 프라이머 서열을 적절히 선택해야 한다.
그러므로 16μg의 플라스미드 pSOM7△2를 20mM Tris, pH 7.5, 5mM MgCl2, 0.02% NP40 세제 및 100mM NaCl을 함유하는 200μl의 완충액으로 희석한 다음 0.5단위의 EcoRI으로 처리한다. 37℃에서 15분간 유지시킨 후, 반응 혼합물을 페닐 추출하고 클로로포름 추출한 후 에탄올 침전시키고 Bg1II로 분해한다. 생성된 보다 긴 단편을 PAGE 공정에 이어서 전기용출시켜 분리한다. 이 단편은 LE'폴리펩타이드의 중심 말단에 대한 코돈 ＂LE'(P)＂, 즉, Bg1II 부위의 윗부분을 함유한다. 다음에 이 단편을 T4DNA 리가아제 존재하에 상기의 LE'(d) 단편에 연결시켜 플라스미드 pSOM7△2△4를 형성하고 이를 사용하여 이.콜라이 K12 294로 형질전환시킴으로써 트립토판 프로모터/오퍼레이터의 조절하에 완전히 재구성된 LE폴리펩타이드 및 스마토스타틴으로 이루어진 융합 단백질을 효율적으로 생성한다.
F. 테트라사이클린 내성을 나타내는 유전자를 억제하는 3'말단에 Pst 그 잔기와 5'말단에 Bg1II잔기를 함유하는 직쇄 DNA의 제조
플라스미드 pBR 322를 HindIII분해시킨 후 돌출 HindIII 말단을 S1 뉴클레아제로 분해시킨다. S1 뉴클레아제 분해에는 10μg의 HindIII-절단 pBR 322를 30μl의 S1 완충액(0.3M NaCl, 1mM ZnCl2, 25mM 아세트산 나트륨, pH 4.5)중에서 300단위의 S1 뉴클레아제로 30분간 15℃에서 처리하는 것이 포함된다. 1μl의 30×S1 뉴클레아제 정지용액(0.8M Tris 염기, 50mM EDTA)을 가하여 반응을 정지시킨다. 혼합물을 페놀추출하고 클로로포름 추출한 후 에탄올 침전시킨 후 전술한 바와 같이 EcoRI 분해시킨다. PAGE조작 및 후속 전기용출에 의해 수득된 단편은 EcoRI 점성말단과 코드화 나선이 티미딘으로 시작되는 평활 말단을 함유한다. 티미딘으로 시작되는 S1-분해 HindIII 잔기를 클레노 폴리머라아제 I-처리 Bg1II 잔기에 결합시켜 연결하에 Bg1II 제한 부위를 재구성할 수 있다.
그러므로 실시예 5C에서 제조된 플라스미드 pSOM7△2는 Bg1II 분해되며 생성된 Bg1II 점성 말단을 4개의 데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용하여 클레노 폴리머라아제 I로 처리하여 이중 나선화 한다. 생성물을 EcoRI 절단하고 소 단편을 PAGE 및 전기용출시키면 트립토판 프로모터/오퍼레이트 및 Bg1II 부위의 상부 LE' 중앙 서열의 코돈(＂LE'(P)＂)을 함유하는 DNA의 직쇄 조각이 수득된다. 생성물은 E coRI 말단 및 Bg1II 부위에 채워짐으로써 평활 말단을 갖는다. 그러나, 평활 말단을 상기 S1-분해 HindIII 단편의 평활 말단에 연결시킴으로써 Bg1II 부위가 재구성된다. 그러므로 이 2개의 단편은 T4DNA 리가아제 존재하에 연결되어 다시 폐환된 플라스미드 pHKY 10가 생성되며, 이는 캄피턴트 이.콜라이 K12 294세포에 형질전환됨으로써 전달된다. 재조합 플라스미드 pHKY 10을 함유하는 테트라사이클린 내성 세포를 선별하여 플라스미드 DNA를 추출한다.
Bg1II 및 PstI으로 분해시킨 후 PAGE 조작으로 분리시키고 긴 단편을 전기용출시켜 PstI 및 Bg1II 점성 말단을 갖는 목적하는 직쇄 DNA조각을 수득한다. 이와 같이 하여 pHKY 10으로부터 생성된 DNA 단편은 복제원을 함유하며, 따라서 trp LE'폴리펩타이드 융합 단백질 코드화 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자 코드화 유전자가 trp 프로모터/오퍼레이터에 의해 조절되는 플라스미드 pHI7△4△1의 제조성분으로 유용하다.
G. trp 프로모터/오퍼레이터를 함유하는 직쇄 DNA의 제조
실시예 5E에서 제조된 플라스미드 pSOM7△2△4를 부분적 EcoRI 분해시킨 후 PstI 분해시킨다. trp 프로모터/오퍼레이터를 함유하는 생성된 단편은 PAGE조작과 전기용출에 의해 분리한다. 스마토스타틴의 5'말단에 인접하게 절단되나 암피실린 내성 유전자와 trp 프로모터/오퍼레이터간에 존재하는 EcoRI 부위에서 절단되지 않는 단편을 수득하기위해 부분적 EcoRI분해가 필요하다. 암피실린 내성 유전자중에 PstI 절단함으로써 상실된 암피실린 내성은 상기 실시예 5F에서 생성된 최종 pHKY 10직쇄 DNA유도체와 연결하여 회복할 수 있다.
H. 프로인슐린의 32N-말단 아미노산 코드화 합성 유전자의 제조
프로인슐린의 처음 32개 아미노산을 코드화하는 유전자를 구성하는 제1단계로 표 2에 나타낸 18올리고뉴클레오티드를 제조한다. 최종적으로 구성된 전체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 제14도에 나타내었다.
[표 2]
인체 프로인슐린의 합성 올리고뉴클레오티드
합성 뉴클레오티드는 제14도에서 [ ]로 표시하였으며 밑줄하였다. 이 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법[Crea et al., 1978, J,Biol.chem.250. : 4592 and Itakura et al., 1975, J.Am Chem. Soc. 97 : 7327]으로 합성한다. 올리고뉴클레오티드는 크레아[Crea et al., 1978] 및 궤들[Goeddel, et al., 1979]에 의해 전술된 인체 인슐린 B쇄에 대한 유전자를 구성하는데에 사용된다. 2개의 올리고뉴클레오티드(B5' 및 B10')는 HpaII 및 말단 BamHI 및 EcoRI 제한 부위를 결합시킨다. 말단 부위는 클론화에 특히 유용하다.
인체 인슐린 B쇄 유전자의 좌반부위를 구성하는데 사용되는 8개의 올리고뉴클레오티드 H1-H8(Goeddel. et al., 1979)은 B쇄 유전자의 1 내지 13개의 아미노산 및 추가의 N-말단 메티오닌의 코드화 서열을 함유한다. B쇄 유전자의 우분 부위는 올리고뉴클레오티드 B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9및 B10에서부터 궤들[Goeddel, et al., 1979]의 방법에 따라 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결시킴으로써 제조한다. 생성된 유전자 단편은 인체 인슐린 B쇄의 14 내지 30개 아미노산 단위 및 가교쇄의 제1아르기닌을 코드화 한다. HpaII 제한 부위는 같은 판독대 및 위치의 유전자 서열에 인체 인슐린 유전자중 HpaII 부위로 결합된다. 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 연결된 유전자 단편을 정제하고 최대 DNA밴드를 용출시킨 후 단편을 HindIII-BamHI-절단된 플라스미드 pBR 322에 결합시킨다. 플라스미드 pB 3을 명명된 생성된 플라스미드를 형질전환에 의해 이.콜라이 K12 294에 삽입한다. 이 플라스미드는 암피실린 및 테트라사이클린에 대한 내성을 부여받았으며 목적 뉴클레오티드 서열을 함유함이 알려졌다.
pB3의 58 bp HindIII-BamHI 단편 및 pBH1의 46 bp EcoRI-HindIII 단편(Goeddel, et al., 1979)을 연결시켜 EcoRI 및 BamHI 말단을 함유하는 단편을 생성한다. 이 단편을 통상적으로 EcoRI 및 BamHI 제한된 플라스미드 pBR 322에 연결시키고 생성된 플라스미드를 pIB 3으로 명명하고 이.콜라이 K12 294에 클론화시킨다. 통상의 증폭 및 분리를 수행한 후 플라스미드 pIB 3을 EcoRI 및 HpaII로 분해시켜 메티오닌 앞에 오는 N-말단 프로인슐린 아미노산을 코드화하는 합성 유전자 단편(제15도의 단편 1)을 생성한다. 합성 유전자는 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 통상적으로 분리한다.
I. 인체 프로인슐린의 50C-말단 아미노산을 코드화하는 cDNA의 분리
목적 cDNA를 수득하는 도식은 제16도에 나타내었다. 여기에 따르면 BamHI 인식서열 및 약 20잔기의 3'폴리티미딜 산을 함유하는 DNA서열 pCCGGATCCGGTTT18T를 합성하여 cDNA합성을 위한 AMV리버스 트랜스크립타아제의 프라이머로 사용한다. 이 프라이머는 1.5×10-4마이크로몰의 TTP를 함유하는 0.6ml반응용적으로 1마이크로몰의 BamHI 데카뉴클레오티드를 함유하는 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라아제(Enzo Biochem 200단위)를 사용하여 제조한다. 이 반응은 완충계[chang, et al., 1978, Nature 275 : 617]중에서 1시간 동안 37℃에서 수행한다.
인체 도세포종 조직은[Institure f
r Diabetesforschung Muenchen, West Germany]에서 공급받는다. 본 분야의 숙련가들은 인체 도세포종 조직은 용이하게 구할 수 있으며 의학 단체에서 다수의 다른 소스로부터 수득할 수 있다. 인체 도세포종 조직 폴리 A mRNA(2.5μg)는 문헌[Ullrich, et al., 1977, Science 196 : 1313]에 기술된 방법에 따라 분리한 후 문헌[Wickens, et al., 1978, J. Biol, chem, 253 : 2483]에 기술된 방법에 따라 이중 나선 cDNA로 전환시킨다. 15mM Tris. HCl(pH 8.3 42℃), 21mM KCl, 8mM MgCl2, 30mM β-머캅토에탄올, 2mM의 플라이머 dCCGGATCCGGTT18T 및 1mM dNTPs를 함유하는 80μl의 반응물을 0℃에서 전배양시킨다. AMV 리버스트랜스크립타아제를 가한 후 반응혼합물을 42℃에서 15분간 배양시킨다. 생성된 RNA/DNA를 통상의 방법으로 변질시킨다.
25mM Tris. HCl, pH 8.3, 35mM KCl, 4mM MgCl2, 15mM β-머캅토에탄올, 1mM dNTPS및 9단위의 클레노폴리머라아제 I을 함유하는 150μl의 반응용액중에서 상보적 cDNA나선을 합성한다. 이 혼합물을 15℃에서 90분간 배양한 후 4℃에서 15시간동안 배양한다. 다음에 37℃에서 2시간동안 1000단위의 S1 뉴클레아제(Miles Laboratories, Elkhart, Indiana)를 사용하여 문헌[Wickens, et al., 1978]에 기술된 방법에 따라 S1 뉴클레아제 분해를 수행한다. 8% 폴리아크릴아미드 겔상에서 이중 나선 cDNA(0.37μg)를 전기영동시킨 다음 500bp 이상인 DNA단편을 용출시킨다. 마이젤[Maizel 1971, Meth, Virol, 5 : 180]의 방법에 따라 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라아제를 사용하여 단편이 3'말단에 올리고 데옥시시티딜산 잔리를 첨가한다. 다음에 dC가 붙은 cDNA 단편을 PstI 제한 효소로 분해시켜둔 pBR 322에 아닐링한 후 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라아제를 사용하여 데옥시구아니딜 산을 붙인다. 생성된 플라스미드를 사용하여 이.콜라이 K12 294를 형질전환시키고 생성된 세포를 LB 및 TET배지에 평판한다. 테트라사이클린 내성이나 암피실린 감수성인 콜로니를 분리하여 3개의 PstI 제한 부위를 갖는 플라스미드를 선별한다. 상기와 같은 제한 양식은 프로인슐린 유전자임을 나타내는 것이다[참조 Sures, et al., 1980, Science, 208 : 57]. 600bp 삽입물을 함유하는 pHI 104로 명명된 플라스미드는 에측된 PstI 제한 양식을 나타내며 cDNA제조중에 도입된 3'폴리A 폴리GC간에 BamHI 부위가 포함되어 있다. 삽입물의 뉴클레오티드 서열은 제14도에 나타내었다.
J. 인체 프로인슐린 코드화 유전자의 조립
인체 프로인슐린 코드화 유전자의 조립도는 제15도에 나타내었다.
프로인슐린의 처음 31개 아미노산을 코드화하는 합성 유전자 단편은 제15도의 단편 1이며 전술한 바와 같이 제한 엔도 뉴클레아제 EcoRI 및 HpaII를 사용하여 50μg의 플라스미드 pIB 3으로부터 회수한다. 또한 이 단편은 프리프로인슐린의 ＂전서열(presequence)＂ 대신 메티오닌을 코드화하는 ATG서열도 함유한다.
40μg의 플라스미드 pHI 104를 BamHI로 처리한 후 HpaII 제한 효소로 처리함으로써 mRNA의 해독 정지 시그널과 3'비해독 부위외에 아미노산 32 내지 86을 코드화하는 cDNA유전자 단편을 회수한다. 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 이어서 전기용출시켜 2개의 단편을 분리한다. 4℃에서 24시간동안 20μl의 리가아제 완충액중에서 T4DNA 리가아제로 처리하여 유전자 단편을 결합시킨다. 반응혼합물을 5μl의 H2O로 희석하고 페놀 및 클로로포름으로 각각 통상의 방법에 따라 추출한 후 에탄올로 침전시킨다.
생성된 DNA를 BamHI 및 EcoRI 제한 효소로 처리하여 제한 부위를 생성한 후 유전자 중합체를 회수한다. 조립된 프로인슐린 유전자를 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 분리하고(T4DNA 리가아제를 사용하여) EcoRI 및 BamHI 분해 플라스미드 pBR 322에 연결시킨다. 생성된 DNA를 사용하여 이.콜라이 K12 294를 형질전환시킨 후 생성된 콜로니를 테트라사이클린 감수성 및 암피실린내성에 대해 선별한다. 이 콜로니에서 분리된 플라스미드 pH 13은 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인된 목적 프로인슐린 유전자를 함유한다.
K. 인체 프로인슐린을 함유하는 단백질의 발현을 위한 플라스미드의 제조
메티오닌을 코드화하는 N-말단코돈을 함유하는 완성된 인체 프로인슐린 유전자는 플라스미드 pH 13을 EcoRI 및 BamHI 제한 효소로 처리하여 회수한다. 목적 단편은 겔 전기영동에 의해 정제한 다음(T4DNA 리가아제를 사용하여) 플라스미드 pSOM7△2△4 PstI -EcoRI 부분 분해물(실시예 5G에서 제조) 및 플라스미드 pHKY 10의 보다큰 PstI -Bg1II 단편(실시예 5F에서 제조)에 연결시킨다. EcoRI 및 BamHI 말단을 함유하는 완성된 인체 프로인슐린 유전자 약 1μg, PstI -EcoRI(부분) pSOM7△2△4 단편 4μg 및 pHKY 10의 PstI -Bg1II 단편 약 1μg을 4℃에서 24시간동안 연결 완충액중의 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결시킨다. 연결된 DNA 혼합물을 사용하여 이.콜라이 k12 294를 형질전환 시킨다. 암피실린 및 테트라사이클린 중에서 성장하는 콜로니를 선별하면 목적 플라스미드 pHI7△4△1을 함유하며 예측된 trp LE'-프로인슐린 융합 분자량의 단백질을 발현시킴이 확인된다. 삽입된 유전자 및 벡터의 DNA 서열 및 제한부위에 대해 trp LE'-프로인슐린을 발현시키는 플라스미드 pHI7△4△1은 완전히 확인되었다. 플라스미드 pHI7△4△1은 제15도에 나타내었으며 암피실린 및 테트라사이클린 내성이 재생되기 때문에 용이하게 선별될 수 있다.
[실시예 6]
[플라스미드 pNM 608 및 이.콜라이 k12 RV 308/pNM 608의 제조]
A. 플라스미드 pHI7△4△1의 ∼253bp EcoRI-Hpa I 단편의 제조
약 5μg의 플라스미드 pHI7△4△1 DNA, 10μl(10X)의 반응 완충액* 80μl의 물 및 5μl(5단위)의 HpaI 제한 효소를 37℃에서 약 1시간동안 배양시킨다. 70℃에서 5분간 배양시켜 반응을 종결한다. 반응 혼합물을 얼음중에서 냉각시킨 후, 약 12μl의 1M Tris. HCl, pH 7.2, 7μl의 물 및 1μl(10단위)의 EcoRI 제한 효소를 가한다. 생성된 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양시키고 이어서 70℃에서 5분간 배양시킨다. 얼음중에서 냉각시킨 후 생성된 DNA를 페놀 및 클로로포름; 이소아밀 알코올(24 : 1)로 각각 추출한 후 에탄올 침전시킨다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 목적 ∼253bp EcoRI-HpaI 단편을 통상적으로 분리하고 전기용출에 의해 회수한 다음 ETOH 침전시킨 후 약 10μl의 TE 완충액에 용해시켜 다음 단계에 사용하기 위해 0℃에서 보관한다.
* HpaI 제한 효소의 반응 완충액(10X)은 하기 조성이 되도록 제조한다 :
100mM Tris. HCl, pH 7
100mM MgCl2
60mM β-머캅토에탄올
200mM KCl
B. 플라스미드 pHI7△4△1의 ∼34bp HpaI -TagI 단편의 제조
32μl(5X)의 EcoRI 반응 완충액 중 약 20μg의 플라스미드 pHI7△4△1 DNA, 124μl의 물 및 4μl의 EcoRI 제한 효소(20단위)를 37℃에서 약 1시간동안 배양시킨다. 70℃에서 5분간 배양시켜 반응을 종결한다. 6% 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동에 이어 전기 용출 및 에탄올 침전을 수행함으로써 생성된 862bp EcoRI 단편을 분리한다. 다음에 분리된 단편을 16단위의 HpaI 제한 효소를 함유하는 약 100μl의 HpaI 완충액에 용해시킨다. 37℃에서 1.5시간동안 유지시킨 후 7.5단위의 TagI 제한 효소를 가하고 다시 1.5시간동안 배양을 계속하고 생성된 단편을
% 폴리아크릴이미드 겔 상에서 통상의 방법으로 분리한다. 전기 용출 및 에탄올 침전에 의해 목적 ∼34bp HpaI -TagI 단편을 회수한 다음 5μl의 TE 완충액에 용해시킨다.
* EcoRI 제한 효소의 반응 완충액(5X)은 하기 조성을 갖도록 제조한다 :
250mM NaCl
500mM Tris. HCl, pH 7.2
25mM MgCl2
30mM β-머캅토에탄올
C. 플라스미드 pBR 322의 EcoRI-ClaI 분해
약 5μl의 플라스미드 pBR 322 DNA, 10μl의 ClaI 반응 혼합물*, 77.5μl의 물 및 7.5μl(15단위)의 ClaI 제한 효소를 37℃에서 약 1시간동안 배양시킨다. 70℃에서 5분간 배양시켜 반응을 종결한다. 반응 혼합물을 빙냉시킨 후, 약 12.5μl의 1M Tris. HCl, pH 7.2 6.25μl의 1M NaCl 2.5μl의 0.1M MgCl2및 1μl(10단위)의 EcoRI 제한 효소를 가한다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양시킨 후 70℃에서 5분간 배양시킨다. 빙냉시킨 후, 생성된 DNA를 1% 아가로즈 겔 상에 전기영동시킨다. 용출 및 에탄올 침전시켜 긴 단편을 회수하고 약 20μl의 TE 완충액에 용해시켜 다음 단계에 사용하기 위해 0℃에서 보관한다.
* ClaI 제한 효소에 반응 혼합물(10X)은 하기 조성을 갖도록 제조한다 :
100mM Tris. HCl, pH 7.4
100mM MgCl2
60mM β-머캅토에탄올
D. 연결 및 형질전환
실시예 6A의 ∼253bp EcoRI-HpaI 단편 약 0.2μg, 실시예 6B의 HpaI-TagI 단편 약 0.5μg 및 실시예 6C의 EcoRI-ClaI 분해물 0.1μg을 연결하여 실시예 20의 방법에 따라 이.콜라이 K12 RV 308을 형질전환시키기 위해 사용한다.
아가로즈겔 전기영동(Maniatis et al, 1982) 및 기타 시험에 의해 통상적으로 확인되는 바와 같이 생성된 형질전환체는 목적 ∼4.6kb 플라스미드만을 함유한다. 본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pNM 608로 명명된 이 형질전환체를 선별하여 적당한 항생제를 함유하는 TY 한천상에 편 다음 통상의 미생물학적 기술을 사용하여 배양한다. 플라스미드 pNM 608은 플라스미드 pHI7△4△1의 ∼287bp EcoRI-ClaI(TagI) 단편의 바람직한 생성원인 동시에 이를 함유한다.
[실시예 7]
[플라스미드 pCZ112 및 이.콜라이 K12 RV308/pCZ112의 제조]
A. 플라스미드 pNM 608의 EcoRI-ClaI 분해 및 ∼0.288kb EcoRI-TagI 단편의 생성
(플라스미드 pHI7△4△1의 0.288kb EcoRI-TagI 단편의 제조시와 동일)
50μl의 매질염 완충액*중 약 5μg의 플라스미드 pNM 608 DNA를 37℃에서 약 1시간동안 각각 10단위의 EcoRI 및 Cla I 제한 효소와 같이 배양시킨다. DNA에 5μl의 3M 아세트산나트륨, pH 7.0을 가한 후 3용적부의 100% 에탄올로 침전시킨다. 목적 DNA 분해물을 100μl의 TE 완충액에 용해시키고 다음 단계에 사용하기 위해 0℃에서 보관한다.
* 매질 염 완충액은 하기 조성을 갖도록 제조한다 :
50mM NaCl
100mM Tris. HCl, pH 7.5
6mM MgCl2
2mM β-머캅토에탄올
B. DNA 링커 서열의 제조
목적 링커 서열은 이다구라 등의 기술[Itakura et al., 1977] 및 크레아 등의 기술[Crea et al., 1978]에 따라 변형 포스포트리에스테르법에 합성한다. 상기 합성법 또한 실시예 1에 상술되어 있다.
C. 연결 및 형질전환
실시예 7B의 DNA 링커 약 20피코올, 실시예 7A의 pNM 608 분해물 1μg, 플라스미드 pCZ101-10.2kb BamHI-EcoRI 단편 0.5μg(Xba I 제한 효소 및 완충액 대신 EcoRI 제한 효소 및 적절한 완충액을 사용하여 실시예 2B의 기술에 따라 제조) 및 실시예 3B의 플라스미드 pCZ101-0.6kb BamHI-HgiAI 단편 1μg을 연결하여 생성된 플라스미드를 사용하여 실시예 2D의 방법에 따라 이.콜라이 K12 RV 308을 형질전환시킨다.
아가로즈 겔 전기영동(Maniatis et al., 1982) 및 기타 시험에 의해 통상 확인되는 바와 같이 생성된 형질전환체는 목적 ∼10.8kb 플라스미드만을 함유한다. 본 명세서에서 이.콜라이 K12 BV308/pCZ112로 명명하는 이 형질전환체를 선별하여 적절한 항생제를 함유하는 TY 한천판상에 평판한 후 통상의 미생물적학적 기술을 사용하여 배양한다. SDS 겔 전기영동, RIA 및 기타 시험에 따르면 생성된 세포는 그 농도의 전술된 MET-ASP-ASP-LYS-bGH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pCZ112는 열 유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 목적 bGH 유도체 생성물의 최고 발현은 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
[실시예 8]
[플라스미드 pAT 1 및 이.콜라이 K12 RV308/pAT 1 의 제조]
실시예 7의 링커 서열 대신 하기 DNA 링커 서열을 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한다.
상기의 링커 서열은 이다구라[Itakura et al., 1977] 등의 방법 및 크레아[Crea et al., 1978] 등의 의해 기술된 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 이 합성 방법은 실시예 1에도 상세히 설명되어 있다.
본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pAT 1로 명명된 목적 형질전환체는 적절한 항생제를 함유하는 한천판상에 평판하고 플라스미드 pAT 1의 생성 및 분리를 위해 통상의 방법으로 배양한다. 또한 형질전환체는 SDS 겔 전기영동, RIA 및 기타 시험에서 확인되는 바와 같이 고농도의 전술된 MET-bGH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pAT 1은 열유도성 런이웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 목적 bGH 유도체 생성물의 최고 발현은 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
[실시예 9]
[플라스키드 pASP 1 및 이.콜라이 K12 RV308/pASP 1의 제조]
실시예 7의 링커 서열 대신 하기 DNA 서열을 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한다 :
상기의 링커 서열은 이다구라 등의 방법 및 크레아 등의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 합성 방법은 실시예 1에도 상세히 설명되어 있다.
본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pASP 1으로 명명된 목적 형질전환체는 적절한 항생제를 함유하는 TY 한천판상에 평판한 후 플라스미드 pASP 1의 생성 및 분리를 위해 통상적으로 배양한다. SDS 겔 전기영동, RIA 및 기타 시험에서 확인되는 바와 같이 형질전환체는 고농도에서 전술된 MET-ASP-bGH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pASP 1은 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 목적 bGH 유도체 생성물의 최고 발현은 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
[실시예 10]
[플라스미드 pASP 2 및 이.콜라이 K12 RV308/pASP 2의 제조]
실시예 7의 링커 서열 대신 하기 DNA 서열을 사용하여 실시예 7의 방법에 따라 제조한다 :
상기의 링커 서열은 이다구라 등의 방법 및 크레아 등의 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기의 합성 방법은 실시예 1에도 상세히 설명되어 있다.
본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pASP 2으로 명명된 목적 형질전환체를 적절한 항생제를 함유하는 TY 한천 판상에 평판한 후 플라스미드 pASP 1의 생성 및 분리를 위해 통상적으로 배양한다. SDS 겔 전기영동, RIA 및 기타시험에서 확인되는 바와 같이 형질전환체는 고농도의 전술된 MET-ASP-bGH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pASP 2는 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 목적 bGH 유도체 생성물의 최고 발현을 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
[실시예 11]
[플라스미드 pAT 2 및 이.콜라이 K12 RV308/pAT 2의 제조]
실시예 3C의 링커 서열 대신 하기의 DNA 링커 서열을 사용하여 실시예 3의 기술에 따라 제조한다 :
상기의 링커 서열은 이다구라 등의 방법 및 크레아 등의 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 실시예에도 상세히 설명되어 있다.
본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pAT 2으로 명명된 목적 형질전환체는 적절한 항생제를 함유하는 TY 한천 판상에 평판한 후 플라스미드 pAT 2의 생성 및 분리를 위해 통상적으로 배양한다. SDS 겔 전기영동, RIA 및 기타 시험에서 확인되는 바와 같이 형질전환체는 고농도의 상기 MET-bGH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pAT 2는 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 목적 bGH 유도체 생성물의 최고 발현은 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
[실시예 12]
[플라스미드 pCZ154 및 이.콜라이 K12 RV308/pCZ154의 제조]
실시예 7의 링커 서열 대신 하기의 DNA 링커 서열을 사용하여 실시예 7의 기술에 따라 제조한다 :
상기의 링커 서열은 이다구라 등의 방법 및 크레아 등의 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 합성법은 실시예 1에도 상세히 설명되어 있다.
본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pCZ154로 명명된 목적 형질전환체는 적절한 항생제를 함유하는 TY 한천 환상에 평판한 후 플라스미드 pCZ154의 생성 분리를 위해 통상적으로 배양한다. SDS 겔 전기영동 RIA 및 기타 시험에서 확인되는 바와 같이 형질전환체는 고농도의 상기 MET-VAL-bGH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pCZ154는 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 목적 bGH 유도체 생성물의 최고 발현은 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
[실시예 13]
[플라스미드 pCZ155 및 이.콜라이 K12 RV308/pCZ155의 제조]
실시예 7의 링커 서열 대신 하기의 DNA 링커 서열을 사용하여 실시예 7의 기술에 따라 제조한다 :
상기의 링커 서열은 이다구라 등의 방법 및 크레아 등의 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 합성법은 실시예 1에도 상세히 설명되어 있다.
본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pCZ155으로 명명된 목적 형질전환체는 적절한 항생제를 함유하는 TY 한천 환상에 평판한 후 플라스미드 pCZ155의 생성 및 분리를 위해 통상적으로 배양한다. SDS 겔 전기영동 RIA 및 기타 시험에서 확인되는 바와 같이 형질전환체는 고농도의 상기 MET-ALA-PHE-PRO-ALA-MET-SER-LEU-SER-VAL-b'GH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pCZ155는 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 목적 bGH 유도체 생성물의 최고 발현은 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
[실시예 14]
[플라스미드 pCZ156 및 이.콜라이 K12 RV308/pCZ156의 제조]
실시예 7의 링커 서열 대신 하기의 DNA 링커 서열을 사용하여 실시예 7의 기술에 따라 제조한다 :
상기의 링커 서열은 이다구라 등의 방법 및 크레아 등의 방법에 따라 제조할 수 있다. 상기 합성법은 실시예 1에도 상세히 설명되어 있다.
본 명세서에서 이.콜라이 K12 RV308/pCZ156으로 명명된 목적 형질전환체는 적절한 항생제를 함유하는 TY 한천 환상에 평판한 후 플라스미드 pCZ156의 생성 분리를 위해 통상적으로 배양한다. SDS 겔 전기영동 RIA 및 기타 시험에서 확인되는 바와 같이 형질전환체는 고농도의 상기 MET-ASP-bGH 유도체를 발현한다. 플라스미드 pCZ156는 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 목적 bGH 유도체 생성물의 최고 발현은 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
[실시예 15]
[플라스미드 pCZ103 및 이.콜라이 K12 RV308/pCZ103의 제조]
10μg의 플라스미드 pCZ101을 10μl의 10×BstEII 반응 완충액(1.5M NaCl; 60mM Tris-HCl, pH=7.9; 60mM MgCl2; 60mM 2-머캅토에탄올; 및 1mg/ml BSA), 2μl(∼20단위)의 제한 효소 BstEII 및 88μl의 H2O에 용해시킨 후 생성된 반응물을 60℃에서 2시간 동안 배양시킨다. 페놀 및 클로로포름 추출 후 0.25M NaOAc 용액으로부터 DNA를 수회에탄올 침전시킨다.
약 0.1μg의 BstEII-분해플라스미드 pCZ101 DNA를 100μl의 리가아제 완충액에 현탁시킨다. 100단위의 T4DNA 리가아제를 가하여 16℃에서 2시간동안 배양시킨 후, 연결된 DNA를 사용하여 이.콜라이 K12 RV308을 통상적으로 형질전환시킨다. 이.콜라이 K12 RV308/pCZ103 형질전환체를 가나마이신 상에서 선별하고 플라스미드 DNA를 제한 효소 분석하여 확인한다. 형질전환체로부터 실시예 2A의 방법에 따라 플라스미드 pCZ103을 분리한다.
[실시예 16]
[소 성장 호르몬 유도체를 발현시키기 위한 플라스미드 pCZ103-유도 벡터의 제조]
플라스미드 pCZ103을 제조하기 위해 수행한 BstEII 제거공정은 bGH 단백질-코드화 서열에 영향을 주지 않기 때문에 본 발명의 플라스미드 pCZ103-유도 플라스미드 상응하는 플라스미드 pCZ101-유도부분과 같이 같은 bGH 유도체를 발현한다.
본 발명의 pCZ103-유도화플라스미드는 상응하는 pCZ101-유도부분을 제조한 실시예의 기술에 따라 제조하며 표 3은 pCZ103-유도 플라스미드의 제조 공정을 개략한 것이다. 표 3에서는 pCZ103-유도화 플라스미드, 상응하는 pCZ101-유도부분의 제조공정을 기술하는 상응하는 실시예 및 제조공정에 관련된 다른 크기의 DNA 단편이 수록되어 있다.
[표 3]
bGH 유도체 발현을 위한 pCZ103-유도화 벡터의 제조
pCZ103-유도 플라스미드를 사용하여 통상적으로 이.콜라이 K12 RV308을 형질 전환시킨다. 생성된 형질전환체는 전술한 bGH 유도체를 발현시킨다. pCZ103-유도 플라스미드는 열유도성 런어웨이 레플리콘을 함유하기 때문에 최고의 발현은 배양온도 약 37℃에서 일어난다.
Claims (38)
- 런어웨이 레플리콘(runaway replicon)과 생활성 소 성장 호르몬 유도체를 코드화하는 하기 유전자 (1), (2), (3), (4), (5) 또는 (6)의 판독대 중에 존재하는 전사 및 해독 활성화 서열을 연결시킴을 특징으로 하여, 선별가능하며 자발적으로 복제하는 제조합체 DNA 발현 벡터를 제조하는 방법.상기식에서 A는 데옥시아데닐이고, G는 데옥시구아닐이며, C는 데옥시시토실이고, T는 티미딜이며, R은 소 성장 호르몬의 아미노산 9(로이신) 내지 191(페닐알라닌)을 코드화하는 DNA 서열이고, R1은 하기의 해독정지 시그널을 코드화하는 DNA 서열이다.또는
- 제1항에 있어서, 전사 활성화 서열이 이.콜라이 락토오즈, 박테리오파아지 λPLOL, 박테이오파아지 λPROR, tac, 이.콜라이 리포프로테인 또는 이.콜라이 트립토판 전사 활성화 서열인 방법.
- 제1 또는 2항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 방법.
- 제3항에 있어서, 해독 활성화 서열 이.콜라이 리포프로테인 서열인 방법.
- 제4항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-XbaI 단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ1920을 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-XbaI 단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pJR1을 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-XbaI 단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pAT2를 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼9.3kb BamHI-XbaI 단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pJR1.3을 제조하는 방법.
- 제3항에 있어서, 해독 활성화 서열이 이.콜라이 트립토판 서열인 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ112를 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한 단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pAT1을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pASP1을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pASP2를 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ154를 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ155를 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ101의 ∼10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ156을 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서, 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-EcoRI 단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ101-0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pAT2.3을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한 단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pAT1.3을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pASP1.3을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pASP2.3을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ154.3을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ155.3을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 플라스미드 pCZ103의 ∼9.3kb BamHI-EcoRI 단편, 플라스미드 pCZ101의 ∼0.6kb BamHI-HgiAI 제한단편, 하기 뉴클레오티드 서열의 DNA 링커 및 플라스미드 pNM608의 트립토판 프로모터-함유 EcoRI-ClaI 제한단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ156.3을 제조하는 방법.
- 플라스미드 pCZ101을 BstEII 제한효소로 처리하고, 생성된 DNA를 정제한 후, 정제된 DNA를 연결시켜 플라스미드 pCZ013을 생성시킴을 특징으로 하여, 제8 및 17 내지 23항중 어느 한항에 따른 방법에 사용되기에 적합한 플라스미드를 제조하는 방법.
- a) 런어웨이 레플리콘과 b) 작용성 폴리펩타이드의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오티드 트리플리트에 인접하여 하부에 위치한 해독 정지 시그널을 함유하는 작용성 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 판독대 중에 존재하는 전사 및 해독활성화 서열로 이루어진 선별가능하고 자발적으로 복제하는 재조합체 DNA 발현 벡터로 캄피턴트 세포를 형질 전환시킨 후, 형질 전환된 세포를 유전자 발현 및 런어웨이 레플리콘의 활성화 또는 유도에 적절한 증식 조건하에서 배양시킴을 특징으로 하여, 세포내 균질성이 높은 단백성 과립을 제조하는 방법.
- 제25항에 있어서, 재조합체 DNA 발현 벡터가 플라스미드인 방법.
- 제25 또는 제26항에 있어서, 전사 활성화 서열이 이.콜라이 트립토판 전사 활성화 서열, 이.콜라이 리포프로테인 전사 활성화 서열, 이.콜라이 락토오즈 전사 활성화 서열, 박테이오파아제 λPLOL전사 활성화 서열 또는 박테리아파아지 λPROR전사 활성화 서열인 방법.
- 제25 내지 27항중 어느 한항에 있어서, 전사 활성화 서열이 하나 이상의 이.콜라이 전사 활성화 서열을 직렬로 함유하는 방법.
- 제27항에 있어서, 전사 활성화 서열이 이.콜라이 트립토판 전사 활성화 서열 또는 이.콜라이 리포프로테인 전사 활성화 서열인 방법.
- 제25항 내지 29항중 어느 하나에 있어서, 작용성 폴리펩타이드 코드화 서열이 소 성장 호르몬, 인체 성장 호르몬, 인체 전-성장 호르몬, 돼지의 성장 호르몬, 포유동물 성장 호르몬, 조류 성장 호르몬, 인체 인슐린 A쇄, 인체 인슐린 B쇄, 인체 프로인슐린, 인체 프리-프로인슐린(pre-proinsulin), 인터페론, 유로키나아제, 인체조직 플라스미노겐 활성화제, 성장 호르몬 유리인자 또는 인터루킨(interleukin) II를 코드화하는 서열인 방법.
- 제26 내지 30항중 어느 한항에 있어서, 플라스미드가 플라스미드 pCZ1920, pJR1, pCZ112, pAT1, pAT2, pASP1, pASP2, pCZ201, pJR1.3, pAT1.3, pAT2.3, pASP1.3, pASP2.3, pCZ154.3, pCZ155.3 또는 pCZ156.3인 방법.
- 제25 내지 31항중 어느 한항에 있어서 형질전환된 숙주 세포가 원핵 세포인 방법.
- 제32항에 있어서, 형질전환된 숙주 세포가 이.콜라이인 방법.
- 제33항에 있어서, 형질전환된 숙주 세포가 이.콜라이 K12 RV308인 방법.
- 제1 내지 23항중 어느 한항에 따른 방법에 의해 생성되는 벡터내에 포함되어 있는 유전자에 의해 코드화되는 소의 성장 호르몬 유도체(단, 메티오닐 소 성장 호르몬은 제외)를 우유 생산을 증가시키는데 유효한 양으로 젖소에게 투여함을 특징으로 하여, 젖소에서의 우유 생산을 증가시키는 방법.
- 제35항에 있어서, 유효량이 동물당 1일 약 0.05 내지 100,000μg인 방법.
- 제36항에 있어서, 유효량이 동물당 1일 약 5 내지 25,000μg인 방법.
- 제37항에 있어서, 유효량이 동물당 1일 약 500 내지 5000μg인 방법.
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