JPS60259185A - グリセリンオキシダ−ゼの取得法 - Google Patents
グリセリンオキシダ−ゼの取得法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はグリセリンオキシダーゼの取得法に関する。
トリグリセリド(長鎖脂肪酸のグリセリンエステル)の
測定は医学的診断学にとって非常に重要である。血中の
上昇したトリグリセリド含量は動脈硬化症の主要な危険
因子である。高いトリグリセリド値、すなわち高トリグ
リセリド症の場合、低いトリグリセリド値におけるより
冠状動脈不全及び心臓砂室がしばしば起こる。
測定は医学的診断学にとって非常に重要である。血中の
上昇したトリグリセリド含量は動脈硬化症の主要な危険
因子である。高いトリグリセリド値、すなわち高トリグ
リセリド症の場合、低いトリグリセリド値におけるより
冠状動脈不全及び心臓砂室がしばしば起こる。
高トリグリセリド症により動脈硬化症及び冠状動脈症に
かかりやすくなるので、これを早期に発見し、ちょうど
よい時期に治療を開始しなければならない。従って、迅
速で信頼のできるトリグリセリドもしくはグリセリンの
測定法は大きな意義な有する。
かかりやすくなるので、これを早期に発見し、ちょうど
よい時期に治療を開始しなければならない。従って、迅
速で信頼のできるトリグリセリドもしくはグリセリンの
測定法は大きな意義な有する。
使用可能な公知のトリグリセリド測定法はリパーゼ/エ
ステラーゼを用いてのトリグリセリドの酵素的加水分解
及び例えばグリセロキナーゼ/ピルビン酸キナーゼ/乳
酸デヒドロゲナーゼな用、いての又はグリセリンオキシ
ダーゼを用いての遊離グリセリン測定を基礎とする(西
ドイツ国特許公告第2817087号公報)。
ステラーゼを用いてのトリグリセリドの酵素的加水分解
及び例えばグリセロキナーゼ/ピルビン酸キナーゼ/乳
酸デヒドロゲナーゼな用、いての又はグリセリンオキシ
ダーゼを用いての遊離グリセリン測定を基礎とする(西
ドイツ国特許公告第2817087号公報)。
しかしながら、この公知法は大きな欠点を示す。すなわ
ち、グリセロキナーゼ法においてのこの試薬の安定性は
多くの不安定な補酵素及び酵素が存在するので僅かであ
り、常に試料の空値測定を実施しなければならない。公
知のグリセリンオキシダーゼ法においては、この酵素が
これな含有する公知の微生物中に全くわずかにしか存在
せず、更にろOU/〜程度の低い比活性を示すという重
要な欠点がある。
ち、グリセロキナーゼ法においてのこの試薬の安定性は
多くの不安定な補酵素及び酵素が存在するので僅かであ
り、常に試料の空値測定を実施しなければならない。公
知のグリセリンオキシダーゼ法においては、この酵素が
これな含有する公知の微生物中に全くわずかにしか存在
せず、更にろOU/〜程度の低い比活性を示すという重
要な欠点がある。
従って、本発明の課題は従来公知のグリセリンオキシダ
ーゼ法の欠点を示さず、かつその利点を保持するような
トリグリセリドもしくはグリセリンの測定法及び測定試
薬をみいだすことな可能とする、グリセリンオキシダー
ゼを取得する方法を提供することである。
ーゼ法の欠点を示さず、かつその利点を保持するような
トリグリセリドもしくはグリセリンの測定法及び測定試
薬をみいだすことな可能とする、グリセリンオキシダー
ゼを取得する方法を提供することである。
この課題は特許請求の範囲に記載されたグリセリンオキ
シダーゼの取得法により解決する。
シダーゼの取得法により解決する。
本発明は公知のグリセリンオキシダーゼ含有微生物に比
較して約数10倍高いグリセリンオキシダーゼ含量を示
すだけでなく、更に非常に高い比活性を有するグリセリ
ンオキシダーゼをも含有する微生物アスペルギルス5p
ec、 BMTU1997−1 (DSM 1729
)の意想外な発見に基づく。
較して約数10倍高いグリセリンオキシダーゼ含量を示
すだけでなく、更に非常に高い比活性を有するグリセリ
ンオキシダーゼをも含有する微生物アスペルギルス5p
ec、 BMTU1997−1 (DSM 1729
)の意想外な発見に基づく。
本発明方法により得られたグリセリンオキシダーゼを用
いるグリセリンの測定法の範囲において、自体公知の方
法により酸素消費量又は生じたH2O2を預す定するこ
とが出来る。酸素消費11ニーは酸未電極を用いてボラ
ロメトリーにより測定するのが有利である。そJlとい
うのもこの方法が特に自動操作に好適であるためである
。これに関して西ドイツ国特許公開第2130.540
号、同第213[]308号公報に記載された水性媒体
中の酸素消費■のボラロメトリー測定法が好適である。
いるグリセリンの測定法の範囲において、自体公知の方
法により酸素消費量又は生じたH2O2を預す定するこ
とが出来る。酸素消費11ニーは酸未電極を用いてボラ
ロメトリーにより測定するのが有利である。そJlとい
うのもこの方法が特に自動操作に好適であるためである
。これに関して西ドイツ国特許公開第2130.540
号、同第213[]308号公報に記載された水性媒体
中の酸素消費■のボラロメトリー測定法が好適である。
他の好適な方法はガスクロマトグラフィーである。
形成されたH2O2は滴定法によっても、ポテンシオメ
トリー、ポーラログラフイー及び比色定量法並びに酵素
法によっても測楚できる。カタラーゼ及びペルオキシダ
ーゼを使用しての酵素法は有利である。それというのも
これは非常に特異的であり、かつ信頼出来るものである
だけでなく、過酸化水素を形成する主反応と最も簡単な
方法で組合わせることができる。特にβ〜ジケトン、例
えばアセチルアセトン及びメタノールもしくはエタノー
ル又はメチレングリコールの存在下でのカタラーゼを用
いての測定並びに1個以上の色原体の存在下でのペルオ
キシダーゼを用いての測定が好適であることが判明する
。カタラーゼ、アセチルアセトン及θメタノールを用い
ての測定において、メタノールはアセチルアセトンと共
に呈色反応を起こすホルムアルデヒドに酸化され、これ
を測定することができる。ペルオキシダーゼを用いて測
定な行なう場合、反応後、測光法により測定することが
できる化合物を色原体として使用する。
トリー、ポーラログラフイー及び比色定量法並びに酵素
法によっても測楚できる。カタラーゼ及びペルオキシダ
ーゼを使用しての酵素法は有利である。それというのも
これは非常に特異的であり、かつ信頼出来るものである
だけでなく、過酸化水素を形成する主反応と最も簡単な
方法で組合わせることができる。特にβ〜ジケトン、例
えばアセチルアセトン及びメタノールもしくはエタノー
ル又はメチレングリコールの存在下でのカタラーゼを用
いての測定並びに1個以上の色原体の存在下でのペルオ
キシダーゼを用いての測定が好適であることが判明する
。カタラーゼ、アセチルアセトン及θメタノールを用い
ての測定において、メタノールはアセチルアセトンと共
に呈色反応を起こすホルムアルデヒドに酸化され、これ
を測定することができる。ペルオキシダーゼを用いて測
定な行なう場合、反応後、測光法により測定することが
できる化合物を色原体として使用する。
好適な色原体の例は2.クーアミノベンズチアゾリン−
スルホン酸である。他の有利な例はトリンダー(Trj
、nder )による指示薬システムであり(Ann、
C]、in、 Bi、ochem、第6巻(1969
年)、第24〜27頁)、ここではフェノールを4−ア
ミンアンチピリン(4−AAp )とペルオキシダーゼ
、(POD )の存在下に、H2O2の作用下に酸化的
に結合させ色素とする。フェノールのかわりにフェノー
ル誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘
導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノ
キノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル
酢酸及び同じように反応する物質を使用することができ
る。、4−アミノアンチピリンの代わりに4−アミノア
ンチピリン誘導体、フェニレンジアミンスルホン酸、M
BTH(メチルベンゾチアゾワンヒドラゾン)、s−M
BTH(スルホン化メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン
)、MBTH誘導体、S −MBTH誘導体並びに同様
に反応する物質を使用することができる。
スルホン酸である。他の有利な例はトリンダー(Trj
、nder )による指示薬システムであり(Ann、
C]、in、 Bi、ochem、第6巻(1969
年)、第24〜27頁)、ここではフェノールを4−ア
ミンアンチピリン(4−AAp )とペルオキシダーゼ
、(POD )の存在下に、H2O2の作用下に酸化的
に結合させ色素とする。フェノールのかわりにフェノー
ル誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘
導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノ
キノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル
酢酸及び同じように反応する物質を使用することができ
る。、4−アミノアンチピリンの代わりに4−アミノア
ンチピリン誘導体、フェニレンジアミンスルホン酸、M
BTH(メチルベンゾチアゾワンヒドラゾン)、s−M
BTH(スルホン化メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン
)、MBTH誘導体、S −MBTH誘導体並びに同様
に反応する物質を使用することができる。
本発明方法により得られたグリセリンオキシダーゼを含
有するグリセリンの測定試薬としてハアスペルギルス5
pec、BMTU 1997−1(DSM 1729
、)からのグリセリンオキシダーゼ及びH2O2の測定
システムから成る試薬を挙げることができる。有利にこ
の試薬はエステル化グリセリンの鹸化のための付加的な
薬剤、特にリパ」ゼ/エステラーゼ又はエステラーゼを
含有する。このために好適な試薬は専門家に公知であり
、ここで更に詳細に説明する必要はない。
有するグリセリンの測定試薬としてハアスペルギルス5
pec、BMTU 1997−1(DSM 1729
、)からのグリセリンオキシダーゼ及びH2O2の測定
システムから成る試薬を挙げることができる。有利にこ
の試薬はエステル化グリセリンの鹸化のための付加的な
薬剤、特にリパ」ゼ/エステラーゼ又はエステラーゼを
含有する。このために好適な試薬は専門家に公知であり
、ここで更に詳細に説明する必要はない。
有利な実施形式によれば、この試薬は主にグリセリンオ
キシダーゼ、カタラーゼ、アセチルアセトン、メタノー
ル及び緩衝剤から、個別に又は混合してなる。もう1つ
の有利な実施形式%式% −ゼ、少なくとも1種の色原体及び緩衝剤から、個別に
又は混合してなる。グリセリンオキシダーゼとは以下常
にアスペルギルス5pec、 BMTUl 997−1
(DSM 1729 )からのグリセリンオキシダー
ゼのことを示す。色指示システムはトリンダーによるシ
ステムが有利である。
キシダーゼ、カタラーゼ、アセチルアセトン、メタノー
ル及び緩衝剤から、個別に又は混合してなる。もう1つ
の有利な実施形式%式% −ゼ、少なくとも1種の色原体及び緩衝剤から、個別に
又は混合してなる。グリセリンオキシダーゼとは以下常
にアスペルギルス5pec、 BMTUl 997−1
(DSM 1729 )からのグリセリンオキシダー
ゼのことを示す。色指示システムはトリンダーによるシ
ステムが有利である。
前記の有利な試薬組成物は前記の必須成分の他に付加的
に常用の溶剤、安定剤又は/及び界面活性物質を含有し
てよい。これら添加物すべては専門家に公知であり、過
酸化水素のための検出システムにおいて常用である、緩
衝剤としてはpH5〜10、有利にpH6〜9を緩衝す
る物質が好適である。好適な緩衝剤の典型的な例は燐酸
塩緩衝剤、トリス−緩衝剤、TRA−緩衝剤、酢酸塩緩
衝剤、クエン酸塩緩衝剤及び1(e’pes −緩衝剤
(N −2−ヒドロキシエチルピペラジン−N−エタン
−スルホン酸)である。
に常用の溶剤、安定剤又は/及び界面活性物質を含有し
てよい。これら添加物すべては専門家に公知であり、過
酸化水素のための検出システムにおいて常用である、緩
衝剤としてはpH5〜10、有利にpH6〜9を緩衝す
る物質が好適である。好適な緩衝剤の典型的な例は燐酸
塩緩衝剤、トリス−緩衝剤、TRA−緩衝剤、酢酸塩緩
衝剤、クエン酸塩緩衝剤及び1(e’pes −緩衝剤
(N −2−ヒドロキシエチルピペラジン−N−エタン
−スルホン酸)である。
前記の試薬配合物は次の量比で主なる成分を含有する:
グリセリンオキシダーゼ 2〜150U/1e。
へ/L/ オ# シタV D 、 !Er”100ν創
、少なくとも1種の色原体 0n5−20ミリ−!:/
Vt1並びに 少なくとも1種の界面活性剤 QI]01”(1,1g
/ILへ緩衝剤 pH6〜9゜ 動力学的測定のために試薬配合物を使用すべき場合、次
の量比が有利である: グリセリンオキシダーゼ 10 ト25 QKU/z\
ペルオキシダーゼ 5〜50KU/l。
、少なくとも1種の色原体 0n5−20ミリ−!:/
Vt1並びに 少なくとも1種の界面活性剤 QI]01”(1,1g
/ILへ緩衝剤 pH6〜9゜ 動力学的測定のために試薬配合物を使用すべき場合、次
の量比が有利である: グリセリンオキシダーゼ 10 ト25 QKU/z\
ペルオキシダーゼ 5〜50KU/l。
色原体 0.2〜5ミリモ/l/A
及び場合により
少なくとも1種の界面活性剤 1〜5.!i7//を又
はこれらの数倍量、及び緩衝剤 PH6,8−8,0グ
リセリンオキシダーゼを獲得するために使用した微生物
アスペルギルス5pec、 BMTU 1997−1
(DEIM 1729 )の培養は主成分としてグリセ
リン、麦芽エキス及び酵母エキス、その他に緩衝剤、塩
及び微量元素を含有する培地を使用して自体公知法で行
なう。予培地としては有利にグリセリン1〜1oog/
ls麦芽エキスト50g/l、酵母エキスト109/l
。
はこれらの数倍量、及び緩衝剤 PH6,8−8,0グ
リセリンオキシダーゼを獲得するために使用した微生物
アスペルギルス5pec、 BMTU 1997−1
(DEIM 1729 )の培養は主成分としてグリセ
リン、麦芽エキス及び酵母エキス、その他に緩衝剤、塩
及び微量元素を含有する培地を使用して自体公知法で行
なう。予培地としては有利にグリセリン1〜1oog/
ls麦芽エキスト50g/l、酵母エキスト109/l
。
綿の実検1〜100g/L並びにに2HPO4・6H2
00,2〜5g/lc又は他のに2HPO4−調剤の当
量)、KNO30,2〜5 g/ L、 CaC0z
0.1〜5g/ l、Mail 0.1〜1 g/ t
、、Fe5o40−001〜0.1 fl/l (7水
和物として測定)及びMgSO40,1〜5g/l(7
水和物として測定)を有する培地を使用する。
00,2〜5g/lc又は他のに2HPO4−調剤の当
量)、KNO30,2〜5 g/ L、 CaC0z
0.1〜5g/ l、Mail 0.1〜1 g/ t
、、Fe5o40−001〜0.1 fl/l (7水
和物として測定)及びMgSO40,1〜5g/l(7
水和物として測定)を有する培地を使用する。
主培地にはグリセリン20〜200 g/l。
麦芽エキス5A−100g/1%酵母エキスo、5〜5
g/ls燐酸−水素カリウム0.2〜5g/l、KNO
3Q、2〜59 / 4Xcaco30.1〜5 g/
”% NaC10−1〜1 g/ L % 硫酸第1
鉄0.0[]11〜0.1gを及び硫酸マグネシウム0
.1〜5g/lを有する培地を使用するのが有利である
。
g/ls燐酸−水素カリウム0.2〜5g/l、KNO
3Q、2〜59 / 4Xcaco30.1〜5 g/
”% NaC10−1〜1 g/ L % 硫酸第1
鉄0.0[]11〜0.1gを及び硫酸マグネシウム0
.1〜5g/lを有する培地を使用するのが有利である
。
個々の塩は前記予培地で記載したものと相応するもので
ある。
ある。
予培地は通気下に25〜40℃の温度で振盪培地として
行なうのがよい。培養期間は一般に20〜60時間であ
る。
行なうのがよい。培養期間は一般に20〜60時間であ
る。
温度及び培養期間は主培地においても同様である。小さ
な発酵器中で空気0.5〜1 t/分/を培地を導入す
る際特に良好な結果が得られる。
な発酵器中で空気0.5〜1 t/分/を培地を導入す
る際特に良好な結果が得られる。
培養終了後、この生物塊を常法で分離し、この細胞を砕
解する。常用の砕解法を使用することができるが、機械
的に砕解するのが有利である。砕解溶液から不溶部を例
えば遠心分離又は吸引濾過することにより除去する。こ
の得られた溶液をそのまま直接グリセリン測定に使用す
ることができる。しかし更にこの酵素を精製するのが有
利である。
解する。常用の砕解法を使用することができるが、機械
的に砕解するのが有利である。砕解溶液から不溶部を例
えば遠心分離又は吸引濾過することにより除去する。こ
の得られた溶液をそのまま直接グリセリン測定に使用す
ることができる。しかし更にこの酵素を精製するのが有
利である。
精製は酵素分割のために常用の生物学的方法により行な
うことができる。しかし特に好適であるのは酵素分割に
おいて常用されない方法、つまりトリクロル酢酸での沈
殿であることが判明した。通常、トリクロル酢酸添加は
、蛋白質を有さない溶液にのみ興味がある場合、蛋白質
の完全な沈殿、すなわち蛋白質除去のためのみ行なわれ
る。意想外にも、本発明による酵素がトリクロル酢酸に
より活性損失なしに、かつ高い濃縮効率で沈殿するとい
うことが判明した。
うことができる。しかし特に好適であるのは酵素分割に
おいて常用されない方法、つまりトリクロル酢酸での沈
殿であることが判明した。通常、トリクロル酢酸添加は
、蛋白質を有さない溶液にのみ興味がある場合、蛋白質
の完全な沈殿、すなわち蛋白質除去のためのみ行なわれ
る。意想外にも、本発明による酵素がトリクロル酢酸に
より活性損失なしに、かつ高い濃縮効率で沈殿するとい
うことが判明した。
この際、この沈殿を、PH5,4〜4.6の範囲のPI
−1値までトリクロル酢酸を添加することにより行なう
。分離した沈殿中に比活性約300U/#I9を有する
所望の酵素が見い出された。
−1値までトリクロル酢酸を添加することにより行なう
。分離した沈殿中に比活性約300U/#I9を有する
所望の酵素が見い出された。
更に精製が所望の場合には、アセトン沈殿、引き続き硫
酸アンモニウム分割並びに弱塩基性交換樹脂での最後の
処理により行なうのが有利である。アセトン沈殿の際、
この溶液にアセトン0.25〜0.65容阻を加える。
酸アンモニウム分割並びに弱塩基性交換樹脂での最後の
処理により行なうのが有利である。アセトン沈殿の際、
この溶液にアセトン0.25〜0.65容阻を加える。
硫酸アンモニウム分割を0.5〜2.0のモル濃度で実
施するのが有利である。この操作はすでに800U/%
’より高い比活性に導びく。弱塩基性イオン交換樹脂、
有利にジエチルアミンエタノール基含有網状デキストラ
> (DEAFi 5ephadex )での処理は史
にろ〜10倍の精製な与え、約2500〜8000U/
m9の比活性を有するグリセリンオキシダーゼに導ひく
。本発明により使用した微生物をもちいて、すでに15
0000〜200000U/7培地の活性が得られるの
で、この方法でグリセリン測定に必要なグリセリンオキ
シダーゼ川が急倣に減少し、この製造は著[2く安くな
る。
施するのが有利である。この操作はすでに800U/%
’より高い比活性に導びく。弱塩基性イオン交換樹脂、
有利にジエチルアミンエタノール基含有網状デキストラ
> (DEAFi 5ephadex )での処理は史
にろ〜10倍の精製な与え、約2500〜8000U/
m9の比活性を有するグリセリンオキシダーゼに導ひく
。本発明により使用した微生物をもちいて、すでに15
0000〜200000U/7培地の活性が得られるの
で、この方法でグリセリン測定に必要なグリセリンオキ
シダーゼ川が急倣に減少し、この製造は著[2く安くな
る。
前記培養法及び精製法は酵素を培養の間培地に放出しな
いということを前提とする。しかしながら、界面活性剤
の存在下に培養することにより培地中に少なくとも活性
の1部が移る。同様に、得られた細胞からの界面活性剤
での抽出も可能である。しかしながら、この結果は機械
的砕解、例えば高圧分散における結果より劣っている。
いということを前提とする。しかしながら、界面活性剤
の存在下に培養することにより培地中に少なくとも活性
の1部が移る。同様に、得られた細胞からの界面活性剤
での抽出も可能である。しかしながら、この結果は機械
的砕解、例えば高圧分散における結果より劣っている。
本発明による酵素は従来公知のグリセリンオキシダーゼ
と特に著しく低い分子量により異なっている。例えば従
来グリセリン測定に使用したグリセリンアルデヒド形成
グリセリンオキシダーゼが分子微少なくとも30000
0を示すのに対し、本発明の酵素はわずか約90000
の分子量を示す。更に、本発明による酵素の活性は硫酸
銅又は酢酸鉛により抑制されず、一方SH−試薬は阻止
する。それに反し、前記の公知グリセリンオキシダーゼ
の場合はSH−試薬は安定化させ、硫酸銅及び酢酸鉛は
活性を約90%まで抑制する。その他の主な差は公知の
酵素の比活性が約30U/〜であるのに対し本発明によ
る酵素の比活性は2000〜8.000U/m9である
ということである。更に、本発明による酵素の安定性は
pH5,0もしくはpH10,0で著しくより良好であ
り、57℃における10分後の活性はこの条件下でなお
50〜55%を有し、それに対し公知の酵素は6もしく
は6%を示す。
と特に著しく低い分子量により異なっている。例えば従
来グリセリン測定に使用したグリセリンアルデヒド形成
グリセリンオキシダーゼが分子微少なくとも30000
0を示すのに対し、本発明の酵素はわずか約90000
の分子量を示す。更に、本発明による酵素の活性は硫酸
銅又は酢酸鉛により抑制されず、一方SH−試薬は阻止
する。それに反し、前記の公知グリセリンオキシダーゼ
の場合はSH−試薬は安定化させ、硫酸銅及び酢酸鉛は
活性を約90%まで抑制する。その他の主な差は公知の
酵素の比活性が約30U/〜であるのに対し本発明によ
る酵素の比活性は2000〜8.000U/m9である
ということである。更に、本発明による酵素の安定性は
pH5,0もしくはpH10,0で著しくより良好であ
り、57℃における10分後の活性はこの条件下でなお
50〜55%を有し、それに対し公知の酵素は6もしく
は6%を示す。
本発明方法により得られたグリセリンオキシダーゼを使
用する前記方法及び試薬はすべての種類の水性媒体、例
えば食品抽出物、体液及び特に血清中のグリセリンもし
くはグリセリンエステル(トリグリセリド)の測定に好
適である。
用する前記方法及び試薬はすべての種類の水性媒体、例
えば食品抽出物、体液及び特に血清中のグリセリンもし
くはグリセリンエステル(トリグリセリド)の測定に好
適である。
この方法の大きな特異性により遊離のグリセリンだけが
測定される。先ず第1に興味のあるエステル化グリセリ
ンの測定は、この化合物の鹸化により行なわれる。鹸化
を酵素により行なうのが有利である。それというのも、
こうして鹸化を本来のグリセリン測定と同時に行なうこ
とができる。
測定される。先ず第1に興味のあるエステル化グリセリ
ンの測定は、この化合物の鹸化により行なわれる。鹸化
を酵素により行なうのが有利である。それというのも、
こうして鹸化を本来のグリセリン測定と同時に行なうこ
とができる。
次に実施例につき本発明の詳細な説明する。
例 1
1)微生物の培養
グリセリン1o g / ts麦芽エキス1og/l、
酵母エキスs g/ls綿実粉1実検/l。
酵母エキスs g/ls綿実粉1実検/l。
K2PO,・3H201,5jJ / 6% KNO3
1g/ tsCaC032,0g/ l、 NaC10
,5jJ / t、 F6so、・7 H2O1]、0
1 g/ L及びMg5O(7)12o 1.Og /
lを含有する予培地60rrtlをアスペルギルス5p
ec、 BMTU 1997−1 (DSM 1729
)の胞子で接種し、30℃で48時間通気下に!盪す
る。
1g/ tsCaC032,0g/ l、 NaC10
,5jJ / t、 F6so、・7 H2O1]、0
1 g/ L及びMg5O(7)12o 1.Og /
lを含有する予培地60rrtlをアスペルギルス5p
ec、 BMTU 1997−1 (DSM 1729
)の胞子で接種し、30℃で48時間通気下に!盪す
る。
このようにして得られた予培地”) 60 mlをグリ
セリン1005’/ls表芽エキス40g/l。
セリン1005’/ls表芽エキス40g/l。
酵母エキス2.5 !j/ t 、 K2HPO4・3
H201,5g/l、 KNO31,Oji / l、
caco32.Og / 4%NaCl Q、59 /
L 、 FeSO4・7H200,01g/ を及び
Mg5O,・7H201、Ojj / I−を含有する
主培地1st中に加える。600 r、p、m、で攪拌
し、空気10t/分で通気された251発酵器中で30
°Cで主培養を行なった。培養期間22時間後、活性は
174800U/lであった。活性測定な0.1モルT
RA−緩衝剤中、PH8で、温度25°Cでp−クロル
フェノール及び4−アミノアンチピリンを用いて546
nmで行なった。
H201,5g/l、 KNO31,Oji / l、
caco32.Og / 4%NaCl Q、59 /
L 、 FeSO4・7H200,01g/ を及び
Mg5O,・7H201、Ojj / I−を含有する
主培地1st中に加える。600 r、p、m、で攪拌
し、空気10t/分で通気された251発酵器中で30
°Cで主培養を行なった。培養期間22時間後、活性は
174800U/lであった。活性測定な0.1モルT
RA−緩衝剤中、PH8で、温度25°Cでp−クロル
フェノール及び4−アミノアンチピリンを用いて546
nmで行なった。
2)酵素の精製
前記のようにして得られた乾燥塊100gを0.02モ
ル准酸塩緩衝剤、PH6,5を中に懸濁させ高圧分散に
より砕解する。引き紗き、遠心分離を行ない、沈殿をす
てる。
ル准酸塩緩衝剤、PH6,5を中に懸濁させ高圧分散に
より砕解する。引き紗き、遠心分離を行ない、沈殿をす
てる。
上澄に0.1モルトリクロル酢酸溶液を加え、pH値を
4.8とする。この沈殿を遠心分離する。
4.8とする。この沈殿を遠心分離する。
これは比活性300U/rngを示す。
3)精密な精製
トリクロル酢酸沈殿による沈殿を0.1モル酢酸塩緩衝
剤、pH6,500疏lに溶かし、o ’cでアセトン
0.3容量を加える。生じた沈殿を遠心分離し、新たに
[1,1モル酢酸塩緩衝剤、PH6,0に溶かす。この
ようにして得られた酵素溶液に硫酸アンモニウムをモル
濃度1.0士で添加する。
剤、pH6,500疏lに溶かし、o ’cでアセトン
0.3容量を加える。生じた沈殿を遠心分離し、新たに
[1,1モル酢酸塩緩衝剤、PH6,0に溶かす。この
ようにして得られた酵素溶液に硫酸アンモニウムをモル
濃度1.0士で添加する。
この沈殿を遠心分離する。その比活性は約800U /
myである〇 この沈殿を新たに硫酸アンモニウム分割におけると同じ
緩衝剤中に溶がし、同じ緩衝剤に対し透析し、次いでD
KAE−セファデックス(5ephadeX %同じ緩
衝剤に対し平衡にする)と混合し、1時間攪拌する。次
いで、交換樹脂を同じ緩衝剤で洗浄し、0.2モル酢酸
塩緩衝剤、pH6,0で分別溶離する。活性のフラクシ
ョンを合併する。このようにして得られた生成物の比活
性は個々のフラクションにおいて2500〜8000U
/Iu9の間である。
myである〇 この沈殿を新たに硫酸アンモニウム分割におけると同じ
緩衝剤中に溶がし、同じ緩衝剤に対し透析し、次いでD
KAE−セファデックス(5ephadeX %同じ緩
衝剤に対し平衡にする)と混合し、1時間攪拌する。次
いで、交換樹脂を同じ緩衝剤で洗浄し、0.2モル酢酸
塩緩衝剤、pH6,0で分別溶離する。活性のフラクシ
ョンを合併する。このようにして得られた生成物の比活
性は個々のフラクションにおいて2500〜8000U
/Iu9の間である。
例 2(参考例)
H2O2−形成を介してのグリセリンの測定;2種類の
試薬を製造する。
試薬を製造する。
試薬1ニ
ド リ エ タ ノ −ルア ミ ン/ pH8,o
O,1モ”/1sHCI−緩衝剤 p−クロルフエ/−ル 10ミリ千欲t。
O,1モ”/1sHCI−緩衝剤 p−クロルフエ/−ル 10ミリ千欲t。
アミン置換 4−アミ/
アンチ−リン 0.5ミリ暉t1
ペルオキシ々゛−ゼ 10U/だE0
試薬2:
グリセリンオキシダーゼ 500 U /rrtl。
測定を実施するために試薬12rnl試薬20.2ml
mlラフベット測り入れる。吸光度E工、を測光器を用
いて546 nmで読み取る。引き続き、試料20μt
を添加し、反応を開始する。
mlラフベット測り入れる。吸光度E工、を測光器を用
いて546 nmで読み取る。引き続き、試料20μt
を添加し、反応を開始する。
遊離のグリセリンを測定するために、試料としてすべて
の種類の水性媒体、例えば食品抽出物、体液及び特に血
清を使用することができ、トリグリセリドの測定のため
には鹸化の後、使用することができる。
の種類の水性媒体、例えば食品抽出物、体液及び特に血
清を使用することができ、トリグリセリドの測定のため
には鹸化の後、使用することができる。
20分間の反応時間後、吸光度E2 ’l読みとる。恒
温保持温度は25°Cである。
温保持温度は25°Cである。
評価は、グリセリン標準溶液の測定吸光度差△E二E2
−E]をグリ七リン濃度もしくはトリグリ七リド濃度に
関連させた検量線により行なう(第2図参照)。
−E]をグリ七リン濃度もしくはトリグリ七リド濃度に
関連させた検量線により行なう(第2図参照)。
試験配合物中の濃度は次のようであるニトリエタノール
アミン/ HCl−緩衝剤、pH800,09モノL//l。
アミン/ HCl−緩衝剤、pH800,09モノL//l。
イソトリデシルエーテル 1 、F39/lc 3.2
ミリ七ηl)、コール酸ナトリウム 4.6ミリモ”A
%p−クロルフェノール アミノ置換4−アミノ 9ミ゛ノゞ″′・ア ンチピ
リ ン 0.45ミリモノVL%ペルオキシダーゼ 9
U/?πe− グリセリンオキシダーゼ 45 U /m/!。
ミリ七ηl)、コール酸ナトリウム 4.6ミリモ”A
%p−クロルフェノール アミノ置換4−アミノ 9ミ゛ノゞ″′・ア ンチピ
リ ン 0.45ミリモノVL%ペルオキシダーゼ 9
U/?πe− グリセリンオキシダーゼ 45 U /m/!。
例 ろ(参考例)
酸素消費量を用いてのグリセリンの測定第1図に示し、
た装置を使用する。この装置は内径143mm及び内高
220順な有する透明なプラスチック製の円筒状の室の
かたちの反応容器1からなる。この室は0.2モルカリ
ウム燐酸緩衝剤、PH6,8中の沃化カリウム18ミリ
モル、七モリゾヂン酸アンモニウム7.5ミリモル、塩
化ナトリウム800ミリモル及びグリセリンオキシダー
ゼ50Uの溶液1.8罰を含有する。反応容器中には、
酸素感受性電極から成るディテクタ3(WTW:0XI
−ElektrodeE016)が突出している。この
ディテクタは分析器4と結合している(WTW・挿入物
0XI610Dを有するディジタルメーターDIGI
610 )。
た装置を使用する。この装置は内径143mm及び内高
220順な有する透明なプラスチック製の円筒状の室の
かたちの反応容器1からなる。この室は0.2モルカリ
ウム燐酸緩衝剤、PH6,8中の沃化カリウム18ミリ
モル、七モリゾヂン酸アンモニウム7.5ミリモル、塩
化ナトリウム800ミリモル及びグリセリンオキシダー
ゼ50Uの溶液1.8罰を含有する。反応容器中には、
酸素感受性電極から成るディテクタ3(WTW:0XI
−ElektrodeE016)が突出している。この
ディテクタは分析器4と結合している(WTW・挿入物
0XI610Dを有するディジタルメーターDIGI
610 )。
反応容器1の底には磁気攪拌″45を有する。
充填口6を介してグリセリン含有水溶液20μtを試料
として加える。磁気攪拌器で弾力な攪拌下に溶液の酸素
濃度の減少を測定する。観測された酸素消費量をグリセ
リン濃度に対して記載する。
として加える。磁気攪拌器で弾力な攪拌下に溶液の酸素
濃度の減少を測定する。観測された酸素消費量をグリセ
リン濃度に対して記載する。
例 4(参考例)
動力学的測定
試料;
水性標準液(グリセリン含有量10〜100m9/d1
.) 試薬。
.) 試薬。
P 1 p e S−緩衝剤0.1 モ/L/ / t
、 H3BO31,7モtv/ l % PHニア、0 イソトリデシルエーテル 5.0g/l。
、 H3BO31,7モtv/ l % PHニア、0 イソトリデシルエーテル 5.0g/l。
コール酸ナトリウム 5.0g/l。
アミノ置換4−アミノ
アンチピ リ ン 0.5ミリモノVt、〜p−クロル
フェノール 1B・0ミリモIVL〜ペルオキシダーゼ
10.0 K U/1%グリセリンオキシダーゼ 1
21.0Ktr/lOゲムゼクーフアストーアナリユー
ず− (Gerrbsaec−Fast−Analyzer
)自動分析器で実施。
フェノール 1B・0ミリモIVL〜ペルオキシダーゼ
10.0 K U/1%グリセリンオキシダーゼ 1
21.0Ktr/lOゲムゼクーフアストーアナリユー
ず− (Gerrbsaec−Fast−Analyzer
)自動分析器で実施。
温度 ° 25°C
測定波長 ’ 546 nm
試料容量 10μを
希釈剤(水): 50μを
試薬容量 : 500μを
測定時間
1回目の測定:開始後65秒
2回目の測定:開始後615秒。
次の結果が得られた:
試料:水性標準液
グリセリン(UV−試験) 再び検出された%ゼ)
11 105
21 101
32 1 00
43 1 口 1
54 1[]0
65 99
76 99
87 99
96 102
動力学的測定において試薬中の次の量比で作業するのが
有利である: Pipes−緩衝剤0.05〜0.5 モル/ t %
H3BO30,5〜2.0モル/ t % PH6,
8〜8.0イソトリデシルエーテル 1〜5 g/1%
コール酸ナトリウム 1〜5 g/1%アミノ置換4−
アミノ アンチピリン 0.2〜5ミリモル/11p=Jロルフ
ェノール 5〜50ミリモル/l。
有利である: Pipes−緩衝剤0.05〜0.5 モル/ t %
H3BO30,5〜2.0モル/ t % PH6,
8〜8.0イソトリデシルエーテル 1〜5 g/1%
コール酸ナトリウム 1〜5 g/1%アミノ置換4−
アミノ アンチピリン 0.2〜5ミリモル/11p=Jロルフ
ェノール 5〜50ミリモル/l。
ペルオキシダーゼ 5〜5QKU/l。
グリセリンオキシダーゼ 100〜250KU/10こ
の例は、本発明を臨床化学的慣用診断実験室中にある重
要な自動分析器で実施することができることを示す。
の例は、本発明を臨床化学的慣用診断実験室中にある重
要な自動分析器で実施することができることを示す。
第1図は酸素消費量によりグリセリンを測定する装置を
示す略図である。 1・・・反応容器、3・・・ディテクタ、4・・分析器
、5・・・磁気攪拌器 第2図はH2O2−形成によりグリセリンを測定する際
の、グリセリン標準液の測定吸光度差△E二E2−E1
をグリセリンもしくはトリグリセリド濃度に関連させた
検量線を示す。 第1頁の続き @発明者 ハンス・ザイデル ド ユ @発明者 グンター・ラング ド 0発 明 者 アルベルト・レーダー ドラ ■発明者 ヨアヒム・ツイーゲン ド ホルン ヴ イッ連邦共和国トウツィング・ヴアクセンシュタインシ
トラーセ 6 イツ連邦共和国トウツイング・ラング・シュトラーセイ
ツ連邦共和国ゼースハウプト・バーンホーフ シュトー
セ 41 イツ連邦共和国シュタルンベルクのイーナーザイデル−
L−り 1
示す略図である。 1・・・反応容器、3・・・ディテクタ、4・・分析器
、5・・・磁気攪拌器 第2図はH2O2−形成によりグリセリンを測定する際
の、グリセリン標準液の測定吸光度差△E二E2−E1
をグリセリンもしくはトリグリセリド濃度に関連させた
検量線を示す。 第1頁の続き @発明者 ハンス・ザイデル ド ユ @発明者 グンター・ラング ド 0発 明 者 アルベルト・レーダー ドラ ■発明者 ヨアヒム・ツイーゲン ド ホルン ヴ イッ連邦共和国トウツィング・ヴアクセンシュタインシ
トラーセ 6 イツ連邦共和国トウツイング・ラング・シュトラーセイ
ツ連邦共和国ゼースハウプト・バーンホーフ シュトー
セ 41 イツ連邦共和国シュタルンベルクのイーナーザイデル−
L−り 1
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、 アスペルギルス5pec、 (Aspergil
lus 5pec、 )BMTU1997−1(DSM
l、729)(微工研菌寄第5860号)からグリセリ
ンオキシダーゼを取得するために、アスペルギルス5p
ec、 BMTU 1997−1 (DSM 1729
)(微工研菌寄第5860号)を好適な培地で培養し
、グリセリンオキシダーゼを細胞群又は培地から取得し
、場合により精製することを特徴とするグリセリンオキ
シダーゼの取得法。 2 グリセリン20〜20[39/1%麦芽エキス5〜
10[]、9/ls酵母エキス0.5〜5g/1%燐酸
−水素カリウム0.2〜s g/ t %硝酸カリウム
0.2〜5 !j/is炭酸カルシウム0.1〜s y
/ t %塩化ナトリウム0.1〜1g/l、、硫酸
第1鉄0.001〜CJ、1g/l(7水和物とし、て
測定)、硫酸マグネシウム0.1〜5 g/l (7水
和物として測定)を含有する培地を使用する特許請求の
範囲第1項記載の方法。 5 細胞群を砕解し、不溶性のものから分離し、グリセ
リンオキシダーゼをトリクロル酢酸を用いて上澄から沈
殿させる特許請求の範囲第1項又は第2項記載の方法。 4 沈殿をpH4,6〜5.4で実施する特許請求の範
囲第5項記載の方法。 5 引き続き、アセトン沈殿、硫酸アンモニウム分割及
び弱い塩基性イオン交換樹脂への吸着を実施する特許請
求の範囲第3項又は第7項記載の方法。 6、 アスペルギルス5pec、 BMTU 1997
−1(DSM 1729 ) (微工研菌寄第5860
号)からのグリセリンオキシダーゼが分子量約9000
0、比活性2000〜81][][]U/ηを有し、か
つSH−試薬により抑制され、硫酸銅及び酢酸鉛により
抑制されない特許拍求の範囲第1項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3004129 | 1980-02-05 | ||
DE3004129.3 | 1980-02-05 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60259185A true JPS60259185A (ja) | 1985-12-21 |
JPH0134034B2 JPH0134034B2 (ja) | 1989-07-17 |
Family
ID=6093779
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56014455A Expired JPS6036754B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | グリセリンの測定法 |
JP56014456A Expired JPS6036756B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | 酸素反応におけるh↓2o↓2−形成の測定法 |
JP60074564A Granted JPS60259185A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンオキシダ−ゼの取得法 |
JP60074563A Granted JPS60259199A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンの測定試薬 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56014455A Expired JPS6036754B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | グリセリンの測定法 |
JP56014456A Expired JPS6036756B2 (ja) | 1980-02-05 | 1981-02-04 | 酸素反応におけるh↓2o↓2−形成の測定法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60074563A Granted JPS60259199A (ja) | 1980-02-05 | 1985-04-10 | グリセリンの測定試薬 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4399218A (ja) |
EP (1) | EP0033540B1 (ja) |
JP (4) | JPS6036754B2 (ja) |
AR (1) | AR224669A1 (ja) |
AT (1) | ATE10013T1 (ja) |
AU (1) | AU522705B2 (ja) |
CA (1) | CA1149712A (ja) |
DD (2) | DD201692A5 (ja) |
DE (1) | DE3166756D1 (ja) |
ES (1) | ES499103A0 (ja) |
SU (1) | SU1554765A3 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62262992A (ja) * | 1986-05-02 | 1987-11-16 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 安定化されたnad(p)h−依存性で可溶性の同化型硝酸還元酵素、その製法及びこれを含有する硝酸塩測定試薬 |
JP2013138617A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-18 | Kirin Holdings Co Ltd | 微生物醗酵による14−デヒドロエルゴステロールの生産法 |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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