JPS60114193A - 新規なマルトースデヒドロゲナーゼおよびその製法それを用いる分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は口「規なマルト−ステヒトロケナーゼおよびそ
の特許、そ八を用いる分析法ならＯ・に分析用，ｒ１１
成物（・こ関する。更に詳しくｒｈ％単Ｑｌｊ　ｉたは
オリゴ、ｉｊ７ｊの還元末ｙ：Ｉ）’＋に作用し，、Ｎ
ＡＤ　にコチン・アテニン・ジヌクレオチド）またはＮ
ＡＤＰにコチン・アデニン−ジヌクレオチド−ホスフェ
−明細書のａＪ書（内容に変更なし） ト）を補酵素として利用することーなく次の反応を触媒
する新規な酵素、 （式中Ｒば０！．鎖残基または水素原子、ＡはＮＡＤま
たはＮＡＤＰを１除く水素受答体、ＡＨｔたはＡＩ−１
ｎは還元型受容体、ＴＬは１または２の整数金示す）お
よびスタフィロコッカス属に属する該酵素生産菌を培地
に培姦し、その培養吻より該酵素を採取することを特徴
とするＬ１×素の４Ａ造法、さらには糖ノ貞、または糖
類を遊８１ｔする酵素の目チ索活性、測だにおいて水素
受４体の存在下、上記酵素を作用させ検出可能な変化を
測定すること全特徴とする測定法、ならびに該測だ法の
ための分析用組成物番ζ関する。

従来から、単糖またはオリゴル・吉の還元末ｊ１幕ｔｉ
ｃｐＨ用し、水素受容体の存在下脱水素反応を触媒する
酵素はグルコースデヒドロゲナーゼ（：　ｈｃ　、　ｌ
　、　ｌ　、　１　。

４７グルコースデヒドロゲナーゼ（酵素／・ンドフ゛ツ
ク、１９８２年１２月発行第１９頁）、ＥＣ。

１．１．１．１１８グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡ
Ｄ＋）（酵素・・ンドブソク第４２頁）、ＪεＣ，１，
ｌ。

１．１１９グルコ−ステヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ’つ
（酵素・・ンドブソク第１１３貞）〕や、〕マルト−ス
テヒドロゲナーゼ英国公開特許２０８８０５２号明細書
）など種々のデヒドロゲナーゼが却ら７′シている。し
かしいずれもこれら酵素はＮＡＤまたシまＮＡＤＰを水
素受容体とする酵素であった。寸だ、これらＮＡＤやＮ
ＡＩ）Ｐを水素受容体とせす、フェナジンメトサルフェ
ート　（ＰＭＳ）を徂」用し、グルコースを酸化（脱水
素）する酵素としてはンユードモナス−ｚス−ビー（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＳＰ、）ｔたはゲルコクバクタ
ー・サブオキシダノス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　
５ｕｂｃｘｙｄａｎｓ　）から１４ｉられる酵素が知ら
れていた。〔松下ら、Ａｇｒ、ｌ３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、
　、４４　。

１５０５−１５１２　（１９８０）、松下ら、Ａｇｒ　
。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、４５　、８５１−８６１　（１
９８１）］。

しかし、これら公知の酵素はグルコースに対する作用を
示すものの、マルト−ス以上のオリゴ糖に対する活性は
グルコースのそれに比べて非常に低いものであった。

不発明者らは、山口県岩国市太字守内のじゃがいも畑で
採取した土１が試料から分離したスタフィロコッカス属
に属する菌株ＳＯ，８，０８７５株が、前記ＮＡＤおよ
びＮ　Ａ　Ｄ　Ｐを補酵素とせず、Ｐ↓νＩｓ、１−メ
トキ／−７エナジンメトサルフエー）（ＭＰ１〜４Ｓ）
またはメルト−ラブル−（９−ジメチルアミノベンゾ−
α−フエナゾキノニウム・クロライド）を水素受容体と
し、寸だ前記公知グルコ−ステヒドロゲナーゼと異なり
、Ｄ−グルコースに対する作用てよりマルトースに対す
る活性の方が高く、丑だマルトリオース、マルトテｌ−
、＞　＊　ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
スにも基質特異性をゼする新規な、単糖、またはオリゴ
糖の還元末端に作用し次の反応を触媒する新規な酵素〔
（以下、マ／ｌ／　ｉ　−ステヒドロゲナーゼｃａｃｃ
ｅｐｔｏｒ）という〕 （式中Ｒは糖鎖残基または水素原子、ＡばＮ　Ａ　Ｉ）
またけＮ　Ａ　Ｄ　Ｐを除く水素受容体、Ａｆ（または
ＡＨｎは還元型受答体、ｎ１ｄｌまたは２の整数を示す
）を生産することを知った。

史に、本発明者らは、このマルトースデヒドロゲナーゼ
（ａｃｃｅｐｔｏｒ）を用いることにより、１．１０ａ
４の測定、または糖類を遊１４ｆする酵素の酵素活性の
測定を水素受容体の存在下に行うことができることを知
った。

本発明の新規なマルトースデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅ
ｐｔｏｒ）生産菌の分類学的性状は以下のり「りである
。

（１）　形態（普通寒天１に−Ｃ３０’Ｃ，１８時間培
養の結果） ＊ペプトンｌＯ＆、肉エキス５ｙＸ食塩３ｇ、蒸留水１
０００　ｒｎｌＸｐｆ（７、２■　）１１］胞の形、大
きさ、多角形の有無：主に二連、またけ単独、短連鎖で
塊状になる球菌で多形性はない。細胞の犬ささば０．６
〜０．８×帆６〜１．０μηｌである。

■　廷１！動性及び鞭毛：なし ■　芽胞（形、大きさ、Ｇ？σ、菌体のふくらみ）：な
し く４）　グラム巣色：１場性（心易に脱色きれる）■　
］フＹ１峻注染色：陰１生 （２）生γ７′試豐 ■　肉汁寒天平板培地（３０℃、１８時間）普通寒天培
地丘状、周囲は丸くなめらかな染落を形１戎する。クリ
ーム状白色または灰白色を呈し、可溶１生色素は産生じ
ない。

■　肉７′ｌ’　港大眉ｍｊ培地（３０℃、１８１（寺
−１）普通寒天培地 勝状に良好に生育する。巴は灰白色〜クリーム状白色で
可溶性色素は産生しな贋。

■　肉汁液体培地（３０℃、１８−４２時間）生前良好
で一様に混濁する。うすい菌 膜を形成する。

■　リドマスミルクまたはＢ　ＣＰミルク約２週間培養
で酸性凝固し、一部ペプ トン化する。

ｔ３）　？、ｌミ理的翻質 硝酸塩の還元　− 脱窒反応　− Ｍｌえテスト　− ｖＰテスト　一 硫化水素の産生　− デンプンの加水分ノ・捏十（ＳｉＳｊＬｎ）クエン酸塩
の利用（／モンズ培地）　十〃　（クリステンゼン培地
）　十 硝億塩の利用　〜 アンモニウム塩の利用　〜 色素の生成　− ウレアーゼ（ＳＳＲ）　− （クリステンゼン）　十 オキシダーゼ　− カタラーゼ　＋ 生育の範囲（ｐｉｌ）　〜 （楯、冒ν）　〜 酸素に対するでホ度　好気性 ＯＦテスト（ヒューレイフノン培地　）■（２〜３週間
培養で嫌気で 弱く咳を産生 ずることがあ る） 〃　（ベプトン不含培地′１“−１′）　○セラチンの
分解　− カセイ／の分ノ’ｒ’ｒ− エスクリンの分解　− アルギニンの分解　へ す／ンの脱炭酸反応　〜 ＮａＣｌ而ｊ准面　５％まで Ｆ　Ｔ　Ｏ培地での生育　− ＧＣ％ＣＴ　ｎｔ法）　３９％ ヒユーレイフンｙ　（１−Ｉｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ　
）培地ペプＨ−７２，０９、ＮａＣｌ３．ＯＥＩ　ＸＩ
（２ｆ（ＰＯ４０，３，９゜ブロムチモールブルー（Ｂ
　Ｔ　Ｂ　）　（０，２％）１０．０＃＋ＣＸ蒸’Ｍｌ
水１０００　ｍｅ、、寒天３．Ｇ９　。

ｐｉ−１７，２ ＊木　ペプトン不含培地 ＮＨ４１１２１）０４１．０９　、ｌ（ＣＩ　Ｏ，２，
／　”を埒ＳＯ４・７Ｈ２００，２Ｂ、イーストエキス
　ｉ、ｏ、ｙ。

寒天　３．０．９ＸＢＴＢ０．２％９１０．０　ｍｅ。

蒸溜水　１０００ｍｅＸｐ　１（７，２（４）　糖より
酸・ガスの派生（基礎培地：ヒューレイフンン培地、ペ
プトン不含培地）いず７′Ｌの２゜（礎培地を用すでも
結果は同じである。

第１表 明細店−＆ハ〕″１店（内容に変更なし）以上の第１表
の結果から、本菌株の主性状を述べると、通常二連で、
たまに単独、短連鎖または塊状になる球状のダラム陽性
（ただし、容易に脱色さ八る）の非運動１生の好気性細
囚で多形性はない。カタラーセＩｔ１ｇユ、オキソダー
ゼ陰性で糖全哉化的に分解し、産生ずる。培地組成（ペ
プトン不含培地からリン順アンモニウムを除いた培地）
（／（よりては３週間以上の培コ１ミで、０１セ”テス
ｊ・ｋＣ７あ・いてＦを示すことがあり、嫌気宋件で弱
く酸を産生ずる場合がある。核酸のクアニン、／トノノ
含ｊｌト（ＧＣ％）Ｉｉ３９％である。

本菌株の主な１隼状をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆｌ）ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ　８版（１９７１Ｉ）Ｑ参照すると、本菌株
Ｉｉｉν１Ｉｃｒｏｃｏｃｃｕｃｅａｅ　ＶＣ属する。

Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｃｅａｅにｌ’ｌ：　Ｍｉ　ｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ属、５ｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、
Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ属および５ｔｏｒｎａｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ　）Ｐｒ６の４属が報告さ瓦ている。本田株Ｂ
−０８７５株は形態的特徴（連動性）、生１ヒ学的特６
ｘ　（Ｏｌｉ’テスト）から’ｒｆ：、　ＩＶ１１ｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓＪｙ５に属するといえるが、ＧＣ％はＭ
ｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属のＧＣ％（６６〜７５係）と２
５係以上の相違がみられる。ＧＣ係の相違は主な遺伝的
多様性、系統発生的に大きな隔たりを示す証拠であると
考え、本［イー１株をＩＶＩｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属Ｖ
Ｃｉ、Ｕｉ−Ｑしめることはできな−と半ｌＪＦ！ｆｒ
した１、そこで、横１を重ねた不吉用り辿ｊ牛嫌気性菌
属の５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属（一般にＯＦテス
ト：　Ｆ　、　Ｇ　Ｃ％：３０−４０％）に酸化的に糖
を分ノ竹する変）１（株が報告さ八ている（　１　ｎ　
ｔ　、　Ｊ　。

５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、２６：２２−３７
．１９７６）ことから、本菌Ｂ−０８７５株のＧＣチが
３９％てりること、培地粗成によってばＯＩ＝”テスト
で３週１１４１以上の長期培養で嫌気的（醗酵的）に弱
く戒を産生ずることがあり（即ち、ＯＦテストにおいて
Ｆを７」マすと省えられる）、１だ本田法はＦ　’ｆ’
　Ｏ寒天培地で生育てきなり　（Ｔｈｅ　Ｐｒｏｋａｒ
ｙｏｔｅｓ、　ｍ　１１巻、１９８１、参照）、などの
結果を参酌して、本菌Ｂ−０８７５株ｆ：５ｔａｐｈｙ
ｌ　ｏｃｏｃｃｕｓ属に属するものと同定し、５ｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　３１）、Ｂ　−０８７５と命名
した。（本菌株は、ブタペスト条約に基つき、通商産業
省工業技術院微生′拗工業技術ω［沈析に（受託番号）
倣工研条寄第３８５号（Ｆ　Ｅ　Ｂへ４］３Ｐ−３８５
）　として寄託さノしている。

本発明のマルト−スデヒＦｏゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏ
ｒ　）を生産するＶＬＣ尚っては、このマルト−ステヒ
ドロゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）生産菌を、抗生物
質、醇素などと生産する通１；ハ′の方法でＬＨ’Ｓ養
−４−る。

培養の形態はｉｆｋ体培養ても固体培養でもよいか工業
的にはマルト−ステヒドロゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ
）生産菌の、賄１胞をその生産カッ培Ｊルに接植し、深
部通気撹拌培養を行なうのが有利である。」１３地の・
ボ養諒としては、微生物の培養に通゛１；；用いら１す
るものが広く防用される。窒素源としては利、１１１１
ＩＪ能な窒素化合物てあればよく、例えはコー／・スチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、大豆粉、１−１シ
１．ノエキス、神々の肉エキスｌどが１吏ｍさ九る。炭
素りＭとしてはへ１ヒｉＪ能な炭素化合物であＪ′Ｌは
よく、し１］えば糖蜜、グルコース、グリセリ／、／ニ
ークロース、テギストす／などがｊ吏月Ｊされる。その
１山、共広、塩化カリウム、硫酸マグ坏ンウム、第一リ
ン酸カリウム、第二リン敵カリウムなどの１重々の無機
塩が必要に応じて１吏用される。培養８１度は菌が発育
し、マルトース戸ヒトロゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　
）を生産する範囲内で適宜変更し得るが、好１しくけ２
５〜３０℃である。培づり峙−１は、朱￥ｌ−によって
多少異なるが、通常１５〜７２時向程１．１であって、
マルトーステヒトロゲナー七（ａ　ｃ　ｃ　Ｏ［）　ｔ
　ｏ　ｒ　）が最高力１曲シこｄするｌｌｋ’−＋　ｊ
υ１企み（はからって適当なＩＪ、ｌｉＩ！Ｉｊに培活
・を終了す、ｔｚばよ−。かくしてイ４Ｌ　ラｈ、　タ
マルトーステヒトロゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）生
ノ爪１′３″」の培養物中（ｔておいて、マルトーステ
ヒトロケナーセ（ａ　ｃ　ｃ　ｅ　ｐ　ｔ　ｏ　ｒ）は
その蘭］本内に含有、免績さ７ｔ″′Ｃいる。

このようにしてイ）Ｊら瓦ｆｃ　Ｊ’ｍ　′Ｊ’ａ　４
勿中よりマルト一ステヒトロケナーセ（ａｃｃｅｐｔｏ
ｒ　）　ｆｘ油抽出るため（ｌこ−ｆ／ｌｊ’＆単げ瓦
は、１ずす音売→勿を巨１（夜分、・ｒＬ　Ｌ、イ辞ら
八る湿１♀自本土、トリス−塩酸５暖辿Ｊ液などの溶液
音用−て、リゾチーム処理、超音波・水理、フレンチプ
レス処理などの独々の画才処理手段で〕薗宜ボ択組合せ
て、徂袈のマルト〜ステヒドロケナーゼ（ａｃｃｅｐｔ
ｏｒ　）含有液蛍イ４ノる。

次すでこの１１１製のマルト−スデヒドロゲナーゼ（ａ
ｃｃｅｐｔｏｒ　）含有液は、さらに公知の」ｆ白質、
酵素などの単ｕｉｌｌ　、Ｊ’ｌ’ｌ刈手段を用いて、
ｆ’＋’＋製さノ′したマルトースデヒドロゲナーゼ（
ａｃｃｅｐｔｏｒ　）をイ（Ｊる。伝えＩｄ　４１ｉ”
Ａ　Ｄマルト−ステヒトロゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ
　）含イ丁（戊に、アセトン、メタノール、エタノール
などの有機溶媒による分別性ｒＪ’ｒ、　：去、硫安、
食塩、硫酸アルミニウムなどによる塩析法なと全適用し
て溶液から酵素を沈澱せしめ、回収ずれ（げよ１７−１
゜　さらにこの沈澱４勿を、（・リスーエ恭、唆経１商
１′イダなどの溶媒に溶解せしめ、これをカルポギノメ
チルーセルロース、カルボキシメチル−テキストランゲ
ル、スルホプロピルーデキストラノゲルなどのイオン交
換樹脂やテキストランゲルやポリアクリルアマイドゲル
なとのケル３週削Ｖ（（、る吸７１′ｆｆクロマトグラ
フィーを行なって精製し、次いでこノｔを像結Ｊ〆Ｘ燥
してマルト−ステヒトロゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　
）の粉末を得る。

このようにして１４Ｊら八だマルト−ステヒドロゲナー
ゼ（ａｃｃｅｐｔ、ｏｒ　）の活性１ｌｌ１１定法、生
化学的’ａｆｆｌＪは、以下に述へる通りである。

（１）、舌注ｉ＋ｔｌｌ定法 ２０１月ν１　リン（ν組所ｊｌ夜（ｐＨ７、５）０．
１係　牛血清アルブミン ０．０２５％　ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）
０．２％トリトンＸ−１００ ０，００１％　フエナ／ンメトサルフエイト　（ＰＭＳ
）０．１Ｍ　マルト−ス 上記組成の反応式１．０＋、７Ｊを不調、横管にとシ、
３７℃に加（晶後、１０μｌのＧ￥素液を冷加して反応
を開始し、３７℃で１０分間インキュベートする。０．
１Ｎ　ＨＣ（！　２．０　ｍｌを加えテ反応”；ｃ　僅
止シ、５５０　ｔＬｍの吸光度を測定する（Ａｓ）。対
照（ブランク）として、；）ス素液の代りに蒸溜水１０
μｌを加え、同様に５５０？乙ｔルの１及光Ｉｆｆ：１
ｔｉｌｌ定しくＡｂ）、下記ｄ１遭一式より酵系活１・
′Ｌを聯二出する。酵素活沈１単ＩＭ（Ｕ）は上記乗件
において１分間に１μモルのマルトースを順化（脱水素
）するｊ」チ累重とする。

なを、測定法の原理は以下の：づ素反応に基つくと推定
さ瓦る。

明細書のンｊＩ書−（内容に変更なしり一＝ｒ　ルト−
ス＋２　Ｐ　Ｍ　Ｓ→フマルグルコノ−γ−シクトン十
２ＰＭＳＨ ２ＰＭＳＨ＋ＮＴＢ−＋２ＰＭＳ十ＮＴＢＩ（２（−Ｅ
−／−４たけジホルマザンＪ（支）力 （２）基質特異性 活性σｉｌｌ定法における反応液のマルトースの代りに
、第２表に記載の各基質０．Ｌｍｌを用いて、以下活性
測定法において、その５５０　ｎｔルにおける吸光度を
ｎ］１］定１−１その相対活性をめた。その結果、第２
表 ｒｊ＋τ２表に不す−Ｊｆ１つ、本酵素はマルトースに
作用し、その他にグルコースや、マルトトリオース、マ
ルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサ
オース、マルトヘプタオース、デキストリン告のオリゴ
糖にも作用１−る。

（３）水系受容体（Ａ） 明却晧のｊ７”ｎｊ（内存に変更なし）マルトースデヒ
ドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）のマルトース酸化
（脱水素）反応（ｔこおける水漏受容体（補酵素）につ
き検討した結果は第３表に示す通りである。第３表から
明らかなように、Ｎ　Ａ　ＤやＮＡＤＰの補酵素は必要
とせず、ｐｒＶＩｓｓ’−メチル−フェナジンメトサル
フェート（Ｍｌ）ＭＳ）ひよびメルト−ラブル−を水漏
受容体としたときに溶存酸素の瀾少が認められるが、こ
れは次の反応による消費であると推定される。

マルトース＋２ＰＭＳ→マルトグルコノラクトン＋２　
Ｐ　Ｍ　Ｓ　ＨｚｐＭｓＨ−＋−Ｌｏ□→２ＰＭＳ＋Ｈ
２０（？）またこのことより以下に示す反応が推定さ丸
る。

肩３３表 明細書の７了１占（内容に変更なし） ｊ４）　ｒ１２累作用 次の反応を触媒する。

（式中Ｒはイ９１１残基−まン辷は水素原子を示１−）
反応に示すようにＰ　Ｍ　Ｓのような水禦受答体の存在
下グルコースまたはオリコ゛砧などの基質の還元禾瑞に
作用り、　ノｊ；ｘ水某反応を触媒し酸化ｉ勿を生成す
る。

（５）至適ｐｉ（ 前記活性測定法における反応液組成中、２０ｍ１辺リン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）の代りに谷独、谷ｐＨの緩衝液
を加え、木酢ふの活性に及ぼすｐＨの影響を調べた。

結果は、Ｉ！１図に示す通りであり〔図中、◎−（ｑ：
０．２Ｍリン酸緩山液（＋）Ｈ６，４−８，ｌＩ　）、
′ω−０：　０．２　Ｉｖｌ　ト　リ　ス”　ｉｎ　ｉ
：ｔ１２　ｐ　’ｆｌｌｌＪ　液　（１）ｌ−１６，８
−８，７）、Δ−△ニゲリフ７−　Ｎａ０１１緩イ！ｌ
ｉｊ液（ｐＨ８，０−９，・υヲ示ス〕、本発明のマル
ト−スデヒドロケナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）の至適
ｐＨｋｌ、、ｐｌ−１７，０−８，５４・］近と認めら
れる。

（６）至適温度 活性測定法Ｃ′こおける反応液り、Ｑｍｌを、２５〜５
０℃の各温度にて１３分間加温し／こ後、こｉ’Ｌ　＆
Ｃ酵素液（０，２−６）　０．ｏ２　ｚ、ｒｌを加え、
各温１１ζて１０分間反応せしめ／こＬ、０−１１’Ｊ
塩酸２．Ｑｍｌを別えて反応定停止せしめ、次いで反ｊ
、５　ｖこよって生成したＰ　ｉｎ　Ｓ　Ｈ２蛍を波長
５５０　ｎｙｒｔにて測定した。その結果、第２図にｚ
Ｊｅす、由りで、本発明のマルト−スデヒドロゲナーゼ
（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）の至適温度は約３５℃付近と認
められる。

（７）　ｐｌ（安矩性 酵素液（１０Ｕ　／ｍｅ）　Ｏ、１ｍｌ　Ｘ谷（ｊｊ、
　ｐ　偵１液０４ｖｔｌおよび蒸留水（１，８ｍｅより
なる溶７＋’ｉ、を、３７’Ｃ，６０分間処理しり必氷
水中にて冷却し、次いでこｈｆｒｌｌそ素話１〈ｔ：測
定、去ンこ基いてその活性をｄｉｌｌ定した。その結果
、第３図ｔ（示す辿りで、〔図中、○−○：１・　リ　
ス　・　玲冒俊７：妥イ！ＩＩＪ　’を夜　（ｐｉ（６
，６−８，３）、　））−・、）：タリンｙ　−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐｉ−１８，１−９，２）、△：ＴＥＳ　緩
イｍｊ　ｔ’ｓε　（ｐｌ−３７，０）　、＾　：　Ｂ
ＥＳ　俵衝ｔｉｆ、（ｐｌ、−１７，０）　、本発明の
マルト−ステヒドロケナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）は
、ｐＨ７，５−８，５付近にｐｉ（安定１生合有する。

また、ＩＡ甲の△、＾から判るようにグツトの緩衝液で
安定化される。

（８）・ド；塾安走訃 酵ｇ　ｐＪ　（ＩＱ　［Ｊ　／ｍｅ）　０．１　ｍｉ、
０．２　ＭＩ３ＥＳ緩衝液（１）Ｈ７，０）　０．１　
ｍ？卦よひ蒸頗水０．Ｂｍ（よりなる溶イシを、３０〜
６０℃の各温度にて、１０分間処理した後、氷水中にて
冷却し、次いでこれを酵素の活百曹ＩＪ１］定法に基い
てその活性全１１１１１定した。その結果、’Ｊ　”ｒ
図に示す通りで、本発明のマルトースデヒドロゲナーゼ
（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）の熱安定ｉ生Ｖ′ｉ４０℃イτ
］υ１以下であると認められる。

（９）分子縫 ８０　、０　（１０±１０，０００　（セファクリルＳ
−２００によるゲルろ過性Ｖこで） ００１　等重点 １）１（９，５付近　（キャリアーアンホライトを用い
る′電気泳動法にて） ｆｌ　ｌｌ　Ｋ　ｍ値 基質濃度と反応速度との関係を第５図に示した。

が、実験全行った範囲ではＶｍａｘは佃゛定できず、ま
たこのときの１′直をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ　−Ｂｕｒ
ｋの式にあて、まめて図に描いたが厳密な直線ｉ’ｌ−
Ｊ係（は１舒しれなかった。従って、正確なＫｍ値をめ
ることができないが、第５図に従って近似性を孟１−出
し／Ｃところ約３．８フルＭであった。

（１２）金に％　イオン、ＥＤＴＡＸＫＣＮの影響？重
性１１ｉ１１定法の項に７１＜　Ｌ、た反＋、ｓ液に第
・１表に７バした’ｄｉ’−１ａ　ノ’４金属塩、Ｅ　
ｌ）　’ｆ’　Ａ　ｔたばＫ　Ｃ１４’Ｃｒｒｔ＞　）
ＩＩＩした反応液を用い、そ瓦ぞ瓦の金属１４．ｆ、Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａまたはｌ（ＣＮの弓イ系？占１生に対する
影掘″をイ占１生ｄ川定明細書の浄占（内容に変更なし
） 法に準じてめた。その結果、第４表に示すノＩｎりであ
った。

第４表 （１３１界面活性剤のＦＩ：、響 酵素話性測定法における反応血中０．２％トリトンｘ−
ｉｏｏＯ代りに８ｉ５表に示す界面活性剤を添加し、市
；素話性を６１１１定した結果全力５表に示す。

第５表 本発明の新規なマルト−スデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅ
ｐｔｏｒ　）は、その基質特異性および醇素作用にノ１
（つめて種々の用途に応用］される。例えば、テンプン
を基質としてアミラーゼを作用せしめ、反応によって生
成するオリゴ糖に、本発明のマルトースデヒドロゲナー
ゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）およびＰ　ｒＶｉ　Ｓなどの
水素受容体を作用ざぜることによる反応で生成する還元
型Ｐ　Ｍ　Ｓを、直接で１ｉｌｌ定するか、址たはテト
ラゾリウム塩と反応させてホルマザン色累を比色７：Ｅ
８ｆｆｉ’３するか、あるいは酸素の減少量を酸素電画
で定量するなどして、アミラーゼ活性の定量側’ｒ４：
　＆こ１１口用することができる。このようンこ、本発
明のｊｉノ「規マルトースデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅ
ｐｔｏｒ　）は、臨床診〜ｒ　Ｊ４Ｊ酵素として有用で
ある。

史に、本発明は、このマルト−ステヒドロゲナーゼ（ａ
ｃｃｅｐｔｏｒ　）を用いた、血清、唾液、尿などの機
構液中のグルコースやマルトース等の糖〃４の定量測定
法およびα−アミラーゼ、β−アミラーゼあるいけグル
コアミラーセ等の酵素活性の測定において、その基質と
して変性俤°元性木端グルコ−ス残−リ（を有するダル
コース重合レドまたは遠吠グルコース重合体を用い、反
応によって生成する基ψＪ分角了ｑ勿ンＣ１本発明の新
規マルト−ステヒドロゲナーゼ 素の活性測定法を包含する。

一般にアミラーセ活］生」り定法としては、基質として
澱粉などのグルコース重合体を用い、アミラーゼの加水
分子Ｑ４作用により、グルコース、マルトースや（’！
１！々のオリゴイノ、むを生・Ｊｙ．ｌｉ−　Ｌめる方
法Ｋ　、（（ものである。し１」えば、アミラーゼによ
るｉｉｆｆＮ分の力ＩＪ水分庁ｒによる粘度の低下を（
１１］定−４−る測定法、ヨウ素を用ハろヨウ素滴定法
、澱粉などにアミラーゼを作用せしめて生成するマルト
ースを、αーグルコンダ〜ゼにてグルコース１で分ノ野
せしめ、このグルコースをグルコースオキ／ターゼヤタ
ルコーステヒトロゲナーセ、ＮＡＤ　（Ｐ）ｈどともＶ
Ｃ反応せしめて測定する測定法、不溶１生色素結合，・
・長田にーアミラーゼを作用ぜしめて生成さＩしる畦７
合化式ｆｐだ色素結合成分（ｉｌ−測定−４−るブルー
スターチ法へ〇マルトースホスホリラーゼ法（　Ｍ”Ｆ
　公開５　ｂ〜ｚＺｓｏｏ刊方法）か報告されてｂる。

その他、Ｐ−二トロフェニルマルトペンタオサイト、Ｐ
−ニトロフェニルマルトヘキサオ＠）−’ｆ　ｒ−、ｌ
）−＝　ｌ・ロフェニルマルトヘプタオザイド崎を基′
Ｊ■とし、アミラーゼを作用せしめてＬＬ成するＰ−二
トロフェニルマル）　ｌ−　１）オース丑／ζばＰ−ニ
トロフェニルマルトノドをαータルコ／ダーセまたばβ
ークルコンダーセを作用烙ぜて遊離してくる■）−ニト
ロフェニルを分光学的・７Ｃ訓５ｊｌする方法が知られ
ている。

しかしながら、これらの方．去准、用いる試要や反１，
己系でのクルコー　ス重合体の加水分角イ状態の多Ｂ１
４性や、共存するクルコースやマルトースにより正確な
ｉｌ！！Ｉ定シま困難であった。特にブルースターチ法
ＶＣお１ハては、可溶性色集成分を遠心分甜手段で分ｐ
ｊｔｌ−する必交件があり、苫らにマルトースホスホリ
ラーゼ法てばｌ１１止頷もの吋紫を必贅とするコスト高
で、かつ工程数の多一方法であるという仄点かあった。

更にまた、と八らの方法は、アミラーセ丑たはグルコシ
ダーゼの作用により加水分解されたけが正（１ｍには測
定されておらず比ρり関係にあるのみて、他に適確な方
法がないので１νΔ宜」二防用されていたにすぎなかっ
た。

本究明者らば、糖シアを遊−憤りする酵素の油性ｌｌｌ
１１足においてｊ１１′ｊ便でかつ自動化川面な正確な
測定法につき（−ＩＥ々仙究１，た結果、グルコース重
合体、好１しくけ］擢元ｊ生末１１１“ｈｌり′ルコー
ス残基−全イ」するグルコース重合体の還元性末ＩＱ基
を、ニスデル化、エーテル化丑たけ酸化もしくは還元開
環してマルト−ステヒドロゲナーゼ（　ａｃｃｅｐｔｏ
ｒ　）のＷ　：（！↓とならない変性還元性末端基とな
し、この変訃還元１／ｌ゛末ｙ．゛１．１グルコース残
基金１１するグルコースｉｌ；，Ｈ合体を裾知をＪｋ　
ｉ９１ｃする酵，−！−≦のイ古［生１則定用の晧′４
，＋＋とすることにより、該所、水活性を面萌〃・つ正
イｒ（＋に測定し１４ｆることを見い出した。寸たこの
変１生還元１１ー末瑞グルコース残〕ｉＱを有するグル
コース重合体の代りＶＣ、環状グルコースーＩｌｊ合体
を用いることもできること金見出した。さらに反応によ
って生成する２・吉貝分ＰＩイ物に、水素受答体の存在
下、マルト−ステヒドロゲナーゼ（　ａｃｃｅｐｔｏｒ
　）を作用せしめ、次いで反応により生成する還元型水
素受容体を直接測定するか、あるｌＡは還元型水素云達
系呈色反応試４を用いたり、減少する酸素を測定するこ
とにまり間ｊ妥的Ｖζ測定して、より良好に糖類を遊離
する酵素のｌ古川．をｉｌｌｊ定し・ｒ４ること？′Ｉ
−兄出し、さら（ｃ本発明では糖重合．度の低い基・Ｈ
ＶＸ　し１ｊえば）］う、合変度１〜８のシ１９１：′
７企用いた場合１作用１信号として市確に（ｉｌＩ］定
し得るものである。更に、このような３ｊｌｌ定法によ
って、［ｎ［清、唾液あるい・は尿なとのアミラーゼ、
グルコシダーゼ、クルコアミラーゼなどのグルコシダー
ゼ、ホスファターゼやエステシーセ含に５　ｄｌ　４Ｍ
２１１中の脅素話（生ヲ、ヘキノースオキシダーセ、好
まシクハグルコースオキシダーセおよびカタラーセで「
」１」処理するかまたは同時て作用させるか、１曹１＼
ＡＴＰの存在下、ヘキノキナーゼ、好１しくけヘキソキ
ナーゼなどのキナーゼで前処理するかまたは同時（て作
用さ萌るかまたはＩ戎′＄寂よび水素受答体の存在下で
マルトーステヒトロゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）の
作用で前・６理することにより、被検液中Ｏであらかじ
め共存（温存）するグルコースなどの糖類による悪影響
をうけるととんく、良好に測定しイＩＩること金知り、
本発明を完成した。

本発明は上記の知見に基因で完成きれたもので、ｇｇ、
ｑ　、ｉ（ｊまたは糖−１１４を遊離する酵素の酵素ｌ
占性測定において、水素党谷体の存在下マルト−ステヒ
ドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）を作用さぜ検出用
能な変化の；ノ；をＪｌυ定ずにとをｑ！ｉ酵とするｄ
１］」定法−Ｃあり、その目的は、ｒｊｉ１便正確で自
動化可能な糖７拍の定量ｉ１！！Ｉ定法、またけ７１ス
ＬノＪｌを遊ｐｉｔＬｔ−る酵詔、１り１ｊえばアミラ
ーセやグルコンダーゼなどの神々の１・１１譜の活性測
定法ｆ：提供するものである。

本発明に使用きれる−）１号質としては、変性−ノし１
隼末端グルコース残基金有するグルコース重合体、また
はマルト−ステヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）
が作用しない糖鎖をノ■元末１′１１ｈ；（ｔｒｃ勺す
るオリゴ糖、寸たば」ｊ５伏グルコース重合体てりり、
一般ｖにＪｚらグルコース重合体としてｆｄダルコース
重合）及１以上のものが好ましく、より好ましくはグル
コース重合度４以上のものである。捷た笈惟還元［生来
☆；１１１グルコース残基を有するグルコース重合体と
しては、好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタ
オース、マルトヘキサオース、マルトヘプタ−オースや
アミロース、アミロペクチン、澱粉、用溶注澱粉などの
澱扮加水分屑吻でテキストリンと呼称さ瓦るグルコース
重合体の還元仕末端グルコース残基を変性正）ｃ１生末
、１ｌＡｉグルコース残基となし／こものが用いられる
。不発１す］シこおいて液性還元ｉ生末端グルコ〜ス残
基とし７てば、その還元化能勿失わせたもの、あるいは
マルトーステヒトロケナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）の
基質にならないものであれはよい。例えは、ノλ元計末
Δｈ；を１・方法によりエーテル化するか、エステル化
するか、または還元性末端側にフラクト〜ス、イノント
−ルやノルビトールを結合したもの、あるーは、グルコ
ース残基を巌化してグルコノ；竣残基またはそのエステ
ル体などの誘導体としたもの力・挙られる。エーテル化
の列をあけると、多ａ占須、例えば口丁溶（生ｉｆｊ、
紛寸たはテキストリンの！容液を、４ｔＩ）メタノール
１生ふ盃ばにカロえて７０℃、４時間反応させ、５」邪
陵、ゲルろ通則充」喧カラム蛍始して種々の重合ザの両
分を果めて、メチル化さノ１だオυゴイｄを得ることが
できる。あるいけ、；（ｌｔＩ：氷酢酸３．５ｍｌ含有
乾燥ピリジン中１Ｃ町溶性澱扮又吋デキストリンを加え
て０℃、−夜反Ｌ６後、アセトンを加えて沈澱させ、さ
らにゲルろ通則充填カラムを通して）ｌＥ１４々の重合
度の両分を集めて、アセチル化さ几たオリゴ糖を得るこ
ともでさる。さらＶ（は、デキストリン溶液にフェーリ
ング試薬を加えて、５分〜２０時間煮沸反応後６裂將」
、メタノールを添加して不溶物を除去し、さらにゲルろ
通則充填カラムを通して種々の重合度の両分を集めて、
オリゴイ唐のユ韮−）七゛１生末Ｖｉｉｊグルコース残
ノ（（をグルコン岐残基（ｌζβ化し／こものを得るこ
と力・できる。またさらにこのグルコン岐残基を、必要
に応して公知のエステル化手段などしてより誘’、１′
７体としてもよ−。さらシＣグルコン摩残基のカルボキ
シル基を還元型（アルコール弗）としたその４元型残ノ
にとしてもよい。こノＬらの変計還元は末Ｍｕ’ｊグル
コース残ノ、（に変ｊ災する手段は上記の方法に１仮定
されるものではなく、公知の種々の手段を適応すること
ができる。しＩＪえばメチルエーテル化の代りに、エチ
ルエーテル化、イソプロピルエーテル化などのり４石々
の低級アルキルエーテル誘導化フェニルエーテル、Ｐ−
二トロフェニルエーテル、２．ｔｌ−ジニトロフェニル
エーテル、Ｐ−アミンフェニルエーテル、２．６−シク
ロロー４−アミンフェニルエーテル、２．６−ジブロモ
−４−アミノフェニルエーテル、２．４−ブタロロフェ
ニルエーテルナトの置換フェニルエーテルなどの（−・
口々のエーテル誘導体やアセチル化の代りにグロピオニ
ル化などの而々のア／ル化手段によるエステル誘導化や
リン岐エステル訪導体、炭素敬Ｃ５〜Ｃ２０まての炭素
鎖を有する脂肪酸のエステル誘導体などのエステル誘導
体や、グルコン酸残姑の代りにその；Ｊｊ（水体である
グルコノラクトンタイプなどである。なおこれらのグル
コース重合体の合成ρりとしては、１列えば米国清許第
４１４５５２７号明Ｊ朴、米国詩作・）τ４１４７８６
０号明＞ｉ：１１１書、彷開１ｊｃ　５４−５１８９２
号公様、特開１ノｇ　５７−６８７９８号分頑を診照智
れｆＣＩＡｏ　サたこれらの姐月として用すられるグル
コース重合体としてはほぼ単一なａ合度全・〜゛するも
のであっても、また神々の重合度からなる混−会４勿で
あってもよい。また本発明に使用される環υζグルコー
ス重合体としては、レリえば澱゛粉を原料として１ｋｌ
られるグルコース重合度６以上のｊ’ＡＪ伏Ｖこ結合し
たデキス）　ｌ）ンで、α−１β−１γ−１δ−やε−
サイクロデキストリンなどがあげられる。

さらにアミラーゼなどのグリコンダーゼは７本の糖類を
遊離する１′Ｊイ素としては、レリえはホスファターゼ
やエステラーゼが挙げられる。このホスファターゼ、例
えばア・・カリホスファターゼ、り゛ルコース−６−ホ
スファターゼ、クルコ〜スー１−月−スファターゼ、フ
ラクトース−１，６−ジ、Ｉ＝スファターゼなどの活性
１ｉ１１１定において１史川さｔＬろ、、ｌ、ｉ；　＋
ｊ′支としては、リン酸エステル化した楯９」”ｊ、例
えばり゛ルコースー１−ホスフェー１・、グルコース−
６−７にスフエート、グルコース−１，６−ジホスフェ
ート、フラクトース−１，６−ジホスフェートなど力１
１史月Ｊできる。さらに、これらのリン酸比エステル化
した糖類を基質とする酸化還元３々素、例えばグルコー
ス−６−ホスフェ−）’を基質、！：ｆるグル＝＋−ス
−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼの反応（ておける
残存グルコース−６〜ホスフェートを電縫することによ
るその酵素活性測定や、リン酸化エステル化（、た）＋
ｉＡ’＋　＞Ａを、ＡＴＰの存在下酵素的に合成してな
るキナーゼの酵素活性の測定に利用できる。

ｉ　ｆｃエステラーゼ活１生において１吏月Ｊされる基
質としては、炭素数０５〜Ｃ２ｏ徒での炭素鎖を有する
脂肪酸による糖類のアノル化誘畳体が使用できる。

このような基質を用いて、アミラーゼなどのグリコンダ
ーゼ、ホスファターゼやエステラーゼ等Ｈｊｊ＋頷を遊
離する１條素を含有する被検液に加えることにより、通
常３７℃、ｐＨ６〜８の緩衝液中で、該基質はアミラー
ゼ弯−酵素の作用により加水分解さ瓦て、グルコースマ
ルトースやマルトトリオース、マルトテトラオース、マ
ルトペンタオース、マルトヘキサオースなど独々のオリ
ゴ楯の基質分解物を生成する。この際反応時間としては
、基質から糖類を遊離するに充分な時間であればよく、
１μ」んら限定されるものではないが、通常１分以上行
なえばよい。

さらにこのノ、！：質分解物を測定することにより、被
検液中の砧を芳Ｐｉ［Ｌするｉ〕そ素の活性、例えば１
店のグル５ンド結合を加水分晴する酵素（グリコンダー
ゼ）の定量を行うのである。一般的に反応は好捷しくは
、この基質分解物（ｌζマルト−スデヒドロゲナーゼ（
ａｃｃｅｐｔｏｒ　）および水素受容体を作用せしめ、
通常３７℃で、３０秒以上行なわせｈ（ばよい。好まし
くは１分ないし６０分間反応せしめ几ばよい。

また被りか穎中の糖類の定せＱま、上述の基誰分）１」
イ１勿の・代りにギンロース、グルコース、ガラクト−
ス、マルトース、フラクトース、マンノース、ラクトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース
などの糖Ｈ２置きかえることによって行うことができる
。

このように、裾を遊離する酵素例えばα−アミラーゼ、
β−アミラーゼ、α−グルコンダーゼまたはグルコアミ
ラーゼなどのグリコ７ダーセ、ホスファターゼ丑たはエ
ステラーゼによる基質分解物または定−ｆ７ｉすべき塘
ゾｕに、水素受容１木、例えばＰＩＶ［Ｓ、ｌ−メトキ
／−フェナジンノドサルフェート、メルドラーブルーな
どの存在下マルトースデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔ
ｏｒ　）を作用せしめることにより、そのｔ！ｉそ素作
用により定量的に還元型水素受容ｌ／Ｉりを生成してな
るものである。

この除用いら江る水素受容体の量としては、測定すべき
基質分解物または糖類のモル比に対して０．０５〜ＩＯ
倍量用いればよｌ／’＋ｏ特に等モル比以下の」易合１
゛・ては、還元型水素受答体の測定６゛こ当って還元型
水素伝達系反応試楽を用いるか、１たは酸素全作用せし
めて、還元型受容体を水素受容体へと１０生ぜしのるサ
イクリング反応系を形成せしめるときである。ぼた用い
られるマルトースデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ
　）の量としては、一般Ｑて０．０１〜１００Ｕ／テス
トを用いればより０ 次めで反応の段、検出可能な変化を測定するのであるが
、好ましくは反応の結果にて生ずる還元型水素受容体を
足置するものである。この還元型水素受答体の定量にお
いては、還元型水素伝達系反応試薬を用いて反応せしめ
、その結果吸光度変化を生ずる反応全行なわせしめるこ
と力（好ましい。

この還元型水素伝達系反応試薬としては、例えば３−（
Ｐ−ヨードフェニル）−２−（Ｐ−ニトロフェニル）−
５−フェニル−２Ｈ゛・テトラン゛リウム争クロライド
、３−（４，５−ジメチル−２−４アソリル）　−２，
５・ジフェニル−２Ｈ・テトラツリウム・ブロマイド、
３．３’　−（４，４’−ビフエニｌＪ＋ｚｙ）−ビス
（２，５−ジフェニル−２１１・テトラゾリウム・クロ
ライド）　、３．３’−（３，３’−ジフトギン−４，
４′−ピフエニリレン）−ビス〔２−（Ｐ−二トロフェ
ニル）−５−フェニル−２１−Ｉ・テトラゾリウム・ク
ロライド〕　にトロテトラソ゛リウムブルー）　、３．
３’　−（３，３’−ンメトキンーｌ＋　、　ｌＩ−ビ
フエニリレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２ｆ−ト
チトラゾリウム テトラゾリウム塩、２，６−シクロロフエノールインド
フエノールまたはメチレンブルー−寺が挙げられる。こ
れらの還元型水素伝達系反応試薬は、通常生じた還元型
水素受容体と等モル比以上用いればよく、好ましくは水
素受容体へのサイクリング反応の形成の時間と反応時間
とに基いて適宜量用いればよく、１０〜１０００倍量程
１要用いればよい。さらにこの還元型水素受容体と還元
型水素伝達系反応試薬との反応の結果、呈色による吸光
度変化を生ずるもので、この吸光度変（ヒの廣に基つい
て測定すればよい。さらに還元型水素受容体は、酸素、
例えば溶存酸素と反応してなるもので、その際の酸素の
梢音量を酸素゛心敞にて定景して還元型水素受容体の生
成量をめてもよい。

このように行なうことにより被検液中の糖類または糖類
を遊離する酵素の活ヰを測定してなるものであるが、詩
に糖用金遊晶りするｒｌざ素を含崩する被検液の場合、
＄検液、ρ１ｊえば１ぺ、唾液や血液中に存在する糖類
、特にグルコースの存在によシ測定誤差を生するため、
あらかじめ彼倹牧をグルコースオキシダーゼなどのへキ
ンスオキシダーゼおよびカタラーセを用いて前処理を行
なうか、またはヘキソキナーゼなどのキナーゼ、Ｍｉｇ
’＋＋イオンおよびＡＴＰを用いて前処理してグルコー
スの悪影響があられれないようにすることが好丑しい。

なお、とｈらの前処理は、測定すべきグリコシダーゼと
基質との反応と同時う′こ行なわせしめても上いもので
ある。さらに溶存酸素または注入による酸素（場合によ
り空気でもよい）の存在下マルトースデヒドロゲナーゼ
（　ａｃｃｅｐｔｏｒ　）および水系受容体を用いて前
処Ｊｊｌすることにより被検液中のグルコースを除去し
てもよい。

以上の辿り、本発明は新規なマルトースデヒドロゲナー
ゼ（　ａｃｃｅｐｔｏｒ　）およびその製造法、ぞＪし
をｍ−る分析法であり、さらにこの分析法に活つく糖ノ
貞またｒ／′ｉ糖頑を糖類ｂｔ：　’ＡＩＬする酵，代
のｌ蓼素を占１生７を山道用組成物を調製してもよく、
このようにして糖類またはｔｌ．！ｉ類を遊￥；１［す
る酵ふ乞Ｖ「現かつ１１１〕捜な方，去にて醍好にＬｉ
ｌｌ定できるものである。

以下本発明の実施例を嫡げて具体的に述べるが、本発明
は何んら実ｈ１Ｍ例によって限定さ瓦るものではない。

実施例１ ベプト　７　１．０％、カンオニキス１．０％、ＮａＣ
６０．３チよりなる培地１　０　０　ｍｌ　（　１　２
　０℃、２０分間滅菌、ｐＨ７．２）含有５　０　０　
ｍｌ　？；三三角シラスコニスタフィロコッカス・ニス
・ピーＢ−ｏｓ７５ＦＥＲＭＢＰ３８５　の斜面培１山
（ブイヨン寒天培地）よりの−白金耳ｆ：接後前、２８
℃、２４時間振盪」１！Ｓ介して種培ジ）−物をイ（）
だ。次いでこの種培養物を、ペプトンｌ憐、Ｋ２１−Ｌ
Ｐｏ，０．１％、ＮａＣｅ０．３％、ｗ／ＳＯ４・７１
（２０帆１係、／リコンＳＡＧー４７１　（／肖２段剤
）０，１％よりなる培地２０１（１２０℃、２０分曲滅
菌、ｌ）Ｈ７．２）含；汀３０６容ジャーファーメンタ
−に後前し、３０℃、３　０　０　ｒｐｍ　、　２０１
ｙ％の通気条件にて１８時間１ｍ気撹拌培養した。培養
終了後培う９物を遠心分離（　５　０　０　０　ｒｐｍ
．１０分間）して湿菌体を回収し、この湿菌体を、０１
％リゾチーム、５ｍｌシＩＥＤＴＡ’ｆ有リンす緩動液
（　ｐｉ４７、０）浴液１．５４にて３７℃、６０分間
処理して可溶化せしめた後、遠心分離（５　０　０　０
　’ｒｐｍ．１　０分間）シテ上７ＹＪ（　１　１．８
　Ｕ／ｍｅ　、　３．２＃）　＃倚だ。

次いでこの上清液に、２８チ飽祁硫安になるよう硫安を
６５加して速心分ｐｔｌｌ＋　（　５　０　０　０　ｒ
ｐｍ．　２　０　ｑ）し、て、その上清（１８７０ｍ１
）　２回収した。さらにこの」二清に７２％飽ＡＩＪに
なるように硫安を加えて生じた沈ｄ・碇を遠心分ｐｉ［
ｆｌ　（５０００ｒｐｍ、２０分）［２て回収した。こ
の沈Ｉジを２２０　ｍｌの２０）＋ＬＭリン酸緩ブ！Ｉ
ｉｊ液（＋）ｌ−Ｉ　７．０　）に溶解し、遠心分ｐノ
Ｉ　（１５０００ｒｐｍ、Ｉ　０分）して不溶ｒｈ　ｋ
除去し、」二循２００　ｍｌ：　（１２３，５ＵＡ＋ｆ
ｆ）を？ａた。この上片」液を透析して脱塩し、ＣＭ−
セファロースＣＬ−６Ｂを充填［、たカラム（ｂｅｄ　
ｖｏｌ、８０＋＋＋Ｊ）にチャージし、ＫＣｌ０〜０．
５Ｍの濃度勾配法にて溶出してマルト−ステヒドロゲナ
ーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）画分を得た。

この両分を限外口過膜ＸＭ−３０でＣ氷ｉ白しく６１ｎ
ｅ矢セファクリルＳ−２００のカラムクロマトグラフィ
でｊ１°’７　、ｉＲ％し、さらにセファデックスＧ−
２５カラムで脱塩後／ヨ漁１％俗液として凍結乾燥し、
ブルｌ−−ステヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）
　１６０　ｍ９（３８Ｕ／＝）１ｇ）　３ｊ；＝１４ｊ
（だ。

実施列２ ８０　？ｌＬＭ　トリス−Ｈ（１’　緩’ｌ！ｆｉｉ液
ｐｉ−Ｉ７．００．１係　牛血清アルブミン ０．０５％　ニトロテトラゾリウムブルー０．２％　ト
リトンＸ−１００ ？ルトーステヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ）　（
ＩＯＩＪＡ＋６）上記組成の反応液１．０＋＋＋ｅを小
試験・百にとり最終濃度か０．０５〜０．２５％（Ｗ／
Ｖ）のグルコース、マルトース、ブル）　ｌ−ＩＪオー
ス、マルトテｌ−ラオース、マルトペノタオース−ｔ／
ｊｙ」マルトヘキザオースをそれぞれ２０μｌ加え、３
７℃で１００分間応全行い、反応後２　ｍｅの０．ＩＮ
塩酸を砲加し、だ後５５０Ｍ、　７７１で吸光度をｊａ
ｉ＋定した結果それぞれの裾とともに吸光ｊｉと月１の
間に良好な直線１牙か有ら瓦た（第６区１）。ｄ中）−
〇；クルコース、○−○；マルトース、０−０；マルト
トリオース、Δ−ム；ブルｌ−テトｉオース、△−△；
マルトブルタオース、ローロ；ブルトヘキサオースを示
す。

実施例３ 天〃也例２に示した反応、１且成故に５　ｎｎ′ＡのＰ
〜ニトロフェニルベンタオ’／　トｉ　タｆ’Ｊ　Ｐ　
−＝　）　ｏ　７　ｘ　、＝ルペプタオシドを加えた反
応敢１　、□ｍｌをそ八それ不調−検盲Ｖことシ、３７
℃に刀日温したのち、５００１汗に希釈した唾液（アミ
ラーゼ含有被検液）２０μｌを冷加し、各々５分、１０
分、１５分間反応を行った。結果金弟７図に示す。１ｌ
Ｉ１１基貿とも良い定−耐性が１ｑらノし／こ。またＰ
−二トロフェニルへブタオフトノ方がＰ−二トロフェニ
ルベンタオシドの約３倍の活性を示した。寸た明らかな
ラグタイムは観県さノｔなかった（第７図）。図中、○
−○；Ｐ−ニトロフェニルマルトブルタオース、ニーｅ
−（５；Ｐ−二トロフェニルブルトベンタオースヲ示ス
。

実施しｌ１４ ′ｆ：施例２にｔＪｅし、た反応相）取寄に５　ｍ１Ｖ
ｌのＰ−二トロフェニルー＼プタオンド、メチルへブタ
オツドまたはδ−グルコノラクトンへブタオツドを加え
た反応液１．Ｑｍｉ企そ瓦ぞ７′し小試験にとり３７℃
（′こ力旧品したのち、人尿２０μｌを加え各々５分、
１０分、１５分間反応を行った。その結果それぞれ艮’
ｗ　’ｔｉ　ｊｉ′Ｌ性が・１４Ｊられた（第８図）。

図中、○−Ｏ；Ｐ−二トロフェニルマルトヘブルオース
、Ｉｌ！’３−、、’ｉ３；Ｊ−メ＋ルマルトヘブルオ
〜ス、△−△；δ−グルコノラクトンマルトブルタオー
子企示す。

実施例５ ５０ｍＩＶＩ　リン酸緩衝液　ｐｉ−Ｉ７．５０．１％
　血清アルブミン ０．２％　トリｌ−７Ｘ−１００ ■％　α−７クロテキストリン ０．０５％　ＮＴＢ ０．２ｍＭＰＭＳ ２ｍ１■　ｒｖ＋ｙｃｌ！２ ヘキノキナーゼ（２５Ｕ／ｍｅ） ２７ｒ１Ｍ　ＡＴＰ ブル！・−ステヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ）（
ＩＯＵ／ＩＩ＋の５フルＭ　ｌ）−ニトロフェニルマル
トへフタオース上記組成の反応液１．Ｑｍｉを分光光度
計のキュベソｌ−ＶことりＩ／、　、４　”　２．４倍
にイ１コ釈し／こ人血清（アミラーセ級・塗液）２０／
＋ｄ子加え３７℃で戊応合イ１ｂそのとさの５５０　ｎ
ｍにおける吸光度変化合一経時的に（Ｉｌｌｌ定した。

結÷１け第９図に示した。

址／こ５分から７分丑ての２分間の吸光、同変化を第１
０図に示すか、血清の４駅と１吸光度は反比ｔｌ’ｌＪ
する。′ｆ；９図中、ｌぽヘキノキナーゼ除云、Ｄ”ｊ
Ａ合、２、３．４．５は血７＾の希釈倍数がそれぞれｒ
／Ｉ、Ｖ、１シ４、’／４に示す。実ｉ１ｊ　（１，ａ
　−５ａ　）はＰ−＝１−ロフェニルブルトヘプタオー
ス無添加の場合、＜ｔ　Ｈ（ｘｂ−ｓｂ）ｉ、ｉ：ｐ−
ニトロフェニルマルトヘプタオースを１企加した場合ケ
示す。

実力出（り１ＩＧ （）Ｘ応ｌ俟　Ｉ　） ５０ｙフｔ＋ｖＩ　Ｉ・リスーｄｃｌ緩函液ｐｌ−ｆ７
．０グルコースオキシダーゼ（１００Ｕ　／ｒｎｅ）カ
タラーセ゛　（１５Ｕ　ＯＵ／ｍ乙）（反応液ＩＩ） 実施・列２に示した反応組成敢に５７ｒｔ　Ｍ　Ｐ−ニ
トロフェニルへブタオシドｋ　’８ｉ’ｉ　７ＪＬＩ　
したもの。

反応液ＩＯ，２＋ｎ（：’全分光ｉｌ、１キュベソｌ−
＆ことり、血１＋’ｔ　２０　ｔｔｌを伯≦刀１１シ、
３７℃で５分１山インキユベー　ト　し　た　。　反　
Ａｍ；　１友　、Ｉ）Ｌ　Ｌ６：　ｍ　ＩＩ　”ｆ：　
１．ＯＩＩＩｅ　７ｙ、＞　７ＪＩＪ　Ｌ、　、３７℃
で史にインキユベートシ、その滋の５６０　？ｔｍにお
ける吸光度のは時的変化をｄｌｌ」定した。結果を第１
１１ｙ、Ｉ　ｔ２Ｊに示す。なお灰化、系よりグルコー
スオギンダーセｆ：除去したものτ対照とし、第１１図
（１）に示す。

実施例７ ４０　ｍＭ　Ｂ　Ｅ　Ｓｍ　槽液ｐＨ７，００，０２俸
ｌ）Ｍ　Ｓ ５フ＋ｚＭ　Ｐ−二］・ロフェニルへブタオシド上記反
応ｔｔ’ｊ、　１．０　ｍｅを酸素、Ｂ倹を装着した反
応槽にと９３７℃に加温後、１／／８．１／、、　１乙
、ン６．２ｆ／Ｃ希釈した人尿を添加し、尿中のアミラ
ーセｈ！５性を酸素岨極を用いて測定した。姑果ｖ′１
Ｍ−４１２図しで示す辿りで、良め定ｈ′Ｌ注が倚られ
た。

実スａヘレリ８ 実施例２ε・Ｃ示した反応組ノ攻吻に５　ｍ　Ｍになる
よつＫ　１）−二トロフェニルへブタオシド’ｆｙ３Ｊ
ＪＤ　Ｌ、ｆｃ７谷液２０　ｔｒｔ　ｌを平谷器にとり
、これに血清゛を電気泳動したアガロース板をひたし、
室温′で３０分間反応させ活１生染色し、０．１　ＮＨ
（ｌにひたし反応ケ停止した。結果を第１３図Ｃ′こポ
すが、非電に）口」便にアミラーゼ活１生の染色かでさ
、Ｘｆ′ｔｃ染色像は拡散も少なく１叶明であった。

実施例９ 実施例２に示した反応、組成物ｖＣ還ノし末ｙ：Ａ：を
メチル化したデキストリン（分子Ｍ　１０００以上の両
分）またはフラクトンルーブルトへノリオシド（Ｇ−フ
ラクトース）を１％添カー］シた反応液１．□ｍｅを小
試験管にとりα−アミラーセ（人１式′敢のイａ釈／１
ｉｊ）ｔＯ，５，１０，２０，３０，ｔｌｏ、５０１ｉ
ｄ深加し、３７℃で１０分１ｉ１反応を何い、反応後２
　ｍｌの０，１１マＨＣｌ３ｔｊｉ＋ａ加に、５５０　
ｎｍ　で比色定型した。丑だメチル化デキストリンの代
りにフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドを示加（２ｔ
ｒｔ　＋ＶＩ　）し、α−グルコンダーセ輸Ｙ母製、／
クマは）を同様に添加し、＋ＩｊＪし操作音したところ
、それぞれの酵素４まと吸光度の間ＶＣ良好なｌＵ線量
関係得られた（第１４図）。図中、〇−〇；Ｇ７−フラ
クト−ス、△−Δ；メチル化テキストリン、＋、）−、
ｂ　；フェニル−α−Ｄ〜グルコピラノ／ド全示す。

夷１ｊｌ！Ｉし１］１０ 央〃１しｌ　２にン」クシた反応組成物の緩１曲１ダを
５０１ルＩＶｉトリス−ＩＣｌ嶽価畝ｐｉ−Ｉ９．０と
し、さらに基ｆ・↓として２　ｍｌＡグルコース−６−
リン１設を加んノこ反応液１．Ｑｍｌを小試験管Ｖごと
９．３７℃に卵ｉしたｅ、Ｅ　、　Ｃｏ１１８Ａアルカ
リホスフアターゼ浴液１０μｌを添７Ｊｌ］　Ｌ−１３
７℃で１０分間反応した。

反応後、２．（Ｊｒｎｌの０．１Ｎ　１−ＩＣｌ　ｋ　
冷加して５５０ｎｍで比色定ｊ１：：　Ｊ〜だ。結呆τ
第１５図に示したが良い直線性かＩＣ）られだ。

人〃ｍ１夕１１１１ 反応イ１ろ、１ ５０　ｍ１ＶＩ　ｌ−リス−１（Ｃｌｔ＆：ｍｊ？ｊ２
　ｐｉ−Ｉ　７．００　、２７１１．ｉＶｆ　Ｐ　Ｍ　
Ｓ ７　ルｌ−−ステヒトロゲナーセ（ａｃｃｅｐｔｏｒ）
（１３０／７＋Ｊ）２ｍ！＼ｔｌＣａＣ１２ 反１．１Ｌ、イ１父ＩＩ ５０　ｙｚ１１リ　トリス−ＨＣ１緩剖敢　ｐＨ７，０
２２ン？、八４１”ＪＴＢ ５　、０ｎｌｌＶＩ　Ｐ−ニトロフェニルヘヘタオント
２ｙ＋ｔＭ　ＣａＣ１２ 反＋、ｒＳ液１．０　、５　ｒｔｔ（を分光ブＣ吠訂の
セルン（と９．３７℃に加温、衾へ血イ′げ又は尿２０
μｌを鉛〃口し、３７℃で５分ＩＩｊＪ反応を行つ／こ
。反Ｌ―毅、反応故Ｉｆ（３７℃に予め加温したもの）
を１．５ｍｌ添加し、このときの３７℃Ｖこおける吸光
ｉｉ　（５５０７ｃｎＬ）の変化を経時的にｉｌｌ＋定
した。

なお、反応液■、０．５１１１１’と反応液１１、Ｌ５
１１１１に最初から混合し、３７℃に加尚髪後血ｍ又は
尿２０μ７１７を添加し、３７℃で反応を行ったものを
対照とした。結果は第１６図に示す通りで、戊応散■で
前処理［、たも′のは内在性の、塘頬の影響が消去だ八
たことが示さ八た。図中、ＣＩ一つ；血／ｌＴ　ｘ’ｌ
　Ｉ！ｉ４、Ｏ−○；血ｉｎ前処理；ムーム；尿対照、
△−△；尿前理。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のマルトースデヒドロゲナーゼ（ａｃｃ
ｅｐｔｏｒ　）の至適ｐｌ（を示し、第２図は本発明の
マルトスデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）の至
Ｊｆｌｌ温度全示し、第３図は本発明のマルト−ステヒ
ドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）のｐＨｆ定性を示
し、ｇ　ｌ１図は本発明のマルト−スデヒドロゲナーゼ
（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）の饅女定性金示し、第５図は本
発明のマルト−スデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ
　）の、！Ｉ’ｉ　ｊ’（Ｃ度の影響ヲ示し、第６図は
本発明のマルト−スデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏ
ｒ　）を用いた単糖およびオリゴ樵の定量を示し、第７
図は本発明のマルト−ステヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐ
ｔｏｒ　）を用いた卵液アミラーセメ占件の副だ結果を
示し、第８図は本発明のマルト−ステヒドロゲナーゼ（
ａｃｃｅｐｔｏｒ　）を用いた尿中アミラーゼの測定結
末を示し、第９図および第ｌＯ図！ｄ本発明のマルト−
ステヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）を用いた血
清アミラーゼ活性のａｉｌｌ途結果を示し１．）＜Ｘ１
図は本発明のマルトースデヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐ
ｔｏｒ　）　ｆ用いた血清アミラーゼの１Ｉｉｌｌ定結
果を示し、第１２図は本発明のマルト〜ステヒトロケナ
ーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）を用いた尿中アミラーセｌ
占１生の街１］定不吉釆をンＪクシ、耐１３図は本発明
のアルド−ステヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）
を用Ａた血？青アミラーゼ測定帖来の゛電気バ動図ｋ　
ンｉｅし、記１４図は本発明のマルトースデヒドロゲナ
ーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）を用いたアミラーゼ５よひ
α−グルコ／ダーゼを用いるアミラーゼの（ｔｉｌｌ定
結釆ｋ　７ｉ＊　Ｌ、４３１５図は本発明のマルト−ス
テヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔｏｒ　）を用いたアル
カリフォスファターゼのｄ（す定紹呆を示し、第１６図
は本発明のマルト−ステヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｐｔ
ｏｒ）を用いた人血７１１および人尿アミラーゼの活性
測定結果を７罫すものである。 Ｍ３’Ａｈ　％　奢 ＃＋　１チ己　祷２　（イ音ン 一い゛の 反応時間　ｃ分） 手続補正書（方式） 昭和５９年　３月２２１」 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願　第２１９７９２　号事件との関係　
特許出願人 住　所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１名　称
　東洋醸造株式会社 ４、代理人 昭和５９年２月８日（発送日　同年２月２８日）６、　
補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 （１）細　書 （２）明細書の一部 （１〕　適用条文を記載した訂正願書を提出します。 （２）　タイプ印トシた明細書の一部、（第１頁、第３
頁、第４頁、第１Ｏ頁、第１３頁、第１８頁、第２５頁
、第２６頁、第２７頁、第２８頁、絹３２頁および第３
３貞）を補正します。 以上 手続補正書 昭和タデ年／θ月ｇ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和　５ｇ年特許願　第２／９７９２　号事件との関係
　特許出願人 １１：　所　靜岡県田方郡大仁町三福６３２番地の７名
　称　東洋醸造株式会社 ４、代理人 自発 ６、　補正により増加する発明の数 にさ　、；Ｃ１ムン ＋　−−−２７ ／）６明細書中第１Ｏページ上から３行目と訂正する。 の、明細書中鎖１２ページ下から２行目［Ｃａｃｃｅｐ
ｔｏｒｌとあるを「（αｃｃｅｐｔｏｒ　）Ｊと訂正す
る。 ■、明明細書箱第１３ページ構造式 と訂正する。 グ）、明細書中温２グページ上から７行目１’−（ＰＭ
Ｓ）Ｊとあるを「（ＰＭＳ：水素受容体）」と訂正する
。 扮、明細書中温２７ページ上から３行目「につき結討し
た」とあるを「につき検討しｆｃ（測定に当っては、活
性測定法に準じて行なつｔものである）」と訂正する。 Ａ）、同ページ中上からＳ行目及び乙行目「２ＭＳ１／
−メチル」とあるを「少なくとも、ＰＭＳ。 ｌ−メトキ７」と訂正する。 力、同ページ中上からＳ行目「認められるが、」とある
を「認められる。さらに、測定条件の一部変更により、
／−アセタミド・フェナジンメトサルフェートや２．ｂ
−ジクロロフェノールインドフェノールも水素受容体と
なり得るものである。」と訂正する。 ｇ）、明細書中温弘６ページ上から１行目「ｌ−メトキ
７」とあるを「ＭＰＭＳ、／−アセタミド」と訂正する
。 ワ）、同ページ中上から３行目「メルドラーブルー」の
後に「、コ、乙−ジクロロフ、エノールインドフェノー
ル」を挿入する。 ／ω、明細明細鎖中第５９ページ上／／７行目／２２行
目の間に次文を挿入する。 実施例／２ （反応液Ｉ） ’ＡＯｍＭ　１１ノ酸緩衝液ｐＨ７、０３３ｍ　Ｍ　Ａ
　Ｔ　Ｐ ０、Ｏθ、２ａり　水素受容体 ’１．　／７ｍ　Ｍ　ＭＷＯｔ２ マルトースデヒドロゲナーゼ（αｃｃｅｐｔｏｒ）（／
乙、りＵＡｎｔ） ヘキソキナーゼ（／／、７　ＵＡ） （反応液■） ／２．６ｍ　Ｍ　０ａＯｔ＝ ／３．ＯｍＭ　ＢＤＴＡ Ｏ，０／３チ　ＮＴＢ ０．５％トリトンメー１００ コ、Ｓ係　還元デキストリン 上記組成の反応液！（ただし、用いる水素受容体は第６
表の通りである）に、人血清〃μｔを添加し、３７℃で
Ｓ分間反応した後、０淳−の反応液■を添加し、３７℃
で反応せしめ、次いでｊ　５０　ｎｍ　における吸光度
変化を分光光度計で測定した。その結果は、第６表に示
す通りであって、水素受容体の種差に関係なく血清中ア
ミラーゼが測定できた。 第乙表 実施例１３ 反応液 １１０　ｍ　Ｍ　リン酸緩衝液ｐＨ７，０２０ｍＭ　Ａ
ＴＰ ２、！；　ｍ　Ｍ　ＭｆＯ／４ ヘキソキナーゼ（５Ｕ／１ｎｔ） マルトースデヒドロゲナーゼ（α（（ｅｐｔｏｒ　）（
ｌθＵ／ゴ） ２チ　還元デキストリン θ、２ｒｒＭ　２．Ａ−ジクロロフェノールインドフェ
ノール 上記組成の反応液／、０−を分光光度計セルにとり、３
７℃に加温後、３，１０，２０゜３０、！；０μｔの人
血清を添加【２．３７℃でＳ分間反応を行なった後、乙
０θｎｒｒＫおける吸光度変化を経時的に測定した。そ
の結果は第１７図に示す通り、良好な定量性が得られた
。 ドロゲナーゼ（αｃｃｅｐｔｏｒ）ｔ＝用いた人血清ア
ミる。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）単糖またＱまオリゴ糖の還元末端に作用し、ＮＡＤ
   またはＮＡＤＰｔ−７１０酵素として利用することなく
   次の反応を触媒する新規な１膵索。 （Ｒは糖鎖残基または水素原子、ＡＰｊＮＡＤまたはＮ
   ＡＤＰを除く水素受容体、Ａ１（またはＡＨ？ｌは還元
   型受容体、ｎは１または２の整数を示す） ２）基質特異性が少くともマルトース、Ｄ−グルコース
   、キシロース、マンノース、ｊｊｙクト−ス、フラクト
   ース、ラクトース、マルトトリオース、マルトテトラオ
   ース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたは
   マルトペンタオースに作用するものである特許請求の範
   囲第１項記載の酵素。 ３）水素受容体が、少くともフェナジンメトサルフェー
   ト、■−メトキ／−フェナジンメトサル７−ｃ　−１・
   ｉ　ｋはメルト−ラフ′ル−であるり寺５午請求の範囲
   第１項記載の酵素。 ４）　酵素がマルト−ステヒドロゲナーゼである４寺。 ′ｆ　請求の範囲４３１項記載の酵素。 ５）　下記の物理化学的性状、生化学匣状を有する特訂
   Ｗｉ’＋求のｄも囲第１項記１或の酵素。 分子量　８０　、０００±１０，０００　（セファクリ
   ルＳ−２００によるゲルろ過去） 等電点　ｐＨ９゜５付近 １（２ル値　３．ＩＬＭ付近（マルト−スに対して）至
   適温度　３５℃付近 ｐ　ｌ−１安定性　ｐｉ−１７，５−８，５付近にて安
   定熱安定性　１１０℃付近以下で安定 ６）　スタフィロコッカス属に属する単糖またはオ明細
   口、の浄書（内容に変更なし） リボ糖の還元末端に作用し、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを補
   酵素として利用することなく次の反応（ＲはＰ３鎖残基
   または水素原子、ＡはＮ　Ａ　Ｉ）またｉｑｔ　Ｎ　Ａ
   　Ｄ　Ｐを除く水素受答体、Ａ　ｌ（またはＡＩ（ｔｉ
   は還元型受容体、ｎは１または２の賢敢を示す）ヲ琺媒
   するマルトースデヒドロゲナーゼ生産菌を培地ＶＣ培養
   し、その培長物より該マルトースデヒドロゲナーゼを採
   Ｊｔｖ、することを特徴とする該マルト−ステヒドロゲ
   ナーゼの製造法。 ７）スタフィロコッカス属に絹するばマルトースデヒド
   ロゲナーゼ生産菌がスタフィロコッカスＳｐ。 Ｂ−０８７５である特許請求の範囲第６項記載の製造法
   。 ８）楯褪または循胡を遊離する酵素の酵素清性ｄｌｌＪ
   定において、水素受答体の存在下下記の性＊を明細口の
   浄書−（内容に変更なし） 有する新規マルトースデヒドロゲナーゼを作用させ検出
   可能な変化の景をθＩＪ定することを特徴とする御ノ定
   法。 酵素の作用： （Ｒは糖鎖７Ａ基または水素原子、ＡはＮＡＤまたはＮ
   　Ａ　Ｉ）　Ｐを除く水素受容体、ＡＨまたはＡＨｎは
   還元型置−谷体、ｎば１またば２の整数を示す） 基質臂異性：少なくともマルトース、Ｄ−グルコース、
   キシロース、マンノース、 ガラクト−ス、フラクトース、ラ クトース、マルトトリオース、マ ルトテトラオース、マルトペンタ オース、マルトヘキサオースまた ハマルトヘグタオースに作ノグする。 水素受答体：ＮＡＤおよびＮＡＤＰを利用しなイ、少り
   ともフエナジンメトザル フエ−１・、■−メトキソーフエナ ジンメトサルフエ−１・菫たはメル ト−ラブル−を利用する。 分子量：　ｓｏ、ｏｏｏ±１０，０００　（セファクリ
   ルＳ−１００によるゲル３過法） 等電点：　ｐ　Ｉ−Ｉ　９　、５４′ＸＪ近Ｋ　？ル値
   ：　３．８ｔ＋ｔＭ何近（マルトースに対して）至適温
   度＝　３５℃付近 至適１）Ｈ：　７．０−ｓ、ｏ付近 ｐ　Ｈ安定性：　ｐ）１７　、５−８　、５付近で安定
   熱安定性：　・１０℃付近以下で安定 ９）糖類が単糖寸たはオリゴ皓、あるいはこれらの糖類
   を遊離する凸？ｆ、素により遊離をえした糖類である特
   許請求の範囲第８項記載の測定法。 ｉｏ）糖類または酵素により遊離ざ八る糖類が少くトモ
   キシロース、グルコース、ガラクトース、フラクトース
   、マルトース、ンクト−ス、マルトペンタオース、フル
   ｌ−テトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキザ
   オースー１ｋｌｄマルトヘプタオースである」４許請求
   の範囲第９項記載の　ＪＩｌｌ　定　法。 １１）、ｉ７μを遊離する酵素が、少くともクリコシダ
   ーセ、ホスファタ〜セ、址たーエステラーゼである特許
   陥１」求の・ｊ・ｌ囲第９項記１或の６川定ｌ去。 １２）グリコンダーセがα−アミラーセ、β−アミラー
   ゼ、α−グルコ／ダーセ寸たはタルコアミラーゼである
   特許請求の範１ｍ俯１１項記載のＪ１１ｊ定法。 １３）　ａ！ｒ類を遊−１［する酵素の活計測定におい
   て、そのｉｄ；、質として変１荘還元末端グルコース残
   基を有するグルコース重合体ま／Ｃは遠吠グルコース重
   合体を用い、反応ｅζよって生成する基質分屏吻を…１
   １定することを特徴とする特許請求の範囲第８項ｄ己載
   の４唐類を遊＾ＩＬする酵素のｌ占ｉ生、・測定法。 １４）ａ類を遊離する酵素の活団測定において、その基
   質として単糖、あるいはオリゴ糖の還元末ψ１“Ｍが修
   飾されたイノμまたは特許請求の範囲第８項記載のマル
   トースデヒドロゲナーゼが作用しな−糖であるオリゴ糖
   を用い、反応によって生成する基質分解物を測定するこ
   とを！１．＋ｉ漱とする特許請求の範囲第８項記載の糖
   類を遊離する１）ヂ累の活性測定法。 １５）基質が、アミロース、アミロペクチン、澱粉また
   は！殿粉加水分ｊ：ｍ物の変注還ｊＬ性末ψ１ｖ１１グ
   ルコース残基を侑するグルコースＩｌｉ、’合体である
   特許請求の範１！Ｊｌ第１３項記載の測定法。 １６）変性還元末☆（１１１グルコース残基がエーテル
   化した還元〆Ｌ末端、ニスデル化し７た還元１生末鼎１
   １１　グルコノラクトンまたはグルコン鍍残基もしくは
   その還元型残基である特許請求の・１゛・已囲第１３項
   記載の測定法。 １７）　１ｌｌ１１定において、還元型水系受容体の生
   成市を測定することを特徴とする特許請求の範１２Ｌｌ
   第１３項記戦の測定法。 １８）　ａ＋＋を走にお因で、還元型水素受容体に、そ
   の還元型水素伝達系１反応試薬を作用させて生じる吸光
   度の変化をｉｎ！Ｉ　ｉすることを特徴とする局ｉｉ’
   Ｆ　請求の範囲第１３項記載のｄｌす定法。 １９）水素受８体が少くともフェナジンメトザルフェー
   ト、■−ノトキノフエナ／／メトサルフェート捷たけメ
   ルト−ラブル−である特許請求の範囲第８」貞＋、Ｑ　
   ＋：＆のイ則途ｌ去。 ２０）還元ｊ、！’！　Ａ（Ｊ受容体の測定がｊ３り素
   上ｔψを用いて酸素をＴｌｌ１１定することを１４σに
   とする特許請求の１１・目（用冴λ１７項、妃・改の〈
   測定法。 ２１）還元厚］水素云達系呈色反応試薬かテトラゾリウ
   ム塩、２　、６−シクロロフエノールイントフエノール の範囲第］．　８　；ｐｉ記載のイｌｉ　’ｉｒ法。 ２２）　４’ｊｉ　ｆＡをＪｉν，ＩＬする酵素を含有
   する被検液中の該ｆ惇，〈・≦ど占；１ユｔｕシぜ４で
   おりて、７岐１尖（１グをヘキソースオギし／ダーゼお
   よびカタラーゼてｂ４」処理するか、こＦしら＋Ｗ素の
   存在下同時に茂原、を行−グリコ７ダーセの測足全行う
   ことを２１、１漱とする４ｉ１　晒諾求の範囲第８Ｊｆ
   ｉ記載のＪｌ１１定法。 ２３）ヘキソースオキシダーゼがグルコースオキシダー
   ゼを含むものである特許請求のＩ＋屯四囲第２２項記載
   測定法。 ２４）　ｉｖｇｌ−お・よひＡ　Ｔ　Ｉ）の存在下キナ
   ーゼの作用で前処」叩するか、寸たは測定時に同時に作
   用させるかして、被検液中の３ｊ，ｊｊ穎を遊９：［Ｉ
   する酵素活性を測定することを特徴とするｑ．′ｉａ’
   ｒ　ｒ、請求の範囲第８項記載のｉｌｉｌｌ定法。 ２５）キナーゼがヘキソキナーゼである特ｉｊ′］請求
   の範囲第２７１７１項記載定法。 ２Ｇ）酸素および水素受容体の存在下て’Ｉ￥　！，′
   Ｆ　、請求の範囲第８項記載のマルトースデヒドロゲナ
   ーゼの作用で前処３里しだ後・岐検液中の’ＩＪＭ励を
   遊離する肖イ素？占１生をｄ（１１定すること合イ牙徴
   とする’ｌ’ｆ　＋ｊ′Ｆ　請求の範囲第８項記載の測
   定法 ２７）糖類、−または糖類を遊離する酵素の１」？素活
   吐測定用，岨成物。