JPH10511559A

JPH10511559A - インテグリン調節／シグナリングの細胞質モジュレーター

Info

Publication number: JPH10511559A
Application number: JP9537319A
Authority: JP
Inventors: ストーントン，ドナルド，イー．; リプスキー，ブライアン，ピー．
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1996-04-15
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 1998-11-10
Also published as: IL122557A0; US6210914B1; NO975851D0; AU2802497A; US20030044958A1; NO975851L; CA2224571A1; AU724246B2; US5958705A; MX9710010A; PL323998A1; CN1195374A; EP0833910A1; WO1997039124A1; HUP9901757A3; CZ398197A3; SK170497A3; HUP9901757A2; BR9702143A

Abstract

(57)【要約】本発明は、β₂及びβ₇インテグリンを調節するIRPポリペプチドをコードし、インテグリンのシグナリング及び／または再循環経路に関与すると考えられる、精製され単離されたポリヌクレオチドを提供するものである。さらに提供されるのは、IRP活性のモジュレーターを同定するための方法及び、シグナリング経路においてIRPポリペプチドと相互作用する他のタンパク質を同定するための方法である。IRP相互作用のモジュレーターは、例えば、白血球が関わる炎症プロセスをモニター及び処置する上で有用であると考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】インテグリン調節／シグナリングの細胞質モジュレーター本出願は、1996年４月15日に出願され係属中である米国特許出願第08/632,247 号の一部継続出願である。発明の分野本発明は概して、インテグリンのシグナリング経路に関与するタンパク質に関する。さらに詳細には、本発明は、本明細書にてインテグリン調節タンパク質（ IRP）と称するタンパク質のファミリーに関し、このタンパク質はインテグリン活性を調節するものであり、かかるタンパク質ファミリーのうちの２つのメンバーをIRP-1及びIRP-2と命名した。発明の背景インテグリンは、非共有性会合状態にあるα及びβサブユニットからなるヘテロダイマーの表面分子である。すべてのインテグリンは、細胞外ドメインに局在するカウンター受容体結合性活性を有する膜貫通タンパク質である。インテグリンはまた、膜貫通性のシグナリングの事象に関わる比較的短い細胞質領域も有している。インテグリンは、可溶性因子のみならず、他の細胞結合性のカウンター受容体及び細胞外基質の成分に相互作用することができる。細胞外リガンドの結合によって、インテグリンの交叉及び局在化したクラスター形成が導かれることになり（Miyamotoら、Science、267巻、833頁(1995)）、さらに限局性の接着が形成され、この場合クラスター形成したインテグリンの細胞質ドメインは、例えばアクチンフィラメント等を含む細胞骨格成分に会合している（Pavalko及びOtey、Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 、205巻、32767頁(1994)ならびにGumbiner、Neuron、11巻、551頁(1993)）。インテグリンの生理活性についての研究のほとんどが、特異的な細胞外カウンター受容体を同定することにその焦点が絞られている一方で、細胞質成分とのインテグリンの特異的な相互作用について知られていることは少ない。しかしながら、変異体を用いた研究により、接着域とのインテグリンの会合のために、細胞質の配列が必要であることが示唆されている（LaFlammeら、J.Cell Biol.、117巻、4 37頁(1992)）。数多くのインテグリンが同定されているが、特定の下位集合は白血球に対して特異的であり、そのサブセットの各メンバーは、特徴的な細胞特異性発現及びカウンター受容体結合特性を有している。白血球に特異的なインテグリンのうち、少なくとも３つのβ₂インテグリンが知られており、各々、β₂サブユニット（CD 18と称される）と会合している独自のαサブユニットを含んでなる（Kishimoto ら、Cell、48巻、681〜690頁(1987)）。β₂インテグリンに関しての現在の状態については、Spring-er、Cell、76巻、301〜314頁(1994)に記載されている。α_L β₂またはLFA-1としても知られているCD11a/CD18は、すべての白血球において発現されており、ICAM-1、ICAM-2、及びICAM-3に結合することが示されている。α_M β₂またはMac-1としても知られているCD11b/CD18は、多形核好中球、単球及び好酸球において発現されており、ICAM-1、補体因子iC3b、X因子、及びフィブリノーゲンに結合することが示されている。α_Xβ₂またはp150/95としても知られているCD11c/CD18は、単球、多形核好中球及び好酸球において発現されており、補体因子iC3b及びフィブリノーゲンに結合することが示されている。加えて、α_d β₂と称される、第４のヒトβ₂インテグリンが、最近同定されている（Van der Vieren ら、Immunity、3巻、683〜690頁(1995)）。 α₄サブユニットと会合するβ₇インテグリンサブユニットは、主に白血球にて発現されている。その細胞表面ヘテロダイマーは、粘膜アドレッシン細胞接着分子（MadCAM）と称される消化管回帰性（homing）カウンター受容体を認識し、そして腸組織にリンパ球が結合するうえで中枢的な役割を果たしているようである（Berlinら、Cell、74巻、185〜195頁(1993)）。α₄β₇は、VCAMに結合することも示されている（Chanら、J.Biol.Chem.、267巻、8366〜8370頁(1992)）。セレクチン表面分子のみに予め関わっていた作用と同様に、α₄β₇が、炎症を受けた小静脈への流動条件下におけるセレクチン非依存性のリンパ球接着に関与することが示されている（Berlinら、Cell、80巻、413〜422頁(1995)）。α₄サブユニットに対して免疫特異性を有する抗体を用いた動物モデルにより、α₄β₇、またはβ₁インテグリンサブユニットに会合しているα₄が、例えば、実験的アレルギー性脳髄膜炎（Yednockら、Nature、356巻、63〜66頁(1992)；Baronら、J.Exp.M ed.、177巻、57〜68頁(1993)）、接触過敏症（Ferguson及びKupper、J.Immunol. 、150巻、1172〜1182頁(1993)；Chisholmら、Eur.J.Immunol.、23巻、682〜688 頁(1993)）ならびに非肥満性糖尿病（Yangら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、90巻、10494〜10498頁(1993)；Burklyら、Diabetes、43巻、529〜534頁(1994)；Baro nら、J.Clin.Invest.、93巻、1700〜1708頁(1994)）等を含む数多くの疾病状態において役割を果たすかもしれないことが示されている。インテグリンは、体全体での白血球のトラフィッキングに関与するタンパク質の主要なタイプの一つであることが示されている。白血球は、リンパ液及び血液から脈管構造の内皮細胞層を通過し、その下にある組織に浸透することにより、リンパ器官と他の組織との間を常に再循環している。炎症性及び自己免疫性疾患の一つの要素は、炎症部位への白血球の流入である。このような部位での炎症の消散は、白血球機能を阻止または阻害する、インテグリンに対して免疫特異性を有するモノクローナル抗体を用いて成し遂げることができる。概説として、Lobb及びHemler、J.Clin.Inves t.、94巻、1722〜1728頁(1994)を参照されたい。インテグリン機能のモジュレーションは、炎症の消散に効を奏しうる手段の一つであるが、インテグリン調節及びシグナリングの特異的な細胞質成分についてはほとんど知られていない。 Liu及びPohajdak、Biochimica et Biophysica Acta、1132巻、75〜58頁(1992) には、酵母SEC7タンパク質、イカのキネシン、プレックストリン（pleckstrin）、及びダイナミン（dynamin）と相同なドメインを有するタンパク質をコードする、B2-1と命名されたヒトcDNAクローンが記載されている。この文献には、B2-1 がSEC7タンパク質と相同なのはごく一部だけであるので、B2-1が酵母のSEC7タンパク質のヒトにおける相同物であることが明らかになったわけではなく、SEC7モチーフの外側の非類似性をもってすれば、B2-1がかような相同物ではなさそうである旨、述べている。この文献では、細胞溶解に際しての標的細胞に対するNK細胞のゴルジ／分泌顆粒の再配向にB2-1が関わっているかもしれないとの仮説が立てられている。Schiller及びKolanus（「A dominant negative effect of the h uman Sec7 PH domein on β₂ integrin mediated binding to ICAM-1」、Adhesi on Meeting of the German Immunology Association、第３回、Regensburg、ドイツ、1995年３月14〜15日）は、β₂インテグリンの細胞質ドメインと相互作用する、類似のモチーフを有するヒトタンパク質を発表しており、このタンパク質のPHドメインの過剰発現の結果、Jurkat細胞におけるβ₂インテグリンの活性化依存性の親和性（avidity）に対して強力な顕性の負の効果が惹起こされることを報告している。しかしながら、Schiller及びKolanusは、(i)インテグリン活性に優先的に相互作用し、及び／またはこの活性をモジュレートするインテグリン調節タンパク質（IRP）の存在、(ii)COS細胞においてインテグリンをコードするDNAと共にコトランスフェクトされた場合に、コトランスフェクトされたインテグリンのdenovo発現を調節するIRP、または(iii)流動条件下でJY細胞の接着及び回転をモジュレートするIRPを示してはいない。従って、インテグリンの結合及び／またはシグナリング活性に結合する、及び／またはそれらをモジュレートする分子を同定すること、ならびにこれらの分子を同定することができる方法を開発することが、当該技術分野において希求されている。その方法、及びそれにより同定される分子によって、インテグリンが介する免疫性及び炎症性の応答における治療的介入のための実用手段が提供されるであろう。発明の要約本発明は、β₂及び／またはβ₇インテグリン調節及び／またはシグナリング経路の細胞質成分である新規ヒトIRPを提供する。本発明の一つの特徴において、IRP-1及びIRP-2をコードする、精製され単離されたポリヌクレオチド（例えば、DNA及びRNA、いずれも、そのコード鎖及び非コード鎖）が提供される。本発明によって企図されるポリヌクレオチドには、ゲノミックDNA、RNA、cDNA及び全体的または部分的に化学合成されたDNAが含まれる。本発明の好ましいポリヌクレオチドには、配列番号：１で示されるIR P-1のDNA配列、配列番号：２で示されるIRP-2のDNA配列、及びストリンジェントな条件下でそれらの非コード鎖にハイブリダイズするDNA配列、または遺伝コードの冗長部分なしで、かかる配列にハイブリダイズするであろうDNA配列が含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りである。すなわち、5 X SSPE、45％ホルムアミド中で42℃にてハイブリダイゼーション、そして0.2 X SSC中で65℃にて、または1 X SSC中50℃にて洗浄。これらの条件を変化させることは、ハイブリダイスされるべき配列の長さ及びGCヌクレオチド塩基含量に基づき、当業者によって想起されることは理解されよう。当該技術分野における公式的な標準が、正確なハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。Sambrookら、Molecular Cloning、9.47〜9.51、Cold Spring Har bor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク(1989)を参照されたい。本発明によって提供されるDNA配列情報から前記のDNA/DNAハイブリダイゼーション及びポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クローニングなどの周知の技術により、関連分子をコードするDNAの同定及び単離が可能となる。実施例の一例として、I RPをコードするDNAの配列の知識から、DNA/DNAハイブリダイゼーションによりIR PをコードするゲノミックDNA配列、及びプロモーター、オペレーター等の発現制御調節配列の単離が可能となる。ストリンジェントな条件下での、本発明のDNA 配列を用いて行われるDNA/DNAハイブリダイゼーション法が、同様に、IRPの対立変異体をコードするDNA；IRPに相同性を有する非ヒト種のタンパク質；及びIRP が関与するβ₂及び／またはβ₇インテグリン調節経路のメンバーまたは調節因子との相互作用能を１以上共有する、他の構造的関連性を有するタンパク質の単離を可能ならしめることが期待される。検出可能なようにラベルされた場合に、本発明のポリヌクレオチドは、IRP を合成する細胞の能力を検出するハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明によって提供されるDNA配列情報は、相同組換えまたは「ノックアウト」ストラテジー（Capecchi、Science 244巻、1288〜1292頁(1989)を参照されたい）によって、機能を有するIRPを発現しない齧歯類または変異型のIRP を発現する齧歯類の開発も可能とする。このような齧歯類は、in vivoにおけるI RP及びIRPモジュレーターの活性を研究するためのモデルとして有用である。本発明のポリヌクレオチドはさらに、１以上の疾病状態に根付く、IRP座における遺伝的変更を同定するために有用な診断方法のための基礎ともなるかもしれない。本発明によってさらに得られるのは、通常IRPを発現している細胞によるIRPの発現の調節に関わるアンチセンスポリヌクレオチドである。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだプラスミド及びウイルスDNAベクターなどの自己複製する組換え構築体、特にポリヌクレオチドが内在性または異種性発現制御DNA配列及び転写終結因子に機能的に連結されたベクターも提供するものである。本発明の別の特徴によれば、宿主細胞、特に原核細胞及び真核細胞などの単一細胞性宿主細胞が、その中でIRPの発現が許容されるように、本発明のDNAで安定に形質転換またはトランスフェクトされる。本発明の宿主細胞は、IRPの大規模な生産のための方法において特に有用であり、それら細胞は、好適な培養培地中で生育され、そして所望のタンパク質が、その細胞から、または細胞が生育され培地から単離されるのである。配列番号：２（IRP-1）及び配列番号：４（IRP-2）に示されるアミノ酸配列の一部または全部を有するIRPポリペプチド産物が企図される。哺乳動物の宿主細胞の使用によって、本発明の組換え発現産物に至適な生物学的活性を付与するために必要とされるかもしれない転写後の修飾（例えば、ミリストイレーション、グリコシレーション、欠切、ラピデーション及び、チロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化等）が行われることが期待される。さらに融合ポリペプチドも提供され、これは、IRPアミノ酸配列が他のポリペプチド由来のアミノ酸配列と接近した状態に発現されるものである。本発明の融合ポリペプチドには、天然型のポリペプチドに比較して、その生物学的、生化学的、及び／または免疫学的特性が修飾されたものが包含される。IRPの多量体型も企図される。本発明のポリペプチド産物は、全長のポリペプチド、断片または変異体であってもよい。変異体は、(1)β₂及び／もしくはβ₇シグナリング経路のメンバーもしくは調節因子との相互作用能を喪失することなく、または(2)β₂及び／もしくはβ₇シグナリング経路のメンバーもしくは調節因子との相互作用能を無力化して、１以上の特定の（すなわち、天然型でコードされている）アミノ酸が欠失もしくは置換され、または１以上の特定のものでないアミノ酸が付加されている IRP産物を含む。IRPと相互作用するタンパク質は、様々なアッセイによって同定することができる。本発明によって企図される第１のアッセイは、２ハイブリッド選別（two-hybr id screen）である。２ハイブリッドシステムは、酵母において開発され（Chien ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、88巻、9578〜9582頁(1991)）、そしてレポーター遺伝子を活性化する転写因子のin vivoでの機能的再構成に基づくものである。詳細には、IRPと相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、以下の工程を含む方法によって単離される。すなわち、DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし；当該宿主細胞にて、IRP の一部またはすべてと、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１融合体をコードする第１ハイブリッドDNA配列を発現させ；IRP結合タンパク質と推定されるタンパク質の一部またはすべてと、第１融合体に組み込まれていない、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第２融合体をコードする第２ハイブリッドDNA配列のライブラリーを宿主細胞で発現させ；かかる宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の生産を検出することにより、特定の宿主細胞における、IRPと相互作用するタンパク質のIRPに対する結合を検出し；そしてその特定の宿主細胞から、かかる相互作用性タンパク質をコードする第２ハイブリッドDNA配列を単離する。アッセイにて使用するために現在のところ好ましいのは、lacZレポーター遺伝子の発現を駆動するGAL4上流活性化配列、GAL4 DNA結合ドメイン及びGAL4トランス活性化ドメインを含む転写因子、ならびに酵母宿主細胞である。 IRPと相互作用するタンパク質を同定するための他のアッセイには、IRPまたは被検タンパク質を固定化し、固定化されなかった方の結合パートナーを検出可能にラベルし、結合パートナーと共にインキュベートして、結合したラベルの量を定量することが包含されうる。結合したラベルは、被検タンパク質がIRPと相互作用することを示唆する。 IRPと相互作用するタンパク質を同定するためのいまひとつの型のアッセイには、蛍光剤が被覆（または含浸）された固体支持体にIRPまたはその断片を固定化し、蛍光剤を励起することができる化合物で被検タンパク質をラベルし、固定化したIRPをラベルした被検タンパク質に接触させ、蛍光剤による光放射を検出し、そして、蛍光剤による光の放射を惹き起こす被検タンパク質として、相互作用性タンパク質を同定することが包含される。あるいは、このアッセイにおいて、相互作用性タンパク質と推定されるタンパク質を固定化し、そしてIRPをラベルしてもよい。さらに本発明によって企図されるのは、本発明のIRPに対して特異的な抗体産物及び他の結合タンパク質（前記のアッセイにて同定されたものなど）である。本発明の抗体産物には、モノクローナル、ポリクローナル、抗イディオタイプ、及び組換え（すなわち、ヒト化、キメラ等）抗体ならびにそれらの断片が包含される。本発明の抗体産物を生産する細胞系（例えば、ハイブリドーマ細胞系）が企図される。結合タンパク質は、単離された、天然または組換えIRPポリペプチド産物を使用してつくることができる。結合タンパク質はまた、組換え及び天然に生じるIRPポリペプチド産物を精製するため、ならびにかかる産物を生産している細胞を同定するために有用である。細胞内及び流体内のタンパク質を検出及び定量するためのアッセイには、単一の抗体物質または「サンドイッチ」アッセイ形式における複数の抗体物質が包含されうる。結合タンパク質は、β₂及び／またはβ₇インテグリンシグナリング経路成分とのIRPの相互作用をモジュレートする（すなわち、阻止、阻害、または刺激する）うえでも、際立って有用である。本発明のモノクローナル抗体として特に例示すべきは、ハイブリドーマ細胞系 200A、200B及び233Gによって生産されるモノクローナル抗体である。これらの細胞系は、郵便番号20852、メリーランド州、ロックビル、パークロウンドライブ1 2301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、1997年４月２日に寄託された。200Aに対する受託番号はHB-12331、200BはHB-12332、及び 233GはHB-12333である。他のタンパク質または脂質とのIRPの相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのアッセイには、以下の工程を含む方法が包含される。すなわち、DN A結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし；当該宿主細胞にて、IRPの一部またはすべてと、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１融合体をコードする第１ハイブリッドDNA配列を発現させ；IRPと相互作用するタンパク質の一部またはすべてと、第１融合体に組み込まれていない、転写因子のDN A結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとをコードする第２ハイブリッドDNA配列を宿主細胞で発現させ；被検化合物の存在または非存在下でのかかる宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の生産を測定することにより、特定の宿主細胞における、IRPに対する相互作用性タンパク質の結合を検出することによって、IRPと相互作用性タンパク質との間の相互作用に対する被検化合物の効果を評価し；そしてモジュレーター化合物が存在しない場合でのレポーター遺伝子産物の生産に比較して、レポーター遺伝子産物の生産を変化させる被検化合物として、モジュレーター化合物を同定する。このアッセイにて使用するために現在のところ好ましいのは、レポーター遺伝子、lacZレポーター遺伝子の発現を駆動するGAL4上流活性化配列、GAL4 DNA結合ドメイン及びGAL4トランス活性化ドメインを含む転写因子、ならびに酵母宿主細胞である。 IRPと相互作用性タンパク質または脂質との相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのいまひとつの型のアッセイには、IRPまたは天然のIRP相互作用性タンパク質を固定化し、固定化しなかった方の結合パートナーを検出可能にラベルし、結合パートナーと共にインキュベートして、結合したラベルの量に対する被検化合物の効果を定量することが包含され、ここで、被検化合物なしで結合したラベルの量に比較して被検化合物の存在下に結合したラベルの量が減少していれば、被検薬剤は、タンパク質とのIRPの相互作用の阻害剤であることが示唆される。逆に、その化合物なしで結合したラベルの量に比較して被検化合物の存在下に結合したラベルの量が増大していれば、モジュレーターと推定される化合物は、タンパク質とのIRPの相互作用の活性化剤であることが示唆される。 IRPと、相互作用性タンパク質または脂質との間の結合をモジュレートする化合物を同定するための、本発明によって企図されるさらに別の方法には、蛍光剤が被覆（または含浸）された固体支持体にIRPまたはその断片を固定化し、蛍光剤を励起することができる化合物で相互作用性タンパク質をラベルし、被検化合物の存在下及び非存在下に、固定化したIRPをラベルした相互作用性タンパク質に接触させ、蛍光剤による光の放射を検出し、そして被検化合物がない場合の蛍光剤による光の放射に比較して、蛍光剤による光の放射に影響を及ぼす被検化合物として、モジュレーター化合物を同定することが包含される。あるいは、このアッセイにおいて、IRP相互作用性タンパク質を固定化し、そしてIRPをラベルしてもよい。 IRPのモジュレーターは、ARF、PI、β₁、β₂、β₃及び／もしくはβ₇インテグリン調節及びシグナリング活性、細胞におけるIRPの局在性、ならびに／またはA RF、PI、β₁、β₂、β₃及び／もしくはβ₇インテグリンのシグナリング経路のメンバーとの IRPの相互作用に効果を及ぼすかもしれない。結合ライブラリー、ペプチド及び疑似ペプチド、限定された化学物質、オリゴヌクレオチド、及び天然産物ライブラリーが、前記のごときアッセイにおけるモジュレーターとしての活性につき、スクリーニングされるとよい。選択的なモジュレーターには、例えば、IRPもしくはIRP核酸に特異的に結合するポリペプチドまたはペプチド、IRPもしくはIRP 核酸に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、及び／またはIRPもしくはIRP核酸と特異的に反応する他の非ペプチド化合物（例えば、単離された、もしくは合成された有機性分子）が包含されうる。野生型のIRPの結合活性または細胞での局在性に作用するIRPの変異型もまた、本発明によって企図される。本発明の方法によって同定される、ARF、PI、β₁、β₂、β₃またはβ₇／IRP相互作用のモジュレーターは、白血球が関与する炎症プロセスに作用するよう、in vitroまたはin vivoで利用される。加えて、ARF、PI、β₁、β₂、β₃及び／もしくはβ₇インテグリンまたはIRPに結合するモジュレーター化合物は、体液または生検組織を包含する生物学的試料における、ARF、PI、β₁、β₂、β₃及び／またはβ₇のレベルをモニターするうえで有用である。 IRPモジュレーターは、製薬的に許容しうる担体を含む組成物に製剤化してもよい。指示投薬量は、IRP／β₁、β₂、β₃またはβ₇インテグリンのシグナリングまたは調節のin vivoでのモジュレーションを惹き起こすに足る量であろう。本発明の他の数多くの特徴及び利点は、以下の詳細な説明を考慮すれば明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、示したポリペプチドを発現しているJY細胞の、VCAM -1への結合能を示すグラフを表す。図２は、示したポリペプチドを発現しているJY細胞の、ICAM-1への結合能を示すグラフを表す。図３は、IRP-1、IRP-2、B2-1及びB2-1のC.elegans相同体のアミノ酸配列のアラインメントを示す。発明の詳細な説明以下の実施例によって本発明を例証する。実施例１には、IRP-1及びIRP-2をコードするcDNAの単離を記載する。実施例２には、そのcDNAによってコードされる IRP-1及びIRP-2タンパク質のドメイン構造の分析を示す。実施例３には、全長の IRP cDNAならびにIRPドメイン及びIRP変異体をコードするcDNAを含む組換え発現構築体を記載する。実施例４に示されるのは、ICAM-1及びVCAM-1への細胞接着に対するIRPの役割、インテグリンの細胞表面発現におけるIRPの役割、及びIRPの細胞下での局在性を含む、宿主細胞接着に対するIRPの組換え発現の効果を分析するアッセイの結果である。実施例５には、IL-8受容体を安定に発現する、安定に形質転換されたJY細胞系（JY-8）の調製ならびにICAM-1及びVCAM-1へのIL-8依存性であってPMAで刺激される細胞接着に対するIRPの役割を決定するうえでの前記細胞系の使用を記載する。実施例５はさらに、緑色蛍光タンパク質（GFP）IRP 融合タンパク質をコードする発現ベクターの調製も記載するものである。実施例６には、IRPでトランスフェクトされたJY細胞の流動条件下での接着を記載する。実施例７には、IRPに対するモノクローナル抗体の調製とその特徴を記載する。実施例８において、化学走性におけるIRPの役割の特徴を記載する。実施例９には、様々なヒト組織におけるIRPの分布を示す実験を記載する。実施例１０において、IRPと相互作用するタンパク質を同定するアッセイを記載し、実施例１１及び１２には、IRP相互作用のモジュレーターを同定するアッセイを記載する。実施例１ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）及びDNA/DNAハイブリダイゼーションを使用して、２つのヒトIRP cDNAクローンを単離した。 BLAST検索によって、B2-1タンパク質に類似性を呈する様々な部分的cDNAを同定した。ESTs、H02055、R82669、R43994、H39073、R45477、T07442、及びT32215 に基づき、プレックストリン相同性ドメインを表す領域の5'及び3'端に対応するコンセンサス配列オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。5'端（TS3.5）及び3'端（TS3.3）に対して設計されたプライマーの配列は、以下の通りであった。 100μlのPCR反応において、pcDNA-1 Amp（Invitrogen、SanDiego、カリホルニア州）にて鋳型の2 mgのプラスミドcDNAとして脾臓cDNAを用いて、プライマーを使用した。試料は、94℃に５分間保ち、次いで、94℃で１分間、50℃で１分間、 72℃で２分間、の工程30サイクルに付した。その結果得られた約450 bpのPCR産物を、MluI及びSalIで消化した。消化されたPCR断片の挿入部位のすぐ5'側にヘマグルチニンタグをコードする配列を有するベクターpCl-neo（Promega、Madis on、ウイスコンシン州）へと、精製された消化断片をクローニングした。得られたインサートの配列を明らかにし、そのベクターを5'HA TS53/pC1#3と命名した。 MluI／SalIで消化されたPCR産物をラベルし、３kbインサートよりも大きなものに対してサイズ選択したヒト脾臓cDNAライブラリーをプローブ探査するために使用した。脾臓ライブラリーは、オリゴdTでプライム付けしたcD NAライブラリーをpcDNA-1Ampへとクローニングし、約7.8kbよりも大きなベクター／インサートをサイズ選択することによって調製した。ライブラリーベクターは、XL1 Blue Ultracompetent Cell（Stratagene、LaJolla、カリホルニア州）へと形質転換され、Hybond N⁺フィルターを備えた１５枚のマスターの150mm²プレートに約20,000コロニー／プレートの密度で播種した。各マスタープレートからつくった２つの写しをハイブリダイゼーションに使用した。消化されたPCR断片（400 ng）は、製造業者が示したプロトコルに従って、Boehringer Mannheim Random Primed Labellig Kitを使用し、120μCiの³²P dCTP及びdTTPでラベルした。取り込まれなかったヌクレオチドは、Centri-sepカラム（Princeton Separa tions、Adelphia、ニュージャージー州）を介して除去した。プローブは（5X SS PE、45％ホルムアミド、5Xデンハーツ、1％SDS）を含有する溶液中で42℃にて終夜ハイブリダイズさせた。65℃にて0.2X SSCの最終ストリンジェンシーまでフィルターを洗浄し、フィルムに露光した。二重試験によるフィルターでの陽性クローンを取り、希釈し、そしてLBMプレートでHybond N⁺フィルターに対して再度播種した。これらのマスターの各々からつくった二重試験によるフィルターを、第１次スクリーニングから保存していたハイブリダイゼーション溶液を用いて再度ハイブリダイズさせた。第２次の陽性クローンを取り、生育させ、そしてプラスミドを単離し、インサートの両側端部を配列決定した。同定した１つのクローンは、クローンS3と命名した全長の遺伝子を含んでおり、それによってコードされるタンパク質は、本明細書中、IRP-1と称している。このクローンのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を、配列番号：１及び２に示す。クローンは、その開始のメチオニンコドンの周囲に至適なコザックコンセンサス配列及びメチオニンの5'フレーム内の終止コドンを有している。クローンはおよそ1.6 kbの鎖長であり、399アミノ酸の読み取り枠を有している。クローンS3は、EST R82724と最も類似しており、469 ヌクレオチドにわたって93％を越える相同性を示している。およそ3.4 kbの長さの別のクローンを回収した。S12と命名されたこのクローンは、IRP-2として本明細書に称するタンパク質をコードしており、IRP-1と相同性を呈するものの明らかに新規の遺伝子である。IRP-2クローンとIRP-1配列との 5'端部のアラインメントから、IRP-1クローンのコード領域におよそ50アミノ酸が認められたので、IRP-2クローンは全長のものではなかった。全長のIRP-2クローンを得るために、以下のように同じ脾臓cDNAライブラリー（前記）を、２つのIRP-2プローブを使用して再度スクリーニングした。欠切したIRP-2クローンは、XbaI及びXhoIで別々に消化した。次いで、2 kbのXbaI断片及び1 kbのXhoI断片を前記の通りにBoehringer Mannheim Random Primed Labell ig Kitを使用してラベルした。取り込まれなかったヌクレオチドは、Centri-sep カラムを使用して除去し、そしてプローブは、前記の通りのハイブリダイゼーション溶液中でフィルターに加え、42℃にて終夜ハイブリダイゼーションを行った。フィルターは50℃にて1X SSC／0.1％SDSの最終ストリンジェンシーまで洗浄した。第１次の陽性クローンを取り、希釈し、そしてLBMプレートでHybond N⁺フィルターに対する操作を繰り返した。これらのマスターの各々からつくった二重試験によるフィルターを、保存しておいた前記ハイブリダイゼーション溶液を用いて再度ハイブリダイズさせた。二重試験におけるフィルターの陽性クローンを取り、生育させ、そしてプラスミドを単離してインサートを配列決定した。２つのクローン、 S12-41及びS12-47は、IRP-2コード領域の5'方向に、約50アミノ酸伸びていた。クローンの5'端にメチオニンがあり、IRP-1にて認められると概ね同様のアミノ酸構成を維持しており、そのメチオニンを囲むコザックコンセンサス配列と良好に符合していた。S12-47クローンを完全に配列決定し、IRP-2 DNA及び推定アミノ酸配列を配列番号：３及び４に示す。実施例２ IRP-1、IRP-2、B2-1（Liuら、前出）遺伝子及び推定アミノ酸配列の比較によって、３つの共通のドメインまたはモチーフ、すなわち、アミノ末端のキネシン／ミオシンドメイン、SEC7ドメイン、及びカルボキシ末端のプレックストリン相同性（PH）ドメインを同定した。キネシン及びミオシンは、微少管に会合する輸送タンパク質である（Navoneら、J.Biol.Chem.、117巻、1263〜1275頁(1992)）。Altschulら、J.Mol.Biol.、215巻、403〜410頁(1990)に記載される酵母タンパク質SEC7は、ゴルジ装置からの糖タンパク質の分泌を調節するらしき2008アミノ酸のタンパク質である。酵母におけるSEC7のさらに正確な機能は調べられていないが、ArabidopsisでのSEC7遺伝子の変異の結果、発生に関連する細胞分裂及び細胞接着のモジュレーションが惹起こされる（Shevellら、Cell、77巻、1051〜1 062頁(1994)）。PHドメインは、シグナリングトランスダクションに関わる数多くのタンパク質に見出される。あるタンパク質では、このドメインによって、Ｇタンパク質β_rサブユニット、イノシトールトリホスフェート（IP₃）、またはホスファチジルイノシトールジホスフェート（PIP₂）に結合する能力が付与される。Ingley及びHemmings、J.Cell.Biochem. 、56巻、436〜443頁(1994)を参照されたい。IRP-1及びIRP-2のアミノ酸配列において、キネシン／ミオシンドメインは、およそ第９残基からおよそ第60残基までにわたり、SEC7ドメインはおよそ第71残基からおよそ第245残基までにわたり、そしてPHドメインはおよそ第260残基からカルボキシ末端までにわたっている。B 2-1において、キネシン／ミオシン、SEC7、及びPHドメインは、それぞれ、およそ第10残基からおよそ第61残基まで、およそ第72残基からおよそ第245残基まで、及びおよそ第246残基からカルボキシ末端までに、概ね特定される。IRP及びB2 -1における様々なドメイン間のアミノ酸の同一性を、以下の表１に示す。３つのタンパク質でキネシン／ミオシン、SEC7、PHドメインが保存されていることに基づき、IRP-1及びIRP-2タンパク質はB2-1に関連するヒトタンパク質のファミリーのメンバーであると考えられる。図３に、見かけ上のC.elegans相同体（Wilsonら、Nature、368巻、32〜38頁(1994)）との、IRP-1、IRP-2、及びB2-1 クローンのアラインメントを示す。他の３つのヒトタンパク質とのC.elegansタンパク質の相同性の百分率は、あまり高くないものの、４つのタンパク質の間で全体のドメイン構造が保存されていることは明らかである。３つのヒトタンパク質とC.elegansタンパク質との間で保存されているほとんどの残基は、相同のSEC7領域を含むArabidopsisタンパク質（Shevellら、前出）においても保存されており、加うるに、酵母のSEC7タンパク質でも保存されている。このことによって、SEC7ドメインの機能におけるこれらの残基の重要性が示される。事実、Shevellら、前出で、Arabidopsisクローン（EMB30）において、これらの残基の１つを変化させる変異（図３のアラインメントで第157位に対応する）によって、細胞分裂、伸長、及び接着に影響を及ぼすことが報告された。 IRP PHドメインにおいて保存された残基は、機能的にも重要であるかもしれない。Tsukadaら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、91巻、11256〜11260頁(1994)は、多くのPHドメインで保存されているアルギニン（図３の第289位に対応する）をシステインに変異すると、マウスにおいてbtkチロシンキナーゼのPHドメインに存在する場合、その酵素は完全なbtkキナーゼ活性を維持しているにも関わらず、X関連の免疫不全表現型が導かれたことを報告している。この残基は分子の表面上にあると予測されるので、かかる置換が構造的な影響をもたらすとは考え難く、他のタンパク質との特異的な相互作用を破壊する可能性が高いと、著者らは考察した。この残基は、ヒトIRPタンパク質及びC.elegansタンパク質の間でも保存されている。最後に、C.elegansタンパク質だけでなく３つのヒトタンパク質のすべてが、他のPHドメインに比較すると、それらのPHドメインのサブドメイン５と６との間に16から18の付加的な残基を有している。Maciasら、Nature、369巻、675頁(199 4)に記載された、PHドメインの提案された３次元構造に鑑みて評価すると、このドメインは、ドメインの核から伸延するループをつくっているらしく、従って、他の１以上のタンパク質との相互作用のために重要なのかもしれないのである。これらの16から18までの残基は、４つのタンパク質の間で73％の同一性を呈している。実施例３インテグリンの機能におけるIRPタンパク質の役割を調べるために、IRP-1、IR P-2、及びB2-1タンパク質またはそれらのPHドメインをCOS及びJY細胞にて、β₂ インテグリンサブユニットCD11a及びCD18と共に発現させた。IRP及びB2-1発現ベクターは、以下の通りに構築した。このベクターを使用したタンパク質の発現は、実施例４に記載する。ヒトB2-1タンパク質をコードする相補的なDNAを、サイズ選択された2.5〜4 kb のRamosライブラリーのPCR増幅によってクローニングした。コード領域の5'及び 3'端に対するプライマーを、以前に公開された配列（Liuら、前出）に基づいて設計した。プライマー対は、適切なベクター内への増幅配列の挿入を容易にするべく設計された。B2-1 cDNAは、5’Sc7.Nde及び3’Sc7.Xhoプライマーを使用して先ず増幅され、ベクターpET 15b（Novagen、Madison、ウイスコンシン州）にクローニングされた： 100μlのPCR反応においてプライマーを使用した。試料は、94℃に５分間保ち、次いで、94℃で30秒間、55℃で30秒間、そして72℃で１分間、の工程30サイクルに付した。その結果得られたPCR産物をゲルで精製し、NdeI及びXhoIで消化して、pET 15bにクローニングした。クローンを配列決定し、そしてクローンSc7/pET #5及びSc7/pET #6が、公開されたB2-1配列と同じ配列を有するインサートを含んでいた。 PCRによってB2-1 cDNAの5'端部にHAタグを付加し、次いでタグを付けた遺伝子をpC1-neoにクローニングした。前記した3'Sc7.Xhoプライマーを、5’Sc7.HASプライマーと共に利用した。プライマー中、下線を付したヌクレオチドは、HAタグをコードしている。100μl のPCR反応において、以下の条件下で鋳型としてSc7/pET #6 DNAを用いて、プライマーを使用した。試料は、94℃に５分間保ち、次いで、94℃で１分間、55℃で１分間、そして72℃で２分間、の工程30サイクルに付した。その結果得られたPC R産物をゲルで精製し、NdeI及びXhoIで消化して、NdeI/XhoIで消化されたpC1-ne oベクターへとクローニングした。得られたクローンは、5'HASc7/pC1#29と命名した。そのインサートは、HA融合タンパク質をコードしており、本明細書中、5' HAB2-1と称する。 B2-1 cDNAの3'端にPCRによってHAタグを付加し、次いでタグ付けしたcDNAをpC 1-neoへとクローニングした。使用したプライマーは、以下のSc7.HA3及びT7であった： 100μlのPCR反応において、以下の条件下で鋳型としてSEC7/pC1 #9 DNAを用いて、プライマーを使用した。試料は、94℃に５分間保ち、次いで、94℃で１分間、55℃で１分間、そして72℃で２分間、の工程30サイクルに付した。その結果得られたPCR産物をゲルで精製し、XhoI及びSalIで消化して、予めXhoI及びSalIで切断されたpC1-neoに連結した。構築体を、3'HA B2-1/pC1#29と命名し、それによってコードされるタンパク質は、3'HA B2-1と命名した。 B2-1 PHドメインを、5'Tsc7.S及び3'Sc7.Xbaプライマーを使用したPCRによってサブクローニングした： 100λのPCR反応において、以下の条件下で鋳型としてSEC7/pET #5 DNAを用いて、プライマーを使用した。試料は、94℃に５分間保ち、続いて94℃で１分間、50 ℃で１分間、そして72℃で２分間、の工程30サイクルに付した。その結果得られたPCR産物をゲルで精製し、Mlu1及びXba1で消化して、予めMluI/XbaIで切断された5'HA pC1-neo（MluI及びXbaIで5'HA B2-1/pC1 #29クローンを切断することにより調製）へとクローニングした。得られたクローンのインサートは、5'HA B2- 1 PHと本明細書で称するHA融合タンパク質をコードしていた。先ずPCRを使用することによって5'HA pC1ベクターへとIRP-1 cDNAをサブクローニングし、cDNAの5'端にMlu制限部位、及びクローンの3'端にSal1部位を付加した。使用したプライマーは以下の通りであった： 100μlのPCR反応において、以下の条件下で鋳型としてS3.3 DNAを用いて、プライマーを使用した。試料は、94℃に５分間保ち、続いて94℃で45秒間、50℃で45 秒間、そして72℃で１分間、の工程30サイクルに付した。PCR産物をゲルで精製し、Mlu1及びSal1で消化して、予めMlu1及びSal1で消化された5'HA pC1へ連結した。得られたクローンは、5'HA IRP-1/pC1 #15と命名され、それによりコードされるタンパク質は、5'HAIRP-1と命名された。 IRP-1 PHドメインを発現するために、クローン5'HA TS3/pc1 #3（実施例１）を使用した。 IRP-2は、先ずHAタグなしでPCRを用いてpC1-neoにクローニングした。使用したプライマーは以下の通りであった： 100μlのPCRにおいて、以下の条件下すなわち、94℃で１分間、50℃で１分間、そして72℃で１分間、の工程で30サイクル行うべく、鋳型としてクローン5'HAS1 2/pC1を用いて、プライマーを使用した。得られた増幅産物を精製し、EcoRI及び SalIで消化して、予め同じ２つの酵素で消化されたpC1-neoベクターへ連結した。得られたクローン#11を完全に配列決定し、元のクローンと同じであることが確認された。加えて、IRP-2及びIRP-2 PHドメインを、PCR（プライマーTS12.5（配列番号：１７）、TS12.3（配列番号：１８）及びS12.5（配列番号：１９））を使用して、5'HAタグと共にpC1-neoに別々にクローニングした。増幅反応のための鋳型DNAは、クローンS12であった。試料は、94℃に４分間保ち、続いて、94℃で１分間、52℃で２分間、そして72℃で２分間、の工程30サイクルに付した。得られた２つの増幅産物の各々を、MluI及びSalIで消化し、精製して、予めMluI及びSalIで消化しておいたpC1-neo HAベクターへと別々に連結した。クローンpC1-neo HA IRP-2 #8及びpC1-neo IRP-2 PH #5を配列決定し、鋳型のクローン内の対応する配列と同じであることを見出した。実施例４ β₂依存性細胞接着（ICAM-1に対する、トランスフェクトされたCOSまたはJY細胞の結合によって測定）及びβ₇依存性細胞接着（VCAM-1に対する、トランスフェクトされたJY細胞の結合によって測定）に対する、過剰発現しているIRPの影響を調べた。 CD11a/CD18をコードするベクターと、5'HA B2-1、3'HA B2-1、5'HA B2-1 PH、 5'HA IRP-1、5'HA IRP-1 PH、5'HA IRP-2、5'HA IRP-2 PH、またはpC1-neoベクター対照のうちの１つをコードするインサートを有するベクター（実施例３）とで、COS細胞をコトランスフェクトした。COS細胞は、トランスフェクションの２４時間前に、10 cm²のプレート当たり1.2ｘ10⁶細胞に分けておいた。次の日に、５ml DME M、２μlのクロロキン（0.25M）、30μlのDEAEデキストラン（CMF-PBS中、50mg/ ml）及び細胞へトランスフェクトされるべき10μgの各ベクターDNAを含むトランスフェクション混合物を、各プレートに対して準備した。およそ80％の周密度の COS細胞のプレートから生育培地を除去し、トランスフェクション混合物を添加した。プレートは、37℃にて２．５時間インキュベートした。吸引によってトランスフェクション混合物を除去し、そしてDMEM中10％のDMSO溶液を１分間で添加した（室温）。１分後に、吸引によってDMSOを除去し、10 mlの完全培地を添加した。トランスフェクトされたCOS細胞によるLFA-1及びIRPの発現は、様々な抗体を使用して確認した。すべてのトランスフェクト体は、CD18に対して陽性染色された。IRPトランスフェクト体はすべて、HAタグ特異的モノクローナル抗体150B OR 12CA5を使用して、HAエピトープに対して陽性に染色された。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクション後４８及び７２時間で、ICAM-1に対する結合能について調べた。接着アッセイのための細胞を調製するために、生育培地を吸引によって除去し、５mlのベルセン（versene）を３分間プレートに加え、次いで細胞を回収した。完全DMEM培地５mlを加え、次いで細胞懸濁液を５分間1,000 rpmにて回転して落とした。細胞を完全DMEMに再懸濁し、計数した。種々トランスフェクトを行った細胞を用いた接着アッセイを、以下の通りに行った。それぞれの96ウェルプレート（Corning、Cambridge、マサチューセッツ州）は、最初に炭酸塩緩衝液、pH 9.6中、５μg/mlタンパク質のICAM-1/FcまたはVCAM- 1/Fcのいずれか、50μl/ウェルで被覆して、4℃にて終夜インキュベートした。プレートは、ウェル当たり150 μlのPBSで２回洗浄し、1％BSAを含むPBSをウェル当たり150μl用いて室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキング剤の後、100μlの接着用緩衝液（10％の胎児ウシ血清を含むRPMI培地）を、室温にて接着用緩衝液に懸濁された、トランスフェクトされたJY細胞100μlと共に各ウェルに添加した。トランスフェクトされた細胞は、以下の通りに調製した。アッセイの前日に、ペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム及び10％胎児ウシ血清を補給したRPMI培地中、３ｘ10⁵細胞/mlの密度に、トランスフェクトされた細胞を分けた。一般的には２４時間インキュベート後まで、細胞の倍加を許容した。倍加後に、細胞を採収して、接着用緩衝液中で１ｘ10⁶細胞/mlの密度に再懸濁した。100μl中、およそ１ｘ10⁵の細胞を各ウェルに加え、被覆しながらプレートを室温にて３０分間インキュベートした。インキュベートに続き、CMF-PBS中14％のグルタルアルデヒドをウェル当たり5 0μl添加して、室温にて３０分間インキュベートすることによって細胞を固定した。インキュベーション後、脱イオン水でウェルを３回洗浄した。最後の洗浄に続き、吸引によって水を除去して、0.125％のクリスタルバイオレット（10％エタノール及び90％脱イオン水中1％の保存溶液として調製し、脱イオン水で0.125 ％に希釈して0.22ミクロンフィルターを通して濾過したもの）を含有する50μl の染色液を加えて、プレートを２分間インキュベートした。インキュベーション後に、前記の通りに脱イオン水でプレートを３回洗浄し、そしてウェル当たり20 0μlのエタノール溶液（95％エタノール２部及び脱イオン水１部）を添加した。１時間のインキュベーション後、570と590 nmの間の波長にて、ELISAリーダーでプレートを読み取った。トランスフェクション後４８時間では、B2-1 PHドメインのトランスフェクト体で、ベクターの対照トランスフェクト体に比して、LFA-1依存性の接着にある程度の減少が示された。IRP-2PHドメイントランスフェクト体の結合において顕著な減少があったが、全長のIRPクローンでは、pC1-neoベクター対照に比して、接着に有意な変化が示されることはなかった。トランスフェクション後７２時間では、ベクター対照に比して、４つのトランスフェクト体（3'HA B2-1、5'HA B2 -1、B2-1 PH、IRP-1PH）でICAM-1接着の50％の減少が示された。内在性のα₄β₇及びLFA-1を発現しているJY細胞を、IRP-1、IRP-2、B2-1、IRP -1 PH、IRP-2 PH、またはB2-1 PHのいずれかをコードするベクターで個々にトランスフェクトした。細胞は、標準プロトコルを使用し、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。手短に説明すると、各形質転換用に10⁷のJY細胞を回転して落とし、氷上に置いた。細胞をDPBSで濯いで再度回転させた。次いで、細胞を0.5 mlのDPBSに再懸濁し、エレクトロポレーション用キュベットに移した。各形質転換用混合物に30μgのDNA（DPBS中、１mg/ml）を添加した。形質転換用混合物を、穏やかに混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞は以下のパラメータ、すなわち、キャパシタンスエクステンダ作動、ボルト数:250 V、キャパシタンス:960μfを使用し、BioRad Gene Pulserを用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、形質転換体混合物は、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、細胞をT25フラスコに5 mlの完全RPMI 培地と共に入れた。トランスフェクション後３日目に、0.5 mg/mlの濃度にて培地にハイグロマイシンを添加した。トランスフェクション後１４日目に、接着アッセイを実施した。 IRPでトランスフェクトされたJY細胞によって、ICAM-1へのLFA-1依存性接着及びVCAM-1へのα₄β₇接着における減少が実証された。LFA-1及びα₄のレベルは、トランスフェクト体の間で有意に相違しておらず、従って、これらによって接着の減少が説明されることはない。かくしてIRPは、β₂またはβ₇インテグリン依存性接着のモジュレーションに対する、何らかの特異性を示すようである。JY細胞にて発現されたIRP-1は、β₂ 依存性の接着を優先的に減少させるらしく、一方IRP-2はβ₇依存性の接着をダウンレギュレートするようであった。B2-1トランスフェクト体は、β₂及びβ₇接着の双方ともを低下させたことが示されている。IRP-1、IRP-2、またはB2-1のPHドメインからなる欠切体の発現は、β₂及びβ₇依存性接着の双方ともを、概して減じさせるようであった。以下の表２を参照されたい。表中、「＋」は、接着の増大を表し、「−」は接着の減少を示し、そして「NS」は接着に有意差がないことを表す。これらの結果は、相違するアフィニティーを有するβ₂またはβ₇インテグリンと直接的または間接的に相互作用するIRPのアミノ末端部分と符合し、インテグリンの１つの型または他の型の選択的な調節を生じさせる結果を導くものと思われる。対照的に、PHドメインの機能及び相互作用は、相異なるインテグリンを調節する経路における共通のシグナリングエレメントであるのかもしれない。このエレメントは、ヘテロトリマー性GTP結合タンパク質（例えば、Ｇ_αβγ）PIP_n、プロテインキナーゼＣ（PKC）またはPHドメインの未同定のなんらかのリガンドであるかもしれない。この共通のシグナリングエレメントに結合するIRP PHドメインを破壊するアンタゴニストは、β₂、β₇ならびにおそらくはβ₁及びβ₃などの他のインテグリンの接着を広範に調節することが予測されよう。これに対し、インテグリンとIRPのアミノ末端の相互作用を破壊するアンタゴニストは、さらに特異的にインテグリン依存性の接着を調節することが予測されうる。インテグリン依存性細胞接着に対して最大限に活性化されていない白血球及び白血球細胞系は、フォルボールエステルPMAなどのPKCアゴニストによって活性化されることができる。PKC活性が細胞接着を誘導する機構は、あまり明確にされておらず、PKCは、アフィニティーすなわち親和力のアップレギュレーションや、細胞の扁平化（spreading）のために必要な細胞骨格の再構築に対してある程度の効果を有するかもしれない。しかしながら、インテグリン依存性接着のIRP ダウンレギュレーションに対するPKC活性化の効果は、PKCがIRPの下流または上流に機能するかどうかを示唆するかもしれない。前記の、JYトランスフェクト体のホルボール刺激が、LFA-1またはα₄β₇依存性接着をベクター対照レベルに復帰させることはあまりない。このように、調節性PKC基質は、IRPによって調節される経路における上流にあるか、または、インテグリン依存性接着の異なる経路もしくは局面をPKCが調節しているのかの、いずれかであろう。あるいは、IRPはインテグリン依存性接着の複数の局面を調節しており、PKCの刺激がこれらのうちの１つのみに効果を及ぼすのかもしれない。IRPは、インテグリンのアフィニティー、親和性（クラスター形成）（実施例４）、または膜の再利用に影響することによってインテグリン依存性の接着を調節するかもしれない。IRPを発現しているCOS細胞でLFA-1レベルが減少しているが、IRP PH ドメインを発現しているCOS細胞では減少しないことによって、インテグリン再循環における役割が示唆される。インテグリンの細胞表面発現に対してIRPが効果を奏するか否かを調べるために、α_Lβ₂、α₄β₇、またはICAM-2のいずれかをコードするDNAと共に、全長のI RP-1、IRP-2、またはB2-1のいずれかをコードするDNA（または、対照DNAベクターpC1-neoもしくは14-3-3θをコードするDNA）で、COS細胞をコトランスフェクトした。モノクローナル抗体ICA4.1（α₄に対して免疫特異性）、TS1/22（α_Lに対して免疫特異性）、3S3（β₁に対して免疫特異性）、または92C12F（ICAM-2に対して免疫特異性）を使用して、表面発現に対する細胞染色（蛍光強度及び陽性細胞の百分率）を行った。β₁は、COS細胞にて内在性に発現されており、β₁をコードするDNAは、トランスフェクションのために必要でなかった。以下の表３に示す結果より、細胞表面上のインテグリンを除去して置換する、 de novoの生合成または再循環プロセスのダウンレギュレーションをおそらくは介して、IRP-1によってα_Lβ₂インテグリンの細胞表面発現が減じられることが示唆される。上述の通り、異なるファミリーメンバーは、インテグリン依存性接着に対して反対の効果を有する可能性がある。このような反対の効果は、インテグリン結合を調節する、異なるエフェクターまたはシグナリング経路と相互作用しているIR Pに符合するものである（後述）。これらの経路における冗長性によって、なぜI RPの過剰発現に起因して、IL-8によって誘導可能な接着が一部のみ阻止されるのかが、部分的に説明されるかもしれない。加えて、IRP-1過剰発現に伴う接着の減少は、別のIRPの前接着性（proadhes ive）活性に拮抗するIRP-1に起因するのかもしれない。B2-1（サイトヘシン（cy tohesin）-1）の前接着性活性は、JY-8細胞に独自ではなく（実施例５）、Jurka t T-リンパ系細胞における過剰発現でも観察されている（Kolanusら、Cell、86 巻、233〜242頁(1996)）。しかしながら、JY-8細胞に比較して、Jurkat細胞における発現は、α_Lβ₂結合を誘導した。しかして、B2-1は細胞型特異的に、α₄β₇ またはα_Lβ₂のいずれかの結合を誘導するかもしれない。特定のインテグリンの結合特性が細胞型で変化しうるということから、これは驚くに値しないことである（Chanら、Ｊ.Cell.Biol.、120巻、537〜343頁(1993)、Kassnerら、J.Exp.Med .、178巻、649〜660頁(1993)）。次に、ICAM-1に接着性のJY-8（実施例５）トランスフェクト体において、IRP/ GFP融合タンパク質の細胞下局在性を調べた。ガラススライドをICAM-1/Fc（10μ g/ml）を含む50 mM重炭酸塩緩衝液、pH 9.6で、4℃にて１８時間被覆し、続いて 10％FBSを含むRPMI培地で濯いだ。GFP/IRP融合体タンパク質を発現しているJY-8 トランスフェクト体を、ICAM-1を被覆したガラススライド上に接着させた。 IRP/GFP融合タンパク質の細胞下分布を調べるため、及び細胞細胞内局在で、I RP-1のいずれの領域が見出されるかを同定するために、JY-8トランスフェクト体を、蛍光共焦点顕微鏡によって調べた。IRP-1、IRP-2及びB2-1は、ICAM-1に這行する（crawl）細胞の先端皮層細胞骨格領域に主に局在していた（実施例８参照）。IRP-1のPHドメインは、原形質膜領域に局在していたが、一方Sec7ドメインは、より拡散した、細胞質での局在を示していた。GFPを発現するトランスフェクト体では、細胞質で拡散した蛍光発生が認められた。これらの結果、原形質膜への局在を支持する PHドメインは、他のドメインと共に機能して、野生型のIRPを先端に局在化させることが示唆される。層板形成（lamelli formation）の際のIRPの分布を調べるために、ICAM-1に這行する、JY-8 IRP-2/GFPトランスフェクト体の経時撮影像を分析した。IRP-2融合トランスフェクト体は、IRP-1またはB2-1トランスフェクト体に比べて化学走性移動のレベルが高いことが示されるので、IRP-2を過剰発現しているJY-8細胞を選択して、IL-8に応答して移動することができる細胞における局在性を調べた。IRP-2は、層板形成の部位で、且つその形成前に、JY-8細胞の一端に沿って濃縮することが見出された。経時撮影像から、その発生に付随して、IRP-2は層板に再び局在化することが示される。かように、IRP-2はごく初期に、且つ層板足部（lamellipodia）伸長時にわたって存在している。 IRPは、移動する細胞の先端におけるインテグリン機能の支持において役割を果たすようである。別々に発現した場合に、Sec７ドメインが拡散性に位置し、P Hドメインは膜に一律に局在しているので、この局在化はSec7及びPHドメインの双方の相互作用に依存しているらしい。PHドメインの相互作用が、IRP及びADPリボシル化因子（ARF）を含む複合体の機能的な膜局在化を支持するのかもしれない。ARNO（本出願の優先権主張出願後に発表された、IRP-1であるかもしれないタンパク質）GTP交換因子（GEF）活性が、PHドメインへのホスファチジルイノシトール結合によって刺激される（Chardinら、Nature、384巻、481〜484頁(1996) ）ので、ARFは、この部位で活性化状態になることができる。膜輸送におけるARF の役割によって、移動している細胞の先端への、及びかかる先端からのインテグリンの局在化を、ARFが媒介することができることが示唆される。これは、先端部における偏った（polarized）エキソサイトーシスが、細胞の移動運動（locomotion）における重大な役割を果たすかもしれないという知見（Bretcher、Cell、87巻、601〜6 06頁(1996)）に一致するものと考えられる。加えて、ARF GTP交換の阻害剤であるBrefeldin Aは、創傷癒合モデルにおける層板形成及び繊維芽細胞の移動を阻害する（Bershadskyら、Proc.Natl.Acad.Sci ．U.S.A.、91巻、5686〜5689頁(1994)）。B2-1は、β₂の細胞質ドメインに直接結合することが報告されている（Kolanusら、Cell、86巻、233〜242頁(1996)）。しかして、IRPは、インテグリンに結合して、化学走性の１以上の工程において機能するかもしれないrasスーパーファミリーのメンバーを活性化しうる。インテグリン親和性における役割も、示唆される。ARF及び、rasスーパーファミリーの他のメンバーであるRhoAは、共同的に作用して、ホスフォリパーゼＤ（ PLD）を活性化する（Kuribaraら、J.Biol.Chem.、270巻、25667〜25671頁(1995) ）。PLDは、異なる細胞型において様々なアゴニストによって活性化され、そしてホスファチジルコリンを切断し、コリン及びホスファチジン酸を生産する（Bo manら、Trends Bio.Chem.Sci.、20巻、147〜150頁(1995)）。ホスファチジン酸は、精製されたインテグリンGPllblllaのフィブリノーケンへの結合を増加させることが示されており、他の負に荷電した様々な脂質ではそのようなことはなかった（Smythら、J.Biol.Chem.、267巻、15568〜15577頁(1992)）。IRPは、インテグリンの膜局在性または親和性を変化させるシグナリング経路における調節因子としても機能する。近年、ARNOは、GDP/GTP交換を誘導し、しかして、rasスーパーファミリーのメンバーで、ARF-1を活性化することが報告されている（Chardinら、Nature、384巻、481〜484頁(1996)）。６つの既知のARFがあり、そして、45〜60％のアミノ酸の同一性を保持するさらに４つのARF様タンパク質がある（Bomanら、Trends Bio.Chem.Sci.、20巻、147〜150頁 (1995)）。ARFは、ゴルジ、小胞及び原形質膜に局在し、膜輸送、エンドサイトーシス及びエキソサイトーシスに関係している（D'Souza-Schoreyら、Science、 267巻、1175〜1178頁(1995)、Petersら、J.Cell Biol.、128巻、1003〜1017頁(1 995)、Bomanら、Trends Bio.Sci.、20巻、147〜150頁(1995)）。IRPは従って、ホスファチジン酸の局所的な増大を調節し、変わって、PKCアゴニストのジアシルグリセロール（DAG）への転換を通じて直接的または間接的にインテグリン結合をアップレギュレートするのかもしれない。実施例５ N-末端mAbエピトープタグを持っている、IL-8に対する機能性受容体を安定に発現するJY細胞系をつくった。この細胞系を、本明細書中では「JY-8」と称する。α_Lβ₂依存性接着における役割を調べるために、JY-8細胞系にてIRPを過剰発現させた。JY-8細胞は、通常は１つのβ₂インテグリン、α_Lβ₂及び、１つのα₄ インテグリン、α₄β₇インテグリンを発現している（Chanら、J.Biol.Chem.、26 7巻、8366〜8370頁(1992)）。IRP発現構築体は、以下の段落に記載する通りに、 IRP-1、IRP-2及びB2-1の野生型配列のアミノ末端に融合された緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いて作製した。緑色蛍光タンパク質（GFP）IRP融合タンパク質に対する発現構築体は、以下のようにして調製した。発現ベクターpCEP4（Invitrogen、San Diego、カリホルニア州）を、NheI及び BamHIで消化した。pEGFP（Clontech、Palo Alto、カリホルニア州）からの、Nhe I及びBamHIで消化された、GFPをコードするDNA断片は、NHeI/BamHIで消化された pCEP4に連結された。得られたプラスミド、pCEP4/GFPを、IRP融合構築体をつくるために使用した。 pCEP4/GFPにIRP DNA断片をサブクローニングするために、PCR反応を行い、その後に行う枠内での連結のため、断片の端部にXho I及びHind III制限酵素部位を付加した。 PCRのために、以下のプライマー対を使用した： IRP-1 GFP融合体用に、加えて、オリゴヌクレオチド：でMuta-Gene ファージミドin vitro変異誘発キット（バージョン２、BioRad、He rcules、カリホルニア州）を使用してアミノ酸置換変異体を作製した。S3.GFP.X ho.5及びS3.GFP.H3.3のプライマーを用いた変異体cDNAのPCR増幅を行って、GFP 融合体のために適切な制限酵素部位を作製した。得られたPCR産物をpCEP4/GFPのXhoI及びHindIII部位に連結した。大腸菌XL1 B lue形質転換体から単離されたクローンを、配列決定によって確認した。すべての発現ベクターは、融合タンパク質のアミノ末端にGFPを持つIRP/GFP融合タンパク質をコードするように設計された。発現構築体を用いてエレクトロポレーションを行うことにより、JY-8細胞をトランスフェクトし、トランスフェクト体は、ハイグロマイシンＢ（0.5 mg/ml、Calbiochem、San Diego、カリホルニア州）を使用して選択した。加えて、Sec7またはPHドメインにおけるアミノ酸置換を有するIRP-1 GFP融合タンパク質を作製した。第156位でのアラニンのグルタミン酸への置換（E156/A ）は、Arabidopsisタンパク質、EMB30のSec7ドメインでの、細胞接着に対するこの変異の効果（Shevellら、Cell、77巻、1051〜1062頁(1994)）に基づいて選択した。同様に、PHドメインにおける置換（R279/A）は、X-関連無ガンマグロブリン血症（XLA）を惹き起こすBTKのPHドメインにおいて同定された変異（Yaoら、P roc.Natl.Acad.Sci U.S.A.、91巻、9175〜9179頁(1994)）に基づいて選択したが、これはPKC（Yaoら、Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.、91巻、9175〜9179頁(1994)）及びイノシトール1,3,4,5-テトラキスホスフェート（IP₄）（Fukudaら、J.Biol. Chem.、271巻、30303〜30306頁(1996)）結合に重要であるかもしれない。GFPに融合されたIRP-1のSec７ドメインまたはPHドメインのいずれかを含む欠切体も作製した。イムノブロッティングによって、IRP/GFP融合タンパク質が、すべてのJY-8細胞トランスフェクト体にて、同様のレベルで発現されていることが示された。融合タンパク質の発現を確認するために、JY-8トランスフェクト体の界面活性剤溶解物のイムノブロッティングを、IRP-1、B2-1、IRP PHドメイン及びGFPに対して特異的な抗体を用いて行った。SDS-PAGEでのGFP融合タンパク質の移動は、それらの予測サイズと一致していた。加えて、融合タンパク質は、GFP抗体のみならず、適切なIRP-1、B2-1またはPHドメイン特異性mAbに結合した。内在性IRP-1及びB2-1も、JY溶解物で検出された。いくつかのブロッティングから見積もったところ、すべての７つの融合タンパク質が、内在性IRP-1及びB2-1のレベルより少なくとも１０倍高いレベルで発現されることが示唆された。インテグリン依存性の細胞接着は、様々な刺激によって誘導可能である（Diam ond及びSpringer、Curr.Opin.Biol.、4巻、506〜517頁(1994)）。接着を誘導するための既知の刺激には、IL-8などのＧタンパク質結合ケモカイン受容体に対するアゴニスト、またはPMAなどのPKCに対するアゴニストが包含される。これらの刺激は、インテグリン依存性の接着を増加または安定化するように、細胞骨格の構築及びインテグリンのクラスター形成を調節しうる、シグナリング経路を活性化する。PMAなどのケモカイン及びアゴニストは、接着を増大させるため、または in vitroアッセイでの接着の最高レベルを調べるために、慣例的に利用される。 ICAM-1またはVCAM-1へのIRP/GFP融合タンパク質結合を測定する接着アッセイを、Morlaら、Nature、367巻、193〜196頁(1994)の変法を使用して、96ウェルの Easy Washプレート（Corning）にて実施した。各ウェルを、ICAM-1/Fc（5μg/ml ）またはVCAM-1/Fc（2μg/ml）を含む50 mM重炭酸塩緩衝液（pH 9.6）50μlで被覆した。100％の投入細胞結合を定量するためにCD18 mAb（22F12C、ICOSコーポレイション）で、またはバックグラウンドの結合を調べるためにBSAブロックで、所定のウェルを被覆した。室温にて１時間、1％BSAを含むPBSでプレートをブロッキングした。次いで、ウェルを濯ぎ、PMA（20 ng/ml）またはIL-8（25 ng/m l）を含むかまたは含まない、200μlの接着用緩衝液（5％FBS、5 mM KCl、150 m M NaCl、1 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂、20 mM HEPES、10 mM D-グルコース）を添加した。次いで、JY-8細胞（5 x 10⁶/mlの100μl）を各ウェルに添加し、プレートを5％CO₂中で37℃にて５または30分間インキュベートした。10％のグルタルアルデヒド溶液50μlを添加して接着細胞を固定し、0.5％のクリスタルバイオレット（SIGMA）溶液で染色した。洗浄して70％エタノールを加えた後、SPECTRAmax（商標名）250 Microplate Spectrophotometer System（Molecular Devices）を使用して570 nmでの吸光度を測定することにより、接着細胞を定量した。以下の式を使用して、接着細胞の百分率を決定した：固定化されたICAM-1またはVCAM-1へのJY-8トランスフェクト体の接着は、IL-8 またはPMA刺激下だけでなく、無刺激の静的条件下でも測定した（基底レベルの結合）。基底レベルの結合に比べて、GFPのみを発現しているJY-8細胞（対照）は、IL-8の存在下に、ICAM-1への結合の３〜４倍の増大及びVCAM-1への結合の２倍の増大を示した。VCAM-1へのIL-8で誘導可能な接着は、５分で認められたが、５分から３０分の間の基底レベルの結合の上昇により、刺激された場合の結合と刺激されない場合の結合との差は減少した。引き続いて３０分間アッセイを行った。PMA処理の結果、ICAM-1及びVCAM-1への接着が４倍以上増加した。IRP-1を過剰発現しているJY-8トランスフェクト体は、同等かそれ以上のレベルのGFPを発現している対照のトランスフェクト体に比べて、ICAM-1への結合が40〜50％減少していることが示された。この減少は、基底及びIL-8で刺激された接着に対しては明らかであったが、PMAで誘導された接着に対しては明示されなかった。IRP-1 を過剰発現しているJY-8トランスフェクト体のVCAM-1への結合も、IL-8刺激の条件下ではおよそ40％減少し、基底またはPMAで刺激された条件下では減少しなかった。これらの結果から、IRP-1はケモカインに優先的に作用するが、PMAで刺激された接着に対しては作用せず、そしてIRP-1の過剰発現が概して細胞を接着に対して無力化させることはないことが示唆される。接着の阻害に対する、異なるIRP-1ドメインの寄与を調べるために、アミノ酸置換及び欠失変異体を発現するJY-8細胞を試験した。Sec7及びPHドメインにおけるアミノ酸置換は、接着に対するIRP-1過剰発現の効果を排除した。IRP-1 Sec7 ドメイン変異体E156/A、及びPHドメイン変異体R279/Aを発現しているトランスフェクト体は、GFPを発現しているJY-8細胞のレベルと同等に、ICAM-1及びVCA M-1との結合のレベルを示す。加えて、IRP-1Sec7またはPHドメインの発現はそれぞれ、野生型IRP-1ほど有効にICAM-1またはVCAM-1のいずれかへの結合を減少させることはなかった。このように、Sec7及びPHドメインの双方は共に機能して、 ICAM-1及びVCAM-1へのIL-8で刺激された接着を調節する。 IRP-1に加えて、IRP-2及びB2-1過剰発現のJY-8接着に対する効果を調べた。IR P-2を過剰発現しているJY-8トランスフェクト体は、GFPトランスフェクト体に比べて、ICAM-1への結合の基底レベル、またはICAM-1及びVCAM-1へのIL-8で誘導される結合のレベルが、およそ20％、微弱に減少していることが示された。これに対し、B2-1を過剰発現しているトランスフェクト体は、IL-8で刺激されるICAM-1 に対する結合は対照レベルであるが、VCAM-1への結合は一貫しておよそ50％増加されることが示された。このように、IL-8で刺激される、VCAM-1に対する接着におけるB2-1過剰発現の効果は、IRP-1及びIRP-2の効果と逆であり、そしてα₄β₇ /VCAM-1相互作用に対して選択的である。 ICAM-1及びVCAM-1に対するJY-8接着の、IRPの過剰発現に伴うモジュレーションは、α_Lβ₂またはα₄β₇の細胞表面レベルの変化に帰することはできない。GF Pを発現しているトランスフェクト体に比して、IRPを過剰発現している、相違するJY-8トランスフェクト体でのα_Lβ₂またはα₄β₇の発現の量には、比較的わずかな差しかなかった。IRP-1 Sec7を過剰発現しているJY-8細胞では、α₄β₇の発現がある程度減少しており、これらの細胞がVCAM-1に対する接着の減少を示すことはなかった。実施例６インテグリンα₄β₇は、流動条件下で、内皮細胞リガンドのVCAM-1及びMadCAM -1へのリンパ球の付着及び回転接着を媒介することができる（Berlinら、前出(1 995)）。α₄β₇で媒介される細胞付着及び回転をIRP発現がもたらすのか否かを調べるために、流動条件下でのJYトランスフェクト体の結合を定量した（Berlin ら、前出(1995)）。加えて、IRP発現に起因するα₄β₇の親和性における可能な変化を調べるために、流動条件下での細胞結合を、静的接着の次に実験した。内在性のα₄β₇を発現するJY細胞を、全長のIRP-1（JY_IRP-1）、IRP-2（JY_IRP _-2 ）、またはB2-1（JY_B2-1）をコードする配列、またはベクター対照DNA（JY_VEC ）のいずれかでトランスフェクトし、固定化されたVCAM-1/イムノグロブリン（V CAM-1/Ig）キメラタンパク質を含む流動システムループへと導入した（Vonderhe ideら、J.Cell.Biol.、125巻、215〜222頁(1994)）。初期の流速は、３ダイン/c m²であり、これを１分間維持した。次の５分間は、流速を1.5ダイン/cm²に下げたが、この間JY_VECトランスフェクト体及びJY_B2-1トランスフェクト体（低度）で、付着及び回転を行う能力が示された（図２）。IRP-1またはIRP-2、JY_IRP-1 及びJY_IRP-2のいずれかでトランスフェクトされた細胞は、全く、またはごくわずかしか付着しなかった。次に、トランスフェクトされた細胞を、流動なしで、固定化リガンドの存在下にインキュベートし、この際には、JY_IRP-1/VCAM-1またはJY_IRP-2/VCAM-1結合の許容は不充分であった。静的結合の後に、次なる４．５分間にわたって、流速を 1.5から9ダイン/cm²に漸増的に高めた。JY_B2-1及びJY_VECの結合は双方とも、流速が3ダイン/cm²に到達するにつれて減少した（図２）。２つのタンパク質に対する結合の、類似した減少速度から、IRP-3及びVECに対する類似の結合親和性が示唆される。アッセイの結果から、IRP-1及びIRP-2発現によって、流動及び短期の静的条件下でのVCAM-1に対するα₄β₇の結合能が排除されることが示唆される。しかしながら、B2-1の発現は、付着及び回転の効率を低下させるのみであるらしい。 ICAM-1に対する内在性LFA-1の結合に対する、IRP-1及びIRP-2発現の効果を調べるために、前記のごとくトランスフェクトされたJY細胞を、ICAM-1が固定化カウンター受容体であることを除いては同様のアッセイにて利用した。JY_B2-1細胞以外のトランスフェクトされたJY細胞はすべて、1.5ダイン/cm²にてICAM-1上に付着及び回転した。付着の効率は、しかしながら、α₄β₇/VCAM-1結合に比して低下していた（図３）。ICAM-1への接着はJY_IRP-1細胞（結合は増加したが、最高値は低かった）を除くすべてのトランスフェクト体について、静的結合の１分後に顕著に増加した。静的結合後に流速を高めるにつれて、JY_IRP-1、JY_B2-1及びJY_VEC細胞のICAM-1結合は減少した。JY_IRP-2細胞結合は、しかしながら、7.5 ダイン/cm²の流速まで結合が検出されたので、流速の増大に最も耐性であると考えられた。これらの結果から、流動条件下でのICAM-1に対するLFA-1の付着をB2- 1発現が排除すること、静的条件下でのLFA-1/ICAM-1結合をIRP-1が低下させること、及びLFA-1とICAM-1との間の高い親和性結合をIRP-2発現が支持することが示される。実施例７ IRP-1及びB2-1に特異的なモノクローナル抗体を作製するために、Hisでタグ付けした、大腸菌より発現及び精製されたIRP-1及びB2-1で、マウスを免疫付与した。IRP-1及びB2-1のコード領域を、ヒスチジンタグをコードする配列に対してＣ末端に、pET15b（Novagen、Madison、ウイスコンシン州）へとフレーム内に連結し、こうしてIRP-1及びB2-1タンパク質が、N-末端にヒスチジンタグ付けされたタンパク質として大腸菌株BL21lysSにて発現されるようにした。組換えタンパク質は、標準法によって精製した（Qiagen、Chatsworth、カリホルニア州）。 Tjoelkerら、J.Biol.Chem.、270巻、25481〜25487頁(1995)、に概して記載される通りに、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマシリーズ200について、６から１２週齢の５匹のBalb/cマウスを、それぞれ、第０日に予備採血し、次いで完全フロインドアジュバント中に懸濁された、大腸菌で生産された67μgのH isB2-1で皮下に免疫付与した。第２１日に、不完全フロインドアジュバント中、 25μgのHisB2-1で、各マウスを追加免疫した。第３４日に試験用の血液採取を行い、ウェスタンブロッティングによって試験した。10％の還元SDS-PAGEから、10 0 ngのHisB2-1タンパク質をPVDFに転写し、次いで小片に切断した。3％BSA、0.2 ％Tween 20を含むCMF-PBSで大気温にて１時間、ブロットをブロッキングした。免疫前の血清及び免疫血清を１：500にブロッキング緩衝液中で希釈し、そしてその小片と共に２時間、大気温度でインキュベートした。小片は、2％Tween 20 を含むCMF-PBSで３回洗浄し、次いでヤギ抗マウス(Fc)-HRPと共に１時間インキュベートした。４回洗浄した後に、小片はRenaissance 化学発光試薬（NEN）で発色させた。マウス#2413に、第４５日に25μgのHisB2-1タンパク質を含むCMF-P BSで腹腔内に最終の追加免疫を行い、４日後に脾臓を摘出した。ハイブリドーマシリーズ233については、６から１２週齢の５匹のBalb/cマウスを、それぞれ、第０日に予備採血し、次いで完全フロインドアジュバント中に懸濁された、大腸菌で生産された30μgのHisIRP-1で皮下に免疫付与した。第２２日に、不完全フロインドアジュバント中、10μgのHisIRP-1及び、第４５日に５μgのHisIRP -1で、各マウスを追加免疫した。第５５日に試験用の血液採取を行い、HisIRP-1 及びHisIRP-2に対するウェスタンブロッティングによって試験した。マウス#252 0は、第１３３及び１３４日にそれぞれ、50μgのHisIRP-1を含むCMF-PBSで腹腔内に追加免疫を行い、第１３７日に脾臓を無菌的に摘出した。融合は、下記の通りに行った。概説すると、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、 100単位／mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した無血清のRPMI 1640（RPMI）(ギブコ(Gibco)、カナダ)の中に沈めた２枚のガラス顕微鏡スライドの磨りガラス状の（frosted）端部の間で脾臓を擦り潰すことによって、単一細胞の懸濁液を形成した。細胞懸濁液を、70メッシュの滅菌したNitex細胞濾過器（Becton Dickinson、Parsippany、ニュージャージー州）を通して濾過し、そして、200× ｇで５分間遠心分離して、濾過物を２度洗浄し、そのペレットを、20 mlの無血清RPMI中に再懸濁した。３匹の未処置Balb/ cマウスから摘出した胸腺細胞を、同様に調製した。 NS-1ミエローマ細胞を、11％のFetalclone血清(FBS)(Hyclone Laboratories社、Logan、ユタ州)を含むRPMI中にて融合の前に対数増殖期に３日間保持しておき、200 gで５分間遠心分離して、ペレットを前の段落に記載の通りに２回洗浄した。洗浄後、各細胞懸濁液は無血清RPMIにて最終容量10 mlとし、計数した。脾臓細胞は、5：1の割合でNS-1細胞と合わせ、遠心分離してその上清は吸引した。細胞ペレットを変位させ、37℃のPEG 1500（75mM Hepes、pH 8.0中、50％）、（Boehringer Mannheim）2 mlを、1分間にわたってかき混ぜながら加え、続いて、さらに無血清RPMI 14mlを7分間かけて加えた。さらに16mlのRPMIを添加し、200 ｇで10分間細胞を遠心分離した。上清を廃棄した後、ペレットは、15％FBS、100μMヒポキサンチンナトリウム、0.４μM アミノプテリン、16μM チミジン(HAT)(Gibco)、 25単位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)及び1.5×10⁶個の胸腺細胞/mlを含む、20 0mlのRPMI中に再懸濁した。懸濁液を、96ウェルの平底組織培養プレート（Corni ng、連合王国）へ、ウェル当たり200μlで分配した。プレート中の細胞には、18 Ｇの針（Becton Dickinson）を用いて各々のウェルからおよそ100μlを吸引し、そしてウェル当たり100μlの培養用（plating）培地（10単位/mlのIL-6を含み胸腺細胞を欠いている以外は、前記に同じ）を加えることによって、スクリーニングの前に３から５回、栄養を供給した。融合200からの上清は、先ず、免疫原についてELISAによってスクリーニングされ、ヤギ抗マウスIgG(fc)セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合物で検出を行った。最高のシグナルを与える３０のウェルからの上清を、免疫原についてのウェスタン分析によって再検査した。アッセイの結果に基づき、さらなるクローニングのために９つの融合ウェルを選択した。９つのウェルは、200Aから200Iまでと、命名した。融合233からの上清は、先ず、HisIRP-1及びHisIRP-2が被覆されたプレートでのELISAによって調べた。HisIRP-1と反応して、HisIRP-2とは反応しないウェルからの融合体を、さらなるクローニングのために選択した。これらの融合細胞は、引き続き、15％FBS、100μMヒポキサンチンナトリウム、16μM チミジン、及び10単位/ml IL-6を含むRPMIを使用して、連続的にサブクローニングした。サブクローニングは、二倍希釈または限界希釈（ウェル当たり0.5〜1.0細胞にて96ウェルプレートに播種することによる）のいずれかによって実施した。サブクローンプレートのウェルは、目視的に評点し、最少密度のウェルでのコロニー数を記録した。各クローニングの選択されたウェルを、前記の通りにELISAまたはウェスタンブロットによって、元の融合ウェルにて観察された反応性について調べた。クローニングは、細胞系200A、200B、200F、200H、200G、233E、233G、及び233Kに対して完遂した。８つのハイブリドーマ細胞系からの抗体を、IRP-1、IRP-2、及び B2-1と反応させることによってウェスタンブロッティングを実施した。Isotrip キット（Boehringer Mannheim）またはイソタイプ特異的試薬（Zymed Laborator ies、South SanFrancisco、カリホルニア州）を使用したELISAのいずれかを用いて、８つのハイブリドーマ細胞系からモノクローナル抗体に対するイソタイプを決定した。IGg2aイソタイプである200Gを除いて、すべての抗体はIgG1である。ハイブリドーマ細胞系200A、200B、及び233Gは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。 mAbの233シリーズを、ウェスタンブロッティングにてスクリーニングするために、ハイブリドーマ上清を使用することによりさらに試験した。概説すると、GF P/IRP-1、GFP/IRP-2またはGFP/B2-1のいずれかでトランスフェクトされたJY-8細胞（実施例５を参照されたい）を、1％のCHAPS緩衝液にて溶解した。氷上で３０分間かけて細胞を溶解し、次いで１０分間、12,000 rpmで遠心分離した。試料用緩衝液を上清に添加し、試料を４分間煮沸した。試料を8％のNovexゲルにかけ、そしてPVDF膜に転写した。膜は、3％BSAを含有するTST（25mM Tris、pH 8.0、15 0 mM NaCl、0.2％Tween-20）中で１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、結合用緩衝液（3％BSAを含むTST）にて１：20に希釈したハイブリドーマ上清と置換して、室温にて１時間インキュベートした。膜を、TSTで充分に洗浄し、次いで、室温にて３０分間、HRPが接合されたヤギ抗マウスIgG Fc断片（Jackson ImmunoResearch）とインキュベートした。TSTで洗浄した後、ECL検出のためにRenaissanceキット（NEN）を使用し、膜をHyperfilm（ Kodak）に露光した。233A、233D、233G、233K、及び233Lからの上清はすべて、G FP-Irp-1溶解液中のおよそ77 kDaのサイズのバンドを特異的に認識し、GFP-IRP- 2またはGFP-B2-1溶解液ではこれは認められなかった。233Gを使用した場合のシグナルが最も強かった。前記と同様の方法を使用して、精製された200A及び200B mAbは、ウェスタンブロッティングを用い、JY-8トランスフェクト体の溶解液からのGFP-IRP融合タンパク質を検出する能力について試験された。双方のmAbとも、ウェスタンブロッティングで、1μg/mlにて使用した。mAb 200Aは、GFP-Irp-1、GFP-IRP-2及びGFP -B2-1を同等の良好さで認識し、一方、200Bは、優先的にGFP-B2-1を認識して、G FP-Irp-1の認識は微弱であった（B2-1の場合に認められるレベルの10％未満）。 IRP-1欠切体の、GFPでタグ付けされたPHドメインを発現しているJY-8トランスフェクト体の溶解液を含む、別のウェスタンでは、IRP-1、IRP-2及びB2-1の相同性のPHドメインにおける共通のエピトープを200Aが認識することを示唆する、GFP- IRP-1 PHドメイン欠切体に対して適切なサイズのバンドが200Aによって検出された。 ELISAによる組換えタンパク質に対する特異的な反応性について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。加えて、IRP-1、IRP-2及びB2-1の大腸菌で発現されたタンパク質を含むウェスタンブロットへの反応性によって、特異性を調べた。mAb 200A（IRP-1、IRP-2及びB2-1 PHドメインに対して反応性）、233G（IRP-1に対して反応性）及び200B（B2-1に対して反応性）を使用して、JY-8 IRPトランスフェクト体におけるGFP-IRP融合タンパク質の発現レベル及びサイズを調べた。 JY-8トランスフェクト体のインテグリン発現レベルを調べるために、標準的な間接免疫蛍光法により、α_Lβ₂に対して特異的なmAb、TS1/22（ATCC）、及びα₄ に対して特異的なmAb、IC/A4.1（ICOSコーポレイション）で細胞を染色した。蛍光は、FACS scanを使用したフローサイトメトリーによって定量した。実施例８化学走性は、基質への初期の接着ならびに偏った細胞における結合及び遊離の相を通ってのインテグリンの循環を必要とするばかりでなく、先端へのトレーリングからのインテグリンの再循環も必要とするものである。静的接着に加えて、他のインテグリン機能にIRPが効果を及ぼすか否かを調べるために、化学走性に対するIRPの役割を、化学走性移動アッセイによって調べた。このアッセイで、J Y-8細胞は、IL-8の供給源に対して、インテグリン及びCAM依存性の態様にて移動する。アッセイは、Schreinerら、Immunol.、88巻、89〜96頁(1980)によって報告されたアガロースでの細胞の移動に対する方法の変法であった。概説すると、６ウェルのプレート（Falcon）を、重炭酸塩緩衝液（pH 9.6）中の、ICAM-1/Fc（25 μg/ml）またはVCAM-1/Fc（10μg/ml）（ICOSコーポレイション）のいずれかで被覆した。0.5％BSA（Intergen）を含有するRPMI中に1％アガロースを載せた後、プレートを4℃にて３０分間インキュベートした。細胞をRPMIで洗浄し、0.5％ BSAを含むRPMI中に5 x 10⁷/mlで再懸濁した。2.5 mmのゲルパンチャー（Pharmac ia）を使用することによってアガロースにウェルを形成し、直ちに10μlのIL-8（2.5μg/ml）（PeproTech）または細胞懸濁液で満たした。プレートは、5％CO₂中で37℃にて８時間インキュベートした。次いで、2％グルタルアルデヒド溶液を添加することによって、細胞を固定した。アガロースを除去した後、蒸留水でウェルを濯ぎ、乾燥させた。細胞移動の定量は、Diaphot顕微鏡（Nikon、東京、日本）、CCD- 72ビデオカメラ及びDSP2000デジタルプロセッサ（Dage、Michigan City、インディアナ州）及びMacintosh（商標）NIH Imageプログラム（米国国立衛生研究所（ NIH）で開発され、zippy.nimh.nih.govからの匿名のファイル転送プロトコル（F TP）によってインターネットより、または、National Technical Information S ervice、Springfield、バージニア州、パーツ番号PB95-500195GEIよりフロッピーディスクで入手可能）からなるビデオ顕微鏡ワークステーションを使用して実施した。 GFP/IRP融合タンパク質を発現しているJY-8細胞の化学走性を、前記の通りに定量した。JY-8細胞におけるIRP-1、IRP-2及びB2-1の過剰発現によって、GFPを発現しているトランスフェクト体に比して、ICAM-1またはVCAM-1についての化学走性が減少した。IRP-1 PHドメイン置換変異体R279/Aの発現もまた、化学走性を減少させた。しかしながら、R279/Aの発現によれば、野生型のIRP-1の発現よりも化学走性の減少の有効性は低かった。IRP-1 PHドメインの発現によって、ICAM -1及びVCAM-1についての化学走性も減少した。これらの結果から、IRP-1 PHドメインが、IRP-1によって介される化学走性の減少において主要な役割を果たしていることが示唆される。IRP-1 Sec7ドメインでの置換体E156/Aもまた、化学走性の減少を惹起こしたが、野生型のIRP-1過剰発現の場合に観察されたよりも減少の程度は低かった。IRP-1 Sec7ドメインの過剰発現の結果、ICAM-1についての化学走性の増加が惹起こされたが、VCAM-1については化学走性の変化が観察されることはなかった。これらの結果、Sec７ドメインもまた、化学走性に寄与しうることが示唆される。このように、IRP-1のSec7及びPHドメインの双方ともが、α₄β₇及びα_Lβ₂依存性の化学走性移動において機能している。前記のごとく、化学走性に対するIRP-1過剰発現の阻害効果は、Sec7（E156/A ）及びPH（R279/A）ドメインでの置換によって減じられ、従って、接着をもって、双方のドメインが化学走性のIRP-1調節に寄与することが示唆された。野生型に比して、IRP-1 R279/Aを発現しているJY-8トランスフェクト体の化学走性移動が増加すること、及びIRP-1 PHドメインの発現でほぼ完全に阻止されることから、PHドメインが化学走性において主要な役割を果たすことが示唆されるものである。従って、IRP-1 PHドメインとホスファチジルイノシトールとの間の相互作用（Harlenら、Biochemistry、34巻、9859〜9864頁(1995)、Pitcherら、J.Biol.Ch em.、270巻、11707〜11710頁(1995)）またはヘテロトリマーＧタンパク質β_γサブユニット（Mahadevenら、Biochemistry、34巻、9111〜9117頁(1995)、Touhara ら、J.Biol.Chem.、269巻、10217〜10220頁(1994)、Pitcherら、J.Biol.Chem.、 270巻、11707〜11710頁(1995)）は、化学走性におけるIRPの役割に重大なものであると考えられる。実施例９モノクローナル抗体200B及び233Gを用いて、IRPの組織分布を調べた。抗体200 Bは、B2-1を優先的に認識し、そして抗体233Gは、IRP-1を特異的に認識する。双方のモノクローナル抗体を、ヒト扁桃、脾臓、及びリンパ節の凍結切片の免疫細胞化学的分析用に、10μg/mlで使用した。6ミクロンの厚みの切片を、Supefrost Plus Slides（VWR）に重ね、-70℃にて保存した。使用前に、スライドを-70℃より取り出し、55℃に５分間置いた。次いで、切片を冷却した4％パラホルムアルデヒド中で2分間、次に冷アセトン中で５分間固定し、そして風乾した。切片は、1％BSA、30％正常ヒト血清及び5％正常ラット血清を含有する溶液中で、室温にて３０分間ブロッキングした。室温にて１時間、各切片を抗体200Bまたは233Gに付した。結合しなかった抗体は、TBS緩衝液中で３回、一回の洗浄当たり５分間ずつ洗浄することによって除去した。次に、ラット抗マウスビオチン接合抗体を、同じTBS緩衝液中で各切片に付し、室温にて３０分間インキュベートした。二次抗体を検出するためにABC-eliteキット（Vector La bs）を使用し、室温にて３０分間、各切片に付した。DAB基質（Vector Labs）を付し、発色は水に浸漬することによって停止した。およそ５から１０秒間、1％オスミウム酸を適用することにより、発色を増強させた。増強は、スライドを水中に入れることによって停止した。Hematoxylin Gillの２号にて切片を対比染色し、脱水前に水、酸アルコール、炭酸リチウムで濯ぎ、そしてPermount（VWR）に載置した。200B及び233Gの染色は、扁桃、脾臓、及びリンパ節で検出されたが、対照のIgG1抗体では検出されなかった。双方の抗体とも扁桃上の粘膜上皮に極めて強いラベルを呈した。双方の抗体とも、層状になったうろこ状上皮のサブセットをラベルするようである。扁桃における200Bと233G結合の相違は、233Gで、二次濾胞（secondary follicle）内にラベリングが認められることである。このラベリングは、200Bを用いた場合には認められなかった。脾臓では、両抗体はその結合において非常に類似しているように見受けられ、赤脾髄の領域での個々の細胞がラベルされていた。リンパ節においては、200Bでは皮質深部において、233Gでは皮質深部及び髄質皮質において、個々の細胞上に結合が観察された。200Bの場合に観察されたラベリングパターンは、いたって点状のものであった。これは、233Gの場合にも見られたが、もっと薄く広がっていた。実施例１０ PHドメインは、キナーゼ及びリンカータンパク質を包含する、機能的に多様な、７０を越えるタンパク質に存在する。PHドメインは、Ｇタンパク質_βγサブユニット、PIP₂、及びPKCに結合する能力を付与することが報告されている。IRPの SEC7モチーフもまた、このモチーフ以外では相同性を共有しない他のタンパク質に存在しており、分子間相互作用を支持しているようである。加えて、IRPのキネシン／ミオシンアミノ末端相同性が、他のタンパク質との相互作用を支持していることが同様に予測されうるかもしれない。IRPと相互作用するタンパク質は、下記のごとき様々なアッセイによって同定されうる。本発明によって企図される第１のアッセイは、２ハイブリッド選別である。２ハイブリッドシステムは、酵母において開発され（Chienら、Proc.Natl.Acad.Sc i.(USA)、88巻、9578〜9582頁(1991)）、レポーター遺伝子を活性化する転写因子のin vivoでの機能的再構成に基づくものである。詳細には、IRPと相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは以下の工程を含む方法によって単離される。すなわち、DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし；当該宿主細胞にて、IRPの一部またはすべてと、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１融合体をコードする第１ハイブリッドDNA配列を発現させ；IRP結合タンパク質と推定されるタンパク質の一部またはすべてと、第１融合体に組み込まれていない、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいすれかとの第２融合体をコードする第２ハイブリッドDNA配列のライブラリーを宿主細胞で発現させ；かかる宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の生産を検出することにより、特定の宿主細胞における、IRPと相互作用するタンパク質のIRPに対する結合を検出し；そしてその特定の宿主細胞から、かかる相互作用性タンパク質をコードする第２ハイブリッドDNA配列を単離する。アッセイにて使用するために現在のところ好ましいのは、レポーター遺伝子、lacZ レポーター遺伝子の発現を駆動するためのlexAプロモーター、lexADNA結合ドメイ及びGAL4トランス活性化ドメインを含む転写因子、ならびに酵母宿主細胞である。 IRPと相互作用するタンパク質を同定するための他のアッセイには、IRPまたは被検タンパク質を固定化し、固定化されなかった方の結合パートナーを検出可能にラベルし、結合パートナーと共にインキュベートして、結合したラベルの量を定量することが包含されうる。結合したラベルは、被検タンパク質がIRPと相互作用することを示唆する。 IRPと相互作用するタンパク質を同定するためのいまひとつの型のアッセイには、蛍光剤が被覆（または含浸）された固体支持体にIRPまたはその断片を固定化し、蛍光剤を励起することができる化合物で被検タンパク質をラベルし、固定化されたIRPをラベルされた被検タンパク質に接触させ、蛍光剤による光放射を検出し、そして、蛍光剤による光の放射を惹き起こす被検タンパク質として、相互作用性タンパク質を同定することが包含される。あるいは、このアッセイにおいて、相互作用性タンパク質と推定されるタンパク質を固定化し、そしてIRPをラベルしてもよい。実施例１１ IRP相互作用のモジュレーターは、インテグリン、特にβ₂及び／またはβ₇インテグリンの細胞または細胞外基質リガンドへの接着を減じさせ、その結果、インテグリンの係合によって支持される機能、特に炎症プロセスでの細胞増殖、刺激及び局在化のダウンレギュレーションを惹き起こすのに有用なものとして、本発明により企図される。詳細には、例えば、好中球、好酸球、リンパ球、単球またはNK細胞などといった細胞の炎症部位への流入を減少させること、及びこのような部位にすでに局在化された細胞の細胞毒性活性を減じることにより、炎症性または自己免疫疾患の処置において、モジュレーターが治療的価値を有することが企図される。モジュレーターは、インテグリン依存性の接着をダウンレギュレートすること、及びインテグリンの活性を刺激するよう、且つ共刺激的に拮抗することの双方を行えるかもしれない。IRPのモジュレーターは、インテグリンの係合が活性化効果を有し、そして前炎症性となることができるので、細胞外リガンド（すなわち、阻止抗体または細胞外リガンドアンタゴニスト）へのインテグリン結合を干渉する化合物よりも利点を有するかもしれない。IRP結合のモジュレーターは、インテグリンのシグナリング経路を直接的または間接的に壊すかもしれない。IRPのカルボキシ末端PHドメインの過剰発現が、インテグリンに特異的な細胞接着の減少を惹き起こすことはないらしいので、特異性は、キナーゼまたはSEC7との相同性を有するアミノ末端配列に関係するのかもしれない。しかして、これらのアミノ末端配列に結合するモジュレーターが、インテグリン特異的に、細胞接着をもたらすかもしれない。他のタンパク質とIRPの相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのアッセイの例を、以下に示す。第１のアッセイには、以下の工程を含む方法が包含される。すなわち、DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし；当該宿主細胞にて、IRPの一部またはすべてと、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１融合体をコードする第１ハイブリッドDNA配列を発現させ；IRPと相互作用するタンパク質の一部またはすべてと、第１融合体に組み込まれていない、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとをコードする第２ハイブリッドDN A配列を宿主細胞で発現させ；被検化合物の存在または非存在下でのかかる宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の生産を測定することにより、特定の宿主細胞における、IRPに対する相互作用性タンパク質の結合を検出することによって、IRPと相互作用性タンパク質との間の相互作用に対する被検化合物の効果を評価し；そしてモジュレーター化合物が存在しない場合でのレポーター遺伝子産物の生産に比較して、レポーター遺伝子産物の生産を変化させる被検化合物として、モジュレーター化合物を同定する。このアッセイにて使用するために現在のところ好ましいのは、レポーター遺伝子、lacZレポーター遺伝子の発現を駆動する lexAプロモーター、lexA DNA結合ドメイン及びGAL4トランス活性化ドメインを含む転写因子、ならびに酵母宿主細胞である。 IRPと相互作用性タンパク質との相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのいまひとつの型のアッセイには、IRPまたは天然のIRP相互作用性タンパク質を固定化し、固定化しなかった方の結合パートナーを検出可能にラベルし、結合パートナーと共にインキュベートして結合したラベルの量に対する被検化合物の効果を定量することが包含され、ここで、被検化合物なしで結合したラベルの量に比較して被検化合物の存在下に結合したラベルの量が減少していれば、被検薬剤は、タンパク質とのIRPの相互作用の阻害剤であることが示唆される。逆に、その化合物なしで結合したラベルの量に比較して被検化合物の存在下に結合したラベルの量が増大していれば、モジュレーターと推定される化合物は、タンパク質とのIRPの相互作用の活性化剤であることが示唆される。詳細には、IRPタンパク質は、Hisでタグ付けされたかまたはHis-ケンプチド（ kemptide）でタグ付けされた組換えタンパク質として発現され、pET15bで形質転換された大腸菌溶解物から、金属キレートクロマトグラフィー樹脂を通して精製された。組換えタンパク質を放射ラベルするためのよく知られた手段は、ケンプチドタグでペプチドにタグ付けすることである。ケンプチドタグは、プロテインキナーゼＡ（PKA）リン酸化部位を含む７アミノ酸のポリペプチド断片である。ケンプチドでタグ付けされた組換えタンパク質は、PKAの作用によってケンプチドタグにて放射ラベルされうる（Mohanrajら、Protein Expr Purif.、8巻2号、175〜18 2頁(1996)）。 IRP（ケンプチドタグ付けされていない）は、Iodobead（商標）法（Pierce）、またはラクトペルオキシダーゼ／過酸化水素法（Antibodies、A Laboratory M anual、Cold Spring Harbor Laboratory、Harlow及びLane編集、第９章、319〜3 58頁(1988) の変法）を使用することのいずれかによって、遊離の¹²⁵Iで放射ラベルした。放射ラベルされたタンパク質は脱塩し、結合アッセイ用緩衝液中（150 mMまたは30 0 mMのいずれかNaClを含み、0.05％の界面活性剤（NP-40またはTriton X-100）を含むかまたは含まず、保存剤として2 mMのアジ化物を含む、20 mM HEPESまたは20 mMリン酸ナトリウムpH 7.5のいずれかの緩衝液）にて保存した。最終的な放射比活性は、3〜10μCi[¹²⁵I]/nmol IRPであった。 β₂インテグリン細胞質尾部タンパク質（Ｃ尾部）は、pET15bで形質転換された大腸菌もしくは形質転換されたサッカロミセス種のいずれかから、His3E9でタグ付けされた組換えタンパク質として発現及び精製されたか、またはタグ付けされていない、合成ペプチド調製物として得られた（Anaspec社、San Jose、カリホルニア州、Macromolecule Resouces、Fort Collins、コロラド）。インテグリンのＣ末端尾部は、96ウェルのミクロタイターScintistrip（商標）（Wallac）プレートへ、1〜100μg/mlの間の濃度で、ウェル当たり50〜100μl の重炭酸塩、pH 9.6中にて固定化し、4℃にて終夜インキュベートした。プレートを乾燥し、結合アッセイ用緩衝液中に溶解した1〜2％のウシ血清アルブミン（ BSA）を濾過滅菌したもの、350μ/ウェルでブロッキングし、室温にて１〜２時間インキュベートした。ウェルは結合アッセイ用緩衝液で３回洗浄し、IRP添加の直前に乾燥させた。結合アッセイの形式は、競合／阻害結合アッセイまたは飽和結合アッセイのいずれかであった。競合結合アッセイでは、放射ラベルされたIRPを、１つの結合モジュレーターの可能性を有するもの（ラベルされていないIRP、可溶性Ｃ尾部またはBSAなどの非特異的対照ポリペプチド）と共に結合アッセイ用緩衝液中で25〜100 nMに希釈した。アッセイは、ブロッキングされたScintistrip（商標）ウェルに、100μlのラベルされたIRP/モジュレーターの可能性を有するものの溶液を添加（50,000〜200,000 cpm/ml）して開始し、次いで室温（22〜24℃）にて１時間インキュベートして、結合アッセイ用緩衝液で３から５回迅速に洗浄することにより、停止した。飽和結合アッセイは、0.01〜30μMの総濃度範囲にわたって、放射ラベル：非ラベルIRPの割合を一定の1：20として試験したことを除いては同様に行った。プレートを乾燥して、検出器を標準化した後にWallec M odel1450液体シンチレーションカウンターでシンチレーションを測定した。ウェル間の混漏（crosstalk）は、重炭酸塩緩衝液中に20μg/mlにてウェル内に被覆された抗IRPモノクローナル抗体200Aによって捕捉された、G11、100μl中に25〜 100μMの放射ラベルされたIRPを含むScintistrip（商標）プレートを用いて補正した。被検プレートに対するインキュベーション時間及び条件は、前記の結合アッセイのものと同様とした。結合は、BSAが被覆されたウェルで認められるカウント数を上回る、Ｃ尾部が被覆されたウェルで認められる放射ラベルされたIRPのカウント数として測定した。特異的結合は、添加された非ラベルのIRPまたは可溶性Ｃ尾部にて減衰した、Ｃ尾部で被覆されたウェルにおけるカウント数として評価した。ヨウ素化されたIRP-1を利用する競合結合アッセイによって、IRP-1、IRP-1 Se c7ドメイン、B2-1の、可能性を有するモジュレーターが、ヨウ素化されたIRP-1 とHis3E9タグ付けされ固定化されたβ₂Ｃ尾部との間の結合を阻害することが示された。0.001〜4μMまでの範囲の濃度で存在する場合に、IRP-1、IRP-1 Sec7ドメイン、B2-1は、約75％まで、β₂Ｃ尾部へのヨウ素化IRP-1の結合を減少させた。固定化されたβ₂Ｃ尾部へのIRP-1の結合が、対照のペプチド（BSA）の添加によって減少せしめられることはなかった。加えて、BSAでブロッキングされたミクロタイタープレート上にβ₂Ｃ尾部が固定化されていない第２の対照では、わずかにバックグラウンドのレベルで、放射ラベルされたIRP-1の結合が示された。結合アッセイは、β₁、β₃及びβ₇を含む（これらに限定されない）、他のインテグリンのＣ尾部とIRPを利用することによる変法としてもよい。IRPまたはＣ尾部は、[³H]-ホウ化水素ナトリウム、[¹²⁵I]-Bolton-Hunter試薬、[³⁵S]-代謝性ラベル、プロテインキナーゼ[³²P]-ラベル、または他の好適な放射ラベル交叉結合法でラベルすることができる。タンパク質及びペプチドは、ミクロタイタープレート（Nunc Covalink、Pierce Reactibind、Costar Labcoat等）上に、またはビーズ（SPAなど）に固定化するとよい。結合アッセイは、インキュベーション時間を調整し、緩衝液の条件を変更して、当業者により変法とされうる。加うるに、アッセイにおいて利用されるポリペプチドは、異なる合成ペプチド断片を包含しえ、また、cDNA構築体の発現、天然の供給源からの単離及び化学合成などを包含する、当業者によって理解される様々な手段によって調製されてもよい。被検化合物がモジュレーターであることの判定は、結合アッセイに被検化合物を添加することによって成し遂げられる。前記のごとく、結合の増大または減少によって、被検化合物がIRPのモジュレーターであることが示唆される。 IRP活性のモジュレーターを同定する上で有用と考えられる他の結合アッセイには、IRPの結合パートナー（ARF、ホスファチジルイノシトールまたは他の関連化合物）に対する結合を定量するアッセイが包含される。これらのアッセイにおいて、IRPまたはその結合パートナーが、ミクロタイタープレートまたはビーズに固定化される。検出可能にラベルされたIRPまたは結合パートナーの結合量が、適切な条件下で被検化合物の存在下及び非存在下に定量される。IRP活性のモジュレーターは、結合パートナーへのIRPの結合を減少または増加させる化合物である。ホスファチジルイノシトールへのIRPの結合を定量するために、Hisでタグ付けされたIRP-1 PHドメイン（5'HA IRP-1 PH）を、4℃にておよそ１６時間、20μg/ mlの5'HA IRP-1 PHを含む重炭酸塩緩衝液、pH 9.6を100μlインキュベートすることによってミクロタイタープレート上に固定化した。次いで、ミクロタイタープレートの内容物を静かに移し出し、およそ22℃にて１時間、1〜2％のヒトIgG でブロッキングした。プレートは、アッセイ用緩衝液（25 mMトリス、pH 7.4、1 00μM NaCl、0.25％ NP-40、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、1 mM MgCl₂、0 .5％ DTT）で３回洗浄した。10ナノモルの³H-イノシトールホスフェート（IPn）（Du Pont、NEN）を22℃にて２時間、0〜100μモルの非ラベルIPnと共に100μl のアッセイ用緩衝液中に添加した。ミクロタイタープレートを４回洗浄し、シンチラントを添加した。シンチレーションカウンターで、結合した放射活性を測定することにより、結合を定量した。その結果、対照に対して１０倍まで（by a f actor of ten）を越える量で、イノシトール（1、3、4、5）P₄及びIP₆に、Hisでタグ付けされたIRP-1 PHドメインが結合することが示唆された。IRPとイノシトールホスフェートとの間の結合のモジュレーターは、このアッセイに被検化合物を添加し、そして被検化合物の存在及び非存在下での結合の相違を定量することによって定量されるとよい。 IRPと相互作用性タンパク質との間の結合をモジュレートする化合物を同定するための、本発明によって企図されるさらに別の方法には、蛍光剤が被覆（または含浸）された固体支持体に IRPまたはその断片を固定化し、蛍光剤を励起することができる化合物で相互作用性タンパク質をラベルし、被検化合物の存在及び非存在下に、ラベルされた相互作用性タンパク質を固定化されたIRPに接触させ、蛍光剤による光の放射を検出し、そして被検化合物がない場合での蛍光剤による光の放射に比べて、蛍光剤による光の放射に影響を及ぼす被検化合物として、モジュレーションを行う化合物を同定する工程が包含される。あるいは、このアッセイにおいて、IRP相互作用性タンパク質を固定化し、IRPをラベルしてもよい。組合せライブラリー、ペプチド及び疑似ペプチド、限定された化学物質、オリゴヌクレオチド、及び天然産物のライブラリーを、前記のごときアッセイにおけるモジュレーターとしての活性について、スクリーニングするとよい。実施例１２ IRP相互作用のモジュレーターの同定は、結合のために必要なタンパク質の部分を明瞭に特定することによって容易になる。標準的な変異技術によるアミノ酸置換が、タンパク質の結合領域の同定における使用に対して企図される。例えば PCRなどによってタンパク質の欠切型を作製する欠失分析もまた、その欠失がタンパク質の三次または四次構造を破壊せず、そのカウンター受容体によって最早認識されなくなる場合に、結合領域の同定のために有用である。結合に関わる重要なタンパク質領域の同定によって、結合活性のモジュレーターと推定される物質の、さらに正確且つ効率的なスクリーニングが可能となる。本発明は、小分子またはペプチドの大きなライブラリーや、さらに、β₂、β₇、 β₁及び／またはβ₃インテグリンとIRPとの相互作用をモジュレートする能力について、また、他の相互作用性タンパク質とのIRPの相互作用をモジュレートする能力について、片方または双方の結合パートナーに対して免疫特異性を有する抗体を分析するための高処理量スクリーニングアッセイを企図するものである。本明細書に開示された２ハイブリッドスクリーニング、シンチレーション近接アッセイ（SPA）及び免疫学的方法論［例えば、酵素関連免疫吸収アッセイ（ELISA）］は、それ自体HTS法ではないが、結合をモジュレートする能力について挙げられている化合物の多くを試験するために、それらは適宜のものとすることができる。SPA及びELISAはこの同定プロセスにおいて特に有用であり、報告された被検化合物の高処理量スクリーニングを許容すべく修飾することもできる。本発明を特定の実施態様に基づいて記載してきたが、当業者であれば、修飾や変更を着想するであろうことは理解されよう。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ、限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２で示されるヒトIRP-1アミノ酸配列をコードする、精製され単離されたポリヌクレオチド。２．配列番号：４で示されるヒトIRP-2アミノ酸配列をコードする、精製され単離されたポリヌクレオチド。３．DNA分子である、請求の範囲第１または２項記載のポリヌクレオチド。４．cDNA、ゲノミックDNA、部分的に合成されたDNA、及び全体的に合成された DNAよりなる群から選択される請求の範囲第３項記載のDNA。５．配列番号：１で示される、ヒトIRP-1ポリペプチドのコード領域配列を含むDNA分子。６．配列番号：３で示される、ヒトIRP-2ポリペプチドのコード領域配列を含むDNA分子。７．DNA分子であって、以下の群、すなわち、ａ）配列番号：１で示されるヒトIRP-1 DNA；ｂ）配列番号：３で示されるヒトIRP-2 DNA；ｃ）（ａ）のタンパク質コーディング部分の非コーディング鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA分子；及びｄ）（ｂ）のタンパク質コーディング部分の非コーディング鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA分子よりなる群から選択される、IRPポリペプチドをコードするDNA分子。８．請求の範囲１、２または７項のいずれかに記載のDNAを含むDNA発現構築体。９．請求の範囲１、２または７項のいずれかに記載のDNAで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１０．IRPポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程、すなわち、好適な培地中で請求の範囲第９項記載の宿主細胞を生育し、そして該宿主細胞またはその生育培地から、IRPポリペプチドを単離する工程を含む方法。１１．配列番号：２で示されるIRP-1アミノ酸配列を含む、精製され単離されたポリペプチド。１２．配列番号：４で示されるIRP-2アミノ酸配列を含む、精製され単離されたポリペプチド。１３．IRP-1と特異的に結合する抗体。１４．IRP-2と特異的に結合する抗体。１５．モノクローナル抗体である請求の範囲第１３または１４項のいずれかに記載の抗体。１６．請求の範囲第１３または１４項のいずれかに記載のモノクローナル抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体。１７．請求の範囲第１３または１４項のいずれかに記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。１８．ハイブリドーマ細胞系200A（ATCC HB-12331）。１９．請求の範囲第１８項記載のハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体。２０．ハイブリドーマ細胞系200B（ATCC HB-12332）２１．請求の範囲第２０項記載のハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体。２２．ハイブリドーマ細胞系233G（ATCC HB-12333）２３．請求の範囲第２２項記載のハイブリドーマ細胞系によって生産されるモノクローナル抗体。２４．IRP-1とβインテグリンサブユニットとの間の結合をモジュレートする化合物を同定するための方法であって、以下の工程すなわち、ａ）IRP-1またはその断片を、βインテグリンサブユニットまたはその断片と接触させ；ｂ）IRP-1またはその断片と、βインテグリンサブユニットまたはその断片との間の結合を測定し；ｃ）被検化合物の存在下に、IRP-1またはその断片と、βインテグリンサブユニットまたはその断片との間の結合を測定し；そしてｄ）工程（ｂ）における測定値と工程（ｃ）における測定値とを比較する工程を含み、工程（ｃ）における結合の減少は、被検化合物が結合の阻害剤であることを示唆し、そして工程（ｃ）における結合の増大は、被検化合物が結合の活性化剤であることを示唆する方法。２５．IRP-2とβインテグリンサブユニットとの間の結合をモジュレートする化合物を同定するための方法であって、以下の工程すなわち、ａ）IRP-2またはその断片を、βインテグリンサブユニットまたはその断片と接触させ；ｂ）IRP-2またはその断片と、βインテグリンサブユニットまたはその断片との間の結合を測定し；ｃ）被検化合物の存在下に、IRP-2またはその断片と、βインテグリンサブユニットまたはその断片との間の結合を測定し；そしてｄ）工程（ｂ）における測定値と工程（ｃ）における測定値とを比較する工程を含み、工程（ｃ）における結合の減少は、被検化合物が結合の阻害剤であることを示唆し、そして工程（ｃ）における結合の増大は、被検化合物が結合の活性化剤であることを示唆する方法。２６．IRP-1とADPリボシル化因子（ARF）との間の結合をモジュレートする化合物を同定するための方法であって、以下の工程すなわち、ａ）IRP-1またはその断片を、ARFまたはその断片と接触させ；ｂ）IRP-1またはその断片と、ARFまたはその断片との間の結合を測定し；ｃ）被検化合物の存在下に、IRP-1またはその断片と、ARFまたはその断片との間の結合を測定し；そしてｄ）工程（ｂ）における測定値と工程（ｃ）における測定値とを比較する、工程を含み、工程（ｃ）における結合の減少は、被検化合物が結合の阻害剤であることを示唆し、そして工程（ｃ）における結合の増大は、被検化合物が結合の活性化剤であることを示唆する方法。２７．IRP-2とADPリボシル化因子（ARF）との間の結合をモジュレートする化合物を同定するための方法であって、以下の工程すなわち、ａ）IRP-2またはその断片を、ARFまたはその断片と接触させ；ｂ）IRP-2またはその断片と、ARFまたはその断片との間の結合を測定し；ｃ）被検化合物の存在下に、IRP-2またはその断片と、ARFまたはその断片との間の結合を測定し；そしてｄ）工程（ｂ）における測定値と工程（ｃ）における測定値とを比較する、工程を含み、工程（ｃ）における結合の減少は、被検化合物が結合の阻害剤であることを示唆し、そして工程（ｃ）における結合の増大は、被検化合物が結合の活性化剤であることを示唆する方法。２８．IRP-1とホスファチジルイノシトール（PI）との間の結合をモジュレートする化合物を同定するための方法であって、以下の工程すなわち、ａ）IRP-1またはその断片を、PIと接触させ；ｂ）IRP-1またはその断片と、PIとの間の結合を測定し；ｃ）被検化合物の存在下に、IRP-1またはその断片と、PIとの間の結合を測定し；そしてｄ）工程（ｂ）における測定値と工程（ｃ）における測定値とを比較する、工程を含み、工程（ｃ）における結合の減少は、被検化合物が結合の阻害剤であることを示唆し、そして工程（ｃ）における結合の増大は、被検化合物が結合の活性化剤であることを示唆する方法。２９．IRP-2とホスファチジルイノシトール（PI）との間の結合をモジュレートする化合物を同定するための方法であって、以下の工程すなわち、ａ）IRP-2またはその断片を、PIと接触させ；ｂ）IRP-2またはその断片と、PIとの間の結合を測定し；ｃ）被検化合物の存在下に、IRP-2またはその断片と、PIとの間の結合を測定し；そしてｄ）工程（ｂ）における測定値と工程（ｃ）における測定値とを比較する、工程を含み、工程（ｃ）における結合の減少は、被検化合物が結合の阻害剤であることを示唆し、そして工程（ｃ）における結合の増大は、被検化合物が結合の活性化剤であることを示唆する方法。３０．IRP-1に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離するための方法であって、以下の工程、すなわち、ａ）DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし；ｂ）IRP-1の一部またはすべてと、前記転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第１融合体をコードする第１ハイブリッドDNA配列を、前記宿主細胞にて発現させ；ｃ）IRP-1結合タンパク質と推定されるタンパク質の一部またはすべてと、前記第１融合体に取り込まれていない、前記転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインとの第２融合体をコードする第２ハイブリッドDNA配列のライブラリーを、前記宿主細胞にて発現させ；ｄ）前記宿主細胞でのレポーター遺伝子産物の生産を検出することにより、特定の宿主細胞における、IRP-1結合タンパク質のIRP-1への結合を検出し、そしてｅ）前記特定の宿主細胞からIRP-1結合タンパク質をコードする第２ハイブリッドDNA配列を単離する工程を含む方法。３１．IRP-2に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離するための方法であって、以下の工程、すなわち、ａ）DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし；ｂ）IRP-2の一部またはすべてと、前記転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいすれかとの第１融合体をコードする第１ハイブリッドDNA配列を、前記宿主細胞にて発現させ；ｃ）IRP-2結合タンパク質と推定されるタンパク質の一部またはすべてと、前記第１融合体に取り込まれていない、前記転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインとの第２融合体をコードする第２ハイブリッドDNA配列のライブラリーを、前記宿主細胞にて発現させ；ｄ）前記宿主細胞でのレポーター遺伝子産物の生産を検出することにより、特定の宿主細胞における、IRP-2結合タンパク質のIRP-2への結合を検出し、そしてｅ）前記特定の宿主細胞からIRP-2結合タンパク質をコードする第２ハイブリッドDNA配列を単離する工程を含む方法。