JP2001510994A

JP2001510994A - グラビンのタンパク質結合断片

Info

Publication number: JP2001510994A
Application number: JP52802498A
Authority: JP
Inventors: スコット，ジョン，ディー．; ノエルト，ジェイ．，ブリアン; クローク，テレサ，エム．
Original assignee: オレゴンヘルスサイエンシーズユニバーシティ
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2001-08-07
Also published as: US6090929A; EP0948537A2; WO1998027116A3; AU5714198A; WO1998027116A2; CA2275477A1; US5741890A

Abstract

(57)【要約】本発明は一般に、グラビンのタンパク質結合断片及びこれら断片をコードするポリヌクレオチドに関する。タンパク質結合断片には、cAMP依存性プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼＣのタイプII調節サブユニットに結合する断片が包含される。本発明はまた、前記タンパク質結合断片に対する抗体及びグラビンの結合タンパク質への結合をモジュレートする化合物を同定するためのアッセイを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】グラビンのタンパク質結合断片発明の属する技術分野本発明は一般に、キナーゼの細胞内局在性を維持するタンパク質に関する。さらに詳細には、本発明は、タンパク質であるグラビンのポリペプチド断片に関し、このグラビンは、cAMP依存性プロテインキナーゼの調節サブユニットに、またはプロテインキナーゼＣに結合する。本発明はさらに、グラビンとその結合パートナーとの相互作用をモジュレートする方法に関する。発明の背景プロテインキナーゼは、あらゆる真核細胞に発現される普遍的な酵素であり、生理学的刺激に対する細胞応答に関わっている。プロテインキナーゼは、基質タンパク質のホスフェート基に接着する。環状AMP（cAMP）依存性プロテインキナーゼ（PKA）は、cAMPに応答して基質タンパク質をリン酸化する、広い基質特異性を有する酵素である。プロテインキナーゼＣ（PKC）は、細胞内Ｃａ²⁺及びリン脂質に応答して基質タンパク質をリン酸化する酵素である。多くのホルモンが、細胞内セカンドメッセンジャーであるcAMPを生産する共通のシグナル伝達経路を通じて作用する。cAMPの主たる作用は、ホロ酵素の調節サブユニット（Ｒ）ダイマーに結合してそれにより触媒（Ｃ）サブユニットを遊離させて、PKAを活性化することである。遊離のＣサブユニットはキナーゼ活性化の部位近傍の基質タンパク質をリン酸化することによってホルモン応答を増強する。Ｒサブユニットの２つのクラスが同定されており、これは、タイプＩ及びタイプIIPKAホロ酵素をそれぞれ形成するＲＩ及びＲIIサブユニットである。PKAイソフォームの細胞内分布は相違しているようである。ＲＩイソフォーム（ＲＩα及びＲＩ）は主として細胞質にあり核成分としては認められないことが報告されており、他方ＲIIイソフォーム（ＲIIαまたはＲIIβ）の75％までが、粒状であり (particulate)、細胞質膜、細胞骨格成分、分泌顆粒、ゴルジ装置、中心体及び／またはおそらくは核に会合している。細胞質膜から特定の細胞内区画へのシグナルの細胞内トランスダクションは、重要な生理学的プロセスを制御する、複雑且つ高度に調節された一連の事象である。細胞のホメオスタシスを維持するのに重要なシグナルトランスダクション経路関与の例は、Hunterら、Cell、80巻225〜236頁(1995)に認められ、ここでは、形質転換オンコジンが低分子量Ｇタンパク質、プロテインキナーゼ、またはホスファターゼなどのシグナルトランスダクション成分をコードしていることが示されている。ホスファターゼは、タンパク質または他の化合物からホスフェート基を除去する。キナーゼ及びホスファターゼ活性はこのようにして、基質分子をリン酸化及び脱リン酸化することによって細胞内シグナルトランスダクションを制御するのである。今やこれらのタンパク質をコードしている多くの遺伝子が同定されているので、研究の重点は、いかようにこれら酵素が介入して細胞での事象を制御するのかに絞られ始めている。この作用における重大な要素は、各シグナリング酵素の細胞内局在である。例えばNewton、Current Biology、６巻、806〜 809頁(1996)は、キナーゼ及びホスファターゼの正確な細胞内標的化が、これらの酵素を好ましい基質へ方向付けし、そして無差別的なバックグラウンドのリン酸化及び脱リン酸化を減じることを示した。キナーゼ及びホスファターゼの標的化は、標的化タンパク質またはサブユニットとの会合を通じて成し遂げられる［Faux及びScott、TIBS、21巻、312〜315頁( 1996b)により概説］。例えば、チロシンキナーゼ（PTK）及びチロシンホスファターゼ（PTPase）活性は、下流の細胞質酵素と、SH2及びSH3ドメインを含むアダプタータンパク質を通じて連関している。SH2ドメインは特定のホスホチロシル残基を認識し、そしてSH3ドメインはあるキナーゼ及びホスファターゼに見出されるPxxpモチーフに結合する。Grb2、p85、IRS-1、Crk及びNckのようなモジュラーアダプタータンパク質は、シグナリング酵素のホスホチロシル残基を認識する単一のSH2ドメインと、標的タンパク質の別々の集合にあるPXXPモチーフに結合するSH3ドメインとを含んでいる。同様に、多くのホスホリパーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ及びヘテロダイマーのＧタンパク質が、LIM、C2、プレックストリン相同性及び脂質アンカー形成ドメインなどの特異的標的化モチーフによって標的化される［Gill、Structure、3巻、1285〜1289頁(1995)；Newton、Current Biology、5巻、973〜976頁(1995)］。これらの相互作用を通じてシグナリング複合体は受容体キナーゼまたは骨格タンパク質の周囲に集まり、ホルモンシグナリング事象や免疫細胞機能を含めた細胞のプロセスを媒介する［Harrisonら、TIBS 、20巻、1213〜1221頁(1995)］。近年まで、セカンドメッセンジャーで刺激されたキナーゼ及びホスファターゼは、個々の標的化タンパク質との会合を通じて局在化されると考えられていた。例えば、プロテインホスファターゼＩ［Chenら、FEBS Letters、356巻、51〜55 頁(1994)］、プロテインホスファターゼ２Ａ［Csortorsら、J.Biol.Chem.、271巻、2578〜2 588頁(1996)］、またはプロテインホスファターゼ２Ｂ［Shibasakiら、Nature、 382巻、370〜373頁(1996)］に対して特異的である、３つのクラスのホスファターゼ標的化サブユニットが同定されている。同様に、３つのクラスのPKC標的化タンパク質が、Chaplineら、J.Biol.Chem.、268巻、6858〜6861頁(1993)；Mochl y-Rosen、1995；及びStaudingerら、J.Cell Biol.、128巻、263〜271頁(1995)にて同定されている。PKAの区画化（compartmentalization）は、AKAPと称されている３０程度のＡキナーゼアンカー形成タンパク質（A-Kjnase Anchoring Prote ins）の機能的に関連しているファミリーとＲサブユニットの相互作用を通じて成し遂げられる［Scott及びMcCartney、Molecular Endocrinology、8巻、5〜13 頁(1994)に概説］。本発明は、アンカー形成タンパク質が、セリン／スレオニンキナーゼ及びホスファターゼに対し、これらの酵素を個別の細胞内部位へ方向付けることによって特異性を付与することを企図するもので、前記細胞内部位ではこれら酵素の特定の基質への接近が制限されて、セカンドメッセンジャーのレベルの変動に応答するように至適に位置付けされる。この課題のバリエーションが、セリン／スレオニンキナーゼ及びホスファターゼシグナリング複合体の配置を調整する多価結合タンパク質の同定にて近年報告された。例えば、Herskowitz、Cell、80巻、187〜197頁(1995)は、酵母でのフェロモン接合応答は、酵母MAPキナーゼカスケードを活性化するＧタンパク質関連受容体を通じて開始されることを示した。カスケードにある各酵素はステライル 5（STE5）と称される骨格タンパク質と会合しているので、このプロセスは効率よく進行する［Choiら、Cell、78巻、499〜512頁(1994)］。MAPキナーゼカスケードにある連続的なメンバーのクラスター形成によって、この経路の厳密な調節が可能となり、そして酵母に含まれる６つの機能的に異なるMAPキナーゼモジュール間の「クロストーク」が妨げられる［Herskowitzら、1995］。多価結合タンパク質の別の例は、哺乳動物シナプスのシナプス後密度（postsynaptic density）にて PKA、PKC及びプロテインホスファターゼ2Bを標的とするAKAP79である［Klauckら、Science、271巻、1589〜1592頁(1996)；Coghlanら、(1995b)］。AKAP79及びST E5の構造はモジュラー状で、STE5に類似している。AKAP79の欠失分析、ペプチド研究及び共沈殿実験によって、これらの酵素がアンカー形成タンパク質の異なる領域に結合することが立証されている［Klauckら、1996］。AKAP79シグナリング複合体のシナプス後密度への標的化によって、可逆的リン酸化に対するモデルが示唆され、かかるモデルにおいて、キナーゼ及びホスファターゼ作用に相対する効果が、共通のアンカー形成タンパク質によって一緒に局在化される［Coghlan ら、Advances in Protein Phosphatases、6巻、51〜61頁(1995a)］。 AKAPは、様々な生物にて同定されている。Aplysia carifornia（アメフラシ、海洋性無脊椎動物）で、PKAの調節サブユニットが結合する少なくとも７つのタンパク質が同定されている［Cheleyら、J.Biol．Chem.、269巻、2911〜2920頁(1 994)］。これらのタンパク質の１つは、粗膜画分とタキソールで安定化された微小管に濃縮しており、しかしてPKAに結合するだけでなく微小管を細胞膜にアンカー形成させるのかもしれない。哺乳動物AKAP微小管会合タンパク質2（MAP2）はPKAを細胞骨格に接着させる［DeCamilliら、J．Cell Biol．、103巻、189〜20 3頁（1986）］。MAP2上のPKA結合部位は、MAP2分子のアミノ末端領域にある３１残基のペプチドである［Rublnoら、Neuron、3巻、631〜63 8頁(1989)］。今日までに、両親媒性のヘリックス領域を含む、共通の二次構造モチーフによって見かけ上PKAに結合する数多くのAKAPが同定されている［Scott及びMcCartne y、1994］。同定されたAKAPのすべてでないにしても殆どのPKAへの結合を、その共通の二次構造に模したペプチド（Ht31）（配列番号：８）の存在下に阻止することができ、他方そのペプチドの二次構造を破壊する単一アミノ酸の置換を含む変異Ht31ペプチド（配列番号：18）はPKA／AKAP結合にに対して効果を有しなかった［Carrら、J.Biol.Chem.、266巻、14188〜14192頁(1991)］。PKA／AKAP相互作用は共通の二次構造による影響を受けるけれども、AKAP（または異なる種に認められる相同なAKAP）は、様々な生物において同定されてきて現在もその同定数が増加しているAKAPによって証明されるように、概して独自の一次構造を有する。各アンカー形成タンパク質における独自の構造によって、AKAPシグナリング複合体を特定の細胞内部位に標的化することにより、キナーゼに特異性が付与されることになるのである。 Chapline及び共同研究者は近年、「クローン72」として同定されたPKC結合タンパク質のクローニングを報告した［Chaplineら、J.Biol.Chem.、271巻、6417 〜6422頁(1996)］。興味深いことに、クローン72は「クローン322」として同定されたマイトジェン性調節遺伝子と実質的な相同性を有することが示された［Li nら、Mol．Cell.Biol.、15巻、2754〜2762頁(1995)］。クローン322は、Linら、 J.Biol．Chem.、271巻、28340〜28348頁(1996)にて「SSeCKS」として同定されたと同じ分子であることが確認された、クローン322はオンコジン（例えば、src、 ras、fos及びmyc）で形質転換された細胞においてダウンレギュレーションを受け、かくして腫瘍サプレッサー遺伝子であるらしいことが示された。本発明にとってさらに興味深いのは、筋肉の哀弱及び迅速な疲弊によって特徴付けられる、神経筋伝達の疾患である重症筋無力症（MG）である。MGは、患者がニコチン性アセチルコリン受容体に対して抗体を発生している自己免疫疾患であると考えられている。ニコチン性アセチルコリン受容体は、アセチルコリンの結合に応答して陽イオンチャンネルを制御する。加うるに、アルファアクチニン、アクチン、フィラミン及びビンキュリンを含めた他の細胞骨格抗原に対する自己抗体の発生が、MG患者において観察されている。筋肉の衰弱は、自己抗体が見がけ上ニコチン性アセチルコリン受容体の破壊に関与しているので、ニコチン性アセチルコリン受容体の不全によって引き起こされるようである。これまでに知られていないMG抗原であるグラビンは、MGに罹患している患者由来の血清を用いたcDNAライブラリーの発現スクリーニングによって同定された［ Gordonら、J.Clin.Invest.、90巻、992〜999頁(1992)］。Gordonらは、グラビンの306のＣ−末端アミノ酸残基を開示したアミノ酸配列とそれに対応するポリヌクレオチドを開示した。グラビンは細胞皮質上に発現されていることが示され、また繊維芽細胞及びニューロンなどの遊走性細胞に発現されているが上皮細胞などの不動細胞には発現されていないことも示された。加えて、グラビンは接着性細胞に発現されているが非接着性細胞には発現されていないことが判った。従ってグラビンは、細胞遊走及び／または細胞接着において役割を果たしていると仮定された［Groveら、Anat.Rec.、239巻、231〜242頁(1994)］。当該技術分野では、アンカー形成タンパク質の性質、機能及び分布や、重症筋無力症におけるアンカー形成タンパク質の役割に対してのさらなる識見に対する必要性が現存している。発明の要約本発明は、グラビンがPKAのタイプII調節サブユニットに、及びPKCに結合するキナーゼアンカー形成タンパク質であるという発見に基づいている。グラビンの完全なアミノ酸配列を、本明細書に示す。プロテインキナーゼへの結合において、グラビンはキナーゼを特定の細胞内領域に局在化させ、そしてキナーゼの機能を調節し、それにより細胞シグナリングを制御しているのかもしれない。一つの特徴において、本発明はPKAのタイプII調節サブユニットに結合するグラビンポリペプチド断片を提供する。好ましくは、そのポリペプチド断片はグラビンのアミノ酸残基1526〜1582（配列番号：１）を含んでなる。さらに好ましくは、そのポリペプチド断片はグラビンのアミノ酸残基1537〜1563（配列番号：２）を含んでなる。他の特徴において、本発明はPKCに結合するポリペプチド断片を提供する。好ましくは、そのポリペプチド断片はグラビンのアミノ酸残基265〜556（配列番号：３）を含んでなる。本発明のさらなる特徴によって、上記断片のポリペプチド類似体が提供される。類似体とは、当該類似体断片のプロテインキナーゼに対する結合アフィニティーを増加または減少させるために、アミノ酸残基の付加、保存的置換を含む置換、または欠失が施された断片のことである。グラビンのこれらの類似体は、グラビンとキナーゼとの間の相互作用をモジュレートする（すなわち、ブロッキング、阻害、または刺激する）のに有用でありうる。本発明のポリペプチドは、Stewart及びYoung、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce Chemical Company(1984)またはTamら、J.A m.Chem.Soc.、105巻、6442頁(1983)（双方とも引用することにより本明細書に組み入れることとする）に記載のごとき旧来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成される。本発明のポリペプチドは、脂質可溶性部分への接合によるなどして、細胞内への通過を容易ならしめるように修飾してもよい。例えば、ペプチドをミリスチン酸に接合してもよい。ペプチドは、Eichholtzら、J.Biol．Chem.、268巻、1982 〜1986頁(1993)（引用することによって本明細書に組み入れることとする）に記載されるような標準技術によってミリストイル化するとよい。あるいは、ペプチドを細胞膜と融合し、そのペプチドを細胞内へと送達しうるリポソームにパッケージングしてもよい。リポソーム内へのペプチドの封入は、米国特許第4,766,04 6；5,169,637；5,180,713；5,185,154；5,204,112；及び5,252,263号ならびにPC T特許出願第92/02244号（引用することにより各々を本明細書に組み入れることとする）に一般に記載されたもののごとき標準技術によって実施してもよい。本発明の別の特徴によって、グラビンのタンパク質結合断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明のポリヌクレオチドには、DNA（すなわち、ゲノミック、相補性、及び合成DNA）ならびにRNAが包含される。センス及びアンチセンスポリヌクレオチド（コーティング及び非コーティングポリヌクレオチドに相補的なもの）もまた企図される。本発明のポリヌクレオチドは、数多くの標準的な、当該技術分野で周知の技術によって作製及び精製することができる。さらに企図されるのは、遺伝コードの縮重に基づいた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術に有用な、グラビンをコードするポリヌクレオチド（例えば、縮重オリゴマー）が企図される。グラビンの類似体をコードするポリヌクレオチド、またはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズする、構造的に関連するDNAも企図される。当業者であれば、「ストリンジェント」と記載された場合のハイブリダイゼーション条件を理解するはずである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、3X SSC、20mM NaPO₄ pH6.8で約65℃にてハイブリダイゼーションを行い、そして0.2X SSCで約65℃にて洗浄するという条件が挙げられる。ハイブリダイズすべき配列の長さ及びＧＣヌクレオチド塩基含量に基づき、これらの条件の変更が想起されることが、当業者には理解されるはずである。当該技術分野における定則標準は、的確なハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。Sambrookら、Molecular Cl oningの9.47〜9.51、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harb or、ニューヨーク(1989)を参照されたい。本発明のポリヌクレオチドは、キナーゼ結合ドメインポリペプチドの組換え製造のために有用である。キナーゼ結合ドメイン、さらにはプロモーター、選択可能マーカー及び他の既知ベクター要素（例えば、複製の起点、多重クローニング部位等）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターもまた、本発明によって企図される。当業者であれば、ベクターの様々な要素、宿主細胞（原核性及び真核性）の形質転換またはトランスフェクトを行い、本発明のキナーゼ結合ドメインを発現する上でのベクターの操作及び使用のための方法を理解できるはずである。宿主細胞、特に原核性及び真核性細胞などの単細胞性宿主細胞は、グラビンのキナーゼ結合ドメインの発現を許容するように、本発明のDNAで安定にまたは一過性に形質転換またはトランスフェクトされる。本発明の宿主細胞はグラビンのタンパク質結合断片の大量生産のための方法においてとりわけ有用であり、かかる方法にて、細胞が好適な培養培地にて生育され、そして所望の断片が、細胞から、または細胞が生育された培地から単離される。哺乳動物細胞を用いることで、本発明の組換え発現産物に対して生物学的活性を付与するのに必要とされうるような転写後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、タンパク溶解性プロセッシング、リピデーション及び、チロシン、セリンまたはスレオニンリン酸化）がもたらされることが期待される。本発明のさらなる特徴において、グラビンのタンパク質結合ドメインとの特異的な免疫反応性を有する抗体物質（例えば、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、抗体断片、単鎖抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体等）が提供される。抗体物質は、単離された天然のグラビンまたは組換えグラビンを用いて、標準技術によって調製することができる。抗体物質は、グラビンとキナーゼとの間の結合をモジュレートする（すなわち、ブロッキング、阻害、または刺激する）上で、またMGに罹患している患者でグラビンを検出する上で有用である、加えて、細胞系（例えば、ハイブリドーマ）、または本発明の抗体物質を産生する組換え発現構築体で形質転換された細胞系も本発明によって企図される。さらなる特徴において、グラビンポリペプチドとグラビン結合パートナー（例えば、PKAのタイプII調節サブユニットまたはPKC）との間の結合を阻害または増加させるモジュレーター化合物を同定する方法が企図される。一つの方法では、配列番号：１、２または３に示すごときグラビンまたはそのポリペプチド断片と結合パートナーとが、結合のために好適な条件下で、モジュレーター推定化合物の存在下及び非存在下にインキュベートされる。被験推定化合物の存在下及び非存在下での結合の量を定量して比較する。被験化合物の存在下に観察される結合の量が減少していれば、被験化合物がインヒビターであることが示唆される。被験化合物の存在下に観察される結合の量が増加していれば、被験化合物がグラビンとその結合パートナーとの間の結合を増加させることが示唆される。１つの実施態様において、グラビンまたはその結合パートナーのいずれかを固体支持体上に固定化させることができ、そしてグラビンまたはその結合パートナーのいずれかが、検出可能にラベルされる。加えて、シンチレーション近接アッセイなどの他のアッセイを採用してもよい。モジュレーターは、例えば特定の細胞内部位へのグラビン（例えばPKA、PKC、または他のキナーゼ）結合パートナーの局在化を阻害するのに有用である。企図されるモジュレーターには、ポリペプチド、グラビンのポリペプチド断片ならびに他の有機化合物及び無機化合物が包含される。本発明によって提供されるDNA配列情報によって、相同組換えまたは「ノックアウト」戦略［Capecchi、Science、244巻、1288〜1292頁(1989)］による、機能を有するグラビンを発現しない、またはグラビンの類似体を発現する哺乳動物の開発も可能になる。本発明の哺乳動物は、当該哺乳動物のグラビン遺伝子の破壊、またはグラビン遺伝子の相同体の破壊を含むものである。本発明の哺乳動物を製造するために利用される一般戦略には、破壊されるべき内在性遺伝子に相同の DNA配列を含む標的化構築体の調製が包含される。次いで標的化構築体は、胎児幹細胞（ES細胞）へと導入され、それにより内在性遺伝子またはその相同体に組み込まれて、それらを破壊する。所望の破壊を含む細胞を選択した後、選択されたES細胞を胞胚期の胎児に移植する。哺乳動物の例としては、齧歯類の種が挙げられる。本発明の数多くのさらなる特徴及び利点が、その例証的な実施態様にかかる以下の詳細な説明より明らかになるはずである。発明の詳細な説明以下の実施例によって、本発明を例証する。実施例１には、グラビンをコードするcDNAのクローニング及び特徴付けを記載する。PKAのタイプII調節サブユニットに結合するグラビンの断片のマッピング及び同定を、実施例２に開示する。実施例３には、COS細胞での全長のグラビンの発現を記載する。実施例４には、グラビンのPKC結合断片のマッピング及び同定を記載する。実施例５では、モノクローナル及びポリクローナル抗体の調製について述べる。赤白血病細胞（HEL ）でのグラビン発現にかかる実験を実施例６に述べる。実施例７には、グラビンの組織分布を同定する実験を記載する。実施例８にはシグナリングトランスダクションにおけるグラビンの役割を記載し、実施例９にはグラビンと結合パートナーを利用した結合アッセイを記載する。実施例１０には、細胞接着におけるグラビンの役割を記載する。本発明の開示に鑑みて、当業者は以下の実施例が例示のみを意図しており、特許請求の範囲を逸脱することのない限りにおいて種々の変更、修正及び改変を施すことができることを認めるはずである。実施例１潜在的なＲII結合タンパク質をコードするcDNAを単離するために、放射線標識されたＲIIαをプローブとして用いた変法オーバーレイ法によってヒト胎児脳λ-ZAP cDNAライブラリーをスクリーニングした［Lohmannら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、81巻、6723〜6727頁(1984)］。８つのＲII結合クローンを同定し、プラーク精製し、そして各インサートの端部を配列決定した。それらクローンのうち２つは、既知配列を示すものであった。１つは以前に同定されたAKAPであるMAP2に一致した［Theurkaufら、J.Biol.Chem.、257巻、3284〜32 90頁(1982)］。HF 9と命名されたもう１つのクローンの3'端は、以前に報告されたグラビンをコードする部分クローンと同じであり、これは元は重症筋無力症患者由来の血清を用いてヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVE）cDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離されたものであった［Gordonら、1992］。クローンHF 9のさらなる配列決定から、cDNAインサートは3023塩基対の長さであり、65 1アミノ酸の読み取り枠をコードしていることが示された。HF 9の、³²Ｐでランダムプライムされた1676塩基対のEcoRI-SpeI断片をプローブとして用いたノザンブロット分析によって、グラビンmRNAは特定のヒト組織で選択的に発現されていることが示唆された。8.4kb及び6.7kbの２つの主たるmRNA種があらゆる組織で検出されたが、肝臓、脳及び肺において卓越的であり、また、脳ではさらに5.5kb のメッセージが検出された。すべてのグラビンメッセージの大きい方のサイズから、HP 9クローンが部分的なcDNAに当たることが示唆された。従って、より完全な転写物に対してのヒト胎児脳cDNAライブラリーのスクリーニングを行うために、1676塩基対のHF 9断片を使用した。コーティング領域のさらなる600塩基対を生じる、さらに５つのクローンを得た。別の選択肢となる戦略として、ヒト心臓 cDNAライブラリーを、同じ1676塩基対のHP９断片でスクリーニングした。心臓cDNAライブラリーから単離された５つの陽性クローンのうち、最長のクローンは4216塩基対のインサートを含み、これはHF 9の5'端と重複していた。これによって、1780アミノ酸のタンパク質をコードしている6605塩基対の隣接複合配列が得られた。このタンパク質（ヒト・グラビン）の完全なDNA及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：４及び５に示す。実施例２グラビンの最後の651アミノ酸が、PKAのタイプII調節サブユニットとの会合のための結合部位を含むことを立証した。以前に、両親媒性のα−ヘリックスを含むと考えられる保存された二次構造の領域が、ＲII−結合を担うことが示されていた［Carrら、J.Biol.Chem.、267巻、13376〜13382頁(1992)］。グラビンの残基1540〜1553：LETKSSKLVQNIIQ（配列番号：６）が、これらの範疇を満たすものであった。これらの残基はまた、他のAKAPの対応する領域との配列の同一性も示し、さらにヘリックス−ホイールプロットによって、両親媒性ヘリックスの形成に適合する、疎水性及び親水性側鎖の分離があることが示された。グラビンのＲ IIα結合断片はまた、AKAP79（LIETASSLVKNAIQ）（配列番号：７）の、そしてHt 31（DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGA）（配列番号：８）の対応ＲII結合領域とのある程度の配列相同性も示している。Ht31は、ヒト甲状腺AKAPに由来する配列である。グラビンのＲII結合部位（１または複数）を同定するために、グラビンの組換えDNAをコードする断片のファミリーを、鋳型としてHF9を用いたPCRによって作製した。これらの断片をコードしているポリヌクレオチドを、発現されるグラビン断片のアミノ末端に発現されるヒスチンタグをコードするヌクレオチド配列を提供するpET16dプラスミドへとサブクローニングした。これらの構築体を大腸菌にて発現し、そしてpET16d Histag細菌発現／アフィニティー精製システムを用いて精製した。共通の5'プライマー、CCGCCATGGTGCATATGTCCGAGTCCAGTGAGC（配列番号：９）を利用することによって、推定ＲII結合部位の残基1130〜1582（配列番号：１７）及び1130〜1525（配列番号：１５）をコードする構築体を作製したが、3'プライマーは、残基1130〜1525（配列番号：１５）のためにはGCGCGGATCCGCACTCACTT T GACCTCCTG（配列番号：１０）を、残基1130〜1582（配列番号：１４）のためにはGCGCGGATCCGCTATCACGTGAGCTTGTGT（配列番号：１１）をと、相違したものを利用した。1526〜1780（配列番号：１６）構築体は、5'プライマーCCGCCATGGTGCAT ATGGTAGCAATTGAGGATTTAG（配列番号：１２）を、全長のクローンをサブクローニングするために使用した3'プライマーGGAGGATCCAGAGATTCTGTAGTTCTG（配列番号：１３）と組み合わせて使用することによって調製した。各グラビン構築体を大腸菌にトランスフェクトし、そして組換えHistag融合タンパク質の発現をIPTGによって誘導した。各組換えタンパク質は、以前に報告された方法に従って精製した［Coghlanら、Science、267巻、108〜111頁(1995b)］。 Lohmannら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、81巻、6723〜6727頁(1984)に記載のとおりに、本質的にオーバーレイ法を用いてグラビン断片をＲIIα結合についてスクリーニングした。要約すると、オーバーレイ法は以下のとおりに実施する。タンパク質試料をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離し、そして標準の電気転写技術によってニトロセルロースへ転写する。固定化されたタンパク質は、ミルクタンパク質を含有するブロッキング溶液中でインキュベートすることによって部分的に再生し、次いで³²ＰでラベルされたＲIIプローブでプローブ探針する。結合していないプローブを洗浄によって除去した後、グラビンポリペプチド断片とＲIIとの間の結合をオートラジオグラフィーによって検出する。アッセイの感度を高める（１０倍まで）ためには、結合したＲIIを免疫学的に検出する（例えば、抗ＲII抗血清及び¹²⁵Ｉ−プロテインＡ、またはＲIIを特異的に認識するモノクローナル抗体）。残基1130〜1582（配列番号：１４）にわたる452残基の断片はオーバーレイ法にて、³²Ｐ−放射線ラベルされたＲIIαに結合したが、他方残基1130〜1525（配列番号：１４）の小さい方の断片はＲII結合領域を欠いており、ＲIIαに結合することができなかった。２つのさらなる実験によって、推定両親媒性ヘリックス領域で、ＲII結合には十分であることの証拠が得られた。グラビンの残基1526〜1780（配列番号：１６）にわたる断片はオーバーレイ法にてＲIIに結合し、そして残基1537〜1563（配列番号：２）に及ぶ合成ペプチドが、オーバーレイ法でのあらゆるＲII結合を阻止した。加えて、ＲII／AKAP相互作用の競合的インヒビターである、アンカー形成タンパク質インヒビターペプチドHt31（DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGA）（配列番号：８）もまた、オーバーレイアッセイによって評価した場合にグラビンへのＲ II結合を阻止した。0.3μMのインヒビターペプチドHt31（配列番号：８）の存在下にオーバーレイが実施された対照実験によって、Ht31はグラビンとＲIIαとの間の結合を阻害することを確認した。加えて、第２の対照ペプチド、ＲII／AKAP 結合を阻止できないHt31-pro（DLIEEAASRPVDAVIEQVKAAGA）（配列番号：１８）が、グラビンとＲIIαとの間の結合を阻害することができなかった。第２の対照ペプチド（配列番号：１８）は、イソロイシンがプロリンに置換されており、それによって二次構造が破壊されたHt31ペプチドである。Ht31（配列番号：８）ペプチド及びHt31-proペプチドは、合成したものであった。対照ペプチドのラベリング及び／またはトラッキングを容易ならしめるために、さらにチロシン（放射ヨウ素標識）またはリジン（ビオチン／アビジン）残基を対照ペプチドのＣ末端に含めた場合もあった。このデータから、グラビンがAKAPであり、その主たるＲII結合部位は残基1526〜1582（配列番号：１）にわたっていることが立証される。ＲIIαの組換え断片に対する、グラビンの1526〜1780（配列番号：１６）断片の結合アフィニティーを表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定することで、前記の知見をさらに確認した。SPRは、巨大分子複合体を調べるために減衰光（e vanescent light）を利用する分析技術である。固定化された結合パートナーへの、あるタンパク質の結合アフィニティーをSPRによって測定することができる。グラビンの残基1526〜1780（配列番号：１６）にわたる組換え断片を、標準ED C/NHSカップリング化学法を用いてカルボキシメチルデキストランIAsysキュベットにカップリングさせた［Daviesら、Techniques in Protein Chemistry、5巻、 285〜2992頁(1994)］。キュベットを0.4M EDC/0.1M NHSで８分間処理することによって活性化し、そしてPBST（PBS＋0.05％Tween-20）で十分に洗浄した。グラビン1526〜1780断片（配列番号：１６）（25μg/ml）のカップリングは、10mMギ酸塩緩衝液、pH3.6中で室温にて１０分間で成し遂げた。カップリングしなかったタンパク質を、PBSTで洗い落とし、1Mエタノールアミン、pH8.5を室温にて２分間用いて遊離アミンをブロックした。PBSTで洗浄した後、データを集める前に１０分間、安定なベースラインを定めた。すべての結合実験は、全長のタンパク質と同様のアフィニティーでAKAPに結合するＲIIαの組換え断片（ＲII 1-45）［Scottら、Proc.Natl.Acad.Sci.、84巻、5192〜5196頁(1987)］を用いて実施した。以前の実験で、全長のＲIIを用いた場合よりも、固定化されたアンカー形成タンパク質に対する害が少ない条件下で、結合表面からのＲIIα 1-45 の遊離を実施できることが示されている。結合実験は、200μlの容量にて、25〜 150nMの濃度範囲内に及んで実施した。結合表面は、結合測定の間に60％エタノールを使用して再生し、実験期間中に測定限界の低下はなかった。データ収集は、３秒間隔で行い、IAsys機器と共に装備されているFastfit（商品名）ソフトウェアを使用して分析した。固定化グラビン断片の結合特性は、25〜150nMのＲII α 1-45濃度の範囲にわたって測定した（図１Ａ）。均一な一次結合が記録され、Ｋ_asscは160006±9700Ｍ^-1秒^-1（ｎ＝３）であり、Ｋ_devは0.016±0.001Ｍ^-1 （ｎ＝３）であった（図１Ｂ）。これらの数値を用いて、ＲII／グラビン断片相互作用に対する解離常数（KD）を100nM（ｎ＝３）と計算した。ＲII／グラビン相互作用に対するナノモル濃度の結合常数は、細胞の中にある双方のタンパク質の生理学的濃度範囲に丁度入っており、双方のタンパク質がin situで会合しているのかもしれないという考え方に矛盾しない。以上立証したとおり、グラビンの残基断片1537〜1563（配列番号：２）は、PK Aアンカー形成部位を組織している。注目すべきは、この配列はSSeCKS／クローン72（実施例４を参照のこと）に存在しているのである。興味深いことに、この共有配列は、AKAP79と称される、他の哺乳動物骨格タンパク質のＲII結合領域に保存されている14残基のうち10残基を有しており、そのAKAP79は、PKA、PKC及びプロテインホスファターゼ２Ｂに結合するのである［Coghlanら、1995b；Klauck ら、1996］。グラビン、SSeCKS／クローン72及びAKAP79において保存されたＲII結合配列の同定は、既知のＲII結合領域内に保存された一次構造の初めての例である。以前は、AKAP 間の配列の同一性がないにも関わらず、ＲII結合モチーフには二次構造の保存性があるのだと提唱されていたので［Scottら、1994］、前記の知見は予想外のものであった。従って、グラビン、SSeCKS／クローン72及びAKAP79は、１以上のキナーゼまたはホスファターゼに結合するAKAPの、構造的に関連するサブファミリーのメンバーであると考えられる。実施例３グラビンによるPKAのアンカー形成の役割を調べるために、全長のグラビンを、正常時には当該タンパク質を発現していない細胞にて発現させた。全長のグラビンcDNAを含むプラスミドを以下のとおりに調製した。1.7kbのXba I断片をHF9から単離し（グラビンのＣ末端配列を含んでいる）、そしてXbaIで予め消化しておいたＮ末端の4216bpクローン（実施例１を参照のこと）を含むpBSI I（Stratagene）へとクローニングした。クローンをスクリーニングし、そして正しい方向性に関し（5'及び3'接合部について）配列決定した。この結果得られたクローンを、pBS/gravinと命名した。pBS/GravinのEcoRI-NotI断片を、EcoRI 及びNotIで予め消化しておいたpcDNA3に挿入した。EcoRI及びNotIを用いた制限消化によって、インサートについてのクローンのスクリーニングを行った。プライマーDCO3及びJHSP6をそれぞれ用いて5'及び3'接合部を配列決定することによって、正しいクローンを確認した。組換えグラビンのトランスフェクション COS細胞を20〜40％の集密度になるまで100mmの培養ディッシュにて生育した。 COS細胞のトランスフェクションは、以下のとおりに実施した。150μlの無血清培地で10μgの濃度のpcDNA3-グラビンベクターを調製し、これに20μlのSuperFe ct（Qiagen、Chatsworth、カリホルニア州）を添加した。COS細胞培養物から培地を除き、そして細胞をCMF-PBSで洗浄した。SuperFect混合物を、10％FBSを含む3mlの培地に添加し、そして細胞に37℃にて３時間で添加した。その後細胞を洗浄し、そして新鮮な培地を添加して終夜のインキュベーションを行った。次に細胞を洗浄し、トリプシンで採集し、再度洗浄して実施例５に記載のとおりに溶解した。Jurkat細胞に対するトランスフェクション法は、Superfect混合物をJur kat細胞に添加し、そして終夜培養しておいたことを除いては同様に行った。トランスフェクション後２４、４８時間及び２週間目に、前記のように細胞溶解液を調製した。グラビン発現は、ウェスタンブロット分析によって調べた。トランスフェクトされたCOS細胞では、トランスフェクション後２４時間でベースラインの発現レベルを越えたグラビンシグナルの増強を示した。グラビンを発現しないJurkat細胞が、トランスフェクション後２４時間から２週間に至るまで組換えタンパク質の有意な発現を示した。組換えグラビンはこのように、ヒト細胞系にて発現及び維持されうる。実施例４さらなる配列分析から、グラビンの別の潜在的な機能が明らかになった。完全なグラビン配列を用いたヌクレオチドデータベースの検索によって、最初の1000 残基がネズミのマイトジェン性調節タンパク質SSeCKS［Linら、1995］（当該技術分野では「クローン72」とも同定され、これはプロテインキナーゼＣ結合タンパク質であるとともにプロテインキナーゼＣ基質であることが最近示された［Chapline、1996］）と69％一致することが示された。そこで、グラビンがPKCに結合する能力を調べた。すなわち、アミノ酸265〜55 6（配列番号：３）及び1130〜1582（配列番号：１４）からなる、２つの組換えグラビンポリペプチド断片を調製して実施例２に記載したオーバーレイ分析と類似のオーバーレイ分析を実施した。固定化されたグラビン断片はPKCと共にインキュベートし、そして結合したPKCをPKCに対するモノクローナル抗体を用いて検出した（Transduction Labs、Lexington、ＫＹ）［Klauckら、(1996)］。プライマーGACGAGATTGTGGAAATCCATGAGG（配列番号：１９）及びGCGCGGATCCAGAGATTCTGT AGTTCTGAC（配列番号：２０）を用いて、PCRによって265〜556（配列番号：３）断片を調製した。1130〜1582（配列番号：１４）断片はは実施例２に記載のとおりに調製した。結果、PKCは265〜556断片（配列番号：３）に結合するが、1130 〜1582（配列番号：１４）には結合しないことが示された。このように、オーバーレイアッセイによってグラビンのPKC結合断片は、残基265〜556（配列番号：３）の間の領域にマッピングされた。グラビン断片のいずれも、ホスファチジルセリン（PS）の非存在下にはPKCに結合せず、これはリン脂質がPKC／結合タンパク質複合体のコファクターであるとの報告に見合うものである［Chaplineら、19 96］。ホスファチジルセリン（PS）は、PKCと基質／結合タンパク質上の多塩基性領域の三成分複合体を支えることが示唆されている［Liaoら、Biochem.、33巻、1229〜1233頁(1994)］。多塩基性領域は、PKCとその結合タンパク質との間のリン脂質架橋の形成に関与していると推察されていた［Chaplineら、1996；Chaplineら、1993］。AKAP79 では、多塩基性領域がPKC結合部位として同定された［Klauckら、1996]。グラビンには、残基295〜316（FKKFFTQGWAGWRKKTSFRKPK）（配列番号：２３）と514〜5 36（PLKKLPTSTGLKKLSGKKQKGKR）（配列番号：２４）との間に位置する２つの多塩基性領域が、グラビン265〜556断片（配列番号：３）の中に存在している。双方の多塩基性領域（残基295〜316及び残基514〜536）は、AKAP79のPKC結合部位に類似している。グラビンの双方の多塩基性領域の合成ペプチドは、オーバーレイアッセイによって評価するとPKC／グラビン相互作用を阻止した。これらの実験から、このタンパク質の残基265〜556の間に位置する１以上の多塩基性領域にて、プロテインキナーゼＣはイン・ビトロでグラビンに結合することが示される。 AKAP79の31〜52PKC結合部位ペプチドであるKASMLCFKRRKKAAKLAKPKAG（配列番号：２３）は、グラビンへのPKC結合を阻止した。この結果、グラビン及びAKAP7 9のいずれも、PKCの同様の部位に結合するらしいことが示される。グラビン265 〜556（配列番号：３）断片が、ペプチド基質VRKRTLRRL（配列番号：２４）（Si gma Co.、St.Louis、ミズーリ州）に対して0.50±0.12μM（ｎ＝４）のＩＣ₅₀にてPKC活性を阻害することが示され（図２）、AKAP79に対するさらなる類似性が立証された。これに対し、ＲII結合ペプチドは、このキナーゼを阻害しなかった。PKC活性は、40mM HEPES（pH7.5）、10mM MgCl₂、0.3mM CaCl₂、1mM DTT、100 μM［γ³²Ｐ］アデノシントリホスフェート（ATP）（500cpm/ml）、ホスファチジルセリン（20μg/ml）を含有する反応液中で、上皮成長因子受容体ペプチド（ VRKRTLRRL）（配列番号：２４）を基質として30℃にて１０分間、以前の報告［Orrら、J.Biol.Chem.、269巻、27715〜27718頁、1994］のとおりにアッセイした。PKCβII（20ng/μl）は、20mM Tris（pH7.9）、1mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）及び1mM DTTで1：10希釈した。0.1から10μMのグラビン265〜556断片（配列番号：３）という阻害濃度範囲にわたって、阻害常数（ＩＣ₅₀）を測定した。これまでに、３つのクラスのPKC結合タンパク質が、ゲルオーバーレイ及び２ハイブリッド技術によって同定されている［Fauxら、Cell、70巻、8〜12頁(1996 a)］。PKC基質／結合タンパク質［Chaplineら、1993］及び活性化Ｃキナーゼに対する受容体（RACK）［Mochly-Rosenら、Proc.Natl.Acad．Sci．USA.、88巻、3 997〜4000頁(1991)］がゲルオーバーレイ法によって検出されており、一方Ｃキナーゼと相互作用するタンパク質（PICK）が２ハイブリッドスクリーンによって単離されている［Staudingerら、1995］。本明細書中に開示するデータから、およそ290アミノ酸の領域がPKC結合を担い、そしてその領域に対応する断片がイン・ビトロでキナーゼ活性を阻止することが示される。実施例５完全フロインドアジュバント（CFA）中でグラビンまたはグラビン断片を用い皮下にBalb/cマウスを免疫付与することによってモノクローナル抗体を調製する。免疫応答を高めるために、CFAまたは不完全フロインドアジュバントにて引き続き免疫付与を行う。免疫付与された動物の脾臓を無菌的に摘出し、そして2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、100単位／mlペニシリン及び100mg/mlストレプトマイシン（Gibco社、カナダ）を添加した無血清のRPMI 1640の中に沈めた２枚のガラス顕微鏡スライドの磨りガラス状の（frosted）端部の間で脾臓を擦り潰すことによって、単一細胞の懸濁液を形成させる。細胞懸濁液を、滅菌した70メッシュNitex細胞濾過器（Becton Dickinson社、Parsippany、ニュージャージー州）を通して濾過し、そして、200 ×gで５分間遠心分離することにより細胞を２度洗浄し、その後、20mlの無血清R PMI中に再懸濁する。未処置Balb/cマウスから取り出した胸腺細胞を、同様に調製する。２×10⁸の脾臓細胞を、４×10⁷のNS-1細胞（融合前の３日間、11％胎児ウシ血清(FBS)を含むRPMIにて対数増殖期に保持しておいたもの）と合わせ、遠心分離して得られた上清は吸引する。細胞ペレットを変位させ、2mlの37℃PEG 1500（7 5mM Hepes、pH8.0中、50％）（Boehringer Mannheim）を、１分間にわたってかき混ぜながら加え、その後、７分間かけて無血清RPMI 14mlを加える。さらにRPM Iを添加してもよく、その後細胞を、200×gで１０分間遠心分離する。上清を廃棄した後、ペレットは、15％FBS、100mMヒポキサンチンナトリウム、0.4mMアミノプテリン、16mMチミジン(HAT)(Gibco)、25単位/ml IL-6（Boehringer Mannhei m）及び1.5×10⁶の胸腺細胞/mlを含有する、200mlのRPMI中に再懸濁する。この懸濁液を、10枚の96ウェルの平底組織培養プレート（Corning社、連合王国）に、ウェル当たり200μlで分配する。プレート内の細胞には、18Ｇの針（Becton D ickinson）を用いて各々のウェルから100μlを吸引し、そしてプレーティング培地（10単位/mlのIL-6を含有し胸腺細胞を含まない）100μl／ウェルを添加することによって、融合後２、４、及び６日目に栄養を供給する。細胞の生長が60〜80％の周密度に達した時（融合後８〜10日）に、各ウェルから培養上清をとり、ELISAによってグラビンとの反応性についてスクリーニングする。ELISAは、以下のとおりに実施する。Imm ulon 4プレート（Dynatech、Cambridge、マサチューセッツ州）を、100ng／ウェルのp110δ：GSTまたはGSTを含む50mMカーボネート緩衝液、pH9.6を50μl／ウェル用いて、4℃にて被覆しておいた。プレートを、0.05％Tween 20を含有するPBS (PBST)で洗浄し、0.5％フィッシュスキンゼラチンで37℃にて30分間ブロッキングを行う。前記のとおりにプレートを洗浄し、そして50μlの培養上清を添加する。37℃にて３０分間インキュベートした後、PBSTで1：10,000に希釈した50μl のセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスIgG（fc）（Jackson Immun oResearch社、West Grove、ペンシルバニア）を添加する。プレートを37℃にて３０分間インキュベートし、PBSTで洗浄して、1mg/mlのTMB（Sigma）及び0.15ml /mlの30％H₂O₂を100mMクエン酸塩、pH4.5を含有する100μlの基質を加える。呈色反応は、15％のH₂SO₄を50ml添加して、停止させる。Ａ₄₅₀をプレートリーダー（Dynatech）で読み取る。ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを含む抗原で動物に免疫付与し、そして当該免疫付与された動物から抗血清を集めることによって調製される。ウサギ、ニワトリ、マウス、ラット、またはモルモットを含めた様々な動物種が、ポリクローナル抗体の調製に有用である。1130〜1780グラビン断片を使用して、ウサギでポリクローナル抗体を調製した。ウサギポリクローナル抗血清Ｒ3698 は、1130〜1780グラビン断片（配列番号：１７）より、民間研究所で（BethylLa bs、Montgomery、テキサス州）作製した。1130〜1780断片（配列番号：１７）は、1130〜1780断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号：９）（5'プライマー、CCGCCATGGTGCATATGTCCGAGTCCAGTGAGC（配列番号：９）及び3'プライマー、G GAGGATCCAGAGATTCTGTAGTTCT G（配列番号：１３）を用い、PCRによって作製したもの）を、実施例２に記載のとおりに調製及び発現することによって製造した。加えて、ウサギ及びニワトリでポリクローナル抗体を調製するために、265〜556断片（配列番号：３）を使用した。ウサギポリクローナル抗血清のR4310及びニワトリポリクローナル抗血清は、Bethyl Labsによって265〜556断片（配列番号：３）から調製した。２つのさらなるポリクローナル抗血清を調製した。２羽のウサギ（4037Ｊ及び 3548Ｊ）を、合計３回の注射と最終追加免疫として、25〜50μgの組換えグラビン断片265〜556で免疫付与した（R & R Rabbitry、Stanwood、ワシントン州）。試験血清及び免疫前血清をウェスタンブロット分析によって調べた。組換えタンパク質（1μg／レーン）及びHEL細胞からの溶解液（25μg／レーン）を、グラビン発現を誘導するために40μg/mlのPMAの存在下、または非存在下に生育し、4〜 12％のSDS−PAGE（Novex、San Diego、カリホルニア州）によって分離して標準技術によってイモビロンへ転写した。この結果得られたブロットは、固定化されたタンパク質を部分的に再生するためにブロッキング用緩衝液（5％ミルクタンパク質を含むTBS）中でインキュベートし、次いでウサギ血清（ブロッキング用緩衝液中、1：500希釈）でプローブ探針した。結合しなかった抗体は、TBSにて洗浄することにより除去し、その後、ブロッキング用緩衝液中の二次ヤギ抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）接合抗体（1：7500希釈）と共にインキュベートした。結合しなかった抗体を洗い落とし、そしてブロットを強化化学発光（ECL、Dupont-NEN、Boston、マサチューセッツ州）によって現像してフィルムに露光した。双方のウサギ由来の血清は、組換えグラビン断片を認識した。PMAで刺激したHEL細胞溶解液には、250kDaのバンドが検出されたが、刺激しなかったHEL細胞から調製した溶解液には当該バンドは検出されなかった。ウサギ4 037Ｊ由来の血清は、ウェスタンブロットによる感受性がより高く、しかしてこの抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。実施例６ヒト赤白血病細胞系（HEL）（HEL92.1.7、ATCC TIB 180）のホルボールエステル処理は、マクロファージ様細胞の特性である形態的な、機能的な、生化学的な変化を引き起こす。この方法の顕著な特徴の一つが、グラビンの強力な誘導である［ゴードンら、1992年］。このため、ホルボールエステルへの遷延露出の後に、HEL細胞のPKA及びPKC結合タンパク質の特性を試験した。 HEL細胞を、１２％のウシ胎児血清及び４ｍＭグルタミンを含むRPMI 1640で成長させた。グラビンの発現は、１８時間、４０ｎＭ酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）で培養することによって誘導された。PBSで洗浄し、１５０ｃｍ²のフラスコの内部がらかき集めたPMAの存在下で成長した接着細胞、あるいは、PMAの非存在下で成長したHEL細胞の懸濁液培養物のいずれかから、細胞可溶化物を調製した。細胞ペレットを、２０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．４、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のトリトンＸ−１００、０．０５％のツイーン２０、０．０２％のアジ化ナトリウム、１０ｍＭのベンズアミジン、２μｇ／ｍｌのペプスタチン、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、４ｍＭの４−（２ −アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフロリドヒドロクロライド（溶解緩衝液）に再懸濁する前に、PBSで２回洗浄し、１０分間氷上でインキュベーションした。その後、その抽出物を４℃において１６，０００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞可溶化物の上清を収集した。バイオラッド社製のＤＣタンパク質分析キットを用いて、タンパク質濃度を測定した。グラビンの残基１１３０〜１７８０に対して作用するアフィニティ精製した抗体を用いて、コントロール細胞及び処理した細胞からの抽出物をウェスタンブロット分析に供した（実施例５参照）。PMA処理は、特異的に抗−グラビン抗体と反応する２５０ｋＤａのタンパク質の誘導を生じた。引き続いてのオーバーレイ分析は、PMA処理が２５０ｋＤａのPKC結合タンパク質及び同じ大きさのＲ II結合タンパク質の発現を誘導することを実証した。マクロファージ様の変化が同時に生じ、PMA処理を行ったHEL細胞は接着するようになり、かなりの細胞質内の拡散を示した［Papayannopoulouら、Blood.62:83 2-845（1983）］。時々、これは、アクチン張力繊維の形成を生じ、細胞の一般的な平滑化を引き起こす。グラビンがアクチン細胞骨格と調製するかどうかを確証するために、ホルボールエステル処理したHEL細胞を下記のアクチン用マーカーとしてのローダミンで染色した。１８時間、４０ｎＭのPMAの存在下にカバーガラス上に成長したHEL細胞をPBS で洗浄し、３．７％のホルムアルデヒドで固定し、−２０℃の無水アセトンで抽出した。PBS及び０．２％ＢＳＡで１時間、細胞を再水和し、その後、０．５μ ｇ／ｍｌでアフィニテイ精製した抗−グラビン抗体Ｒ３６９８とインキュベートするが、あるいは、０．５μｇ／ｍｌで前免疫のＩｇＧとともにインキュベートした。１時間後に、PBS及び０．２％ＢＳＡで注意深くカバーガラスを洗浄し、ロバ抗ウサギ第２抗体結合ＦＩＴＣ（１：１００希釈、Jackson ImmunoReasearc h Laboratories Inc，West Grove，ペンシルバニア州）及びファロイジン結合ローダミン（カバーガラス当たり１単位、Molecular Probes，Inc，Eug ene，オレゴン州）の混合物、あるいは第２抗体単独のいずれかでインキュベートした。Coghlanら、J．Biol．Chem.,269:7658-7665(1994)の記載にあるように、実質的に、ＲII−オーバーレイ系中で実施した。第一抗体とのインキュベーションに先立って、細胞を、２時間、８０ｎＭの組換えマウスＲIIαで培養し、非結合のＲIIをPBS及び０．２％ＢＳＡで３回洗浄して除去した。固定化したＲII αを、アフィニテイ精製したヤギ抗−マウスＲII（１μｇ／ｍｌ）及びロバ抗− ヤギ第二ＩｇＧ複合テキサスレッド（１：１００希釈、Jackson ImmunoReasearc h Laboratories Inc,West Grove,ペンシルバニア州）で免疫化学的に検出した。コントロールのカバーガラスは、外因性のマウスＲIIの非存在下において、ＲII に対する抗体で処理した。ライツ（Leitz）のFluovert-FU倒立顕微鏡を付帯したライカ共焦点レーザー走査システム及びアルゴン／クリプトンレーザーを使用して細胞を検査した。すべての細胞が、周辺部に対してアクチンの濃度を表示した。対照的に、染色されているグラビンは主として細胞質であり、細胞の部分集合のみ（約２５％）大量のタンパク質を発現した。HEL細胞が異なった分化の段階で異種集団を表すので、グラビン発現の可変レベルは予想されていた。［Papayannopoulouら，198 3］。アクチンに対して染色された細胞とグラビンに対して染色された細胞の像の重ね合わせは、部分的に重複している細胞下の分布を除いて共にタンパク質を明確に示している。前免疫血清で細胞を染色した場合、コントロール実験はネガティブであった。さらに詳細なHEL細胞の共焦点分析は、細胞の周辺部に向かって染色され、接着表面に糸状仮足が豊富なグラビンを検出した。これらの知見は、培養基板へのHEL細胞接着を増強するグラビンの機能を示している。グラビンとPKAの共存局在化実施例２及び３に記述された生体外で結合の研究は、グラビンがキナーゼ骨格タンパク質であることを示している。したがって、HEL細胞にグラビンシグナル伝達複合体を検出することができるかどうかを測定するため、共存局在化試験を開始した。予めPMAで処理された固定化され透過化処理された細胞を、組換えマウスＲIIαで重ねた。系中でＲII結合を特異的にマウスＲIIを認識する抗体で検出した。それはグラビンに対する染色パターンに類似していた。抗マウスＲII抗体は、内因性のヒトＲIIを検出しないということをコントロール実験で確認したので、染色されたＲIIの増加はグラビンと直接関係することに基づいていた。系中で、ＲII−結合がHt 31接着阻害ペプチドとのインキュベーションによってブロックされたことを示す追加のコントロール実験により、この結論は支持された。最終的に、グラビンシグナル伝達複合体を２つの補足的な生化学的方法、すなわち、免疫沈降反応及びｃＡＭＰ−アガロース上のアフィニティクロマトグラフィーによって分離した。グラビンの免疫沈降反応は以下のように行った。上記のように調製したHEL細胞可溶化物（１５ｍｇ／ｍｌの２００μｌ）をアフィニテイ精製抗−グラビン１５μｇまたは前免疫のＩｇＧ１５μｇを用いて、４℃で１８時間インキュベートした。溶解緩衝液で予め平衡化した１０％（ｖ／ｖ）のタンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Sigma,St Louis，ミズーリ州）２００μｌを添加して免疫複合体を分離した。４℃で９０分間インキュベーションした後、そのビーズを０．５ＭＮａＣｌ溶解緩衝液で１回、そして過多の２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌで４回洗浄した。１ｍＭｃＡＭＰ、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｎＭＮａＣｌの２００μｌで１５分間、タンパク質−Ａビーズをインキュベートすることによって、免疫複合体からPKA触媒サブユニットを遊離した。ニトロセルロース上への４−１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、エレクトロブロッターの分析より前にその溶出液をＴＣＡ沈降させ、先に記述したように触媒サブユニットを検出した。グラビンの免疫沈降及び検出については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で洗浄したビーズを煮沸し、４−１５％の変性ＰＡＧＥゲル（５μｇ／レーン）上でタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写し、グラビンウエスタン、PKCオーバーレイ及びＲIIオーバーレイウエスタン［上記及びＫｌａｕｃｋら、１９９６年の記述による］による分析を行うことによって溶出を実施した。 HEL細胞可溶化物（上記のように、緩衝液に１０ｍＭのＩＢＭＸを添加して調製した１５ｍｇ／ｍｌの４００μｌ）を１０ｍＭのＢＭＸを伴う溶解緩衝液で平衡化した２００μｌの充填されたcAMP−アガロース（Sigma,St Louis，ミズーリ州）とインキュベーションしてグラビンをアフィニテイ精製した。そのスラリーを４℃で１８時間ゆるやかに撹拌し、１．５ｍｌ溶解緩衝液、１ＭのＮａＣｌで洗浄し、次いで４つの１．５ｍｌを２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。７５ｍＭのcAMP、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ０．５ｍｌでビーズをインキュベートして溶出を行った。その最終洗浄と溶出液をＴＣＡ沈殿させ、全体サンプルを４−１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の単一レーンに充填した。分離されたタンパク質がニトロセルロースにブロットされ、上記のウエスタン分析によってグラビンを識別した。グラビン抗体を用いた免疫沈降は、ＳＤＳゲルがクーマシーブルーで染色された場合、かすかに検出できる２５０ｋＤａのタンパク質を特異的に分離した。この２５０ｋＤａタンパク質は、アフィニテイ精製グラビン抗体を用いた免疫沈降のときのみ存在し、前免疫血清で行ったコントロール実験おいては検出されなかった。ウェスタンブロットとオーバーレイの分析は、２５０ｋＤａタンパク質がグラビンであることを確証した。さらに、cAMPを用いて免疫沈降がら溶出した画分中の触媒サブユニットの検出によりPKAホロ酵素の共存沈殿が示されたが、前免疫血清で処理した実験画分には存在しなかった。５４ｋＤａタンパク質は、免疫グロブリンＧ重鎖のような類似可動性で移動するので、免疫沈降中にＲサブユニットは検出できなかった。しかしながら、Ｒサブユニット／グラビン複合体は、HEL細胞抽出物を誘導するPMAから、cAMP−アガロース上のアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。高塩性緩衝液中で広範囲に洗浄した後、７５ｍＭのcAMPでそのアフィニテイ樹脂からグラビンを溶出した。遊離したグラビンはアフィニテイ樹脂に屈折するので、溶出液で検出されたタンパク質は調節サブユニットに関係していた。両方の共存精製技術は、PKAホロ酵素が生体内でグラビンに関係していることを強く示唆している。実施例７前に検討したように、これまで、グラビンはヒト線維芽細胞、ニューロン及び内皮細胞中にのみ検出されてきた。グラビンがより多くの広い細胞分布状態を持っているかどうか、または他の細胞タイプにおいて誘導されるかどうかを検出するために、主要なヒト細胞及び様々なヒト、サル、ラットの細胞系に対して抗体４０３７Ｊを使用して、ウェスタンブロット分析によって発現を検出した。細胞の調製第一次の末梢血単核細胞（PBMC）を成人ボランティアの分離したヘパリン処置された抹消血から分離した。血液をＣＭＦ−PBSで１：１に希釈し、１．０９６ｇ／ｃｍ³の密度で３０分間４００×ｇでヒストパーク（Histopaque）（Sigma． St.Louis,ミズーリ州）で覆い遠心分離した。得られた界面を集めてCMF-PBSで洗浄した。１０％胎仔ウシ血清を補充したRPMI培地で満たした１００ｍｍポリスチレン培養プレート（コーニング）中で１時間インキュベーションし、（上記のように調製した）PBMCから単核細胞を分離した。CMF-PBSで非接着細胞を洗浄除去した。ゴムへらでプラスチックから接着細胞（単核細胞）をこすり落とし、次いでPBSで洗浄した。上記のヒストパークの手順の赤血球／顆粒体画分を用いて、抹消血がら多形核細胞（PMN）を分離した。その細胞ペレットを、０．９％のＮａＣｌに溶解した３％のデキストラン（Pharmacia.Uppsala、スウェーデン）とC MF−PBSの等量中に３０分間再懸濁し、赤血球を沈殿させた。PMNが濃厚な上澄みを集めてCMF−PBSで３回洗浄した。洗浄の間に、３０秒間、１ｍｌの水中で、残存性の赤血球細胞を低浸透圧性細胞溶解させた。剰余の細胞は、CMF−PBS５０ｍｌで等張性状態に戻した。 ATCC（American Type CultureCollection,Rockville、メリーランド州）から以下のヒト細胞系を得て、RPMI＋１０％胎仔ウシ血清中で維持した。HEL（ヒト赤白血病細胞）、A549（ヒト肺上皮）、HEK293（ヒト胚芽の腎臓）、HL60（ヒト前骨髄球の白血病）、KU812（未熟ヒト好塩基性白血球）、Jurkat（ヒトＴ細胞リンパ腫）、THP1.1（ヒト単球）、RBL2H3（ラットの好塩基性リンパ腫）、 COS（サル線維芽細胞）、RAW309（マウス単核細胞）、RAW2647（マウス単核細胞）、3T3L1（マウス胚芽線維芽細胞）、L929（マウス線維芽細胞）及びEL4IL-2（マウス胸腺腫）。細胞培養を、４０ｎｇ／ｍｌのPMA、１０ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（LPS）、１０^-X Ｍ f-met-leu-phe（fMLP）（すべてSigma、St Louis、ミズーリ州）または１０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子α（TNFα，Boehringer Mannheim.Indianapolis、インディアナ州）の存在下で、一晩培養し、グラビン発現が刺激されたかどうかを検出した。細胞ペレットからの溶解物を調製し、実施例６に前述したように、タンパク質濃度を検出した。タンパク質−Ａ精製抗一グラビン抗体４０３７Ｊ、５μｇ／ｍｌを使用して、記述のようにウェスタンブロットによってグラビンに対する細胞可溶化物を分析した。様々な細胞系中のグラビンの発現 KU812、HEK293、A549、THP1.1及びマウス細胞系3T3L1及びL929を含む、数種のヒト細胞系において、ウエスタン分析は２５０Ｋｄのバンドが検出されたことを示した。主要なヒト細胞については、接着単核細胞のみが２５０ｋＤａのバンドを発現した。HEL細胞（実施例６を参照）のPMA刺激の例外はあるが、このバンドは、PMA、LPS、fNILPあるいはTNFaのいずれがでは他の細胞中に誘導されなかった。実施例２に記述されるオーバーレイ分析によって、それらのバンドはＲII結合タンパク質であることが確認された。グラビンを発現した細胞は、細胞集合中の形成または成長に対し、接着の共通機能を共にしていた。グラビンとＲIIの同時免疫沈降培養物からＨＥＫ２９３細胞を回収し、実施例４の記述のように溶解物を調製した。ＨＥＫ２９３溶解物（１００μｇ）を４０３７Ｊ（抗−グラビンポリクローナル）または２４１Ａ（抗ヒトＲII モノクローナル）抗体のいずれがの１０ μｇと、氷上で２時間、培養した。予め洗浄しておいたタンパク質Ｇ−セファロースビーズ（Pharmacia.Uppsala、スウェーデン）の等量を添加し、その試料をローター上で１時間培養した。そのビーズを３回細胞溶解緩衝液で洗浄し、続いて１回PBSで洗浄した。その後、ＳＤＳ試料緩衝液を、１００℃で２分間沸騰したビーズに添加した。試料を遠心沈殿し、上清を回収した。複製レーン中の４− １２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上へ、抗体（２μｇ）及びコントロールとしての細胞可溶化物（２５μｇ）とともにその試料を流した。標準の技術によって、イモビロンへタンパク質を転写した。６に記載した方法によって、得られたブロットをウエスタン分析した。１つのブロットが４０３７Ｊ抗体でプローブ化され、ヤギ抗−ウサギIgG−HRPで検出した。また、他のブロットを２４１Ａ抗体でインキュベートし、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−HRPで検出した。グラビンウエスタンにおいて、２５０ｋＤａのバンドが、細胞可溶化物、４０３７Ｊ同時免疫沈降物及び２４１Ａ同時免疫沈降物を含んでいるレーンに検出された。ＲIIウエスタンにおいて、細胞可溶化物中に５４ｋＤａのバンドが検出された。４０３７Ｊ及び２４１Ａの同時免疫沈降物を含んでいるレーンにおいては、５４ｋＤａで１本のバンドが検出され、他のバンドはわずかに高所へ泳動していた。この上部のバンドは、低いバンドがＲIIであることを示しているIgGレーンと一線になった。これらの結果は、細胞の中でグラビンとＲIIが関係しており、また、抗−グラビンあるいは抗−ＲIIのいずれかを用いて、細胞可溶化物から同時免疫沈澱物化することができることを証明している。実施例８ニコチン性アセチルコリン受容体は、５つの膜内外ポリペプチドから成る神経伝達物質をゲートするイオンチャンネルである。５つのポリペプチドは、陽イオンが流れることが可能であることによって、膜内外の水性細孔を形成しているように思われる。アセチルコリンの結合に応じて、イオンチャンネルは「開き」、細胞の中へのＮａ⁺の流れ（ナトリウム流）を可能にする。ナトリウムイオンの流入は、筋肉へ収縮するように信号する膜脱分極を引き起こす。個々の受容体は、アセチルコリンが受容体へ結合したままである期間中に、急速に開いたり閉じたりするように見える。アセチルコリン結合の数百ミリ秒以内に、チャンネルは閉じ、さらなるナトリウム流の流れを防ぎ、そのアセチルコリン信号は終了する。アセチルコリンに対するニコチン性アセチルコリン受容体の感度は、膜内外のポリペプチドのリン酸化によって低下する（感度低下）。アセチルコリンへの受容体の遷延露出は、受容体の感度低下に結びつく。PKAは、５つの膜内外ポリペプチドのセリン残基とチロシン残基のリン酸化によって、ニコチン性アセチルコリン受容体の感度低下に関係しているように見える。重症筋無力症は、ニコチン性アセチルコリン受容体に対する抗体の発生に関連した自己免疫疾患である。本発明は、その細胞の特異的な細胞下領域に対してPK A及びPKCを局在化するグラビン機能を熟考した。細胞骨格成分を標的とするPKA 及びPKCの調整におけるグラビンの役割は、樹状の細胞骨格の特定化された構造であるシナプス後性の密度で、PKA、PKC及びタンパク質ホスファターゼ２ＢをクラスタリングするＡＫＡＰ７９の役割と類似しているようである［Coghla nら，1995b;Klauckら，1996;Rosenmundら，Nature，368:853-856(1994)］。グラビンとPKC及び／またはPKAの間の結合を阻害するか廃止するモジュレーターは、特異的な細胞下領域へのPKA及び／またはPKCの局在化の調整において有用である。これらのモジュレーターは、グラビンまたはPKA及び／またはPKCに結合するグラビンの断片、及び他の非ペプチド化合物（例えば、分離されたあるいは合成された有機的あるいは無機的分子）に特異的に結合するポリペプチドを含むことができる。実施例９結合対象へのグラビンの結合を検出する分析を開発した。グラビンのＲII結合領域を含むＣ−末端クローンHP9は、下記のようにチオレドキシン（Trx）細菌性発現ベクターへクローン化した。グラビンのＲII結合領域をその中に含むＣ−末端クローン、pBSII/HP9（実施例３に記述）は、チオレドキシン（Trx）細菌性発現ベクターへクローニングされた。簡単には、チオレドキシン発現ベクターを構築するために、lacZ遺伝子及びlacZプロモーターを含んでいるpUC19へXbal/Hind IIIチオレドキシン断片をサブクローン化した。得られたプラスミドをTRX F/S p UC19と称した。TRX P/S pUC19へHF9クローンを挿入するため、NcoI部位をオリゴヌクレオチド、Met1153、5'TACAACCATGGACAGGCTATCCCCで作成した。（NCO切断部位に下線を付した。）3'オリゴヌクレオチドは、T7（ストラタジーン）を用いた。２つのオリゴヌクレオチドを用いたpBS/HF9の増幅は、３ｋｂ断片を生じ、それはNcoI及びXhoI（後者は、pBSのポリリンカーを提供した）で消化された。その後、NcoI/XhoI断片を、（NcoI/XhoIで予め消化させた）TR X F/S pUC 19中のチオレドキシン遺伝子でフレームに連結させた。大腸菌中に発現したその融合タンパク質を、３０℃で、０．７のO.D.₆₀₀へ１ｍＭのＩＰＴＧを用いて導いた。回収された細胞は、標準条件下にのフレンチプレスで溶解した。以下のように、タンパク質−タンバク質結合分析を行った。簡単には、PBSを満たしたイムロンプレート（Dynatech）の上で受動的に抗−Trxマウスモノクローナル抗体を捕獲した。実施例５に記述された方法を使用して、抗−Trxモノクローナル抗体を調製した。ウエル中の非特異的部位は、５０ｍＭクエン酸ナトリウム及び１４５ｍＭ塩化ナトリウムに溶解した２．５％ミルクを含む緩衝液で１時間、室温でブロックした。Trx／Ｃ−末端グラビンを含む大腸菌溶解物をPBS／０．２％BSAを満たしたウエルへ添加し、４℃で一晩おいた。遊離した非特異的タンパク質は、PBSで数回洗浄して除去した。ビオチン化されたＲII（標準の手順を使用して、化学上ビオチン化した）は、その後、リガンドとして使用され、０．０２％BSAを含むPBSに添加した。室温で３時間インキュベーションした後に、PBS／０．０５％ツイーン２０で複数回洗浄して、非結合のタンパク質を除去した。ストレプトアビジン−Ｅｕ（Wallac）を分析緩衝液（Ｗａｌｌａｃ）で１：１０００に希釈し、ビオチン化されたＲII／グラビン複合体を検出するために添加した。その後、PBS／０．０５％ツイーンで新たに洗浄して、非特異的結合タンパク質を除去した。水で１：１に希釈された促進溶液（Wallac）が添加され、増大した蛍光をDELFIA（商品名）リサーチ・フルオロメーター）（モデル1232 、Wallac）を使用してユウロピウムの遊離を測定した。このタンパク質−タンパク質結合分析は、グラビンに対する結合の５０％以上が特異的であることを示した。ビオチン化されたＲIIは、特異的かつ飽和可能な状態でグラビンへ結合していた。相互作用に関するＫｄは約５０ｎＭであることが認められ、それは、表面プラスモン応答を使用したNauertらが1996年に報告した内容に類似していた。実施例１０グラビンのアミノ酸配列は、SSeCKS／クローン３２２／クローン72［Chapli neら、1996］に多少の類似性を示している。グラビン及びSSeCKSの最初の1,000 個のアミノ酸に約６９％の相同性がある。また、グラビンは、ミリスチン酸化されたアラニンリッチPKC基質（MARCKS）に対して選択された領域にいくらかの相同性を示している［Aderem,Cell，71:713-716(1992)］。しかしながら、そのタンパク質配列の残余部分は全く別である。さらに、グラビンは、ＳＤＳゲル上で２５０ｋＤａの可動性で移動する１７８０のアミノ酸のタンパク質である。しかし、SSeCKS／クローン72は１６８７の残基であり、２０７ｋＤａで移動する［Li nら，(1996),Chaplinら，(1995)及びNational Center for Biotechnology Infor mation accession no.2210332A］。加えて、５つの予期される核の局在化シグナルの識別は、SSeCKSが核のタンパク質であるという考え方に結びついた［Linら，1995］が、免疫化学的データは、グラビンが細胞質の成分であり、また細胞骨格の成分でありそうなことを明らかに示している。クローン３２２は、腫瘍形成遺伝子で形質転換された細胞中でダウンレギュレーションされている腫瘍抑圧遺伝子であると記述されていた。グラビンとクローン72（及びクローン３２２）の間の配列類似性に基づくと、グラビンはまた腫瘍抑圧遺伝子としての機能するかも知れない。癌細胞が非接着細胞であることは当業者において公知である。悪性癌細胞の非接着性の性質は、これらの細胞が転移することを可能にしている。マトリックスタンパク質あるいは他の細胞からの癌細胞の遊離あるいは非接着は、移動あるいは新しい部位への転移に対する必要条件である。変化した細胞または腫瘍が発生した細胞は、細胞骨格の再組織、接着及び移動において機能するαアクチンまたはタリンのような細胞質のタンパク質の発現増加によって、それほど腫瘍を形成しない状態に変換されるかもしれない。［Gluckら，Cell Science,107:1773-178 2(1994)］。組織調査は、グラビンが制限された細胞の分布状態を示し、維芽細胞、ニューロン及び神経堤に由来する細胞中で主に発現することを示した［Groveら，1994 ］。これらの各細胞のタイプは、接着、移動性または経路探索機能に関与するので、グラビンが細胞膜／細胞骨格事象を制御するかもしれないと仮定された［Gr oveら，1994］。さらに、この見解は、グラビンが接着HEL細胞のひだ及び糸状仮足でPKAを集めることができるということを示す実施例４に記述された免疫局在化実験によって確認された。加えて、細胞接着中のグラビンの役割に対して実施例４にデータが記述されている。HEL細胞［Papayannopoulouら，1983］に接着するホルボールエステルは、グラビン発現の増加を伴う。ところが、ＳＶ４０誘導体を用いたREF 52繊維芽細胞の形質転換上の接着表現型の損失は、クローン72のダウンレギュレーションと同時発生した［Chapllneら，1996］。リン酸化現象が薄膜／細胞骨格の一体性の維持を促進するので、グラビンによって接着している PKA及びPKCは、接着工程で役割を果たしているかも知れないということがまた推測される。グラビンは接着細胞中で発現されるが非接着細胞では発現せず、クローン72は腫瘍形成遺伝子形質転換細胞中でダウンレギュレートされ、グラビンは癌生物学に関係があることが提示された。さらに、ニコチン性アセチルコリン受容体に関係の深い局在化しているキナーゼの機能に類似しており、グラビンは、細胞シグナルまたは他の刺激に対する応答が細胞接着分子のリン酸化をもたらす細胞接着分子に関係の深い１つ以上のキナーゼを局在化しているかも知れない。LFA-1β サブユニットの細胞質ドメイン中のスレオニン残基の置換が、LFA-1によって媒介される細胞接着を防止したと報告されている［Hibbsら，J.Exp.Med.,174:1227 -1238(1991)］。これらのスレオニン残基は、細胞活性化の間にリン酸化されると考えられる［Valmuら、J.Immunol.、155巻、1175〜1183頁(1995)］。これら残基は他のインテグリンβサブユニットに保存されている。このように、様々の異なるインテグリンによって媒介される細胞接着をリン酸化が調節しているのかもしれない。グラビンとその結合パートナーとの間の阻害または解消するモジュレーターが、グラビンによる結合パートナーの局在をモジュレートする上で有用である。例えば、モジュレーターは細胞接着分子近傍へのキナーゼの局在を妨害するかもしれない。これらモジュレーターには、グラビンまたはグラビン結合パートナーに結合するグラビンの断片に、特異的に結合するポリペプチド、及び、グラビン断片またはグラビンの断片と特異的に相互作用する他の非ペプチド化合物（例えば、単離されたもしくは合成された、有機もしくは無機分子）が含まれうる。本発明の実施にあたり、数多くの修正や変更をなすことが、当業者にあっては想起されると予測される。従って、添付の特許請求の範囲によってのみ、本発明は限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ノエルト，ジェイ．，ブリアンアメリカ合衆国 97201 オレゴンポートランドサウスウェスト 10スナンバー21 3106 (72)発明者クローク，テレサ，エム. アメリカ合衆国 97221 オレゴンポートランドサウスウェスト 39スドライブ 4708

Claims

【特許請求の範囲】１．cAMP依存性プロテインキナーゼのタイプII調節サブユニットに結合することができるグラビンのポリペプチド断片であって、配列番号：１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド断片。２．前記断片が、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド断片。３．プロテインキナーゼＣ（PKC）に結合することができるグラビンのポリペプチド断片であって、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド断片。４．請求の範囲第１、２または３項記載のポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド。５．請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。６．前記ポリヌクレオチドが、発現制御DNA配列に作動可能に連結されている請求の範囲第５項記載のベクター。７．請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチドで安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。８．好適な栄養培地にて請求の範囲第７項記載の宿主細胞を生育し、発現されたポリペプチドを細胞または培地から単離する工程を含む、グラビンのポリペプチド断片を製造する方法。９．請求の範囲第１、２または３項記載のポリペプチド断片と特異的な免疫反応性を有する抗体物質。１０．前記抗体物質がポリクローナル抗体である請求の範囲第９項記載の抗体物質。１１．前記抗体物質がモノクローナル抗体である請求の範囲第９項記載の抗体物質。１２．請求の範囲第１、２または３項記載のポリペプチド断片と特異的な免疫反応性を有するモノクローナル抗体を生産する細胞系。１３．グラビンポリペプチドと結合パートナーとの間のモジュレーターである化合物を同定する方法であって、以下の工程すなわち、ａ）グラビンポリペプチドと結合パートナーとの間の結合のレベルを、ある化合物の非存在下及び存在下に定量し、ｂ）工程（ａ）で観察される結合のレベルを比較し、ならびにｃ）工程（ｂ）で観察される結合の差に基づいて、グラビンポリペプチドと結合パートナーとの間の結合のモジュレーターとして前記化合物を同定する工程を含む方法。１４．前記結合パートナーまたはグラビンポリペプチドが、検出可能な標識でラベルされる請求の範囲第１３項記載の方法。１５．前記検出可能な標識が、放射線標識である請求の範囲第１４項記載の方法。１６．前記グラビンポリペプチドが、配列番号：１に示すアミノ酸配列を含む断片である請求の範囲第１３項記載の方法。１７．前記グラビンポリペプチドが、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む断片である請求の範囲第１３項記載の方法。１８．前記グラビンポリペプチドが、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む断片である請求の範囲第１３項記載の方法。１９．前記結合パートナーが、cAMP依存性プロテインキナーゼのタイプII調節サブユニットである請求の範囲第１３項記載の方法。２０．前記結合パートナーが、プロテインキナーゼＣである請求の範囲第１３項記載の方法。