JPH10508482A

JPH10508482A - 抗体

Info

Publication number: JPH10508482A
Application number: JP8515138A
Authority: JP
Inventors: クル・ジュニア、フレドリック・チャールズ; フライング、メアリ・エリザベス; スティメル、ジュリー・ベス
Original assignee: ザ・ウエルカム・ファウンデーション・リミテッド
Priority date: 1994-11-05
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 1998-08-25
Also published as: WO1996014339A1; EP0789713A1; AU3811495A; ZA959336B; GB9422383D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、特異的部位で結合できる抗体、このような抗体の部位特異的結合方法、特異的部位で結合している抗体、および治療と診断におけるこのような抗体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】抗体本発明は、特異的部位で結合できる抗体、このような抗体の部位特異的結合方法、特異的部位で結合している抗体、および治療と診断におけるこのような抗体の使用に関する。抗体は、疾患を誘発する外来性物質に対する哺乳動物の免疫応答の重要な成分である。抗体は、多くの方法のいずれかを用いて生体外で製造され、そのような抗体、特にモノクローナル抗体やその断片は、診断および治療用物質として有用であることがわかった。抗体の有用性は、そのユニークな抗原特異性、すなわち病原性抗原または腫瘍関連抗原のような独立した化学的分子を認識しこれに結合する能力に由来する。その有用性の別の側面は、その多様性、すなわち非常に多種類の独立した遺伝的に規定された抗体（モノクローナル抗体）を作成する哺乳動物の能力（および、現在はファージディスプレイ（phage display）のような過程）である。抗体の有用性の最後の側面は、その「定常」領域を介して相互作用する能力である。この最後の側面は、他のセットの性質、例えばエフェクター細胞、補体または他の結合分子（例えばプロテインＡ）との相互作用のようなイソタイプに共通の性質を決定する。抗体または断片の有用性は、成分単独では自然には存在しない性質を結合体（ conjugate）に持ち込む１以上の追加の分子的残基(molecular moieties)（以後、物質と呼ぶ）を、直接または間接に化学的に結合することによって増強される。そのような性質には、色素や放射性核種のようなレポーター機能、酵素的機能、第２の結合機能（例えば、ビオチン−アビジン）、薬物（例えば、アドリアマイシン）、細胞毒性機能（例えば、リシン）、キレート物質、または広範な分子的残基のいずれかと抗体が反応できるようにする化学的結合残基(chemical link age moiety)がある。すなわち、抗体結合体は、抗体と、該抗体に直接または間接に抗体に結合した活性物質（物質）を含んでなる。例えば、活性物質が放射性核種の時、放射性核種は抗体に直接結合するか、または例えばＴＭＴのようなキレート物質または例えばブロモアセチルのようなさらなるタンパク反応性基（架橋物質）により抗体に結合するキレート物質を介して、抗体に間接的に結合してもよい。同様に、活性物質は、酵素−プロドラッグ治療に使用するための分子的キメラでもよく、そのようなキメラは、癌細胞のような哺乳動物細胞中で活性化される転写制御ＤＮＡ配列、転写制御ＤＮＡ配列に機能的に結合しており、投与されるプロドラッグの癌細胞に毒性のある物質への変換を触媒することができる異種酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。この分子的キメラは、抗体に直接結合しているが、またはウイルスベクターまたはリポソーム内に含有され、そのウイルスベクターまたはリポソームが次に抗体に結合してもよい（例えば、ヨーロッパ特許出願第９０３０９４３０．８号を参照）。抗体やその断片への分子の化学的付加または架橋について多くの方法が記載されており、そのような反応は一般に結合反応（conjutgation reaction）と呼ばれる。結合反応は、抗体中に天然に存在する化学的官能基を利用する。例えば、共通のアプローチの１つは、一級アミン（主に、リジン残基のεアミノ基）を標的にする。このアプローチの他の共通の例は、チロシン残基のヨード化（例えば、¹²⁵Ｉ）である。このアプローチの欠点は、ランダムであることである。すなわち、リジンまたはチロシン残基は、分子構造の全体に存在するため、これらの残基が伝達を補助すべき天然の性質（例えば、抗原認識、補体反応性またはエフェクター細胞相互作用）が犠牲になることがある。結合体の挙動は、個別のユニークな成分（そのいくつかは、全く無効であるかまたは有害である）の挙動の平均である。このランダムなアプローチは、抗原認識に影響することも知られている。部位特異的結合（すなわち、抗体構造内の特異的アミノ酸残基への結合）は、得られる結合体は異なる生成物の混合物ではないという利点を導く。抗体が結合体に導入する性質（例えば、抗原反応性または薬物動態安定性）は、明確な化学的構造に帰因する。さらに、抗原結合性を有する領域から空間的に離れているような部位を選択できる。例えば、抗体の可変領域には抗原結合部位を含まれ、重鎖のＣＨ２ドメインにはエフェクター（ＦｃＲ）および補体（Ｃ１ｑ）相互作用残基が含まれることが知られている。従って、重鎖のＣＨ３ドメインへの付加を選択することにより、これらの機能を犠牲にすることを避けることができる。部位特異的結合方法の２つの例が記載されている。抗体の糖鎖部分(carbohyd rate portion)に対する抗体の結合が詳述されている（O'Shannessy and Quarles ，J．Immunol．Met 99:153-161，1987）。ヒトのＩｇＧ抗体は、ＣＨ２ドメインのａｓｎ２９７に１つの共通のグリコシル化部位を有する。（なお、本明細書に記載のアミノ酸はすべて、ＥＵ指数に従って番号が付けられていることに留意されたい。Kabatら、「免疫学的興味のあるタンパクの配列」（Sequences of prot eins of immunological interest）、第５版、ＮＩＨ publication No．91-3242 ，1991。共通のイソタイプを、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ４などと呼ぶ）。グリコシル化結合方法は、抗原またはエフェクター相互作用に必要となるかも知れない糖鎖を変化させる危険性を有する（Lundら、Molec．Immunol 27: 1145，1990；Isaacsら、J．Immunol．1-18: 3062，1992）。抗体への部位特異的結合の他の例では、部位特異的突然変異誘発による抗体上の遊離チオールの形成が関与する。抗体は天然のシステイン残基を有し、そのチオール基はジスルフィド結合により結合している。天然に存在するシステイン残基の位置は種間で高度に保存されており、これらの残基が、抗体の構造と機能にとって必須であることを示している。抗体は、遊離のスルフヒドリル基を天然には含有しない。そのチオール基が酸化されないか、または天然のスルフヒドリル結合が犠牲にならないシステインを含有するように、抗体を作成することは理論的に魅力的である。システイン残基のスルフヒドリル基は、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびアリール、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドのようなスルフヒドリルに特異的な、多くの結合化学による結合のために使用することができる。しかし、天然にはないシステイン残基を有するように設計されている変種モノクローナル抗体は、結合のために利用できる遊離のチオール基を事実上有するということはない。（抗体は２つの同じ重鎖と２つの同じ軽鎖から構成され、遺伝子の作成方法および発現方法に依存して、１つの鎖の残基の遺伝子的置換により、完全なＨ２−Ｌ２構造に２つの新しい残基をできることがあるため；さらに、２つの残基は、その空間的配置と近傍の状況のため化学的に同一ではないため）。作成されたチオールの１つの既知の例では（Bodmerら、米国特許第５，２１９，９９６号、およびLyonsら、Protein Eng．3: 703，1990）、抗体構造内の別個の「凹型」分子ポケット（直径０．１３〜０．５mmの小分子のみが近づくことができ、同じかまたは異なる抗体鎖内にジスルフィド結合を形成することができないポケット）にシステイン残基が導入された時のみ、利用可能な遊離のチオールが観察された。モノクローナル抗体の「凸型の」または「平面的な」表面に導入されたシステイン残基は、遊離のチオールを有さないことがわかった。従って当業者は、表面システイン残基は、同じおよび／または別の抗体鎖内にジスルフィド結合を形成し、そのため抗体の巨大分子構造や機能をゆがめると結論できるであろう。公表されている文献は、作成した表面チオールは抗体の構造と機能を変化させることを示している。例えば、ｓｅｒ４４４→ｃｙｓ変種の抗体産生細胞の粗上清中にモノマーとダイマー（ＩｇＧ−ＩｇＧ）の両方とも観察された（Shopes， J．Immunol．148: 2918，1992）。これに関連して、ｓｅｒ４４４→ｃｙｓ変種を利用して、ダイマー抗体の産生方法が記載された（Caronら、J．Exp．Med．17 6: 1191-1195，1992）。これらの例の両方のダイマーＩｇＧが、インビトロでエフェクター機能が増強していることがわかった。これらの実験および前述のBdom erらの実験において、ダイマーが操作した部位で形成したか、またはどの程度正常なジスルフィド結合が修飾されているかを示す、生理学的証拠は提供されていない。最後に、ｓｅｒ１１９→ｃｙｓ変種を作成することによる「つながれた」抗体が記載されている（Shopes，Mol．Immunol．30: 603，1993）。この変種は、ダイマーおよび鎖間構造変種すなわち「つながれた」抗体を生成したと報告されている。構造異常物の混合物は、規定された化学的物質を得るという目的を犠牲にする。従って、抗体の表面に露出したシステイン残基を含有するモノクローナル抗体（特に、ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ重鎖変種を含有するもの）が、部位特異的結合を受けることを見いだしたことは、驚きであり予想外であった。従って本発明は、システイン残基が物質に結合できるように、抗体の表面に露出しているシステイン残基を含んでなるモノクローナル抗体を提供する。ここで、該抗体は免疫化学的機能を有し、また免疫化学的機能の用語は、主に抗体の結合能力を意味するが、エフェクター機能（もし存在するなら）をも包含する。抗体の可変領域が抗原結合部位を含有することを考えると、結合の好適な部位は、抗原結合に関与しない可変領域の表面上の表面残基（例えばｓＳｖ重鎖−軽鎖リンカーペプチド）、並びに軽鎖の定常領域、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを包含する抗体の定常領域の表面残基であり、ヒンジ領域も含まれる。すなわち、抗原結合に関与しない抗体表面のすべての残基、特にＣＤＲの一部でないものが、物質への結合に適している。抗体がエフェクター機能を有する場合は、結合の好適な部位は、エフェクター機能を含むことが知られているＣＨ２ドメイン以外は同じである。システイン残基は実質的に還元型である。より好ましくは、還元システイン残基は、重鎖のＣＨ３ドメインにあり、好ましくはＣＨ３ドメイン内の４４２位にある。還元システイン残基の別の好適な位置は、重鎖 −軽鎖リンカーペプチドである。新規のｃｙｓ４４２抗体は、その産生細胞により、モノマーＩｇＧ型と凝集型の両方を示すように発現されることが可能である。凝集の存在は、BodmerらとShopesの研究で観察されたように、ｃｙｓ４２２変種が表面変種であることを示唆するが、驚くべきことにほとんどの抗体は凝集型ではなかった。モノマーＩｇＧは、例えばゲル濾過クロマトグラフィーにより容易に精製可能であり、モノマー型は長期間の保存でも安定であった。モノマーＩｇＧは、遊離のチオールを有さないことがわかった（表１）。理論に拘泥するつもりはないが、チオールはまず、天然に存在する付加物（例えば、グルタチオン）により阻止（すなわち、保護）されると我々は考えている。我々は、加工されたチオール(engineered thiol)は、天然のジスルフィド結合を還元しない制御された条件下で還元されることを発見した。例えば、天然のジスルフィド結合を還元することができない低濃度の還元剤のような穏やかな条件が、加工されたチオールの還元に適していることがわかっている。還元抗体は、ｐＨ８で長期間保存された時でもモノマー型を維持する。（ｐＨと酸素をうまく操作することによりチオールは反応性になることは公知である）。すなわち、制御された還元により、加工された抗体は、特に加工されたチオールで特異的に部位特異的化学的付加が可能になるようにできる。従って本発明はまた、抗体の表面に露出したシステイン残基を含んでなるモノクローナル抗体であって、制御された還元により物質への部位特異的化学的結合が可能になり、システイン残基は抗体の免疫化学的機能を妨害しない部位に導入される抗体に向けられている。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体またはその断片であり、抗体という用語は、抗体と抗体断片の両方を包含する。本発明の抗体は任意の種から得られる。抗体は、可変領域が１つの抗体から得られ、定常領域は別の抗体（例えば、ヒトの抗体）から得られるキメラ抗体でもよい。すなわち、キメラ抗体は、種／種キメラまたはクラス／クラスキメラでもよい。このようなキメラ抗体は、抗原結合性を改善するために、またはエフェクター機能を改善するために、１つまたはそれ以上のさらなる修飾を受けても良い。改変抗体の別の型は、定常領域とＣＤＲ以外の可変領域がヒトのフレームワークに移される複合抗体を包含するヒト化抗体である。結合能を回復するために必要であれば、フレームワークまたはこのような抗体の定常領域内の追加のアミノ酸を修飾してもよい。すなわち、本発明で使用される抗体は、アミノ酸配列が天然に存在するものではない任意の改変抗体を包含する。しかし、ＣＤＲを移植された抗体が最も好ましい。本発明の抗体は、例えばＧ１、Ｇ２、Ｇ４のような異なるイソタイプを含む。抗体の例は、J．Cell Biol 125(2)437-446，1994年４月、およびProc．Natl．Acad．Sc i．87，3542-3546，1990年５月、に記載の４０ＫＤ抗体（ＣＯ／１７．１．Ａ）であり、好ましくはヒト化抗−４０ＫＤ抗体であり、特にＧ４イソタイプのヒト化抗−４０ＫＤである。抗−４０ＫＤ抗体の具体例は、３２３／Ａ３であり、好ましくはヒト化３２３／Ａ３であり、特に好ましくは３２３／Ａ３ＩｇＧ４である。抗体の別の例は、A．Tomasettiら、ヨーロッパ生化学会連合（Federation of European Biochemical Societies）第３１７巻、143-146、1993年２月、に開示されている抗−葉酸受容体抗体であり、好ましくはヒト化抗−葉酸抗体および特にＧ１イソタイプのヒト化抗−葉酸抗体である。抗−葉酸抗体の具体例は、ＭＯＶ１８であり、好ましくはヒト化ＭＯＶ１８ＩｇＧ１である。抗体のさらなる例には、抗−ＣＥＡ、抗−ムチン（mucin）、抗−２０／２００ＫＤ、抗−ガングリオシド、抗−ジゴキシン、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ２３、抗−ＣＤｗ５２、およびより具体的には、ヒト化抗−ＣＤｗ５２抗体であるＣａｍｐａｔｈ−１Ｈがある。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（登録商標）のＣＤＲを含む抗体鎖ＤＮＡ配列は、ＥＰＯ３２８４０４に開示されており、その開示内容は参考のため本明細書に引用される。（Page，M.J.，and Sydernham，M.A.，チャイニーズハムスター卵巣細胞でのヒト化モノクローナル抗体Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの高レベル発現、Biot ech．9: 64-68，1991）。本発明で使用される抗体断片には、Ｆab、Ｆ(ab)2、Ｆv、および組換えＤＮＡ技術で得られるような合成ペプチド配列からなる断片がある。本発明で使用されるモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の方法で調製されるか、またはさらに詳しくはＧＢ９０２２５４７．５に記載のものがある。精製は、ＥＰ−Ａ−９１９１７８９１に記載のように行われる。断片は、文献、例えば「抗体、実験室マニュアル（Antibodies，a laboratory manual）」、E．Harlow and D．Lane編、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、1988に記載のような任意の方法、または分子遺伝学的方法により調製される。本発明はまた、システインが直接または間接的に物質に結合している抗体を提供する。物質が抗体に間接的に結合している時、それは、例えばキレート物質のような１つまたはそれ以上の結合残基を介して、抗体に結合される。１つまたはそれ以上の結合残基を介して抗体に結合されるそのような物質は、「２官能性物質」として知られている。そのような結合残基は、例えば、抗体のようなタンパク内のチオール官能基に共有結合することができるマレイミドまたはブロモアセチルのような官能性化学的残基でもよい。結合残基はまた、物質と抗体結合残基の間の橋として機能する化学的スペーサー（例えば、ｐ−ベンジル基）を利用してもよい。結合物質の例には、色素、放射性核種、酵素、薬物、細胞毒、およびビオチン／アビジンがある。薬物や細胞毒の具体的な例は、それぞれアドリアマイシンおよびリシンである。キレート物質の具体的な例には、以下のものが含まれる：・ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ'' ，Ｎ'''−四酢酸）；・ＰＡ−ＤＯＴＡ（α−［２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル］−１，４，７，１０−１−酢酸−４，７，１０−トリス（メチル酢酸））；・ＴＭＴ（６，６''−ビス［Ｎ，Ｎ''，Ｎ'''−テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル）−４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−２，２'：６' ，２''−テルピリジン）；・ＩＢ４Ｍ−ＤＴＰＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタキス（カルボキシメチル）−２−［（４−アミノフェニル）メチル］−６−メチルジエチレントリアミン）；・ＣＨＸ−Ａ−ＤＴＰＡ（Ｎ−［２−アミノ−３−（ｐ−アミノベンジル）プロピル］−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ'' ，Ｎ''−五酢酸）；・ＴＲＩＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸）；および・ＴＥＴＡ１，４，８、１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ' '，Ｎ'''−四酢酸。物質が放射性核種の場合、これは直接または間接的な方法で抗体の遊離のチオールに結合される。例えば、Schawartz法（Schawartz，A.，and Steinstrasser ， A.，J．Nucl．Med．18:721，1987）に類似の方法を修飾して、⁹⁹ｍＴｃを抗体に結合させる（ここでは、天然のジスルフィドを還元する必要はないであろう）。金属性放射性核種（⁹⁰Ｙ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹¹¹Ｉｎおよび⁶⁷Ｃｕ）は、間接的プレラベル法により結合される（ここで放射性核種をまず２官能基キレート物質に付加し、次に抗体に結合させる）か、または間接的ポストラベル法により結合させる（ここではあらかじめ形成したキレート物質−抗体結合体に放射性核種を結合させる）。本発明のキレート物質は、キレート物質を抗体のチオール基に結合させることができる任意のヘテロ−またはホモ−２官能性架橋リンカー（すなわち、化学的スペーサー）（M．McCallら、Bioconjutate Chem．1，222-236， 1990）、またはPierce「免疫技術のカタログとハンドブック」（″Immuno Techn ology Catalog and Handbook″）、1992、E8〜E39頁およびParker、Chem．Soc. Rev．［1990］，19，271-291に記載の架橋物質とそこに記載の方法を用いて、抗体に結合させてもよい。架橋リンカーと組合せるキレート物質の例としては、以下のものがある：・ブロモアセチル−ＤＯＴＡ（２−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル− １，４，７，１０−テトラアザシクロードデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸）；・ブロモアセチル−ＴＲＩＴＡ（２−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''− 四酢酸）；・ブロモアセチル−ＴＭＴ（２−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル］− ６，６''−ビス［Ｎ，Ｎ''，Ｎ''−テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル） −４’−（３−アミノ−４’−メトキシフェニル）−２，２’：６’，２''−テルピリジン）。２官能性キレート物質架橋リンカーの組合せであるブロモアセチル−ＤＯＴＡ（ＢＡＤとも呼ぶ）は、M.J．McCall，H．Diril．and C.F．Meares，Bioconjuga te Chem．1:222-226，1990）に記載されている。さらに詳しくは、本発明で使用されるキレート物質は、ＤＯＴＡまたはＴＭＴであり、タンパク反応性基（架橋リンカー）は、ブロモアセチルまたはマレイミドであり、最も好ましくはブロモアセチルである。本発明で使用されるキレート物質は、任意の既知の方法により調製される（例えば、M．McCallら、前述）。本発明において使用される放射性核種には、インビボの放射免疫療法および／または標的細胞または標的組織のイメージングに適したものがある。放射免疫療法のためには、細胞性ＤＮＡを破壊するために高線量のエネルギーを標的部位に与える必要がある。αおよびβ放射性放射性核種は、適当なエネルギー範囲の放射線を出す。しかし、α−放射性物質は、短命であるか、または崩壊して有害な娘産物になる。従って放射免疫療法に最適の放射性核種は、普通β−放射性物質である。イメージングのためには、放射線は、体組織との相互作用ができるだけ少なく、外部から検出できるように強いシグナルを出す必要がある。従って、イメージングにはガンマ放射線放出性放射性核種が最も適している。イメージングと放射免疫療法の両方のために、放射性核種は、投与と標的部位への結合の間の経過時間後に活性を有し検出するのに適当な半減期を有していなければならない。放射能標識抗体は、血流中から内皮孔を介して標的の細胞外液に移動する必要がある。大きな抗体または抗体／キレート物質複合体は、拡散が遅く、放射性核種の半減期は数時間〜数日が好ましい。本発明の特定の側面において、放射性核種は、¹⁹⁵ｍＰｔ、⁵⁷Ｎｉ、⁵⁷Ｃｏ、¹⁰⁵Ａｇ、⁶⁸Ｃｕ、⁵²Ｍｎ、⁵²Ｆｅ、¹¹¹Ｉｎ、^113mＩｎ、^99mＴＣ、⁶⁷Ｇａ、¹⁶⁹Ｙｂ、¹⁶⁶Ｔｍ、¹⁶⁷Ｔｍ、¹⁴⁶Ｇｄ、¹⁵⁷Ｄｙ、⁹⁵mＮｂ、¹⁰³Ｒｕ、⁹⁷Ｒｕ、⁹⁹Ｒｕ、^101mＲｈ、²⁰¹Ｔｌ、²⁰³Ｈｇ、¹⁹⁷Ｈｇ、²⁰³Ｐｂ、⁹⁹Ｒｈ、⁴⁸Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁵³Ｓｍ、⁸⁸Ｙ、⁹⁰ Ｙ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｂｉ、²¹²Ｐｂおよび¹⁷⁷Ｌｕよりなる群から選択される。本発明のより具体的な例では、放射性核種は、¹¹¹Ｉｎ、⁶⁷Ｃｕ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸ ⁸ Ｒｅ、¹⁷⁷Ｌｕ、⁹⁹ｍＴｃ、¹³¹Ｉ、88Ｙ、⁹⁰Ｙ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｂｉ、²¹²Ｐｂ、⁵⁷ Ｃｏ、¹⁵³Ｓｍ、⁸⁸Ｙ⁹⁰Ｙおよび¹⁷⁷Ｌｕよりなる群から選択される。本発明のより具体的な例では、放射性核種は、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁵³Ｓｍ、⁹⁰Ｙおよび¹¹¹ Ｉｎである。本発明はまた、直接または間接に放射性核種に結合した本発明の抗体を含んでなる放射標識抗体、特にＤＯＴＡまたはＴＭＴを介して⁹⁰Ｙまたは¹⁷⁷Ｌｕで標識されたキレート物質−抗体結合体を提供する。本発明はまた、特異的部位で結合されることができる抗体の産生方法、および本発明の抗体の部位特異的結合方法を提供する。本発明の別の側面において、治療と診断における本発明の結合した抗体の使用が提供される。特に、色素、放射性核種酵素、薬物および細胞毒を用いて検出できるか、或いは治療できる症状の診断および／または治療のための、本発明の抗体の使用を提供する。これらの抗体複合体は、リンパ腫や白血病、特に小細胞肺癌や非小細胞肺癌、前立腺癌ならびに卵巣癌のような癌の治療に有用である。本発明の最も好適な側面において、癌や関連する転移のイメージングおよび／または治療に使用される本発明の抗体複合体を提供する。これらはまた、免疫抑制物質として使用され、および特に重症の血管炎、リウマチ様関節炎、全身性ループス、また多発性硬化症、移植片対宿主疾患、乾癬、若年性糖尿病、シェーグレン症候群、甲状腺疾患、重症筋無力症、移植拒絶および喘息などの自己免疫疾患などのＴ細胞介在性疾患の治療に、使用される。本発明はまた、前記のいずれかの疾患の治療またはイメージングのための薬剤の製造における前記結合した抗体の使用を提供する。本発明の別の側面によれば、本発明の結合した抗体複合体を用いた治療および診断ができる症状の治療法であって、治療的有効量の抗体複合体をそのような治療の必要な哺乳動物に投与することを具備した方法を提供する。特に、リンパ腫や白血病、特に小細胞肺癌や非小細胞肺癌、前立腺癌ならびに卵巣癌のような癌の治療法、および特に癌や関連疾患の治療法が提供される。これらはまた、重症の血管炎、リウマチ様関節炎、全身性ループス、また多発性硬化症、移植片対宿主疾患、乾癬、若年性糖尿病、シェーグレン症候群、甲状腺疾患、重症筋無力症、移植拒絶および喘息などの自己免疫疾患などのＴ細胞介在性疾患の治療方法に使用される。また本発明において、結合したモノクローナル抗体またはその断片および１つまたはそれ以上の薬剤学的に許容される賦形剤とからなる、本発明の結合した抗体を含有する薬剤学的に許容される組成物が提供される。このような組成物は、結合した抗体以外に、おそらくは他の抗体もしくは抗生物質のような他の物質との混合物である、生理学的に許容される希釈物または担体を含む。適当な担体には、リン酸緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水グルコースおよび緩衝化生理食塩水などがあるが、これらに限定されない。投与経路は、通常静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内注射または送達などの非経口投与である。放射免疫療法の点から、本発明の放射性核種に結合した抗体を含有する組成物の投与量は、治療される症状および治療の受容者により異なるが、成人患者では約１〜１００mgの範囲であり、好ましくは１〜１０mg、最も好ましくは５mgが、通常注入物として投与される。１日１０mg投与した数週間後または数ケ月後に第２回目の繰り返し投与が好ましい。放射免疫療法の点から、このような組成物の投与量は、治療される症状および治療の受容者により異なるが、成人患者では１〜約１００mgの範囲であり、好ましくは１〜１０mg、最も好ましくは５mgである。また、細胞活性もしくは選択された抗原の存在に対する防御もしくはその検出において、本発明の結合した抗体を用いて使用するためのキットが提供される。すなわち、本発明の結合したモノクローナル抗体が、容器中で通常凍結乾燥型で、単独または目的の型の細胞に特異的な追加の抗体とともに提供される。色素、放射性核種、酵素、薬物、細胞毒、キレート物質およびビオチン／アビジンに結合した抗体は、緩衝液（例えば、トリス、リン酸塩、炭酸塩など）、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク（例えば、血清アルブミン）などおよび使用説明書のセットとともにキット内に含まれる。一般にこれらの物質は、活性な抗体の総量に基づき約５％未満、そして通常活性な抗体の濃度に基づき少なくとも約０．００１重量％の総量で存在する。しばしば、不活性の増量剤または賦形剤を含有させて活性成分を希釈することが好ましく、この場合賦形剤は組成物全体の約１〜９９重量％で存在する。キメラ抗体に結合することができる第２の抗体が測定に使用される場合、これは通常別のバイアル中に存在する。第２抗体は、典型的には標識物に結合し、前述の抗体調製物と同様に調製される。一般にキットは使用説明書のセットを含む。図面の説明図１．変種抗体の免疫反応性ａ）Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗原特異性を有する５つの別個の抗体調製物（２つの天然のイソタイプ（Ｇ１とＧ４）および３つの変種（Ｇ４ｍ、Ｇ４ｃおよびＧ４ｍｃ）（Ｇ４ｃとＧ４ｍｃはｓｅｒ４４２→ｃｙｓ置換を含有する））を作製し、実施例１に記載のようにＮＳＯ細胞中で発現させた。抗体を³⁵Ｓでｉｎｓｉｔｕで標識し、下記の方法で精製した。２×１０⁷個の洗浄した産生細胞を、５mlのメチオニンシスチンを含まないＤＭＥＭ（アイシーエヌ・バイオメディカルズ（ICN Biomedicals）、コスタメサ、カリホルニア州）（６μg/mlシスチン、３μg/mlメチオニン、および８〜１０mCiの³⁵Ｓメチオニン（例えば、Tran³⁵S -label（ICN））含有）中で、３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。遠心分離して上清を採取し、透析し、濃縮（セントリコン（Centricon）、アミコン（Amicon）、ビバリー、マサチューセッツ州）した。抗体をプロテインＡクロマトグラフィー（ＨＰＬＣダイナマックスハイドロポア−プロテインＡ（HPLCDy namax Hydropore-protein A）ミニカラム［ライニン（Rainin）、ウォボーン（W oburn）、マサチューセッツ州］）で精製し、１Ｍ酢酸で溶出し、限外ろ過（例えば、ＰＭ３０膜（アミコン（Amicon）））し、さらにＨＰＬＣゲル濾過（例えば、Ｓ−５２００Ａジオール、ＹＭＣ、ウィルミントン、ノースカロライナ州）した。プロテインＡ溶出液を、非標識抗体と一緒にゲル濾過で分析すると、比活性約２μCi/μgを有していた。免疫反応性は、Lindmoらの方法（J．Immunol．Me th．72:77-84，1984）を用いて、Fixed Wein 133 Cl細胞で測定した。ｙ切片（この逆数は、免疫反応性の尺度である）は、すべての調製物について同等であったことに注意されたい。（傾きは、比活性の関数であり、免疫反応性の関数ではない）。ｂ）固定Wein 133 Cl細胞でのＣａｍｐａｔｈ−１ＨＧ１およびＧ４ｍｃに対する平衡特異的結合競合。２つの抗体を、³⁵Ｓでｉｎｓｉｔｕで生合成的に同じ比活性（０．３mCi/nmole）まで標識し、前記のように精製した（³⁵Ｓ−リガンド）。平衡競合は平行して行い、ここで各リガンドは、それぞれの非標識型により競合させた。結合は、５×１０⁴固定 Wein 133 C1細胞、約０．１ｎＭの記載のＣ１Ｈの放射標識型と記載の濃度の競合物質を含有する０．２ml中で行なった。結合緩衝液は、リン酸緩衝化生理食塩水、２％子ウシ血清、０．０１％トリトンＸ−１００、および０．０２％アジ化ナトリウム（結合緩衝液）であり、４℃で一晩行なった。細胞を遠心分離し、冷結合緩衝液で３回洗浄し、放射能を測定した。点は、３重測定の平均±標準誤差（棒）を示す。２つの抗体は、³⁵Ｓでｉｎｓｉｔｕで生合成的に同じ比活性（０．３mCi/nmole）まで標識し、前記のように精製した（³⁵Ｓ−リガンド）。平衡競合は平行して行い、ここで各リガンドは、それぞれの非標識型により競合させた。２つのプロフィールは、抗体が同じ抗原結合能力を有することを示す。部位特異的結合のより明確な証拠は、実施例３に記載のように調製したモノクローナル抗体キレート物質結合体を放射標識して得た。ペプチドマッビング（ペプチドの酵素的消化、分画、およびペプチドアミノ酸配列の解析）により、すべての放射能ピークは、ｃｙｓ４４２−キレート物質付加物を含有する重鎖Ｃ−末端ペプチド断片から構成されることが確定した。図２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示される部位特異的結合ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ変種であるＣａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、実施例２に記載のように特異的に還元した。比較のために、McCallら、Bioconjugate C hem．1:222-226，1990に記載の方法を用いて、チオール基を非還元抗体に導入した（この方法は、２−イミノチアランを用いてリジン残基のεアミノ基にチオール基を導入する、ランダム結合方法である）。次に、両方のチオール含有抗体調製物を、実施例２に記載のように結合させた。等量の標識結合体に、還元ＳＤＳ −ＰＡＧＥを行い、ここで抗体重鎖および軽鎖サブユニットを、そのサイズにより分離した。ゲルを、タンパク（左側）と、オートラジオグラフィーにより放射能（右側）について染色した。レーンは左から右に：ランダム、タンパク染色；特異的、タンパク染色；ランダム、オートラジオグラフィー；特異的、オートラジオグラフィー、である。図は、結合体の付加は、特異的標識法について重鎖に局在しており、ランダム法については両方のサブユニットが標識されたことを示す。図３． ⁹⁰Ｙ−ＴＭＴ−Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃ結合体の生体分布。還元Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、ブロモアセチル−ＴＭＴに結合させ、⁹⁰ＹＣｌ₃ で放射標識し、ブロモアセチルＤＯＴＡについて記載したように担癌マウスで、生体分布を測定した。棒は、５匹のマウスで放射能崩壊について補正した平均注入投与％／ｇ組織（%ID/g）を示す。以下の実施例により本発明を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例１．ｃｙｓ置換による変種モノクローナル抗体の産生（ａ）Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈと抗−ジゴキシン変種。従来法の分子遺伝学的方法により、種々のイソタイプの重鎖にｃｙｓ４４２を導入した。例えば、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ４、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈおよび抗−ジゴキシン（いずれもＩｇＧ１）の遺伝的作製体は、ウェルカムラボラトリーズ（Wellcome Laboratorie s）内で得た。ＣＨ３領域の末端部分を、制限酵素Ｎｓｉｌ（５’）およびＥｃｏＲＩ（３’）で切断し、各切断部位で連結したアニーリングした２本鎖オリゴヌクレオチドで置換した。抗原の特異性は、可変領域とＣＨ１領域の各置換により、定常領域に導入した。Pinkら、Biochem．J．117:33-47，1970が最初に報告したＧ４配列に一致するようにするため、ｓｅｒ２２８→ｐｒｏをＩｇＧ４に導入した。Ｇ４ｍｃと呼ぶＩｇＧ４ｃｙｓ４４２変種を、ＣＨ２領域中のこれらの残基を変化させることによりさらに修飾した：ｌｅｕ２３５→ａｌａ、ｇｌｙ２３７→ａｌａ、およびｇｌｕ３１８→ａｌａ。これらの後者の変化は、このような変化がＦｃガンマ受容体と補体Ｃ１ｑとの抗体の相互作用を低下させるように、Winterらの理論に基づき導入した（Duncanら、Nature 332: 563-564，1988; Duncan and Winter，Nature 332: 738-740，1988）。（ｂ）３２３／Ａ３変種。マウス抗体３２３／Ａ３は、腺腫の治療の同定に有用なヒト上皮組織上のエピトープと反応する（Edwardsら、Cancer Res．46: 1 306-1317，1986）。３２３／Ａ３の可変領域内の相補性決定領域をまず「ヒト化」し、ヒトＩｇＧ１イソタイプに移植した。ｃｙｓ変種を調製するために、ｃＤＮＡ発現作製体を、Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＩｇＧ４ｃｙｓ４４２変種の定常領域をコードするｃＤＮＡにフレーム内に連結した。ヒト化３２３／Ａ３ＩｇＧ４ｃｙｓ４４２変種を、ＮＳＯ細胞中で発現し、常法に従って精製した。（ｃ）３２３／Ａ３ｓＦｖ断片。ヒト化した３２３／Ａ３の単一鎖のｓＦｖ断片を、通常のＰＣＲ法とクローニング法により作製した。ｃｙｓ残基置換をリンカー領域に導入して、ｃｙｓ変種作製体を作成した。例えば、通常のリンカー領域（ｇｌｙ４ｓｅｒ３つの繰り返し）を、部位特異的突然変異誘発によりｇｌｙ４ｓｅｒｇｌｙ２ｃｙｓ２ｓｅｒｇｌｙ４ｓｅｒを含有するように修飾した。変種を大腸菌（E．coli）中で発現し、親和性クロマトグラフィーにより精製した。（ｄ）Ｍｏｖ−１８変種。Ｍｏｖ−１８は、主に卵巣癌組織上で発現される葉酸結合タンパクと反応する（Miottiら、Intl．J．Cancer 39，297-303，1987 ））。ヒトＩｇＧ１イソタイプcＤＮＡを、逆転写酵素を用いて公共の供給源のｍＲＮＡライブラリーからクローン化した。Ｍｏｖ−１８の可変領域をヒト化し、ヒトＧ１定常領域に連結させた。ｃｙｓ４４２を部位特異的突然変異誘発により、重鎖ｃＤＮＡに導入した。ヒト化Ｍｏｖ−１８ＩｇＧ１ｃｙｓ４４２をＮＳＯ細胞中で発現させ、常法に従って精製した。実施例２．変種モノクローナル抗体の還元抗体溶液を、脱気した緩衝液（例えば、１００mMリン酸ナトリウムまたはリン酸トリメチルアンモニウム、ｐＨ＞８．０、好ましくはｐＨ８．０〜８．５、濃度は例えば１００μＭ（１５mg/ml））中で調製した。ある量の還元剤を抗体溶液と混合して、所望の程度の還元を達成する。例えば、Reduce-Imm（登録商標）（ピアス（Perce））のような固相還元剤の５０％ゲルスラリー５部を、抗体溶液中に撹拌して入れる。Reduce-Imm（登録商標）ゲルの還元能力は、製造業者の情報から３０μgモル/ml充填ゲルであると仮定した。５０％スラリーの２５０μ ｌを、１００μM抗体溶液１mlに添加して、３０倍以上過剰の還元剤を有する混合物を作成した（完全剤モル数／抗体モル数）。抗体−還元剤混合物を、室温で１時間攪拌し、遠心分離し、溶液に、実施例３に記載のようにチオール測定、ｐＨ低下、精製または結合のような追加の操作を行なった。あるいは抗体タンパクを、メルカプトエチルアミンのような可溶性還元剤で還元した。例えばタンパクを、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５mMＥＤＴＡ中で２００〜３００μＭに濃縮した。メルカプトエチルアミンを、最終的にタンパク濃度の１０倍過剰になるように加え、室温で１時間静かに攪拌した。次に還元タンパクを還元剤から分離し、ゲル濾過のような従来法により結合のために調製した。タンパク溶液は通常、０．１Ｍリン酸テトラメチルアンモニウム（ｐＨ８．２）、２５μＭＤＴＰＡ中で１５０×ｇで２分間プレ平衡化させた Bio Spin 30 カラム（バイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories））でゲル濾過した。実施例３．還元変種抗体の部位特異的結合還元ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ変種。Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、２−［ｐ−（ブロモアセトアミド）ベンジル］−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸（ブロモアセチル−ＤＯＴＡ）に結合させた。ブロモアセチル−ＤＯＴＡは、２官能性残基であり、第一の側面は⁵⁷Ｃｏであらかじめ標識されたキレート物質であり、第２の側面は遊離のスルフヒドリルに共有結合できる反応性基である。２官能性キレート物質とそれを⁵⁷Ｃｏで標識する方法は、既に記載されている（Mearsら、Analytical Biochem．142: 68 -78，1984）。簡単に説明すると、ブロモアセチルＤＯＴＡの溶液を、⁵⁷Ｃｏでトレース標識し、次に１０倍モル過剰を抗体溶液に加えた。結合反応は、37℃で２時間行い、製造業者の薦める方法に従ってBio Spin 30 カラム（バイオラッド（Bio-Rad））でゲル濾過により、反応物を分離して反応を停止させた。２官能性キレート物質（例えば、ブロモアセチルＴＭＴ）はまた、放射標識の前に使用した。結合反応の温度と時間は、最大の部位特異的結合が得られるように変化させた。例えば、リン酸テトラメチルアンモニウム（ｐＨ８．２）、２５μM ＤＴＰＡ中１５０〜２５０μＭの濃度の還元タンパクを、金属を含まない反応バイアル中で１０倍過剰のブロモアセチルＴＭＴに加えた。反応を室温で２４時間行い、結合体は前記のようにゲル濾過で単離した。実施例４．結合体のマウス生体分布還元ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ変種であるＣａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、プレ標識することなく、前述のように部位特異的方法によりブロモアセチルＤＯＴＡに結合させた。比較のために、Ｌｙｍ−１について既に記載されている（この方法は、McCallら、Bioconjugate Chem．1: 222-226，1990の方法に従い、２− イミノチアランを用いて、リジン残基のεアミノ基にチオール基をランダムに導入する）ように非還元Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃにチオール基を導入して、ランダム結合体を調製した。イミノチオール化したＣａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃを、部位特異的結合体と同程度（抗体当たりのキレート物質）にブロモアセチル−ＤＯＴＡに結合させた。プラスチック容器中の⁹⁰ＹＣｌ₃を以下の試薬と混合して、結合体を放射性にした：８倍量のモノクローナル抗体結合体（＞２５mg/ml、０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．７）、２倍量の⁹⁰Ｙ、および最終濃度１０μＭの非放射性イットリウム。まず、非放射性イットリウムを加え、次に⁹⁰Ｙと結合体を加えた。キレート化は、室温で９０分間行なった。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗原を発現する皮下の癌を有するマウス（ＣＨＯ−１０／Ｄ４）に、１０μｇ（２μCi）を静脈内注射した。所定の時間にマウスを屠殺し、組織を切り出し、重量を測定し、放射能を測定した。結果を下記表IIに示し、組織１ｇ当たりの注射量の％として表した（１群５匹のマウスの平均±標準誤差）。ランダム群に対する部位特異的（直接）結合体群の、正常組織定着の減少と癌定着の増加に注目されたい。図３は、⁹⁰Ｙ−ＴＭＴ−Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨＧ４ｍｃの生体分布を示す。実施例５還元ｓｅｒ４４２→ｃｙｓ変種であるＣａｍｐａｔｈ−１ＨをＴＭＴに結合させ、これを図４に示すように重鎖中のｃｙｓ４４２残基に置換基を介して共有結合させた。反応を制御して、抗体１分子当たり平均１〜２キレート物質を含有する結合体を産生させてもよい。結合体を、金属のない条件下でゲル濾過により未反応の２官能性キレート物質を含まないように精製すると、緩衝化した金属のない環境で安定である。免疫結合体キレート化．入手できる最高の金属のない試薬を用いて、金属のないプラスチック中で結合体を放射標識した。担体を含まない⁹⁰ＹＣｌ₃を、デュポン／ニューイングランドヌクレア（Dupont/New England Nuclear）、アマーシャム（Amersham）および他の供給源から購入した。比活性は典型的には、１０〜３０μｌの０．０５ＮＨＣｌ中５mCi、比活性５．６×１０⁵Ci/gであった。使用前に、⁹⁰ＹＣｌ₃を０．１部の６Ｍ酢酸アンモニウムでｐＨを約５．８に緩衝化した。キレート化は、以下の試薬を連続的に加えて、室温で最高９０分間インキュベートして行なった：１部の非放射性イットリウム（０．１Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ６．８、中１００μＭ）、２倍量の酢酸⁹⁰Ｙ、および８倍量のモノクローナル抗体結合体（０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５、中２５mg/ml ）。キレート化しなかった放射性金属は、最終濃度５００μＭのＤＴＰＡと１０培量の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）を加えて、「捕捉（scavenge）」させた。混合物を室温で３０分間インキュベートして、「スピンカラムゲル濾過」により分画した。すなわち、リン酸緩衝化生理食塩水であらかじめ平衡化し、１５０×ｇで２分間遠心分離した１mlのBio Spin 30 カラム（バイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories））に加えた。スピンカラムゲル濾過は、２回の遠心分離について繰り返した。キレート化の効率（すべての放射性金属をキレートする能力）と捕捉の効率（放射標識結合体から非キレート化放射能を除去する能力）は、Mearesら、Anal． Biochem．142: 68-78，1984に記載のように薄層クロマトグラフィーにより追跡した。９０％を超える放射性金属がルーチンにキレート化された。（キレート化の程度は、酸と提供された物質の金属含量に依存する）。捕捉後、結合体に強固に結合した⁹⁰Ｙの画分はＨＰＬＣゲル濾過、薄層クロマトグラフィーまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析すると典型的には＞９８％であった。 ⁹⁰Ｙでポストラベルした結合体は、比活性が最高１０mCi/mgまで、すなわち理論的能力の３０倍下まで調製されている。すべてのキレート物質は放射性金属を受け取ることができるが、高比活性は、放射能崩壊を引き起こし（時間と濃度の関数）、これはアスコルビン酸のような抗酸化剤を含有させることにより還元することができる。原理上、キレート化は、一貫した高品質の放射性金属が供給されると完全な効率について最適化され、捕捉の必要性を排除する。実施例６．変種モノクローナル抗体の大規模還元限外濾過したＩｇＧ産物を５０mg/ml（±１mg/ml）に希釈し、容量Ｖを測定する。Ｖ／１０の新たに調製したストック溶液（５０mMリン酸塩および５mMＥＤＴＡ、ｐＨ７．０、中１３mg/mlのＭＥＡ）を加え、添加の間還元剤の均一な分布を確保するために充分攪拌する。周囲温度に６０分間放置する。試料を、例えばセファデックスＧ２５またはスーパーデックス７５または３０のようなゲル濾過カラムに添加する。ＩｇＧピークを吸光度２８０nmで追跡し、ピークを集め、さらに、実施例３に記載のようにチオール測定、ｐＨ調整、精製または結合を行う。実施例７．還元した変種抗体の大規摸部位特異的結合０．１Ｍヘペス＋２５μＭＤＴＰＡ（ｐＨ８．４）中で作成した１０mMストックとして、１０倍モル過剰のブロモアセチル−ＴＭＴを加える。充分混合し、周囲温度で少なくとも２１時間、最大３７時間放置する。次に結合した抗体をスーパーデックス２００カラムにかける。ＩｇＧピークを吸光度２８０nmで追跡し、モノマーのピークを集め、結合の推定、タンパク含量の測定などの標準的分析を行う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＢＣＡ６１Ｋ 39/395 ＡＣＤＡＢＪＡＣＶＨＡＣＤＡＤＡＡＣＶＡＤＰＡＤＡＡＤＶＡＤＰＣ０７Ｋ 16/00 ＡＤＶ 16/28 51/00 19/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 19/00 37/48 ＡＢＥＣ１２Ｐ 21/08 49/02 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フライング、メアリ・エリザベスアメリカ合衆国、ノースカロライナ州 27707、ダーハム、イートン・ロード 3712 (72)発明者スティメル、ジュリー・ベスアメリカ合衆国、ノースカロライナ州 27713、ダーハム、オーデュボン・レイク・ドライブ 600、ユニット４シー − 11

Claims

【特許請求の範囲】１．システイン残基が物質に結合することができるように、抗体の表面に露出したシステイン残基を含んでなる、免疫化学的機能を有するモノクローナル抗体。２．システイン残基は抗体の可変領域にあるがＣＤＲの一部ではない、請求の範囲第１項記載の抗体。３．システイン残基は定常領域にある、請求の範囲第１項に記載の抗体。４．システイン残基は重鎖のＣＨ３ドメインにある、請求の範囲第３項に記載の抗体。５．システイン残基はＣＨ３ドメインの４４２位にある、請求の範囲第４項に記載の抗体。６．抗体は４０ＫＤ抗原または葉酸受容体抗原に結合する、前記請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の抗体。７．抗体はヒト化されている、前記請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の抗体。８．抗体はＧ１またはＧ４イソタイプである、前記請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の抗体。９．前記請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載の抗体と、該抗体のシステイン残基に直接または間接に結合している物質を含んでなる抗体結合体。１０．前記物質はキレート物質を介して間接的に結合している、請求の範囲第９項に記載の抗体結合体。１１．前記物質はリンカーおよびキレート物質を介して間接的に結合している、請求の範囲第９項に記載の抗体結合体。１２．前記キレート物質はＴＭＴまたはＤＯＴＡである、請求の範囲第１０項または第１１項に記載の抗体結合体。１３．前記リンカーはブロモアセチルである、請求の範囲第１１項または第１２項に記載の抗体結合体。１４．前記物質は、⁹⁰Ｙまたは¹⁷⁷Ｌｕである、請求の範囲第１０項〜第１３頃のいずれかに１項に記載の抗体結合体。１５．前記物質は、酵素プロドラッグ療法に使用される分子的キメラである、請求の範囲第９項に記載の抗体結合体。１６．請求の範囲第１５項に記載の抗体結合体であって、前記キメラは、哺乳動物細胞中で活性化されることができる転写制御ＤＮＡ配列と、該転写制御ＤＮＡ配列に機能的に結合し且つプロドラッグの癌細胞毒性物質への変換を触媒することができる異種酵素をコードするＤＮＡ配列とを具備する抗体。１７．前記転写制御ＤＮＡ配列は、組織特異的、または癌特異的転写制御ＤＮＡ配列である、請求の範囲第１６項に記載の抗体結合体。１８．前記キメラはウイルスベクターまたはリポソーム内に含有されている、請求の範囲第１５項または１７項に記載の抗体結合体。１９．癌および関連転移の治療と診断のための、請求の範囲第９項〜第１８項のいずれかに１項記載の抗体結合体の使用。２０．小細胞肺癌および非小細胞肺癌、前立腺癌および関連転移の治療のための、請求の範囲第９項〜第１４項のいずれか１項に記載の抗体結合体の使用。２１．卵巣癌の治療のための、請求の範囲第１５項〜第１８項の何れか１項に記載の抗体結合体の使用。２２．放射免疫療法のための、請求の範囲第１０項〜第１４項の何れか１項に記載の抗体結合体の使用。２３．生理学的に許容される希釈剤または担体と一緒に、請求の範囲第９項〜第１８項までのいずれか１項に記載の結合した抗体を含んでなる、薬剤学的に許容される組成物。２４．投与量は１〜１０mgである、放射免疫療法のための請求の範囲第２３項に記載の薬剤学的に許容される組成物。