JPH03503241A - 胚幹細胞のインビトロ増殖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 胚幹細胞のインビトロ増殖 本発明は、以面に発見され、確認された分子である、白血病抑制因子（ＬＩＦ） の、インビトロの胚幹細胞の分離および増殖における用途に関するものである。

胚幹（ＥＳ）細胞、すなわち胞胚の多能性外植は、インビトロで培養され操作さ れ、次いで生殖細胞系を含む全組織に正常に寄与するように胚環境に戻され得る ［総説として、ロバートソン・イー・ジエイ（１９８６年）トレエズ・イン・ジ エネテイクス第２巻、９−１３頁参照］。インビトロで増殖されるＥＳ細胞は、 生殖細胞系キメラを含むキメラを形成するのに効果的に寄与し得るのみならず、 またさらにこれらの細胞はそれらの能力を失うことなくインビトロで操作でき、 生殖細胞系キメラを生成し得る［ロバートソン、イー・ジエイら（１９８６年） 、ネーチャー・第３２３巻、４４５−４４７頁コ。

ＥＳ細胞は、すなわちトランスジェニックマウスのようなトランスジェニックの 動物の発生のための経路を提供するもので、その経路は上記の動物に新規の遺伝 子の物質を導入するための接合体注入およびウィルス感染のような、既知の技術 と比較してより多くの重要な利益を有している［ワグナ−およびステワード（１ ９８６年）エクスペリメンタルアプローチス・ツー・エンブリョニック・デベロ ップメント。ロサントおよびベダセン編集、ケンブリッジ、ケンブリッジ・ユニ バーシティプレス。先ず、関心のある遺伝子を導入し、その挿入および発現はイ ンビトロで確認し得る。次に、ＥＳ細胞生育への導入される遺伝子の効果はイン ビトロで研究され得る。第３番目に、新規の導入された遺伝子を持っている確認 したＥＳ細胞は、胞胚注大または胚凝集により胚に効果的に導入され得、産生ず るトランスジェニックのキメラの発育での導入された遺伝子の結果は、出生の前 後の間モニターし得る。第４番目に、導入された遺伝子を統合するＥＳ細胞ゲノ ムの部位は、遺伝子標的および遺伝子置換への道を用いたままで操作し得る［ト ーマス、ケイ・アール・およびカベキイ、エム・アール（１９８７年）セル第５ １巻、５０３−５１２頁］。

しかし、ＥＳ細胞および成るＥＣ（胎生期癌）細胞系は、線維芽細胞のフィーダ 一層上で培養した場合［ネズミＳＴＯ細胞のような、たとえば、マーチン、ジー ・アールおよびエバンス、エム・ジェイ（１９７５年）ブロンンディング・オブ ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・ニーニスエイ第７２巻、１４４ １−１４４５頁］またはある細胞により調整された培地で培養した場合（たとえ ば、クープマン、ピーおよびコドン、アール・シイ−・エッチ（１９８４年）エ キスペアリメンタル・セル・リサーチ−第１５４巻、２３３−２４２１１ニスミ ス、エイ・シイ−・およびツーパー。エム・エル・（１９８７年）デベロブメン タル・バイオロジー第１２１巻、１−９１頁］、インビトロで幹細胞表現型をわ ずかに保ち得ることが知られている。フィーダー細胞または調整培地が存在しな いと、ＥＳ細胞は、自然的に広くいろいろな細胞型に分化し、胚形成の間および 成熟した動物に見い出されものと類似したものになる。しかし、ＥＳ細胞の分化 多能性の維持に関与する因子は、はとんど特性がわかっていない。

本発明に至る研究において、ＬＩＦは、インビトロで分化多能性ＥＳ細胞の維持 において、フィーダ一層（または調整培地）と置換しつるかまたはこれに添加し うろことが見い出された。

ＬＩＦは、既にエシェリヒア・コリおよび酵母細胞の両方から精製組み換え体の 形で精製され、クーロン化され、多量に生成された蛋白質である（国際特許出願 、第ＰＣＴ／ＡＵ８８１０００９３号、１９８８年３月３１日出願）。ＬＩＦは 、その性質が下記を含む因子として定義された。

■、それは、白血病細胞の分化を伴なって、Ｍｌ細胞のような骨髄性白血病の増 殖を抑制する能力を持っている、そして２、それは、Ｍｌ細胞上またはネズミま たはヒトのマクロファージ上の特異的細胞レセプターとの結合においてネズミＬ ＩＦまたはヒトＬＩＦの特定配列（国際特許出願、第ＰＣＴ／ＡＵ８　Ｂ１００ ０９３号により定義される）を有する分子と競合する。ネズミおよびヒトＬＩＦ について以前に開示された生物学的特性以外に、ＬＩＦは現在以下に示す特性を 持っていることが見い出された：（ａ）それは、フィーダー細胞の不存在下でＥ Ｓ細胞のインビトロ分化多能性表現型の誘導および維持を可能にする。

（ｂ）それは、前述のＥＳ細胞がＬＩＦの存在下でインビトロ継代後、胚環境に 再導入した場合、マウスのようなキメラ動物の体細胞および生殖細胞系組織に寄 与することを可能にする。

（Ｃ）それは、ネズミＥＳ（ＥＫｃｓ−１（ＣＳ　１として既知）およびＤ３） およびＥＣ（ＰＣＯ２−３ＡおよびＦ９）細胞の高親和性レセプターとの選択的 結合を示す： そして、 （ｄ）”’　Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆの高親和性レセプターへの特異的結合は、インシ ュリン、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＣ；Ｆ−ｎ、酸性および塩基性Ｆ’ＧＦ、　ＴＧＦβ、 ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｉ　Ｌ −４、ＧＭ　−ＣＳ　Ｆ、　Ｇ　−ＣＳ　ＰＳＭｕｅｔｉ　−Ｃ５Ｆと競合せず 、またエリスロボイエチンとも競合しないが、ネズミおよびヒトＬＩＦと競合す る。

したがって、本発明の第１の特徴は、インビトロでの動物胚からの胚幹（ＥＳ） 細胞の分離方法に関するものであり、その方法は、該ＥＳ細胞の発育に充分であ る時間および条件下、有効量の白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含んでいる培地中で 該胚からＥＳ細胞を誘導することよりなる。用いた胚は、ヒトおよび鳥類（たと えば、チキン）、マウス、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよび魚のような多くの他 の動物種を含む、しかしこれらに限定されない、動物から分離され得る。

本発明の第２の特徴は、それらの多能性表現型を保ちつつ間、インビトロで動物 胚幹（ＥＳ）細胞を維持する方法を意図するものであり、その方法は、該細胞を 維持するのに充分である条件下、有効量の白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含んでい る培地で該細胞を培養することよりなる。本発明のこの特徴によるＥＳ細胞は、 ヒト、マウス、鳥類（たとえば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよび魚 からの細胞を含む。培地に用いるＬＩＦは、国際特許出願、例えば第ＰＣＴ／Ａ Ｕ　８８１０００９３号に記載された方法により、生成された組み換えＬＩＦで あることが好ましい。本発明によると、組み換えＬＩＦおよび特に組み換えヒト およびネズミＬＩＦは、インビトロでのＥＳ細胞を維持する際に、フィーダ一層 または調整培地の有効な置換物または付加物であることが明らかにされた。本明 細書において、組み換えＬＩＦは、国際特許出願、第ＰＣＴ／ＡＵ８８１０００ ９３号に記載の方法を用いてイー・コリおよび酵母で生成されるが、しかじ哺乳 動物および昆虫細胞を含む他の宿主で生成される組み換えＬＩＦおよび合成ＬＩ Ｆも本発明の範囲内にある。

他の特徴では、本発明は、ＬＩＦを含んでいる培地での通過により動物胚から誘 導されるＥＳ細胞、挿入された付加的遺伝物質をもっているかかるＥＳ細胞およ びキメラマウスのようなキメラ動物およびＬｒＦ含打培地でインビトロで維持さ れたＥＳ細胞を用いて既知の技術により産生される該動物のトランスジェニック の子孫に及ぶ。

すなわち、本発明は、ヒト、マウス、鳥類（たとえば、チキン）、ヒツジ、ブタ 、ウシ、ヤギおよび魚からのＥＳ細胞の生成および維持、およびマウス、鳥類（ たとえば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよび魚のような動物種から分 離したＥＳ細胞を用いるトランスジェニックのキメラ動物およびそれらのキメラ 遺伝子の子孫の生成に拡大する。本発明は、またたとえばインビトロ受精および 他の手法で用いるために、ヒトおよびウソの生殖細胞ならびに胚細胞のような他 の動物種の生存および生長を調節するための培地でのＬＩＦの使用を含む。

本発明は、また下記の図に基づいて記述され得る。

第１図は、異なる濃度のＬＩＦ’のＥＳ細胞に対する効果を示しているグラフで ある。

第２図は、ＬＩＦの存在下および不存在下でのＥＳ細胞形態学を示す図である。

第３図は、ＥＳ細胞ＣＥＫｃｓ−１）およびＥＣ細胞（Ｆ９およびＰＣＣＩＡ） への”’ｒ−Ｌ［Ｆ’の結合を示しているグラフ（ＡおよびＣ）と図（Ｂ）であ る。

本発明は、インビトロの動物胚からの胚幹（ＥＳ）細胞の分離および維持方法に 関するものであり、その方法は、上記のＥＳ細胞の誘導および／または維持に充 分な時間および条件下で、有効量の白血病抑制因子（Ｌ　Ｉ　Ｐ）含有培地中の 上記胚から該ＥＳ細胞を誘導および／または維持することよりなる。動物胚は、 ヒト、マウス、鳥類（たとえば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよび魚 のような多くの動物種から分離され得る。本明細書での“動物胚”の表現は、“ 動物胚盤胞′の意味を含む。さらに本発明は、ネズミＥＳ細胞とヒト１．ＩＦ（ 異種系）およびネズミＥＳ細胞とネズミＩ、　Ｉ　Ｐ（同種系）を用いて例証さ れる。これは、本発明がヒト、マウス、鳥類（たとえば、チキン）、ヒツジ、ブ タ、ウシ、ヤギおよび魚のような動物種からの動物胚により異種系および同種系 の全ての動物種からのＬＩＦを考慮しているということである。ある状態では、 異種系は効果的に働くが、同種系を用いることが好ましい。本明細書での教示が 得られれば、同種系または異種系が特殊な動物ＥＳ細胞を分離または維持するた めに必要であるかどうかを確認することは熟練者にとって日常的作業である。

“培地′は、ＥＳ細胞の生育を支持することができる適当な培地を意味する。本 発明の実施に有用な適当な例は、イグール培地またはその修飾あるいは同効培地 、例えば５容量％−３０容量％胎児の子牛血清、必要な場合、０．０１−１．０ ｍＭβ−メルカプトエタノール、好ましくは約０　、１　ｍｍβ−メルカプトエ タノールのような補足物を加えたダルベ）　（Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ）またはグラ スゴウズ（Ｇ　ｌａｓｇｏｗｓ）修飾イーグル（Ｅ　ａｇｌｅ）培地である。培 地は、フィーダー細胞を含んでも含まなくてもよく、ＬＩＦは、上記のフィーダ ー細胞に代えて、またはさらに添加して用いられ得る。所望の場合、ＬＩＰまた はさらに詳細には合成または組み換えＬＩＦは、約１００−１００００００単位 ＩＲＱ、好ましくは約ｔｏｏ−１０００００単位／ｘｆ２、さらに好ましくは５ ００−１００００単位ＩＲＱの濃度で培地に添加され、ここに５０単位は、１ミ リリツトル中でネズミＭ骨髄性細胞によるクーロン形成を５０％減少させＬＩＦ 量として定義される。“組み換えＬＩＦ”は、たとえば国際特許出願第Ｐ　ＣＴ ／ＡＵ　８８１０００９３号に従って、たとえば細菌［たとえば、イー・コリ］ または酵母細胞のような多くの宿主が用いられ得る遺伝子操作方法により製造さ れるＬ　Ｉ　Ｆを意味する。本発明によると、効果的誘導時間は１日−２０週間 、詳細には１−８週間である。

本発明の他の特徴は、分化多能性表現型を保って、インビトロで動物ＥＳ細胞を 維持する方法を意図しており、その方法は上記細胞を維持するのに充分な条件下 で有効量のＬＩＰを含んでいる培地で上記細胞を培養することよりなる。本発明 のこの特徴とするＥＳ細胞は、ヒト、マウス、鳥類（たとえば、チキン）、ヒツ ジ、ブタ、ウシ、ヤギおよび魚から誘導される細胞を含む。動物胚からのＥＳ細 胞の分離による場合、前述の方法で用いられるＬＩＰは好ましくは組み換えｉ、 　Ｔ　Ｆである。培地はフィーダー細胞を含んでも含まなくてもよい。

本発明によると、“分化多能性細胞′および“胚幹細胞“は、全ての体細胞およ び生殖細胞直系へ分化する発育能を保つ細胞である。

幹細胞表現型ＥＳ細胞を維持する組み換えＬＩＦの能力は、精製酵母誘導組み換 えヒトＬ　Ｉ　Ｆ（ｒＹ−ＨＬ　Ｉ　Ｆ）またはイー・コリ誘導組み換えマウス Ｌ　Ｉ　Ｆ（ｒＥ−ＭＬ　Ｉ　Ｐ）のさまざまな濃度の存在下、通常の細胞培地 にＥＳＳ細胞系およびＨＤ５を移植することによる示される。ｒＹ−ＭＬＩＦま たはｒＥ−ＭＬＩＦ’の１０００−５０００単位／峠の濃度で、９０％以上のＤ ３およびＨＤ５　　ＥＳ細胞はそれらの幹細胞表現型を保つ。対照的に、通常の 培地に維持されるＥＳ細胞は３−６日の期間以上で分化した。幹細胞表現型をも っているコロニーの割合は培地中のＬＸＦの濃度に関連している。樹立したＥＳ 細胞系の維持に加えて、６つの新規ＥＳ細胞系（ＭＢＬ−１，２，３，４，５お よび６）が、培地に１０００単位／ｘＱｒＥ−ＨＬ　Ｉ　Ｆが補足された場合、 フィーダー細胞が欠除した胚盤胞から分離された。２２継代までの間ＬＩＦ中で ＥＳ細胞系Ｄ３、ＨＤ５およびＭＢＬ−１〜６を長期維持（約１００細胞世代ま たは１０週）したが、これらのＥＳ細胞の生育特性またはＬＩＦに対するこれら の用量依存性の著しい変化はなかった。ＥＳ細胞の全ての体細胞および生殖細胞 直系への分化能力は、胚盤胞へのＤ３およびＭＢＬ−１細胞の再導入により確認 された。分析した約５０％の子孫は、個々のマウスに９０％と同じ高い明白なキ メリズムのレベルで注入したＥＳ細胞から誘導される組織を含む。ＥＳ誘導細胞 の生殖細胞系伝達テストのため、雄キメラをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと支配した 。

３つのＤ３および２つのＭＢＬ−Ｉ　　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊキメラは、これらのＥ Ｓ細胞が生殖細胞の生成に寄与し得ることを確認しているアグーチ子孫を発生さ せた。

本発明は、また本明細書で考察したＥＳ細胞を用いる既知の技術により生成され るキメラ動物に関するものである。これらのＥＳ細胞は動物胚から分離および／ または主題の発明によるインビトロで維持され得る。さらに、遺伝学的に操作さ れたＥＳ細胞は、ＬＩＦ中で継代され、キメラ動物を作るのに用いられ得る。た とえば、ネオマイシン耐性およびｃ−ｓｒｃ”’に遺伝子をプログラムしている レトロウィルス・ベクター［Ｎ−ＴＫ５２７：ｐＸＴｌから誘導；ター・エイ・ プルターおよびイー・エフ・ワグナ−（１９８７年）ヌクレイ・ツク・アンズ・ リサーチ、第１５巻、７１９４頁コを含んでいる遺伝学的に操作したＥＳ細胞は 、ＬＩＦの存在下ではあるがフィーダー細胞の不存在下２０以上の継代により、 増殖された。これらの細胞は、正常キメラの生成：さらに胚盤胞注入による着床 前肢へのこれらの細胞の導入により判定されるように分化能力を保った。

本発明のＬＩＦの用途のより詳細は下記の実施例から認められ得る。

実施例１ 本実施例は、ＬＩＦでインビトロのＥＳ細胞を維持し、継代したＥＳ細胞を用い てキメラマウスを生成するのに用いた段階を詳しく述へる。

第１段階　インビトロ増殖 用いたＥＳ細胞は、１２９ｓＶＨｅ胚盤胞から分離したＤ３［ドエヂンマン、テ ィー・ノイーら（１９８５年）ツヤ−ナル・オブ・エムブリオロジー・アンド・ エキスペリメンタル・モルフオロジー第８７巻、２７−４５頁］、ＥＫｃｓ　− １（ＣＳ　ｌとして既知）［ワグナ−。

イー・エフら（１９８５年）コールド・スプリング・ハーバ−・ノンボンラム・ クオンティテユティブ・バイオケミストリイ第５０巻、６９１７００頁コおよび ＨＤ　５　［ソイ−・ステワード（発表せず）ＥＳ細胞系およびＣ５７ＢＬ／６ ．Ｊ胚盤胞から分離したＣＢＬ６３［アール・ケムラー（出版せず）ＥＳ細胞で あった。ＬＩＦでの培養の前に、Ｄ３およびＣｌ５Ｌ６３細胞を、第一次胚線維 芽細胞のフィーダ一層で１５容量％の胎児の子牛血清を加えたダルベコ修飾イー グル培地に維持し、ＥＫｃｓ−１およびＨＤ５　　ＥＳ細胞を襄癌細胞系５６３ ７（ＡＴＣＣ第ＨＴＢ９号］により調整された培地の存在で、１５容量％の胎児 の子牛血清および０　、１　ｍＭβ−メルカプトエタノールを加えたイーグル培 地で維持した。

組み換えＬＴＦＥＳ細胞の幹細胞表現型維持能力を、精製酵母誘導組み換えヒト ＬｒＦ（以下ｒＹ−ＨＬＩＦと称する）またはイー・コリ誘導組み換えマウスＬ 　Ｉ　Ｆ（ｒＹ−ＭＬ　Ｉ　ＦＸ国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ８８１０００９３ 号により開示）のいろいろな濃度の存在で、正常細胞培地に系Ｄ３およびＨＤ５ のＥＳ細胞を転移することにより示した。結果を第１および第２図に示す。第１ Ａ図で８０％の５６３７調整培地中、８４Ｉ！代あらかじめ維持したＨＤＳ細胞 を０−５０００単位、Ｑ−１の精製組み換え酵母誘導ヒトＬＩＦ（Ｈ−Ｌ　Ｉ　 Ｆ、以下参照）（−一一）または精製組み換えエシェリヒア・コリ（Ｅ、　Ｃｏ １１）誘導マウスＬ　Ｉ　Ｆ’（Ｍ−Ｌ　Ｉ　Ｆ、以下参照）（〇−〇）を含ん でいる培地に転移した。さらに１０００単位ｘＱ−１Ｈ−Ｌ、ＩＦを含んでいる 培地で１Ｂ継代維持したＨＤ５細胞を、次に０−１０００単位ｘ（！−’Ｍ−Ｌ 　Ｉ　Ｆ（・−・）に転移した。第１Ｂ図で、１０通過でマウス胚線維芽細胞で ｌＯ継代維持したＤ３細胞を、　１０００−５０００単位ｔｔｒＱ−’Ｈ−Ｌ　 Ｉ　Ｆを含んでいる培地に転移し、さらに７または１Ｂ継代後、この細胞を（１ −５０００単位ＩＣ−’Ｈ−ＬＩＦ（■−■）または０−１０００単位ｐｔＱ− ’Ｍ　−Ｌ　Ｉ　Ｐ　（・−・）をそれぞれ含んでいる培地に転移した。第２図 は組み換えＬＩＦの存在でＥＳ細胞形態学を示す。８０％５６３７調整培地の存 在で培養したＨＤ５Ｅ５細胞を１０００単位酎−’Ｍ−Ｌ　Ｉ　Ｆを含んでいる 培地（Ａ）または通常培地（Ｂ）に転移することにより、精製組み換えしＩＦの 幹細胞表現型維持能力を検定した。７日後、コログーをギームサで染色した。コ ンパクトな幹細胞コロニーを散漫な分化したコロニーと区別することができた。

Ｈ−ＬＩＦ中１中縦５継Ｄ３細胞を１０００単位屑Ｑ．−’Ｍ−　Ｌ　Ｉ　Ｆを 含んでいる培地（Ｃ）または通常培地（Ｄ）に転移することにより、分化能力を 検定した。２つのＤ３コロニー型の細胞の免疫蛍光を、幹細胞−特異的細胞一表 面抗原を認識するＥＣＭＡ−７モノクロ一ナル抗体を用いて実施した。

細胞−表面−特異的免疫蛍光を１０００単位婦−１組み換えＬＩＦを含んでいる 培地に維持した細胞９０％以上で（Ｅ）、しかし通常の培地に維持した細胞１％ 以下で（Ｆ）検定した。（Ｆ）で示した図の範囲は２１細胞を含む。第１図およ び第２図から、１０００−５０００単位／ｘＱ　ｒＹ−ＨＬ　Ｉ　ＦまたはｒＥ −ＭＬＩＦに維持した９０％以上のＥＳ細胞がそれらの幹細胞を保つことが示さ れる。対照的に、通常培地に維持したＥＳ細胞は、３−６日の期間を越えると分 化した。用いたｒＹ−ＨＬＩＦまたはｒＥ−ＭＬＩＦの種々の濃度は、培養６８ 後細胞数に著しい変化を示さず、ＬＩＦで生育し得る特異的サブポビュレーンヨ ンに対する選択性かないことを指示した。同じ結果は酵母誘導ｒＭＬＩＦをを用 いて得られ、また国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ８　８１０　Ｏ　０　９　３号に 開示した。第１図のデータは、Ｍｌ骨髄性白血病細胞に対するヒトＬＩＦの作用 について既に記述された［グー、エフ・エム（１９８８年）プロシディング・オ ブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・ニーニスエイ第８５巻、２６ ２１−２６２７頁コように、ヒトＬＩＦがマウスＥＳ細胞に作用することを指示 する。第１図のデータは、また、Ｍ１骨髄性白血病細約に対するＬＩＦの作用に ついて以前に記述された通り、ＥＳ細胞に対するＬ　Ｉ　Ｆの作用が、グリコジ ル化と無関係であることを指示する。

４つのＥＳ細胞系、Ｄ３、ＥＫｃｓ　−１，、ＣＢＬ　６３およびＨＤ５を、１ ０００−５０００単位／ｘＱ　ｒＹ−ＨＬ　Ｉ　Ｆを含んでいる培地に２２継代 維持した（１０週または約１００世代）。ｒＹ−ＨＬＩＦ中ＥＳ細胞を長期維持 しても、細胞の生育特性の著しい変化はなかった。さらに、培地からＬＩＦの減 少または除去の結果、膀胱癌５６３７条調整培地またはマウス線維芽細胞のフィ ーダ一層から直接に外部移植したものと同じキネティクスでＥＳ細胞が分化した （たとえば、第１図および第２図参照）。ＬＴＦの存在で、多数の継代の間培養 した幹細胞表現型ＥＳ細胞を、細胞−表面一幹細胞一特異的抗原を認識するＥＣ ＭＡ−７抗体での免疫蛍光により確認した［ケムラー、アール、プログレスイン デベロップメンタル・バイオロジイ第２６巻、ソイラー、エッチ・ダブリュ編集 　１７５頁：フイシャー（Ｆ　１ｓｈｅｒ）、スットガート（Ｓ　ｔｕｔｔｇａ ｒｔ）、１９８０年］：Ｌ　Ｉ　Ｆの存在下で培養したＥＳ細胞は、幹細胞マー カーを発現したが、ＬＴＦの不存在では１％以下しか発現しなかった（第２回） 。

第２段階　ＥＳ細胞系の分離 ネズミ胚盤胞は、１５容量％の胎児の子牛血清、０　、１　ｍＭβ−メルカプト エタノールおよび１０００単位／ｌＱ精製ｒＥ−ＨＬＩＦを加えたジルベコ培地 またはグラスゴ修飾イーグル培地のいずれかでの４日の発育て（１日−プラグの 日）１２９ＳＶＨｅマウスから分離した。ＥＳ細胞系を次に２つの異なる方法論 により分離した。

最初の方法において、胚盤胞を培養皿に付着させておき、約７日の発芽後成長し ている内部細胞塊をはぐし、トリプシン処理し、同じ培地での他の培地器に移し た。ＥＳ細胞コロニーは、外部移植各内部細胞塊から発生する５−７の間の個々 のコロニーを共に２−３週後出現した。次いでＥＳ細胞系を別の分析用に膨張さ せた。ＥＣ細胞系を分離する２番目の方法は、内部細胞塊を外部移植する前に抗 マウス抗体を用いて栄養外胚葉細胞を破壊する免疫蛍光［マーチン、ノイー・ア ール（１９８１年）プロンディング・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サ イエンス・ニーニスエイ第７８巻、７６３４−７６３８頁］を用いた。ＥＳ細胞 系分離の効果を第１表で示す。

第３段階　キメラマウスの生成 全てのＥＳ細胞系は、フィーダー細胞の不存在下でＬｉＦの存在下で培養（第１ 段階に示した）または直接にＬＩＦを含んでいる培地の助けをかり分離しく第２ 段階に示した）、多数の細胞型への分化能力を有し、それに続くこれらの細胞が 分化多能性表現型を保つことを示すＬ　［Ｆの除去を示した。それらの発育能を 確認するために、Ｌ　Ｉ　Ｆ中維持されたＤ３　　ＥＳ細胞および７−２２継代 、１４−ｉ７継代維持させたＭＢＬ−Ｉ　　ＥＳ細胞を、胚盤胞注入により胚環 境に再導入した［ウィリアムスら（１９８８年）セル第５２巻、１２１−１３１ 頁に記載されるように］。胚盤能を、非近交系ＩＣＲマウス系または近交系Ｃ５ ７ＢＬ／６Ｊマウスから分離した。膨張した胚盤胞を培養の前に４℃で１０分間 油滴培養に維持した。ＥＳ細胞を個々のコロニーを採集することにより調製し、 それは次にりん酸緩衝食塩液、０．５ｍＭＥＧＴＡで５分間培養した：単細胞懸 濁液を１容量％のヒョコ血清を含んでいるトリプンターＥＤＴＡ溶液中、４℃で さらに５分間インキュベーションして調製した。５−２０のＥＳ細胞［１０容量 ％胎児子牛血清および２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ［ｐＨ８］で緩衝した３０００単位 ／ＲρＤＮＡアーゼで１を有するジルベコ修飾イーグル培地で］を各胚盤胞に注 入した。胚盤胞を偽妊娠の受容細胞に転移し、正常に発育させた。キメラマウス を被覆マーカーにより同定した［ホーガンら（１９８６年）（マクプレテング・ ザ・マウス・エムブリオ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク。続 くキメラマウスの分析から、約５０％に達している子孫が、個々のマウス中９０ ％と同じ程度に高い明白なキメリズムのレベルで、注入した細胞から誘導される 組織（第２表）を含有することが明らかにされた。さらに、４つのＤ３−キメラ の器官を分析したところ、ＬＩＦに維持したＥＳ細胞は全ての体細胞の発育に広 範囲に寄与し得たことが確認された。

雄キメラを、ＩＣＲまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌との交配によりＥＳ誘導細胞の生 殖細胞系伝達についてテストした。４の中３のＤ３−Ｃ５７ＢＬ／６　Ｊキメラ および６の中２のＭＢＬ−１−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊキメラか、Ｌ　Ｉ　Ｆで培養し たＥＳ細胞から誘導されたアグーチ子孫を生じた（第４表）。

遺伝学的に変化したＥＳ細胞をＬＩＦを含んでいる培地に維持し得たかをテスト するのに、Ｄ３ＥＳ細胞をネオマイシン耐性遺伝子およびｃ−ｓｒｃ遺伝子変異 体（ｃ−ｓｒｃ”’）を発現するレトロウィルスベクター（Ｎ−ＴＫ５２７）に よって感染させた［感染についてのプロトコールは、ウィリアムスら（１９８８ 年）セル第５２巻、１２１−１３１頁に記載される］。分離したＥＳ細胞クーロ ンを、ＬＩＦを含んでいる培地中、２０ｎ代以上維持した。これらの遺伝学的に 修飾したＥＳ細胞は、キメラマウス生成能力を保持し、それによって胚盤胞注入 により胚環境に再導入する。

第１表　ｒＥ−ＭＬＩＦを含んでいる培地における１２９ＳｖＨｅＥＳ細胞の分 離 外部移植　　　　　９　　　　９　　　　　　　４免疫外科　　　　１１　　　 　３　　　　　　　０免疫外科　　　　　７　　　　５　　　　　　　２ネズミ 胚盤胞を、１５容量％胎児の子牛血清、０　、１０１Ｍβ−メルカプトエタノー ルおよび１０００単位／ＩＲＱ精製ｒＥ−ＨＬＩＦを加えたジルベコ培地または グラスゴ修飾イーグル培地のいずれかに、発生の４日で（１日−プラグの日）１ ２９ＳｖＨｅマウスから分離した。胚盤胞を次に同一培地に外部移植し、培養皿 に付着させておき、採集した内部細胞塊はりん酸−緩衝食塩液、０．５ｍＭＥＧ ＴＡに５分間解離した：単細胞懸濁液を１容量％ヒョコ血清を含んでいるトリプ シン−ＥＤＴＡ溶液中でインキュベーションすることにより調製し、細胞は上記 の細胞培地に再び塗布した。特徴のあるＥＳ細胞コロニーはｌ−３週以内に出現 した。

他の胚盤胞を免疫蛍光［マーチン、シイ−・アール、（１９８１年）プロシディ ング・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・ニーニスエイ第７８ 巻、７６３４−７６３８頁に記載されるように］により処理した。胚盤胞を、卵 の透明帯からふ化し、次いで抗−マウス抗体で処理し、そして補体の添加により 破壊した。露出した内部細胞塊を次に組織培養皿に付着させておき、再び抗−マ ウス抗体および補体で処理した。数日以内に、分化多能性幹細胞は出現し、上記 のように解離し、トリプシン処理した。

第２表　ＬＩＦで培養したＥＳ細胞から誘導したキメラマウス生成能力　　転移 した胚盤胞　　生まれた子犬　　キメラＤ３　　　　　１４２　　　　６０（４ ２％）　　　３３（５５％）ＭＢＬ−１５１３３（６５％）　　　１６（４８％ ）第３表　個々のＤ３キメラマウスにおける組織寄与　％キメラ　　検屍齢　Ｃ Ｂ１２５ｐＰ　　ＬｉＴ　　　ＨＤ３ｉ　　　　１３ｄ　　　３５　　０　３５ 　２０　１０　２０　　４０Ｄ３−２　　１４ｄ　　　４０　１５　３５　３０ 　４５　３０　　５０Ｄｉ３　　　ｌｉｄ　　　９０　５０　５０　３５　５０ 　４０　　６０Ｄ３−１　　　１３ｄ　　　３０　　１０　３５　　３０　　３ ５　　２０Ｄ３−２　　１４ｄ　　　３５　　２０　３０　　５０　　５０　　 ２５Ｄ３−３　　　ｌｉｄ　　　４５　　５０　５０　　７０　　５０　　５５ 第４表　ＥＳ誘導細胞の生殖細胞伝達キメラの証明７７５−３　　　７５％　　 　　　１０　　　　１６′９　　２４７７８−１７０％　　　　　１０．　　　 ２２　　　５　　３３７７８−２　　　５０％　　　　　１０２２２３６７７８ −３　　　５５％　　　　　１０　　　　２２　　　０　　　０以下に示すもの は第２．３および４表に関するものである：Ｄ３およびＭＢｌ−１ＥＳ細胞を！ ２９ＳｖＨｅマウスから誘導する（同系交配、アグーチ、グルコースリン酸イソ メラーゼ１ａ対立遺伝子にホモ接合性）。Ｄ３ＥＳ細胞を最初に第−次胚線維細 胞てｌＯ継代、培養し、次に１０００−５０００単位／Ｍ（１組み換えしＩＦに ７−２２継代で転移した。ＭＢｌ、−ＩＥＳ細胞を、フィーダー細胞の不存在、 しかしｒＥ−ＨＬＩＦの存在下で分離し、これらの細胞をｌ１１７継代、培養し た。ＥＳ細胞をＴ　ＣＲ（異種交配、白子）またはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（同種交配 、黒人種）胚盤胞に注入し、次いでこれらは偽妊娠の里子の母親に転移した。Ｉ ＣＲおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの両方は、グルコースリン酸イソメラーゼｌ ｂ対立遺伝子にホモ接合性である。キメラ子犬は、外膜の色素沈着により同定し た（妊娠した里子の母親のみを、子孫の数と判定し計算した）。組織キメラ化を グルコースリン酸イソメラーゼ株相違点を用いて判定した。組織キメラ産生の程 度を、２つのＤＩＩＣＲ（番号１および２）および２つのＤ３−Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊキメラ（番号３および４）で測定した。分析した組織：Ｃ１外膜；ＢＬ血液； Ｓｐ、牌臓：Ｐ、バンクレアーゼ；Ｌｉ、肝臓、Ｔ、胸腺、Ｈ１心臓；Ｌｕ。

肺臓、Ｇ１生殖腺、に１腎臓；Ｍ、筋肉、Ｂ、脳；Ｓａ、唾液腺。雄キメラは、 ＩＣＲまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、子孫を外膜色素沈着により同定 した。

実施例２ 本実施例は、ＥＳおよびＥＣ細胞の特異的高親和性レセプターを記録するのに用 いた段階を詳述する。添付の第３図は、ＥＣ細胞ＥＫｃｓ−１およびＥＣ細胞Ｆ ９およびＰＣＯ２−Ａへの１２５ｒ　　ＬＩＦの結合を示す［ツヤコブ、ノエイ ら（１９７３年）アナルス・デュ・マイクロバイオロノー・ル・インスティテユ ト・パスツール第１２４巻、２６９−２８２頁］。第３図に関して、（Ａ）、Ｆ ９（ロ）、ＥＫＣ８−１（・）、ＰＣＣ３Ａ−１（■）およびＭｌ（○）細胞と ＋２Ｊ−標識ＬＩＰとの結合のスカチアード分析。結合についての飽和曲線は、 特異的に結合したＬＩＦの量（過剰の非標識ＬｒＦの有無で観察される結合間の 巻として同定）対遊離のＬＩＦとの結合の割合をプロシトするスカチアードの方 法により分析した。遊離のＬＩＦ値は、特異的にＬＩＦレセプターと結合しうる １２５■−標識ＬＩＦのパーセントで決定し、本実験では、７５％と測定された 。ＬＩＦとそのレセプターとの相互作用の見掛は解離定数は、曲線の勾配および 縦座標の切片からのレセプター数から同定した。（Ａ）の結果を点当り５×１０ ８細胞に標準化し、２つの点の平均を示し、曲線をリガンド・プログラムを用い てあてはめた。（Ｂ）、Ｆ９　ＥＣ細胞のオートラジオグラフィーは１２５Ｉ− 標識ＬＩＦで標識した。（Ｃ）、’！Ｊ　−標識ＬＩＰ’の結合後、Ｅ９　ＥＣ 細胞のシルバーグレンの定量。

精製組み換え（酵母誘導）ヒトＬ　Ｉ　Ｆ（ｒＨ−ＨＬ　Ｉ　Ｆ）は、既に記述 されているように［ヒルトン、ディー、ジエイら（１９８８年）プロノディング ・オブ・ナノヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・ニーニスエイ、第８５巻 、５９７１−５９７５頁コチロシン基を放射性に標識し、約１　、２　Ｘ　１０ 　’ｃｐｍ／ｐモルの特異的放射能をもった”５ｌ−ＬＩＰを生成した。”’Ｉ −ＬＩＦ（２Ｘ１０’−５Ｘ１０５ｃｐｍ）を、少なくとも１００倍モル過剰の 非標識ＬＩＰと共にまたは無しで１−４　Ｘ　ｌ　０６標的細胞と全量１００μ ｇで氷中４時間インキュベートした。細胞内および遊離の１２Ｊ　−Ｌ　Ｉ　Ｆ を、胎児の子牛血清による遠心分離により分離した［ニコラ、エフ、エイおよび メトカルフ、ディー（１９８６年）ジャーナル・オブ・セルラル・フィジオロン −第１２８巻、１６０−１８８頁コ。特異的細胞内＋２Ｊ　　ＬＩＦを寒冷競合 により測定した。

第３図は、ＥＳ細胞ＥＫｃｓ−１およびＥＣ細胞ＰＣＣ３−ＡおよびＦ９と”５ ｌ−ＬＩＦとの特異的飽和可能な高親和性結合を示す。

スカチアードプロットから出された細胞当りのＬＩＦレセプター数は、それぞれ ２９５．１９０および３３０で、４°Ｃでの見掛は解離定数は約９０ｐＭであっ た。これは、Ｍ１細胞系、ＬＩＦ−反応性の単球性白血病と比較し、それは見掛 は解離定数５５０−１５０ｐで、５Ｏ−２０ＯＬＩｒ’レセプター／細胞を示す 。テストした全ての他のＥＳおよびおよびＥＣ細胞−Ｄ３、ＮＧ２、ＰＣｌ３お よびＰＩ９−は、同しレヘルのＬＩＦを結合した（データは提示せず）。

Ｍｌ細胞、ＥＫｃｓ−１およびＰＣＣＩ−Ａとｌ′Ｊ−ＬＩＦとの結合は、また 非標識組み換えおよび自生のネズミおよびヒトＬＩＦと競合するが、一連のホル モンおよび因子（胚細胞で作用するいくつかを含む）：インシュリン、ＩＧＦ− Ｉ、ＩＧＰ−１１、酸性および塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、 ＮＧＦ’、ＰＤＧＦ。

ＥＧＦ、ＩＬ−１，ＩＬ−４、ＧＭ−Ｃ８Ｆ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭｕＱｔｉ−ＣＳＦ およびエリスロポイエチン、と競合しないことが見い出された。

Ｌ工Ｆ（単ｊ、ｔ／ハ（１，ン 撃田月乞あｒ〕ソのグルシン 国際調査報告

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. （１）インビトロで動物胚から胚幹（ＥＳ）細胞へ分離方法であって、有効量の 白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含んでいる培地で上記のＥＳ細胞の発育に充分な時 間および条件下上記の胚を誘導し、維持することを含む方法。
2. （２）培地が、フィーダー細胞を欠いている請求項１記載の方法。
3. （３）動物胚がヒト、マウス、鳥類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギまたは魚から誘 導される請求項１または２記載の方法。
4. （４）動物胚がマウスから誘導される請求項３記載の方法。
5. （５）培地がイーグル培地またはその修飾培地またはそれと同等のものである請 求項１または２項記載の方法。
6. （６）ＬＩＦが、組み換えＬＩＦである前述の請求項の何れか１項記載の方法。
7. （７）ＬＩＦが組み換えヒトまたはネズミＬＩＦである方法。
8. （８）ＬＩＦが、１０−１００００００単位／ｍｌの濃度で培地に添加される請 求項７記載の方法。
9. （９）ＬＩＦが、１０−１０００００単位／ｍｌの濃度で培地に添加される請求 項８記載の方法。
10. （１０）ＬＩＦが、５０−１００００単位／ｍｌの濃度で培地に添加される請求 項９記載の方法。
11. （１１）有効な時間が、１日−２０週である前述の請求項の何れか１項記載の方 法。
12. （１２）有効な時間が、１日から８週間である請求項１１記載の方法。
13. （１３）分化多能性表現型を保ちながらインビトロで動物胚幹（ＥＳ）細胞を維 持する方法であって、有効量の白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含んでいる培地で上 記の細胞を維持するのに充分である条件下上記の細胞を培養することを含む方法 。
14. （１４）培地が、フィーダー細胞を欠いている請求項１３記載の方法。
15. （１５）動物ＥＳ細胞が、ヒト、マウス、鳥類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギまた は魚から誘導される請求項１３または１４項記載の方法。
16. （１６）動物ＥＳ細胞が、マウスから誘導される請求項１５記載の方法。
17. （１７）培地がイーグル培地またはその修飾培地またはそれと同等のものよりな る請求項１３または１４項記載の方法。
18. （１８）ＬＩＦが組み換えＬＩＦである請求項１３−１４項の何れか１項記載の 方法。
19. （１９）ＬＩＦが組み換えネズミまたはヒトＬＩＦである請求項１８記載の方法 。
20. （２０）組み換えＬＩＦが１０−１００００００単位／ｍｌの濃度で培地に添加 される請求項１９記載の方法。
21. （２１）組み換えＬＩＦが１００−１０００００単位／ｍｌの濃度で培地に添加 される請求項２０記載の方法。
22. （２２）ＬＩＦが５００−１００００単位／ｍｌの濃度で培地に添加される請求 項２１記載の方法。
23. （２３）培地中で胚を誘導し、維持することによって分離された、インビトロで 動物胚から誘導される胚幹（ＥＳ）細胞であって、上記培地は、ＥＳ細胞の発育 に充分な時間および条件下、有効量の白血病制御因子（ＬＩＦ）を含んでいる、 細胞。
24. （２４）培地がフィーダー細胞を欠いている請求項２３記載のＥＳ細胞。
25. （２５）ヒト、マウス、鳥類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギまたは魚の胚から誘導 される請求項２３または２４項記載のＥＳ細胞。
26. （２６）マウス胚から誘導される請求項２３記載のＥＳ細胞。
27. （２７）請求項１記載の動物胚から分離されたＥＳ細胞を用いて産生されるキメ ラ動物またはそのトランスジェニック子孫。
28. （２８）請求項１３記載の方法によりインビトロで維持された動物ＥＳ細胞を用 いて産生されたキメラ動物またはそのトランスジェニック子孫。
29. （２９）上記の動物がマウスである請求項２７または２８記載のキメラ動物また はそのトランスジェニック子孫。
30. （３０）ＥＳ細胞がその中に挿入される付加的遺伝学的物質を含む請求項２７ま たは２８または２９項記載のキメラ動物またはそのトランスジェニック子孫。