JP2740320B2

JP2740320B2 - 胚幹細胞のインビトロ増殖

Info

Publication number: JP2740320B2
Application number: JP1508674A
Authority: JP
Inventors: ウイリアムス、ロバート・リンジ; ゴウ、ニコラス・マーチン; ヒルトン、ダグラス・ジェイムズ
Original assignee: アムラド・コーポレイション・リミテッド
Priority date: 1988-08-04
Filing date: 1989-08-03
Publication date: 1998-04-15
Anticipated expiration: 2013-04-15
Also published as: DK17091D0; DK176238B1; ATE175994T1; DK17091A; DE68928914D1; JPH03503241A; EP0380646A1; HK1003208A1; US5166065A; AU4059089A; NO322243B1; CA1341469C; AU623922B2; DE68928914T2; NO910385D0; NO910385L; WO1990001541A1; EP0380646A4; EP0380646B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、以前に発見され、確認された分子である、
白血病抑制因子（LIF）の、インビトロの胚幹細胞の分
離および増殖における用途に関するものである。

胚幹（ES）細胞、すなわち胞胚の多能性外植は、イン
ビトロで培養され操作され、次いで生殖細胞系を含む全
組織に正常に寄与するように胚環境に戻され得る［総説
として、ロバートソン・イー・ジェイ（1986年）トレエ
ズ・イン・ジェネティクス第２巻、９−13頁参照］。イ
ンビトロで増殖されるES細胞は、生殖細胞系キメラを含
むキメラを形成するのに効果的に寄与し得るのみなら
ず、またさらにこれらの細胞はそれらの能力を失うこと
なくインビトロで操作でき、生殖細胞系キメラを生成し
得る［ロバートソン，イー・ジェイら（1986）年、ネー
チャー第323巻、445−447頁］。

ES細胞は、すなわちトランスジェニックマウスのよう
なトランスジェニックの動物の発生のための経路を提供
するもので、その経路は上記の動物に新規の遺伝子の物
質を導入するための接合体注入およびウイルス感染のよ
うな、既知の技術と比較してより多くの重要な利益を有
している［ワグナーおよびステワート（1986）年エクス
ペリメンタルアプローチス・ツー・エンプリヨニック・
デベロップメント。ロサントおよびペダセン編集、ケン
ブリッジ、ケンブリッジ・ユニバーシティプレス。先
ず。関心のある遺伝子を導入し、その挿入および発現は
インビトロで確認し得る。次に、ES細胞生育への導入さ
れる遺伝子の効果はインビトロで研究され得る。第３番
目に、新規の導入された遺伝子を持っている確認したES
細胞は、胞胚注入または胚凝集により胚に効果的に導入
され得、産生するトランスジェニックのキメラの発育で
の導入された遺伝子の結果は、出生の前後の間モニター
し得る。第４番目に、導入された遺伝子を統合するES細
胞ゲノムの部位は、遺伝子標的および遺伝子置換への道
を用いたままで操作し得る［トーマス，ケイ・アール・
およびカペキイ，エム・アール（1987年）セル第51巻、
503−512頁］。

しかし、ES細胞および或るEC（胎生期癌）細胞系は、
線維芽細胞のフィーダー層上で培養した場合［ネズミST
O細胞のような、たとえば、マーチン，ジー・アールお
よびエバンス、エム・ジェイ（1975年）プロンシディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス
・ユーエスエイ第72巻、1441−1445頁］またはある細胞
により調整された培地で培養した場合（たとえば、クー
プマン，ピーおよびコトン，アール・ジィー・エッチ
（1984年）エキスペアリメンタル・セル・リサーチー第
154巻、233−242頁；スミス，エイ・ジィー・およびフ
ーパー，エム・エル・（1987年）デベロプメンタル・バ
イオロジー第121巻、１−91頁］、インビトロで幹細胞
表現型をわずかに保ち得ることが知られている。フィー
ダー細胞または調整培地が存在しないと、ES細胞は、自
然的に広くいろいろな細胞型に分化し、胚形成の間およ
び成熟した動物に見い出されものと類似したものにな
る。しかし、ES細胞の分化多能性の維持に関与する因子
は、ほとんど特性がわかっていない。

本発明に至る研究において、LIFは、インビトロで分
化多能性ES細胞の維持において、フィーダー層（または
調整培地）と置換しうるかまたはこれに添加しうること
が見い出された。

LIFは、既にエシェリヒア・コリおよび酵母細胞の両
方から精製組み換え体の形で精製され、クーロン化さ
れ、多量に生成された蛋白質である（国際特許出願、第
PCT/AU88/00093号、1988年３月31日出願）。LIFは、そ
の性質が下記を含み因子として定義された。

1.それは、白血病細胞の分化を伴なって、M1細胞のよう
な骨髄性白血病の増殖を抑制する能力を持っている、そ
して 2.それは、M1細胞上またはネズミまたはヒトのマクロフ
ァージ上の特異的細胞レセプターとの結合においてネズ
ミLIFまたはヒトLIFの特定配列（国際特許出願、第PCT/
AU88/00093号により定義される）を有する分子と競合す
る。ネズミおよびヒトLIFについて以前に開示された生
物学的特性以外に、LIFは現在以下に示す特性を持って
いることが見い出された：（ａ）それは、フィーダー細胞の不存在下でES細胞のイ
ンビトロ分化多能性表現型の誘導および維持を可能にす
る。

（ｂ）それは、前述のES細胞がLIFの存在下でインビト
ロ継代後、胚環境に再導入した場合、マウスのようなキ
メラ動物の体細胞および生殖細胞系組織に寄与すること
を可能にする。

（ｃ）それは、ネズミES（EKcs−１（CS1として既知）
およびD3）およびEC（PCC3−3AおよびF9）細胞の高親和
性レセプターとの選択的結合を示す：そして、（ｄ）¹²⁵I−LIFの高親和性レセプターへの特異的結合
は、インシュリン、IGF−Ｉ、IGF−II、酸性および塩基
性FGE、TGFβ、TNFα、TNFβ、NGF、PDGF、EGF、IL−
１、IL−２、IL−４、GM−CSF、Ｇ−CSF、Multi−CSFと
競合せず、またエリスロポイエチンとも競合しないが、
ネズミおよびヒトLIFと競合する。

したがって、本発明の第１の特徴は、インビトロでの
動物胚からの胚幹（ES）細胞の分離方法に関するもので
あり、その方法は、該ES細胞の発育に充分である時間お
よび条件下、有効量の白血病抑制因子（LIF）を含んで
いる培地中で該胚からES細胞を誘導することよりなる。
用いた胚は、ヒトおよび鳥類（たとえば、チキン）、マ
ウス、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよび魚のような多く
の他の動物種を含む、しかしこれらに限定されない、動
物から分離され得る。

本発明の第２の特徴は、それらの多能性表現型を保ち
つつ間、インビトロで動物胚幹（ES）細胞を維持する方
法を意図するものであり、その方法は、該細胞を維持す
るのに充分である条件下、有効量の白血病抑制因子（LI
F）を含んでいる培地で該細胞を培養することよりな
る。本発明のこの特徴によるES細胞は、ヒト、マウス、
鳥類（たとえば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ
および魚からの細胞を含む。培地を用いるLIFは、国際
特許出願、例えば第PCT/AU88/00093号に記載された方法
により、生成された組み換えLIFであることが好まし
い。本発明によると、組み換えLIFおよび特に組み換え
ヒトおよびネズミLIFは、インビトロでのES細胞を維持
する際に、フィーダー層または調整培地の有効な置換物
または付加物であることが明らかにされた。本明細書に
おいて、組み換えLIFは、国際特許出願、第PCT/AU88/00
093号に記載の方法を用いてイー・コリおよび酵母で生
成されるが、しかし哺乳動物および昆虫細胞を含む他の
宿主で生成される組み換えLIFおよび合成LIFも本発明の
範囲内にある。

他の特徴では、本発明は、LIFを含んでいる培地での
通過により動物胚から誘導されるES細胞、挿入された付
加的遺伝物質をもっているかかるES細胞およびキメラマ
ウスのようなキメラ動物およびLIF含有培地でインビト
ロで維持されたES細胞を用いて既知の技術により産生さ
れる該動物のトランスジェニックの子孫に及ぶ。

すなわち、本発明は、ヒト、マウス、鳥類（たとえ
ば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよび魚から
のES細胞の生成および維持、およびマウス、鳥類（たと
えば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよび魚の
ような動物種から分離したES細胞を用いるトランスジェ
ニックのキメラ動物およびそれらのキメラ遺伝子の子孫
の生成に拡大する。本発明は、またたとえばインビトロ
受精および他の手法で用いるために、ヒトおよびウシの
生殖細胞ならびに胚細胞のような他の動物種の生存およ
び生長を調節するための培地でのLIFの使用を含む。

本発明は、また下記の図に基づいて記述され得る：第１図は、異なる濃度のLIFのES細胞に対する効果を
示しているグラフである。

第２図は、LIFの存在下および不存在下でのES細胞形
態学を示す図である。

第３図は、ES細胞（EKcs−１）およびEC細胞（F9およ
びPCC3−Ａ）への¹²⁵I−LIFの結合を示しているグラフ
（ＡおよびＣ）と図（Ｂ）である。

本発明は、インビトロの動物胚からの胚幹（ES）細胞
の分離および維持方法に関するものであり、その方法
は、上記のES細胞の誘導および／または維持に充分な時
間および条件下で、有効量の白血病抑制因子（LIF）含
有培地中の上記胚から該ES細胞を誘導および／または維
持することよりなる。動物胚は、ヒト、マウス、鳥類
（たとえば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよ
び魚のような多くの動物種から分離され得る。本明細書
での“動物胚”の表現は、“動物胚盤胞”の意味を含
む。さらに本発明は、ネズミES細胞とヒトLIF（異種
系）およびネズミES細胞とネズミLIF（同種系）を用い
て例証される。これは、本発明がヒト、マウス、鳥類
（たとえば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギおよ
び魚のような動物種からの動物胚により異種系および同
種系の全ての動物種からのLIFを考慮しているというこ
とである。ある状態では、異種系は効果的に働くが、同
種系を用いることが好ましい。本明細書での教示が得ら
れれば、同種系または異種系が特殊な動物ES細胞を分離
または維持するために必要であるかどうかを確認するこ
とは熟練者にとって日常的作業である。

“培地”は、ES細胞の生育を支持することができる適
当な培地を意味する。本発明の実施に有用な適当な例
は、イグール培地またはその修飾あるいは同効培地、例
えば５容量％−30容量％胎児の子牛血清、必要な場合、
0.01−1.0mMβ−メルカプトエタノール、好ましくは約
0.1mmβ−メルカプトエタノールのような補足物を加え
たダルベコ（Dulbecco）またはグラスゴウズ（Glasgow
s）修飾イーグル（Eagle）培地である。培地は、フィー
ダー細胞を含んでも含まなくてもよく、LIFは、上記の
フィーダー細胞に代えて、またはさらに添加して用いら
れ得る。所望の場合、LIFまたはさらに詳細には合成ま
たは組み換えLIFは、約100−1000000単位/ml、好ましく
は約100−100000単位/ml、さらに好ましくは500−10000
単位/mlの濃度で培地に添加され、ここに50単位は、１
ミリリットル中でネズミＭ骨髄性細胞によるクーロン形
成を50％減少させLIF量として定義される。“組み換えL
IF"は、たとえば国際特許出願第PCT/AU88/00093号に従
って、たとえば細菌［たとえば、イー・コリ］または酵
母細胞のような多くの宿主が用いられ得る遺伝子操作方
法により製造されるLIFを意味する。本発明によると、
効果的誘導時間は１日−20週間、詳細には１−８週間で
ある。

本発明の他の特徴は、分化多能性表現型を保って、イ
ンビトロで動物ES細胞を維持する方法を意図しており、
その方法は上記細胞を維持するのに充分な条件下で有効
量のLIFを含んでいる培地で上記細胞を培養することよ
りなる。本発明のこの特徴とするES細胞は、ヒト、マウ
ス、鳥類（たとえば、チキン）、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ヤギおよび魚から誘導される細胞を含む。動物胚からの
ES細胞の分離による場合、前述の方法で用いられるLIF
は好ましくは組み換えLIFである。培地はフィーダー細
胞を含んでも含まなくてもよい。

本発明によると、“分化多能性細胞”および“胚幹細
胞”は、全ての体細胞および生殖細胞直系へ分化する発
育能を保つ細胞である。

幹細胞表現型ES細胞を維持する組み換えLIFの能力
は、精製酵母誘導組み換えヒトLIF（rY−HLIF）または
イー・コリ誘導組み換えマウスLIF（rE−MLIF）のさま
ざまな濃度の存在下、通常の細胞培地にES細胞D3および
HD5を移植することによる示される。rY−MLIFまたはrE
−MLIFの1000−5000単位/mlの濃度で、90％以上のD3お
よびHD5 ES細胞はそれらの幹細胞表現型を保つ。対照
的に、通常の培地に維持されるES細胞は３−６日の期間
以上で分化した。幹細胞表現型をもっているコロニーの
割合は培地中のLIFの濃度に関連している。樹立したES
細胞系の維持に加えて、６つの新規ES細胞系（MBL−
１、２、３、４、５および６）が、培地に1000単位/mlr
E−HLIFが補足された場合、フィーダー細胞が欠除した
胚盤胞から分離された、22継代までの間LIF中でES細胞
系D3、HD5およびMBL−１〜６を長期維持（約100細胞世
代または10週）したが、これらのES細胞の生育特性また
はLIFに対するこれらの用量依存性の著しい変化はなか
った。ES細胞の全ての体細胞および生殖細胞直系への分
化能力は、胚盤胞へのD3およびMBL−１細胞の再導入に
より確認された。分析した約50％の子孫は、個々のマウ
スに90％と同じ高い明白なキメリズムのレベルで注入し
たES細胞から誘導される組織を含む。ES誘導細胞の生殖
細胞系伝達テストのため、雄キメラをC57BL/6Jマウスと
支配した。

３つのD3および２つのMBL−１ C57BL/6Jキメラは、こ
れらのES細胞が生殖細胞の生成に寄与し得ることを確認
しているアグーチ子孫を発生させた。

本発明は、また本明細書で考察したES細胞を用いる既
知の技術により生成されるキメラ動物に関するものであ
る。これらのES細胞は動物胚から分離および／または主
題の発明によるインビトロで維持され得る。さらに、遺
伝学的に操作されたES細胞は、LIF中で継代され、キメ
ラ動物を作るのに用いられ得る。たとえば、ネオマイシ
ン耐性およびｃ−src⁵²⁷に遺伝子をプログラムしている
レトロウイルス・ベクター［Ｎ−TK527;pXT1から誘導；
シー・エイ・ブルターおよびイー・エフ・ワグナー（19
87年）ヌクレイック・アシズ・リサーチ、第15巻、7194
頁］を含んでいる遺伝学的に操作したES細胞は、LIFの
存在下ではあるがフィーダー細胞の不存在下20以上の継
代により、増殖された。これらの細胞は、正常キメラの
生成：さらに胚盤胞注入による着床前胚へのこれらの細
胞の導入により判定されるように分化能力を保った。

本発明のLIFの用途のより詳細は下記の実施例から認
められ得る。

実施例１本実施例は、LIFでインビトロのES細胞を維持し、継
代したES細胞を用いてキメラマウスを生成するのに用い
た段階を詳しく述べる。

第１段階インビトロ増殖用いたES細胞は、129SVHe胚盤胞から分離したD3［ド
ェチシマン，ティー・シィーら（1985年）ジャーナル・
オブ・エムブリオロジー・アンド・エキスペリメンタル
・モルフォロジー第87巻、27〜45頁］、EKcs−１（CS1
として既知）［ワグナー，イー・エフら（1985年）コー
ルド・スプリング・ハーバー・シンポジウム・クォンテ
ィテュティブ・バイオケミストリィ第50巻、691−700
頁］およびHD5［シィー・ステワート（発表せず）ES細
胞系およびC57BL/6J胚盤胞から分離したCBL63［アール
・ケムラー（出版せず）ES細胞であった。LIFでの培養
の前に、D3およびCBL63細胞を、第一次胚線維芽細胞の
フィーダー層で15容量％の胎児の子牛血清を加えたダル
ベコ修飾イーグル培地に維持し、EKcs−１およびHD5 E
S細胞を襄癌細胞系5637（ATCC第HTB9号］により調整さ
れた培地の存在で、15容量％の胎児の子牛血清および0.
1mMβ−メルカプトエタノールを加えたイーグル培地で
維持した。

組み換えLIF ES細胞の幹細胞表現型維持能力を、精
製酵母誘導組み換えヒトLIF（以下rY−HLIFと称する）
またはイー・コリ誘導組み換えマウスLIF（rY−MLIF）
（国際特許出願第PCT/AU88/00093号により開示）のいろ
いろな濃度の存在で、正常細胞培地に系D3およびHD5のE
S細胞を転移することにより示した。結果を第１および
第２図に示す。第1A図で80％の5637調整培地中、８継代
あらかじめ維持したHDS細胞を０−5000単位ml^-1の精製
組み換え酵母誘導ヒトLIF（Ｈ−LIF、以下参照）（■−
■）または精製組み換えエシエヒア・コリ（E.Coli）誘
導マウスLIF（Ｍ−LIF、以下参照）（○−○）を含んで
いる培地に転移した。さらに1000単位ml^-1H−LIFを含ん
でいる培地で13継代維持したHD5細胞を、次に０−1000
単位ml^-1M−LIF（●−●）に転移した。第1B図で、10通
過でマウス胚線維芽細胞で10継代維持したD3細胞を、10
00−5000単位ml^-1H−LIFを含んでいる培地に転移し、さ
らに７または15継代後、この細胞を０−5000単位ml^-1H
−LIF（■−■）または０−1000単位ml^-1M−LIF（●−
●）をそれぞれ含んでいる培地に転移した。第２図は組
み換えLIFの存在でES細胞形態学を示す。80％5637調整
培地の存在で培養したHD5 E5細胞を1000単位ml^-1M−LI
Fを含んでいる培地（Ａ）または通常培地（Ｂ）に転移
することにより、精製組み換えLIFの幹細胞表現型維持
能力を検定した。７日後、コロリーをギームサで染色し
た。コンパクトな幹細胞コロニーを散漫な分化したコロ
ニーと区別することができた。Ｈ−LIF中15継代に維持
したD3細胞を1000単位ml^-1M−LIFを含んでいる培地
（Ｃ）または通常培地（Ｄ）に転移することにより、分
化能力を検定した。２つのD3コロニー型細胞の免疫蛍光
を、幹細胞−特異的細胞−表面抗原を認識するECMA−７
モノクローナル抗体を用いて実施した。細胞−表面−特
異的免疫蛍光を1000単位ml^-1組み換えLIFを含んでいる
培地に維持した細胞90％以上で（Ｅ）、しかし通常の培
地に維持した細胞１％以下で（Ｆ）検定した。（Ｆ）で
示した図の範囲は21細胞を含む。第１図および第２図か
ら、1000−5000単位/mlrY−HLIFまたはrE−MLIFに維持
した90％以上のES細胞がそれらの幹細胞を保つことが示
される。対照的に、通常培地に維持したES細胞は、３−
６日の期間を越えると分化した。用いたrY−HLIFまたは
rE−MLIFの種々の濃度は、培養６日後細胞数に著しい変
化を示さず、LIFで生育し得る特異的サブポピュレーシ
ョンに対する選択性がないことを指示した。同じ結果は
酵母誘導rMLIFをを用いて得られ、また国際特許出願第P
CT/AU88/00093号に開示した。第Ｉ図のデータは、M1骨
髄性白血病細胞に対するヒトLIFの作用について既に記
述された［グー，エヌ・エム（1988年）プロシディング
・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・
ユーエスエイ第85巻、2623−2627頁］ように、ヒトLIF
がマウスES細胞に作用することを指示する。第Ｉ図のデ
ータは、また、M1骨髄性白血病細胞に対するLIFの作用
について以前に記述された通り、ES細胞に対するLIFの
作用が、グリコシル化と無関係であることを指示する。

４つのES細胞系、D3、EKcs−１、CBL63およびHD5を、
1000−5000単位/ml rY−HLIFを含んでいる培地に22継代
維持した（10週または約100世代）。rY−HLIF中ES細胞
を長期維持しても、細胞の生育特性の著しい変化はなか
った。さらに、培地からLIFの減少または除去の結果、
膀胱癌5637条調整培地またはマウス線維芽細胞のフィー
ダー層から直接に外部移植したものと同じキネティクス
でES細胞が分化した（たとえば、第１図および第２図参
照）。LIFの存在で、多数の継代の間培養した幹細胞表
現型ES細胞を、細胞−表面−幹細胞−特異的抗原を認識
するECMA−７抗体での免疫蛍光により確認した［ケムラ
ー，アール，プログレスインデベロップメンタル・バイ
オロジィ第26巻、ソィラー，エッチ・ダブリュ編集 17
5頁：フィシャー（Fisher）、スットガート（Stuttgar
t）、1980年］;LIFの存在下で培養したES細胞は、幹細
胞マーカーを発現したが、LIFの不存在では１％以下し
か発現しなかった（第２回）。

第２段階 ES細胞系の分離ネズミ胚盤胞は、15容量％の胎児の子牛血清、0.1mM
β−メルカプトエタノールおよび1000単位/ml精製rE−H
LIFを加えたズルベコ培地またはグラスゴ修飾イーグル
培地のいずれかでの４日の発育で（１日＝プラグの日）
129SV Heマウスから分離した。ES細胞系を次に２つの
異なる方法論により分離した。

最初の方法において、胚盤胞を培養皿に付着させてお
き、約７日の発芽後成長している内部細胞塊をはぐし、
トリプシン処理し、同じ培地での他の培地皿に移した。
ES細胞コロニーは、外部移植各内部細胞塊から発生する
５−７の間の個々のコロニーを共に２−３週後出現し
た。次いでES細胞系を別の分析用に膨張させた。EC細胞
系を分離する２番目の方法は、内部細胞塊を外部移植す
る前に抗マウス抗体を用いて栄養外胚葉細胞を破壊する
免疫蛍光［マーチン，ジィー・アール（1981年）プロシ
ディング・オブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイ
エンス・ユーエスエイ第78巻、7634−7638頁］を用い
た。ES細胞系分離の効果を第１表で示す。

第３段階キメラマウスの生成フィーダー細胞の不存在下、LIFの存在下で培養され
た（第１段階に示した）か、または、LIFを含有する培
養培地の助けをかりて直接分離された（第２段階に示し
た）、すべてのES細胞系はLIFの除去後も多細胞系に分
化し得る能力を持ち続け、これらの細胞がそれらの分化
多能性表現型を保持し続けることを示している。それら
の発育能を確認するために、LIF中維持されたD3 ES細
胞および７−22継代、14−17継代維持させたMBL−１ E
S細胞を、胚盤胞注入により胚環境に再導入した［ウイ
リアムスら（1988年）セラ第52巻、121−131頁に記載さ
れるように］。胚盤能を、非近交系ICRマウス系または
近交系C57BL/6Jマウスから分離した。膨張した胚盤胞を
培養の前に４℃で10分間油滴培養に維持した。ES細胞を
個々のコロニーを採集することにより調製し、それは次
にりん酸緩衝食塩液、0.5mMEGTAで５分間培養した；単
細胞懸濁液を１容量％のヒヨコ血清を含んでいるトリプ
シン−EDTA溶液中、４℃でさらに５分間インキュベーシ
ョンして調製した。５−20のES細胞［10容量％胎児子牛
血清および20mM HEPES［pH8］で緩衝した3000単位/mlD
NAアーゼで１を有するズルベコ修飾イーグル培地で］を
各胚盤胞に注入した。胚盤胞を偽妊娠の受容細胞に転移
し、正常に発育させた。キメラマウスを被覆マーカーに
より同定した［ホーガンら（1986年）（マクプレテング
・ザ・マウス・エムブリオ・コールド・スプリング・ハ
ーバー・ニューヨーク。続くキメラマウスの分析から、
約５％に達している子孫が、個々のマウス中90％と同じ
程度に高い明白なキメリズムのレベルで、注入した細胞
から誘導される組織（第２表）を含有することが明らか
にされた。さらに、４つのD3−キメラの器官を分析した
ところ、LIFに維持したES細胞は全ての体細胞の発育に
広範囲に寄与し得たことが確認された。

雄キメラを、ICRまたはC57BL/6J雌との交配によりES
誘導細胞の生殖細胞系伝達についてテストした。４つ中
３のD3−C57BL/6Jキメラおよび６の中２のMBL−１−C57
BL/6Jキメラが、LIFで培養したES細胞から誘導されたア
グーチ子孫を生じた（第４表）。

遺伝学的に変化したES細胞をLIFを含んでいる培地に
維持し得たかをテストするのに、D3ES細胞をネオマイシ
ン耐性遺伝子およびｃ−src遺伝子変異体（ｃ−sr
c⁵²⁷）発現するレトロウイルスベクター（Ｎ−TK527）
によって感染させた［感染についてのプロトコールは、
ウイリアムズら（1988年）セラ第52巻、121−131頁に記
載される］。分離したES細胞クーロンを、LIFを含んで
いる培地中、20継代以上維持した。これらの遺伝学的に
修飾したES細胞は、キメラマウス生成能力を保持し、そ
れによって胚盤胞注入により胚環境に再導入する。

ネズミ胚盤胞を、15容量％胎児の子牛血清、0.1mM β
−メルカプトエタノールおよび1000単位/ml精製rE−HLI
Fを加えたズルベコ培地またはグラスゴ修飾イーグル培
地のいずれかに、発生の４日で（１日＝プラグの日）12
9 Sv Heマウスから分離した。胚盤胞を次に同一培地に
外部移植し、培養皿に付着させておき、採集した内部細
胞塊はりん酸−緩衝食塩液、0.5mM EGTAに５分間解離し
た：単細胞懸濁液を１容量％ヒヨコ血清を含んでいるト
リプシン−EDTA溶液中でインキュベーションすることに
より調製し、細胞は上記の細胞培地に再び塗布した。特
徴のあるES細胞コロニーは１−３週以内に出現した。

他の胚盤胞を免疫蛍光［マーチン，ジィー・アール、
（1981年）プロシディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス・ユーエスエイ第78巻、7634−
7638頁に記載されるように］により処理した。胚盤胞
は、卵の透明帯からふ化し、次いで抗−マウス抗体で処
理し、そして補体の添加により破壊した。露出した内部
細胞塊を次に組織培養皿に付着させておき、再び抗−マ
ウス抗体および補体で処理した。数日以内に、分化多能
性幹細胞は出現し、上記のように解離し、トリプシン処
理した。

以下に示すものは第2,3および４表に関するものであ
る： D3およびMB1−1 ES細胞を129Sv Heマウスから誘導す
る（同系交配、アグーチ、グルコースリン酸イソメラー
ゼ1a対立遺伝子にホモ接合性）。D3 ES細胞を最初に第
一次胚線維細胞で10継代、培養し、次に1000−5000単位
/ml組み換えLIFに７−22継代で転移した。MB1−1 ES細
胞を、フィーダー細胞の不存在、しかしrE−HLIFの存在
下で分離し、これらの細胞を14−17継代、培養した。ES
細胞をICR（異種交配、白子）またはC57BL/6J（同種交
配、黒人種）胚盤胞に注入し、次いでこれらは偽妊娠の
里子の母親に転移した。ICRおよびC57BL/6Jマウスの両
方は、グルコースリン酸イソメラーゼ1b対立遺伝子にホ
モ接合性である。キメラ子犬は、外膜の色素沈着により
同定した（妊娠した里子の母親のみを、子孫の数と判定
し計算した。）組織キメラ化をグルコースリン酸イソメ
ラーゼ株相違点を用いて判定した。組織キメラ産生の程
度を、２つのD3P−ICR（番号１および２）および２つの
D3−C57BL/6Jキメラ（番号３および４）で測定した。分
析した組織:C、外膜;Bl、血液;Sp、脾臓;P、パンクレア
ーゼ;Li、肝臓;T、胸腺;H、心臓;Lu、肺臓;G、生殖腺;
K、腎臓;M、筋肉;B、脳;Sa、唾液腺。雄キメラは、ICR
またはC57BL/6Jマウスと交配し、子孫を外膜色素沈着に
より同定した。

実施例２本実施例は、ESおよびEC細胞の特異的高親和性レセプ
ターを記録するのに用いた段階を詳述する。添付の第３
図は、EC細胞EKcs−１およびEC細胞F9およびPCC3−Ａへ
の¹²⁵I−LIFの結合を示す［ジャコブ，ジェイら（1973
年）アナルス・デュ・マイクロバイオロジー・ル・イン
スティテュト・パスツール第124巻、269−282頁］。第
３図に関して、（Ａ）、F9（□）、EKcs−１（●）、PC
C3A−１（■）およびM1（○）細胞と¹²⁵I−標識LIFとの
結合のスカチァード分析。結合についての飽和曲線は、
特異的に結合したLIFの量（過剰の非標識LIFの有無で観
察される結合間の巻として同定）対遊離のLIFとの結合
の割合をプロットするスカチァードの方法により分析し
た。遊離のLIF値は、特異的にLIFレセプターと結合しう
る¹²⁵I−標識LIFのパーセントで決定し、本実験では、7
5％と測定された。LIFとそのレセプターとの相互作用の
見掛け解離定数は、曲線の勾配および縦座標の切片から
のレセプター数から同定した。（Ａ）の結果を点当り５
×10⁶細胞に標準化し、２つの点の平均を示し、曲線を
リガンド・プログラムを用いてあてはめた。（Ｂ）、F9
EC細胞のオートラジオグラフィーは¹²⁵I−標識LIFで標
識した。（Ｃ）、¹²⁵I−標識LIFの結合後、E9 EC細胞の
シルバーグレンの定量。

精製組み換え（酵母誘導）ヒトLIF（rH−HLIF）は、
既に記述されているように［ヒルオン，ディー，ジェイ
ら（1988年）プロシディング・オブ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンス・ユーエスエイ、第85巻、59
71−5975頁］チロシン基を放射性に標識し、約1.2×10⁷
cpm/pモルの特異的放射能をもった¹²⁵I−LIFを生成し
た。¹²⁵I−LIF（２×10³−５×10⁵cpm）を、少なくとも
100倍モル過剰の非標識LIFと共にまたは無しで１−４×
10⁶標的細胞と全量100μで氷中４時間インキュベート
した。細胞内および遊離の¹²⁵I−LIFを、胎児の子牛血
清による遠心分離により分離した［ニコラ，エヌ，エイ
およびメトカルフ，ディー（1986年）ジャーナル・オブ
・セルラル・フィジオロジー第128巻、160−188頁］。
特異的細胞内¹²⁵I−LIFを寒冷競合により測定した。

第３図は、ES細胞EKcs−１およびEC細胞PCC3−Ａおよ
びF9と¹²⁵I−LIFとの特異的飽和可能な高親和性結合を
示す。スカチァードプロットから出された細胞当りのLI
Fレセプター数は、それぞれ295、190および330で、４℃
での見掛け解離定数は約90pMであった。これは、M1細胞
系、LIF−反応性の単球性白血病と比較し、それは見掛
け解離定数50−150pMで、50−200LIFレセプター／細胞
を示す。テストした全ての他のESおよびおよびEC細胞−
D3、NG2、PC13およびP19−は、同じレベルのLIFを結合
した（データは提示せず）。

M1細胞、EKcs−１およびPCC3−Ａと¹²⁵I−LIFとの結
合は、また非標識組み換えおよび自生のネズミおよびヒ
トLIFと競合するが、一連のホルモンおよび因子（胚細
胞で作用するいくつかを含む）：インシュリン、IGF−
Ｉ、IGF−II、酸性および塩基性FGF、TGFβ、TNFα、TN
Fβ、NGF、PDGF、EGF、IL−１、IL−４、GM−CSF、Ｇ−
CSF、Multi−CSFおよびエリスロポイエチン、と競合し
ないことが見い出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヒルトン、ダグラス・ジェイムズオーストラリア連邦3133 ビクトリア、ワランダイト、ウエスト・エンド・ロード８番 (56)参考文献ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．121（1987）ｐ．１ −９ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．50（1985）ｐ．707−711 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．309（1984) ｐ．255−256 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．292（1981) ｐ．154−156 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．78（1981）ｐ. 7634−7638 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．326（1987) ｐ．292−295 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83（1986）ｐ. 9065−9069 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．326（1987) ｐ．295−298 ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．127（1988 Ｍａｙ) ｐ．224−227 ＷｉｌｈｅｌｍＲｏｕｘ’ｓＡｒｃｈ．ＤｅｖＢｉｏｌ，Ｖｏｌ．196, Ｎｏ．３（1987）ｐ．185−190 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．323（1986) ｐ．445−448

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】インビトロで動物（ひとを除く）胚から胚
幹（ES）細胞の分離方法であって、有効量の白血病抑制
因子（LIF）を含んでいる培地で上記のES細胞の発育に
充分な時間および条件下上記の胚を誘導し、維持するこ
とを含む方法。
【請求項２】培地が、フィーダー細胞を欠いている請求
項１記載の方法。
【請求項３】動物胚が、マウス、鳥類、ヒツジ、ブタ、
ウシ、ヤギまたは魚から誘導される請求項１または２記
載の方法。
【請求項４】動物胚が、マウスから誘導される請求項３
記載の方法。
【請求項５】培地がイーグル培地またはその修飾培地ま
たはそれと同等のものである請求項１または２項記載の
方法。
【請求項６】LIFが、組み換えLIFである請求項１−５の
何れか１項記載の方法。
【請求項７】LIFが組み換えヒトまたはネズミLIFである
請求項６記載の方法。
【請求項８】LIFが、10−1000000単位/mlの濃度で培地
に添加される請求項７記載の方法。
【請求項９】LIFが、100−100000単位/mlの濃度で培地
に添加される請求項８記載の方法。
【請求項１０】LIFが、500−10000単位/mlの濃度で培地
に添加される請求項９記載の方法。
【請求項１１】有効な時間が、１日−20週である請求項
１−10の何れか１項記載の方法。
【請求項１２】有効な時間が、１日から８週間である請
求項11記載の方法。
【請求項１３】分化多能性表現型を保ちながらインビト
ロで動物（ひとを除く）胚幹（ES）細胞を維持する方法
であって、有効量の白血病抑制因子（LIF）を含んでい
る培地で上記の細胞を維持するのに充分である条件下上
記の細胞を培養することを含む方法。
【請求項１４】培地が、フィーダー細胞を欠いている請
求項13記載の方法。
【請求項１５】動物ES細胞が、マウス、鳥類、ヒツジ、
ブタ、ウシ、ヤギまたは魚から誘導される請求項13また
は14項記載の方法。
【請求項１６】動物ES細胞が、マウスから誘導される請
求項15記載の方法。
【請求項１７】培地がイーグル培地またはその修飾培地
またはそれと同等のものよりなる請求項13または14項記
載の方法。
【請求項１８】LIFが組み換えLIFである請求項13−17項
の何れか１項記載の方法。
【請求項１９】LIFが組み換えネズミまたはヒトLIFであ
る請求項18記載の方法。
【請求項２０】組み換えLIFが10−1000000単位/mlの濃
度で培地に添加される請求項19記載の方法。
【請求項２１】組み換えLIFが100−100000単位/mlの濃
度で培地に添加される請求項20記載の方法。
【請求項２２】LIFが500−10000単位/mlの濃度で培地に
添加される請求項21記載の方法。
【請求項２３】有効量の白血病抑制因子（LIF）を含む
培養培地中で動物（ひとを除く）胚を誘導し維持するこ
とによってインビトロの動物（ひとを除く）胚から、分
化多能性表現型の維持可能な胚幹（ES）細胞を誘導し、
上記ES細胞からキメラ動物（ひとを除く）を産生する前
に上記ES細胞を遺伝学的に修飾することを含む、キメラ
動物（ひとを除く）の産生方法。
【請求項２４】上記ES細胞が有効量のLIFの存在下で維
持される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】上記動物（ひとを除く）がマウスであ
る、請求項23または24記載の方法。