DE68928914T2 - (in vitro)-vermehrung von embryonalen stammzellen unter verwendung von leukämie-inhibitionsfaktor (lif) - Google Patents
(in vitro)-vermehrung von embryonalen stammzellen unter verwendung von leukämie-inhibitionsfaktor (lif)Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft den Gebrauch eines früher entdeckten und charakterisierten Moleküls, Leukämie-Inhibitionsfaktor (LIF), bei der Isolierung und Vermehrung von embryonalen Stammzellen in vitro.
- Embryonale Stammzellen (Es-Zellen), die pluripotenten Auswüchse von Blastocysten, können in vitro kultiviert und manipuliert und anschließend in die embryonale Umgebung zurückgegeben werden, um normal zu allen Geweben, einschließlich der Keimbahn, beizutragen (als Überblick siehe Robertson, E. J. (1986) Trends in Genetics 2: 9-13). Es können nicht nur in vitro vermehrte Es-Zellen wirksam zur Bildung von Chimären, einschließlich Keimbahn-Chimären, beitragen, sondern diese Zellen können außerdem in vitro manipuliert werden, ohne ihre Fähigkeit zu verlieren, Keimbahn-Chimäre zu erzeugen (Robertson, E. J. et. al. (1986) Nature 323: 445-447).
- Es-Zellen stellen daher einen Weg für die Erzeugung von transgenen Tieren, wie transgenen Mäusen, bereit, einen Weg, welcher eine Anzahl von wichtigen Vorteilen, verglichen mit konventionelleren Techniken, wie Zygoten-Injektion und virale Infektion (Wagner und Stewart (1986) in Experimental Approaches to Embryonic Development. J. Rossant und A. Perdersen eds. Cambridge: Cambridge University Press), zum Einbringen von neuem genetischen Material in solche Tiere besitzt. Erstens kann das interessierende Gen eingebracht werden und seine Integration und Expression in vitro charakterisiert werden. Zweitens kann der Effekt des eingebrachten Gens auf das Wachstum der Es-Zellen in vitro studiert werden. Drittens können die charakterisierten Es-Zellen, die ein neues eingebrachtes Gen besitzen, wirksam in Embryos durch Blastocysten- Injektion oder Embryo-Aggregation eingebracht werden, und die Auswirkungen des eingebrachten Gens auf die Entwicklung der resultierenden transgenen Chimäre können während des prä- oder postnatalen Lebens beobachtet werden. Viertens kann die Stelle in dem Es-Zellengenom, an welcher das eingebrachte Gen integriert, manipuliert werden, wobei der Weg für Gen- Targeting und Gen-Ersetzung offen bleibt (Thomas, K. R. und Capecci, M. R. (1987) Cell 51: 503-512).
- Es ist jedoch bekannt, daß Es-Zellen und bestimmte EC- Zellinien (embryonale Karzinomzellinien) den Stammzell- Phänotyp in vitro nur behalten werden, wenn sie auf einer Fütterschicht von Fibroblasten (wie murine STO-Zellen, z. B. Martin, G. R. und Evans, M. J. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 1441-1445) kultiviert werden, oder wenn sie in durch bestimmte Zellen konditioniertem Medium kultiviert werden (z. B. Koopman, P. und Cotton, R. G. H. (1984) Exp. Cell Res. 154: 233-242; Smith, A. G. und Hooper, M. L. (1987) Devel. Biol. 121: 1-91). In der Abwesenheit von Fütterzellen oder konditioniertem Medium differenzieren die Es-Zellen spontan in eine breite Mannigfaltigkeit von Zelltypen, welche denen ähnlich sind, die während der Embryogenese und in dem erwachsenen Tier gefunden werden. Die Faktoren, die für das Erhalten der Pluripotenz von Es-Zellen verantwortlich sind, sind jedoch wenig charakterisiert geblieben.
- Während der Arbeit, die zu der vorliegende Erfindung führte, wurde gefunden, daß LIF die Kapazität besitzt, Fütterschichten (oder konditioniertes Medium) zu ersetzen oder ihnen zugesetzt zu werden, wobei die Erhaltung von pluripotenten Es-Zellen in vitro unterstützt wird.
- LIF ist ein Protein, welches früher gereinigt, kloniert und in großen Mengen in gereinigter rekombinanter Form aus sowohl Escherichia coli als auch Hefe-Zellen hergestellt wurde. (Internationales Patent Nr. WO 88/07548, angemeldet am 31. März 1988) LIF wurde als ein Faktor definiert, dessen Eigenschaften umfassen:
- 1. es hat die Fähigkeit, die Proliferation von myeloiden Leukämiezellen, wie M1-Zellen, mit einer assoziierten Differenzierung der Leukämiezellen zu unterdrücken; und
- 2. es wird mit einem Molekül, welches die definierte Sequenz von murinem LIF oder humanem LIF (definiert in dem Internationalen Patent Nr. WO 88/07548) besitzt, um die Bindung an spezifische zelluläre Rezeptoren auf M1-Zellen oder murinen oder humanen Makrophagen konkurrieren. Gearing et al., in EMBO J., 1987, Vol. 6, Nr. 3, Seiten 3995-4002 offenbaren den Effekt von LIF als einen Induktor der Differenzierung von M1 murinen myeloiden Leukämiezellen. Zusätzlich zu den biologischen Eigenschaften, die früher für murines und humanes LIF offenbart wurden, wurde nun gefunden, daß LIF folgende Eigenschaften besitzt:
- (a) es ermöglicht die Herleitung und Erhaltung des pluripotenten Phänotyps von Es-Zellen in vitro in der Abwesenheit von Fütterzellen;
- (b) es ermöglicht den obengenannten Es-Zellen nach einer Passage in vitro in der Gegenwart von LIF zu somatischem und Keimbahn-Zellgeweben von chimären Tieren, wie Mäusen, beizutragen, wenn die Zellen in die embryonale Umgebung zurückgeführt werden;
- (c) es zeigt selektive Bindung an hochaffine Rezeptoren auf murinen Es- (EKcs-1 (früher bekannt als CS1) und D3) und EC- (PCC3-3A und F9) Zellen; und
- (d) spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-LIF an hochaffine Rezeptoren steht weder in Konkurrenz mit Insulin, IGF-I, IGF-II, saurem und basischem FGF, TGF-beta, TNF-alpha, TNF-beta, NGF, PDGF, EGF, IL-1, IL-2, IL-4, GM-CSF, G-CSF, Multi-CSF noch Erythropoietin, steht jedoch in Konkurrenz mit murinem und humanem LIF.
- Folglich betrifft ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Isolierung von embryonalen Stammzellen (Es-Zellen) aus nicht-menschlichen tierischen Embryos in vitro, wobei das Verfahren die Kultivierung der besagten Embryos in einem Kulturmedium, welches eine wirksame Menge von Leukämie-Inhibitionsfaktor (LIF) enthält, sowie die Gewinnung von Es-Zellen von den besagten Embryos umfaßt. Die verwendeten Embryos können aus Tieren, umfassend, doch nicht darauf beschränkt, eine Anzahl von Tierarten wie Vögel (z. B. Hühner), Mäuse, Schafe, Schweine, Rinder, Ziegen und Fische, isoliert werden.
- Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung befaßt sich mit einem Verfahren zur Erhaltung von tierischen embryonalen Stammzellen (Es-Zellen) in vitro, wobei der pluripotente Phänotyp erhalten bleibt, wobei das Verfahren eine Kultivierung besagter Zellen in einem Kulturmedium umfaßt, welches eine wirksame Menge von Leukämie-Inhibitionsfaktor (LIF) enthält, unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Zellen zu erhalten. Die Es-Zellen gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen Zellen von Menschen, Mäusen, Vögeln (z. B. Hühnern), Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen und Fischen.
- Das in dem Kulturmedium verwendete LIF ist vorzugsweise rekombinantes LIF, welches beispielsweise gemäß den beschriebenen Verfahren (Internationales Patent Nr. WO 88/07548) hergestellt wurde. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß rekombinantes LIF und insbeson dere rekombinantes humanes und murines LIF wirksame Substituenten für, oder Zusätze zu, Fütterschichten oder konditioniertem Medium sind, um die Es-Zellen in vitro zu erhalten. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung wird rekombinantes LIF in E. coli und Hefe unter Verwendung der beschriebenen Verfahren (Internationales Patent Nr. WO 88/07548) hergestellt, dennoch liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, rekombinantes LIF, welches in anderen Wirten hergestellt wurde, einschließlich Säuger- und Insektenzellen, und synthetisches LIF einzubeziehen.
- In einem anderen Aspekt erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von nicht-humanen chimären Tieren, umfassend ein Einbringen von tierischen Es- Zellen, die nach den Verfahren der Erfindung isoliert oder erhalten wurden, in das besagte Tier im embryonalen Stadium vor der Implantation.
- Es-Zellen können aus tierischen Embryos durch Passage in einem Kulturmedium, welches LIF enthält, gewonnen werden, zusätzliches genetisches Material kann darin eingefügt sein, und chimäre Tiere, wie chimäre Mäuse oder transgene Nachkommen von besagten Tieren, können durch bekannte Techniken unter Verwendung von Es-Zellen, welche in vitro in einem LIF- enthaltenden Kulturmedium erhalten wurden, generiert werden.
- Somit ermöglicht die Erfindung die Erzeugung und Erhaltung von Es-Zellen aus Menschen, Mäusen, Vögeln (z. B. Hühnern), Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen und Fischen sowie die Erzeugung von transgenen chimären Tieren und deren transgenen Nachkommen unter Verwendung der Es-Zellen, die aus Tierarten wie Mäusen, Vögeln (z. B. Hühnern), Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen und Fischen isoliert wurden. Diese Erfindung umfaßt auch die Verwendung von LIF in Kulturmedien, um das Überleben und Wachstum von Menschen und anderen Tierarten, wie Rinder-Keimbahnzellen und embryonalen Zellen, zu modulieren, beispielsweise für die Verwendung bei in vitro-Befruchtung und anderen Prozeduren.
- Die vorliegende Erfindung kann auch bezogen auf die folgenden Figuren beschrieben werden:
- Fig. 1 ist eine grafische Darstellung, die den Effekt von verschiedenen LIF-Konzentrationen auf Es-Zellen zeigt.
- Fig. 2 ist eine bildliche Darstellung, die Es-Zellmorphologie in der Gegenwart und Abwesenheit von LIF zeigt.
- Fig. 3 ist eine grafische (A und C) und bildliche (B) Darstellung, die die Bindung von ¹²&sup5;I-LIF an Zellen (EKcs-1) und EC-Zellen (F9 und PCC3-A) zeigt.
- Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können für die Isolierung und Erhaltung von embryonalen Stammzellen (Es- Zellen) aus tierischen Embryos in vitro verwendet werden durch Verfahren, welche ein Gewinnen und/oder Erhalten dieser Es-Zellen von diesen Embryos in einem Kulturmedium umfassen, welches eine wirksame Menge von Leukämie-Inhibitionsfaktor (LIF) enthält, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die für die Gewinnung und/oder Erhaltung von diesen Es-Zellen ausreichend sind. Die tierischen Embryos können aus einer Anzahl von Tierarten, wie Mäusen, Vögeln (z. B. Hühnern), Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen und Fischen, isoliert werden. Die Bezugnahme hier auf "tierische Embryos" umfaßt die Bezugnahme auf "tierische Blastocysten". Weiterhin ist die vorliegende Erfindung unter Verwendung von humanem LIF mit murinen Es-Zellen (heterologes System) und murinem LIF mit murinen Es-Zellen (homologes System) beispielhaft ausgeführt. Dies ist in dem Verständnis getan, daß die vorliegende Erfindung LIF von jeder Tierart in heterologen oder homologen Systemen mit tierischen Embryos aus Tierarten wie Menschen, Mäusen, Vögeln (z. B. Hühnern), Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen und Fischen erwägt. Obwohl unter bestimmten Umständen ein heterologes System wirksam arbeiten wird, könnte es bevorzugt sein, homologe Systeme zu verwenden. Mit den hier gegebenen Anweisungen wird es für einen erfahrenen Fachmann Routine sein, zu ermitteln, ob ein homologes oder heterologes System zum Isolieren oder Erhalten spezieller tierischer Es- Zellen benötigt wird.
- Mit "Kulturmedium" ist ein geeignetes Medium gemeint, welches imstande ist, Wachstum von Es-Zellen zu unterstützen. Beispiele für geeignete Kulturmedien, die in der Praktizierung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind Eagles Medium oder Modifikationen oder Äquivalente davon, wie Dulbecco's oder Glasgows modifiziertes Eagle's Medium mit Zusätzen wie 5%-30% (v/v) fötales Kälberserum und wo nötig 0,01 bis 1,0 mM β-Mercaptoethanol, jedoch vorzugsweise etwa 0,1 mM β-Mercaptoethanol. Das Kulturmedium kann oder kann nicht Fütterzellen enthalten, und LIF kann verwendet werden, um (die Fütterzellen) zu ersetzen oder diesen Fütterzellen zugesetzt zu werden. Wenn benötigt, wird LIF, oder insbesondere synthetisches oder rekombinantes LIF, dem Medium in einer Konzentration von etwa 100-1.000.000 Einheiten/ml und bevorzugt etwa 100-100.000 Einheiten/ml und sogar besonders bevorzugt 500-10.000 Einheiten/ml zugesetzt, wobei 50 Einheiten als die Menge von LIF definiert sind, welche in einem Milliliter eine 50%ige Reduktion der Klonbildung durch murine M1 myeloide Zellen induziert. Mit "rekombiantem LIF" ist das LIF gemeint, welches mit gentechnischen Mitteln hergestellt wurde, zum Beispiel gemäß dem Internationalen Patent Nr. WO 88/07548, worin eine Anzahl von Wirten wie Bakterien (z. B. E. coli) oder Hefezellen verwendet werden können. Gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt die wirksame Gewinnungszeit von einem Tag bis 20 Wochen und insbesondere von einer bis acht Wochen.
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet einen Prozeß, um tierische Es-Zellen in vitro zu erhalten, während deren pluripotenter Phänotyp erhalten wird, dieser Prozeß umfaßt eine Kultivierung dieser Zellen in einem Kulturmedium, welches eine wirksame Menge von LIF enthält, unter Bedingungen, die für eine Erhaltung dieser Zellen ausreichend sind. Die Es-Zellen in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung schließen Zellen ein, welche von Menschen, Mäusen, Vögeln (z. b. Hühnern), Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen und Fischen gewonnen sind. Ebenso wie bei der Isolierung von Es-Zellen aus tierischen Embryos ist das LIF, welches in dem obengenannten Prozeß verwendet wird, vorzugsweise rekombinantes LIF. Das Kulturmedium kann Fütterzellen enthalten oder nicht.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung sind "pluripotente Zellen" und "embryonale Stamzellen" solche, welche das Entwicklungspotential zurückbehalten, in alle somatischen und Keimbahn-Zellinien zu differenzieren.
- Das Vermögen von rekombinantem LIF, den Stammzell- Phänotyp von Es-Zellen zu erhalten, wird damit gezeigt, daß Es-Zellen D3 und HD5 in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen von gereinigtem rekombinanten humanen LIF aus Hefe (rY-HLIF) oder rekombinantem murinen LIF aus E. coli (rE-MLIF) in normales Zellkulturmedium übertragen werden. Bei Konzentrationen von 1000-5000 Einheiten/ml von rY-HLIF oder rE-MLIF behielten mehr als 90% der D3 und HD5 Es-Zellen ihren Stammzell-Phänotyp. Im Gegensatz dazu differenzierten die Es-Zellen, die in normalem Kulturmedium gehalten wurden, über einen Zeitraum von 3-6 Tagen. Der Anteil von Kolonien, die den Stammzell-Phänotyp hatten, wurde in Relation zu der Konzentration von LIF in dem Kulturmedium gesetzt. Zusätzlich zum Erhalten von etablierten Es- Zellinien wurden sechs neue Es-Zellinien (MBL-1, 2, 3, 4, 5, & 6) aus Blastocysten in der Abwesenheit von Fütterzellen isoliert, als das Medium mit 1000 Einheiten/ml rE-HLIF ergänzt worden war. Eine Langzeit-Erhaltung der Es-Zellinien D3, HD5 und MBL-1 bis 6 in LIF für bis zu 22 Passagen (ungefähr 100 Zellgenerationen oder 10 Wochen) veränderte nicht merklich die Wachstums-Charakteristika dieser Es-Zellen oder deren Dosis-Abhängigkeit von LIF. Das Vermögen dieser Es- Zellen, in alle somatischen und Keimbahn-Zellinien zu differenzieren, wurde dadurch bestätigt, daß D3 und MBL-1 Zellen in Blastocysten wieder eingebracht wurden. Ungefähr 50% der analysierten Nachkommenschaft enthielt Gewebe, welche von den injizierten Es-Zellen herstammten, mit Stufen von offenkundigem Chimärismus von bis zu 90% in individuellen Mäusen. Um die Keimbahn-Übertragung von Zellen, die von Es-Zellen herstammen, zu testen, wurden männliche Chimäre mit C57BL/6 J- Mäusen gepaart. Drei D3 und zwei MBL-1 C57BL/6 J Chimäre führten zum Erscheinen von Agouti-Nachkommenschaft, wodurch bestätigt wurde, daß diese Es-Zellen zu der Bildung von Keimzellen beitragen können.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch nicht-humane chimäre Tiere, die durch bekannte Techniken unter Verwendung der hier betrachteten Es-Zellen erzeugt sind. Diese Es-Zellen können aus tierischen Embryos isoliert werden und/oder in vitro erhalten werden gemäß der vorliegenden Erfindung. Weiterhin können genetisch manipulierte Es-Zellen in LIF passagiert werden und für das Herstellen von chimären Tieren verwendet werden. Z. B. wurden genetisch manipulierte Es- Zellen, die einen Retrovirus-Vektor enthielten (N-TK527; abgeleitet von pXT1; C. A. Boulter ud E. F. Wagner, (1987) Nucl. Acids Res. 15: 7194), welcher Gene für Neomycin-Resistenz und c-src&sup5;²&sup7; kodiert, in der Gegenwart von LIF, jedoch in der Abwesenheit von Fütterzellen für mehr als 20 Passagen vermehrt. Diese Zellen behielten immer noch die Fähigkeit zu differenzieren, wie aus der Bildung von normalen Chimären, folgend der Einbringung dieser Zellen in Embryos vor einer Implantation durch Blastocysten-Injektion, gefolgert wurde.
- Weitere Einzelheiten der Verwendung von LIF gemäß der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden Beispielen deutlich werden.
- Dieses Beispiel legt die Schritte dar, die verwendet wurden, um Es-Zellen in vitro in LIF zu erhalten und chimären Mäusen unter Verwendung der auf diese Weise passagierten Es-Zellen zu erzeugen.
- Die verwendeten Es-Zellen waren die D3 (Doetschman, T. C. et. al. (1985) J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45), die EKcs-1 (früher bekannt als CS1) (Wagner, E. F. et. al. (1985) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 691-700) und die HD5 (C. Stewart, unveröffentlicht) Es-Zellinien, die aus 129 SV He Blastocysten isoliert sind und die CBL63 (R. Kemler, unveröffentlicht) Es-Zellen, die aus C57BL/6 J Blastocysten isoliert sind. Vor einer Kultur in LIF wurden die D3 und CBL63 Zellen in Dulbecco modifiziertem Eagle's Medium mit 15% (v/v) fötalem Kälberserum auf einer Fütterschicht von primären Embryo-Fibroblasten gehalten, und die EKcs-1 und HD5 Es- Zellen wurden in Eagle's Medium mit 15% (v/v) fötalem Kälberserum und 0,1 mM β-Mercaptoethanol in der Gegenwart von Medium, welches durch die Blasenkarzinom-Zellinie 5637 (ATCC Nr. HTB9) konditioniert war, gehalten.
- Das Vermögen von rekombinantem LIF, den Stammzell-Phänotyp von Es-Zellen zu erhalten, wurde dadurch gezeigt, daß Es- Zellen der Linien D3 und HD5 in normales Zellkulturmedium in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen von gereinigtem rekombinanten humanen LIF aus Hefe (ab hier bezeichnet als rY-HLIF) oder rekombinanten murinen LIF aus E. coli (rE- MLIF) (zuvor offenbart in dem Internationalen Patent No. WO88/07548) überführt wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 und 2 gezeigt. In Fig. 1A wurden HDS Zellen, die zuvor in 80% 5637 konditioniertem Medium für acht Passagen gehalten worden waren, in Kulturmedien übertragen, welche 0-5.000 Einheiten ml&supmin;¹ von gereinigtem, rekombinanten humanen LIF aus Hefe (H-LIF; siehe unten) ( - ) oder gereinigtem, rekombinanten murinen LIF aus E. coli (M-LIF; siehe unten) (O - O) enthielten. HD5 Zellen, die für weitere 13 Passagen in Medium gehalten wurden, welches 1.000 Einheiten ml&supmin;¹ H-LIF enthielt, wurden dann in 0-1.000 Einheiten ml&supmin;¹ M-LIF ( - ) übertragen. In Fig. 1B wurden D3 Zellen, die auf murinen Embryo- Fibroblasten für 10 Passagen gehalten worden waren, in Medien transferiert, die 1.000-5.000 Einheiten ml&supmin;¹ H-LIF enthielten, und nach weiteren 7 oder 15 Passagen wurden die Zellen in Medien transferiert, die 0-5.000 Einheiten ml&supmin;¹ von H-LIF ( - ) bzw. 0-1. 000 Einheiten ml-1 M-LIF ( - ) enthielten. Fig. 2 zeigt die Es-Zellmorphologie in der Gegenwart von rekombinantem LIF. HD5 Es-Zellen, die in der Gegenwart von 80% 5637-konditioniertem Medium kultiviert worden waren, wurden durch Transfer in Medien, die 1.000 Einheiten ml&supmin;¹ M- LIF enthielten (A), oder in normale Kulturmedien (B) auf das Vermögen von gereinigtem rekombinanten LIF getestet, den Stammzell-Phänotyp zu erhalten. Nach sieben Tagen wurden die Kolonien mit Giemsa gefärbt. Kompakte Stammzell-Kolonien konnten von diffusen differenzierten Kolonien unterschieden werden. D3 Zellen, die in H-LIF für 15 Passagen gehalten worden waren, wurden durch Transfer in Medien, die 1.000 Einheiten ml&supmin;¹ M-LIF (C) enthielten, oder in normale Kulturmedien (D) auf die Fähigkeit zu differenzieren getestet. Immunofluoreszenz der Zellen in den zwei D3-Kolonietypen wurde unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers ECMA-7 durchgeführt, welcher ein Stammzell-spezifisches Zelloberflächen-Antigen erkennt. Eine Zelloberflächen-spezifische Immunofluoreszenz wurde auf mehr als 90% der Zellen detektiert, die in Medien gehalten wurden, die 1.000 Einheiten ml&supmin;¹ rekombinantes LIF (E) enthielten, jedoch auf weniger als 1% der Zellen, die in normalen Kulturmedien gehalten wurden (F). Der Ausschnitt, der in (F) gezeigt ist, enthält 21 Zellen.
- Fig. 1 und 2 zeigen, daß mehr als 90% der Es-Zellen, die in 1000-5000 Einheiten/ml rY-HLIF oder rE-MLIF gehalten wurden, ihren Stammzell-Phänotyp behielten. Im Gegensatz dazu differenzierten Es-Zellen, die in normalem Kulturmedium gehalten wurden, über einen Zeitraum von 3-6 Tagen. Die verschiedenen verwendeten Konzentrationen von rY-HLIF oder rE-MLIF resultierten nicht in einer merklichen Veränderung der Zellzahl nach 6 Tagen in Kultur, dies zeigt, daß dort keine Selektion für eine spezifische Subpopulation, die in LIF wachsen kann, vorhanden ist. Ähnliche Ergebnisse sind bei der Verwendung von rMLIF aus Hefe, ebenfalls offenbart in dem Internationalen Patent Nr. WO 88/07548, gewonnen worden. Die Daten in Fig. 1 zeigen, daß humanes LIF auf murine Es-Zellen wirkt, wie es früher für die Wirkung von humanem LIF auf M1 myeloide Leukämiezellen beschrieben wurde (Gough, N. M. et. al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2623-2627). Die Daten in Fig. 1 zeigen auch, daß die Wirkung von LIF auf Es-Zellen unabhängig von einer Glykosylierung ist, wie es früher für die Wirkung von LIF auf M1 myeloide Leukämiezellen beschrieben wurde.
- Vier Es-Zellinien, D3, EKcs-1, CBL63 und HD5, wurden bis zu 22 Passagen (10 Wochen oder ungefähr 100 Generationen) in Medium gehalten, welches 1000-5000 U/ml rY-HLIF enthielt. Eine Langzeit-Haltung der Es-Zellen in rY-HLIF veränderte nicht merklich die Wachstums-Charakteristika der Zellen. Weiterhin resultierte eine Reduktion oder ein Entfernen des LIF aus dem Kulturmedium in der Differenzierung der Es-Zellen mit ähnlichen Kinetiken, wie bei aus Blasenkarzinom 5637- konditioniertem Medium oder einer Fütterschicht von Maus- Fibroblasten explantierten (siehe z. B. Fig. 1 und 2). Der Stammzell-Phänotyp von Es-Zellen, die für mehrere Passagen in der Gegenwart von LIF kultiviert wurden, wurde durch Immunofluoreszenz mit dem Antikörper ECMA-7 bestätigt, welcher ein Stammzell-spezifisches Zelloberflächen-Antigen erkennt (Kemler, R. in Arbeit in Developmental Biology Band 26 Sauer, H. W. ed Seite 175; Fisher, Stuttgart, 1980); Es-Zellen, die in der Gegenwart von LIF kultiviert wurden, exprimierten den Stammzell-Marker, wohingegen in der Abwesenheit von LIF weniger als 1% das taten (den Stammzell-Marker exprimierten) (Fig. 2).
- Murine Blastocysten wurden aus 129 Sv He Mäusen am Tag 4 der Entwicklung (Tag 1 = "day of plug") in entweder Dulbecco's oder Glasgows modifiziertem Eagle's Medium mit 15% (v/v) fötalem Kälberserum, 0,1 mM β-Mercaptoethanol und 1000 Einheiten/ml von gereinigtem rE-HLIF isoliert. Es-Zellinien wurden dann durch zwei verschiedene Methoden isoliert.
- In dem ersten Verfahren wurde den Blastocysten erlaubt, an der Kulturschale anzuheften, und etwa 7 Tage später wurden die herauswachsenden inneren Zellmassen gepickt, trypsiniert und in eine andere Kulturschale in die gleichen Kulturmedien überführt. Es-Zellkolonien erschienen 2-3 Wochen später mit zwischen 5-7 individuellen Kolonien, die aus jeder explantierten inneren Zellmasse erschienen. Die Es-Zellinien wurden dann für weitere Analysen expandiert. Das zweite Verfahren zur Isolierung von Es-Zellinien benutzte die Technik der Immunchirurgie (beschrieben in Martin, G. R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-7638), wobei die Trophektodermzellen unter Verwendung von Anti-Maus Antikörpern zerstört werden, bevor die inneren Zellmassen explantiert werden. Die Effizienz einer Isolierung von Es-Zellinien ist in Tabelle 1 gezeigt.
- Alle die Es-Zellinien, die in der Abwesenheit von Fütterzellen, aber in der Anwesenheit von LIF (siehe Schritt 1), kultiviert wurden oder mit der Hilfe von Kulturmedium, welches LIF enthielt, direkt isoliert wurden (siehe Schritt 2), behielten die Fähigkeit, in mehrere Zelltypen nach dem Entfernen von LIF zu differenzieren, womit gezeigt wird, daß diese Zellen ihren pluripotenten Phänotyp behalten hatten. Um deren entwicklungsmäßiges Potential zu bestätigen, wurden D3 Es-Zellen, die in LIF für 7-22 Passagen gehalten wurden, und MBL-1 Es-Zellen, die in LIF für 14-17 Passagen gehalten wurden, durch Blastocysten-Injektion in die embryonale Umgebung zurückgeführt (wie in Williams et al., (1988) Cell 52: 121-131 beschrieben). Blastocysten wurden aus dem nicht zuchtverwandten ICR-Mausstamm oder den durch Inzucht erzeugten C57BL/6 J-Mäusen isoliert. Vor einer Kultur wurden die expandierten Blastocysten in Öltropfen-Kulturen bei 4ºC für 10 min gehalten. Die Es-Zellen wurden durch Picken von individuellen Kolonien präpariert, welche dann in Phosphatgepufferter Saline, 0,5 mM EGTA für 5 min inkubiert wurden; eine Einzelzell-Suspension wurde durch Inkubation in einer Trypsin-EDTA-Lösung, die 1% (v/v) Hühnerserum enthielt, für weitere 5 min bei 4ºC hergestellt. Fünf bis zwanzig Es-Zellen (in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum und 3.000 Einheiten/ml DNAase 1, gepuffert in 20 mM HEPES [pH 8]) wurden in jede Blastocyste injiziert. Blastocysten wurden in scheinträchtige Empfänger transferiert, und es wurde ihnen erlaubt, sich normal zu entwickeln. Chimäre Mäuse wurden durch Hautmarker identifiziert (Hogan et al., (1986) Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor, New York). Eine Analyse der entstandenen chimären Mäuse ergab, daß bis zu etwa 50% der Nachkommen Gewebe enthielten, die von den injizierten Zellen herrührten (Tabelle 2), mit Stufen von offenkundigem Chimärismus von bis zu 90% in individuellen Mäusen. Weiterhin bestätigte eine Analyse der Organe von vier D3-Chimären, daß die in LIF gehaltenen Es-Zellen beträchtlich zu der Entwicklung von allen somatischen Geweben beitragen konnten (Tabelle 3).
- Die männlichen Chimäre wurden durch Paarung mit ICR oder C57BL/6 J Weibchen auf eine Keimbahn-Übertragung von Zellen, die sich von Es-Zellen herleiten, getestet. Drei von vier der D3-C57BL/6 J Chimäre und zwei von sechs der MBL-1- C57BL/6 J Chimäre führten zum Erscheinen von Agouti-Nachkommenschaft, die von den Es-Zellen, die in LIF kultiviert worden waren, herrührte (Tabelle 4).
- Um zu testen, ob genetisch veränderte Es-Zellen in LIF enthaltendem Kulturmedium gehalten werden können, wurden D3 Es-Zellen mit einem Retrovirus-Vektor (N-TK527) infiziert, welcher das Neomycin-Resistenzgen und eine c-src-Genmutante (c-src&sup5;²&sup7;) exprimiert (ein Protokol für eine Infektion ist in Williams et al., (1988) Cell 52: 121-131 beschrieben). Die isolierten ES-Zellklone wurden in LIF enthaltendem Kulturmedium für über 20 Passagen gehalten. Diese genetisch veränderten Es-Zellen behielten das Vermögen, chimäre Mäuse zu bilden, nachdem sie durch Blastocysten-Injektion in die embryonale Umgebung zurückgeführt wurden (Tabelle 2). TABELLE 1: Isolierung von 129 Sv He Es-Zellinien in rE-HLIF enthaltenden Medien.
- Murine Blastocysten wurden aus 129 Sv He Mäusen am Tag 4 der Entwicklung (Tag 1 = "day of plug") in entweder Dulbecco's oder Glasgows modifiziertem Eagle's Medium mit 15% (v/v) fötalem Kälberserum, 0,1 mM β-Mercaptoethanol und 1000 Einheiten/ml von gereinigtem rE-HLIF isoliert. Die Blastocysten wurden dann in die gleichen Medien explantiert und zum Anheften an die Kulturschale stehen gelassen, und die innere Zellmasse wurde gepickt, dissoziiert in Phosphatgepufferter Saline, 0,5 mM EGTA für 5 min. eine Einzelzell-Suspension wurde durch Inkubation in einer Trypsin-EDTA-Lösung, welche 1% (v/v) Hühnerserum enthielt, hergestellt, und die Zellen wurden in dem oben beschriebenen Zellkulturmedium wieder ausplatiert. Die charakteristischen Es-Zellkolonien erschienen innerhalb von 1-3 Wochen.
- Andere Blastocysten wurden durch Immunchirurgie behandelt (wie beschrieben in Martin, G. R. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634-7638). Den Blastocysten wurde erlaubt, sich aus der Zona pelucida zu entwickeln, und wurden dann mit Anti-Maus Antikörpern behandelt und durch den Zusatz von Komplement zerstört. Die exponierte innere Zellmasse wurde dann zum Anheften an eine Kulturschale stehen gelassen und wieder mit Anti-Maus Antikörpern und Komplement behandelt. Innerhalb einiger Tage erschienen pluripotente Stammzell-Kolonien und wurden wie oben beschrieben dissoziiert und trypsiniert. TABELLE 2: Chimäre Mäuse, die von in LIF kultivierten ES- Zellen herstammen. TABELLE 3: Prozentuale Gewebe-Verteilungen in individuellen D3 chimären Mäusen. TABELLE 4: Chimärische, die die Keimbahn-Übertragung von Zellen, die von ES-Zellen herstammen, demonstrieren.
- Das folgende betrifft die Tabellen 2, 3 und 4:
- D3 und MB1-1 Es-Zellen sind von 129 Sv He Mäusen hergeleitet (Inzucht, Agouti, homozygot für das Glucosephosphat- Isomerase 1a-Allel). Die D3 Es-Zellen wurden zuerst auf primären Embryo-Fibroblasten für 10 Passagen kultiviert und dann in 1.000-5.000 Einheiten/ml rekombinantes LIF für 7-22 Passagen transferiert. Die MB1-1 Es-Zellen wurden in der Abwesenheit von Fütterzellen, jedoch in der Anwesenheit von rE-HLIF, isoliert, diese Zellen wurden für 14-17 Passagen kultiviert. Die Es-Zellen wurden dann in ICR (nicht zuchtverwandt, albino) oder C57BL/6 J (Inzucht, schwarz) Blastocysten injiziert, welche anschließend in scheinträchtige Foster- Mütter transferiert wurden. Sowohl die ICR als auch die C57BL/6 J Mäuse sind homozygot für das Glucosephosphat-Isomerase 1b Allel. Chimäre Jungen wurden durch Haut-Pigmentierung identifiziert (nur Foster-Mütter, die trächtig wurden, wurden zum Bewerten der Anzahl der Nachkommenschaft gezählt). Gewebe-Chimärismus wurde unter Verwendung von stammspezifischen Unterschieden der Glucosephosphat-Isomerase abgeschätzt. Das Ausmaß von Gewebe-Chimärismus wurde in zwei D3-ICR (Nummern 1 und 2) und zwei D3-C57BL/6 J Chimären (Nummern 3 und 4) bestimmt. Analysierte Gewebe: C, Haut; B1, Blut; Sp, Milz; P, Pankreas; Li, Leber; T, Thymus; H, Herz; Lu, Lungen; G, Gonaden; K, Nieren; M, Muskel; B, Gehirn; Sa, Speicheldrüse. Männliche Chimäre wurden mit ICR oder C57BL/6J Mäusen gepaart und die Nachkommenschaft durch Haut-Pigmentierung identifiziert.
- Dieses Beispiel legt die Schritte dar, die zur Dokumentierung von spezifischen hochaffinen Rezeptoren auf ES- und EC-Zellen durchgeführt wurden. Die begleitende Fig. 3 zeigt eine Bindung von ¹²&sup5;I-LIF an Es-Zellen EKcs-1 und EC-Zellen F9 und PCC3-A (Jakob, J. et. al. (1973) Ann. Microbiol. Inst. Pasteur, 124B: 269-282). Im Hinblick auf Fig. 3, (A), Scatchard-Analyse von 1251-markiertem LIF, bindend an F9 ( ), EKcs-1 ( ), PCC3A-1 ( ) und M1 (o) Zellen. Sättigungskurven für eine Bindung wurden durch die Scatchard-Methode analysiert, indem die Menge von spezifisch gebundenem LIF (definiert als der Unterschied zwischen beobachteter Bindung in der Abwesenheit und Anwesenheit von überschüssigem unmarkiertem LIF) gegenüber dem Verhältnis von gebundenem zu freiem LIF aufgetragen wurde. Freie LIF-Werte wurden für die Prozentzahl von ¹²&sup5;I-markiertem LIF eingestellt, welche in der Lage ist, spezifisch an LIF-Rezeptoren zu binden, in diesem Experiment als 75% bestimmt. Die offenbare Dissoziationskonstante für die Wechselwirkung von LIF mit seinem Rezeptor wurde aus den Steigungen der Kurven und der Rezeptoranzahl von deren Abschnitten mit der Ordinate bestimmt. Ergebnisse in (A) wurden auf 5 · 10&sup6; Zellen pro Punkt standardisiert, und die Mittelwerte von doppelten Punkten sind gezeigt, und Kurven wurden unter Verwendung des Liganden- Programms angepaßt. (B), Autoradiographie von F9 EC-Zellen, markiert mit ¹²&sup5;I-markiertem LIF. (C), Quantifizierung von Silberkörnern auf F9 EC-Zellen nach Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem LIF.
- Gereinigtes rekombinantes (aus Hefe stammend) humanes LIF (rY-HLIF) wurde an Tyrosin-Resten radioaktiv markiert wie früher beschrieben (Hilton, D. Jet. al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5971-5975), wobei ¹²&sup5;I-LIF mit einer spezifischen Radioaktivität von etwa 1,2 · 10&sup7; cpm/pmol produziert wurde. ¹²&sup5;I-LIF (2 · 10³ - 5 · 10&sup5; cpm) wurde mit 1-4 · 10&sup6; Zielzellen mit oder ohne wenigstens 100-fachem molaren Überschuß von nicht-markiertem LIF in einem Gesamt volumen von 100 ul für 4 Stunden auf Eis inkubiert. Zellassoziiertes und freies ¹²&sup5;I-LIF wurden durch Zentrifugation durch fötales Kälberserum (Nicola, N. A. und Metcalf, (1986) D. J. Cell Physiol. 128 : 160-188) getrennt. Spezifisch zellassoziiertes ¹²&sup5;I-LIF wurde durch kalte Kompetition bestimmt.
- Fig. 3 illustriert die spezifische sättigbare und hochaffine Bindung von ¹²&sup5;I-LIF an die Es-Zellen EKcs-1 und die EC-Zellen PCC3-A und F9. Die Anzahl von LIF-Rezeptoren pro Zelle, abgeleitet von diesen Scatchard-Plots, waren 295, 190 bzw. 330 mit offenbaren Dissoziationskonstanten bei 4ºC von etwa 90 pH. Dies ist mit der M1 Zellinie vergleichbar, eine auf LIF antwortende monocytische Leukämia, welche 50-200 LIF-Rezeptoren/Zelle mit einer offenbaren Dissoziationskonstante von 50-150 pH zeigt. Alle anderen getesteten Es- und EC-Zellen - D3, NG2, PC13 und P19 - banden ähnliche Level von LIF (Daten nicht gezeigt).
- Es wurde auch gefunden, daß die Bindung von ¹²&sup5;I-LIF an M1 Zellen, EKcs-1 und PCC3-A in Kompetition mit unmarkiertem rekombinanten und nativen murinen und humanen LIF, aber nicht mit dem Bereich von anderen Hormonen und Faktoren (einschließlich einigen, die auf embryonale Zellen wirken) steht: Insulin, IGF-I, IGF-II, saurer und basischer FGF, TGF-beta, TNF-alpha, TNF-beta, NGF, PDGF, EGF, IL-1, IL-4, GM-CSF, G- CSF, Multi-CSF und Erythropoietin.
Claims (14)
1. Verfahren zur Isolierung von embryonalen Stammzellen (Es-
Zellen) von nicht-menschlichen tierischen Embryos in vitro,
wobei das Verfahren die Kultivierung der Embryos in einem
Kulturmedium, welches eine wirksame Menge von Leukämie-
Inhibitionsfaktor (LIF) enthält, sowie die Gewinnung der Es-
Zellen von den Embryos umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Embryos in der
Gegenwart von LIF von einem Tag bis zu 20 Wochen kultiviert
werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Embryos von einer bis
zu acht Wochen in der Gegenwart von LIF kultiviert werden.
4. Verfahren zur Erhaltung von tierischen embryonalen
Stammzellen (Es-Zellen) in vitro unter Beibehaltung von deren
pluripotentem Phänotyp, wobei das Verfahren eine Kultivierung
der Zellen in einem Kulturmedium, welches eine wirksame Menge
von Leukämie-Inhibitionsfaktor (LIF) enthält, unter
Bedingungen, die zur Erhaltung der Zellen ausreichend sind, umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das
Kulturmedium frei von Fütterzellen ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die
tierischen Embryos von Mäusen, Vögeln, Schafen, Schweinen,
Rindern, Ziegen oder Fischen und wobei die embryonalen
Stammzellen von Menschen, Mäusen, Vögeln, Schafen, Schweinen,
Rindern, Ziegen oder Fischen stammen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die tierischen Embryos
oder embryonalen Stammzellen von Mäusen stammen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das
Kulturmedium Eagle's Medium oder eine Modifikation oder ein
Äquivalent davon ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das LIF
rekombinantes LIF ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das LIF rekombinantes
humanes oder murines LIF ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das
LIF in Konzentrationen von 10 bis 1.000.000 Einheiten/ml dem
Kulturmedium zugesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das LIF dem
Kulturmedium in einer Konzentration von 100 bis 100.000 Einheiten/ml
zugesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das LIF dem
Kulturmedium in einer Konzentration von 500 bis 10.000 Einheiten/ml
zugesetzt wird.
14. Verfahren zur Herstellung eines nicht-humanen chimären
Tieres, umfassend das Einbringen von Es-Zellen, welche nach
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 isoliert oder
erhalten wurden, in das Tier im embryonalen Stadium vor der
Implantation.
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