JPH02500437A - ヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）を選択的に阻害する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト免疫不全ウィルス（）ＩＩＶ　）を選択約３こ阻害する方法Ｔ細胞および単 球／マクロファージ内でのＨＩＶタンノＸｌｌり質の発現を阻害する方法に関す る。

ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　ＡＩＤＳ 　（１９８６年６月２３〜２５日、パリ）に提出。

バービエリ・エルら（Ｂａｒｂｉｅｒｉ、　Ｌ、ｅｔ　ａｔ、）　、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ　Ｊ。

ハーヒエリ・エルら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　２０３巻、５５頁（１９８２年 ）。

バーンズ・ディ・エム（Ｂａｒｎｅｓ、　Ｄ、Ｍ、）　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　 ２３５巻。

コールタ−ウッド・ニス・ビーら（Ｃｏｌｄｅｒｗｏｏｄ　Ｓ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ 、）。

２５６巻、　２３５６頁（１９８６年）。

コーフィン・ジェイら（Ｃｏｆｆｉｎ、　Ｊ、ａｔ　ａｌ、）　、　５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２３２巻、６９７頁、（１９８６年）。

コールマン・ダブリュ・エイチら（Ｃｏｌｅｍａｎ、　Ｗ、Ｈｏｅｔ　ａｌ　） 　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、　６９６巻、２３９頁、（１９８ ２年）。

コンデ・エフ・ピーら（Ｃｏｎｄｅ、　Ｆ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、　）、　ＦＥ ＭＳ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ、　４巻、３４９頁、（１９ ７８年）。

クロウ・ニス・ミルズ・ジェイおよびマツフグラス・エム・ニス（Ｃｒｏｗｅ、 　Ｓ、、　Ｍｉｌｌｓ、　Ｊ、、　ａｎｄ　ＭｃＧｒａｔｈ　Ｍ、Ｓ、）　、　 ＡＩＤＳＲｅｓ、　ａｎｄ　）ｌｕｍａｎ　Ｐｅｔｒｏｖｉｒｕｓ、　１３巻、 １３５頁（１９８７年）。

ダルグリーシｓ”エイ・ジーら（Ｄａｌｇｌｉｅｓｈ、　Ａ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ　 ）　。

Ｎａｔｕｒｅ、　３１２巻、７６３頁（１９８４年）。

エントウ・ワイら（ＩＩ：ｎｄｏ　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　 Ｃｈｅｗ、　２５７巻、　９０５４頁（１９８２年）。

エンドウーワイら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６２巻、　５９０８頁（１ ９８７年）。

フェイー・ジェイーｘル（Ｆａｈｅｙ　Ｊ、Ｌ、）　、　Ａｍ　Ｊ　Ｍｅｄ、　 ７６巻。

９５頁（１９８４年）。

フアラスカ・エイら（Ｆａｌａｓｃａ　Ａ、ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ　Ｊ、　２０７巻、５０５頁（１９８２年）。

ファーナンデーープエンティス・シー（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｕｅｎｔｅｓ。

Ｃ，）　、　Ｍｏｌ　［：ｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５０巻、１８５頁（１９ ８３年）。

ファーナンデーーブエンティス・シーら、　Ｃｅ１ｌ、　２０巻、７６９頁（１ ９８０年）。

ボアートマシ・エルら（Ｆｏａ−Ｔｏｍａｓｉ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ａ ｒｃｈＶｉｒｏｌ、　７１巻、３２３頁（１９８２年）。

ヨーク、４３７頁（１９８５年）。

ファウンーｘス・ケイーｘイチら（Ｆｏｕｎｇ、　Ｓ、に、）Ｉ、　ｅｔ　ａｌ ）　。

Ｈｕｍａｎ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ、イー、ジー。

イングルマンら（Ｅ、Ｇ、　Ｅｎｇｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ　）編集、　Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨーク、４３７頁（１９８５年）。

ガードナー−ｘｘ　（Ｇａｒｔｎｅｒ　Ｓ、）　、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３３巻 、２１５頁（１９８６年ａ）。

ガードナー・ニスら、　、ＪＡＭＡ、　２５６巻、　２３６５頁（１９８６年ｂ ）。

ガスバニーカンバニ・エイ　（Ｇａｓｐａｎｉ−Ｃａｍｐａｎｉ、　Ａ、）　、 　ＢｉｏｃｈｅｍＪ、、　１８６巻、４３９頁（１９８０年）。

グー・ケイ・ウェイら（Ｇｕ、　Ｚｉ−ｗｅｉ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ａｃｔａ　 ＣｈｅｍｉｃａＳｉｎｉｃａ、　４３巻、９４３頁（１９８４年）。

グラ−ソーニスら（Ｇｒａｓｓｏ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ）　、Ｐｈｙｔｏｐａｔ ｈｏｌｏｇｙ。

６８巻、１９９頁（１９７８年）。

ホー・ディ”ディら（Ｈａ、　Ｄ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｊ　Ｃ１１ｎ、Ｉ ｎｖｅｓｔ。

７７巻、　１７１２頁（１９８６年）。

ホフマン・エイ・ディら（Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ａ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ）　、　Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ。

１４７巻、３２６頁（１９８５年）。

ホワン争ワイーｘヌ（Ｈｗａｎｇ、　Ｙ、Ｎ、）　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊ　Ｉｎｔ ｅｇｒａｔｅｄＴｒａｄ　ａｎｄ％１ｉｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　７ 巻、１５４頁＜１９８７年）。

アービンージエイ・ディ（Ｉｒｖｉｎ、　Ｊ、Ｄ、）　、　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　 Ｂｉｏｃｈｅｎ＋Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１６９巻、５２２頁（１９７５年）。

アービン・ジエイ・ディら、　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ。

２００（２）巻、４１８頁（１９８０年）。

アービン・ジェイ・ディら、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｈｅｒ、　２１巻、３７ １頁（１９８３年）。

ヒメネイーｘイら（Ｊｉｍｅｎｅｚ、　Ａ、ｅｔ　ａｔ）　、Ａｎｔ　Ａｇｅｎ ｔ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ。

３巻、７２９頁（１９７３年）。

ケネディ”アール・シイら（Ｋａｎｎｅｄｙ、　Ｒ１Ｃ１ｅｔ　ａｌ）　、　５ ｃｉｅｎｃｅ。

２３１巻、　１５５６頁（１９８６年）。

ケーハン・パンら（Ｋｅｚｈａｎ、　Ｐａｎ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｓｕｐｐｌｅ ｍｅｎｔ　ｏｆＰｒｏｃ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ−Ｊａｐａｎ　Ｂ１１ａｔｅｒａｌ 　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｗｕｘｉ。

Ｃｈｉｎａ　（１９８５年５月）。

タラッツマン・ディら（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ　）　、　５ ｃｉｅｎｃｅ。

２２５巻、５９頁（１９８４年ａ）。

タラッツマン・ディら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２巻、７６７頁（１９８４年ｂ ）。

ケーニッヒ・ニスら（Ｋｏｅｎｉｇ、　Ｓ、ｅｔ　ａｌ）　、　５ｃｉｅｎｃｅ 、　２３３巻、１０８９頁（１９８６年）。

フォーフェン・シイら（Ｋｕｏ−Ｆｅｎ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｏｂｓ　 ａｎｄＧｙｎ、５９（４）巻、４９４頁（１９８２年）。

ロー・エル・ケイら（Ｌａｗ、　Ｌ、に、　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｊ　Ｒｅｐｒ ｏｄ　Ｆｅｒｔ。

６９巻、５９７頁（１９８３年）。

リフリン・ジエイ・ディら（Ｌｉｆｓｏｎ、　Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）　、　５ ｃｉｅｎｃｅ。

２３２巻、　１１２３頁（１９８６年ａ）。

リフリン・ジェイ・ディら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２３巻、７２５頁（１９８６ 年ｂ）。

リフリン・ジエイ・ディ、　Ｊ　ＥＸＩ）０Ｍｅｄ、　１６４巻、　２１０１頁 （１９８６年Ｃ）。

リン・ジェイ・シイら（Ｌｉｎ、　Ｊ、Ｙ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ。

３０巻、　２４３１頁（１９７０年）。

リン・ジェイ・シイら、　Ｔｏｘｉｃｏｎ、　１６巻、６５３頁（１９７８年） 。

マトン・ジェイ・ビー（Ｍａｄｄｏｎ、　Ｊ、Ｐ、）　、　Ｃｅ１ｌ、　４７巻 、３３３頁（１９８６年）。

マラガノ・ジェイーｘムら（Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ、　ＪｏＭ、　ｅｔ　ａｌ） 　。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６２巻、　１１６２８頁（１９８７年）。

マクトウーガル・ジェイ・ニス（ＭｃＤｏｕｇａｌ、　Ｊ、Ｓ、）　、　５ｃｉ ｅｎｃｅ。

２３１巻、３８２頁（１９８５年ａ）。

マクドゥーガＪＬ／−ジェイーｘスら、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３５巻、　 ３１５１頁（１９８５年ｂ）。

マクドゥーガＪＬ、−ジェイ・ニスら、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７巻、　 ２９３７頁（１９８６年）。

オールスンズ０ニスら（Ｏｌｓｎｅｓ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒＡｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｘｉｎｓ　ａｎｄ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　５１ −１０５頁、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム＜１９８２年）。

オールスンズーｘス、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２８巻、４７４頁（１９８７年）。

オールスフ・ビー・エイチら（Ｏｌｓｏｎ、　Ｂ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ　）　、米国 特許第３．１０４．２０８号（１９６３年）。

オールスフ・ビー・エイチら、米国特許第３．２３０．１５３号（１９６６年） 。

オールスフ・ビーーｘイチら、　Ａｐｐ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　１３（３）巻、 ３１４頁（１９６５年ａ）。

オールスフ　−ヒ−−ｘイチら、　Ａｐｐ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　１３（３）巻 、３２２頁＜１９６５年ｂ）。

ポポウビッチーｘムら（Ｐｏｐｏｖｉｃ、　Ｍ、ｅｔ　ａｌ　）　、　５ｃｉｅ ｎｃｅ。

２２４巻、４９７頁（１９８４年）。

ロバーツ・グブリュ”ケイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、％ｌｉ、に、）　、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ。

１８巻、　２６１５頁（１９７９年）。

ロドリゲス・アールら（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ、　１０８　（１）巻、３１ ５頁（１９８２年）。

サークｏ−シイら（Ｓａｃｒｏ、　Ｇ、ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃ ｈｅｍ、　２５８巻、　５８１１頁（１９８３年）。

サルペット・イー（Ｓａｌｖｅｄｔ、　Ｅ）　、　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ　Ａｃｔａ。

４５１巻、５３６頁（１９７６年）。

サーンガドハラン・エム・ジーら（Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、　Ｍ、Ｇ、ｅｔ ａｌ）　、　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　［フィールズ・ビー ・エフら（Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｂ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ）編集コ、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒ ｅｓｓ、＝ｓ−ヨーク（１９８６年）６８１〜７０７頁。

シンドラ−・ディ・ジーら（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ、　Ｄ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ　）　 。

Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　４巻、　１０９７頁（１９７７年）。

ソドロスキー・ジェイら（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｎａ ｔｕｒｅ。

３２２巻、４７０頁（１９８６年）。

スプリフィコ・エフら（Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ、　Ｆ、ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｉｎ ｔ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ、　５（４）巻、３３５頁（１９８３年）。

スタイカー・エイチ・ゼットら（Ｓｔｅｉｃｈｅｒ、　Ｈ，Ｚ、　ｅｔ　ａｌ） 　。

ＪＡＭＡ、　２５６巻、　２３９０頁（１９８６年）。

スターベーｘフら（Ｓｔｉｒｐｅ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　 Ｃｈｅｍ。

２５５巻、　６９４７頁（１９８０年）。

スターペ−ｘ７ら（Ｓｔｉｒｐｅ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 　Ｊ、　１９５巻、３９９頁（１９８１年）。

ワン０ニーら（Ｗａｎｇ、　Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｉｎｔ　Ｓｙｍｐｏｓｉ ｕｍ　ｏｎ　ＯｒｇＣｈｅｍ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ、上湯、中国（１９８５年１１月）。

クスジャン・ゼットら（Ｘｕｅｊａｎ、　Ｚ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｎａｔｕｒ ｅ、　３２１巻、４７７頁（１９８６年）。

ヤロハン°アールら（Ｙａｒｏｃｈａｎ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ）　、　Ｌａｎｃｅ ｔ、　ｉ　：５７５頁（１９８６年）。

ヤロハン・アールら、　Ｌａｎｃｅｔ、　ｉ　：　１３２頁（１９８７年）。

３、背景 ヒト免疫不全ウィルス（旧ν）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）とあるス ペクトルの関連疾患との病原体であるレトロウィルスである（コーフィン）。こ のウィルスは、非経口の伝染および／または性的接触によって伝染する。現在、 米国では約２００万人のヒトが旧Ｖに感染していると推定され。

現在の予想では、現在感染しているヒトの大多数が、今後７〜１０年間に、エイ ズまたは顕著に臨床的な旧Ｖ関連疾患を発病するとされている（バーンズ）。

ＨＩＶは、細胞表面分化抗原ＣＤ４　（Ｔ４．　ｌｅｕ　３　）を発現する細胞 に対して親和性でかつ細胞変性効果を有する。このウィルスの向性は、　ＣＩ） ４と、　ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質との相互作用が原因であると考えら れる。これらの相互作用は。

旧νが、感染しやすい細胞に感染する過程で行われ、しかもＨＩＶがＴ細胞に細 胞融合を誘発する機序の基礎になっているようである（リフワン、　１９８６年 ａおよび１９８６年ｂ：ダりグリーシュ；クラッッマン、　１９８４年ａおよび １９８４年ｂ；マりン：マクトウーガル、　１９８５年ａおよび１９８５年ｂ： ソりドロスキー）。

この細胞融合の過程は、細胞死に至る場合があるが、一方では、エイズを特徴づ け、かっ旧Ｖが誘発された免疫無防備状態とその２次的効果９日和見感染症およ び新生物に寄与する因子であるＣＤ４細胞の進行性排除に寄与している（フエイ ー）。

ヒト免疫不全ウィルス（）ＩＩＶ　’）の宿主細胞の範囲には、　ＣＤ４＋Ｔ細 胞に加えて、単核食細胞系の細胞が含まれ、この細胞系には、末梢血液単球９組 織マクロファージ（スタイカー）。

皮膚のランゲルハンス細胞およびリンパ節内の樹脂状細網細胞（アームストロン グ）が含まれる。単核食細胞は、中枢神経系内の旧Ｖ感染症の主要な標的細胞で ある（ケーニッヒ；ガードナー、　１９８６年ｂ）。マクロファージ系の細胞は 、生体内のウィルスの主要な貯蔵庫であり、単独またはＴ細胞との相互作用によ って、エイズと、関連の臨床疾患の発病に寄与しているようである（クロウ）。

この発明を裏付けるために行った実験は、　ＩＩＩＶに感染した個体由来の単球 ／マクロファージの大部分が、　ＨＩＶ抗原を発現することができ、マクロファ ージ前駆体が広範囲に感染していることを示唆している。

また、　）ＩＩＶ表面抗原を発現するマクロファージが、　ＣＤ４　＋Ｔ細胞と 相互に作用して融合し十字形のＴ細胞が破壊するに至る証拠もある（クロウ）。

ＨＩＶに感染した個体の重い臨床症状の進行を阻害できる治療法を開発する努力 が強力に進められている。これらの努力は、大部分が、このウィルスの逆転写酵 素を阻害する。ヌクレオシド類の医薬の使用に集中している（ヤロハン、　１９ ８６年。

１９８７年；ブローグー、　１９８５年、　１９８７年）。逆転写酵素は、初期 のウィルス感染に必要なので、上記の医薬が、Ｔ細胞や単球／マクロファージの ような細胞が新たにウィルス感染するのを選択的に阻害すると期待されている。

しかし、一旦ウィルスが細胞に感染して、ウィルスの複製が宿主細胞の酵素を用 いて行われると、逆転写酵素阻害剤は、ウィルスの複製と宿主細胞表面へのウィ ルス抗原の発現とに対する阻害効果が制限されると予想される。生体外の研究に よって、長期間の培養物に、ヌクレオシド類を連続して存在させても、　ＨＩＶ が複製することが証明されている。いくらかの有利な臨床効果の徴候が観察され たが、初期の臨床試験結果では、これらの医薬が、　ＨＩＶ感染症が後の段階で 重い臨床疾患に進行するのに対して有効であるという証拠がほとんど得られなか った。

４、発明の要約 この発明の一般的な目的は、　ＩＩＩＶの複製、および旧Ｖが感染したヒ）Ｔ細 胞と単核食細胞系細胞の増殖を選択的に阻害する方法を提供するにある。

この発明の関連する目的は、ｌｌ’ｌＶの感染した細胞に旧Ｖ抗原が発現するの を阻害する方法を提供することにある。

他の関連する目的は、単核食細胞系細胞に旧Ｖ抗原が発現するのを選択的に阻害 する方法を提供するにある。

この発明のさらに他の目的は、ヒトの旧Ｖ感染症の治療法を提供するにある。

）１１Ｖの感染したＴ細胞と単球／マクロファージとにおけるウィルスの発現と 細胞増殖とが、二つの植物タンパク質のトリコサンチン（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔ ｈｉｎ、　ＴＣＳ）とモモルカリン（ｍｏｍｏｒｃｈａｒ　ｉｎ。

ＭＭＣ）によって選択的に阻害されるという発見が、上記の先に出願された特許 願“旧Ｖの阻害法”に記載されている。この発見の重要な点は、［Ｖの感染した 細胞内でのウィルスの阻害が、未感染の細胞に対して実質的に非毒性の濃度のＴ ＣＳもしくはＭＭＣによって達成することができるという知見であった。この選 択的な効果は、　ＴＣＳもしくはＭＭＣに数日間暴露した場合、　ＨＩＶに感染 した細胞に関するウィルス抗原と、測定可能な逆転写酵素活性とが著しく減少す るが、未感染細胞内の非ウィルスタンパク質の発現が有意に減少しないというこ とから明らかである。ＴＣＳとＭＭＣの選択的な阻害効果について観察される別 の効果は、未感染細胞の生存率が有意には減少しないＭＭＣもしくはＴＣＳの濃 度で、　ＨＩＶに感染した細胞の細胞生存率がかなり低下することである。一般 に、上記の選択的阻害効果は、　ＴＣＳもしくはＭＭＣの約０．０１〜３．０μ ｇ／ｄの濃度でみとめられる。

先に出願された特許願で検討したように、　ＴＣＳとＭＭＣの選択的阻害効果は 、これらのタンパク質の提示されたリポソーム阻害活性に関連するものである。

ＭＭＣは、細胞の存在しない系内でのタンパク質合成の強力な阻害剤であり（バ ービエリ、　１９８２年）、そしてＴＣＳが、リシン（ｒｉｃｉｎ　）　、およ びＮ−グリコシダーゼ活性を有しかつリポソームＲＮＡ　ｂＲＮＡ）内の一つ以 上の選択された部位でグリコシドを開裂させることによってリポソームを失活さ せると報告されている種々の単一連鎖の植物タンパク質もしくは糖タンパク質と 、類似のリポソームを失活させる性質を有するということは、　ＴＣＳとりシン （ｒｉｃｉｎ　）のＡ鎖とにアミノ酸の相同が観察されることから推測された。

ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ　）　、アメリカヤマゴボウの抗ウイルスタンパク質 の色々の種、α−サルシン（α−５ａｒｃｉｎ）　、レストリフトシン（ｒｅｓ ｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）　、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）およびリシンＡ 鎖を含むリポソーム失活化活性を有する広範囲の単一連鎖のタンパク質も、　Ｈ ＩＶに感染したＴ細胞でのウィルスの発現を選択的に阻害することが見出された のである。

またこの選択的阻害効果は、　）ＩＴＬＶ−Ｉウィルスすなわち同族ではあるが 明確なヒトレトロウィルスに感染したＴ細胞に対しては選択的な阻害性を欠いて いることから明らかなように。

ウィルス特異性であることが見出された。

ＨＩＶに感染した細胞に対する選択的阻害効果は９次のことによって証明するこ とができる。即ち、　（ａ）ＴＣＳとＭＭＣによって、旧Ｖに感染した単核食細 胞系細胞へのウィルス抗原の発現の選択的阻害：（ｂ）処理された未感染Ｔ細胞 のタンパク質とＤＮＡの合成レベルを比較して測定した場合の、細胞増殖の選択 的阻害：および（Ｃ）　Ｔ細胞の生存率の選択的低下である。これらの阻害効果 は、Ｔ細胞に対して、いくつもの代表的な単一連鎖もしくはＡ鎮の、植物と真菌 類のリポソーム失活性タンパク質（ｓｃＲＩＰ類）に観察された。

さらに、　ＨＩＶに感染したＴ細胞に対する選択的阻害効果は。

選択された５ｃＲＩＰの濃度で、　ｓｃＲ［Ｐに、細胞を連続的に暴露するか、 または例えば３０〜１２０分間、短期間すなわちパルスで暴露させることによっ て得られることが見出された。パルス暴露法では、　５ｃＲＩＰの濃度と暴露の 時間は９選択することによって未感染細胞に対して明確な阻害なしで、　ＨＩＶ に感染したＴ細胞のほとんど完全な阻害を行うことができる。

一つの態様としてこの発明の方法には、細胞内のウィルス抗原の発現が実質的に 減少するのに有効な、暴露濃度と暴露期間で、単一連鎖のリポソーム失活性タン パク質（ｓｃＲＩＰ　）に、　ＨＩＶに感染したＴ細胞を暴露する方法が含まれ る。単核食細胞系細胞の場合、　ＭＭＣもしくはＴＣＳの阻害効果は、ウィルス 抗原の発現に対しては選択的であり、　５ｃＲＩＰ投与量／暴露時間を選択する ことによって、　ＨＩＶに感染した細胞内の細胞タンパク質の合成の阻害が実質 的に少ない状態で、　ＨＩＶに感染した細胞内のウィルスタンパク質の発現を阻 害することができる。一方、　５ｃＲＩＰ類は、　ＨＩＶに感染したＴ細胞の細 胞選択することによって２例えば旧Ｖに感染した細胞の細胞生存率の選択的低下 または該細胞のチミジン取込みの阻害を測定して比較し、未感染Ｔ細胞のこれら パラメータを有意に阻害することなく、ＨＩＶ感染Ｔ細胞の細胞増殖を阻害する ことができる。一般に、細胞が暴露される抗−旧Ｖタンパク質の濃度は、約０． ０１〜１μｇ／ｍＡである。

感染Ｔ細胞における旧Ｖ抗原発現を阻害する。　５ｃＲＩＰ類の性質は、この発 明の他の態様によって、ヒトの旧Ｖ感染症の治療に活用される。この方法には、 　ＨＩＶ感染症の下記指標の少なくとも一つを測定可能な程度に減少させるのに 有効な投与量で、患者に、単一鎖のリポソーム失活性タンパク質を投与する方法 が含まれる。旧Ｖ感染症の指標は次のとおりである。

（ａ）ＨＩ　Ｖ感染子細胞に関連する旧Ｖ抗原の濃度。

（ハ）血流中の旧Ｖ抗原の濃度。

（Ｃ）ＨＩ　Ｖ感染子細胞に関連する逆転写酵素活性。

（ｄ）旧Ｖ感染Ｔ細胞の生存率と未感染Ｔ細胞の生存率との比率、および （ｅ）ＭＭＣもしくはＴＣＳの場合の旧ソ感染単核食細胞系細胞における９選択 された旧Ｖ抗原と選択された細胞抗原との比率である。

指標の減少は、タンパク質の投与後１〜５日以内に測定できることが好ましい。

上記の方法には、さらにまた、前記指標の少なくとも一つが減少するのを測定し 、　ＨＩＶ感染症の測定された指標がもはや減少しないことを示すまでタンパク 質の投与を繰返す方法が含まれる。

好ましい５ｃＲＩＰ類には、トリコサンチン、モモルカリン。

アメリカヤマゴボウの抗ウイルスタンパク質、α−サルシン。

ミトギリンおよびレストリフトシンのような植物または真菌類由来の５ｃＲＩＰ 類が含まれる。

この発明の上記およびその外の目的と特徴は、この発明の下記の詳細な説明を添 付図面とともに読むことによって一層明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 第１Ａ図−第１Ｃ図は、トリコサンチンの分離の際に得られたクロマトグラフィ の溶融曲線を示す。

第２Ａ図−第２Ｃ図は、αモモルカリンとβモモルカリンの分離の際に得られた クロマトグラフィの溶融曲線を示す。

第３Ａ図−第３Ｈ図は、　（等分目盛の）細胞フルオログラフのプロットであり 、対照の（非特異性）抗体またはヒト抗）１１Ｖ抗体と反応させたＴ細胞をそれ ぞれ、フルオレセインでａ識した抗ヒト抗体で追跡して左側と右側の座標に示し 、未感染のＴ細胞については３八図と３Ｂ図に、　）ＩＩＶ感染Ｔ細胞について は３０図と３Ｄ図に、　１０μｇ／ｍ１のＴＣＳに１６日間暴露後の未感染Ｔ細 胞もしくは旧Ｖ感染Ｔ細胞については、それぞれ３Ｂ図と３Ｆ図におよび１０μ ｇ／−のＭＭＣに１６日間暴露後の未感染Ｔ細胞もしくは旧Ｖ感染Ｔ細胞につい てはそれぞれ３Ｇ図と３Ｈ図に示す。

第４図は、　ＴＣＳの濃度（白および黒の四角印）およびＭＭＣの濃度（三角形 印）の関数として、　ＨＩＶ感染Ｔ細胞でのｐ２４）１１Ｖ抗原発現の阻害百分 率を示す。

第５図は、ＰＡＰ−Ｉの濃度（白の四角形印）　、　ＰＡＰ−ＩＩの濃度（三角 形印）およびＰＡＰ−３の濃度（黒の四角形印）の関数として、　ＨＩＶ感染Ｔ 細胞でのｐ２４旧ν抗原発現の阻害百分率を示す。

第６図は、ミトギリンの濃度（白の四角印）、レストリフトシンの濃度（三角形 印）およびα−サルシンの濃度（黒の四角印）の関数として、　ＨＩＶ感染Ｔ細 胞でのｐ２４　ＨＩＶ抗原発現の阻害百分率を示す。

第７図は、　ＴＣＳとＭＭＣで処理された感染細胞での旧Ｖの複製を減少を示し 、このことはＴＣＳ　（黒の菱形印）またはＭＭＣ（白の四角印）を添加して５ 日後に取出した培養物の上澄液中に検出できた粒子結合逆転写酵素の濃度が減少 していることから明らかである。また、黒の四角印は、未感染細胞がＲＴ活性を 欠いていることを示している。

第８Ａ図と８Ｂ図は、マウス抗ｐ２４抗体、およびフルオレセインで標識した抗 マウス抗体でＬＪｋした後の、パーミアビライズされた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉ ｚｅｄ　）未感染単球／マクロファージ（８Ａ図）および旧ソ感染単球／マクロ ファージ（８Ｂ図）の細胞フルオログラフを示す。

第９図は、二つのドナーそれぞれ由来の正常なマクロファージ（白丸印と白三角 印）中の、生体外で旧Ｖに感染した時以後の時間の関数としての９発現したウィ ルスル２４抗原を含ムマクロファージの百分率（バーミアビライズされた蛍光分 析法によって検出可能）の増加と、同期間中の細胞（黒丸印と黒三角印）に起こ る細胞生存率の変化とを示す。

第１０Ａ〜ＩＯＤ図は、未感染の単球／マクロファージ（１０Ａ図）と旧Ｖ感染 の単球／マクロファージ（１０８図）の細胞フルオログラフ、および第８図の場 合と同様にして、ｐ２４ウィルス抗原の存在を検定する４日前に、５μｇ／ｍｆ のＴＣＳ　（ＩＯＣ図）もしくは５μｇ／−のＭＭＣｃｌｏＤ図）で処理した感 染マクロファージの細胞フルオログラフである。

第１１図は、　）ＩＩＶに感染した患者から単離した単球／マクロファージを培 地に入れた後１０日間の旧Ｖ　ｐ２４抗原の発現の増加を示すグラフ（白画角印 ）、および細胞をまず培地に入れて０．３μｇ／ｍｊ２のＴＣＳに暴露した場合 （黒丸印）またはＴＣＳ　（０，３μｇ／ｍｆ）を培地に４日後に添加した場合 （黒画角印、この場合は培養細胞の大部分にすでにｐ２４抗原が発現している） のｐ２４２４抗原害を示すグラフである。

第１２図は、検出可能なレベルの旧Ｖ　ｐ２４抗原（バーミアビライズ蛍光分析 法によって検出可能）を有するＨＩＶ感染単球／マクロファージ細胞の変化百分 率を示すグラフであり、感染培地を、５μｇ／ｍｆのＴＣＳ　（黒三角印）もし くは５μｇ／ｍｌのＭＭＣ（白丸印）で処理し、または全く薬剤処理しない（黒 丸印）で、ゼロ、２４および９６時間後に測定したものである。

第１３図は、旧Ｖ　ｐ２４抗原を検出可能なレベルで含有する旧ソ感染単球／マ クロファージの変化百分率を示すグラフであり。

ＴＣＳ　（白三角印）もしくはＭＭＣ（白丸印）のゼロ、０．５もしくは５μｇ ／−に暴露して４日後に、第８図の場合と同様にして測定した。

第１４図は、ゼＤ、　０．００５．０．０５．０．５および５．ｔｚｇ／ｍｌ！ のＭＭＣに暴露して４日後の、未処理細胞（１００％）に対するｐ２４２４抗原 の百分率を示す（三角印）。

第１５図は、細胞増殖の阻害の程度を、　Ｈｒｖ感染Ｔ細胞（Ｈ９゜ＨＩＶ　） と未感染細胞（Ｈ９）中の細胞ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込みの百分率で測定 して、　ＴＣ３Ｃ１０関数として示す。

第１６Ａ図と１６Ｂ図は、細胞増殖の阻害の程度を、　）ＩＩＶ感染Ｔ細胞（） １９．１（ＩＶ　）と未感染細胞（Ｈ９）中の細胞ＤＮＡ　（７）３Ｈ−チミジ ンの取込みの百分率で測定して、ＴＣＳ（第１６Ａ図）もしくはＭＭＣ（第１６ Ｂ図）の２μｇ／ｍｌに暴露した時間の関数として示す。

第１７Ａ図と１７Ｂ図は、旧ν感染Ｔ細胞（ＦＩ９．　）ＩＩＶ　）　ト未感染 Ｔ細胞（Ｈ９）を同様に接種した培地を、種々の濃度のＴＣＳの存在下で２日間 （第１７Ａ図）または５日間（第１７Ｂ図）培養したものの、生育力のある細胞 の絶対計数値を示すグラフであり、　第１７Ｃ図は、同様に接種した培地を種々 の濃度のＴＣＳで処理して２日後に存在する生育力のある細胞の百分率を示す。

第１８Ａ図と第１８Ｂ図は、　ＨＩＶ感染Ｔ細胞（Ｈ９，ＨＩＶ　）と未感染Ｔ 細胞（Ｈ９）を増大する濃度のＰＡＰ−Ｉに暴露した場合の細胞増殖を阻害する 百分率を示し、細胞ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取込みの阻害（第１８Ａ図）お よび細胞タンパク質への３Ｈ−ロイシンの取込みの阻害（ｉｌＢＢ図）で示す。

第１９図は、細胞増殖を阻害する程度を示し、旧ν感染Ｔ細胞（）１９．）ＩＩ Ｖ　）　ト未感染Ｔ！胞（）１９）　（ｌｌ胞ＤＮＡ　ヘア７）’）ｌ−チミジ ンの取込み百分率をＰＡＰ−ＩＩの濃度の関数として示す。

第２０図は、細胞増殖を阻害する程度を示し、　）ＩＩＶ感染Ｔ細胞（）１９． 　ＨＩＶ　）　ト未感染Ｔ細胞（Ｈ９）　（Ｄ細胞ＤＮＡ　ヘノ３Ｈ−チミジン 取込み百分率をミトギリンの濃度の関数として示す。

第２１図は、細胞増殖を阻害する程度を示し、旧ν感染Ｔ細胞（Ｈ９，旧ν）と 未感染細胞（Ｈ９）の細胞ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取込み百分率をレスｌ− ＩＪタクトンの濃度の関数として示す。

第２２図は、細胞増殖を阻害する程度を示し、　）ＩＩＶ感染Ｔ細胞（）１９． 　ＨＩＶ　）　ト未感染細胞（Ｈ９）　（７）細胞ＤＮＡヘノｓＨ−チミジン取 込み百分率をα−サルシン濃度の関数として示す。

第２３Ａ図〜２３Ｃ図は、細胞増殖を阻害する程度を示すもので、　Ｉ（ＴＬＶ −Ｉ感染Ｔ細胞（白画角印）と未感染Ｔ細胞（黒画角印）の細胞ＤＮＡへの３Ｈ −チミジン取込み百分率を、ＴＣＳ（第２３Ａ図）、ＭＭＣ（第２３Ｂ図）およ びミトギリン（第２３Ｃ図）の濃度を増大させて測定して示す。

（以下余白） 発明の詳細な説明 下記の用語は、特に指示がなければ１本明細書では以下のことを意味する。

１、“旧Ｖ”は、　ＣＤＪ＋依存性（Ｔ４．　］ｅｕ３−依存性）ヒト免疫不全 レトロウィルスを意味し９例えば旧Ｖ−１とその公知の変異体が挙げられる。

２、“単核食細胞系細胞”は、　［：Ｄ４＋単核食細胞を意味し。

これには、　ＣＤＡ＋末梢血液単球、腹膜マクロファージ、皮膚のランゲルハン ス細胞、リンパ節の樹枝状細網細胞、肺胞マクロファージ、肝臓のタッパ−細胞 および単球／マクロファージ細胞が含まれる。

３、“単球／マクロファージ細胞”は、末梢血液中に存在する単核食細胞系細胞 で、血液マクロファージの前駆体である。この細胞は、末梢血液またはヒ）Ｒ臓 バイオブシイから得られ、細胞培養法で培養される。

４、“Ｔ細胞は、　ＨＩＶ感染症に感染しやすい形質転換Ｔ　ＩＪンパ球系、ま たは−次の末梢血液単核細胞プリバレージョン由来の旧Ｖに感染しゃすいＴ細胞 を意味する。

５、　’　ＨＩＶ感染細胞は、　ＨＩＶに感染した。Ｔ細胞および／または単核 食細胞系細胞を意味する。

６、“未感染細胞″は、　ＨＩＶに感染していないＴ細胞および／または単核食 細胞系細胞を意味する。

７、“単一連鎖リポソーム失活化タンパク質（ｓｃＲＩＰ　）”は、下記の第■ 節で述べる。真核リポソームＲＮＡの１部位特異的な酵素失活化反応によって、 細胞の存在しないタンパク質合成系においてタンパク質合成を阻害できる単一連 鎖のタンパク質もしくはペプチドを意味する。

Ｉｌ、　ＨＩＶ抗原の発現の選択的阻害この節では、　ＨＩＶ感染ヒト細胞にお ける旧ν抗原の発現の。

５ｃＲＩＰによる選択的阻害のパラメータについて考察する。具体的に記載され ているヒト細胞はＴ細胞であり、この細胞の生体外での破壊は、進行した臨床器 Ｖ感染症での免疫機能の低下に関連があり、上記定義の単核食細胞系細胞の１種 である単球／マクロファージは、感染した個体内にウィルスの貯蔵庫を提供する ようであるが、　ＨＩＶタンパク質を発現すると。

Ｔ細胞と融合して破壊することができる。またこの単球／マクロファージは、感 染を広げる働きがあり、特に神経系内に広げる（ケーニッヒ）。

正常なヒ）　Ｔ　ＩＪンバ球は、末梢血液もしくはリンパ球の充実性組織から標 準の方法で調製することができる（ファウン）。

この細胞には、所望により、　ＣＤ４＋表面抗原に対して特異的な親和性法によ って単離できるＣＤ４＋細胞の両分が含まれる。

通常、　ＣＤ４＋細胞と非ＣＤ４＋細胞の混合物が用いられる。この細胞は、ウ シ胎児血清とインターロイキン−２を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地のような 標準細胞培地内で、　ＰＨＡのような公知のリンパ球マイトジェンを用いて活性 化することによって。

培地中に、数日間〜数週間保持される。この培養されたＴ　０７３球は１例えば エイズ患者由来のＨＩＶ単離物を用いて、生体外で旧Ｖに感染させることができ る。

さらに、一般に、リンパ球の悪性疾患の患者の由来の連続Ｔ細胞も利用できる。

この細胞は、熱で失活化されたウシ胎児血清を補充したＲＰＭ１１６４０のよう な標準細胞培地に保持することができる。

）１１Ｖ感染Ｔ細胞の一つの特徴は、　ＨＩＶエンベロープタンパク質の出現で あり、特に、大きなエンベロープタンパク質のｇｐ１２０とｇｐ４１の、感染細 胞の表面への出現である。上記のように、　ｇｐ１２０は、　ＣＤＪ＋リンパ球 を認識して次いでこれらリンパ球を破壊するのに決定的な働きをするようである 。またｇＰ４１は、　１（ＩＶエンベロープが仲介する細胞融合反応に参画する （ケネディ）。それ故、これらのウィルス抗原の発現を阻害する５ｃＲＩＰの性 能は、タンパク質が、Ｔ細胞の破壊に至るウィルスに仲介されたプロセスを阻害 しかつエイズのよう？、（ＨＩＶ関連疾患に見られる免疫機能の低下を阻止する 性能の重要な指標である。しかしその例証された抗ウイルス性はこの機作による 作風に限定されるものではない。

ＨＩＶ抗原（ｇｐ１２０とｇｐ４１を含む）の感染Ｔ細胞の表面への発現に対す るＴＣＳとα−ＭＭＣの効果は、実施例３で詳細に研究した。連続的にＴＣＳと ＭＭＣに暴露した場合の旧Ｖ抗原の発現に対する効果を第３図に示す。旧Ｖ感染 Ｔ細胞（）１９細胞系）は、１０μｇ／ｍｌのＴＣＳまたはα−ＭＭＣで１６日 間処理し９次いで間接免疫蛍光分析法によって旧Ｖ抗原の発現を試験した。概略 を述べれば９次のとおりである。旧Ｖ陽性個体由来のヒト血清を試験細胞ととも に培養し９次いで洗浄し、フルオレセインで標識したヤギ抗ヒＨｇＧ試薬で、結 合された特異的１ｇＧを検出した。この定量流動細胞計数法の結果を第３図に示 し実施例３で検討する。その結果は、　ＴＣＳとＭＭＣがともに、処理された旧 Ｖ感染Ｔ細胞における旧Ｖ抗原の発現のレベルをバックグランドまで低下させた ことを示している。

１１１Ｖ感染Ｔ細胞における旧Ｖ抗原の発現の指標として使用できる他の旧Ｖ抗 原は、　）ＩＩＶコアタンパク質抗原ｐ２４である。

この抗原は、感染細胞内に主して局在しているが、細胞をトリトンＸ−１００の ような膜をバーミャライズする試薬で処理して抗ｐ２４マウスモノクローナルが 細胞に容易に入るようにし。

次いで細胞を、蛍光で標識した抗マウスＩｇＧ抗体で処理することによって容易 に測定することができる。これらの方法は。

実施例４で詳細に述べる。一方、ウィルスの複製は、感染培養物の細胞が存在し ない上澄液または感染細胞の溶菌液中に存在する旧Ｖ　ｐ２４抗原の量を、サン ドイッチ形抗原捕獲免疫検定で測定することによってはかることができる。両方 法ともに、ウィルス抗原の発現もしくは産生の尺度、すなわち感染細胞によって 産生され、使用される特定の検定法で検出可能な量を提供する。

ＨＩＶ感染Ｔ細胞におけるｐ２４０発現に対する低濃度のいくつかのｓｃＲＩ　 Ｐ類の効果を、実施例４に詳述した方法によって試験した。要旨を述べれば次の とおりである。すなわち、　）ＩＩＶ感染Ｔ細胞と未感染Ｔ細胞を、ｏ、ｏｉ〜 ５μｇ／ｍｌの連続暴露濃度で１０日間１選択された５ｃＲＩＰとともに培養し 、前記したのと同様にしてｐ２４抗原を検定した。第４図は、ｐ２４の産生が。

表示濃度のＴＣＳとＭＭＣによって阻害される百分率を示す。このデータは、１ μｇ／ｍｌの５ｃＲＩＰ連続暴露濃度でウィルス抗原が実質的に完全に阻害され ることを示している。

第５図は、　ＨＩＶ感染Ｔ細胞におけるｐ２４発現に対する三つのアメリカヤマ ゴボウの抗ウィルスタンパク質製剤の効果を示す。ｐ２４０発現を完全に阻止す るにはわずかに高い濃度の５ｃＲＩＰが必要であるが、　ＴＣＳとＭＭ　Ｃで得 られたのと定量的に類似の結果が得られている。

第６図は、旧ν感染細胞におけるｐ２４の発現に対する三つの真菌の５ｃＲＩＰ 類の阻害効果を示す。図から分かるように。

試験した最低濃度によって、感染Ｔ細胞におけるｐ２４の発現が完全もしくはほ ぼ完全に阻止されている。これら真菌５ｃＲＩＰ類の比活性が明らかに大きいの は、その分子量が幾分小さく（第１節）、シたがってμｇ／ｒＩＴｆ！表示濃度 では２モル濃度が高くなるからである。

先に検討した旧Ｖ抗原発現が阻害されると、感染細胞の逆転写酵素（ＲＴ）活性 が低下することから、ウィルスの複製が阻害されることが確認された。この特徴 を第７図に示すが。

この図は、　ＨＩＶ感染Ｔ細胞の逆転写酵素活性をＴＣＳもしくはＭＭＣの濃度 の関数としてプロットしている。ＲＴ活性の低下は。

感染細胞における旧Ｖ表面抗原の発現の阻害と良好な相関関係を有している（第 ３図）。

下記第■節で分かることであるが、感染Ｔ細胞における旧Ｖ抗原発現を実質的に 完全に阻止するのに必要な０．１〜１μｇＺｍｆｆｉ度の５ｃＲＩＰによって、 未感染Ｔ細胞の細胞増殖を阻害することはたとえあっても非常に少ない。したが って、このＴ細胞についての選択的効果は、未感染細胞に対する毒性効果がほと んどなしに、感染Ｔ細胞での旧Ｖ感染を阻害するのに利用することができる。

Ｂ、単核食細胞系細胞 単核食細胞系細胞（ＭＰＬＣ）は、旧νに感染可能な他の一群の細胞であり、ま た恐らくヒトの身体内にウィルスの有意な貯蔵庫を提供するので、この細胞群の 旧ν感染に対するＭＭＣおよびＴＣＳの阻害効果も重要である。試験を行った細 胞系は。

単球／マクロファージ、末梢血液中に存在する単核マクロファージ系細胞および 組織マクロファージの前駆体である。これらの細胞は、簡略にするため本願明細 書では“卓球”と呼ぶことにするが、末梢血液、またはヒト膵臓バイオブシイか ら公知の方法で単離することができる（クロウ）。この細胞は、実施例６で述べ るように、テフロンでコートした培養容器を用いる新規の生体外培養シテスムで 培養するのが好ましい。生体外で培養されると、末梢血管由来の単球は分化され て組織マクロファージのいくつかの特性を得る。単球を単離するために、末梢血 液の単核細胞をガラス皿に付着させて。

非接着性のリンパ球から単球を分離することができる。次いで分離された単球を 、懸濁液として、テフロンコートの皿で培養する。この細胞は増殖しないが、細 胞生存率が有意に低下することなく、４ケ月以上も培地内に生育状態で保持する ことができる。

上記の細胞は、実施例６で述べる様に、　ＨＩＶ単離物に、生体外で感染させる ことができ、または類似の方法で、ＨＩＶ感染個体から感染形態で得ることがで きる。単球／マクロファージにおける旧Ｖ抗原の発現は、すでに概略述べたよう にｐ２４抗原の変化で容易に追跡することができる。第８Ａ図と８Ｂ図は、　） ＩＩＶ感染単球を、対照の抗体く非特異的）もしくはマウス抗ｐ２４抗体と反応 させて、生体外での旧ソ感染１０日後に測定した細胞フルオログラフを示す。約 ６０％の細胞が、検出可能な（バックグランド以上）蛍光レベルを有し、　ＨＩ Ｖ感染を示している。

１（ＩＶ感染症と旧Ｖ阻害剤を研究するのに、単球細胞培養システムの重要な特 徴の一つは、細胞を、活性的に感染した状態で、数週間以上もの長期間、培地内 に保持できるということである。この特徴を第９図に示すが、この図は、単球の 生存率（魚卵）とｐ２４抗原のレベル（白印）を、　）ＩＩＶで生体外にて感染 させてからの日数の関数としてプロットしたものであり、丸印と三角印は二つの 異なる単球ドナーを示す。実験の詳細は実施例６で説明する。この図から分かる ように、ウィルス抗原は、最大で約５０〜６０％の感染細胞まで着実に増大し９ 次いで約２週間後には横ばい状態になり、一方、生存率は、試験期間を通じて実 質的に変化しない。

ＴＣＳもしくはＭＭＣに暴露された場合の＋、　ＨＩＶ感染単球でのウィルス抗 原発現の阻害を第９図に示す。卓球は、　ＨＩＶに感染してから１０日後、５μ ｇ／ｍｊ？のＴＣＳもしくはＭＭＣに暴露し。

４日後に流動細胞計数法で細胞を検定した。第１０Ａ図と１０８図は、第８Ａ図 と８Ｂ図のそれぞれと同様に対照の抗体（非特異的）および抗ｐ２４抗体と反応 させた後に分析した未処理細胞の細胞フルオログラフを示す。ＴＣＳとＭＭＣで 処理した細胞の細胞フルオログラフは、それぞれ、第１０Ｃ図とＩＯＤ図に示す 。ｓｃＲＩ　Ｐで処理した細胞に見られるｐ２４０レベル（第１０Ｃ図とＩＯＤ 図）はバックグランド（第１０Ａ図）に近似しており、細胞が抗ウイルスタンパ ク質に暴露されて４日後に、ウィルス抗原の発現を実質的に完全に阻害すること を示している。実施例７Ａでこの方法の詳細を述べる。

ＴＣＳまたはＭＭＣに暴露後の感染単球におけるｐ２４抗原の低下の時間経過を 、第１２図に示す。各時点で、流動細胞計数法によって上記のようにして測定し た。上記バックグランドの抗原特異性蛍光を有する細胞の百分率を示す。未処理 の細胞（黒丸印）は抗原レベルがほとんど変化を示さないが、　ＴＣＳ（三角印 ）とＭＭＣ（白丸）で処理した細胞は、１日後にウィルス抗原を数分の−に減少 させ、　ＴＣＳもしくはＭＭＣに暴露してから４日後にｐ２４抗原を実質的に完 全になくしてしまうことを示している。この研究の詳細は実施例７Ｂで述べる。

第１３図のデータは、ｐ２４２４抗原害をＴＣＳも１−７＜はＭＭＣの関数々１ −でプロットしたものであるが、　ＴＣＳとＭＭＣともに。

０．５μｇ／ｍｊ２の濃度で、ｐ２４の発現をほぼ完全に阻害することを示して いる。第１４図には、０．００５μｇ／−という低濃度のＭＭＣに３時間パルス 暴露Ｉ７た際のｐ２４阻害の百分率を示す。データは、５■／ｒｒＬ１の濃度で ほとんど完全に阻害することを示している。

この発明の他の態様によって、旧Ｖ感染単球に対するＴＣＳもしくはＭＭＣの阻 害効果は、少なくとも感染細胞が低投与量の５ｃＲＩＰのパルス暴露を受けた場 合、ウィルスタンパク質に対して選択的になることが見出されたのである。具体 的に述べると、　ＨＩＶ感染単球は、低濃度のパルス投与のＴＣＳに暴露された 際、測定可能なｐ２４が著しく減少することが見出されたが（第１４図）１例え ば表面抗原肛Ａ−ＤＲのような測定可能な細胞表面抗原は有意には減少しない。

この研究の詳細は実施例７Ｄで詳細に述べる。

エイズ患者から単離したマクロファージ中の旧Ｖの存在。

および生体外で感染させ、感染ドナーから単離された単球における旧Ｖ抗原の発 現の阻害を試験した。エイズ患者由来の末梢血液と膵臓細胞の両者からのいくつ かの単球製剤を、ｐ２４２４抗原について試験した。マクロファージの培養は、 ドナーが旧Ｖ血清陽性で、かつ外因性ウィルスを添加せずに生体外感染を行うこ と以外、実施例４に記載したのと同様に行った。培養物の旧Ｖの起源は、自然に 生体外で感染した細胞ドナーからの旧Ｖである。単離後直ちに試験した単球は、 ｐ２４抗原の存在によって分かるように、旧ν陽性細胞は、ごく少ない百分率で 含有しているにすぎない。ｐ２４を発現する細胞の百分率は、第１１図に膵臓単 球の培養物の場合に示したが（白画角印）、培養の３〜４日間にわたって徐々に 増加した。

試験を行った旧Ｖ血清陽性の個体由来の五つの異なる単球製剤において、培養細 胞は、培養の３〜４日間にわたって約１０％〜４０％がｐ２４を発現した。この 結果は、旧■血清陽性の個体に存在する単球が高い比率で旧Ｖに感染しているこ とを示している。これらの感染細胞は、生体外で短期間培養されない限り、ごく 少ない百分率の感染細胞だけが旧Ｖ抗原を発現することは明らかである。新たに 感染させて培養された卓球におけるｐ２４の発現が比較的低速であるとすれば、 ｐ２４を発現する細胞の数の増加が培養細胞中へのウィルスの拡散によって起こ るという可能性は小さい（第７図）。

生体外で感染した細胞でのｐ２４の発現に対するＴＣＳの阻害効果を試験したが 、培養の開始時ではｐ２４を発現する細胞が全く少なく、別の培養物で培養を開 始してから５日後では。

ｐ２４の発現が約４５％の細胞に認められた。第１１図は、１０日間にわたって 培養された５Ｘ１０’の単球をＴＣＳ　（０，３μｇ／ｍｌ）で処理した結果を 示す。培養開始時にＴＣＳを添加すると、１０日間の試験期間中、　ＨＩＶ抗原 の発現が完全に防止された。また５日目の単球培養物にＴＣＳを添加したところ 、ｐ２４を発現する細胞の百分率が、３日間の間に約４５％から２％に減少し。

さらに５日間で、抗原を発現する細胞の百分率がバックグランドのレベルまで低 下した。抗原の発現が培養中に起こる前後のいずれの場合でも、感染した個体由 来の単球における旧ν抗原の発現を、　ＴＣＳが阻止できるということは、上記 のデータから明らかである。

ここで検討する方法と知見を要約すると次のとおりである。

１、同時係属中の特許願“旧Ｖの阻害法”で提供された初期の知見によって、低 濃度の、　ＴＣＳとα−およびβ−ＭＭＣとは、　ＨＩＶに感染したＴ細胞と単 核マクロファージ系細胞とにおける旧Ｖ抗原の発現を有効に阻害することが証明 された。

低濃度（例えば約１μｇｉｒｄより小さい）の上記化合物は、未感染細胞におけ るタンパク質合成をごくわずかしか阻害しない。

２、感染Ｔ細胞におけるウィルス発現に対する上記の選択的阻害効果が、植物と 真菌の両者を起源とする５ｃＲＩＰを含む。

いくつかの別の単一連鎖のリポソーム失活化タンパク質にあることが証明された 。

３、　ＨＩＶ感染Ｔ細胞にみられる選択的阻害効果（低濃度の５ｃＲＩＰでは不 感染細胞中に産生されるタンパク質を阻害できないことから明らかなように）に 加えて、　ＭＭＣとＴＣＳ　、低濃度および／または低暴露時間で、　ＨＩＶ感 染単球／マクロファージにおけるウィルスタンパク質合成を９選択的に阻害する ことができる。

ＴＣＳが、　ＨＩＶ感染細胞中での細胞の増殖と生存率とを著しく選択的に低下 させたということは、先に出願した同時係属中の特許願に提示された研究が示し ている。この節では、　ＨＩＶ感染細胞における細胞増殖を選択的に阻害するパ ラメーターを考案する。いくつかの代表的な５ｃＲＩＰが、低投与量のレベルで 細胞の増殖を選択的に阻害する効果が証明されたのである。その上、パルス投与 法によって９本質的に完全な選択性が得られることが見出された。また同族では あるが別個のヒトウィルスであるＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞では、感知でき るほどの選択的阻害効果が全く観察されないので、この選択的効果は、旧ν感染 症に対して比較的に特異的であるということが分かる。細胞増殖の阻害は、処理 された細胞のチミジン取込みの阻害を追跡することによって測定したが、いくつ かの場合には、この方法は、アミノ酸取込みの阻害および／または細胞生存率の 減少のデータで補足した。細胞阻害の研究の詳細は実施例８と９で説明する。

５ｃＲＩＰの有効阻害投与量を決定するために、未感染細胞とＨＩＶ感染細胞を 、一般に０．０１〜５μｇ／ｒａｉｌの範囲で増大させた濃度の選択された５ｃ ＲＩＰに３日間暴露した。得られた細胞に。

放射能で標識したチミジンを１２時間パルスし、細胞ＤＮＡに取込まれた放射能 標識を、細胞増殖の指数として測定した。

第１５図は、　０．０１．０．１　、　１．　５および１０μｇ／ｍＩ！のＴＣ Ｓの場合に測定したチミジン取込みレベルを示す。なおこの図中のＨ９とＨ９， Ｉ（ＩＶは、それぞれ、未感染Ｔ細胞と旧Ｖ感染Ｔ細胞を示す。図から分かるよ うに、感染細胞の５０％阻害は、約０．２μｇ／−の濃度で達成され、他方、未 感染細胞を同程度に阻害するにはほぼ１０μｇ／ｍｌのＴＣＳが必要である。こ の二つの濃度の比率として定義される選択性指数は、したがってＴＣＳについて は約５０である。同様の結果がＭＭＣについても得られた（図示せず）。

第１５図に示されているように、最大の選択性効果（上記２曲線間の最大の差） は、１μｇｏｄのＴＣＳで観察された。この発明の一つの態様によって、感染細 胞と未感染細胞間の阻害の選択性は、細胞を１選択された５ｃＲＩＰに、連続的 に暴露するのとは異なり、そのパルス投与で暴露することによって著しく促進す ることができる。この効果は第１６Ａ図と１６Ｂ図から分かるが、これらの図は 、チミジン取込みの阻害を、２μｇ／ｒｎ１の、ＴＣＳ（第１６Ａ図）とＭＭＣ （第１６Ｂ図）への暴露時間の関数として示している。図から明らかなように、 試験したｓｃＲＩ　Ｐはいずれも、未感染細胞によるチミジン取込みの感知可能 の阻害は、これら化合物に２時間暴露してもみとめられなかった。他方、２時間 の暴露をすれば、続けて暴露しなくても。

感染細胞の細胞増殖をほぼ完全に阻害するのに十分であった。

なおこれは３日後に測定された。

第１７Ａ図〜１７Ｃ図は、先の特許出願で報告したような、　ＴＣＳの濃度を増 大させた場合の細胞の生存率に対する効果を示す。

表示濃度のＴＣＳに暴露してから２日および５日後の生存力のある細胞の数を、 それぞれｌｃ１？Ａ図と１７Ｂ図に示し、また生存力のある細胞の百分率を第１ ７Ｃ図に示したが、細胞の生存率は、生体染料排除法（トリバンブルー）によっ て測定した。

これらの図の細胞生存率のデータは、感染細胞が、特に高濃度のＴＣＳで殺され やすく、また５日目よりも２日目により著しい効果が観察される。このことは、 　“感染した”集団中の細胞の１００％以下が、実際に、生産的に感染したとい うことを反映しているようである。生産的に感染していない細胞は、　ＴＣＳと ＭＭＣに対してあまり敏感でないようであるが、５日目の細胞カウント数に対す る薬剤暴露の効果が明らかに比較的小さいのは、それ自体生産的に感染していな い、　“感染”集団内の個々の細胞が優先する結果を反映している。生存力のあ る細胞の全数を生存百分率と比較すると、　ＴＣＳは、投与量依存形で、未感染 細胞に対するよりも旧Ｖ感染細胞に対し。

所定濃度で優先して、殺細胞（細胞を殺す）効果および静細胞（細胞の増殖を阻 害する）効果を与えることができることを示唆している。同様な結果がα−及び β−のＭＭＣにも得られた。

第１８Ａ図と１８Ｂ図は、濃度を増大させたＰＡＰ−Ｉ　ニ、　１１９とＨ９， ＨＩＶの細胞を暴露させた場合の細胞阻害の程度を示す。第１８Ａ図から分かる ように、チミジン取込みに対する５０％阻害のレベルと選択性指数とは、　ＴＣ Ｓの度合によく似ている。第１８Ｂ図は、処理されたＨ９細胞と１（９，ｔｌｌ Ｖｌｌへのアミノ酸（ロイシン）取込みの阻害が、チミジン取込みの阻害の場合 とよく似ていることを示している。

第１９〜２２図は、　ＰＡＰ　ＩＩ　（第１９図）、ミトギリン（第２０図）。

レストリフトシン（第２１図）およびα−サルシン（第２２図）で処理したＨ９ 細胞と８９．　ＨＩＶ細胞の選択的阻害曲線を示す。すべての場合９選択性指数 は約５０〜７０であった。前記第ｍ節で考察したウィルス抗原阻害のデータと矛 盾することなく、これらのデータは、三つの真菌タンパク質が、植物の５ｃＲＩ Ｐ類に観察されたのより幾分低い濃度で阻害することを示している。

精製リシン（ｒｉｃｉｎ　）のＡ！１ｌｌｌの旧Ｖ感染Ｔ細胞に対する阻害効果 も研究した。感染細胞および未感染細胞の両者を、濃度を０．００１〜１０μｇ ／ｍｌｉ！の範囲で増加させたりシンのＡ鎮に暴露させた。細胞の阻害を３Ｈ− チミジンの取込みの阻害で測定゛　した。感染細胞と未感染細胞を、　１００ｍ Ｍの乳糖の存在および不存在下で試験した。この乳糖は、精製Ａ鎖部剤中に混入 しているＢ鎮による非特異的毒性を制御するために添加した。

未感染細胞の３Ｈ−チミジン取込みの阻害レベルは、１０μｇ／ｄのりシンＡ鎮 では約２０〜３０％であったが、乳糖は阻害効果がほとんどなかった。対照して みると、　ＨＩＶ感染Ｔ細胞の阻害は、０．１〜１μｇ／−のりシンＡ鎮で著し く増大し、　１０μｇ／ｍｌで事実上完全に行われた（９８％阻害）。

）ＩＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞に対する５ｃＲＩＰ類の阻害効果も試験した。

）ＩＴＬＶ−Ｉ（ヒ）Ｔ細胞白血病／リンパ腫ウィルス）は、　ＨＩＶと共通の いくつかの特徴、すなわち０ＫＴ４／ロイシン３＋リンパ球に対する向性２Ｍｇ ＋２依存性高分子量逆転写酵素。

類似の大きさと性質を有するいくつかの構造タンパク質および限定された核酸の 相同を有する。

１（ＬＴＶ−Ｉに感染した細胞を、実施例１０に記載の方法にしたがって、濃度 を増大させたＴＣＳ　、　ＭＭＣもしくはミトギリンに暴露した。未感染細胞間 いて、三つのタンパク質で試験し、チミジン取込みの阻害を５ｃＲＩＰの濃度の 関数として第２３Ａ〜２３Ｃ図に示す。試験したどの化合物についても選択的阻 害は全く観察されなかった。

具体的に述べると、　ＩＩＬＴＶ−１に感染した細胞がこれらの化合物によって 阻害を受けにくいのは、未感染のＨ９細胞と同じである。この節で考察した方法 と知見を要約すると次のとおりである。

１、同時係属出願中の特許願“旧Ｖの阻害法”で提供された最初の知見によって 、　ＴＣＳとＭＭＣが、　ＩＩＩＶ感染Ｔ細胞の細胞増殖を選択的に阻害できる ということが、チミジン取込みの阻害と低下した細胞生存率の両者によって証明 されることが分かった。

２、感染Ｔ細胞の細胞増殖に対する選択的阻害効果が、いくつもの追加のＡ鎮様 植物タンパク質と真菌タンパク質について証明された。試験された全化合物は、 　）ＩＩＶ感染細胞もしくは未感染細胞を化合物に連続的に暴露する検定条件下 で試験した場合、約５０〜７０の選択性指数を示す。

３、感染Ｔ細胞に５ｃＲＩＰ類をパルス投与することによって。

本質的に完全な選択性（すなわち：未感染細胞に対しては測定可能な阻害効果が ない）を得ることができる。

４．同族ではあるが異なるヒトレトロウィルスのＨＴＬＶ−１に感染したＴ細胞 には全く選択性がないことから明らかなように９選択効果は旧Ｖに対して特異的 なものである。

（以下余白） ■、単一連鎖リポソーム失活化タンパク質この発明に有用な５ｃＲＩＰタンパク 質類は、タンパク質の起源（植物、真菌もしくは細菌）と、天然産タンパク質の サブユニット（単一連鎖もしくは二つのサブユニット）によって。

一般に４グループの一つに分類することができる。

第一グループには、多数の植物によって産出される。タンパク質合成の単一連鎖 阻害剤が含まれる。このグループのタンパク質の例としては、Ｔｅ３（ロウ、ク オーフエン、グ、クスジャン、ワン、グーヘン）　；ＭＭＣ（フアラスカ、スプ リフィコ、リン、　１９７０．１９７８．バービエリ、　１９７９．１９８０） 　；アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（バービニ１ハ１９８２゜アービ ン、　１９７５．１９８０．１９８３）　；ゲロニン（スターベ、　１９８０） 　；ジアンチン３０とジアンチン３２　（ｄｉａｎｔｈｉｎ３２）　（スターぺ 、　１９８１）　；クロチンｆｌ　（ｃｒｏｔｉｎＩＩ　）　（コンデ）；カー シンＩＩ　（ｃｕｒｃｉｎ　ＩＩ　）（コンデ）：小麦胚阻害剤（ロバーツ）お よび穀物から得られるいくつかの他のタンパク質阻害（コールマン、ガスバリー カンパニ）がある。

第ニゲループの５ｃＲＩＰには、真菌起源から得られるものと。

単一連鎖のペプチド形で天然に生成するものがある。このグループの例は、α− サルシン（ロドリゲス、オールスン、　１９６５ａ、　１９６５ｂ）　；レスト リフトシン（ロドリゲス）ミトギリン（ロドリゲス）；エンマイシン（ｅｎｏｍ ｙｃｉｎ）　（コンデ）：フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ＞　（コンデ ）がある。

いくつかの植物は、二つの似ていないサブユニットすなわちペプチド連鎖、すな わち、大きなリポソームのサブユニットのリポソームＲＮＡに対し特異的なリポ ソーム失活化活性を有する酵素的に活性なＡ鎮と、毒素を細胞表面のレセプター に結合する作用を行うＢ類とで構成された細胞毒素を産出する（オールスンズ、 　１９８２）。この種の細胞毒素で最もよく知られているのは、リシン（ｒｉｃ ｉｎ　）　、アブリン（ａｂｒｉｎ　）およびモデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ＞で あり、これらはすべて構造と作用機構が似ている。これらのタンパク質のサブユ ニットは。

ジスルフィド結合で連結され、またこの結合は還元条件下で切断することができ （オールスンズ、　１９８２）　、個々のサブユニットを精製することができる 。細胞毒素のＡサブユニットすなわちリポソーム失活化サブユニットは、この発 明にしたがって第３グループの５ｃＲＩＰを形成する。

第４グループの５ｃＲＩＰは、シゲラ・ジセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙ ｓｅｎｔｅｒｉａｅ）由来の細胞毒素と同様のツガ様（Ｓｈｉｇａ−１１ｋｅ） 毒素のような単一連鎖の、細菌タンパク質すなわちペプチドの細胞毒素である（ コールグーウッド）。これらの毒素は。

前記の植物細胞毒素のＡ鎖に類似しかつ同じ作用モードを有する一つのＡ鎮様サ ブユニット（エントウ、　１９８７年）と、細胞結合機能を有する多Ｂサブユニ ットとで構成されている。

これらのＡサブユニットは、第４グループの５ｃＲＩＰを形成する。

いくつもの証拠が、４グル一プ全体の５ｃＲＩＰは共通の構造上の特徴を分けも って、共通の作用機構を有することを示している。リシン、モデシン、アルビン のＡ鎮はすべて、アミノ酸配列相同性の領域示しくオールスンズ、　１９８７） 　、次のような多数の単一連鎖植物旧Ｐ類、すなわちアメリカヤマゴボウ抗ウイ ルスタンパク質（アービン、　１９７５）　；小麦胚失活剤（ロバーツ）　；Ｍ ＭＣ（バービエリ）；ゲロニン（スターペ）ニジアンチン類（スターベ）；およ びＴｅ３　（マラガノア）は。

−次ペプチド構造かりシンＡ鎖に似ている。ツガ様細菌毒素も、リシンＡと配列 相同性を示す（コールグーウッド）。レストリクトシン、ミトギリンおよびα− サルシンの一次構造はすべて、高度の配列相同性を示す（ロドリゲス）。

本願で定義される５ｃＲＩＰ類も、リポソーム不活性化活性の共通の機構を分け もっており、この活性には、６０Ｓリポソームサブユニツトの大きなリポソーム ＲＮＡ　（γＲＮＡ　）に対する部位特異的酵素活性が含まれる（オールスンズ ）。リシン。

アルビンおよびモデシンのＡ鎖；単一連鎖の植物阻害剤の。

アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、クロチン■、カーシン■；真菌タン パク質のミトギリン、α−サルシン、レストリクトシン、エノミツク、フェノマ イシン：およびツガ様細菌毒素を含む、従来研究されてきた５ｃＲＩＰ類のいく つかには、真核リポソームの６ＯＳサブユニツトの触媒失活化作用が報告されて いる（コンデ）。リシン、アルビン、モデシンおよびアメリカヤマゴボウ抗ウイ ルスタンパク質を含む多くの植物阻害剤の場合、リポソーム失活化作用の機構に は、特定のアデノシンヌクレオチドサブユニットからアデニンを除くＮ−グリコ シダーゼ活性が含まれる。α−サルシン、ミトギリンおよびレストリフトシンを 含む、現在までに研究された真菌阻害剤についての失活化作用には、Ｎ−グリコ シダーゼ阻害剤タンパク質の開裂部位に近い特定の部位のホスホジエステル結合 の開裂反応が含まれる（エントウ、　１９８２．１９８７）。

報告されている単一連鎖リポソーム失活化性タンパク質に共通の他の特徴は、あ る種のウィルス感染細胞系におけるタンパク質合成の阻害を促進することである 。例えば、ゲロニン、ジアンチン−３２，ＭＣＩ　［エム・シャランチア阻害剤 （Ｍ。

ｃｈａｒａｎｔｉａ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　）およびＰＡＰ−５がすべて、単純 ヘルペスウィルス−１（ＩＳＶ−１＞またはポリオウィルスＩに感染したＨＥｐ −２細胞のタンパク質合成を、未感染細胞のタンパク質合成よりも一層大きく阻 害するということが観察されている（ホアートマシ）。選択的阻害効果を得るの に必要な阻害剤タンパク質の濃度は、一般に１０〜１００μｇ／ｍｌであり、み とめられる阻害の程度は、一般に約５０％より小さい（ホアートマシの第３図） 。

α−サルシン、ミトギリン、レストリクトシン、　ＰＡＰおよびアルビンのＡ鎖 を含むいくつかの単一連鎖の阻害剤が、ピコルナウィルス、脳心筋炎ウィルス（ ＥＭＣ）に感染したＨｅＬａ細胞のタンパク質合成を選択的に阻害することが、 より最近になって示された。選択的阻害が、α−サルシンとアルビンのＡｔ１ｆ ｉの比較的低い失活化濃度でみとめられた。アデノウィルスに感染したＨｅＬａ 細胞と、セムリキ森林熱ウィルスに感染したＢＨＫ細胞の選択的阻害も観察され た。その後の研究によって、ウィルス感染性宿主細胞上の表面レセプターに、　 ６ＭＣウィルスもしくはポリオウィルスが結合すると、その細胞の。

失活化性タンパク質に対する透過性が増加することが分かった（ファーナンデー ーブエンティス、　１９８０．１９８３）。

ウィルス感染によって、単一連ｔ［ＩＪボソーム失活化性タンパク質の、感染細 胞に対するタンパク質阻害効果が促進されるが、この効果は、特異的ウィルスに 関連する感染細胞のタイプとに強く左右されるようである。例えば、ウィルスに 感染したＨｅＬａ細胞に関する上記研究において、　ＥＭＣに感染した場合は、 アデノウィルスに感染した同じ細胞よりも、タンパク質合成の選択的阻害が著し く大きいことを示した。同じ引用文献では、セムリキ森林熱ウィルスに感染した Ｂ）ＩＫ細胞が。

感染細胞と未感染細胞間でタンパク質阻害に最大で約４０％の差異を示した。さ きに示したように、ポリオウィルスまたは）ＩＳＶ−ｉに感染したＨＥｐ−２細 胞においては１選択的タンパク質阻害効果は、高い失活化濃度で観察されただけ で、感染細胞と未感染細胞間の阻害度の最大差は、約５０％であった。

上記第■節で提供された知見から、異なるレトロウィルスに感染したＴ細胞が、 　５ｃＲＩＰ類に対する反応に劇的な差異を示すことが分かっている。特にヒ） Ｔ細胞がＨＬＴＶ−Ｉに感染すると、　５ｃＲＩＰ類による検出可能な選択的阻 害作用がなくなる。他方、異なるが密接に関連するレトロウィルスの旧Ｖに感染 したＴ細胞には、８０〜９０％の阻害効果の差異が、約０．１〜１μｇ／ｒＩＬ １の濃度の低い失活化濃度で観察される。さらに。

その細胞がパルスされた投与に暴露された場合は、１００％までの選択的阻害効 果の差が観察される。

小投与量のＴＣＳとＭＭＣによって、　）ＩＩＶに感染したＴ細胞と単球マクロ ファージにおけるウィルス抗原の発現を著しく選択的に阻害し、かつ感染Ｔ細胞 の細胞生存率を選択的に減少させたということは、以前に示した（同時係属出願 中の特許願“旧Ｖの阻害法”）。ここにおいて、上記の発見が、Ｔ細胞について ９代表的な、単一連鎖植物阻害剤と真菌阻害剤と２−サブユニットの植物毒素の Ａ鎮を代表する合計９箇の５ｃＲＩＰ類に拡大されたのである。゛その上、　Ｈ ＩＶに感染したＴ細胞および／または単球／マクロファージを上記５ｃＲＩＰで 処理すると、従来観察されたことのないいくつかの重要な効果を与えることが分 かったのである。すなわち以下の効果である。

（ａ）未感染細胞には実質的に非毒性の５ｃＲＩＰの濃度での、　）ＩＩＶ感染 Ｔ細胞における旧Ｖ抗原の発現とウィルスの複製の実質に完全な阻害： （ｂ）ＴＣＳで処理した。ウィルス感染単球／マクロファージにおける細胞抗原 に対するウィルス抗原の選択的減少：および（Ｃ）試験された種々の異なる５ｃ ＲＩＰ類によって行われる実質的に同程度の選択的阻害：である。特に、第■節 で述べたように、試験されたすべての植物および真菌の化合物が、約５０〜７０ の、細胞増殖の阻害に対する選択性指数を示した。このことは１選択性効果が、 試験されたリポソーム失活化タンパク質問で大きく変わるという従来技術の報告 とは異なっている。上記の結果は、試験を行った９箇の５ｃＲＩＰ化合物の代表 的な性質を総合して得られたものであるが１本願発明で提供される著しい選択性 効果が、上記定義の４グループの５ｃＲＩＰ類を含むと結論してもよいというこ とを示している。

■、ヒトの旧ν感染症の治療 エイズの病因の連鎖の一つは、ＣＤ４＋ＴＩＪンバ球の破壊のようであり、細胞 破壊の少なくとも一つの機構が、感染細胞が融合して大型の多核細胞を形成する ことであると示唆する証拠が生体内および生体外にある。本願発明者らおよび共 同研究者らは、以前に、　ＣＤ４抗原と、旧νへの感染しやすさとの関係を研究 した（リフソン、　１９８６ａ−ｃ）。この研究によって、Ｔ１７７８球の感染 にはＣＤ４抗原を必要とし、その感染プロセスでは、　ＣＤ、抗原と、旧νの１ 種以上のエンベロープタンパク質との相互作用が必要なことを示唆している初期 の報告（ダルグリ−シュ；クラ−／　”７７７、１９８４ａ、　１９８４ｂ　； 　７クドーガル、　１９８５ａ、　１９８５ｂ、　１９８６；７ドン；ソドロス キー）が確認された。また本願発明者らの以前の研究によって、感染Ｔ細胞が、 生体外で、感染ＣＤ４＋Ｔ細胞と未感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の両者と融合して大型の 多核シンシチウムを産生じ、その細胞融合が、抗ＣＤ４抗体を添加することによ って阻止されることが分かった。これは次のことを示している。すなわち旧ν感 染のような細胞融合は、感染細胞の表面上のウィルス抗原とＴ’Ｊンバ球ＣＤ４ 抗原との相互作用を必要とする（感染細胞または未感染細胞のいずれでも）こと である。またこの結果によって、　）ＩＩＶに感染した個体から単離された比較 的少数のＣＤ４＋Ｔ細胞しかＩＩＩＶ感染の証拠を示さなくても、　（１：０４ 十Ｔ細胞の大部分がいかにして破壊されるかを説明することができる。この機構 によって、感染１９７８球が、細胞の融合と破壊に対して、健康なＴ細胞を“回 復させる”と考えられる。

ＣＤ４＋抗原の高い発現に対して選択された１９７８球を用いて１発明者らは、 さらに以前の研究で次のことを示した。

すなわち、（ａ）Ｔ！Ｊンパ球の旧Ｖへの感染性は、抗原の表面濃度が増加する につれて著しく増大する。および（ｂ）細胞融合によるシンシチウムの形成が、 高ＣＤＪ＋細胞では極めて高速で行われることである。この結果は、　ＨＩＶ感 染症におけるＣＤＪ＋抗原の重要性と、続いて起こる細胞融合の現象についての 初期の知見を裏付けている。

また、単球／マクロファージが旧Ｖ感染症の病因に含まれることを示す証拠があ る。単球／マクロファージ系の細胞が。

生体外で旧Ｖに感染可能であり（クロウ、ガードナー、　１９８６ａ、　１９８ ６ｂ　；ケーニッヒ；ホー；チェイト：アームストロング：スタイカー）、単球 が、　１（ＩＶの中枢神経系への拡散に関係している（ケーニッヒ）ということ が報告されている。旧Ｖに感染した患者から調製した単球について第■節で報告 した研究は、たとえウィルス抗原が、比較的少量の細胞に、生体内に活性をもっ て発現されても、多量の、血液とｖｅ臓のマクロファージが旧Ｖ感染症を保持す ることを示している。体内に旧Ｖの貯蔵庫を提供するのに加えて、マクロファー ジは。

細胞融合による１９７８球の破壊に直接関連している。発明者らおよび共同研究 者らによる最近の研究は、　ＨＩｖに感染した単球が、未感染ＣＤ４１Ｊンバ球 と容易に融合し、巨大な多核シンシチウムを形成することを示した（クロウ）。

また、マクロファージがＣＮＳの旧Ｖ感染症に関連することを示す証拠がある（ ケーニッヒ）。

５ｃＲＩＰ類によって生ずる選択的ウィルス阻害効果を、この発明にしたがって 、いかにしてヒトの旧Ｖ感染症の治療に利用できるかは、上記のことから明らか である。ＩＩＩＶの複製を選択的に阻害する５ｃＲＩＰ類の性質は、ウィルス抗 原の発現と逆転写酵素の活性とを実質的に完全に阻害することによって証明され ているが、この性質によって新しい細胞に感染可能な新しいウィルスの産生を減 少させることにより感染の数を減らすことができるであろう。さらに、ウィルス 複製の阻害は、単球／マクロファージなどの細胞が提供するウィルスの“貯蔵庫 ”の排除を促進する。この点については、少なくともひとつの５ｃＲＩＰのＴＣ Ｓは、血液脳関門を通過できるようであり、　ＨＩＶ感染症のＣＮＳへの拡散に 対して有効であるに違いない。

第２に、先に考察した証拠は、　ＣＤ４　＋Ｔ子細胞、感染したＴ細胞もしくは 単球／マクロファージとが融合するには、感染した細胞の表面に旧Ｖ抗原が存在 することが必要であることを示唆している。ウィルスタンパク質の発現が実質的 に減少するということは、感染症の細胞変性効果が著しく減少することに関連す ると考えられる。

この発明による。　５ｃＲＩＰ類による旧Ｖの治療の他の治療上の利点は、　Ｈ ＩＶ感染Ｔ細胞を選択的に阻害することである。

感染したＴ細胞は、未感染のＴ細胞と融合するポテンシャルを有し、全Ｔ細胞の 集団の消耗を促進するので、感染細胞を選択して破壊すれば、“二次的な”Ｔ細 胞の破壊の程度が制限されるけずである。

また５ｃＲＩＰタンパク質は、ウィルスレベルの一般的な抑制と感染細胞でのウ ィルスタンパク質の合成の阻害によって。

ＨＩＶに感染した個体の免疫適格性の減退に関連するその外の現象を阻害もしく は防止することが期待できる。

治療上有効な５ｃＲＩＰの投与量は、治療対象のヒトの容易に監視できる種々の 因子によってきまる。Ｔ細胞における旧Ｖの複製と細胞増殖の選択的阻害が、特 に試験された真菌由来の５ｃＲＩＰについて、０．０１μｇ／ＷＬｌという少量 の投与量で観察された。いくつかの５ｃＲＩＰまたは急性の感染症の場合は、１ μｇ／ｍｊ２までもしくはそれを超える投与量が必要である。しかし、　５ｃＲ ＩＰに長期間暴露した場合でも、１〜２μｇｏｄの範囲の濃度が。

未感染細胞をひどく阻害することはない（第■節）。０．０１〜１μｇ／ｍｌの 血液中の５ｃＲＩＰの濃度は、約３．５０！！の血漿容積を想定して、約０．０ ３〜３■５ｃＲＩＰの全５ｃＲＩＰ投与量を投与することによって達成できる。

ＴＣＳの場合、この投与量は、ヒトに流産を起こさせるのに使うＴＣＳの投与量 ５〜１２．５■に匹敵し、この投与量では、ヒトにひどい副作用を一般に起こさ ない（クオーフエン；ホワン）。

この発明の治療法において、　５ｃＲＩＰは、旧ν感染症の下記指標の少なくと も一つに測定可能な減退をもたらすのに有効な投与量で、　）ＩＩＶに感染した ラインブレイク（ｌｉｍｅｂｒｅａｋ）のない患者に投与される。

（ａ）ＨＩ　Ｖ感染子細胞に関連する旧Ｖ抗原のレベル：ら）血流中の旧Ｖ抗原 のレベル； （Ｃ）ＨＩ　Ｖ感染子細胞に関連する逆転写酵素の活性：（ｄ）ＨＩ　Ｖ感染子 細胞と未感染Ｔ細胞きの生存率：および（ｅ）選択された旧Ｖ抗原と、　ＴＣＳ もしくはＭＭＣで治療された。

）１１Ｖに感染した単核食細胞系細胞における選択された細胞抗原との比率。

監視される旧Ｖ阻害の指標として好ましいのは血漿抗原のレベル、例えばＥＬＩ ＳＡ法を用いて容易に追跡できる血清もしくは血漿のｐ２４のレベルである。指 標の減退は、化合物を投与した後１〜５日以内に測定できることが好ましい。さ らにこの発明の方法には１代わりに、指標の少なくとも一つが減退するのを測定 し、　ＩＩＩＶ感染症の測定された指標がもはや減退しなくなるまでｓｃＲＩ　 Ｐの投与を繰返す方法が含まれる。

一連の投与が、例えば数週間にわたって行われる場合、患者は、抗旧Ｖタンパク 質に対するアレルギー反応を監視しなければならない。

強い反応が、第一番目に投与された５ｃＲＩＰ　、例えばＴＣＳに起こったなら ば１例えば第二番目の５ｃＲＩＰ　、例えばＭＭＣを投与して、免疫反応とその タンパク質の中和を最小にする。発明者の一人が行った予備的な動物実験のデー タは、これら二つのタンパク質が、実質的に、交差免疫反応性でないことを示唆 している。し、かし、治療を受けている多くの患者は、免疫性がいちじるしく弱 くなっているので、これらタンパク質に対する免疫反応は、比較的小さな副作用 である。

これらのタンパク質は９種々の放出形態の一つで非経口で投与することができる 。放出形態には、液剤形、リポソームで包んだ形態、およびタンパク質を、　Ｈ ＩＶに感染する可能性のある細胞もしくは旧Ｖに感染した細胞に目標を定めて、 抗Ｔ細胞、抗マクロファージまたは抗開Ｖ抗体のようなキャリヤに結合させたも のがある。種々の形態のペプチド医薬製剤の製造法と貯蔵法、および製剤を、静 脈、筋肉、皮下、粘膜および吸入によって投与する方法が医薬産業界には知られ ている。

下記の実施例によって、この発明の１種々の方法と用途。

およびこの発明のスクリーニング法において観察された代表的な抗開Ｖ効果を例 証する。実施例は例証するのを目的とするもので、この発明の範囲を少しも限定 するものではない。

（以下余白） 見料 ［３］Ｈ−チミジンと［３］Ｈ−ロイシンは、　Ｎｅ＠ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃ］ ｅａｒ社から入手し；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を抱合し たヤギ抗ヒトＩｇＧ試薬は、　Ｚｙｍｅｄ社（米国。

カリフォルニア州、バーリンゲーム）から入手し；抗ｐ２４モノクローナル抗体 は、米国、カリフォルニア州、ディビスのＵＣＭｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒの ジェイ・カールソン博士（叶、Ｊ、Ｃａｒｌｓｏｎ）から提供された。

Ｂ、…Ｌ垂胤立 ＨＩＶのＤＶ菌株を、未怒染ドナーからの単球／マクロファージの生体外感染を 含むすべての実験に用いた。これは、カボシ肉腫をもった異性愛男性の末梢血液 から得たローパッセージ（ｌｏ匈ｐａｓｓａｇｅ　）単離物である（クロウ）。

ウィルスの高力価保存物の数ｌを、ＶＢＴリンパ腫細胞系内で増殖させて（リフ ワンら、　１９８６年ａ　−Ｃ）　、その小分けしたものを、使用するまで一７ ０°Ｃで貯蔵した。旧Ｖ−Ｄνの貯蔵培養物は、約５Ｘ１０’感染単位／戚を含 有していた。なおこの感染単位は、５　ＸＩＯ’　ＶＢ指示細胞に接種して５日 間培養することによって特徴的な細胞変性効果（ＣＰＥ　）を生ずるのに必要な 感染ウィルスの量と定義する。貯蔵培養物は、公表された方法（ホフマン）で測 定して約８９　Ｘ　１０’ＣＩ）ＤＩの逆転写酵素活性をもっていた。他の実験 では、詳細に述べであるように。

ＨＩＶに感染したドナーから得た単球／マクロファージを利用した。これらの実 験では、利用した旧Ｖ単離吻は、特定の患者の自系の単離物であった。、Ｔ細胞 の研究には、　ＨＩＶのＨχＢ−２単離物を用いた。

Ｃ９工豊ｍ Ｈ９Ｔリンパ球細胞はＨ９細胞系由来のものであった。（ボボビッチ）。’ｉｌ Ｂ細胞、Ｔリンパ球芽細胞系は、ニス・スミス博士（スタッフォード大学）から 入手した。蛍光で標識した抗ＣＤ４抗体を利用する蛍光活性化細胞選別法を２強 ＜　ＣＤ４を発現する。　ＶＢのサプラインを得るのに用いた。細胞は、　１０ ％（ｖ／ｖ）の熱で不活性化したウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０内 に保管した。

Ｄ、　マクロファージ ヒトマクロファージ培養物は、既定の方法によって、ヒト血液のロイコホレーシ ス（Ｉｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）製剤と正常な献血者由来の軟膜とから得た 末梢血液単核細胞から調製した（クロウ）。要約して述べると、末梢血液単核細 胞は、フィコールハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｅ　）を用いる密度遠 心法で単離し、２０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭ１１６４０媒体にいれて。

３７℃で１時間保持してガラス製ペトリ皿に付着させた。洗浄後（汚染している 。非接着性の白血球を除去するため）、氷上にて、５μＭ　ＥＤＴＡ−ＰＢＳ、 ５％ＦＣＳの媒体中に１０分間入れ。

次いでゴムのポリスマンでこすりとることによって、単球をベトリ皿から回収し た。次いで回収した単球製剤を、遠心分離し、１０％のプールされた男性の旧Ｖ −負−ヒト血清を含有するＲＰＭ１１６４０媒体（感染媒体）中に懸濁させ、テ フロン培養容器に２ＸｌＯ’細胞数／滅で入れた。細胞生存率は、培養中最初の ５日間は減少し、約５Ｘ１０’細胞／ｄの安定した密度になった。長期の培養物 は、４ケ月間もこの密度に保持された。

媒体は通常７日毎に取替えた。

トリコサンチン（ＴＣＳ　）は、トリコサンチン・キリロウィ（Ｔｒｉｃｈｏｓ ａｎｔｈｅｓ　ｋｉｒｉｌｏｉｅｉｉ　）の根の塊茎から得られる植物タンパク 質である。このタンパク質は、α−トリコサンチン（ロー）およびラデソクス・ トリコサンチンス（Ｒａｄｉｘ　ｔｒｉｃｈｏ−ｓａｎｔｈｉｓ　）　（クラオ ーフェン）としても知られ、約２２４（グー）〜２３４（クスジャン）のアミノ 酸残基で構成され、約２４．０００ダルトンの分子量を有する塩基性の単一連鎖 のタンパク質である。ＴＣＳを精製した形態で得る好ましい精製法を、以下の実 施例１で概説する。この方法には、第１図に示す三つのクロマトグラフィによる 分離が含まれている。ＴＣＳのタンパク質の配列は解明されており（グー；ワン ）７分子モデルは。

細胞フルオログラフィＸ線分析法によって得られている（ケモモルカリン（ＭＭ Ｃ）は、苦味のメロン植物のモモルディカ・シャランチ＋　（１１ｏｉｏｒｄｉ ｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ　）の種から得られる塩基性の糖タンパク質である。

このタンパク質は、α−及びβ−モモルカリンと指名された二つの同族の形態を もっているようである。α−七モルカリンは、約３１，０００〜３２，０００ダ ルトンの分子量と約１．６％含有量の中性糖を有すると報告されている。β−モ モルカリンは、約２９．０００ダルトンの分子量。

と約１．３％含量の中性糖を有すると報告されている（チャン）。

この発明によれば、モモルカリンの両形態ともに、　ＨＩＶに感染したＴリンパ 球と単球／マクロファージにおけるＨＩＶ抗原の発現を阻害するのに有効である 。モモルカリンは、α−とβ−とのモモルカリンと、　ＨＩＶに感染した血液細 胞におけるＨＩＶ抗原の発現を阻害するのに有効なこれらタンパク質の活性部分 とを含むものであると定義する。この植物糖タンパク質は、既定の方法にしたが って、　ＣＭセフラロースＣＬ−６ＢとセファデックスＧ１００を用いて、エム ・シャランチャの種から得られるアセトン抽出液を分画することによって均質な ものを単離可能で［ユアン（Ｙｅｕｎｇ　）　、　１９８５］下記実施例２で詳 細に述べる。第２図は、　ＭＭＣに実施される三つのクロマトグラフィによる分 離法を示す。これらのタンパク質は、　ＴＳＫ２５０のゲル透過カラムを用いる 高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）　。

ＳＤＳゲル電気泳動法および免疫電気泳動法で分画した場合。

均等である。

モモルカリンは１分子量が３０，０００〜３２．０００ダルトンの範囲にあり、 細胞の存在しない系でリポソーム阻害活性を有する１種以上のエム・シャランチ ャ阻害剤（“ＭＣＩ”）と同族でおそらく同一物であると思われる０文献に記載 されているこのような阻害剤は１分子量が３１，０００ダルトン（フアラスカ） または３０，０００ダルトン（スプリフィコ）のモモディ力・シャランチャ阻害 剤；分子量が約３２，０００ダルトンの“アグリチニン”　（Ａｇｇｌｕｔｉｎ ｉｎ）　（リン、　１９７０．１９７８）　；およびエム・シャランチャの種か ら得られた血球凝集性レクチン中の四つのサブユニット（分子量が、　３０，５ ００．２９，０００．２８，５００および２７，０００ダルトン）のうちの１種 以上と思われるものである（バービエリ、１９８０）。

リポソーム不活性化タンパク質として最も広く研究されたＭＣＩ　は、最初は２ 分子量が２３，０００ダルトンのタンパク質であるとされていたが、その後の分 子量測定では、約３１，０００ダルトンの分子量であった（フアラスカ）。

３、アメリカヤマゴボウ−ウィルスタンパク　−ＩＰへＰ−ＩＰＡＰ−１は１分 子量が約２７，０００ダルトンの、植物由来の単一連鎖タンパク質である。この タンパク質は、ジェイムズ・ディ・アービン博士から提供されたもので、公表さ れた方法にしたがって、アメリカヤマゴボウのフィトラッカ・アメリカーナ（Ｐ ｈｙｔｏｌａｃｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ）から調製された。概略述べれば次の とおりである。若い草木から得たビイ・アメリカーナの葉を、蒸留水中でホモジ ナイズし、濾過し、濾液を４０％硫酸アルミニウム溶液中に入れて遠心分離し沈 澱物を除去した。

得られた上澄液をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィに付した。

ＰＡＰのタンパク質阻害活性全体を含むタンパク質のピークを。

さらにホスホセルロースイオン交換クロマトグラフィによって分画した。　０． １２Ｍ、：　ＣＩで溶出され、大部分のタンパク質阻害活性を有するピークを用 いた。

４、アメ官カヤマゴボウ　ウィルス　ンバク　−■ＰＡＰ−■ＰＡＰ−Ｕは、ビ イ・アメリカーナから得られる。もう一つの単一連鎖リポソーム不活性化タンパ ク質である。このタンパク質は２分子量が約２９，０００ダルトンの単一ポリペ プチド連鎖である。このタンパク質は、ジエイムズ・ディ・アービン博士から供 給されたもので、公表された方法（アービン、　１９８０）（ＰＡＰ−Ｉを製造 する際の精製法の改変法を含む）で調製されたものである。概略述べれば次のと おりである。ＰＡＰ−Ｔの精製に用いた最後のホスホセルロースのカラム由来の 溶離画分が、タンパク質阻害活性の二つの主要ピークを与えた。この最初のピー クはＰＡＰ−Ｉに対応するものである。２番目のピークをＰＡＰ−ＩＩとした。

ＰＡＰ−１と同様に、ＰＡＰ−ＩＩタンパク質は。

細胞の存在しない系での真核タンパク質の合成を強く阻害し。

タバコモザイクウィルスの透過も阻害する。しかしこの二つのタンパク質は９分 子量、トリプシンペプチド地図、および免疫特性で識別することができる。

５、アメリカヤマゴボウ　ウィルスタンパク　一５ＰＡＰ−３ＰＡＰ−Ｓは、ビ イ・アメリカーナから得られる第三番目の区別しうる。単一連鎖の、リポソーム 阻害タンパク質である。

このタンパク質は２分子量が約３０，０００ダルトンの単一のポリペプチド連鎖 である。このタンパク質は、ジエイムズ・ディ・アービン博士から提供され、公 表された方法（バービエリ）で調製されたものである。ＰＡＰ−１、ＰＡＰ−Ｉ Ｉ及び／またはＰＡＰ−Ｓは９本願明細書では、一般的に、“アメリカヤマゴボ ウ抗ウイルスタンパク質”と呼称する。

６、α−サルシン α−サルシンは１分子量が約１７，０００ダルトンである。真田の単一連鎖ポリ ペプチドである（サーク口）。このタンパク質は、アール・アミルス博士（叶、 　Ｒ，Ａｍ１ｌｓ）　（ＵｎｉｖｅｒｓｉｄａｄＡｕｔｏｎｏｍａ　ｄｅ　Ｍａ ｄｒｉｄ、スペイン、マドリード）から提供され。

公表された方法（オルスン、　１９６３ａ、　１９６５ｂ）によってアスペルギ ルス・ギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ　）から得 ることができるものである。概略を述べれば次のとおりである。エイ・ギガンテ ウスの醗酵物を、プレートとフレームプレスで濾過し、洗浄した抽出物を、　ｐ Ｈを７．０に平衡化したカルボン酸樹脂に吸収させた。これを１．５Ｍ　ＭＣＩ で溶離して。

α−サルシンの活性を有する二つのピークを得た。これらを濃縮して合わせ、活 性炭で処理していくつかの汚染タンパク質を除去した。粗物質を、さらに、　０ ．４？Ｉ−０，９？’ｌのリン酸緩衝液の匂配液を用いてカルボン酸イオン交換 樹脂で分画した。

α−サルシンが実質的に純粋なタンパク質として溶出した。

７、レストリフトシン レストリフトシンは、α−サルシンと同様に真菌の単一連鎖ポリペプチドであり １分子量が約１７，０００ダルトンである。

このタンパク質は、アール・アミルス博士から提供されたもので、公表された方 法（オールスン、　１９６３）で９アスベルギリス・レストリフラス（Ａｓｐｅ ｒｇｉｌｌｉｓ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）から得ることができる。

８、ミトギリン ミトギリンは９分子量が約１７．０００ダルトンの同族の真菌タンパク質である 。このタンパク質は、アール・アミルス博士から供給され、公表された方法（オ ールスン、　１９６６）によってアスペルギリス・レストリフラス（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｉｓ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）から得ることができる。

（以下余白） 夫差号± トリコサン乱乙ｑ裂遣 下記方法の全工程はすべて４℃で実施した。テ、イ・キリロウイの新鮮な根の塊 茎の皮を除き薄く切って小片にし、　ｐＨ１のノーマルセーライン（米国薬局方 の等張車塩水）　（０，７ｆ／ｋｇ）中でワーリングブレンダー（誓ａｒｉｎｇ 　ｂｌｅｎｄｅｒ）を用いて均一化した。得られたホモジネートをチーズクロス で濾過して破片を除去した。得られたエキスを、ＩＮＮＡＯ）ｌでｐｌ（８に調 整し。

２時間攪拌し２次いで一夜静置した。得られた懸濁液をｓ、ｏｏ。

ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上澄み液をＩ　ＮＮＡＯＨでｐＨ８に調 整した。１時間静置後、冷アセトン（０，８μｇｏｄ溶液）を添加した。重い沈 澱が生成し、混合物を３０分間攪拌した。

５．０００７μｍで１５分間遠心分離することによって、沈Ｂ（Ａｐｌ）を集め た。上澄み液に冷アセトンを加え（１，２μｇ／ｍＡ上澄み液）、２時間静置は 、沈降した物質（ＡＰ２　）を遠心分離することによって回収した。二つの画分 ＡＰＩとＡＰ２を最小容積のリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ　）中に懸濁させ、同じ緩 衝液に対してエクステンシブ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　）透析に付し、各画分の上 澄み液と沈澱を遠心分離で分離した。次に得られた沈澱をＰＢＳで再抽出し、遠 心分離し、得られた上澄み液を先に得た上澄み液と合して副画分Ｓを作製した。

一方沈澱については、再抽出後、副画分Ｐを作製した。このようにして両分ＡＰ Ｉから。

二つの副画分ＡＰＩＳとＡＰＩＰを得た。各種画分の収量は９次のとおりであっ た。すなわち１ｋｇの薄く切った塊茎から３．２ｇのＡＰＩＳと３．８ｇのＡＰ ２Ｓを得た。

画分ＡＰ２Ｓ　（１ｇ）を、約１０ｍｆの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，４ ）に溶解し、　ＣＭ−セファロースＣＬ−６８（ファーマシア社）のカラムに注 入した。このカラムは、予め０．０５Ｍリン酸緩衝液で平衡化したものを用いた が、最初の溶離は同じ緩衝液で行った。第３ビークＣ３（第１Ａ図）を溶離した 後、第１Ａ図に示すように、前記の同じ緩衝液による０〜０．３Ｍ　ＮａＣ１の 線形匂配液を注入した。Ｃ６と命名したタンパク質のピークを集め。

蒸留水に対して透析し、凍結乾燥して高度に精製されたトリコサンチンを得た。

トリコサンチンのＡＰ２Ｓからの平均の収量と回収率とは約１８０■（１８％） である。

画分ＡＰＩＳからも、さらにＤＥＡＥ−セファロースＣｌ−６Ｂカラムのクロマ トグラフィに付すことによって、高度に精製されたトリコサンチンが得られた。

ＡＰＩＳ　（１ｇ）を１４ｍ１の蒸留水に溶解した。０．ＩＭ　ＮａＣ１（ｐＨ ８，０）を含有する０、０２Ｍ　ＮＨ，）ＩＣＵ。

に対して透析した後、上記したのと同じ緩衝液で予め平衡化したＤＢＡＥ−セフ ァ０−スＣＬ−６８カラム（１，５Ｘ３２ｃｍ）に注入した。カラムクロマトグ ラフィを、室温にて７０ｍｆ／ｈの流速で行い、溶出液を１０ｄづつの画分に集 めた。カラムを、　０．１Ｍ　Ｎａｃｌ含有の出発時の緩衝液（０，０２Ｍ　Ｎ Ｈ４ＮＣ０，）の１００　ｉｆで洗浄し。

上記と同じ重炭酸緩衝液による０、２Ｍ　ＮａＣ１と０．５Ｍ　ＮａＣ１で。

段階的溶離を行った。溶離は、　２８０ｎｍの波長の吸光度で監視した。溶出液 を、４画分Ｄ１〜Ｄ４　（第１Ｂ図に示す）に集め。

透析して凍結乾燥した。ＡＰＩＳからのトリコサンチン濃縮両分Ｄ１の平均の収 量と回収率とは約１８５■（１８，５％）である。

トリコサンチン濃縮画分Ｄ１を、　ＡＰ２Ｓについて上記したのと類似の方法で 、　ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムを用いてさらに精製した。Ｐ６と命名 したタンパク質ピーク（第１Ａ図）を集め、−７０℃で保管するか、または蒸留 水に対して透析して凍結乾燥して高度に精製されたトリコサンチンを得た。ＤＩ 　（Ｉｇ）から得たトリコサンチンの平均の収量と回収率とは約４４５■（４４ ，５％）である。

ティ・キリロウイのスライスした新鮮な塊茎１ｋｇからのトリコサンチンの合計 した（ＡＰ２ＳとＤＩ）収量と回収率は約９００■（０，０９％）である。

モセルディ力・シャランチャの皮をむいて乾燥した成熟種子（１００ｇ）を、０ ．９％塩水中に（約４　ｍｌ／１ｇ　）　、　ワーリングブレンダーで均質化し 、チーズクロスで濾過した。濾液のｐＨを２８）ＩＣＩで４．０に調整し１次い で１２．００Ｏｒ　ｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み液（粗エキス）を、４ ℃でアセトン分画に付した。前記粗エキスに、　０．８Ｖ／Ｖの冷アセトン（− ２０℃）を。

常に攪拌しながら、徐々に添加し、得られた混合物を４℃で１時間保持し９次に ５．０００１ｐｍで１５分間遠心分離して沈澱（ＡＰＩ）を取出した。次いで上 澄み液に冷アセトン（−２０℃）を添加して最終濃度を２．　ＯＶ／νにした。

４℃で１時間静置後。

混合物を５．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離して沈澱（ＡＰＩＩ）を回収し、 これを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，４’Ｊに再懸濁させ。

同じ緩衝液に透析し２次いで同じ緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロースＣＬ− ６Ｂカラム（ファーマシャ社）に注入した。最初の溶離は、同じ緩衝液で行った 。第三のピークが溶出した後、第２Ａ図に示すように、同じ緩衝液によるＯ〜０ ．２Ｍ　ＮａＣ１の線形匂配液を注入した。また第２Ａ図は、このカラムの溶離 曲線を示すｅ　Ｃ５ｌ＋とＣ１と命名したタンパク質ピークを集めて９−７０° Ｃ貯蔵するか、または蒸留水に対して透析して凍結乾燥した。ＡＰＩＩからの平 均の収量と回収率は、Ｃｓｂ　（１３６■。

１７％）およびＣ６，（７６■、９．５％）である。

タンパク質画分Ｃｓｂ　（５０■）とＣｂ−（５０■）を、別々に２．５ｉのリ ン酸緩衝塩水（ＰＨ７，２）に溶解し、不溶解沈澱物を遠心分離で除去し１次に 同じ緩衝液で平衡化されたセファデックスＧ−１００（ファイン）カラム（ファ ーマシャ社）に注入し。

同じ緩衝液で溶離した。Ｃ５−Ｇｌ　（第２Ｂ図のピークＣ＋）およびＣ＆−Ｇ ｌ　（第２Ｃ図のピークＧｌ）と命名した主要タンパク質ピークを集めて、＝７ ０℃で保存するか、または蒸留水に対して透析し、凍結乾燥してα−モモルカリ ン（ＣＳ−Ｃ＋　）およびβ−モモルカリン（Ｃ５−Ｇｌ　）をそれぞれ得た＊ 　ＣａｂとＣ６ｍからの平均の収量と回収率とは、α−モモルカリン（３５■、 ７２％）およびβ−モモルカリン（３２■、６４％）である。

モルディ力・シャランチャの皮をむいて乾燥した種子１ｋｇからのα−モモルカ リンとβ−モモルカリンの収量と回収率は、それぞれ約８００■（０，０８％） と４００■（０，０４％）である。

ス新■引１ −）ＩＩＶ感次Ｔ６　における旧ｖ−７、に・するＴＣＳと聞Ｃ■羞！ ウィルス抗原の発現（病因として有意なエンベロープ抗原ｇｐ１２０およびｇｐ ４１の発現を含む）に対するＴＣＳとα−ＭＭＣの効果を評価するために、　Ｈ ＩＶ感染Ｈ９細胞を、熱で不活性化したウシ胎児血清を１０％補充したＲＰＭＩ −１６４０中に、　ＴＣＳもしくはα−ＭＭＣの０．３〜１．０Ｍｇ／戚の範囲 の濃度での存在下、　Ｏ，Ｓ　Ｘ１０’／ｄで接種し培養した。培地は、追加の ＴＣＳもしくはα−？ＩＭＣを含有する新しい培地で３〜５日毎に取替えて、指 定の濃度を保持した。いくつかの時点で２間接免疫蛍光分析法を用いて、細胞を 、　）ＩＩＶ抗原の発現について検定した。概略をのべると次のとおりである。

各検定法について、１×１０６の細胞を、１％旧−ＦＣＳを含有するリン酸緩衝 塩水（染色緩衝液）で洗浄した。次いで細胞を、予め特性を測定された旧Ｖ抗体 陽性もしくは陰性の血清の、染色緩衝液による１：５０希釈物とともに、４°Ｃ で４５分間培養した。洗浄後、結合した特異的抗体を、フルオレセイン抱合ヤギ 抗ヒトｆｇＧ試薬で検出した。

定量流動細胞計数法を、オルト・サイトフルオログラフ５０Ｈ（Ｏｒｔｈｏ　Ｃ ｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｆ　５０　Ｈ）で実施した。第３Ａ〜３Ｈ図は、培養 １６日目に実施した流動細胞計数法の試験結果を示す、第３Ａ図と３Ｂ図は、　 ＨＩＶ抗体陰性（３Ａ）および同抗体陽性（３Ｂ）の患者の血清が未感染Ｈ９細 胞との反応性を欠いていることを証明している。第３ｃ図と第３Ｄ図は、抗体陽 性の血清は旧Ｖ感染細胞と特異的反応性を示すが（３Ｄ）　、一方ＨＩＶ抗体陰 性の血清は反応しない（３Ｃ）を示す。抗体陰性血清は１０ＭｇｏｄのＴＣＳ　 （３Ｅ）もしくはα−ＭＭＣ（３Ｇ）で処理したＨＩＶ感染細胞とは反応しない 、抗体陽性血清は、　ＴＣＳで処理したＨＩＶ惑染細胞（３Ｆ）およびα−聞Ｃ で処理した旧Ｖ感染細胞（３Ｈ）とはバックグランドレベルの反応性しか示さず （約２％もしくはそれより少ない細胞がしきい値を超える蛍光を示す）、処理さ れた細胞にはウィルス抗原の発現が事実上ないことを示している。この劇的な現 象は、第３Ｄ図を第３Ｆ図および第３Ｈ図と比較すれば最もはっきりと分かる。

１隻斑土 ＨＩＶ　＊ｍｒ　ニおＬ　ルＨＩＶ　２４　ノニ＝　る５ｃＲＩＰ立泣来 ＶＢ細胞を、伝染性の細胞を含有していない旧Ｖウィルスを接種した５ｃＲＩＰ の所定の濃度のもので処理した。１０％の熱で不活性化したウシ胎児血清を補充 したＲＰＭＩ−１６４０中、　ＴＣＳ、α−聞Ｃ，ＰＡＰ−Ｉ　、　ＰＡＰ−ｎ 、　ＰＡＰ−Ｓ　、ミトギリン、レストリクトシンまたはα−サルシンの選択さ れた濃度を連続的に保持して、細胞を０．５　ＸＩＯ’／ｄ接種して培養した。

　５ｃＲＩＰの濃度は。

第４〜６図の縦座標に示した。

因（リフソン、１９８６ａ）の展開を観察した。細胞を含有しない上澄み液を取 出し、市販されているＥＬＩＳＡファーマットのＨＩｖ抗原検定法を用いて試験 し、　ＨＩＶ　ｐ２４コアタンパク質のレベルを測定することによってウィルス の複製を評価した。

第４図は、未処理の感染細胞が産生ずるｐ２４に対して、感染Ｔ細胞が産生ずる ｐ２４のレベルを、ＴＣＳ（白画角印と黒四角印）とα−ＭＭＣ（三角印）の増 大させた濃度の関数として示す。ＭＭＣとＴＣＳの両者の０．５〜１　ｐｇ／ｄ の５ｃＲＩＰ濃度で、ウィルス抗原の発現が本質的にかつ完全に阻害された。

第５図は、感染Ｔ細胞が産生ずる。ｐ２４のレベルを、第４図と同様に、ＰＡＰ −１（白画角印）　、　ＰＡＰ−ＩＩ　（三角印）およびＰＡＰ−Ｓ　（黒四角 印）の増大する濃度の関数として示す。得られた結果は、第４図の結果と似てい るが、同レベルの抗原阻害を行うにはいくぶん高い濃度のＰＡＰ　５ｃＲＩＰ化 合物を必要とする。

第６図は、感染Ｔ細胞が産生ずるｐ２４のレベルを、第４図および５図と同様に 、ミトギリン（白画角印）、レストリフトシン（三角印）、およびα−サルシン （黒四角印）の増大する濃度の関数として示す。これら三つの５ｃＲＩＰ化合物 はすべて、０．５μｇｏｄの濃度で実質的に完全にｐ２４を阻害した。

皇施斑ｌ 旧νの複製も、培養物の細胞の存在しない上澄み液の粒子会合逆転写酵素活性を 測定することによって評価した。感染細胞と未感染細胞を、接種して、上記のよ うに、いくつかの露してから２日後と５日後に、細胞の懸濁液を集め、　５００ 　Ｘｇで１０分間遠心分離してペレット化化した。次に上澄み液を４５．’００ ０ｇで１時間遠心分離し、逆転写酵素（ＲＴ）活性を１発表されている（ホフマ ン）のと同様にして測定した。

５日目に取出した上澄み液について得られた結果を、添加した５ｃＲＩＰの濃度 の関数としてプロットして第７図に示した。

未感染細胞（黒丸印）は、　ＲＴ活性を全く検出できなかった。

ＴＣＳ　（黒菱形印）および聞ｃ　（白画角印）処理によって、培養物中のウィ ルスの複製量が濃度によって顕著に減少するという結果が、細胞の存在しない培 養物の上澄み液中の粒子会合ＲＴ活性を測定することによって分かった。特に、 抗開Ｖ剤が効力を発揮する前の、処理後の最初の数時間に、産生された少量のウ ィルスを考慮しても、高濃度のＴＣＳで処理した場合、　ＲＴ活性は事実上全く 検出されなかった。

裏庭旦旦 ゛　マクロフ　−ジのＨＩＶ　＆ことｉ恣象Ａ、感染細胞の百分率 単球／マクロファージを上記のようにして単離して培養した。マクロファージ細 胞を旧Ｖに感染させるために、５〜１５日の培養後、遠心分離してペレット化し 、２μｇ／−のポリブレン含有のＰＢＳ中に再懸濁させ、３７°Ｃで３０分間加 温した。洗浄し遠心分離して、ペレット化した細胞を、１−当り、５×１０’マ クロフアージおよび５Ｘ１０’怒染性単位の濃度で、　ＨＩＶ−ＤＶ中に再懸濁 させた。細胞を、ウィルスと接触したままで一夜３７°Ｃで放置し９未結合のウ ィルスを洗浄して除き、細胞を、完全培地中に５Ｘ１０ｓ細胞／ｄで再懸濁させ た。

ＦＨＩＶ感染マクロファージの頻度を、報告されている次の方法（クロウ）：細 胞フルオログラフィ的な単一セル間接免疫蛍光法を用い、上記実施例４で概、略 述べたようにして測定した。第８図は、対照の（ＩＩＯＰＣ−２１＞抗体（Ａ） もしくは抗ｐ２４抗体（Ｂ）で標識した旧Ｖ感染細胞に対する蛍光レベルの関数 として細胞カウント数をプロットしたものである。このデータは、感染マクロフ ァージの細胞の約６０％が、生体外で感染してから１０日後に抗ｐ２４抗体と反 応性になることを示している。約４０〜６０％が感染した細胞が、他のドナー由 来の細胞によって常に得られた。

Ｂ、長期間の細胞生存率 ＨＩＶ感染マクロファージが、長期間の培養に生き残り続けるか否かを決定する ために、細胞を、数週間にわたってｐ２４抗原の発現について試験した。二つの 異なるドナー由来の感染マクロファージ細胞におけるｐ２４２４抗原間による経 過（白丸印と三角印）をプロットして第９図に示す。図から分かるように、ｐ２ ４抗原の発現は、感染（時間ゼロ）に続く最初の２週間に急速に増大し、少なく とも約４週間は比較的高いレベルが続く。二つのドナー由来の感染細胞の生存率 （第７図の黒丸印と黒三角印）（トリバンプルー排除法を用いて試験した。感染 細胞は、４週間培養にわたって生存率が殆んど減少していない。試験期間中、感 染細胞には、細胞変性効果は全く観察されなかった。

災施廻ユ ＨＩＶ感＾　マクロファージにお番るＨＩＶ　２４　”１３、に・するＴＣＳお よびＭＭＣＯ六 Ａ、　ｐ２４　ＨＩＶ抗原発現の阻害 前記のように調製した培養マクロファージを７日間培養を続け１次いで、最終濃 度５μｇ／１ｕｆｔのＴＣＳもしくはＭＭＣに暴露した。医薬を添加してから４ 日後、抗ｐ２４抗体による間接免疫蛍光法を用い、上記のようにして、細胞のｐ ２４２４抗原験した。第１０図は、細胞フルオログラフィ曲線であり、（Ａ）は 対照細胞（未感染）、（Ｂ）は医薬に暴露されていない感染細胞、（Ｃ）は感染 細胞のＴＣＳで処理されたものおよび（Ｄ）は感染細胞のＭＭＣで処理されたも のである。図から分かるように。

いずれの医薬による４日間の処理よっても、感染細胞におけるｐ２４の発現がほ ぼバッグランドのレベルまで低下している。

第１１図は、　ＨＩＶ感染単球／マクロファージにおけるｐ２４２４抗原が、　 ＴＣＳによって同様に阻害されることを示している。

この場合、培養ゼロ日（黒丸印）または培養４日後（黒画角印）に、０．３μｇ ／ａｔ！ＴＣ３に暴露した０図から分かるように。

ゼロ時点でＴＣＳが存在すると、細胞における旧Ｖ抗原ｐ２４の発現が防止され 、またＴＣＳは、細胞をこれに暴露してから４日後に既存のｐ２４のレベルをほ ぼゼロに減少させた。

Ｂ、ＴＣＳとＭＭＣの作用の時間経過 旧■感染マクロファージの培養物を、上記のＡ項と同様にして５μｇ／ｄｌのＴ ＣＳもしくはＭＭＣで処理した。薬剤を添加してから１日後と４日後に、上記の 間接免疫蛍光法によってｐ２４抗原の発現について試験した。第１２図にプロッ トしたデータは、ｐ２４２４抗原の阻害の約２７３が、ＴＣＳ（白玉角印）とＭ ＭＣ（白丸印）の両者について処理後２４時間以内に起こっていることを示して いる。上記と同様にして測定したＲＴ活性も、いずれの薬剤で処理した場合でも 、細胞内で２４時間後に著しく低下した。４日までにｐ２４の発現とＲＴ活性は バックグランドレベルまで低下したが、一方未処理の旧Ｖ感染細胞は、ｐ２４２ ４抗原く低下せず（第１１図における黒丸印）、またＲＴ活性も全く低下しなか った。トリバンブルー排除試験法で測定した細胞生存率は２両薬剤のいずれかに よる処理後の４日間で約６０〜７０％減少した。

Ｃ，ＴＣＳとＭＭＣに対する投与量の反応ＴＣ５もしくはＭＭＣを、０．５また は５μｇｏｄの投与レベルで感染細胞の培養物に添加した。上記したのと同様に して１選択した薬剤を添加してから４日後にｐ２４の発現を測定した。

結果は第１３図にプロットしである。図から分かるように９両方の薬剤濃度によ って、ＴＣＳ（三角印）もしくはＭＭＣ（白丸印）を添加して４日後に、ｐ２４ ２４抗原ぼ完全に阻害された。

低濃度の５ｃＲＩＰに対する感染細胞の反応を測定するために。

感染細胞をｏ、ｏｏｓ〜５μｇ／ｄｌの範囲の濃度の聞Ｃに３時間暴露した０次 に洗浄してＭＭＣを除去し、　５ｃＲＩＰに最初暴露してから４日後にｐ２４２ ４抗原害について試験した。結果を第１４図に示す。旧Ｖ抗原発現の阻害は、　 ０．００５μｇ／ｄの濃度でも８０％を超える大きなものであった。

Ｄ、旧Ｖ抗原発現の選択的阻害 生体外でＴＣＳによって仲介される旧Ｖ　ｐ２４抗原の発現の阻害が旧Ｖタンパ ク質に対して特異的なものであるか否かを試験するために、慢性的に感染したマ クロファージを用いる。

標準旧Ｖ阻害検定法を実施した。この実験では、　１．５　ＸＩＯ’／ウェルの マクロファージを、５ナノグラムノｄ〜５μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度のＴＣ Ｓで３時間処理し、その時に遊離のＴＣＳは洗浄して培養物から除去した。処理 した細胞と、対照の細胞を４日後に評価した。以前の実験で示したように、　Ｈ ＩＶに感染したマクロファージをＴＣＳでパルス処理すると、　ＴＣＳの濃度が ５０ナノグラム／ｉであってもｐ２４タンパク質の発現のレベルが著しく減少す る。この試験では、　ＴＣＳに対する暴露の、細胞タンパク質の発現および特異 的な細胞抗原、　ＨＬＡ−ＤＲに対する効果も試験した。

ＨＬＡ−ＤＲは、約４５０フルオレセイン単位／細胞によって、　ＨＩＶ感染マ クロファージの表面に９通常検出される（直接フルオレセインで指標した抗−Ｄ Ｒモノクローナル抗体を染色試薬として用いる）　、ＴＣＳで処理した場合、　 ＨＩＶ感染マクロファージの表面のＤＲの量が実質的に低下するということは全 く検知されなかった。５μｇ／ｒｔｒｌの濃度のＴＣＳで処理しても、細胞表面 のＤＲ抗原の量が明らかに減少することは検知されず、他方。

ＨＩＶ　９２４は、平均試験で、７０％以上も減少し、また５０ｍｇ／−で、４ ０％阻害という測定可能な抗開Ｖ　Ｐ２４効果が検知された。

同様にＴＣＳで処理した平行培養物を、　ＴＣＳに暴露して、から４日後に、　 ３Ｂ−ロイシン（２０μＣｉ／ｍ）で３時間パルスし、タンパク質に取込まれた 放射能を、　ＴＣＡ抗Ａ沈澱法定した。ＴＣＳの投与量のいかんにかかわらず、 　３Ｈ−ロイシン取込みの阻害は全くみられなかった。

災施旦旦 ＴＣＳおよびＭＭＣによる旧ｖ座汎Ｔ　の　のＡ、３Ｈ−チミジンの細胞による 取込み上記したのと同じ、未感染Ｈ９Ｔ細胞もしくは慢性的に旧νに感染した細 胞を、９６ウエルのプレートに接種した（最終全容量が２００μ！の、熱で不活 性化したウシ胎児血清１０％（Ｖ／Ｖ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中、　２ ．５　ＸＩＯ’細胞／ウェル）　、　ＴＣＳもしくは間Ｃを加えて、最終濃度を ０．０１〜１μｇ／ｒｒｔｆｌの範囲とする。５〜７％のＣＯｚを供給されてい る加温インキュベーター内で３７°Ｃで３日間培養した後は、培養物に、１μＣ ｉ／ウエルの３Ｈ−チミジンを１２時間パルスした。１２時間パルスした後。

上記プレートのウェルを蒸留水で洗浄することによって培養物をガラス繊維のフ ィルター上に取出し、そのフィルターを。

液体シンチレーション計数法で計数した。試験化合物を含有しない陽性の調節物 に対する。放射能で標識した取込みの阻害百分率として、データを示した。

ＴＣＳに暴露して得たデータを、非感染細胞（Ｈ９）と旧Ｖ感染細胞（Ｉ（９， ＨＩＶ　”）について第１５図に示す。各曲線と５０％阻害ラインとの交点に対 応する丁ＣＳ濃度が、細胞増殖を５０％阻害するのに有効なＴＣＳ濃度を示し、 これはＤＮＡへのチミジンの取込みの５０％阻害で証明される。未感染細胞と旧 Ｖ感染細胞との５０％を阻害するのに要するＴＣＳ濃度の比率を選択性指数と定 義するが、　ＴＣＳについては、この阻害剤が連続的に存在する場合、約５０〜 ６０である。すなわち、未感染細胞に、　ＨＴＶ感染Ｔ細胞に匹敵するレベルの 阻害を起こさせるためには。

はぼ５０〜６０倍ものＴＣＳが必要なのである。同様の選択性指数力＜ＭＭＣに も観察された。これらの選択性指数は、　５ｃＲＩＰを連続的に存在させること によって得た。一層大きな選択性は。

前記のように、パルス暴露の場合に観察された。未怒染丁細胞と感染Ｔ細胞への ３Ｈ−ロイシンの取込みについての選択性指数は、　ＴＣＳとＭＭＣの両方の処 理について類似の値が得られた。

Ｂ、ＴＣＳと聞Ｃへの暴露時間 未感染Ｈ９Ｔ細胞もしくは旧Ｖに慢性的に感染している細胞を、２μｇ／ｄのＴ ＣＳもしくはＭｌ’ｌＣで処理した。暴露の種々の時点（５，１５，３０，６０ ，１２０分）で、処理された細胞の一部を洗浄して遊離のＴＣＳとＭＭＣを除去 し、得られた細胞を、上記のように９６ウエルのマイクロタイタープレートに、 　２．５　ｘ１０４細胞／ウェルで接種した。細胞を３日間培養し２次いで１２ 時間、１μＣｉ／ウエルの３Ｈ−チミジンでパルスした。１２時間のパルスの後 、培養物を取出した。細胞ＤＮＡ内への３Ｈ−チミジンの取込み量を上記と同様 にシンチレーション計数法で測定した。試験化合物を含有していない陽性調節物 質に対する放射能標識の取込み阻害の百分率でデータを示す。

ＴＣＳとＭＭＣの暴露について得られたデータは、それぞれ第１６Ａ図と１６Ｂ 図にプロットして示す。図がら分かるように。

ＴＣＳもしくはＭＭＣに１時間もしくはそれ以上暴露すると、感染細胞の細胞増 殖は５０％以上も阻害されるが、一方未感染細胞は、　５ｃＲＩＰを添加して２ 時間暴露しても有意な阻害は全くみとめられなかった。このように、阻害剤に対 する暴露を限定した場合には（連続的ではなく）、）ＩＩＶ惑染感染の細胞増殖 の選択的阻害（第８Ａ図）はさらに促進される。

Ｃ０細胞の増殖と生存率に対する効果 細胞の増殖と生存率を、抗開Ｖ剤を添加してから２日後と５日後に評価した。細 胞の計数は血球計数器を用いて行い。

生存率はトリバンブルー排除法で測定した。第１７Ａ図と１７Ｂ図に示すように 、　ＴＣＳとＭＭＣで処理した場合、２日後と５日後の両方とも、細胞増殖の阻 害が濃度依存性で（生育力のある細胞／−の絶対カウント）あり、また旧Ｖ感染 細胞の増殖の阻害が優先する結果が得られた。第１７Ｃ図が、処理した培養物中 の生育力のある細胞の百分率が、濃度の増加につれて減少することを示している 。このように細胞の増殖と生存率は、殺細胞機構（生育力のある細胞の百分率を 減少させる）と静細胞機構（絶対細胞カウントを減少させかつ生育力のある細胞 の百分率を低下させる）の両方で損われるようである。

ス財ｌ１ｌ ）ＩＩＶ　；”Ｔ却ａ　Ｑ”Ｔ’　の　声　に・するｓｃＲＩＰｍ展 未感染Ｔ細胞と旧ν感染Ｔ細胞の細胞増殖に対するいくつかの選択された５ｃＲ ＩＰ化合物の効果を、実質的に、実施例８Ａに記載の放射能標識取込み法によっ て試験した。具体的に述べると次のとおりである。細胞を９６ウエルのプレート に接種し９選択された濃度の、試験される５ｃＲＩＰに、３日の培養期間、暴露 した。次いで細胞を３Ｈ−チミジンまたは３Ｈ−ロイシンに、１μＣｉ／ウエル の放射能標識濃度で１２時間暴露し。

次に細胞を取出し、取込まれた放射能標識をカウントした。

上記のように、データは、試験化合物を含有していない陽性調節物質に対する。

放射能標識取込み阻害の百分率として示す。

第１８Ａ図は、　ＰＡＰ−１による処理による。細胞増殖の選択的阻害を示し、 これは、非感染Ｔ細胞と旧Ｖ感染Ｔ細胞のチミジンの取込みによって測定したも のである。前記の定義の選択性指数は５０〜６０である。第１８Ｂ図は、感染Ｔ 細胞と未感染Ｔ細胞へのロイシン取込みの、ＰＡＰ−Ｉによる類似の選択的阻害 を示す。第１９図は、ＰＡＰ−ｎに暴露された。感染Ｔ細胞と未感染Ｔ細胞のチ ミジン取込みについて、類似の結果を示している。

第２０−２２図は、ミトギリン（第２０図）、レストリフトシン（第２１図）お らびα−サルシン（第２２図）に暴露した感染細胞と未感染細胞へのチミジン取 込みの阻害を同様にしてプロットしている。各場合、　）ＩＩＶ惑染感染へのチ ミジン取込みの５０％阻害が、約０．０５μｇ／ｄの５ｃＲＩＰ濃度で起こり９ 選択性指数は約１００であった。

！施拠刊 ＨＴＬＶ−１ニｑ？’したＴ’　０Ｉｉｌ　（７）　ＴＣＳ＆ＭＭＣ４１：ｅＥ ｉ里！ Ａ、３Ｈ−チミジンの細胞による取込み）ＩＴＬシー■に感染したプロデュサー 細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌ　）系Ｃ９１／ＰＣを、グレゴリイ・レイズ 博士（Ｄｒ、　Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｒｅｙｅｓ）［Ｇｅｎｅｌａｂｓ　Ｉｎｃｏｒ ｐｏｒａｔｅｄ　（米国、カリフォルニア州、レッドウッド）］から入手した。

いずれの公知のレトロウィルスにも感染していない連続的細胞系のＨ９細胞は、 陰性の調節物質細胞系として適切なものであった。

未怒染の８９Ｔ細胞もしくは慢性的にＨＴＬＶ−１に感染したＣ９１／ＰＣ細胞 を、実施例７Ａと同様にして９６ウエルプレートに接種した。ＴＣＳ　、　ＭＭ Ｃもしくはミトギリンを添加して最終濃度を０．０５〜５μｇ／ｍｌとした。５ 〜７％ｃｏ２が供給されている加湿器付きインキュベーター内で、３７℃で３日 間培養した後、１μＣｉ／ウエルの３Ｈ−チミジンで１２時間パルスした。上記 の１２時間のパルスの後、培養物をガラス繊維フィルター上に取出し、細胞ＤＮ Ａに取込まれたチミジンを前記したのと同様にして測定した。試験化合物を含有 しない陽性調節物に対する。

放射能取込みの阻害百分率としてデータを示した。

未感染細胞（Ｈ９）とＨＴＬＶ−１ニ感染した（Ｃ９１／ＰＬ）細胞ニついて、 　ＴＣＳ暴露によって得られたデータをプロットして第２３Ａ図に示す。図から 分かるように、チミジン取込みを測定したが、　ＴＣＳの濃度のいかんにかかわ らず、感染細胞と未感染細胞間には、細胞増殖に有意な差はない。ＴＣＳの濃度 を上昇させると細胞増殖の非選択的な阻害がみとめられた。

類似の結果が、ＭＭＣ（第２３Ｂ図）とミトギリン（第２３Ｃ図）に得られ、　 ＨＴＬＶ−１に感染した細胞に対して選択的阻害効果を全く示さず、またいずれ の５ｃＲＩＰも濃度を増大させると細胞増殖の非選択的増加を示している。

この発明は、特定の実施例、用途および方法について述べたが２種々の改変を、 この発明から逸脱することな〈実施することができることは認識されるであろう 。

ＦＩＧ、　８Ａ　ＦＩＧ、　８Ｂ ＦＩＧ、　ＩＱ Ｔｅ３　（弓／ｍ１） Ｔｅ３　（ｕｇ／ｍＤ ＰＡＰ−ＩＩ儂戻（ｕｇ／ｍｌ） 国際調査報告 −１”１１＾−”””’　ｐｃ’ｒル５８Ｂ１０１７９４５１頁の続き 優先！主張６１９８８年４月８日［相］米国（Ｕ　Ｓ　）＠１７９，２７４醗　 明　者　マクグラス、マイケル、ニス、　アメリカ合衆国　夕少発　明　者　イ ヨン、ヒンーウイン　香港　コールーン。

９発　明　者　ホ　ワ　ン、　コ　−　アメリカ合衆国　フラジ　コート　２２ ０ り出　願　人　ザ　リージエンツ　オブ　ザ　アメリカ合衆国　クユニバーシテ ィ　オブ　カリフ　ン　ストリート　２オルニア 特表千２−５００４３７　（２５） カリフォルニア　９４０１０　バーリンガム、ベニト、２エフ、ウォータールー 　ロード　６９ジ−カリフォルニア　９４５２６　ダンビル、スタンブリカリフ ォルニア　９４７２０　バークレイ、アゾイソ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．単一連鎖でリボソーム不活性化性のタンパク質の，ＨＩＶ感染症治療用医薬 を製造する用途。
2. ２．前記の不活性化性タンパク質が，トリコサンチン，モモルカリン，アメリカ ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質，α−サルシン，ミトギリンおよびレストリク トシンからなる群から選ばれる請求項１記載の用途。
3. ３．前記不活性化性タンパク質がＮ−グリコシダーゼ活性を有する請求項１記載 の用途。
4. ４．前記不活性化性タンパク質が，トリコサンチンおよびモモルカリンからなる 群から選択される請求項１記載の用途。
5. ５．単一連鎖でリボソーム不活性化性のタンパク質の，ＨＩＶ感染症を治療する 用途。
6. ６．前記不活性化性タンパク質が，トリコサンチン，モモルカリン，アメリカヤ マゴボウ抗ウイルスタンパク質，α−サルシン，ミトギリンおよびレストリクト シンからなる群から選択される請求項５記載の用途。
7. ７．前記の不活性化性タンパク質が，Ｎ−グリコシダーゼ活性を有する請求項５ 記載の用途。
8. ８．前記不活性化性タンパク質が，トリコサンチンおよびモモルカリンからなる 群から選択される請求項５記載の用途。
9. ９．感染細胞を，単一連鎖でリボソーム不活性化性のタンパク質に，ＨＩＶ感染 Ｔ細胞の生存率を未感染Ｔ細胞に対して選択的に低下させるのに有効な前記不活 性化性タンパク質の濃度で暴露させることを包含する，ＨＩＶ感染Ｔ細胞の細胞 増殖を選択的に阻害する方法。
10. １０．前記不活性化性タンパク質が，トリコサンチン，モモルカリン，アメリカ ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質，α−サルシン，ミトギリンおよびレストリク トシンからなる群から選択される請求項９記載の方法。
11. １１．前記不活性化性タンパク質がＮ−グリコシダーゼ活性を有する請求項９記 載の方法。
12. １２．感染細胞を，Ｎ−グリコシダーゼ活性を有する単一連鎖でリボソーム不活 性化性のタンパク質に，感染細胞中の選択された細胞抗原に対する選択されたＨ ＩＶ抗原の比率を減少させるのに有効な，前記不活性化性タンパク質の濃度と期 間とで暴露させることを包含する，ＨＩＶに感染した単核食細胞系細胞における ＨＩＶ抗原の発現を選択的に阻害する方法。
13. １３．感染細胞を，トリコサンチンとモモルカリンとからなる群から選択された 単一連鎖でリボソーム不活性化性のタンパク質に，感染細胞中の選択された細胞 抗原に対する選択されたＨＩＶ抗原の比率を減少させるのに有効な，前記不活性 化性タンパク質の濃度と期間とで暴露させることを包含する，ＨＩＶに感染した 単核食細胞系細胞におけるＨＩＶ抗原の発現を選択的に阻害する方法。
14. １４．ヒトの患者に単一連鎖でリボソーム不活性化性のタンパク質を，ＨＩＶ感 染症の下記指標： （ａＨＩＶ感染Ｔ細胞に関連のＨＩＶ抗原のレベル；（５）血流中のＨＩＶ抗原 のレベル； （ｃ）ＨＩＶ感染Ｔ細胞に関連の逆転写酵素活性；および（ｄ）未感染Ｔ細胞に 対するＨＩＶ感染Ｔ細胞の生存率の比率，の少なくとも一つを測定可能に低下さ せるのに有効な投与量で投与することを包含する，ＨＩＶに感染したヒトの患者 を治療する方法。
15. １５．前記の指標の低下が，前記投与を行ってから１〜５日以内に測定可能にな る請求項１４記載の方法。
16. １６．代わりに，前記指標の少なくとも一つが低下するのを測定し，次いでＨＩ Ｖ感染症の測定された指標がもはや低下しなくなるまで前記投与を繰返すことを さらに含む請求項１４記載の方法。
17. １７．前記リボソーム不活性化性タンパク質を，ＨＩＶ感染Ｔ細胞に関連のＨＩ Ｖ抗原の発現を阻害するのに有効な投与量で非経口で投与する請求項１４記載の 方法。
18. １８．前記の不活性化性タンパク質が，トリコサンチン，モモルカリン，アメリ カヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質，α−サルシン，ミトギリンおよびレストリ クトシンからなる群から選択される請求項１４記載の方法。
19. １９．前記不活性化性タンパク質がＮ−グリコシダーゼ活性を有し，そして前記 指標としてさらに，ＨＩＶに感染した単核食細胞系細胞における選択された細胞 抗原に対する選択されたＨＩＶ抗原の比率が測定可能に低下することが含まれる 請求項１４記載の方法。
20. ２０．前記不活性化性タンパク質がトリコサンチンとモモルカリンからなる群か ら選択され，そして前記指標としてさらに，ＨＩＶに感染した単核食細胞系細胞 における選択された細胞抗原に対する選択されたＨＩＶ抗原の比率が測定可能に 低下することが含まれる請求項１４記載の方法。