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FR2731355A1 - Nouveaux immunogenes, nouveaux anticorps, procede de preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant - Google Patents

Nouveaux immunogenes, nouveaux anticorps, procede de preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant Download PDF

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FR2731355A1
FR2731355A1 FR9502708A FR9502708A FR2731355A1 FR 2731355 A1 FR2731355 A1 FR 2731355A1 FR 9502708 A FR9502708 A FR 9502708A FR 9502708 A FR9502708 A FR 9502708A FR 2731355 A1 FR2731355 A1 FR 2731355A1
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tat
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Neovacs SA
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Neovacs SA
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Abstract

Composé immunogène caractérisé en ce qu'il dérive d'une protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2, par traitement chimique, physique, génétique ou immunologique bien connu de l'état de la technique, tout en étant reconnu par des anticorps dirigés contre ladite protéine de régulation native, tout en conservant des propriétés immunogènes suffisantes pour créer des anticorps neutralisant ladite protéine native ou bloquant ses effets et tout en ayant perdu au moins 50% de ses propriétés biologiques toxiques, procédé de préparation et applications.

Description

La présente invention concerne de nouveaux immunogènes, de nouveaux anticorps obtenus par utilisation de ces immunogènes, leur procédé de préparation et des compositions pharmaceutiques les renfermant.
La molécule tat est une protéine de régulation du VIH que l'on ne trouve pas dans la particule virale mais qui est codée par le génome du VIH-1.
A l'intérieur des cellules infectées, cette protéine codée par l'ADN proviral joue un rôle transactivateur de gènes viraux ou cellulaires. Cette protéine de régulation génétique peut cependant se trouver également à l'extérieur des cellules dans le milieu circulant extracellulaire, excrétée au sein de débris de cellules mortes à l'état natif ou fragmentaire ou par processus de sécrétion. Sa présence dans le milieu circulant explique l'existence d'anticorps anti-tat détectables chez certains sujets séropositifs. Dans ce contexte extracellulaire du tat le segment C terminal porteur des résidus RGD reconnus par les intégrines de surface cellulaire et la région basique de la molécule (résidus 45 - 70) vont lui permettre, comme le font les toxines bactériennes, d'agir sur les cellules non infectées de différents tissus.Ainsi la protéine tat circulante agissant comme une véritable toxine virale, peut exercer des effets nocifs sur les cellules endothéliales et en association avec le facteur de croissance
BFGF, contribuer à la néoangiogenèse du Sarcome de Kaposi caractérisant la maladie Sida. La protéine tat circulante peut également aggraver l'immunosuppression qui s'installe progressivement dans le Sida, soit par action immunosuppressive directe sur les cellules T soit en contribuant à dérégler la production d'lFNa par les cellules présentant d'antigène, appelées
APC (macrophages ou cellules dendritiques).
Le syndrome d'immunodéficience acquise (Sida) est cliniquement défini par une immunosuppression, responsable des infections opportunistes ou par le Sarcome de Kaposi. L'immunosuppression acquise, d'installation progressive au cours de l'infection VIH, se manifeste biologiquement par la perte de réactivité immunologique des cellules T (cytostase et la diminution de production de l'IL2) après stimulation en premier lieu par les antigènes de rappel, puis par les alloantigènes et enfin par les mitogènes (PHA). Cette immunosuppression est associée à la surproduction des interférons a et y (IFNa et y).
Les mécanismes cytopathogènes qui induisent l'immunosuppression sont complexes et font intervenir différents facteurs d'origine virale agissant soit directement sur les cellules de l'immunité, lymphocytes T et APC, soit indirectement via le réseau des cytokines. Ainsi la protéine d'enveloppe gp120 portée par la particule de VIH-1 et dont la présence extracellulaire est mesurée par la charge virale sérique peut induire directement l'anergie de cellules T de phénotype CD4. De leur côté les protéines de régulation du VIH, notamment le tat dans sa configuration extracellulaire de toxine virale circulante, semblent également induire une immunosuppression directe des cellules T ou d'autres effets pathogènes, du fait par exemple qu'in vitro les cellules T activées par un antigène de rappel ou par des anticorps anti CD3 ne prolifèrent plus en présence de la molécule tat.
En outre la protéine tat circulante semble faciliter la surproduction par les APC d'lFNa, cytokine cytostatique et apoptogène susceptible d'amplifier l'immunosuppression et l'apoptose observés dans la maladie Sida. En effet la sécrétion d'lFNa (interféron a) par les macrophages ne semble plus, en présence de tat arrêtée par une rétrorégulation (feedback) qui à l'état normal contrôle cette production d'lFNa (période réfractaire).
Le Sarcome de Kaposi se manifeste diniquement par l'apparition de nodules vasculaires représentant une néoangiogenèse constituée à partir de cellules endothéliales. Ces cellules inactivées par des processus inflammatoires engendrant la production de cytokines (IFNy, IL1 et lL6) produisent du BFGF (Basic Fibroblastic Growth Factor) et se multiplient. La prolifération des cellules endothéliales activées in vitro est augmentée par la présence dans le milieu de la protéine tat. Les anticorps anti-tat bloquent in vitro les effets prolifératifs de la protéine tat. L'action du tat sur les cellules endothéliales porteuses à leur surface d'adhésine de la famille des Intégrines s'explique par la présence de la séquence RGD reconnue par ces molécules.
La néoangiogenèse qui sous-tend in vivo le sarcome de Kaposi serait donc favorisée par la protéine de régulation tat dans sa configuration extracellulaire, qui pourrait être reconnue, grâce à son fragment C terminal contenant la séquence RGD, par les intégrines des cellules endothéliales. De plus le tat pourra également agir par sa région basique riche en résidus K et R, et par conséquent susceptible de se lier à l'héparine sulfate de la matrice extracellulaire qui concentre le facteur de croissance BFGF. Ainsi la prolifération des cellules endothéliales induite par les facteurs de croissance est accrue par la présence de tat et engendre la néoangiogenèse. Cet effet sur la croissance des cellules endothéliales est réduit in vitro par l'action d'anticorps anti-tat.
II apparaît donc souhaitable de bloquer l'activité nocive des protéines de régulation des rétrovirus, notamment du tat circulant dans les milieux extracellulaires (sang, lymphe, milieux interstitiels...), véritables toxines virales.
Or, on a trouvé avec étonnement que, tout comme les toxines bactériennes (tétanique, diphtérique ou botulique) dont l'activité toxique est neutralisée par des anticorps spécifiques, les effets nocifs des protéines virales de régulation et notamment du tat véritable toxine du VIH dans sa configuration extracellulaire - qu'ils s'exercent par l'immunosuppression des cellules T, par le dérèglement de la production de l'lFNa (interféron a) par les
APC ou par la néoangiogenèse qui sous-tend le Sarcome de Kaposi - sont abolis en présence d'anticorps spécifiques anti-tat, comme on le verra ciaprès dans la partie expérimentale.
II en est de même avec d'autres protéines de régulation de virus tels que VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2. II serait donc souhaitable de disposer d'immunogènes capables de produire de tels anticorps, de même que disposer de tels anticorps, à des fins tant curatives que préventives.
C'est pourquoi la présente demande a pour objet des composés immunogènes, caractérisés en ce qu'ils dérivent d'une protéine de régulation d'un virus VI H-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2, par traitement chimique, physique, génétique ou immunologique, bien connu de l'état de la technique, tout en étant reconnus par des anticorps dirigés contre ladite de protéine de régulation, tout en conservant des propriétés immunogènes suffisantes pour créer des anticorps neutralisant ou bloquant ladite protéine native et tout en ayant perdu au moins 50 % des propriétés biologiques toxiques de ladite protéine native.
Un traitement chimique peut être par exemple le couplage à une protéine porteuse activée par un pré-traitement à l'aide d'un aldéhyde, de préférence le glutaraldéhyde.
Un traitement physique peut être par exemple une irradiation et tout particulièrement une irradiation U.V.
Un traitement immunologique peut être par exemple la formation d'un complexe immun entre le composé immunogène et un anticorps spécifique. Un traitement génétique peut être par exemple la préparation d'un peptide identique ou similaire à une séquence peptidique d'une protéine de régulation, telle que la protéine tat, par recombinaison génétique.
Un peptide ayant une séquence identique ou similaire à une séquence peptidique d'une protéine de régulation, telle que le tat peut aussi être obtenu par synthèse peptidique conventionnelle sur résine.
Tous ces procédés sont bien connus par l'état de la technique.
Afin de vérifier que la protéine de régulation modifiée est bien reconnue par des anticorps dirigés contre ladite protéine de régulation native, on peut par exemple vérifier immunologiquement par Elisa en présence d'anticorps spécifiques, la formation de complexes antigènes-anticorps comme on le verra ci-après dans la partie expérimentale.
Afin de déterminer si les propriétés immunogènes de la protéine de régulation ont été suffisamment conservées pour créer des anticorps neutralisant ladite protéine native, on peut par exemple immuniser des mammifères (lapins, rats, souris) à l'aide d'un composé immunogène selon l'invention et vérifier que les anticorps produits neutralisent les activités toxiques du tat.
Afin de déterminer si la protéine de régulation modifiée a perdu au moins de 50% de ses propriétés biologiques toxiques, on peut par exemple etudier l'effet du tat inactivé sur l'immunosuppression des cellules T ou sur la néoangiogénèse.
L'inactivation de la protéine de régulation tat est vérifiée par exemple par le Tat Rescue Assai utilisant un mutant de HIV non infectieux tat déficient cultivé sur la lignée cellulaire HLM-I dont la réplication dépend d'un apport exogène de tat natif.
Le composé immunogène peut dériver d'une quelconque des protéines de régulation des virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et notamment nef, rev et de préférence tat des virus VIH-1 et VIH-2.
On peut aussi citer la protéine tax de HTLV-1 ou HTLV-2.
On peut citer également tout particulièrement le peptide
HQVSLSKQPTSQPRGD.
Par dérivent ou dériver d'une protéine de régulation d'un virus VIH1, VIH2, HTLV1 ou HTLV2, I'on entend que le composé immunogène peut être constitué de la totalité ou d'un fragment de la protéine de régulation et peut comporter une ou plusieurs modifications dans les acides aminés de cette protéine ou fragment telles que des délétions, substitutions, additions, ou fonctionnalisations telles qu'acylation d'acides aminés, dans la mesure où ces modifications restent dans le cadre précisé ci-dessus (absence de toxicité, caractères immunologiques).Par exemple, en général le remplacement d'un reste leucine par un reste isoleucine ne modifie pas de telles propriétés, les modifications doivent généralement concemer moins de 30 % d'acides aminés, de préférence moins de 20 % et tout particulièrement moins de 10 %. Un fragment peut comporter de 8 à 60 acides aminés par exemple et de préférence de 12 à 40 acides aminés. On peut citer par exemple les résidus 65-80 en C terminal du tat de VlH-I, un tel résidu peut comporter aussi du ou des côtés C ou N terminal de 1 à 5 acides aminés supplémentaires.
De manière générale, en ce qui conceme les modifications,
I'homologie ou la similitude entre l'immunogène modifié et la protéine ou partie de protéine native, ainsi que les dimensions du composé immunogène, de même que les modalités d'utilisation, ou de couplage du composé immunogène selon l'invention à une protéine immunogène telle que le toxolde tétanique, on peut en particulier se référer à WO-A 86/06 414 ou à EP-A-0.220.273 ou encore à PCT/US.86/00831, équivalents, dont l'enseignement est incorporé ici par référence.
Les composés immunogènes selon l'invention dérivant de protéines de régulation seront appelées ci-après dans la partie expérimentale toxoldes viraux .
En effet, tout comme les toxoides bactériens classiques, ils sont dépourvus de toxicité propre, mais sont cependant capables de provoquer une immunisation par administration chez un sujet.
Les composés immunogènes selon l'invention peuvent être utilisés comme suit:
On administre à un patient un composé immunogène selon la présente invention, par exemple par voie sous-cutanée ou intramusculaire, en quantité suffisante pour être efficace sur le plan thérapeutique, à un sujet ayant besoin d'un tel traitement. La dose administrée peut aller par exemple de 100 à 1000 pg par voie souscutanée, une fois par mois pendant trois mois, puis périodiquement en fonction du taux des anticorps sériques induits, par exemple tous les 2-6 mois.
Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire, par voie intraveineuse ou par voie orale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain intervalle de temps.
C'est pourquoi la présente demande a également pour objet une composition pharmaceutique, curative ou préventive, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, un composé immunogène tel que défini ci-dessus. Le composé immunogène peut être conditionné seul ou mélangé à un excipient pharmaceutiquement acceptable tel qu'un adjuvant.
L'invention a encore pour objet des médicaments caractérisés en ce qu'ils sont constitués des composés immunogènes tels que définis cidessus, à savoir des composés immunogènes ci-dessus pour leur utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal, ainsi que l'utilisation d'un tel composé immunogène pour la préparation d'un médicament curatif ou préventif destiné au traitement ou à la prévention des effets nocifs des protéines de régulation ci-dessus, et notamment du tat.
L'administration de composés immunogènes selon l'invention correspond à une immunothérapie active. II peut être intéressant également de procéder à une immunothérapie passive, c'est à dire de foumir à un patient directement des anticorps dont il a besoin pour neutraliser les effets nocifs des protéines de régulation des virus VI H-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.
Ces anticorps anti-protéine de régulation peuvent être obtenus classiquement et à titre d'exemple après immunisation d'un mammifère, homme ou animal, à l'aide d'un composé immunogène tel que défini ci-dessus, par clonage de lymphocytes B humains transformés par le virus Epstein-Barr puis récupération des anticorps attendus sécrétés par lesdits lymphocytes B transformés, ou encore par recombinaison génétique à partir d'une librairie de phages.
C'est pourquoi la présente demande a également pour objet de tels procédés de préparation d'anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VI H-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et en particulier d'anticorps anti-tat ou antitat toxoîde.
La présente demande a encore pour objet un anticorps antiprotéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et en particulier des anticorps polyclonaux ou monoclonaux obtenus à partir de sujets humains ou de mammifères immunisés par la mise en oeuvre des procédés ci-dessus décrits.
Ces anticorps spécifiques pourront provenir:
1. soit du sujet lui-même, induits par une immunisation active (vaccination) avec une protéine de régulation biologiquement inactivée mais immunogène, notamment le tat. Un tel composé immunogène, dans le cas par exemple du tat est appelé tat-toxoide par analogie aux toxoides bactériens,
2. soit d'un organisme étranger, allo- ou xénogénique, administré au sujet par immunisation passive (sérothérapie). Les anticorps allogéniques (chez l'homme) pourront être engendrés chez des sujets non infectés volontaires après immunisation active (vaccination) avec une protéine immunogène ou ses dérivés selon l'invention, notamment du tat (tat-toxolde ou fragments peptidiques du tat).Ces anticorps administrés passivement, qu'ils soient allogéniques (humains) ou xénogéniques (animaux), pourront être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux complets ou des fragments F(ab')2 ou
Fab de l'anticorps.
Par anticorps anti-protéine de régulation., I'on entend des anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des fragments F(ab')2 ou Fab de ces anticorps ou encore des anticorps anti-protéine de régulation obtenus par construction génétique à partir d'une librairie de phages.
Les anticorps allogéniques d'origine humaine sont: - soit polyclonaux - pouvant être obtenus chez des sujets séronégatifs volontaires immunisés avec un composé immunogène selon l'invention, notamment du tat-toxo-lde ou des fragments peptidiques de tat - soit monoclonaux à partir de clones spécifiques de cellules B transformées par le virus EBV de ces individus immunisés (lignées B EBV spécifiques).
Les anticorps xénogéniques proviennent d'animaux hyperimmunisés avec un composé immunogène selon l'invention, notamment du tat ou ses dérivés (tat-toxoîde, fragments peptidiques de tat), et sont - soit polyclonaux provenant d'animaux hyperimmunisés, - soit monoclonaux, obtenus après hybridation selon la technique que Kohler et
Milstein de cellules spléniques ou d'adénocytes avec une lignée myélomateuse, type x63, notamment x63AG3.
La présente demande a encore pour objet un procédé de préparation d'anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2,
HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l'on immunise un mammifère, homme ou animal, avec un composé immunogène tel que défini ci-dessus.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux anti-protéine de régulation d'un virus VIH1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l'on utilise des cellules B provenant d'individus immunisés par un composé immunogène selon la présente invention, lesdites cellules B étant transformées par le virus EBV et produisant des anticorps spécifiques anti-protéine de régulation d'un virus VIH1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.
Les cellules EBV + ci-dessus peuvent être cultivées de manière à produire les anticorps attendus. Ces cellules, comme on l'a vu, proviennent notamment de malades immunisés par une protéine de régulation native, ou par un composé immunogène selon l'invention.
La présente demande a encore pour objet un procédé de préparation d'anticorps selon l'invention monoclonaux, dirigés contre une protéine de régulation d'un virus VIH-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 inactivée ou non, caractérisé en ce que l'on prépare des hybridomes de mammifère, notamment de souris à partir de splénocytes ou adénocytes notamment de souris immunisées par une protéine de régulation native ou un composé immunogène selon l'invention, et de cellules de myélome, de préférence de lignée x63, selon les procédés bien connus de l'état de la technique (Kohler et
Milstein).
La présente demande a également pour objet un procédé d'obtention d'anticorps anti-protéine de régulation d'un virus VI H-I, VIH-2,
HTLV-1 ou HTLV-2, par la technologie de recombinaison génétique, caractérisé en ce que l'on utilise à titre d'immunogène un composé immunogène tel que défini ci-dessus.
La présente demande a encore pour objet des fragments F(ab')2 ou Fab desdits anticorps ; ceux-ci peuvent être obtenus par digestion enzymatique par exemple.
La présente invention a tout autant pour objet un procédé d'immunisation passive de sujets contaminés par le virus VIH, utilisant des anticorps spécifiques anti-protéine de régulation de la multiplication du virus
VIH et spécialement anti-tat neutralisant ou bloquant les effets nocifs de cette protéine dans sa configuration extracellulaire et préparés comme indiqué cidessus, ou des fragments F(ab')2 ou F(ab) de ces anticorps.
La présente demande a aussi pour objet un procédé d'immunisation active anti-VIH ou Sida utilisant un composé immunogène décrit ci-dessus, associé à une protéine constitutive (ou de structure) d'un virus
VIH, notamment la glycoprotéine d'enveloppe gp 120 ou gp 160 ou un fragment peptidique modifié ou non de celles-ci, ou au virus VIH inactivé, ou au virus
VIH deplété de son ARN génomique par exemple par hydrolyse alcaline.
L'invention a encore pour objet un procédé d'immunisation active anti-VIH ou - Sida utilisant un composé immunogène décrit ci-dessus, associé à un ou plusieurs immunogènes à base de cytokines inactivées et spécialement l'interféron a, leTGFss ou le TNF.
La présente demande a également pour objet un procédé d'immunisation active caractérisé en ce que l'on utilise à titre d'immunogène un composé immunogène tel que défini ci-dessus associé à un adjuvant d'immunité minéral, huileux ou de synthèse, ou encore un composé immunogène tel que défini ci-dessus couplé ou associé à une protéine augmentant son immunogénicité.
Ces immunisations peuvent être réalisées tant à titre curatif qu'à titre préventif.
A titre d'immunogène pour tous les procédés ci-dessus et ciaprès, on utilise de préférence un dérivé de la protéine tat.
La présente invention a encore pour objet un procédé d'hyperimmunisation de sujets séronégatifs ou séropositifs VIH-1, VIH-2,
HTLV-1 ou HTLV-2, caractérisé en ce que l'on utilise un immunogène tel que défini ci-dessus, pour la production de sérums humains hyperimmuns, lesquels peuvent être particulièrement destinés à la sérothérapie passive par administration d'anticorps spécifiques purifiés ou de leurs fragments F(ab')2 ou
Fab..
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif curatif ou préventif, au moins un anticorps anti-protéine de régulation d'un virus tel que défini ci-dessus ou obtenu selon les procédés ci-dessus.
L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'un composé immunogène ou d'un anticorps ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des effets nocifs d'une protéine de régulation d'un virus
VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.
En résumé et notamment, la présente invention a pour objet l'usage à titre préventif, ou curatif chez le sujet séropositif ou atteint d'ARC/Sida d'anticorps spécifiques de manière à bloquer l'action nocive d'une protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 et notamment du tat circulant. Ces anticorps spécifiques pourront provenir: 1. du sujet lui-même, induits par une immunisation active (vaccination) avec du tat biologiquement inactivé mais immunogène, appelé tat-toxoide par analogie aux toxoîdes bactériens ou 2. d'un organisme étranger, allo- ou xénogénique, administré au sujet par immunisation passive (sérothérapie).Les anticorps allogéniques (chez l'homme) pourront être engendrés chez des sujets non infectés volontaires après immunisation active (vaccination) avec une protéine de régulation telle que le tat ou ses dérivés (tat-toxoide ou fragments peptidiques du tat). Ces anticorps administrés passivement, qu'ils soient allogéniques (humains) ou xénogéniques (animaux), pourront être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux complets ou des fragments F(ab')2 ou
Fab de l'anticorps.
Par tat-toxoide on entend une protéine tat traitée par des agents chimiques (aldéhydes) ou physiques ou modifiés par voie chimique. Ces traitements ont fait perdre à la molécule les propriétés biologiques du tat circulant (immunosuppression des cellules T; néoangiogenèse des cellules endothéliales; blocage de l'effet antiviral de l'lFN sur les macrophages) mais préservent les propriétés susceptibles d'induire la formation des anticorps, lorsque présente et préparée de manière appropriée, couplée ou non à un "carrier', agrégée ou non, en présence ou non d'adjuvant.
On a élargi la notion de tat-toxoide aux fragments peptidiques immunogènes de tat c'est-à-dire une séquence peptidique du tat susceptible d'induire la formation des anticorps anti-tat lorsqu'elle est présentée de manière appropriée, couplée à un carrier ou non, en présence ou non d'adjuvant.
Les anticorps allogéniques d'origine humaine sont: - soit polyclonaux - pouvant être obtenus chez des sujets séronégatifs volontaires immunisés avec du tat-toxoide ou des fragments peptidiques de tat - soit monoclonaux à partir de clones spécifiques de cellules B transformées par le virus EBV de ces individus immunisés (lignées B EBV spécifiques).
Les anticorps xénogéniques provenant d'animaux hyperimmunisés avec du tat ou ses dérivés (tat-toxoide, fragments peptidiques de tat) - soit polyclonaux provenant d'animaux hyperimmunisés, - soit monoclonaux - obtenus après hybridation selon la technique que Kolher et
Milstein de cellules spléniques ou d'adénocytes avec une lignée myélomateuse, type x63, notamment x63AG3.
L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques.
a) Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent préventif ou curatif un toxoîde viral ou un fragment ou analogue de protéine de régulation, notamment du tat selon l'invention.
b) Une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent préventif ou curatif des anticorps anti-tat produits à partir d'organismes immunisés contre ladite protéine ou ses fragments F(ab')2 ou Fab, selon l'invention.
En outre l'invention propose également un kit comprenant une composition pharmaceutique vaccinale qui en plus du principe actif (tat-toxoîde ou ses dérivés ou anticorps anti-tat) peut comprendre un adjuvant etlou un autre immunogène à propriétés anti-rétrovirus.
Enfin l'invention propose une composition pharmaceutique sous une forme galénique conventionnelle. En particulier on associe le principe actif selon l'invention en quantité suffisante pour être efficace d'un point de vue thérapeutique avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
EXPéRIENCE 1:
EFFETS PATHOGENES DE LA PROTEINE TAT CIRCULANTE
Immunosuppression des cellules T en présence de tat:
L'effet du tat sur des lymphocytes T activés du sang périphérique a été recherché. Des cellules mononuclées (PMBC) et des lymphocytes T (HLA 35 DR-) isolés par immunomagnétisme ont été activés par des anticorps anti
CD3 en présence ou en absence de la molécule tant. Après 5 jours de culture, la prolifération cellulaire a été mesurée par incorporation de thymidine H3. Les résultats ont montré que le tat inhibait la prolifération des cellules T HLA DR (85% d'inhibition à la concentration de 1,5 mg par ml). Cette inhibition disparaît en présence d'anticorps spécifique anti-Lat (Intracel, U.K).
EXPéRIENCE 2
EFFETS PATHOGENES DE LA PROTEINE TAT CIRCULANTE:
Inhibition de l'effet de l'lFN sur les macrophages en présence de tat:
L'effet du tat sur l'action antivirale de l'IF Na a été mesuré par le test biologique conventionnel en utilisant la mesure du pouvoir cytopathogène du virus VSV sur les cellules MDBK.
Effet du tat sur l'lFN exogène
Des doses croissantes de tat ont permis d'inhiber dès de faibles concentrations suivant une courbe dose effet, le pouvoir anti-viral de l'lFN exogène. Dans une expérience représentative, L'effet protecteur de l'lFNa apparent jusqu'à la dilution 1/4800 (correspondant à 150 U.l.) est réduit à la dilution 1/300 en présence de 40 ug de tat.A la dilution 4 800 de l'lFN exogène le titre de VSV est passé de 103,8 (échantillons IFN sans tat) à 105,5 (échantillons IFN en présence de tant). Dans ces expériences, I'inhibition de l'effet anti-viral de l'lFNa par la molécule tat est supprimée en présence d'anticorps spécifiques anti-tat (Intracel, U.K).
EXPERIENCE 3
MISE EN EVIDENCE CHEZ LES SUJETS INFECTES PAR LE VIH-1 DE LA
PROTEINE TAT DANS SA CONFIGURATION EXTRACELLULAIRE:
Présence d'anticorps anti-tat dans le sérum de patients séropositifs:
a) Une étude par Elisa des anticorps anti-tat sériques utilisant comme antigène la molécule tat native a été réalisée chez 50 sujets séropositifs et 15 sujets séronégatifs. Tous les sérums des sujets séronégatifs et 20 sérums de séropositifs n'ont pas révélé la présence d'anticorps anti-tat avec une densité optique inférieure au seuil (cut off) (D.O. = 0,250). Parmi les 30 sérums de sujets infectés par le VIH, qui ont dépassé le seuil, 6 ont une DO supérieure à 0,500. Aucune corrélation apparente n'a pu être faite entre la présence d'anticorps anti-tat d'une part, I'état clinique et le nombre de cellules
CD4 par mm3 de sang d'autre part.
b) Une étude par Elisa d'anticorps anti-tat sériques utilisant comme antigènes différents peptides du tat a été réalisée chez des sujets séropositifs à différents stades de l'évolution de leur infection VIH - sujets asymptomatiques ; patients présentant des manifestations cliniques pré-Sida (ARC) et patients atteints de Sida. Les résultats de cette étude sont les suivants:
1) Les séquences peptidiques du tat
MEPVDPRLEPWKHPG (résidus 1 - 15 en N terminal)
HQVSLSKQPTSQPRGD (résidus 65 - 80 en C terminal) ont été reconnues par la grande majorité des sérums de séropositifs et par aucun sérum de séronégatifs (contrôles). Les réactions ont été fortement positives mais aucune corrélation n'a pu être montrée en rapport avec l'évolution de l'infection VIH et le nombre de CD4 des sujets.
2) Les autres séquences étudiées n'ont pas été reconnues de manière notable par les sérums qu'ils soient d'individus séropositifs ou contrôles (voir Tableau 1). Seuls quelques rares sérums pour chaque séquence ont montré une densité optique supérieure au seuil (2 fois la moyenne des sérums contrôles).
TABLEAU 1
Figure img00130001
<tb> <SEP> Sujets <SEP> infectés* <SEP> Sujets <SEP> contrôles
<tb> <SEP> (72 <SEP> sérums) <SEP> ( <SEP> <SEP> 10 <SEP> sérums
<tb> Résidus <SEP> peptidiques <SEP> du <SEP> Sérums <SEP> D.O. <SEP> moyenne <SEP> Sérums <SEP> D. <SEP> 0.
<tb>
<SEP> tat <SEP> positifs** <SEP> positifs** <SEP> moyenne
<tb> <SEP> 1-15 <SEP> 67 <SEP> 0,43 <SEP> 0 <SEP> 0,08
<tb> <SEP> 9-20 <SEP> 0 <SEP> 0,26 <SEP> 0
<tb> <SEP> 22-37 <SEP> 7 <SEP> 0,78 <SEP> 0 <SEP> 0,41
<tb> <SEP> 36-50 <SEP> 5 <SEP> 0,86 <SEP> O <SEP> 0,65 <SEP>
<tb> <SEP> 46 <SEP> - <SEP> 60 <SEP> 6 <SEP> 0,53 <SEP> 0 <SEP> 0,40
<tb> <SEP> 52-60 <SEP> 2 <SEP> 0,32 <SEP> 0 <SEP> 0,38
<tb> <SEP> 56 <SEP> - <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> 0,19 <SEP> 0 <SEP> 0,20
<tb> <SEP> 65 <SEP> - <SEP> 80 <SEP> 70 <SEP> 1,01 <SEP> 0 <SEP> 0,08
<tb> * Les sujets infectés par le VIH sont à des stades variés; sujets asymptomatiques, patients atteints d'ARC et patients atteints de Sida.
" La réaction est considérée positive (seuil) lorsque la densité optique est 2 fois supérieure à la moyenne des séronégatifs.
3) II est intéressant de noter que la séquence la plus réactive (AA 65 - 80) est celle contenant les résidus RGD reconnus par les intégrines.
EXEMPLE 1
PREPARATION DE LA PROTEINE TAT IMMUNOGENE (TAT-TOXOIDE):
Inactivation de la protéine tat en présence de formaldéhyde
A une solution de tat (1 mg/ml) dans du phosphate disodique 70 mM, pH 8,0, on ajoute du formaldéhyde à la concentration finale 33 mM.
Le mélange est incubé à 37 "C pendant 1,3,5,7 et 9 jours. A la fin de chacune des périodes d'incubation, un échantillon est prélevé et la réaction avec le formaldéhyde bloquée par addition de glycine à la concentration finale 100 mM.
Chaque prélèvement est dialysé pendant 1 nuit à 4"C contre 100 fois son volume de PBS (tampon phosphate salin).
EXEMPLE 2
PREPARATION DE LA PROTEINE TAT IMMUNOGENE (TAT-TOXOIDE)
Inactivation de la protéine tat en présence de glutaraldéhyde
A une solution de tat (1 mg/ml) dans du phosphate disodique 70 mM, pH 8,2 on ajoute du glutaraldéhyde à la concentration finale, soit 0,026 M, soit 0,0026 M. On laisse la réaction avec le glutaraldéhyde se poursuivre pendant des temps divers variant de 1 mn à 3 h. Après le temps de réaction choisi, à la température du laboratoire, la réaction est bloquée par addition de glycine à la concentration finale de 100 mM. Les différents prélèvements sont dialysés, pendant 16 heures, à 4"C, contre 100 fois leur volume de PBS.
EXEMPLE 3
PREPARATION DE LA PROTEINE TAT IMMUNOGENE (TAT-TOXOIDE)
Inactivation et couplage simultané à la toxine tétanique du tat
A un mélange de toxine tétanique et de tat dans un rapport molaire de 1 à 15, dans un tampon phosphate 70 mM - 100 mM (pH variant de 6,8 à 8,2) on a ajouté du glutaraldéhyde à la concentration finale (variant de 0,0026 M à 0,026 M) et on laisse la réaction d'inactivation et de couplage s'effectuer pendant des temps variables (3-15 mn) à la température du laboratoire. La réaction est bloquée par addition de glycine à la concentration finale 100 mM et les différents prélèvements sont dialysés pendant 16 heures, à 4"C, contre 100 fois leur volume de PBS.
EXEMPLE 4
POUVOIR IMMUNOGENE DES TAT-TOXOIDES
Tat-toxo-lde immunogène chez la souris: Anticorps par Elisa
Le pouvoir immunogène des différentes préparations de tat inactivé, soit par le formaldéhyde (tat-toxoîde), soit par le glutaraldéhyde (tat- polan), soit après couplage à la toxine tétanique (conjugué tat-toxine tétanique), c'est à dire des composés immunogènes des exemples 1 à 3, a été déterminé chez la souris.
Des souris swiss de 18-209 ont été immunisées par 2 injections sous-cutanées de l'immunogène des exemples 1, 2 et 3 en présence d'adjuvant complet de Freund, la seconde pratiquée 3 semaines après la 1 ère avec 5 mg de préparation en émulsion en présence d'adjuvant incomplet de Freund.
15 jours après l'injection de rappel, des prélèvements sanguins ont été pratiqués par voie intracardiaque. Les anticorps anti-tat ont été déterminés dans les sérums par Elisa. La densité optique a été mesurée à 490 nm.
Les résultats obtenus, résumés dans le Tableau 2, montrent que toutes les préparations de tat sont immunogènes à des degrés divers, hormis le conjugué tat-TT traité pendant un temps court (3 minutes) par la glutaraldéhyde, qui s'est avéré toxique et a tué les souris en 24 heures (TT trop faiblement inactivé).
TABLEAU 2
Figure img00150001
<tb> <SEP> PréDarations <SEP> Taux <SEP> d'anticorPs <SEP> anti-tat
<tb> <SEP> Densité <SEP> Optique <SEP> (D.O)
<tb> <SEP> Tat-toxoïde <SEP> (1 <SEP> jours) <SEP> 0,320
<tb> <SEP> Tat-toxoïde <SEP> (3 <SEP> jours) <SEP> 0,465
<tb> <SEP> Tat-toxoïde <SEP> (5 <SEP> jours) <SEP> 0,998
<tb> <SEP> Tat-toxoïde <SEP> (9 <SEP> jours) <SEP> 0,807
<tb> <SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (1 <SEP> mn;) <SEP> 0,026 <SEP> M <SEP> 0,718
<tb> <SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (15 <SEP> mn;) <SEP> 0,026 <SEP> M <SEP> 1,564
<tb> <SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (60 <SEP> mn;) <SEP> 0,0026 <SEP> M <SEP> 1,065
<tb> <SEP> Tat <SEP> -polan <SEP> (3h;) <SEP> 0,0026 <SEP> M <SEP> 0,194
<tb> <SEP> conjugué <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (3 <SEP> mn; <SEP> 0,0026M) <SEP> toxique
<tb> <SEP> conjugué <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (15 <SEP> mn; <SEP> 0,0026M) <SEP> 1,987
<tb> conjugué <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (6 <SEP> min; <SEP> 0,026M) <SEP> 0,824
<tb> conjugué <SEP> tat <SEP> - <SEP> TT <SEP> (15 <SEP> mn; <SEP> 0,026M) <SEP> 1,642
<tb>
EXEMPLE 5
TOXICITE AIGUE
La toxicité des préparations de tat-toxolde et de tat-polan a été déterminée par injection sous-cutanée à la souris Swiss de 18-209. Les préparations de tat-toxoïde (7 jours) et tat-polan (15 mn; 0,026 M) ont été administrées à la dose de 100 pg par souris. Les animaux ont été observés pendant 7 jours.
Aucun signe manifeste de toxicité n'a été observé. Le poids des animaux a continué de crottre. L'examen macroscopique des organes à l'autopsie n'a pas permis de révéler d'anomalies.
EXEMPLE 6
ANTICORPS ANTI-TAT
On a préparé des anticorps anti-tat comme suit: on a isolé la fraction
IgG sur une colonne de protéine G à partir de sérums de souris immunisées avec du tat-polan. Les fragments F(ab')2 ont été également préparés à partir de la fraction IgG isolée par digestion pepsique. La réactivité immunologique de ces fractions a été vérifiée par Elisa.
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM:NEOVACS
(B) RUE : 117, rue Vieille du Temple
(C ) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL 75003
(ii) TITRE DE L'INVENTION : Nouveaux immunogènes, de nouveaux anticorps, leur procédé de préparation et des compositions pharmaceutiques les renfermant.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES 1
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C ) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release &num; 1.0, Version &num; 1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQUENCE ID NO : 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés (B) TYPE : acide aminé
(C ) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 1 :
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Pro Arg Gly Asp
1 5 10 15

Claims (20)

REVENDICATIONS
1. Composé immunogène caractérisé en ce qu'il dérive d'une protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 , par traitement chimique, physique, génétique ou immunologique bien connu de l'état de la technique, tout en étant reconnu par des anticorps dirigés contre ladite protéine de régulation native, tout en conservant des propriétés immunogènes suffisantes pour créer des anticorps neutralisant ladite protéine native ou bloquant ses effets et tout en ayant perdu au moins 50 % de ses propriétés biologiques toxiques.
2. Composé immunogène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il dérive d'une des protéines de régulation suivantes des virus VIH-1 ou
VIH-2, nef. tat ou rev.
3. Composé immunogène selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il dérive de la protéine tat.
4. Composé immunogène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il dérive d'une protéine tax, d'un virus HTLV-1 ou HTLV-2.
5. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 1 à4.
6. Un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 1 à 4 pour son utilisation dans une méthode de traitement du corps humain ou animal.
7. Procédé de préparation d'un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'on soumet une protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 à un traitement chimique, immunologique, génétique ou chimique d'inactivation, sélectionne puis purifie une protéine reconnue par des anticorps dirigés contre ladite protéine de régulation native, tout en conservant des propriétés immunogènes suffisantes pour créer des anticorps neutralisant ladite protéine native ou bloquant ses effets et tout en ayant perdu au moins 50 % de ses propriétés biologiques toxiques, selon des méthodes connues en ellesmêmes.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le traitement chimique comprenant un traitement à l'aide d'un aldéhyde suivi d'un couplage à une protéine porteuse.
9. Procédé de préparation d'un anticorps anti protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 caractérisé en ce que l'on immunise un mammifère à l'aide d'un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 1 à 4.
10. Procédé de préparation d'un anticorps anti protéine de régulation d'un virus VlH-I, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 caractérisé en ce que l'on procède au clonage de lymphocytes B transformés par le virus Epstein
Bar, puis récupère les anticorps attendus sécrétés par lesdits lymphocytes B transformés.
11. Procédé de préparation d'un anticorps anti-protéine tat d'un virus VIH-1 ou VIH-2, caractérisé en ce que l'on procède au clonage de lymphocytes B transformés par le virus Epstein-Barr, puis récupère les anticorps attendus secrétés par lesdits lymphocytes B transformés.
12. Procédé de préparation d'un anticorps anti-protéine tax d'un virus HTLV-1 ou HTLV-2 caractérisé en ce que l'on procède au clonage de lymphocytes B transformés par le virus Epstein-Barr, puis récupère les anticorps attendus secrétés par lesdits lymphocytes B transformés.
13. Procédé de préparation d'un anticorps anti protéine de régulation d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2 caractérisé en ce que l'on prépare ledit anticorps par recombinaison génétique, à partir d'une librairie de phages.
14. Procédé de préparation d'un fragment F(ab')2 ou F(ab) d'un anticorps tel que préparé à l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que l'on procède à la digestion enzymatique d'un tel anticorps.
15. Un anticorps anti protéine de régulation d'un virus VIH-1,
VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.
16. Un fragment F (ab')2 ou F(ab) d'un anticorps tel que défini à la revendication 15.
17. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps tel que défini à l'une des revendications 15 et 16.
18. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un composé immunogène tel que défini à l'une des revendications 1 à 5, associé à une protéine sain, pM ou env d'un virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ou HTLV-2.
19. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un composé immunogéne tel que défini à l'une des revendications 1 à 5, associé à une protéine gp120 / gp160, native ou inactivée par traitement physique, chimique, génétique ou immunologique ou à une fraction peptidique de cette protéine, modifiée ou non.
20. Un composé immunogène ayant la formule suivante
HQVSLSKQPTSQPRGD.
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