JP2002511753A - Ｔｘｕ−７−ｐａｐ イムノトキシン及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｔ細胞白血病、リンパ腫、急性骨髄性白血病及びウィルス感染、例えばHIV感染の治療のために有効である所定量のアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質に連結したモノクローナル抗体TXU−７を含むイムノトキシンを供する。

Description

【発明の詳細な説明】 TXU−７−PAPイムノトキシン及びその使用 発明の背景 急性リンパ芽球性白血病(ALL)は小児期の悪性腫瘍の最も一般的な形態である （Champlinら、Blood，73，2051(1989)）。毎年15歳未満の約1250の子供が急性 リンパ芽球性白血病を有することが判明している（Champlinら、前掲）。現在、 ALLでの子供の悪性腫瘍化学療法の劇的な改良は70〜75％の治癒率となっている （Poplackら、Pediatric clinics of North America，35，903(1988)）。しかし ながら、これら現在の改良にかかわらず、１〜５人の患者が最終的に白血病を再 発するであろう（Riehmら、Haematol，Blood Transf．33，439(1990)）。この再 発患者の発生率は年に250ケースに当たり、小児急性非リンパ芽球性白血病髄芽 腫、及び横紋筋肉腫の新しく診断されるケースの数に等しい。更に、この再発率 は、小児ユーイング肉腫、骨原性肉腫、肝癌、及び生殖細胞腫瘍の新しく診断さ れるケースの数をしのぐ。この集団の不満足な結果は、ALLでの子供の実質的に 大部分についての優れた結果にかかわらず、全体の小児科癌死亡率に大きく寄与 する。 現在、子供のALLでの治療における主なチャレンジは、集中的な悪性腫瘍化学 療法にかかわらず再発した患者を治癒することである（Champlinら、前掲）。治 療中に又は治療の選択的休止直後に再発した患者について、全体の生存率は極め て低い（Poplackら、前掲）。これらの再発した子供の治療は、一般に、第２の 寛解を達成するための集中的化学療法、後の非外科的化学療法又は外科的放射線 化学療法及び骨髄移植(BMT)のいずれかを用いている（Kerseyら、 N．Engl．J．Med．117，461(1987)）。しかしながら、白血病の再発はいずれの アプローチの成功にも主な障害である(Dickeら、Clin．Hematol.，15，86(1986) )。 更に、慣用的な薬剤を用いる細胞毒性治療の強化によるこれらの再発患者の治 療は、重複した毒性を引きおこす可能性があるであろうし、治療の強さをむしば み得る遅れを生じ得る。結果として、新しい潜在的な抗−ALL薬剤及びこれらの 新しい剤を利用する組合せ治療プロトコルのデザインの開発が再発ALLの治療に おける調査のための焦点として浮かび上がっている。 急性骨髄性白血病(AML)は、成人において急性白血病の最も一般的な形態であ り、子供においては２番目に頻繁な白血病で、急性小児白血病の20〜25％を占め る（Priesierら、Blood，80，2600(1992)）。骨髄白血病の患者の大部分は最初 には、集中的化学治療に応答するが、ほとんどは再発し、最終的にはそれらの病 気に倒れるであろう。更に、AML患者を有効に優れた及び乏しい結果に導くため の有用かつ特異的な予後の因子を同定するための試みは一般に成功しておらず、 全ての患者が高い死亡率の代償を払って極めて集中的な治療を受ける結果となる 。更に、AMLのための現在の悪性腫瘍の化学治療は白血病細胞の多重薬剤耐性の ため患者の半分超を治癒させることができず、しばしば、潜在的な致命的な全身 毒性を導く（Galeら、Sem．Hematol.，24，40(1987)）。 最後に、同種の骨髄移植は骨髄白血病の多くの患者のための有効な治療である ことが証明されているが、その適用は適切なHLAが適合したMLLに非反応性のドナ ーの利用に限られる（Woodsら、J．Clin．Oncol.，11，1448(1993)）。小児AML のための自家骨髄移植において、遺伝子マーカー研究は、移植のために収集され た浄化されていない“寛解”髄における亜臨床的な病気は病気の再発にかな り寄与する（Brennerら、Lancet，341，85(1993)）。骨髄除去的化学療法又は致 死前放射線化学療法の後の同種又は自家骨髄移植はかなりの罹患率及び致死率と 関係しており、AML患者の全体の生存率を実質的に改良することができず、この ことはAMLのための合理的な薬剤デザインベースの治療についての必要性を強調 する（Yeaperら、NewEngl．J．Med.，315，141(1986);Woodsら、前掲）。 免疫系の別の病気は先天性免疫不全症候群（AIDS）である。ヒト免疫不全ウィ ルスＩ型(HIV−１)の感染は世界的な公衆の健康の問題を構成する(Venkatesan，Science ，241，1481(1988))。HIV感染の免疫病因についての重大な基礎は顕著な 免疫抑制を生ずるＴ細胞のCD4＋ヘルパー／インデューサーサブセットの涸渇で ある。Dehlgleishら(Nature，312，763(1984);Fauci，Clin．Res.，32．491(198 5);Hoら、N．Engl．J．Med.，317，278(1987))を参照のこと。HIVは、HIV−１の ための細胞表面レセプターの本質的な構成物、CD４抗原とのエンベロープ(env) タンパク質gp120の相互作用によって媒介されるCD4＋Ｔ細胞及びマクロファージ のための選択的向性を有する（Laskyら、Science，233，209(1986)）。HIVが外 部のエンベロープグリコプロテインgp120によりCD４分子の第１のドメインに結 合した後、ウィルスはインターナライズされ、非コート化される(Fauci，Scienc e，239，617(1988))。いったん非コート化されると、ウィルスゲノムRNAは逆転 写酵素によりDNAに転写される。次に、そのプロウィルスDNAが宿主染色体DNAに 組み込まれる。プロウィルスの組込みの後、感染は潜在期に入るか、又はプロウ ィルスDNAがウィルスゲノムRNA及びメッセンジャーRNAを転写する。タンパク質 合成、プロセッシング、及びウィルスアセンブリーは、細胞表面からの成熟ビリ オンの出芽と共におこる。 現在、AIDSは不治であり、逆転写酵素インヒビター、例えばジド ブジン／ZDV(以前はアジドチミジン／AZTと呼ばれる）及びジデオキシイノシン( ddI)を用いることによる生体内でのHIV−１複製を減少させる治療モダリティー は実質的な副作用を引きおこす(Yarchoanら、Blood，78，859(1991))。ZDVはHIV −１血清陽性無症候性個体での病気の進行を遅らせ、AIDS及びAIDS関連合併症(A RC)の患者の生存性を改善しているが、その治療応答は頻繁に一過性である(Volb erdingら、N．Engl．J．Med.，322，941(1990);Fischlら、Ann．Intern．Med.， 112，727(1990);Fischlら、N．Engl．J．Med.，317，185(1987))。更に、ZDVに 対して耐性であるHIV−１の変異体は連続治療の成功を妨害することがわかって いる。（Ericeら、Clinical Infections Diseases，18，149(1994)）。現在のデ ータは、ジデオキシイノシン(ddI)治療の間にもHIV−１単離物の中で耐性が現れ ることを示す(St．Clairら、Science，253，1557(1991))。これらの特徴はHIV− １の回復力及びこのウィルスに対するより強力なストラテジーの必要性を確認す る。 薬剤ターゲッティングは、悪性腫瘍又はHIV感染細胞を殺し、正常な又は感染 していない組織又は細胞を無害で残すことができる潜在的に注目される新しいア プローチである。薬剤ターゲッティングにおける決定的な進展は、本質的に限度 がない供給で利用できる多くのモノクローナル抗体(MoAbs)を作るハイブリドー マ技術の出現であった。細胞の特定の集団について選択的である治療試薬を作製 するために、MoAbs又は他の細胞ターゲッティングタンパク質は生物活性成分に 連結されてターゲッティング成分の選択性を生物活性成分の能力と組み合わせる ことができるイムノコンジュゲート、イムノトキシン又は融合タンパク質と呼ば れる生物治療剤を形成する。MoAb（又は他のターゲッティング成分）の選択は標 的細胞の表面抗原プロフィールに基づく。 過去数十年、これらの型の生物治療剤は種々の癌の治療のための研究下にある 。これらの生物治療剤はヒトの病気のための安全かつ有効な治療を供する特定の 能力を示しでいるが、多くの困難が残っている。理想的には、標的細胞に確実に 位置することができかつ信頼できるマーカーは、生物治療剤の結合部分が非標的 組織を完全に避けることを許容するであろう。現実的には、重大な生命維持器官 により発現される抗原との交差反応はしばしば生体内適用において許容できない 合併症を引きおこす。患者は、既にそれらの病気によって免疫抑制されている場 合でさえ、生物治療剤の別個の成分に対する免疫応答を示すであろう。更に、試 験管内研究で得られた細胞毒性は、患者によって許容され得る投与量での能力の 欠如により臨床的適用において限定され得る。最後に、固体腫瘍は完全に浸透す るのが困難であり、血液悪性腫瘍において、残りの病気は、白血病及びリンパ腫 においては標的細胞へのアクセスが容易であるにかかわらず、再発し得る。 マウス及びサルにおけるイムノトキシンを用いる毒性研究は、臨床試験におい てイムノトキシンの毒性を予測していない。例えば、Ｂ細胞表面抗原CD19又はCD 22に対するリシンＡ鎖イムノトキシンで処理したサルにおいて神経毒性が観察さ れたが、これらのイムノトキシンをリンパ腫の患者に用いた場合、重大な画分が 末梢神経障害及び失語症（言語能力の喪失）を示した。同様に、454A12マウスア ンチトランスフェリンレセプターモノクローナル抗体の組換えリシンＡ鎖イムノ トキシン又はOVB3マウス抗副腎癌モノクローナル抗体の天然のシュードモナスエ キソトキシンイムノトキシンを用いるプレ臨床動物研究において観察された。し かしながら、両方のイムノトキシンは癌の患者に用いる場合に激しい脳障害及び 脳幹炎症を引きおこした(Grossbardら、Blood，80，863(1992);Hertlerら、 J．Clin．Oncol.，7，1932(1989))。 PAPは、Food and Drug Administrationにより認可されたInvestigational New Drug Application IBB-IND-3864)下で急性リンパ芽球性白血病の成人及び小児 患者のフェーズＩ／II臨床試験における抗CD19イムノトキシンのリボソーム阻害 （細胞毒性）成分として用いられている。抗CD19PAPは1984年から抗白血病剤と して開発されており、進歩する臨床研究のための基礎を供する前臨床白血病モデ ルにおいて極めて拘束された結果を供している(Uckunら、Leukemia，7，341(199 3);UckunらJournal of Exp．Med.，163，347(1986))。 現在完了したフェーズＩ／II研究において、18人の白血病の患者が0.1μｇ／k g／日〜250μｇ／kg／日×５日の範囲の投与レベルで段階的に増加する投与量の 抗CD19PAPを受容しており、10人の患者が100μｇ／kg／日×５日の固定した投与 レベルで抗CD19−PAPを受容している（Uckun F.M.，Brit．J．Haematol.，85，4 35(1993)）。最大許容投与量は250μｇ／kg/日×５日の最も高い投与レベルで達 成されなかった。患者に、１〜３回の治療の間、５日間の各々の日に１時間のi. v.注入の抗CD19−PAPを与えた。毒性には、毛細管漏出症候群及び筋痛があった 。重要なのは、重大な肝臓、腎臓、心臓、又は神経毒性が観察されておらす、患 者はPAP又は抗CD19PAPのモノクローナル抗体成分のいずれにも免疫応答を進展さ せなかったことである。これにより、イムノコンジュゲートとして投与されたPA Pの臨床毒性プロフィールは他のRIPの報告された毒性プロフィールが極めて異な る。24人の評価できる患者のうち、５人が完全な寛解を達成し、２人が部分的な 寛解を達成し、５人が部分的に応答したが寛解を達成せず、９人が安定的な病気 を有し、そして３人のみが治療の間、進行した。４人の患者が最小限の白血病の ための治療を受けた：それゆえ、彼らは目的の応答について評価できなかった。 これにより、抗CD19PAPは骨髄、肝臓、脾臓、及びリンパ節に浸透し、CD19−陽 性白血病細胞の選択的根絶を導くことができる。 正常なCD4＋Ｔ細胞におけるHIV−１複製はPAPにより試験管内で阻害され得る （Zarlingら、Nature，347，92(1990)）。顕著なのはPAPを、CD4＋Ｔと反応性の MoAbsにコンジュゲートすることにより試験管内でPAPをCD4＋Ｔにターゲッティ ングすることは、HIV−１複製の阻害においてその能力を1000倍超に増加させた （Zarlingら、前掲）。AZT−センシティブ及びAZT−耐性HIV−１の臨床単離物を 用いる後の研究は、G17.2(抗CD4)−PAPイムノコンジュゲートがナノモラー濃度 において全ての単離物に対して潜在的な抗HIV活性を示すことを証明した(Erice ら、Antimicrobial Agent and Chemo.，37：835(1993))。しかしながら、生体内 でのG17.2(抗CD4)−PAPイムノコンジュゲートの安定性及び効能は不明である。 それゆえ、生体内で効能を示す改良された安定性を有する抗Ｔ細胞PAPイムノ トキシンについての必要性が存在する。更に、種々のＴ細胞特異的病因に関連す る細胞集団を標的にし、そして阻害し又は評価するためのイムノトキシン及びそ れらの使用の方法についての絶え間ない必要性がある。 発明の概要 本発明は、生物活性を有する有効量の成分、例えばポリペプチド又は毒素に連 結した哺乳動物に特異的なモノクローナル抗体、例えばヒト、Ｔ−細胞／骨髄球 抗原CD７を含む生物治療剤、例えばイムノコンジュゲート又はイムノトキシンを 供する。これらの剤は試験 管内及び生体内の両方で活性であり、CD７＋Ｔ細胞特異的病気、例えば特定の癌 及び特定のウィルス感染、例えばAIDS又はARCに関連したHIV感染を治療するのに 役立つ。本明細書に用いる場合、モノクローナル抗体（MoAb）との用語は、好ま しくは生物活性成分に共有結合し又は架橋した、フラグメント、サブユニット又 は誘導体を含む。好ましくは、その成分はアメリカヤマゴボウ（pokeweed）抗ウ ィルスタンパク質(PAP)である。用語“アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク 質”は、ネイティブの精製されたアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質の少 くとも約１％、好ましくは約10％、より好ましくは約50％の活性を有する。いず れの成分、例えばアメリカヤマゴボウタンパク質、そのサブユニット、変異体又 は誘導体、例えばPAP−II,PAP−Ｓ、及び組換えPAPを含む。アメリカヤマゴボウ 抗ウィルスタンパク質の調製物の活性は、以下に記載の方法を含む、当業者に公 知の方法によって決定することができる。 これにより、癌を治療するために、本発明のイムノトキシンは、好ましくは、 アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質の細胞毒性量を含む。ウィルス感染を 阻害し又は治療するために、本発明のイムノコンジュゲートは、好ましくは、ウ ィルス感染及び／又は複製を阻害するために有効である量のアメリカヤマゴボウ 抗ウィルスタンパク質を含む。 本発明のイムノコンジュゲート又はイムノトキシンは、哺乳動物Ｔ細胞／骨髄 細胞の表面に存在するCD７抗原、例えばＴ細胞ALL，AML及びＴ−系列リンパ腫患 者からの白血病芽細胞の表面上に存在するCD７抗原に結合する、モノクローナル 抗体TXU−７又はその生物活性サブユニット、フラグメント又は誘導体を用いる 。モノクローナル抗体の“生物活性”サブユニット又はフラグメントは、モノク ローナル抗体の結合活性の少くとも約１％、好ましくは少くとも約 10％、より好ましくは少くとも約50％を有する。より好ましくは、本発明の実施 に利用される抗体は、ハイブリッド細胞系ATCC HB-12260によって生産されるモ ノクローナル抗体の結合特異性を有する。 標的への結合を供するために感染した細胞でのHIV−１エンベロープタンパク 質の発現に依存するイムノコンジュゲートと異なり、本発明のイムノコンジュゲ ートは、CD７＋細胞上の正常な抗原に対するモノクローナル抗体を用いて、アメ リカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質を、感染していない又は潜在的に感染した CD７＋細胞に標的化する。モノクローナル抗体レセプター媒介エンドサイトーシ スによるタンパク質抗ウィルスタンパク質−モノクローナル抗体コンジュゲート のインターナリゼーションは、高アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質濃度 でおこる非特異的取込みと比べて、形質膜を通してのアメリカヤマゴボウ抗ウィ ルスタンパク質のデリバリーを増加させることは、本出願人により以前、発見さ れ、引用により本明細書に組み込まれる米国特許出願通し番号071979,470号に記 載されている。 しかしながら'470号出願に開示されるアメリカヤマゴボウ抗ウイルスイムノコ ンジュゲートは極めて乏しい生体内安定性を示し、ヒトACDSのSCIDマウスモデル に抗HIV活性を示さなかった。対照的に、以下に記載されるように、本発明のイ ムノコンジュゲートは全身毒性を引き起こすことなくヒトACDSのSCIDマウスモデ ルにおいて潜在的な抗HIV−１活性を示した。更に、カニクイザルにおいて、本 発明のイムノコンジュゲートは、8.1〜8.7時間の排出半減期で好ましい、薬理速 度を示した。50μｇ／kg／日×５日又は100μｇ／kg／日×５日の投与レベルでT XU−PAPで処理したサルは、いずれの重大な臨床的妥協又は副作用もなく、その 治療を極めて十分に許 容し、検死において、大きい又は微視的障害も見い出されなかった。これにより 、本発明のイムノコンジュゲートは、より長い血清半減期及びより大きな全身露 出によって測定されるように驚くべき生体内安定性を示す。 従って、本発明は、哺乳動物細胞においてウィルス感染を治療又はウィルス複 製を阻害する方法も供する。その方法は、本発明のイムノコンジュゲートの有効 量で、試験管内で哺乳動物細胞を、又はウィルス感染を有するもしくはその危険 のある哺乳動物を治療することを含む。本発明の一実施形態は、骨髄細胞系の哺 乳動物細胞及びＴ細胞においてHIV複製を阻害し又はウィルス負荷を減少させる 方法であり；それにより、まだAIDSを進展させていないHIV−１に感染したAIDS ，ARC又は無症候性患者を治療する方法を供する。本発明のイムノコンジュゲー トは、より慣用的な抗AIDS剤のうちの少くとも１つ、例えば抗ウィルスヌクレオ シドアナログ、例えば逆転写酵素インヒビタージドブジン(ZDV)との組合せにお いても、不要な副作用を引きおこすことなく、利用することができる。本方法は 、特に、ZDV耐性となったHIV株に感染した患者の治療に適する。 更に、本イムノコンジュゲートは、他のレンチウィルス（HTLV−１等）及びCD 7＋細胞に感染するレンチウィルス以外のウィルス、例えばこれらに限らないが 、ヘルペスウィルス群のメンバー(HSV，CMV，EBV)、インフルエンザウィルス、 リノウィルス、パポバウィルス（例えばヒトパピローマ）、アデノウィルス、肝 炎ウィルス等を阻害する有効な方法のための基礎も供し得る。 本発明は、更に単独で、又はこのような苦痛のための慣用的な治療と組み合わ せて、不要なＴ細胞増殖に関連した病気又は病因を治療するために役立つイムノ トキシンを供する。このような病因には、癌、例えばＴ細胞白血病又はリンパ腫 、急性骨髄性白血病、器官 拒絶、骨髄移植の拒絶又は自己免疫疾患、例えは全身性エリテマトーデス、慢性 関節リウマチ、非糸球体ネフローゼ、乾癬、慢性活性肝炎、潰瘍性大腸炎、クロ ーン病、ベーチェット病、慢性糸球体腎炎（膜質）、慢性血小板減少性紫斑病、 及び自己免疫溶血性貧血がある。イムノトキシンには、細胞毒性量のアメリカヤ マゴボウ抗ウィルスタンパク質に連結した、ヒトＴ細胞骨髄球抗原CD７に特異的 なモノクローナル抗体、又はその生物学的に活性なフラグメントもしくはサブユ ニットがある。好ましくは、本発明のイムノトキシンは、哺乳動物細胞の表面に 存在するCD７抗原に結合する、モノクローナル抗体TXU−７又はその生物学的に 活性なフラグメントもしくはサブユニットを用いる。 本発明の更に別の実施形態は、癌の治療のための治療方法である。その方法は 、それに苦しむ哺乳動物に、医薬として許容される担体と組み合わせて、アメリ カヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質に共有結合した、モノクローナル抗体TXU− ７、又はその生物学的に活性なフラグメントもしくはサブユニットを含むイムノ トキシンを含む所定量の医薬組成物を非経口的に投与することを含む。投与する 組成物の量は、癌を阻害し又は治療するために有効であり、例えばそれは細胞毒 性又は抗新形成の量である。好ましくは、治療するべき癌はＴ細胞、白血病、リ ンパ腫又は急性骨髄白血病(AML)である。用語“細胞毒性量”は、そのイムノト キシンがその細胞に会合した後に、標的細胞に対して毒性である所定量のアメリ カヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質を意味すると定義される。 標的抗原を欠如する末梢癌細胞は、特定の患者の治療において合併症を供し得 る。これらの場合、慣用的な化学療法又は放射線療法によって供される異なる細 胞毒性メカニズムを利用する組合せ又は補助的療法は、標的抗原を欠如するいず れかの癌細胞の除去及びイ ムノトキシン耐性変異体の抑制においで補助し得る。これにより、本発明の一実 施形態は、有効量の１又は複数の慣用的な抗新生物剤の投与を、例えば、前、間 もしくは後、又はそれらの組合せで組み合わせてのTXU−７−アメリカヤマゴボ ウ抗ウィルスタンパク質の投与を含む。好ましくは、用いる抗新生物剤は抗代謝 産物又はクラスＩもしくはクラスIII免疫抑制剤である。好ましくは、用いる抗 新生物剤はサイトアラビン、メトトレキセート、トリメトレキセート、５−フル オロウラシル、メルカプトプリン、チオグアニン、５−アザシチジン、フロキシ ウリジン又は２”−クロロデオキシアデノシン、シクロホスホアミド又はエトポ シドである。より好ましくは、用いる抗新生物剤は、シクロホスホアミド又はエ トポシドである。抗新生物剤を、約10mg／ml〜約30mg／mlの濃度で医薬として許 容される液体担体と組み合わせることも好ましい。本発明のこの実施形態におい て、抗新生物剤、例えばシクロホスホアミド又はサイトアラビンを静脈内に投与 することが好ましい。好ましくは、シクロホスホアミドは、0.5〜3.5Ｌ／Ｍ²／2 4時間の比率で投与される。 図面の簡単な説明 図１は、TXU(抗CD７)−アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質(PAP)の試験 管内抗HIV−１活性を示す。HIV−１株HTL V_III3に対するTXU−PAP(○)を、試験 管内p24 EIA(パネルＡ)及びRTアッセイ（パネルＢ）を用いて、Ｂ53（抗CD4）− PAP(○)、非コンジュゲートPAP(△)、AZT(□)、及びｄ４Ｔ（■）との横並びの 比較で評価した。RTアッセイからの非感染対照培養物でのバックグラウンドcpm( 即ち116±９cpm)も示す（○）。 図２は、試験管内でのHIV−１の潜在的な非毒性のインヒビター であることを示す。TXU−PAPは、投与量依存様式でｐ24生産（パネルＡ）及びRT 活性（パネルＢ）により並びに細胞への細胞毒性なしで（パネルＣ）測定してHI V−１複製を阻害した。CC、非感染陰性対照培養物；VC，HIV−１に感染している が未処理の陽性対照培養物。 図３は、TXU(抗CD7)−PAPの生体内抗HIV−１活性を示す。Hu−PBL−SCIDマウ スに臨床HIV−１単離物を接種し、PAPイムノコンジュゲートを、２つのスケジュ ール、Regimen A又はRegimen Bに従って投与した。HIV−１の感染後２週間に、 それらの腹腔洗浄細胞（パネルＡ及びＣ）並びに脾臓細胞（パネルＢ及びＤ）を 、PCR増幅により感染の証拠について検査した。特定のマウスを1mg／mlの最終濃 度で水に加えたAZTで処理し、平均200mg／kg／日のAZTの消費があった。対照は 、（１）ゲノムDNAを含まないPCR反応緩衝液(＝NEG CON)、（２）HIV−１感染し たが再構成していないSCIDマウス及び非感染Hu−PBL−SCIDマウスからのDNAの陰 性バックグラウンド対照としてのPCR反応産物、及び（３）HIV−１対照プラスミ ドDNA(POS CON)(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)並びに陽性対照としての感 染したが未処理のHu−PBL SCIDマウスからのDNAを含む。 図４は、B53（抗CD4）−PAPの生体内抗HIV−１活性を示す。B53−PAPの抗ウィ ルス活性を、処理したマウスのHIV状態を評価するためのHIV−PCRアッセイ及び 培養アッセイを用いて、ヒトAIDSのHu−PBL−SCIDマウスモデルで検査した。AZT を１mg／mlの最終濃度で水に加えた。対照は、（１）ゲノムDNA(＝NEGCON)を含 まないPCR反応緩衝液、及び（２）HIV−１対照プラスミドDNA(POS CON)(Perkin- Elmer Cetus，Norwalk，CT)を含む。N.D.未測定。 図５は、TXU−PAP処理したカニクイザルからの血漿サンプルの 試験管内抗HIV−１活性を示す。非ヒト霊長類におけるTXU−PAPの毒性及び薬理 速度は以前に開示されでいる（本明細書に引用により組み込まれるWaurzyniakら 、前掲）。サル52Ｅに、50μｇ／kg TXU−PAPの１時間静脈内注入を行い、ザル5 2Ｄ及び410Ｃに、末梢血液サンプルの収集前、１時間に、100μｇ／kg TXU−PAP の１時間静脈内注入を行った。固相ELISAに基づくTXU−PAPレベルは52Ｅ血漿に おいて1027mg／mL、52D血漿において5800mg/mL、及び410C血漿において5597mg／ mLであった。HIV−１複製への、連続的に希釈した血漿サンプルの試験管内効果 を、p24EIA及びRTアッセイを用いて検査した。その活性データは、用いた血漿希 釈率（DE）に従って供する。 発明の詳細な記載 本発明は哺乳動物の癌及びウィルス感染、例えばレトロウィルス及びレンチウ ィルス、例えばHTLV−１，HTLV−II，SIV，HIV−１及びHIV−２等による感染の 治療に役立つイムノトキシン又はイムノコンジュゲートに関する。特に、本発明 は、ARC，AIDS、又は無症候性HIVもしくはHTLV感染の治療に役立つイムノコンジ ュゲートを供する。本発明は、ALL及びAMLを含む、癌の治療に役立つイムノトキ シンにも関する。 １．イムノトキシン イムノトキシンが有効であるためにいくつかの要求が満たされなければならな い。とりわけ、イムノトキシンは特異的であるべきであり、標的哺乳動物にとっ て有害である程度まで標的抗原を発現しない組織と反応すべきでない（Pastanら 、Cell，47，641(1986)）。抗原を発現しない組織への結合は、生物治療成分、 例えば植物グリコプロテイントキシン又は抗ウィルス剤の非特異的な天然の細胞 結合サブユニット又はドメインの除去により減少させることができる。更に、植 物グリコプロテイン毒素は細網内皮系の細胞に結合するマンノースオリゴサッカ ライドを含み、特定の場合、肝細胞上のレセプターにより認識されるフコース残 基も含むので、植物トキシンの脱グリコシル化は、迅速なクリアランス及びこれ らの細胞への潜在的な細胞毒性効果を避けるために要求され得る。第２に、トキ シンの抗体への結合は、抗体の抗原に結合する能力を実質的に害さないはずであ る。第３に、イムノトキシンは、エンドソームのベシクル内に有効にインターナ ライズされなければならない。これにより、正常にインターナライズされた表面 レセプターに対するモノクローナル抗体により誘導された毒素は、非インターナ ライズ細胞表面分子に対するものより活性であり得る。第４に、その毒素の活性 成分は細胞質に位置を換えなければならない。最後に、生体内治療のために、Mo Abと毒素との間の結合はイムノトキシンが哺乳動物の組織を通してその細胞の作 用の部位に通過する間、完全であり続けるのに十分に安定でなければならない。 毒素をモノクローナル抗体に結合さぜるのに用いるヘテロ二官能性クロスリン カーの最初の形成は、生体内で不安定であるジスルフィド結合を形成した。この 問題は、その結合へのアクセスを制限するために、ジスルフィド結合に隣接した フェニルもしくはメチル基、又は両方を用いるより安定なクロスリンカーの合成 によって部分的に解決された。これらの種々のアプローチは、衝突であり得る： 例えば、リシンのＢ鎖の除去は非特異的結合を減少させるが、残りのＡ鎖モノク ローナル抗体コンジュゲートがエンドソームベシクル膜を横切って転位する能力 も減少させる。 イムノトキシンの活性は、最初に、表面上の標的抗原で細胞を殺す能力を測定 することにより評価される。毒素は細胞内で作用する ので、エンドサイトーシスにより自然に細胞に入るレセプター及び他の表面タン パク質は、通常、イムノトキシンのための適切な標的であるか、細胞表面上に固 定された表面タンパク質は、そうでない。しかしながら、同じ細胞表面タンパク 質上で異なるエピトープを認識するいくつかの抗体が利用できるなら、それら全 てをテストするのが有用である。これは、いくつかの抗体は、おそらく標的タン パク質内でのコンホメーション変化を行うことにより、毒素転位のための適切な 位置へのインターナリゼーション又は細胞内誘導をより有効に誘導することがで きるからである(Mayら、Cell Immunol，135，490(1991))。また、レセプターが 有効にインターナライズされるなら、イムノトキシンを調製するために必要とさ れる化学修飾のため、レセプターに強力に結合しないイムノトキシンを用いるこ とが可能である(Willinghamら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84，2474(1987)) 。 Ａ．モノクローナル抗体 モノクローナル抗体(MoAbs)は、骨髄一次腫瘍の悪性細胞（ミエローマ）との 脾臓リンパ球の融合によって生産される（Milstein，Sci．Am.，243，66(1980) ）。その手順は、ハイブリッド細胞系、又はリンパ球及びミエローマ細胞系の両 方の特徴を有する単一の融合した細胞ハイブリッドから生ずるハイブリドーマを 作り出す。（抗原としてヒツジ赤血球でプライムした動物からとった）リンパ球 のように、融合したハイブリッド又はハイブリドーマは抗原と反応する抗体（イ ムノグロブリン）を分泌する。更に、ミエローマ細胞系と同様に、ハイブリッド 細胞系は不死である。特に、ワクチン接種した動物由来の抗血清は同一に再現で きない抗体の種々の混合物であるが、ハイブリドーマにより分泌されるイムノグ ロブリンの単一の型は、抗原上の１つの及び唯一の決定基、多重の抗原性分子サ ブ構造を有する複合体、又は決定基（エピトープ）に特異的である。従って、単 一抗原に対して生じたモノクローナル抗体は、それらの形成を誘導する決定基に 依存して、互いに別個であり得る。しかしながら、所定のクローンにより生産さ れた抗体の全ては同一である。更に、ハイブリドーマ細胞系は無制限に再生させ ることができ、試験管内及び生体内で容易に増殖させることができ、そして極め て高濃度でモノクローナル抗体を生産することができる。 モノクローナル抗体は、癌の診断及び治療、自己免疫及び移植片対ホストの疾 患（GVHD）の治療のために免疫抑制するための免疫応答の調節並びに同種移植片 拒絶の防止のために臨床的にかなり適用されている。ヒトモノクローナル抗体は 、サイトメガロウィルス、バリセラ・ゾスター（Varicella zoster）ウィルス、 並びにシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginsa）、大腸菌、及 びクレブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiela pneumoniae）の種々の特定の血清 型に対しても臨床的に適用されている。 本発明に役立つモノクローナル抗体は、公知のハイブリドーマ融合技術(G．Ko hler及びC．Milstein，Eur．J．Immunol．6，511(1976);M．Shulmanら、Nature ，276，269(1978))を用いて生産ささる。上述の通り、本発明は、Ｔ細胞に対す るモノクローナル抗体を用いる。好ましくは、特定の抗体は、CD７＋Ｔ細胞に特 異的である。より好ましくは、抗体はTXU−７である。 １．TXU−７ MoAbTXU−７（ネズミIgG1：カッパクラス）はヒトＴ系列リンパ細胞で、最も 重要なのは、Ｔ系列リンパ球悪性腫瘍において白血病始原（幹）細胞）で発現さ れるCD７／41kDa抗原を認識する。 Ｂ．毒素 多くの非修飾MoAbの限られた効能は、別のアプローチ、即ち、毒 素のための担体としてのこれらの剤の使用を導いた。細菌及び植物の源のアレイ はイムノトキシンの生産のためのMoAbに結合されている。そのストラテジーは、 自然から細胞毒性タンパク質を選択し、次にそれが正常な細胞にもはや識別でき ないように結合せず、それを殺さないが、かわりにMoAbに結合した抗原を発現す る細胞のみを殺すであろうように細胞毒性タンパク質を改変することである。最 適に有効であるために、このようなアプローチは、所定のMoAbのために細胞表面 上に限られたレセプター部位があるので、比較的少数の細胞毒性分子のインター ナリゼーションが標的細胞に対して致死的であることを要求する。細胞のタンパ ク質合成を不活性化する特定の細菌及び植物により生産される毒素はこの基準に 合致する。それは、立体化学的に機能するほとんどの化学治療剤と異なり、それ らはそれらの致死活性において触媒するからである。一般に、細胞の細胞質内の 10未満の毒素分子からの細胞を殺すのに十分である。 タンパク質合成を不活性化する２つのクラスの毒素がイムノトキシンの作製に 広く用いられている。第１のクラスは、完全な毒素、例えば完全なリシンからな る。例えば、Leonardら、前掲を参照のこと。これらの毒素は、致死的毒性のた め、生体内に安全に適用することができない。第２のグループの毒素はヘミトキ シンと呼ばれる。相捕的様式でタンパク質合成を致死的に阻害するヘミトキシン は、それがもはや延長因子２と生産的に相互作用することができないように、リ ボソームを共有結合的に改変する。この後者の毒素のファミリーには、アメリカ ヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（PAP）リシン、アブリン、ゼロニン、サポリ ン、及びα−サルシンがある。植物由来のリボソーム不活性化タンパク質は、結 合鎖及び触媒鎖（例えばリシン）を含む２つの鎖、又は単一の触媒鎖のみ（例え ばPAP又はサポリン）からなる。１．PAP PAPは毒素のヘミトキシングループの一員であり、これにより、全ての大きなr RNAの３’末端近くに見い出される保存性ループ配列からの単一アデニンの特異 的除去によりリボソームを不活性化する(Irvinら、Pharmacology and Therapent ics ， 55，279(1992))。この特異的脱プリン化は、伸長因子がリボソームと相互 作用する能力を大きく減少させ、タンパク質合成を不可逆的に停止させる（Irvi nら、前掲）。更に、PAPは最も活性なリボソーム不活性化タンパク質の１つであ る。抗マウスIgGイムノトキシンゼロニン、リシンＡ鎖、モモルジン、ジアンチ ン32、サポリン、及びPAPの細胞毒性の比較において、PAP構成物はテストされた 最も潜在的なイムノトキシンの中の１つであった(Irvinら、前掲、Bolognesiら 、Clin．Exp．Immunol.，89，341(1992))。 発現が季節に依存する３つのサブタイプのアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタン パク質(PAP)がある。PAPはアメリカヤマゴボウ（Phytolacca americans）の春の 葉に見い出され、PAP−IIは夏の終りの葉に見い出され、そしてPAP−Ｓは種子に 見い出される。(Irvin，Pharmacol．Ther.，21，371(1983))。それらは大きさに おいて小さな差があり（全て約29,000MW)、それらがリボソームを触媒的に限定 する能力間はいずれも小さな差しかない(Houstonら、“Immunological Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer,”C.W．Vogel，ed.，New York，Oxford University Press，p．71(1987))。 Ｃ．TXU−７−PAPの生産及び精製 本方法に用いるための好ましいTXU−７−PAPイムノトキシンは、有効な細胞毒 性又は抗ウィルス量のPAP分子をTXU−７の各々の分子に連結させることによって 形成される。例えば、本発明の実施 に役立つ試薬は、TXU−７分子当りに１〜２のPAP分子を含む。好ましくは、本発 明の比較は、ａ）PAP １分子／TXU−７の１分子、及びｂ）PAP ２分子／TXU−７ の１分子の約１：１混合物を含む。好ましくは、本発明の組成物は、主に、完全 なTXU−７モノクローナル抗体分子、遊離TXU−７ MoAb、及び遊離PAP当り１又は ２のPAP分子を含む。より好ましくは、本組成物１mg中には、TXU−７ MoAbの各 々の分子に結合したPAP １分子を含む180kDa TXU−７−PAP 420μｇ、TXU−７ MoAbの各々の分子に結合したPAP ２分子を含む210kDa TXU−７−PAP 395μｇ、 非コンジュゲート遊離TXU−７ MoAb 130μｇ、及び非コンジュゲート遊離PAP 5 5μｇがある。 以下の実施例４及び５に用いる特定のTXU−７−PAPは、引用により本明細書に 組み込まれる米国特許4,831,117に記載されるように、TXU−７ MoAbをPAPに連結 させることによって調製される。 TXU−７−PAPの生産及び精製の更なる記述は、実施例１〜３に見い出すことが できる。しかしながら、TXU−７は、開示される他の手段、例えば米国特許4,363 ,758（Masuhoら）；5,167,956（Neville Jrら）及び4,340,535（Voisinら）に教 示されるものによって有効量のPAPに連結させることができる。例えば、Ｎ−ス クシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）に加えて、４ −スクシニミジルオキシカルボニル−メチル−（２−ピリミジルジチオ）−トル エン（SMPT）及びＮ−スクシニミジル６−〔３−（２−ピリジルジチオ）プロピ オンアミド〕ヘキサノエート（LC−SPDP）を連結剤として用いることができる。 Ｄ．TXU−７−PAPの投与の態様 本発明のイムノトキシン又はその組合せは医薬組成物として調剤することがで き、癌を患う又はウィルスに感染したヒト又は他の哺 乳動物に、好ましくは、医薬として許容される担体もしくはビヒクルと組合わせ て、及び／又は他の治療剤と組み合わせて、有効量の１又は複数のイムノトキシ ンを含む単位投与形態として投与することができる。 １．投与形態 本発明のTXU−７−PAPイムノトキシンは、非経口的に、即ち注射又は注入によ り静脈内に又は皮下に投与することか好ましい。イムノトキシンの溶液又は懸濁 液は、水又は生理食塩水、例えば等張塩類溶液又はPBS中に、任意に非毒性界面 活性剤と混合して調製することができる。より好ましくは、イムノトキシンは、 150mM塩化ナトリウムを含む40mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5中に約1.0mg／m Lの濃度で調製され、静脈内投与のためには更に0.9％塩類溶液に希釈される。 イムノトキシンは、本明細書に記載されるように、液体組成物として投与する ことが好ましいが、種々の他の担体と共に投与することができる。例えば、グリ セロール、液体ポリエチレングリコール、DMA、植物油、トリアセチン、及びそ れらの混合物中に分散物を調製することもできる。貯蔵及び使用の通常の条件下 において、これらの調製物は、微生物の生長を防ぐための防腐剤を含み得る。更 に、イムノトキシンの肺へのより特異的なデリバリーは、エーロゾルデリバリー システムによって達成することができる。エーロゾルデリバリーのために適した 組成物はデボ製剤、例えば適切な大きさのリボソームを含み得る。 注射又は注入のために適した組成物は、滅菌注入又は注射溶液又は分散液の即 席調製物に適したイムノトキシンを含む滅菌水溶液又は分散物もしくは滅菌粉末 を含み得る。全ての場合において、最終的な組成物は、製造及び保存の条件下で 滅菌、流体状及び安定でな ければならない。液体担体又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオー ル（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコ ール等）、植物油、非毒性グリセロールエステル、脂質（例えばジシリストイル ホスファチジルコリン）及びその適切な混合物を含む、溶媒又は液体分散媒体で あり得る。正確な流動性は、例えば、リボソームの形成により、分散液の場合は 必要な粒径の維持により、又は非毒性界面活性剤の使用により、維持することが できる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、 クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサル等によって達成するこ とができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、緩衝液又は塩化ナトリウムを含め ることが要求されよう。注入用組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる剤、例 えばアルミニウムモノステアレートヒドロゲル及びゼラチンを組成物内に含める ことによりもたらすことができる。 滅菌注入又は注射溶液は、必要量のイムノトキシンを、上述の種々の他の成分 と共に適切な溶媒に組み込み、そして必要に応じて、ろ過滅菌することによって 調製される。滅菌注入又は注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製 の方法は、活性成分の粉末＋先の滅菌溶液中に存在するいずれかの更なる要求さ れる成分を作り出す真空乾燥及び凍結乾燥技術である。 更に、本発明のイムノトキシンのための適切な製剤は、経口、直腸、鼻、局所 （眼内及ひ舌下を含む）もしくは膣内投与に適したもの、又は吸入もしくは吹き 込みによる投与に適した形態を含む。その製剤は、薬学界で公知の方法のいずれ かによって調製することができる。このような方法には、イムノトキシンを液体 担体と一緒にし、又は固体担体を細かく分割し、又は両方を行い、次に必要に応 じてその産物を要求される製剤に成形するステップを含む。 経口投与に適した医薬製剤は、便利には、各々所定の量の活性成分を含む別個 の単位、例えばカプセル、サチェット、又は錠剤として；粉末又は粒子として； 溶液、懸濁液として、又はエマルションとして供することができる。活性成分は 、ボーラス、舐剤又はペーストとして供してもよい。経口投与のための錠剤及び カプセルは、慣用的な賦形剤、例えば結合剤、充填剤、滑剤、分解剤、又は湿潤 剤を含み得る。錠剤は、当該技術で公知の方法に従ってコートすることができる 。経口液体調製物は、例えば水性又は油性懸濁液、溶液、エマルション、シロッ プ又はエリキシルの形態であり得、又は使用前に水又は他の適切なビヒクルでの 構成のための乾燥製品として供することができる。このような液体調製物は、慣 用的な添加物、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含む）、又は 防腐剤を含み得る。 本発明のイムノトキシンは、鼻内又は眼内投与のために調剤することもできる 。この投与の形態において、活性成分は液体スプレーもしくは分散性粉末として 又は液滴の形態で用いることができる。液滴、例えば点眼剤は、１又は複数の分 散剤、可溶化剤又は懸濁剤も含む水性又は非水性塩基と共に調剤することができ る。液体スプレーは、便利には、加圧パックから送り出される。 吸入による投与のために、イムノトキシンは、便利には、吸入器、ネブライザ ーもしくは加圧パックから、又は他のエーロゾルスプレーをデリバリーする便利 な手段により送り出される。加圧パックは、適切な推進剤、例えばジクロロジフ ルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二 酸化炭素又は他の適切なガスを含み得る。加圧エーロゾルの場合、投与単位は、 計量した量を送り出すためにパルプを供することにより決定することができる。 あるいは、吹き込みの吸入による投与のため、イムノトキシンは、乾燥粉末組 成物の形態、例えば化合物の粉末混合物又は適切な粉末ベース、例えばラクトー ス又はデンプンの形態をとり得る。粉末組成物は、単位投与形態で、例えばカプ セル又はカートリッジ、又は例えばゼラチン又は粉末が吹き入れ器の吸入器によ り投与することができるゼラチン又はブリスターパックで供することができる。 更に、本発明のイムノトキシンは、調節放出投与形態において調剤するのに十 分に適する。製剤は、それらか単独で又は好ましくは特定の生理的位置に、任意 に所定の期間で活性乾燥成分を放出するように構成することができる。コーティ ング、エンベロープ、及び保護マトリックスは、例えばポリマー物質又はワック スから作ることができる。その化合物は、経口デリバリーのためのパッチ、皮下 インプラント、注入ポンプ、又は移植したデボ持続性放出投与形態からの放出に よっても送り出すことができる。 ２．投与量 本発明の組成物中のイムノトキシンの投与量は、哺乳動物及び病気の大きさ、 年齢及び状態に従って広範囲で多様であり得る。例えば、TXU−７ PAPが癌を阻 害する投与量は、約10〜約100,000ng／ml、好ましくは約100〜約10,000ng／mlで ある。これにより、成人のために、癌を阻害するために投与されるTXU−７ PAP の投与量は約１μｇ／kg〜約1000μｇ／kg、好まし，くは約50μｇ／kg〜約500 μｇ／kg、より好ましくは約10μｇ／kg〜約250μｇ／kgである。ウィルス感染 を阻害するために投与されるTXU−７ PAPの投与量は１μｇ／kg〜約750μｇ／kg 、好ましくは約５μｇ／kg〜約250μｇ／kg、より好ましくは10μｇ／kg〜約50 μｇ／kgである。投与量は、固相ELISAにより決定して、所定の患者におけるTXU −７−PAPイムノトキシンの血漿半減期に基づく頻度で投与される。特定の 場合にはより高い投与量を用いることができ、その投与量は、先の式を用いてイ ムノトキシンの適量を子供に供するように直ちに調節することができる。 本発明は、以下の詳細な例を引用しで更に記載されよう。 実施例１．アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（PAP） Ａ．アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質(PAP)の調節及び精製 アメリカヤマゴボウ（Phytolacca americans）の葉をCaldwell County，Texas において自然から５月に収集する。以下に記載の臨床用TXU−PAPイムノトキシン の生産に用いたこれらの春の葉からのPAP（Loｔ＃P-1993）を以下の手順に従っ て調製した：5kgの新しい又は凍結したアメリカヤマゴボウの葉をキッチンジュ サー(Acme model 5001)で汁をしぼり、遠心により透明にした。PAPを含む上清を 固体硫酸アンモニウムを加えることによって40％飽和に調節し、40℃で45分、10 ,000×ｇで遠心した。生じた上清を固体硫酸アンモニウムで90％飽和に調節し、 遠心によりその沈殿を収集した。 そのペレット（沈殿したPAPを含むもの）を最小量の10mM Tris-HCl、pH8.0に 溶かし、同じ溶液に対して一晩、透析した。その透析液を交換し、６〜12時間、 続けた。次にその透析した硫酸アンモニウム画分を、目の粗い酸ベースで洗浄し たDEAEセルロース（DE52及びCDR，Whatman）の２cm床に通し、ブッフナー漏斗に パックし、そしてそのろ液を、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6）で平衡化した ５×48cmＳ−Sepharoseカラムに適用した。そのカラムを１Ｌの平衡化緩衝液で 洗い、そのタンパク質は、平衡化緩衝液中0〜0.5KClの2500mL直線勾配で溶出し た。 約700mL〜1000mLで溶出するPAPピークをPN−30膜（Amicon）での限外ろ過によ り濃縮し、−70℃で凍結した。その手順により、１ 日当り５kgのアメリカヤマゴボウの葉を処理し、ルーチン的に、アメリカヤマゴ ボウの葉１kg当り80〜85mgの精製PAPを供し、１週間以内に400〜1000mgの精製PA Pを供した。 Ｂ．アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質(PAP)の質の制御 １．SDS−PAGE PAP毒素の純度を生化学的に確認するために、精製PAPの1.5〜３μｇサンプル を、Laemmli（Nature，227，680(1970)）に記載される方法に従って変性条件下 での15％分離ゲル及びBio−Rad MiniProteanIIスラブゲルを用いてSDS−PAGEに より分析した。ゲルは、Bio−Rad Laboratoriesから得られたクーマシーブルー 又は銀染色キットで染色し、脱染色し、乾燥させ、そして以下に記載のBeckman DV62スペクトロホトメーター及びGel Scan Soft-Pac Moduleソフトウエアー(Bec kman Instruments，Fullerton，CA)を用いてスキャンした。PAPの純度を、更に 、ウサギ抗PAP一次抗体及びアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ 抗ウサギIgG二次抗体を用いてウエスタン・ブロット分析により確認した。 PAPのSDS−PAGEは、単一な29kDaタンパク質バンドを示した。クーマシーブル ー染色したゲルのデンシトメータースキャンは、PAPがレーン内にタンパク質の9 9.0％を示すことを示した。更に、単一バンドを、イムノブロッティング手順の 間に抗PAP一次抗体により同定した。２．高性能液体クロマトグラフィー（HPLC） PAPの純度を、SP−５PW 7.5×75mm分析カラム及びBeckman System Gold HPLC System並びにSystem Gold Chromatography Software(Beckman Instruments，San Ramon，CA)を用いてイオン交換HPLCによっても評価した。１ml/分の流速を用い て、PAPは20分で、20mMリン酸カリウム緩衝液pH７中0〜300mM塩化カリウム勾配 で溶出 した。 精製PAPは、SP−５PW7.5×75mm分析カチオン交換HPLCカラムでの20分の20mMリ ン酸カリウム緩衝液pH7.0中０〜300mM塩化カリウム(KCl)勾配にかけた時に、12 〜13分の滞留時間で鋭いピークとして特徴的に溶出された。明白なHPLCピークの 自動一体分析は、PAPがその調製物中に存在する全タンパク質の99.0％であるこ とを示す。 ３．精製PAPのＮ末端アミノ酸配列 10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0中の高度に精製したPAPタンパク質30mgを、 Applied Biosystems Model 470A気相タンパク質シーケンサーを用いて、Edman及 びBegg（1967）に開示され、Hunkapillerら（1983）により改良された自動分解 法に従って、University of Minnesota Microchemical Facilityで配列決定した （Edmanら、Eur．J．Biochemistry，1，80(1967);Hunkapillerら、Methods in E nzymol，91，399(1983)）。オンラインモデル120Ａ HPLC（Applied Blosystems ，Foster City，CA）を用いる高性能液体クロマトグラフィーを、フェニルチオ ヒダントインアミノ酸を同定するために用いた。各々のエドマン分解サイクルに ついて生成されたサンプルのHPLCクロマトグラムを、フェニルチオヒダントイン アミノ酸標準について得られた同様のHPLCグロマトグラムと比較した。 エドマン分解反応43サイクルの後、アミノ酸残基を割り当てた。そのアミノ末 端配列は、以前にHoustonら(J．Biol．Chem．258，9601(1983))により公開され ている32アミノ酸残基の配列と一致する。この配列は、リシン酸基が（フェニル アラニンのかわりに）位置15に見い出され、アルギニン残基が（グルタミンのか わりに）位置24に見い出される点でReadyらにより報告される30残基のうちの１ つと異なる(Readyら、J．Biol．Chem．259，15252(1984))。 システイン残基は、生じた修飾システイン残基を同定するために誘導化されてい るPAPのサンプルで行った更なる配列決定実験の間、位置34に試験的に割り当て た。重要なのは、３つの異なるPAPの調製物で同一の配列データが得られたこと であり、このことは、その精製手順の再現性を確認する。顕著なのは、この高度 に精製されたPAPの調製物１ｎモルで配列データが得られたことである。 ４．PAP毒性の無細胞タンパク質合成阻害アッセイ PAPのリボソーム阻害活性を、Promega Biotec，Inc．(Madison，WI)からキッ ト型で得たPelham及びJacksonにより開発された方法に基づく無細胞翻訳系で分 析した（Pelhamら、Eur．J．Biochem.，67，247(1976)）。この系は以下のもの からなる；ヌクレアーゼ処理したウサギ網状赤血球ライゼート（35μＬ）、１mM アミノ酸混合物(ロイシンを除く)(１μｌ)、〔³Ｈ〕ロイシン(183Ci/mmol，１mC i/mL，Amersham Corp.，Arlington Hts，IC.)、５μｌのブロムモザイクウィル スRNA(２μＬの0.5μｇ／μＬストック）、及びアッセイチューブ当り最終容量5 0μＬにするような水又は緩衝液。サンプルをPBS中に希釈し、2.5〜５μＬの量 をそのライゼートに加えた。対照サンプルから毒素を除いたものを三回重複でセ ット−アップした。０時間（〔³Ｈ〕−ロイシン及びRNAを加え、静かに混合して 反応を開始した直後）に、その対照から10μＬアリコートを除去し、１mLの１Ｎ NaOHと混合してその反応を停止させた。その対照毒素処理サンプルを更に60分 、37℃でインキュベートし、この時に、10μＬサンプルを再びNaOHにとり、混合 し、そして50μＬの30％ H₂O₂を加えてサンプルを脱色した。 37℃で10分のインキュベーションの後、そのチューブを氷浴に移し、そして２ mLの冷４％カザミノ酸、次に２mLの冷50％トリクロロ酢酸(TCA)を加えて合成さ れたタンパク質を沈殿させた。氷上で30 分後、そのサンプルをGF／Ｆガラスマイクロファイバーフィルター(Whatman，It illsboro，OR)を通してろ過した。タンパク質合成不活性化の程度を、対照応答 割合＝100×（毒素処理サンプルについての〔³Ｈ〕−ロイシン取込み〔＋60’で の平均cpm−toでの平均cpm〕）／非処理対照についての（〔³Ｈ〕−ロイシン取 込み〔＋60’での平均cpm−toでの平均cpm〕）として測定する。 TXU−７−PAPイムノトキシンの臨床バッチを調製するのに用いた精製PAPバッ チ（ｎ＝６）は、例えば、ウサギ網状赤血球を含まない翻訳アッセイにおいてリ ボソーム阻害活性についてテストした時、0.34±0.06μｇ／mL（範囲＝0.17〜0. 58μｇ／mL、12.2pM；範囲＝6.0〜20pM）のIC（平均SE）値及び3.7±1.1μｇ／m L(範囲＝0.63〜7.5μｇ／mL、130.37pM；範囲＝22〜263pM)のIC値を有した。 以下の表１は、精製PAPでの質制御分析データを要約する。 実施例２．モノクローナル抗体TXU−７ Ａ．モノクローナル抗体TXU−７の調製 TXU−７ MoAbを、ハイブリドーマ細胞系の培養上清から得た。TXU−７ MoAbの 大規模生産を、デジタル化ACUSYST−JR（69.8cm幅×66cm深さ×52cm高）ベンチ トップ自動化中空繊維細胞培養システム(Cellex Biosciences，Inc.，Coon Rapi ds，MN)を用いて、Center for Biologics Evaluation and Research(CBER)，FDA の一般的な忠告（“Points to Consider in the Manufacture and Testing of M onoclonal Antibody Products for Human Use”，1994，FDAの文献に詳述）に従 って行った。 10,000ダルトン分子量カットオフ膜を備えた１つの中空繊維バイオリアクター (表面領域＝1.1m²)を含むフローパスに、抗体を含まない45mLのFBS(10％ｖ／ｖ) を補給したRPMIの容量で、TXU−７MoAbを分泌する2.4×10⁸の生存ハイブリドー マ細胞を接種した。接種後、毛管内空間(ICS)を無血清かつ無抗生物質RPMIを連 続的に再循環させた。RPMIを補給した胎児ウシ血清(FBS)をバイオリアクターの 毛管外空間(150mL)にのみ用い、補給していないRPMIを中空繊維システムのICSを 通して循環させて栄養素及び溶解した酸素を供し、廃棄物を除去した。細胞代謝 を溶けた酸素及び１日おきに較正した。pHプローブによりライン上で連続的にモ ニターした。ECSからの毎日のサンプルをpH、重炭酸、グルコース、乳酸、溶け た酸素、及び二酸化炭素CpO₂及びpCO₂）、並びにマウスIgGレベルについてアッ セイした。媒体が気体交換カートリッジ中で酸素化される速度は、ACUSYST−JR におけるベローポンプによって制御される。その上清を100〜200mL／日の速度で 収集した。同時に、同じ速度で、新しく調製したFBS−供給RPMIをECS(毛管外空 間)に送り出した。 ECS中のTXU−７ MoAbの濃度を以下の通り固相ELISAにより決 定した；Falcon Micro Test１に培養プレート（Cat．＃3070）のウェルを50μＬ のアフィニティー精製したヤギ抗マウスIgG（100μｇ／mL；Cappel，Orgaron Te knika Corp.，Westchester，PA）でコートした。37℃で一晩のインキュベーショ ンの後、プレートを、0.05％ Tween 20（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO） を含むPBSで３回、洗った。そのウェル表面上のバックグラウンド部位を、2.5％ ウシ血清（Hyclone，Logan，UT）を捕給した100μＬ／ウェルのPBSで37℃で２時 間、ブロックした。次に、ウェルを、テストサンプルを加える前に、0.05％ Twe en 20を含むPBSで３回、洗った。テストサンプル（50μｌ／ウェルで３回重複） は、無希釈、１：100希釈、又は１：500希釈したECSからの上清である。標準と して、精製したTXU−７ MoAbを0.01〜10.0μｇ／mLの濃度に、2.5％ウシ血清を 含むPBS中に連続的に希釈し、各々の希釈物からの50μＬサンプルを３回重複ウ ェルに加える。37℃で２時間のインキュベーションの後、プレートを0.05％ Twe en 20を含むPBSで３回、洗った。ペルオキシダーゼに連結したヤギ抗マウスIgG の１：500希釈物50μＬ（Cappel）を、次に各々のウェルに加えた。37℃で30分 のインキュベーションの後、プレートを、0.05％ Tween 20を含むPBS中で３回洗 い、50μＬのABTS（ペルオキシダーゼ基質システム；Kirkegaard & Pervy，Gait hersburg，MD）をウェルの各々に加えた。そのプレートを、ELISAリーダー（Dyn atech MR 580 Micro ELISAオートリーダー）を用いて465nm吸光度で15分後に読 んだ。ECS上清の抗体濃度を、精製TXU−７ MoAbの周知の量を用いて回帰分析に よって作った標準曲線から決定した。 72日の生産を行う間、ECS中のグルコース濃度を340〜440mg％に維持するため に、グルコース消費の増加に応じて25mL／hr（＝６00mL／日）〜360mL／hr（＝8 640mL／日）に段階的に増加させた。 pO₂を120〜190mmHgに維持し、pCO₂を24〜80mmHgに維持した。そのpHを、気体交 換カートリッジを通してCO₂／空気混合物の速度を調節することにより、及びECS 中の乳酸濃度を調節することにより、7.0〜7.2ユニットの範囲に維持した。重炭 酸は15〜25mmol／Ｌの範囲であり、乳酸は2.5〜9.5mmol／Ｌの範囲であった。AC USYST−JRバイオリアクターのECS中のTXU−７ IgG1濃度は５日目の34μｇ／mLの レベルが46日目の336μｇ／mLの最大値に増加した。全部で1.2ｇのTXU−７ IgG を、生産の過程の間、7.55Ｌの全量でECSから収集した。ECS中のTXU−７ MoAbの 平均濃度は0.16ｇ／Ｌ(160mg／Ｌ)であった。 Ｂ．モノクローナル抗体TXU−７の精製 TXU−７ MoAb（Lot＃Ａ−1993）を、２つの15ワット殺菌紫外（UV）ランプを 備えた49cu.ft.クロマトグラフィーキャビネット（Model 450 Puffer Hubbard， New York，NY）中にセット−アップしたBio−Rad Laboratories（Hercules，CA ）からのAffi−Prep Protein A MoAb精製システムを用いて、収集したACUSYST− JR培養上清から精製した。 その支持体は、親水性ポリマービーズに架橋したプロテインＡの高度に精製し た調製物からなる。その樹脂は、１ＮのNaOHできれいにし、pH２〜14で安定で1, 000psiまでの圧力である。そのプロテインＡ調製物はハイロジエンを含まず、非 毒性であり、溶出物の５μｇ／mL未満の漏出を有する。 収集した培養物上清を、最初に遠心して細胞デブリスを除去し、次にCentripr ep−30濃縮装置(Amicon，Beverly，MA)を用いて５mg／mLに濃縮した。次にその 上清を結合緩衝液(1.5Mグリシン＋３ＭNaCl pH8.9)で１：１に希釈し、同緩衝液 で先に平衡化したAffi−Prep Protein Aカラムに適用した。そのカラムを結合緩 衝液の15ベ ット容量で洗い、次にMoAbをpH４で溶出した。次にその精製した抗体を中和し、 濃縮し、そして150mM塩化ナトリウムを含む40mMリン酸ナトリウムpH7.5に対して 透析してろ過滅菌した。抗体濃度を、1.4のＥ₂₈₀ ^1%nm値を用いて分光測定により 決定した。全ての緩衝液は、エンドトキシンを含まない水（Baxter Healthcare Corp.，Deerfield，IL）中に作り、使用前にろ過滅菌した。Affi−Prep Protein Aカラムを、最後に100mMクエン酸で洗っていずれの残留したタンパク質をも除 去し、樹脂に残ったいずれのウィルス粒子も不活性化した。 Affi−Prep Protein A樹脂を用いて、収集したACUSYST−JR上清から、一回の ステップで１日当り100mgのTXU−７ MoAbを精製した。プロテインＡで精製したT XU−７ MoAbの全てのバッチからのアリコートを、変性条件下でポリアクリルア ミドゲル電気泳動により分析した(SDS−PAGE)。染色及び膜染色した後、その５ ％分離ゲルを乾燥させ、次にBeckman DU−62スペクトロオートメーター及びGel Scan Soft−Pac Moduleソフトウェアーを用いてスキャンした。 精製したTXU−７ MoAbのサンプル(1.5〜2.5μｇ)を、５％分離ゲル（又は還元 条件下で15％）及び４％スタッキングゲルを用いて、Laemmliの方法に従ってSDS −PAGE(Bio−Rad LaboratoriesのMini−Protean IIIスラブゲル装置)により分析 した。（Laemmli、前掲）。予め染色した分子量標準（Amersham Corp.，Arlingt on Hts.，IC）は、リゾチーム(14.3kDa)、トリプシンインヒビター(21.5kDa)、 カルボニックアンヒドラーゼ(30kDa)、オブアルブミン(46kDa)、ウシ血清アルブ ミン(69kDa)、ホスホリラーゼＢ（97.4kDaサブユニット）、及びミオシン（200k Daサブユニット）を含んだ。ゲルを、クーマシーブルーＧ−250で染色し、10％ 酢酸／30％メ タノールで脱染色し、乾燥させ、そして次に、Beckman DU62スペクトロホトメー ター及びGel Scan Soft−Pac Moduleソフトウェアー（Beckman Instruments，Fu llerton，CA）を用いてスキャンした。より大きな染色感度が要求される場合、B io−Rad Laboratoriesから得た銀染色キットを利用してSDS−PAGE後にタンパク 質バンドを視覚化した（Merrilら、Science，211，1437(1981))）。 要約すると、ゲルを40％メタノール、10％酢酸溶液に移し、室温で一晩、保存 した。ゲルを10％エタノール、５％酢酸で２日洗い、酸化剤溶液で５分、インキ ュベートした。次に、蒸留水H₂Oで３回洗い、次に硝酸銀溶液で20分、インキュ ベートした。ゲルを１分、蒸留水で洗い、現像液（炭酸ナトリウム及びパラホル ムアルデヒドを含むもの）中に30分、おいた。その現像液を２×５分、新しい溶 液に置換し、次に５分、５％酢酸で洗った。ゲルをH₂O中に保存し、Ektachrome ASA 100フィルムを用いて写真をとった。標準５％及び15％分離ゲルについて、 タンパク質サンプルの見掛け分子量を、標準分子量の対数対ゲルへのマイグレー ションの距離のプロットから計算した。 アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウスIgG（Sigma Chemical Co.，S t．Louis，MO）を用いるウエスタン・ブロット分析及びBio−Rad Laboratories から得た検出キットを用いてTXU−７ MoAbの存在を確認した。このキットは、半 乾燥Semi−Phon装置(Model TE−70 Hoefer Scientific，San Francisco，CA)を 用いて、SDS−PAGEの後、ニトロセルロース膜に電気泳動で移したMoAbタンパク 質10ngを検出することができる。要約すると、25ngの精製TXU-７ MoAb及び10μ ｇの予め染色した分子量標準(Amersham Corp.，Arlington Hts，IC)を、１％ SD S、４％グリセロール及び0.025％ブロモフェノールブルーを含む62.5mM Tris pH 6.8中で３分、沸騰 し、５％アクリルアミドミニゲル（Mini−Protean II,Bio−Rad Laboratories， Hercules，CA）に走らせた（Laemmli、前掲）。ゲルからニトロセルロース膜へ のタンパク質の電気泳動での転位は、Towbinらに記載される方法を少し改良しで 行った(Towbinら、PNAS USA，76，4350(1979))。 電気泳動の後、ゲル、ニトロセルロース膜(0.4μｍ孔径、Bio−Rad Laborator ies)及びろ紙(３mm Whatman，Hillsboro，OR)を転移緩衝液（25mM Tris，192mM グリシン、pH8.3、0.01％（ｗ／ｖ）SDS及び10％（ｖ／ｖ）メタノール）中で５ 分、平衡化した“サンドイッチ”を、アノードに面し、緩衝液に浸した３つのろ 紙で各々の側面を覆ったゲルの側面上にゲルに対向して置いたニトロセルロース 膜で調製した。このサンドイッチをHoefer TE−70半乾燥転移ユニット（Hoefer Scientific Instruments，San Francisco，CA）に置き、70〜100mAmpの電流を、 30分、適用した。転移後、ゲルを転移効率を検査するため、クーマシーブル−Ｇ −250で染色した。そのニトロセルロース膜をTris緩衝塩類溶液(TBS、20mM Tris 、50mM NaCl、pH7.5)中で室温で一晩、保存した。 一段階イムノブロッティングを、以下の通りImmun−Blot Assayキット(Bio−R ad Laboratories)を用いて室温で行った：ニトロセルロース膜上のバックグラウ ンド部位を、プラットホームロッカー(Hoefer Scientific)上で静かに振とうし ながら、２時間、その膜を３％ゼラチン(EIAグレード、Bio−Rad Laboratories) を含むTBSにおくことによりブロックした。そのブロッキング溶液をデカントし た後、膜を10分、静かにゆすりながらTween−20を含む10mL Tris緩衝塩類溶液(T TBS、20mM Tris、500mM NaCl、0.05％ Tween−20、pH7.5)で洗った。その膜を静 かにゆらしながら、２時間、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウ スIgG(Sigma Che mical Co.)の300倍希釈物10mL中でインキュベートした。その膜を、再び、TTBS で２回、TBSで１回、洗い、次にｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド及 び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリホスフェート(Bio−Rad Laboratories )を含むアルカリホスファターゼ基質溶液中で10〜20分、インキュベートした。 その反応を、膜を５分、２回、10mLの蒸留水で洗い、次に２つのろ紙の間で膜を 乾燥させた。 精製したTXU−７ MoAbの個々のバッチをLotを形成するように組み合わせた。 臨床用TXU−７−PAPイムノトキシンを生成するのに用いた最終的なTXU−７ MoAb 調製物(Lot＃Ａ−1933)は99％超の純度であった。更に、ヤギ抗マウスIgG−アル カリホスファターゼコンジュゲートを用いるウエスタンブロット分析は、抗マウ ス抗体と交差反応する他のタンパク質がないことを証明した。 Ｃ．TXU−７モノクローナル抗体での質制御テスト及びプレ臨床研究 製造元の研究細胞バンクは、TXU−７ MoAb生産性ハイブリドーマ細胞系のマス ター細胞バンク(MCB)から確立された。MCB、及び精製したTXU−７ MoAbは、細菌 及び真菌を含む微生物汚染物についてスクリーニングするためMicrobiological Associates，Inc．(Rockville，MD)に送った。更に、MCBを寒天培養可能な及び 培養できないマイコプラズマの存在について及びネズミウィルス（MAP Test）に ついて、OBRR−FDA“Pointes to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use”に従ってテストした。TXU−７ を生産するMCBを、細胞病理的効果及び外来ウィルスの存在による赤血球凝集に ついてもアッセイした。 10倍に濃縮したTXU−７ MoAb含有収集物（精製前）を、電子顕 微鏡によりウィルス粒子について分析した。その抗体精製方法がウィルスを除去 ／不活性化する能力を、同様に濃縮した収集物を高タイターのモロニーネズミ白 血球ウィルス(MoMLV)でスパイクし、精製されたサンプルを、XCPlaqueアッセイ を用いて感染ウィルスについてアッセイすることにより評価した。更に、精製し たTXU−７ MoAb Lot ＃Ａ−1993のサンプルを残留MoMLVの検出のためにTektagen ，Inc．(Malvern，PA)に送った。以下の表２は、精製したTXU−７に基づく質制 御分析を要約する。 Ｄ．TXU−７モノクローナル抗体での免疫反応性研究 精製したTXU−７ MoAbの標的細胞への結合を、標準的な間接的免疫蛍光法（IF ）により決定した。要約すると、0.1mL PBS、2.5％ウシ血清(CBS)中10⁶の細胞を 、４℃で30分、種々の濃度のモノクローナル抗体と共にインキュベートした。イ ンキュベーションの後、細胞を洗い、30分、10μＬのFITCコンジュゲートヤギ抗 マウスIgG(Becton Dickinson，Mountain View，CA)又は50μＬのFITCコンジュゲ ートヤギF(ab’)₂抗マウスIgG(FITC−GAMG，CappelLaboratories，Cochranville ，NC)の１：20希釈物と共にインキュベートした。次に細胞を３日洗い、200μＬ のPBS、2.5％ CBS、NaN₃に再度懸濁し、そしてFACS 440又はFac Star Plusマル チパラメータフローサイトメーター(Becton Dickinson，Mountain View，CA)を 用いて分析した。 CD７抗原についてTXU−７の特異性を確認するためにデザインされた交差競合 実験において、細胞を、最初に、氷上で30分、100μｇ／mL非コンジュゲートTXU −７又はTXU−７ MoAbを含む腹水の１：100希釈物と共にインキュベートし、次 に、残りの遊離CD７抗体結合部位を検出するために１μｇ／mLで、Leu５（抗CD2 ）−FITC、Leu4（抗CD3）−PE、10.2（抗CD5）−PE、G3.7（抗CD7）−PE、又はL eu９（抗CD７）−FITCを加えた。氷上での30分のインキュベーションの後、細胞 を３回、洗って、FACS 440で分析した。 MoAb G3.7−PE及びLeu ９−FITC（抗CD７）を対照抗体として用いる。アルゴ ンレーザー(400MW、488nm)をFITC及びPEの励起のために用いた。FITC及びPEのた めの蛍光放射を、FITCについて530±15nmを、PEについて575±12.5nmを選択的に 収集することにより検出した。低角前方光散乱及び緑色蛍光データを、Consort 40 PDP／11コンピューターシステム（Becton Dickinson，FACS Division，Sunny vale，CA）による再分析のためのリストモードでスコアーした。リストモードデ ータファイルの分析の間、リンパ細胞は、それらの特徴的な低角前方光散乱及び 右角光散乱特性により、単球、顆粒球、及び死んだ細胞から識別された。 実施例３．TXU−７−PAP Ａ．TXU−７−PAPイムノトキシンの大規模生産及び精製 TXU−７ MoAb及びPAPの高度に精製した調製物（実施例１及び２の通り調製 ）を、TXU−７−PAPイムノトキシンの大規模調製のための出発材料として用いた 。全てのカラム溶出物を、使用前に、滅菌度及びエンドトキシンの存在（リムル ス変形細胞アッセイを用いる）についてテストした。TXU−７−PAPイムノトキシ ンの調製及び精製における以下の全てのステップを、滅菌したエンドトキシンの ない緩衝液及び装置を用いて、GLP条件下のUniversity of MinesotaのBiotherap y Programの“PAP-MoAb Conjugation Facllity”において行った。 １．TXU−７ MoAb及びPAPの改変 PAP毒素及びTXU−７ MoAbを、分子間コンジュゲーション反応の前に、遊離ア ミノ基により改変した。PAPに反応性スルフヒドリル基を導入するために２−イ ミノチオランを用い、TXU−７ MoAbに２−ピリジルジスルフィド結合を導入する ためにＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP） を用いた 。要約すると、40mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.5（PBS）中 ９〜14mg／mLの濃度の精製TXU−７ MoAb 70〜100mg量を、64mMの濃度で、使用前 にPBSで１：10に希釈した。DMSO(Hybri-Maxグレード、Sigma Chemical Co.，St ．Louis，MO)中に新しく調製した3.5：１モル過剰なSPDP（Ｎ−スクシニミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート(Pharmacia Biotech，Piscataway， NJ)と反応させた。PBS、pH８中10〜13mg／mLの濃度の50〜75mg量の精製PAPを50m Mリン酸ナトリウムpH8.6中20mM溶液として使用直前に調製した3.5倍モル過剰の ２−イミノチオランHCl（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）と混合した。両 方の改変反応物を、滅菌無エンドトキシン容器（Bayer，Spokane，WA）中で静か にゆすりながら、室温で２時間、処理した。 過剰な試薬及び低分子量反応産物を滅菌したエンドトキシンを含まないPBS、p H7.5中で平衡化したSephader G−25PD−10プレパックカラム(Pharmacia Biotech )でのゲルろ過により除去した。個々の画分を収集し、280mmでモニターするため にPBS中で希釈物を作った。タンパク質の大部分を含むこれらのものを組み合わ せ、抗体及びPAPの全量を、各々TXU−７及びPAPについて1.40及び0.83のＥ＿EQ ＼Ｓ(１％、280)値を用いて計算した。このゲルろ過ステップ後に回収されたPAP の量は改変にかけたPAPタンパク質の最初の量の91％（平均±SE＝91±1.3％）を 示した。ゲルろ過後に回収したTXU−７ MoAbの量は、改変にかけたTXU−７ MoAb タンパク質の最初の量の86％（平均±SE＝86＋3.6％）を示した。２．TXU−７ MoAb及びPAPのコンジュゲーション 改変したPAP毒素を、改変したTXU−７ MoAbと反応させてスルフヒドリル−ジ スルフィド交換反応をおこして、本明細書においてTXU−７−PAPイムノトキシン と呼ぶジスルフィド連結化PAP−T XU−７ MoAbコンジュゲートを生成した。特に、２−イミノチオラン誘導化PAPを 3.5：１の最終モル比でSPDP改変TXU−７ MoAbに加えた(PAP−TXU−７ MoAb)。こ の混合物を静かにゆすりながら、室温で２時間、滅菌無エンドトキシン容器内で インキュベートし、４℃で一晩放置した。次の日に静かに４〜５時間、ゆすり続 け、その後、その反応混合物を、HPLCステップのための調製物中にろ過した0.2 μｍ Acrodisc，Gelman Sciences，AnnArbor，MI)。 コンジュゲーション混合物からのサンプルのSDS−PAGE分析を、コンジュゲー ション効率をモニターするのにルーチン的に用いた。個々のタンパク質種の相対 量を、上述のゲルスキャンにより決定した。各々のコンジュゲーションにおいて 、この分析は、大量の未反応PAP及び相対分子量の異なるいくつかの別個のTXU− ７−PAPイムノトキシン種の存在を示した。180kDa及び210kDaの見掛け分子量に 相当する２つの主要なTXU−７−PAPイムノトキシンバンドが一貫して見い出され 、各々TXU−７ MoAb分子に連結した１又は２ PAPの存在と一致した。更に、240k Daの見掛け分子量に相当するTXU−７−PAPイムノトキシン種が見い出され、各々 のTXU−７ MoAb分子に連結した３つのPAP分子、及び300kDa超の分子量に相当す る極めて大きなイムノトキシン種の存在と一致した。イムノトキシン種における TXU−７ MoAb及びPAP毒素分子の存在を、抗PAP及び抗マウスIgG抗体を用いるイ ムノブロッティングにより確認した。 ３．TXU−PAPイムノトキシンの精製 TXU−７／PAP反応混合物を、未反応のPAP及び高分子量（300KDa超）凝集物 を除去するために、（21.5×600mm Spherogel TSK 3000SWカラム、TosoHaas及び Beckman Instrumensを利用する）HPLCによるゲルろ過クロマトグラフィーにかけ た。カラムは理論的には、最大で200mgのタンパク質のサンプル充填及び最大で ５mLのサンプ ル容量を有するが、高タンパク質濃度でおこる凝集物形成を最小にするために、 最大で50mgのコンジュゲーション混合物を注入した。そのカラムを３mL／分の流 速で、100mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。大きなイムノトキシン種が 注入後14分で、21.5×600mm TSK 3000SWカラムから溶出し始め、次に240kDa，21 0kDa、及び18OkDaイムノトキシン種、そして21〜34分後に非コンジュゲートMoAb が溶出した。非反応PAPは50〜55分に溶出し、TXU−７−PAPコンジュゲートから 十分に分離された。 次に、HPLCステップからの半精製TXU−７−PAPイムノトキシンの100mgバッチ を、Centriprep−30装置(Amicon，Beverly，MA)を用いて、15〜20mLの容量に濃 縮した。DMSO中に新しく調製し、最終濃度８mmを供するように、PBS中に希釈し たＮ−エチルマレイミド(Sigma)を、10：１のモル比で、濃縮TXU−７−PAPに加 え、50mL遠心管中で15分、室温で静かに回転させ、次にSpectral Por 2透析チュ ーブを用いて10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.1に対して透析した。 CM−Sepharose Fast Flow樹脂(Sigma Chemical Company，St．Louis，MO)での イオン交換クロマトグラフィーを、いずれかの残った非コンジュゲートTXU−７ MoAbからTXU−７−PAPイムノトキシンを更に精製するために用いた。要約すると 、カラムを10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5で平衡化し、その流出物のpH及び 電導度を測定した。４℃で一晩の透析の後、サンプルをカラムのpHで電導度に調 節した。次にそのサンプルを低イオン強度及びpH(10mMリン酸ナトリウム、pH6.5 )の条件下でカラムに適用し、全てのイムノトキシンの種及びTXU−７ MoAbが樹 脂に結合した。次に、TXU−７ MoAbを20mM塩化ナトリウムを含む10mMリン酸ナト リウムpH7.8で溶出した。 TXU−PAPを樹脂に完全に排出した時、カラムを10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.1で簡単に洗い、非コンジュゲート抗体を、20mM塩化ナトリウムを含む10mMリ ン酸ナトリウムpH7.8で溶出した。TXU−７ MoAbのピークが通り過ぎて280nmでの 吸光度がベースラインに戻った時、TXU−７−PAPイムノトキシンは、150mM塩化 ナトリウムを含む40mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5（PBS）を用いてCM−Sephar oseから溶出された。そのイムノトキシンピークを４mL画分に集め、次に、非コ ンジュゲートTXU−７ MoAbの欠如及び約180kDa，210KDa、及び240kDaのイムノト キシン種の存在（即ち、各々抗体分子に結合した。１，２、又は３のPAP分子） を確認するためのSDS−PAGEの後に組み合わせた。 タンパク質濃度を、Sigma Chemical Companyから得たBicinchoninic Acid Pro tein Assay Kitを用いてTXU−７−PAPイムノトキシンについて決定した。ビシン コニニン酸は色原試薬であり、タンパク質濃度に正比例する562nmの吸光度の紫 色の複合体を形成するCu（Ｉ）に極めて特異的なものである。CM−Sepharoseで 精製したTXU−７−PAPイムノトキシンの個々のバッチを、試験管内細胞毒性アッ セイを用いてそれらの能力について、及びそれらのエンドトキシンレベルについ てテストした。エンドトキシンを除去するために更なる処理が、必要とされるな ら、TXU−７−PAPをCentriprep−30装置（Amicon）を用いて2.5mg／mLに濃縮し 、Affi−Prep Polymyxin樹脂(Bio−Rad Laboratories)と混合してろ過滅菌した 。最終的なCM−Sepharoseで精製したイムノトキシン産物の収率は最初にコンジ ュゲートに用いたTXU−７ MoAbの量の11.5％であった。 ４．エンドトキシン除去 （Bio−Rad Laboratories，Hercules，CAから得た）Affi−Prep Polymyxin Su pportを、精製したTXU−７−PAPイムノトキシン調製 物からエンドトキシンを除去するために用いた（Myersら、J．Immunol．Methods ，136，221(1991)）。その樹脂を滅菌したエンドトキシンを含まないH₂Oで５回 、洗い、静かにゆすりながら、室温で30分、0.1Ｎ NaOHで処理し、次に、150mM 塩化ナトリウムを含む滅菌したエンドトキシンを含まない40mMリン酸ナトリウム 緩衝液pH7.5で５回、洗った。最後に、その樹脂を５回、10mMリン酸ナトリウム 緩衝液pH6.4で洗ってpHを7.0に下げた。次に、2.5mg／mLの濃度のTXU−７−PAP 10mLを、滅菌したパイロジエンを含まない50mL遠心チューブ中の洗ったAffi−Pr ep Polymyxin 12mLに加えた。その混合物を、４℃で一晩（24〜36時間）、静か に回転させ、その樹脂を沈殿させた。そのイムノトキシン含有上清を注意深く除 去し、滅菌したエンドトキシンを含まないガラス容器に滅菌ろ過した。その樹脂 を洗うために５mL量の滅菌PBSを加える。この上清を同じガラス容器にろ過し、L ALアッセイのためにサンプルを除去した。 TXU−７−PAPイムノトキシンのエンドトキシン濃度はLALアッセイにより決定 して3.0EU／mgであった。計画したフェーズＩ毒性研究において投与すべき見積 もった最も多い全TXU−７−PAP投与量は0.25mg／kg（0.05／mg／kg/投与×５回 ）であった。従って、患者に、最も高いイムノトキシン投与量で0.75EU／kgのエ ンドトキシンを与えた。 ５．TXU−７−PAPイムノトキシンの質制御テスト及びプレ臨床研究 TXU−７−PAPイムノトキシンの純度の生化学的テストのため、3.5μｇ量のC M−Sepharose精製したTXU−PAPタンパク質を、40mM Tris緩衝液pH6.8、２％ SDS 、7.5％グリセロール及び0.005％ブロモフェノールブルートラッキング染料を含 むサンプル緩衝液中で沸騰し、PAP及びTXU−７ MoAbについて上述されるように 、 ５％分離ゲル又は４〜20％勾配ゲル(Bio−Rad Laboratories，Hercules，CA)で 電気泳動を行った（Laemi、前掲）。 更に、精製したTXU−７−PAPイムノトキシン中のPAP及びTXU−７成分の存在を 、ウエスタンブロット分析及びBio−Rad Laboratoriesから得た検出キットを用 いて確認した。このキットは、ヤギ抗ウサギIgG−アルカリホスファターゼコン ジュゲートを含み、半乾燥Semi−Phor装置(Model TE−70 Hoefer Scientific，S an Francisco，CA)を用いて、SDS−PAGEの後、ニトロセルロース膜に電気泳動で 移されたPAPタンパク質10ngを検出することができる。この方法は、TXU−７−PA Pイムノトキシンの臨床調製物からの非コンジュゲートPAPの除去を確認するのに も用いられる。要約すると、100ngの精製TXU−７−PAP(１mg／mL濃度)、10ngの 精製PAP及び10mgの予め染色した分子量標準を、１％ SDS、４％グリセロール及 び0.025％ブロモフェノールブルーを含む62.5mM Tris pH6.8中で３分、沸騰し、 15％アクリルアミドミニゲル（Mini−Protean II、Bio−Rad Laboratories，Her cules，CA）に走らせる（Laemmli、前掲）。ゲルからニトロセルロース膜へのタ ンパク質の電気泳動による転移は、少し改良を加えたTowbinに記載される方法に 従って行った（Towbinら、前掲）。 転移後、ゲルを転移効率を検査するためにクーマシーブル−Ｒ−250で染色し 、ニトロセルロース膜を室温で一晩、Tris緩衝塩類溶液(TBS、20mM Tris、500mM NaCl、pH7.5)に保存した。２段階イムノブロッティングを次の通りImmun−Blot AssayKit(Bio−Rad Laboratories)を用いて室温で行った：ニトロセルロース膜 内上のバックグラウンド部位を、その膜を、プラットホームロッカー(Hoefer Sc ientific)上で静かに振とうしながら、２時間、３％ゼラチン（EIAグレード、Bi o−Rad Laboratories）を含むTBS中に入れるこ とによりブロックした。ブロッキング溶液をデカントした後、その膜を、10分、 静かにゆらしながら、Tween 20を含む10mLのTris緩衝塩類溶液(TTBS、20mM Tris 、500mM NaCl、0.05％、Tween-20、pH7.5)で洗った。その膜を、静かにゆらしな がら、２時間、10mLの一次抗体溶液（１％ゼラチンを含むTTBS中１／500に希釈 した10.7mg／mLのウサギ抗PAP、RVFUM−１、10.7mg/mL）中でインキュベートし た。抗PAP一次抗体を、精製PAPで過度に免疫化したウサギにおいて作った。 いずれの未結合の一次抗体も除去するためにTTBS中で２回、洗った後、膜を、 静かにゆらしながら、２時間、二次抗体（ヤギ抗ウサギIgG(Ｈ＋Ｌ)アルカリホ スファターゼコンジュゲート）(Bio−Rad Laboratories)の3000倍希釈物10mL中 でインキュベートした。膜を再びTTBSで２回、TBSで１回、洗い、次にｐ−ニト ロブルーテトラゾリウムクロライド及び５−ブロモ−４クロロ−３インドリルホ スフェート(Bio−RadLaboratories)を含むアルカリホスファターゼ基質溶液中で 10〜20分、インキュベートした。その反応を、膜を５分、10mLの蒸留水で２回、 洗い、２つのろ紙の間で膜を乾燥させることにより終えた。同様に、標準として 精製したTXU−７ MoAbを用いる一段階イムノブロッティングを、イムノトキシン 調製物中に残っている非コンジュゲートTXU−７ MoAbを検出するためにアルカリ ホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG（Sigma Chemical Co.，St．Lou is，MO）を用いて行った。 ゲルスキャンでのSDS−PAGE及び抗PAP又は抗マウスIgG抗体を用いるウエスタ ン・ブロットは、最終産物（Lot ＃Ｉ−1994）が、39％の210kDa TXU−７−PAP 、42％の180kDa TXU−７−PAP、12.5％の遊離MoAb及び5.5％の遊離PAPを含んで いることを示した。 精製したTXU−７−PAPイムノトキシンは、その均一なIgG重鎖 、カッパ軽鎖、及びPAP毒素成分に還元後に解離し、このことは、TXU−７−PAP イムノトキシンの純度についての更に補強する証拠を供する。 実施例４．TXU−７−PAPの免疫反応性 TXU−７−PAPが白血病芽球に結合する能力は、二重サンドイッチ法により決定 した。この方法では、細胞が、連続的に（ａ）10mg／mLイムノトキシン(IT)(50m M、30分、４℃)、（ｂ）アフィニティー精製したウサギ抗PAP IgG−PEコンジュ ゲート（１：20希釈物、15分、４℃）、及び（ｃ）FITCコンジュゲートヤギ抗マ ウスIgG(Becton Dickinson，Mountain View，CA)(１：20希釈物、15分、４℃)と インキュベートされる。細胞を、FACS IV（Becton Dickinson Immunocytochemis try Systems，Mountain View，CA）を用いてサイトフルオロメトリーにより分析 した。 Ｔ系列ALL患者からの骨髄芽球を、10mg/mL(50nM)TXU−７−PAPでの処理の後、 結合したイムノトキシンの存在について検査した。Ｔ−系統ALL細胞は、研究し た全ての場合においてTXU−７−PAPイムノトキシンと反応した。対照的に、これ らの芽球は、Ｂ−系統関連表面決定基に対する対照イムノトキシンＢ43−PAPと 結合しなかった。これらの結果は、TXU−７−PAPイムノトキシンのMoAb成分が標 的CD７抗原について特異性及びアフィニティーを保持することを証明した。従っ て、そのコンジュゲーション手順は、TXU-７ MoAbの免疫反応性を特異的に変化 させなかった。 連続希釈クローン原性アッセイを、Ｔ系統ALL細胞系Molt−３からのクローン 原性細胞、並びに対照NALM−６(Ｂ−ALL)及びHL−60(AML)細胞系に対するTXU−P APイムノトキシンの対数殺傷効率を決定するために行った。イムノトキシン処理 後の白血病細胞のクローン原性増殖の阻害を、素量的連続希釈アッセイにより評 価した。 ウェル中のクローン原増殖を、クローン原性培地(2.5％ウシ血清、２mM Ｌ−グ ルタミン、１mmピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを 補給したRPMI 1640)中で５％ CO₂／95％空気中で37℃での14日の培養後に倒立顕 微鏡を用いることにより検査した。白血病細胞除去の程度を、log Kill＝log φ 対照／φテスト（ここで、φはSpearman Kaerber法により評価して最も確からし いクローン原単位（CU）の数である）として表した。 標的細胞(10⁶〜10⁷／mL)を、氷上で２時間、次に37℃、５％ CO₂／95％空気で 加湿空気中で２時間（短時間）又は16時間（長時間）、pH7.5のIMDM＋２％ HSA 中TXU−PAPで処理した。対照は、（ａ）未処理の培養物及び（ｂ）PAPにセンシ ティブである非標的白血球細胞である。処理後、細胞をaMEM培地で洗って未結合 のイムノトキシンを除去した。 TXU MoAbは、CD７抗原陰性NALM−６プレＢ白血病細胞が染色される条件下で、 CD７抗原陽性Jurket Ｔ系統白血病細胞の96％及びCD７抗原陽性MOLT−３−Ｔ系 統白血病細胞の99％を染色した。 MOLT−３ Ｔ系統リンパ球を、FITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgGをプロー ブとして用いて、間接的免疫蛍光法により、0.1μｇ／mL、1.0μｇ／mL又は10μ ｇ／mL（50nm）での処理の後、結合したイムノトキシンの存在について検査した 。免疫蛍光MOLT−３細胞の割合は、投与量に依存してTXU−PAPでの処理後に増加 した。最も高い濃度において、MOLT−３細胞の98％は細胞表面結合TXU−PAPにつ いて陽性であった。比較により、８％のNALM−６細胞のみが、最も高い濃度のTX U−PAPでの処理後に先のバックグラウンド蛍光を示した。これらの結果は、TXU −PAPイムノトキシンのMoAb成分が標的CD７抗原について特異性及びアフィニテ ィーを保持したことを証明した。 連続希釈クローン原アッセイにおいて、抗CD７(TXU)−PAPはCD７抗原陽性Ｔ系 統白血病細胞系、MOLT３からのクローン原芽球に対して極めて有効であり、１μ ｇ／mL（＝５mM）で2.8〜3.7logを殺した。比較により、0.1logのみのNALM−６ 又はHL−60細胞がそれらのクローン原増殖において阻害された。更に、白血病始 原細胞アッセイにおいて、TXU−PAPは放射線耐性のレベルにかかわらず、Ｔ系統 ALL患者からの一次クローン原白血病細胞を殺した。実施例５．生体内毒性研究 Ａ．アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質（PAP）の毒性 約20グラムの雌のBALB／ｃマウスに、尾の静脈を通して精製PAP（Lot＃Ｐ−19 93）の一回の静脈内注入を行った。10μｇ〜175μｇの範囲の８つの異なる投与 量を用い、各々の投与量を５のマウスでテストした。マウスを、罹患率及び死亡 率について、30日間、モニターした。100ｇ／20ｇマウス又は５ｇ／ｇ（＝3.1ｇ ／cm²＝５mg／kg）程度の高い投与量で死は観察されなかった。この非毒性投与 量は、TXU−７抗体コンジュゲートとして患者に供されるであろう最も高いPAP投 与量より90倍超、高い。150μｇ／20ｇマウス（＝7.5mg／kg）又はそれより高い 投与量を与えたグループでのみ死が観察された。150μｇ／20ｇマウスの投与量 は、TXU−７−PAPイムノトキシンとして患者に与えられるであろう最も高いPAP 投与量より60倍超、高い。 Ｂ．TXU−７−PAPイムノトキシンの毒性 TXU−７−PAPイムノトキシンの毒性を、全部で４回の研究で分析した。全て のスライド（ホルマリン固定）を、University of MinnesotaのDivision of Com parative Medicine，Department of Laboratory Medicine and Pathologyの年配 の獣医学病理学者によって評価した。 第１及び第４の研究において、約20グラムの体重の５匹の雌のBACB／ｃマウ スのグループに、10μｇ／マウス〜100μｇ／マウスの範囲の５つの異なる投与 量でTXU−７−PAPイムノトキシンを一回、静脈内又は腹腔内に注入した。第２及 び第３の研究において、マウスに、３回の連続的静脈内投与を行った。毒性情報 を不明瞭にしないように、試験において鎮静剤及び麻酔剤は用いなかった。 最初の研究で、各々19〜26グラムの５匹の雌のBACB／ｃマウスのグループに、 尾の静脈は、10μｇ／マウス〜100μｇ／マウスの範囲の投与量で、0.2mL容量中 のTXU−７−PAPの一回の静脈内ボーラス注入を行った。マウスを、30日のLD₅₀値 の測定について死亡率についてモニターし、死後４時間以内に複数の器官を集め 、全体を検査し、そしてホルマリン中に固定した。スライドを、組織病理学的研 究のために調製した。処理後30日生存したマウスを殺し、複数の器官をランダム に選択した２匹のマウス／投与量グループから直ちに集め、スライド及び組織病 理学的検査の調製のために10％緩衝ホルマリン中に保存した。 50μｇ及びそれ超の投与量で、TXU−７−PAP毒性の臨床的症状には、体重の喪 失、虚弱、きたならしい皮膚、活気の減少、嗜眠、及び歩行障害があった。TXU −７−PAP処置後16日に、死を観察した。LD₅₀イ値は、30日のLD₅₀（ほとんど゛ のグノレープは７日目LD₅₀を報告する）として表す。30日目のLD₅₀は50μｇ／20 ｇ、マウス（＝2.5μｇ／ｇ又は1.55μｇ／cm²＝2.5mg／kg）。この投与レベル において、30日超の中程度の生存期間で、各々14及び30日後にいくつかのマウス は生きていた。 50μgのTXU−７−PAPは約8.0μｇのPAPを含むので、これらの発見は、コンジ ュゲートしたPAPが非コンジュゲートPAPより約20倍毒性であることを証明する。 これはおそらく、一部は長い半減 期のため、及び一部は、PAPにより影響を受けないであろう組織へのイムノトキ シンのFcレセプター媒体非特異的結合のためである。 実施例６．TXU−７−PAPイムノトキシンの生体内安定性 本発明のTXU−７−PAPイムノトキシンの生体内安定性を証明するために、３kg の体重のニュージーランド白色雌ウサギに、１mg投与量のTXU−７−PAP又は遊離 抗体のみを静脈内注入する。イムノトキシン及び完全なイムノトキシンの血清濃 縮物の投与後、複数の時点で、眼窩後方の静脈穿刺により末梢血液を得て、非コ ンジュゲート抗体を上述の通り、固相ELISAにより測定した（Uckunら、Leukemia and Lymphoma，9，959(1993));及びMyerら、Leukemia and Lymphoma，18，93(1 995)）。２つの別個であるが連結した２成分第１列薬理モデルであり、完全なイ ムノトキシンについてのもの及び遊離抗体データについてのものを、同じ動物内 の完全なイムノトキシン及び遊離抗体データと同時に適合させた。ADAPT−IIソ フトウェアーで処理した最尤評価を、薬理パラメータを決定するために用いる。 生体内安定性が極めて乏しい本明細書に引用により組み込まれる米国特許通し番 号07／979,470号に開示されるPAPイムノトキシンと対照的に、本発明のイムノト キシンは、より長い血清半減期及びより大きな全身露出（即ち濃度一時間曲線下 の領域）により決定して生体内安定性を示す。 実施例７．試験管内抗白血病活性 雌SCIDマウスに、i.v.で、10×10⁶MOLT−３細胞を接種し、直後に、３連続日 に以下のi.p.処理を行った：PBS(ｎ＝10)、30mgのＢ43（抗CD19）−PAP(10μｇ ／日×３日；ｎ＝６)、30μｇのTXU(抗CD7)抗体（１０μｇ／日×３日；ｎ＝３ ）15μｇ／マウスTXU(抗CD7)−PAP(５μｇ／日×３日；ｎ＝10)、又は30μｇ／ マウスTXU(抗CD７)−PAP(５μｇ／日×３日；ｎ＝10)。19のマウスの対 照グループ（即ちTXU抗体、Ｂ43−PAP又はPBSで処理したマウス）において、マ ウスの21±９％だけが60日以上、生き続け、ここで37日の中間生存率であり、80 日を超えて生存したマウスはなかった。対照的に、15μｇ／マウス（0.25mg／kg ／日×３日）TXU(抗CD７)−PAP処理グループのマウスの80±13％は処理後120日 生き続け、ここで116.4日の中間生存率であった。30μｇ／マウス（0.50mg／kg ／日×３日）TXU(抗CD7)−PAPグループにおいて、全てのマウスが120日以上、生 存し続けた。これらの生存結果の差は、統計的に有意であった（対照対15μｇの TXU−PAP、10ｇランクテストによりＰ＜0.0001；対照対30μｇのTXU−PAP、log ランクテストによりＰ＜0.000001）。 これにより、TXU−PAPは、別の不変の胎児ヒトCD7＋Ｔ系統ALLで攻撃したSCID マウスにおいて潜在的な抗白血病活性を示した。全部で19の対照マウスは、白血 病細胞の接種後80日以内に死んだが、15μｇ／マウス(0.75mg／kg)TXU−PAP処理 グループのマウスの80％及び30μｇ／マウス(1.50mg／kg)TXU−PAP処理グループ のマウスの100％は処理後120日、生き続けた。 実施例８．抗ウィルス治療剤材料及び方法としてのTXU−７−PAP PAP イムノトキシンの調製。対照は、非コンジュゲートPAP、Ｂ細胞に対するB4 3（抗CD19）PAP、並びに非コンジュゲートmAb Ｂ53（抗CD４）及びTXU(抗CD７) を含んだ。これらの対照試薬は上述の通り調製した。更なる対照は、AZT及び２ ’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）を含んだ。 ストックHTLV_IIIBウィルス。CCRF−CEM細胞内で増殖させたHIV−１株HTLV_IIIB を、PAPイムノコンジュゲートの抗HIV−１活性の試験管内アッセイに用いた。HT LV_IIIB感染CCRF−CEM細胞の無細胞上清を 収集し、１mlアリコートに分散させ、そして−70℃で凍結した。ストックウィル スの周期的な滴定を、そのMT−２細胞における細胞毒性効果を検査することによ り行った。 抗HIV−１活性の試験管内アッセイ。HIV陰性ドナーからの正常なヒト末梢血液 単核細胞(PBMNC)を、20％（ｖ／ｖ）熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、３％インタ ーロイキン−２、２mM Ｌ−グルタミン、25mM HEPES、２gL NaHCO₃、50μｇ／m lゼンタマイシン、及び４μｇ／mlフィトヘマグルチニンを補給したRPMI 1640中 で72時間、培養し、その後、加湿した５％ CO₂雰囲気下で37℃で１時間の吸収期 間の間、0.1の感染の多重度(MIJI)でHIV−１に露出した。次に、細胞を、種々の 濃度のPAPイムノコンジュゲート又は標準抗HIV薬剤の存在下で96ウェルマイクロ タイタープレート(100μｌ／ウェル；２×10⁶細胞/ml)中で培養し、培養上清の アリコートを、ｐ24抗原及び逆転写酵素（RT）アッセイのために感染後７日目に ウェルから除去した。用いたｐ24酵素イムノアッセイは、テスト培養上清サンプ ル中に存在する抗原が結合するマイクロウェルストリップ上にコートしたHIVコ アタンパク質に対するネズミmAbを利用するCoulter Corporation Immunotech，I nc．(Westbrooke，ME)から市販される非改良速度アッセイであった。ウィルス阻 害の割合を、テスト物質処理した感染した細胞からのｐ24値を未処理の感染した 細胞（即ちウィルス対照）からのｐ24値と比較することによって計算した。 RT活性を評価するために、シンチラント充填フルオマイクロスフィアに結合し たDNA／RNAプライマー／テンプレートを用いるAmersham Lifescienceから市販さ れる方法を用いた。逆転写による放射能標識ヌクレオチドの組込みによりプライ マーの伸長及びマイクロスフィア内のシンチライトの刺激を行った。生じたRT活 性のシグナ ルを検出し、シンチレーションカウンターにより定量し、分当りのカウント(cpm )として記録した。いくつかの実験において、HTLV_IIIBに対するTXU−PAP処理し たカニクイザルから処置後１時間に得た１：２，１：10，１：20、及び１：100 希釈血漿の抗HIV活性を検査した。静脈内TXU−PAP投与量はサル52Ｅについて50 μｇ／kg、サル52Ｄ及びサル410Cについて100μｇ／kgであった。平行して、細 胞生存性への種々の処置の効果＝Ericeら、前掲及びZarlingら、前掲により記載 されるように検査した。要約すると、非感染PBMNCを同一実験条件下で７日間、P APイムノコンジュゲートで処理した。２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ −５−スルホフェニル）−５−〔（フェニルアミノ）−カルボニル）−２Ｈ−テ トラゾリウムヒドロキシド(XTT)を用いるマイクロカルチャーテトラゾリウムア ッセイを、細胞増殖を定量するために行った。 臨床的HIV−１単離物の調製。HIV単離物を先に詳述される培養技術を用いて、 University of Minnesota AIDS Clinical Trials Unit(ACTU)においてNIH主体の AIDS臨床試験に関与するHIV−１感染患者の末梢血液試料から回収した（Jackson ら、J．Clin．Micro.，28，16(1990);Ericeら、J．Clin．Micro，30，444(1992) ;Levyら、J．Infect．Dis.，152，734(1985)）。要約すると、血液陽性患者から の10×10⁶のFicoll-Hypaque分離単核細胞を、20％ウシ血清、５％インターロイ キン２（Cellular Products，Buffalo，NY）、160Ｕ／mLのペニシリン、及び160 μｇ／mLのストレプトマイシンを補給した15mL RPMI 1640を含む50mL組織培養フ ラスコ中で、37℃／５％ CO₂で42日間、HIV−１血液陰性の健康な有志者からの ５×10⁵のPHA刺激末梢血液単核細胞と同時に培養した。同時培養上清を、市販の ELISA ｐ24抗原検出キット（Abbott Laboratories，North Chicago，IC）を用い て、HIV p24 gag抗原の存在につい て３〜４日毎にアッセイした。ｐ24抗原陽性培養物を標準的プロトコルに従って 拡大し、無細胞ストックウィルスのアリコートを、その上清中の逆転写酵素（RT ）活性が20,000cpm／50μＬを超えた時に、拡大した培養物の上清から調製した 。いくつかの単離物を、ｐ24抗原陽性培養物から又はHIV−１培養陽性患者の凍 結細胞から回収した。これらの場合において、正常なドナー末梢血液単核細胞（ ２〜５×10⁶細胞／mL）は、２時間、37℃／５％ CO₂で、ｐ24陽性培養上清１mL 又はHIV−１培養陽性患者からの１×10⁶の解凍した末梢血液単核細胞１mLに露出 し、40mL組織培養フラスコ中で培養した。次に、陽性培養物を上述の通り拡大し た。 ヒトAIDSのSCIDマウスモデル。効率研究に用いた全てのSCIDマウスは、AAALAC 承認され認可されたResearch Animal Resources（RAR）SCID Mouse Facility of the University of Minnesota(Minneapolis，MN)においてSPF CD−１のscid／s cidブリーダーにより生育された。マウスで行った全ての管理及び実験的コンタ クトはSPF条件を維持した。マウスは、オートクレーブした食物、水及び寝わら を含むMicro−Isolatorゲージ内に住ませた。トリメトプリム／スルファメトキ サゾール(Bactrim)を週３回、飲料水に加えた。Hu−PBL−SCIDマウスは、単−ED V血液陰性有志者ドナーからの10×10⁶の末梢血液単核細胞の腹腔内注入によりSC IDマウスを再構成することにより形成した。細胞接種後２週間目に、マウスを無 細胞ウィルスの1.4〜7.7×10⁴のメジアン組織培養感染投与量（TCID₅₀）を腹腔 内注入することにより攻撃した。３つの異なる臨床HIV−１株(AT−101，AT−328 ，AT−332)を用いた。これらの単離物は、National Instltute of Health主催の AIDS臨床試験に関与するHIV−１に感染した個体の末梢血液リンパ球が、Univers ity of Minnesotaにおいて回収した（Jacksonら、前掲；Ericeら、前掲；Levy ら、前掲）。SCIDマウスは、Biosafety Level ３汚染施設においてHIV−１単離 物を感染させ、全ての操作は、バイオセイフティーキャビネット内で行った。ZD V処理マウスにおいては、即ち、AZT，ZDVをそれらの水に１mg／mlの最終濃度で 加えて、平均、200mg／kg／日のZDVを消費させた。 PAPイムノトキシンの段階的に上昇させる投与量を、腹腔内ボーラス投与とし て全投与量の半分を注入し、Alzetマイクロ浸透ポンプを用いて２週間にわたっ て全投与量の残りを送り出すことにより、又は５日の処理期間にわたって毎日腹 腔内に注入することにより全投与量を投与することにより、腹腔内に注入した。 実験期間全体にわたって、マウスを、全般的な健康状態及び生存率について毎日 、モニターした。HIV感染後２週間目に、Hu−PBL−SCIDマウスを電気的に殺し、 それらの腹腔洗浄細胞及び脾臓細胞を、以下に詳述するように、HIV−１培養ア ッセイにより、及びHIV−１ゲノムのgag領域における115bp DNA配列のPCR増幅に より感染の証拠について検査した。 組織病理学的研究のために、組織を10％中性緩衝ホルマリンで固定し、脱水し 、そして慣用的な方法によりパラフィンに埋めた。付属の６ミクロン組織セクシ ョンを伴うガラススライドを調製し、Ｈ＆Ｅで染色し、そして獣医病理学者に検 査させた。 新しく調製した腹腔洗浄細胞及び脾臓細胞を単離し、HIV−１抗体陰性ドナー からのフィトヘマグルチニン(PHA)刺激ヒト末梢血液単核細胞と同時に培養し、 そして培養上清を、HIV−１のコアｐ24抗原を主に検出する市販の酵素イムノア ッセイ（Abbott Laboratories，North Chicago，IC）を用いて、HIV−１抗原の 存在について最大28日間、３〜４日毎にテストした（Goudsmitら、J．Infection s，Diseases，155，558(1987)）。 上述の培養法に加えて、増幅すべき領域に隣接する２つの29塩基オリゴヌクレ オチドプライマー、SK38及びSK37を用いて、HIV−１ゲノムのgag領域内の115bp 配列のPCR増幅によりHIV−１ DNAの検出のために、腹腔洗浄液及び脾細胞からの DNAを単離した（Ouら、前掲）。DNAサンプルを、増幅すべき領域に隣接する２つ の20塩基オリゴヌクレオチドプライマー、PCO３及びPCO４を用いて、ヒトβ−グ ロビン遺伝子の第１のエキソンからの110bpフラグメントのPCR増幅により、ヒト DNAの存在についても検査した(Hoら、NEJM，317，278(1987))。オリゴヌクレオ チドプライマー（SK38：５’ATA ATC CAC CTA TCC CAG TAG GAG AAA T ３’；配 列番号：１及びSK39：５’TTT GGT CCT TGT CTT ATG TCC AGA ATG C ３’；配列 番号：２）は、Applied Biosystems Synthesizer(Foster City，CA)を用いてUni versity of Minnesota Microchemical Facilityにより合成した。HIV DNAは、全 量100μＬ中0.5μＭの各々のプライマー及び200μＭのdNTP(Pharmacia，Piscata way，NJ)を含む１×PCR緩衝液（50mM KCl、10mM Tris-Cl、pH8.3、2.5mM MgCl₂ 、及び0.01％wt／volゼラチン）中の2.5ＵのTaq DNAポリメラーゼ(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)と共に1.0μｇのゲノムDNAを用いて増幅した。増幅前に、 サンプルに、100μＬの鉱油（Sigma，St．Louis，MD）を重層した。サンプルを9 5℃で１分及び60℃で１分、インキュベートすることにより、30サイクルを行っ た。 オリゴマーハイブリダイゼーションを、PCR増幅化HIV DNAを検出するために用 いた。要約すると、30μＬの増幅したDNAを、0.2pmolの³²Ｐ−標識化SK19（５’ ATC CTG GGA TTA AAT AAA ATA GTA AGA ATG TAT AGC CCT AC３’；配列番号：３ ）、24mMのNaCl及び４mMのEDTA、pH8.0からなる10μＬのプローブ混合物に加え た。サンプルを95℃浴で５分、変性させ、次に55℃で15分、インキュベート してプローブ及び標的配列をアニーリングした。10μＬのブロモフェノールブル ー／キシレンシアノール染料混合物を各々のチューブに加え、25μＬの各々のサ ンプルを１×TBE緩衝液(0.089Ｍ Tris-borate及び0.002Ｍ EDTA)中10％ポリアク リルアミドゲル上で分析した。電気泳動の後、そのゲルを乾燥させて増感紙と共 に２時間、Kodak XAR−５フィルムに露出した。結果 B53 （抗CD4）−PAP及びTXU(抗CD7)−PAPイムノトキシンの試験管内抗HIV活性 。HTLV_IIIBに対するPAPイムノトキシンの抗ウィルス活性を、ウィルス複製のマ ーカーとしてHIV−１ｐ24コア抗原生産を用いて評価した。図１Ａに示すように 、Ｂ53−PAP及びTXU−PAPの両方とも、投与量に依存してウィルス複製を示した 。HIV−１ｐ24生産についてのID₅₀値は、B53（抗CD 4）−PAPについて30pM(5.9n g／ml）及びTXU(抗CD7)−PAPについて20pM(4.4ng／ml)であるが、非コンジュゲ ートPAPは、８nM(228ng／ml)のID₅₀値で270〜400倍小さい効率でｐ24生産を阻害 した。両方のPAP含有イムノトキシンは、AZT(ZDV)(ID₅₀１mM)又は２’，３’− ジヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン(ｄ４Ｔ)(ID₅₀＝18mM)より２〜３け た大きな倍率の能力であった。ウィルス複製のためのインジケーターとして逆転 写酵素が機能する場合、同様の効率プロフィールが得られた（図１Ｂ）。これに より、PAP含有イムノコンジュゲートの抗ウィルス効果は、大きな細胞毒性を示 すことなく、HIV−１の構造及び機能的タンパク質の両方に作用する。全体とし て、TXU(抗CD７)−PAPはB53（抗CD４）−PAPより少し能力の高い抗HIV剤であっ た。TXU(抗CD７)−PAPの抗HIV−１活性は極めて再現性があり、Ｔ細胞に対して 大きな細胞毒性を示さなかった（図２）。ヒトAIDSのスロゲートSCIDマウスモデルにおけるB53（抗CD４）−PAP及びTXU( 抗CD７)−PAPの生体内抗HIV−１活性 。ヒトAIDSのHu−PBL−SCIDマウスモデルに おけるB53（抗CD４）−PAP及びTXU(抗CD７)−PAPの生体内抗HIV−１活性を検査 した。表３に示すように、HIV−１に感染させ、PBSで処理した23のHu−PBL−SCI Dマウスのうち、（ａ）11をHIV−培養及びHIV−PCRの両方により分析し、10は両 アッセイで陽性であったが、１はPCRによってのみ陽性であり；（ｂ）６をHIV培 養のみで分析して、６匹全部が陽性であり；そして（ｃ）６をHIV−PCRのみによ り分析して６匹全部が陽性であった（ND＝未決定）。同様に、HIV−１を感染さ せ、Ｂ細胞に対する対照Ｂ43−PAPイムノコンジュゲートで処理した５のHu−PBL −SCIDマウスをHIV−PCRにより分析し、５匹全てが陽性であったが、HIV−１を 注入しなかった17の対照Hu−PBL−SCIDマウスのいずれでも、HIV−培養又はHIV −PCRによる誤った陽性結果はなかった（表３）。 Hu−PBL−SCIDマウスに、Biosafety Level ３汚染施設において、臨床的HIV− １単離物を接種した。PAPイムノコンシュゲートを、腹腔内ボーラス投与として 全投与量の半分を注入し、そしてAlzetマイクロ浸透ポンプを用いて２週間にわ たって全投与量の残りを送り出すことにより(Regimen A)、又は５日の処理期間 にわたって毎日の腹腔内注入により全投与量を投与することにより(Regimen B) 、腹腔内に投与した。HIV感染後２週間目に、Hu−PBL−SCIDマウスを電気により 殺し、それらの腹腔洗浄細胞及び脾臓細胞を、HIV−１培養アッセイにより及びH IV−１ゲノムのgag領域内の115bp DNA配列のPCR増幅により感染の証拠について 検査した。PBS処理した対照Hu−PBL−SCIDマウスにおいて、HIV培養アッセイは 、脾臓細胞（ｎ＝４）、及び腹腔洗浄及び脾臓細胞の混合物（ｎ＝12）を用いて 行った。HIV−PCRアッセイは、脾臓をPCRによって検査しなかった２匹のPBS処理 Hu−PBL−SCIDを除いて、脾臓細胞及び腹腔洗浄細胞の両方で行った。 TXU(抗CD7)−PAPは、Ｂ53（抗CD4）−PAPよりHu−PBL−SCIDマウスモデルにお いてより高い抗HIV−１活性能を示した。上述の14日(Regimen A)又は５日(Regim en B)処理スケジュールに従って投与した10μｇ又は20μｇのTXU(抗CD７)−PAP で処理した20のHu−PBL−SCIDマウスのいずれにおいてもHIV−１感染のPCRの証 拠はなかった（図３、表３）。比較により、これらのマウスのいずれからの培養 物によってもウィルスが回収されなかった場合でも、20μｇの全投与量でＢ53（ 抗CD4）−PAPで処理した全部で４匹のHu−PBL−SCIDマウスにおいてPCRによりウ ィルスゲノムを検出した。より高い投与量において、Ｂ53（抗CD４）−PAPは、 潜在的な抗HIV−１活性も示した（図４）。HIV−１ DNAは、40μｇの全投与量で Ｂ53（抗CD４）−PAPで処理した18のHu−PBL−SCIDマウス のうちの３つでのみ検出され、これらのマウスからの11の腹腔＋脾臓細胞培養混 合物で陽性のものはなかった。（図３、表３）。同様に、60μｇのＢ53（抗CD４ ）−PAPで処理した５のHu−PBL−SCIDマウスのいずれでも見い出されたHIV−１ 感染の培養又はPCRの証拠はなかった。 重要なのは、60μｇＢ53（抗CD４）−PAP又は20μｇTXU(抗CD７)−PAPで処理 したHu−PBL−SCIDマウスの腹腔洗浄物での多重パラメータフローサイトメトリ ーによりCD４＋CD７＋CD45＋gp120Ｔ細胞が検出され、これらのHu−PBL−SCIDの 脾臓及び腹腔内のヒトDNAの存在がβ−グロブリン遺伝子PCRにより確認されたこ とである。これにより、Ｂ53（抗CD4）−PAP又はTXU(抗CD７)−PAPで処理したHu −PBL−SCIDマウス内のHIV−１の欠如は、植え継ぎの乏しさ又はPAPイムノコン ジュゲートが誘導する無差別の細胞毒性によるヒトＴ細胞の欠如によって引きお こされたものではなかった。Ｂ53（抗CD4）−PAP又はTXU(抗CD７)−PAPで処理し た全てのマウスはテスト期間中、健康であり続けた。病気の明白な兆候又は異常 な応答は観察されなかった。Ｂ53（抗CD４）−PAP又はTXU(抗CD７)−PAPで処理 したマウスと対照的に、水に加えて最終濃度１mg／mlとして200mg／kg／日のAZT の平均消費としたAZTで処理した10のHu−PBL−SCIDマウスのうち３つのみがHIV 陰性であると判断された。残りの７のマウスのうち、４は培養陽性PCR陽性であ り、３は培養陰性であるがPCR陽性であった（表３）。 未処理の又はZDV処理したマウスの腹腔から得られたリンパ球上の表面抗原の マルチフローサイトメトリー分析は、永存的HIV−１感染と一致したCD７細胞上 のgp120の存在を示したが、TXU−７−PAP処理したマウスからのCD７細胞はgp120 陰性である。TXU−７−PAP処理SCIDマウス中のヒトDNA及びCD７細胞は、TXU−７ −PA P処理Hu−PBL−SCIDマウス内のHIV−１の欠如が植え継ぎの乏しさ又はCD７細胞 へのTXU−７−PAP細胞毒性のためのヒトCD７細胞の欠如によって引きおこされる ものでないことという証拠を供した。その結果は、ZDVのみで得られたものより 明らかに優れており、TXU−７−PAP及びZDVが安全に組み合わせることができる ことを示す。 TXU −PAP処理したカニクイザルからの血漿サンプルの試験管内抗HIV−１活 性 。TXU−PAPで処理したサルは大きな副作用を示さなかった（Waurzynickら、前 掲）。注入後１時間の血漿サンプル中のTXU−PAP濃度は50μｇ／kg TXU−PAPで 処理した52Ｅにおいて1027ng／mL、100μｇ／kg TXU−PAPで処理した52Ｄにおい て5800ng／mL及び100μｇ／kg TXU−PAPで処理した410Cにおいて5593ng／mLであ った。図５に示すように、これらの血漿サンプルは、１：100希釈でさえも、試 験管内でHTLV_IIIBに対する潜在的な抗ウィルス活性を示した。 議論 本明細書に記載される結果は、AZT，d4T、非コンジュゲートPAP、及びB53−PA P、及び抗CD４−PAPイムノトキシンとの横ならびの比較において、TXU−PAPの優 れた試験管内抗HIV−１活性を証明する。顕著なのは、TXU−PAPは、いずれの副 作用もなく、カニクイザルにより極めて十分に許容される投与レベルで、ヒトAI DSのHu−PBL−SCIDマウスモデルにおいて潜在的な抗HIV活性を示したことである 。更に、TXU−PAP処理したカニクイザルからの血漿サンプルは、試験管内で潜在 的な抗HIV−１活性を示した。 その潜在的な抗HIV−１活性に基づいて、このイムノトキシンの臨床処置プロ トコルへの組み込みは、AIDS患者のための予後を改善させると予想される。これ ら患者のTXU−PAP(BB−IND−6985)で のフェーズＩ試験を、カニクイザルにおける0.1mg／kg／日×５日の十分に許容 される投与レベルより100倍低く、BACB／ｃマウスにおけるLD₅₀投与量より25,00 0倍低い（即ち50μｇ／マウス＝2.5mg／kg)0.001mg／kg／日×５日の投与レベル で開始した。 これにより、CD７抗原のようなCD4＋細胞上の通常の抗原に対するmAbを用いる PAPの、非感染又は潜在的に感染したCD４＋細胞へのターゲッティングは感染し た細胞上のHIV−１エンベロープタンパク質の発現によらない。このアプローチ は、異なるHIV−１単離物の中でのエンベロープ抗原不均一性又は血漿抗エンベ ロープ抗体の存在により引きおこされる潜在的な問題も避ける。CMV及びHSVのよ うな他のウィルスの同時の感染が潜在的に感染したCD４＋細胞内でHIV発現を誘 導し得ることが示唆されている。PAPがCMV及びHSVを含む多くのウィルスの複製 を阻害する報告されている能力は、それゆえ、HIV−１感染の治療のための別の 特有の利点を供する。 実施例９．TXU−PAPでのHIV感染チンパンジーの治療 ３匹のHIVに感染したチンパンジーをTXU−PAPで処理した。このプロトコルに おいて、TXU−PAPを、10連続日、0.01mg／kg／日の投与量で単一剤として、又は 0.02mg／kgの投与量で１日、単一剤として静脈内に投与した。 表４に示す通り、チンパンジーは、いずれの大きな副作用も示さなかった。特 に、毛管漏出症候群も観察されなかった。顕著なのは、0.02mg／kg／投与量レベ ルで処理したチンパンジー＃1156において、HIVウィルス負荷がPCRで検出可能な レベル未満に減少したことである。そのチンパンジーは、いずれの副作用もなく 、現在、100日間、生存し続けている。それゆえ、TXU−PAPは活性から安全であ る。 本発明の特定の好ましい実施形態のみが詳細に示され、記載されているが、多 くの改良が当業者により行われるであろう。それゆえ、本発明は、本発明の精神 及び範囲内にある全てのこのような改良を包含することを意図することが理解さ れることが必要である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 35/02 31/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 35/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質に連結した、CD７抗原に特異的 に結合する抗体、又はその生物学的に活性なフラグメントを含むイムノトキシン 。 2. 前記抗体がモノクローナル抗体TXU−７を含むことを特徴とする請求項１ に記載のイムノトキシン。 3. 新生物疾患を有する又はその危険性を有する哺乳動物に、有効量の請求項 １に記載のイムノトキシンを非経口的に投与することを含む治療方法。 4. 前記イムノトキシンを、医薬として許容される液体担体と組み合わせて投 与することを特徴とする請求項３に記載の方法。 5. 前記液体担体が、等張塩類溶液を含むことを特徴とする請求項４に記載の 方法。 6. 前記イムノトキシンを静脈内に投与することを特徴とする請求項４に記載 の方法。 7. １又は２分子のアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質が抗体の各々の 分子に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の方法。 8. 有効量の抗新生物剤を非経口的に投与することを更に含む請求項３に記載 の方法。 9. 前記抗新生物剤がクラスＩ免疫抑制剤又は代謝拮抗物質であることを特徴 とする請求項８に記載の方法。 10．前記抗新生物剤がクラスＩ免疫抑制剤であることを特徴とする請求項９に 記載の方法。 11．前記抗新生物剤がシクロホスファミドであることを特徴とする請求項10に 記載の方法。 12．前記抗新生物剤が代謝拮抗物質であることを特徴とする請求項９に記載の 方法。 13．前記抗新生物剤が、メトトレキセート、トリメトレキセート、５−フルオ ロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、５−アザシチジン 、フロキシウリジン又は２”−クロロデオキシアデノシンであることを特徴とす る請求項12に記載の方法。 14．前記抗新生物剤がシタラビンであることを特徴とする請求項13に記載の方 法。 15．前記抗新生物剤が医薬として許容される担体と組み合わせられることを特 徴とする請求項８に記載の方法。 16．前記抗新生物剤を静脈内に投与することを特徴とする請求項８に記載の方 法。 17．前記疾患が、Ｔ細胞白血病、リンパ腫又は急性骨髄性白血病であることを 特徴とする請求項３に記載の方法。 18．CD７＋Ｔ細胞のウィルス感染を阻害し又は処理するための治療方法であっ て、該治療の必要な哺乳動物に、CD７抗原に特異的な抗体又はその生物学的に活 性なフラグメントに連結したアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質を含むイ ムノコンジュゲートを含む有効量の投与形態を投与することを含む方法。 19．前記抗体がモノクローナル抗体TXU−７を含むことを特徴とする請求項18 に記載の方法。 20．前記ウィルスがレンチウィルスであることを特徴とする請求項19に記載の 方法。 21．前記投与形態が非経口投与のために適合することを特徴とする請求項19に 記載の方法。 22．前記イムノコンジュゲートを、医薬として許容される液体担体と組み合わ せて投与することを特徴とする請求項19に記載の方法 。 23．前記液体担体が等張塩類溶液を含むことを特徴とする請求項22に記載の方 法。 24．前記投与形態が静脈内投与に適合していることを特徴とする請求項21に記 載の方法。 25．前記投与形態が有効量の抗ウィルスヌクレオシドアナログと組み合わせて 用いられることを特徴とする請求項19又は20に記載の方法。 26．前記ヌクレオシドアナログが逆転写酵素インヒビターであることを特徴と する請求項25に記載の方法。 27．前記ヌクレオシドアナログがジドブジンであることを特徴とする請求項26 に記載の方法。 28．前記量が、HIVのジドブジン耐性株の複製を阻害するのに有効であること を特徴とする請求項25に記載の方法。