JPH09510869A

JPH09510869A - 造血成熟因子

Info

Publication number: JPH09510869A
Application number: JP7519543A
Authority: JP
Inventors: エウェンカークネス，; マークディー．アダムス，; ヘンリックオルソン，; クレイグローゼン，
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1994-05-10
Publication date: 1997-11-04
Also published as: AU7354194A; CN1143372A; US6346246B1; NZ269871A; WO1995019985A1; AU697535B2; US20020146408A1; US5986069A; CA2181431A1; ZA943463B; EP0763045A4; EP0763045A1; US5922572A; US6790826B2

Abstract

(57)【要約】ヒト成熟因子ポリペプチドおよびこのような造血成熟因子ポリペプチドをコードするDNA(RNA)を開示する。組換え技術によりこのようなポリペプチドを生成する方法およびこのようなポリペプチドに対する抗体をもまた提供する。このようなポリペプチドは、適切な薬学的キャリアまたは希釈液と組み合わせ得、このようなヒト造血成熟因子ポリペプチドの過少発現に関する種々の疾患に対して診断効果、治療効果、および／または予防効果を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】造血成熟因子本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド配列、このような配列にコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。さらに特定すれば、本発明のポリペプチドは、造血成熟因子である。種々の増殖因子が発見、研究、および利用されている(Cellular and molecula r biology、日本組織培養協会編、朝倉書店(1987))。このような細胞増殖因子は、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、および塩基性線維芽細胞増殖因子を包含する。これらの因子は全て、線維芽細胞の増殖促進に基づいて単離されている。しかし、これらの因子はまた、広範な活性および貧弱な特異性を示すことが見出されている。従って、最近の試みは、機能的に分化した細胞に特異的に作用する増殖因子の探索が行われている。その結果、ケラチン生成細胞増殖因子および肝細胞増殖因子のような増殖因子が単離され、従って、これらの因子を、それらの特異的作用スペクトルに攻撃されやすい疾患を処置するために使用し得る可能性が生み出されている。単離されている別の増殖因子は、武田薬品工業による欧州特許出願番号第92102385.9号に開示されており、これはグリア細胞の増殖を促進する活性を有するグリア活性化因子およびそのポリペプチドをコードするDNAを開示している。造血は、血液細胞の生成である。主な造血組織は、骨髄、脾臓、リンパ節、および胸腺である。ヒトの胚の造血は、発生２週間目に始まる。骨髄は２ヶ月目で胚に現れ、そして骨髄は妊娠後半および出生後の生活を通しての主要な造血器官となる。骨髄は幹細胞を含み、幹細胞は造血系の全ての細胞を生じる。Ｔリンパ球を除く全ての血液細胞は、骨髄で生成される。造血幹細胞は、造血成熟因子の作用に応答して成熟血液細胞に分化する。従って、精製および単離され得る造血増殖因子は、血液細胞および他の疾患の処置および診断に広範な治療的価値を有する。本発明の１局面によれば、造血成熟因子である新規ポリペプチドならびにその類似体および誘導体が提供される。本発明の造血成熟因子は、ヒト起源である。本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）が提供される。本発明のさらに別の局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術により生成する手順が提供される。本発明のいっそう異なる局面によれば、これらのポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするDNA配列を、治療の目的で（例えば、造血起源または神経起源の細胞の分化および増殖を刺激するために）利用する方法が提供される。本発明のいっそう別の局面によれば、造血成熟因子に対する抗体が提供される。本発明のいっそう別の局面によれば、例えば、Ｔ細胞の欠損に関する疾患の処置において、造血成熟因子に対するアンタゴニストとして用いられる組成物（例えば、造血成熟因子ポリペプチドの作用を阻害するために使用され得る、造血成熟因子ポリペプチドに対する抗体）が提供される。本発明のこれらの局面およびさらに別の局面は、本明細書中の教示により当業者には明らかである。以下の図面は、単に本発明の特定の実施態様の例示を意味し、そしていかなる方法における制限をも意図しない。図１は、造血成熟因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示す。これはまた、造血成熟因子ポリペプチドのアミノ酸配列も示す。標準的な３文字表記が、アミノ酸配列を示すために使用されている。図２は、造血成熟因子とグリア成熟因子βとの相同性を示す。図３は、細菌での発現および精製後の精製造血成熟因子タンパク質のバンド特性を示す。図４は、増殖成熟因子が際立って見出される、ヒトの体内の器官を示すノーザンブロット解析である。図５は、造血成熟因子存在下で阻害されるHeLa細胞の増殖を示す。本発明の１局面によれば、図面の図１に示すDNA配列（および対応するRNA配列）および／または図面の図２の配列と同一のポリペプチドをコードするDNA(RNA) 配列、ならびにこのような配列のフラグメント部分、誘導体、類似体、および全ての対立遺伝子変異体が提供される。本発明の別の局面によれば、1993年８月４日に寄託されたATCC受託番号75514 として寄託されたcDNAクローンのポリヌクレオチドと同一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはこのようなポリヌクレオチドのフラグメント、類似体、誘導体、または対立遺伝子変異体が提供される。 DNAの場合、DNAは1本鎖または２本鎖であり得、そして１本鎖である場合、DNA 配列は図１に示す「センス」鎖またはその相補鎖であり得る。ポリヌクレオチド(DNAまたはRNA、好ましくはDNA)は、少なくともポリペプチドをコードする部分を含む。ここで、コード部分は、寄託したクローンと同一であり得るか、または同一のポリペプチドまたはその対立遺伝子変異体をコードするのであれば寄託したクローンと異なり得る。コード部分は、好ましくは、少なくとも本発明のタンパク質の成熟形をコードする。本発明はさらに、上記のポリヌクレオチド配列と、配列間に少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％の同一性がある場合に、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列に関する。別の好ましい実施態様では、本発明は、ストリンジェントな条件下で上記のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列に関する。本明細書中で使用するように、用語「ストリンジェントな条件」は、セグメント間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性を有する場合に起こるハイブリダイゼーションを意味する。従って、本発明は、図１のDNAによりコードされるペプチドの対立遺伝子変異形態をコードするDNA(RNA) 配列を包含する。従って、本発明は、造血成熟因子である天然に存在するヒトのポリペプチドおよびその対立遺伝子変異体をコードする単離されたDNA(RNA)を提供する。本発明はさらに、造血成熟因子であり、そして図２に示す構造を有するポリペプチド、ならびにその対立遺伝子変異体、および天然に存在するポリペプチドと同一の機能を有するその類似体、フラグメントおよび誘導体に関する。本発明のポリペプチドは主に造血組織で発現され、そしてそのようなものとして、造血起源の細胞およびそれらが相互作用する細胞を制御する造血成熟因子を代表する。本発明はさらに、1993年８月４日にATCC番号75514として寄託されたクローンに含まれるDNAによりコードされるポリペプチドならびにその類似体、フラグメント、誘導体、およびその対立遺伝子変異体に関する。これらの寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、単に便宜上提供されるのみであり、そして35 U.S.C.112条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは精製される。用語「単離された」は、物質が本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されているわけではなく、しかし天然の系において共存する物質の幾らかまたは全部と分離されている同一のポリヌクレオチドまたはDNA、あるいはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得るが、それにもかかわらずそのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離されている。好ましい実施態様では、造血成熟因子は、全長の成熟ヒト造血成熟因子またはその対立遺伝子変異体またはグリコシル化変異体である。ポリヌクレオチドはまた、プレタンパク質をコードし得る。このプレタンパク質はプロセシングされて哺乳動物細胞から成熟タンパク質として分泌される。本発明のポリヌクレオチド配列は、成熟形のポリペプチドをコードし得るか、またはポリペプチドの分泌を容易にするリーダー配列もまたコードし得る。例えば、所望のDNA配列は、ポリペプチドの分泌を補助するDNA配列（例えば、宿主の細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列）に同一の読み枠で融合され得る。リーダー配列を有するタンパク質は、プレタンパク質であり、そして宿主細胞により切断されてタンパク質の成熟形を形成するリーダー配列を有し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、インフレームでマーカー配列（例えば、ポリペプチドの精製を可能にするヒスチジンタグ）に融合され得る。従って、本発明のポリペプチドは、本発明の造血成熟因子の成熟形であり得る；またはプレタンパク質またはプレポリペプチドの形であり得、ここで、成熟ポリペプチドはリーダー配列または分泌配列を含有する；または融合タンパク質の形であり得、ここで、付加的なアミノ酸（これは、例えばポリペプチドの精製を補助する）が成熟タンパク質またはプレタンパク質にその３'末端または５'末端のいずれかで融合されている。本発明の好ましい実施態様では、マーカー配列は、細菌の発現ベクターにより読み枠に付加されるヘキサヒスチジンタグである。本発明のポリペプチドは、主に脾臓および胸腺に見出され、そして白血球に最も集中している。上記に示すように、本発明はまた、ポリペプチドの変異体を包含する。このポリペプチドは、図１のDNAおよび／または寄託されたクローンに含まれるDNAの変異体によりコードされている。この変異体は、造血成熟因子であるこのようなポリペプチドの質的な活性を維持している。変異体は、置換変異体、または挿入変異体、または欠失変異体であり得る。このような変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体であり得る。このような対立遺伝子変異体は、例えば、異なるグリコシル化パターンを有する変異体、またはアミノ酸レベルの置換、またはアミノ酸レベルの欠失である。このような変異体はまた、部位特異的変異誘発により生成され得る。置換変異は、保存アミノ酸の置換または非保存アミノ酸の置換てあり得、好ましくは保存アミノ酸てある。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒトの初期腎臓組織、脾臓、胸腺、または白血球由来のcDNAライブラリーから得られ得る。このポリヌクレオチドは、長さ142アミノ酸の成熟タンパク質をコードしているオープンリーディングフレームを含有している。造血成熟アミノ酸因子のアミノ酸は、神経細胞から単離された公知の増殖因子と配列相同性を有する。このポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドは、全領域にわたって82％同一、そして92％類似であることから、ヒトグリア成熟因子と構造的に関連する。このポリペプチドはまた、全コード領域体にわたって82％同一、そして92％類似であることから、ウシグリア成熟因子にも構造的に関連している。このポリペプチドは、Ｔ細胞の表面に見出され得る。グリア成熟因子は、哺乳動物の脳に見出される17kdのタンパク質であり、他の公知のタンパク質には明らかな配列相同性を有しない。この因子は胚に最も豊富に存在するが、発達の後期段階にも見出される。ヒトグリア成熟因子は、神経起源の特定の細胞の分化および増殖を制御する。宿主細胞は、本発明の発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または造血成熟因子遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養される。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現について選択される宿主細胞で以前使用した条件であり、そして当業者には明らかである。「形質転換」は、DNAが染色体外要素としてまたは染色体組込みのいずれかにより複製可能であるように、DNAを生物に導入することを意味する。あるいは他に指示がなければ、本明細書中で宿主細胞の形質転換に使用される方法は、Grah am,F.およびvan der Eb,A.，Virology 52: 456-457（1973）の方法による。しかし、核への注入またはプロトプラスト融合のような、DNAを細胞に導入する他の方法もまた使用され得る。原核細胞または実質的な細胞壁構成物を含む細胞を使用する場合、トランスフェクションの好ましい方法は、Cohen,F.N.ら，Proc.Nat l.Acad.Sci. (USA)，69:2110（1972）により記載されたような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。「トランスフェクション」は、コード配列が最終的に発現されるかされないかにかかわらず、宿主細胞へのDNAの導入をいう。細胞は、自然にはDNAを取り込まない。従って、種々の技術的な「トリック」が、自然の障壁を回避して遺伝子導入を行うために利用される。トランスフェクションの多くの方法（例えば、CaPO₄ およびエレクトロポレーション）が当業者には公知である。宿主細胞の形質転換は、トランスフェクションが成功したあらわれである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発現するための種々のベクターまたはプラスミドのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を包含する。このようなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、種痘、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルス DNAである。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターも使用され得る。上記に記載のように、適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順または他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはt rp 、ファージλPLプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御すると公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞の培養についてジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性、またはE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供し得る遺伝子を含有する。上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli 、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；動物細胞（例えば、CHOまたはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書の教示により当業者に公知の範囲内であると考えられる。さらに特に、本発明はまた、上述で広範に記載した１またはそれ以上の配列を含有する組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサーを包含する）を含有し得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE-9(Qiagen)、pBs、phagescript、PsiX174、 pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99 A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLneo、pSV2cat 、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターも使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、、pKK232-8およびpCM7である。特定の名付けられた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、およびtrcを包含する。真核プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、早期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル範囲内である。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE、デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in M olecular Biology ，1986)。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生成するために、従来の方法において使用され得る。あるいは、コードされるポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターまたは発現ベクターは、Sambrookら，Molucular Cloning: A Laboratory Manual，第２版(C old Spring Harbor,N.Y.,1989）（この開示は、本明細書中に援用として参照されている）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大させ得る。エンハンサーはDNA のシス作用因子であり、通常は約10〜約300bpであり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。例は、複製起点(bp100〜270)の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae のTRPI遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来プロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、転写開始配列および転写終結配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を指示し得るリーダー配列と適切な段階で組立てられる。細菌の使用における有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読みとり段階において、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、１またはそれ以上の形質的な選択マーカー、およびベクターの維持を保証するため、そして所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有し得る。形質転換に適切な原核宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Sal monella typhimurium 、およびPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylo coccus属の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝因子を含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala， Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を包含する。これらのP BR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わされる。適切な宿主系統の形質転換および適切な細胞密度への宿主系統の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により抑制解除され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により粉砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製が続けられる。造血成熟因子は、以下で使用される方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製される。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、固体支持体上のDNAまたはヌクレオチドを使用する）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。精製の間に低濃度（約0.1〜約５mM）のカルシウムイオンが存在することか好ましい(Priceら、J.Biol.Chem.，244: 917(1969))。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載されたサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含し得る。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、および任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング非転写配列を含有する。SV40のウイルスゲノムに由来するDNA配列（例えば、SV40 起点部位、初期プロモーター部位、エンハンサー部位、スプライス部位、およびポリアデニル化部位）は、必要な非転写遺伝因子を提供するために使用され得る。細菌培養物で産生される組換えタンパク質は、通常、細胞のペレットからまず抽出した後、続いて１またはそれ以上の塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことにより単離される。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ工程が、成熟タンパク質を完全な配置とするために使用され得る。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、任意の便宜的な方法（凍結融解サイクル、超音波処理、機械的粉砕、または細胞溶解剤の使用を包含する）により粉砕され得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物または化学合成手順の産物であり得るか、または本発明のポリヌクレオチド配列の原核宿主または真核宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主により、本発明のポリペプチドは、哺乳動物細胞または他の真核細胞の糖質でグリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基（−１位）をも包含し得る。ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子形に加えて、本発明はまた、その類似体およびフラグメントを包含し、これらは造血成熟因子として機能し得る。従って、例えはポリペプチドの１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基に置換され得る。造血成熟因子は、神経または造血性起源の異常（例えば、ガン）の処置において使用され得る。なぜなら、造血成熟因子は、ガン細胞の増殖をブロックまたは遅延し得るからである。本発明のポリペプチドはまた、白血病の処置のために使用され得る。白血病は、白血病細胞により産生される因子による正常な造血の抑制から生じる正常な血液細胞形成の抑制を臨床上の特色としている。この結果、貧血、血小板減少、および顆粒球減少になる。従って、治療有効量の造血成熟因子の投与は、白血病細胞による造血の抑制を克服するために用いられ得る。造血成熟因子はまた、他の血液関連疾患（例えば、溶血、真性赤血球増加、骨髄線維症(melogibrosis)、血有病、および巨脾腫）の処置のために使用され得る。造血成熟因子はまた、患者がガンまたは他の状況により骨髄移植を受けた状況で成熟血液細胞の分化の刺激において使用され得る。造血成熟因子はまた、調査または診断上の目的でインビトロでの骨髄細胞の刺激に使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現で本発明に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。従って、例えば、骨髄細胞のような細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエクソビボで形質導入され得、次いで、形質導入された細胞は、ポリペプチドで処置される患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって形質導入され得る。同様に、細胞の形質導入は、インビボでのポリペプチドの発現のためには、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで達成され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボでの形質導入およびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するこれらの方法または他の方法は、本発明の教示により当業者には明らかである。例えば、細胞に形質導入するための発現媒体は、レトロウイルス粒子（例えば、アデノウイルス）以外のものであり得る。これらは、適切な送達媒体と組み合わせた後インビボで細胞を形質導入するために使用され得る。本発明のポリペプチドは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のタンパク質、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を包含し得る。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを包含するが、これに限定されない。処方は、投与方法に合わせるべきである。造血成熟因子を含有する組成物の注射薬は、例えば、グルコースまたは他の補助剤を含有する生理的食塩水または水性溶液を使用して、従来の方法により調製され得る。錠剤およびカプセル剤のような薬学的組成物もまた、従来の方法に従って調製され得る。薬学的組成物としての注射薬、溶剤、錠剤、およびカプセル剤は、無菌条件下で調製される。本発明はまた、１またはそれ以上の本発明の薬学的組成物の成分が満たされた１またはそれ以上の容器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤または生物製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の通知と関連し得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の薬学的化合物と併用して用いられ得る。本発明の造血成熟因子は、薬剤として用いられる場合、適切な賦形剤中で哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ウサギ、およびネコ）に与えられ得る。本発明のポリペプチドは、上記のように薬剤として用いられる場合、例えば、上述の被験体に少なくとも約10μg/kg体重の治療有効用量で与えられ、そしてほとんどの場合、１日あたり約８mg/kg体重を超えない量で投与され、そして好ましくは、投与量は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約10μg/kg体重〜約１mg/kg体重である。本明細書中で同定されたそれぞれのcDNA配列またはその部分は、多数の方法でポリヌクレオチド試薬として使用され得る。配列は、特定の細胞型の特定のmRNA の存在についての診断プローブとして使用され得る。さらに、これらの配列は、遺伝学的連鎖分析（多形）に使用するために適切な診断プローブとして使用され得る。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多形）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明によるcDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子との相関についての重要な第１段階である。簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこれらのハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプールにより下部位置決め(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基という短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpよりも長いクローンの方が、簡便な検出では充分なシグナル強度でユニークな染色体位置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし、そしてこのクローンはより長いことが好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,0 00bpはより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、当節の適度な割合で良好な結果を得るためにおそらく必要でない。この技術の総説としては、Vermaら， Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。いったん配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。(このようなデータは、例えば、V．McKusick，Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins U niversity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である))。次いで、同一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体の間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして20 kbあたり１遺伝子と仮定する。）罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、まず染色体の構造変化（例えば、染色体展開物で目視できるか、あるいはそのcDNA配列に基づくPCRを使用して検出可能な欠失または転座）を探すことを包含する。最終的には、変異の存在を確認し、そして変異を多形から区別するために、数個体からの遺伝子の完全な配列決定が必要とされる。本発明はさらに、造血成熟因子の刺激効果を減少および／または除去するために、アンチセンス技術の使用によるインビボでの造血成熟因子の阻害に関する。アンチセンス技術は、３重ヘリックスの形成あるいはアンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAにより遺伝子発現を制御するために使用され得る。これらの方法は両方とも、ポリヌクレオチド配列のDNAまたはRNAへの結合に基づく。例えば、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分（これは、本発明のポリペプチドをコードする）が、長さ10塩基対〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関わる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（３重ヘリックス−Leeら，Nucl．Acids Res . ,6: 3073(1979); Cooneyら，Science，241: 456(1988);およびDervanら，Scien ce ，251: 1360(1991)を参照のこと）、その結果造血成熟因子の転写および生成を防ぐ。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子からの造血成熟因子への翻訳をブロックする（アンチセンス− Okano，J．Neurochem.,56: 560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense I nhibitors of Gene Expression ，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)を参照のこと）。あるいは、上記のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNAまたはアンチセンスDNAがインビボで発現されて上記の様式で造血成熟因子の生成を阻害し得るように、当該分野の手順により細胞に送達され得る。従って、造血成熟因子に対するアンチセンス構築物は、細胞増殖を刺激し得、これは、所定の疾患（例えば、AIDS）を処置するために使用され得る。なぜなら、造血成熟因子をブロックすることによりＴ細胞の成熟を制御し得るからである。このようにして、アンチセンス構築物はまた、貧血を処置するために使用され得る。このタンパク質、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらの類似体、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖、Fabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物であり得る。当該分野で公知の種々の手順が、ポリクローナル抗体の生成のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られる。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントしかコードしていない配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。さらに、このような抗体のパネルは、多数のポリペプチドに特異的であり、このような組織を同定しそして区別するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により生成される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle rおよびMilstein，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today 4: 72)、およびヒトモノクローナル抗体を生成するEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Mo noclonal Antibodies and Cancer Therapy ，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げられる。単鎖抗体を生成するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。抗体は、本発明のタンパク質配列の位置決めおよび活性に関する方法（例えば、これらのタンパク質のイメージング、および適切な生理学的サンプル中でのこれらタンパク質のレベルの測定など）において使用され得る。造血成熟因子に特異的な抗体はさらに、ポリペプチドに固有の機能を阻害するアンタゴニストとして使用され得る。このようにして、抗体は、治療において、例えば、細胞増殖を刺激して所定の疾患（例えば、AIDSおよび貧血）を処置するために使用され得る。さらに、このような抗体は、造血成熟因子の存在または非存在を検出し得、その結果、造血および神経系の疾患の指標となる。従って、これらの抗体はそれらに関連する疾患の診断薬として使用され得る。出生前診断はまた、関連した疾患が先天的である場合に特に有用である。あるいは、本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストが用いられ得る。このアンタゴニストは、本発明のポリペプチドが通常結合するレセプターに結合する。アンタゴニストは、ポリペプチドの不活性な形態に類似し、そして造血成熟因子に特異的な抗体が生成される方法と同様の方法で生成され得る。このようにして、造血成熟因子の作用が妨げられ、そしてアンタゴニストは細胞増殖を刺激して所定の疾患（例えばAIDS）を処置するために治療的に使用され得る。アンタゴニストはまた、造血成熟因子の存在または非存在を検出するために診断的に使用され得る。これから、本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。全ての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い所定の方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後に大文字および／または数字を示すことにより称される。本明細書中の出発プラスミドは、購入可能であり、制限無く公的に入手可能であり、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと同等のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の所定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、購入可能であり、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的で、代表的には１μgのプラスミドまたはD NAフラグメントが約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的では、代表的には５〜5 0μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量で消化される。特定の制限酵素の適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかし供給者の説明書に従って変動させ得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res.,８:４ 057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、大体等モル量の連結されるDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。実施例１造血成熟因子の発現および精製造血成熟因子をコードするDNA配列(ATCC#75514)を、まずそのDNA配列の５'末端および３'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し、挿入フラグメントを合成する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列を有し、１箇所のBspHI制限酵素部位およびompAリーダー配列に続き、メチオニン開始コドンに続くコドンから始まる21ヌクレオチドの造血成熟因子コード配列を含有する；３'配列GACTAGATCTACGAAAGAAAGACAACTTTTCは、BglII部位に相補的な配列、および造血成熟因子コード配列の最後の21ヌクレオチドを含有する。制限酵素部位は、細菌発現ベクターのpQE-60(Qiagen Inc.,9259 Eton Ave.,Chatsw orth，CA 91311)上の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性(Amp^r)、細菌の複製起点(ori)、IPTG制御性プロモーター／オペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、６−ヒスチジンタグ(6-His)、および制限酵素クローニング部位をコードする。pQE-60ベクターを、NcoIおよびBglIIで消化し、次いで細菌のRBSから開始される読み枠を維持しながら、挿入フラグメントをpQE-60ベクターに連結した。次いで、連結混合物を用いてE.coli m15/rep 4株（登録商標m15/rep4でQiagenより入手可能）を形質転換した。M15/rep4は、多コピーのプラスミドpREP4を含有し、これは、lacIリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性(Kan^r)を付与する。形質転換体を、AmpおよびKanの両方を含有するLBプレートで増殖する能力により同定する。所望の構築物を含有するクローンは、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の両方を添加したLB培地中の液体培養で１晩(O/N)増殖させた。１晩の培養物を、より大きな培養物を移植するために、１:100〜１:250の比率で使用した。細胞を、0.4と0.6との間の600 での光学密度(O.D.⁶⁰⁰)まで増殖させた。次いで、IPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１mMで添加した。IPTGの誘導により、lacl リプレッサーを不活化することによりP/Oを切り開き、遺伝子発現の増加を導く。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６MのグアニジンHCL中で可溶化した。洗浄後、可溶化した造血成熟因子を、6-Hisタグを含有するタンパク質が強く結合し得る条件下でのニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーにより、この溶液から精製した(Hochuli,E.ら，Genetic Engineering，Principle & Methods ，12：87-98 Plenum Press，New York(1990))。造血成熟因子（95％純度）をpH5 .0の６MグアニジンHCL中でカラムから溶出させ、そして復元の目的で３MグアニジンHCL、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元）、および２mMグルタチオン（酸化）に調整した。この溶液中で12時間インキュベーションした後、タンパク質を50mMリン酸ナトリウムで透析した。実施例２異なる組織での造血成熟因子をコードするRNAの発現造血成熟因子の発現パターンを分析するため、RNAを異なるヒト組織から単離した。全RNAを単離した後、ポリＡ含有RNAをポリＴ含有アフィニティー樹脂でのアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。ポリＡ含有RNA(２μg)をゲルクロマトグラフィーを変性することにより分離し、そしてポリＡ含有RNAをブロッティングすることによりメンブレンにトランスファーした。メンブレンに結合したポリＡ RNAを造血成熟因子遺伝子にわたる放射性プローブとハイブリダイズさせ、続いてのオートラジオグラフィーによりRNA発現パターンを決定した。図４。実施例３造血成熟因子およびHeLa細胞の増殖阻害 HeLa細胞を24ウェルプレートに１ウェルあたり10⁵（実験番号１）または10⁴（実験番号２および番号３）で播いた。細胞を、５％ウシ胎児血清、ペニシリン50 単位/ml、およびストレプトマイシン50μg/mlを含有するDMEM培地（「ダルベッコの改変Eagle培地」）１ml中で増殖させた。実験あたり各濃度の造血成熟因子について４つのウェルで播いた。造血成熟因子を播種１日後に適用した。３日後、細胞をトリプシン処理し、そして計数した。図５。結果は、造血成熟因子がガン細胞の増殖を阻害することを示す。なぜなら、He La細胞は、ガン細胞の形態だからである。本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、従って、特に記載がなければ、以下の請求の範囲内で本発明は実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＹ 9356−4ＨＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｈ 21/04 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 14/47 9637−4Ｂ 21/08 16/18 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｎ 5/10 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/24 ＡＣＣＣ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ 37/02 ＡＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9051−4ＣＡＤＶＣ１２Ｑ 1/68 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者アダムス，マークディー. アメリカ合衆国メリーランド 20878, ノースポトマック，ダフィーフドライブ 1505 (72)発明者オルソン，ヘンリックアメリカ合衆国メリーランド 20878, ガイザースバーグ，ケンドリックプレイス 182 (72)発明者ローゼン，クレイグアメリカ合衆国メリーランド 20882, レイトンズビル，ローリングヒルロード 22400

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたDNA配列であって、図１のDNA配列と同一の成熟ポリペプチドを少なくともコードするDNAまたはその対立遺伝子変異体を含む、DNA配列。２．前記DNAが、図１の成熟ポリペプチドを少なくともコードする図１のDNAおよびその対立遺伝子変異体を含む、請求項１に記載の単離されたDNA。３．請求項１に記載のDNA配列に対応するRNAおよびその対立遺伝子変異体を包含する、単離されたRNA配列。４．単離されたDNA配列であって、ATCC受託番号75514に含有されるDNA配列によりコードされる成熟ポリペプチドと同一の成熟ポリペプチドを少なくともコードするDNA配列およびその対立遺伝子変異体を含む、DNA配列。５．前記DNAがATCC受託番号75514に含有されるDNAを含有し、該DNA配列が前記成熟ポリペプチドをコードする、請求項４に記載の単離されたDNA。６．請求項４に記載のDNA配列に対応するRNAを含む、単離されたRNA配列。７．請求項１に記載のDNA配列を含む発現媒体。８．請求項４に記載のDNA配列を含む発現媒体。９．請求項１に記載のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその活性なフラグメント、誘導体または機能的類似体。１０．請求項４に記載のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその活性なフラグメント、誘導体または機能的類似体。１１．請求項２に記載のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその活性なフラグメント、誘導体または機能的類似体。１２．請求項５に記載のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその活性なフラグメント、誘導体または機能的類似体。１３．ポリペプチドを生成する方法であって、請求項１に記載のDNAを使用することによりポリペプチドを発現させる工程を包含する、方法。１４．請求項９に記載のポリペプチドに対する抗体。１５．請求項１０に記載のポリペプチドに対する抗体。１６．請求項１に記載のDNAを用いて設計された細胞。１７．ポリペプチドを発現する細胞を生成する方法であって、請求項１に記載の DNAを用いて細胞を遺伝的に設計する工程を包含する、方法。１８．請求項９に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。１９．造血成熟因子を必要とする患者を処置する方法であって、治療有効量の請求項９に記載のポリペプチドを該患者に投与する工程を包含する、方法。２０．造血成熟因子を阻害するために患者を処置する方法であって、治療有効量の請求項１８に記載のアンタゴニストを該患者に投与する工程を包含する、方法。２１．請求項１に記載のDNA配列にハイブリダイズし得る、単離されたDNA配列。２２．前記治療有効量の前記ポリペプチドが、該ポリペプチドをコードするDNA を患者に提供し、そして該ポリペプチドをインビボで発現させることにより、該患者に投与される、請求項１９に記載の方法。