JPH10508484A

JPH10508484A - ヒトｄｎａリガーゼｉｉｉ

Info

Publication number: JPH10508484A
Application number: JP8515267A
Authority: JP
Inventors: ウェイ，イン−フェイ; ヘイゼルタイン，ウィリアム・エイ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 1998-08-25
Also published as: AU687484B2; AU1174795A; EP0796320A1; EP0796320A4; WO1996014394A1

Abstract

(57)【要約】ヒトＤＮＡリガーゼIIIポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）並びにそのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を開示する。ＤＮＡリガーゼIIIの欠損に関連する障害の治療のために遺伝子治療を介してそのようなポリペプチドを利用する方法も開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよび望ましくない細胞を殺すための治療としての使用も開示する。ＤＮＡリガーゼIII遺伝子変異体を検出する診断法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＤＮＡリガーゼIII 本発明は新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。特には本発明のポリペプチドはヒトＤＮＡリガーゼIIIである。本発明はそのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。ＤＮＡ鎖の中断とギャップは、複製、修復、組換え中に生じる。哺乳動物の細胞核においてはそのような切断の再結合はいくつかの異なるＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼに依存する。３つの異なるＤＮＡリガーゼの存在は、精製された酵素の生化学的および免疫学的キャラクタリゼーションにより以前に確立された(Ｔomkinson，Ａ.Ｅ.等、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.、２６６：２１７２８−２１７３５(１９９１))。ＤＮＡリガーゼは哺乳動物細胞におけるＤＮＡ複製、除去修復および組換修復を触媒する酵素である(Ｌi，Ｊ.Ｊ.およびＫelly，Ｔ.Ｊ.、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８１：６９７３−７７（１９８４）およびＷook．Ｒ.Ｏ.等、Ｃell，５３：９７−１０６(１９８８))。細菌においては３つのＤＮＡリガーゼ、すなわちＤＮＡリガーゼI、ＤＮＡリガーゼII、およびＤＮＡリガーゼIIIが発見され、ヒトでは３つすべてが見出されているが、ＤＮＡリガーゼIのみがクローン化されている。ＤＮＡリガーゼIをコードする完全長のヒトcＤＮＡは、Ｓ．cereviasiae cdc 温度感受性ＤＮＡリガーゼ変異体の機能的相補性により得られた(Ｂaker，Ｄ．Ｇ.、Ｅur．Ｊ．Ｂiochem.，１６２：６５９−６７(１９８７))。完全長cＤＮＡは９１９個のアミノ酸残基よりなる１０２kＤaのタンパク質をコードする。微生物ＤＮＡリガーゼを除いて他の公知タンパク質と顕著な配列相同性はない。活性部位リジン残基は位置５６８に位置している。ＤＮＡリガーゼIは活性のためにマグネシウムとＡＴＰを必要とする。ＤＮＡリガーゼIの主な機能は、ラギング鎖ＤＮＡ複製の間にオカザキ断片を結合することである。それはＤＮＡ中の一本鎖破断点をも有効にシールし、制限酵素ＤＮＡ断片を付着末端に結合する。該酵素はＤＮＡのブラント末端結合を触媒することもできる。ＤＮＡリガーゼIは、poly（dＡ）に水素結合したオリゴ（dＴ）分子を結合できるが、該酵素は、オリゴ（dＴ）をポリ（rＡ）相補鎖にライゲートできない点でＴ４ＤＮＡリガーゼとは異なる。ヒトＤＮＡリガーゼIIは細胞核とより堅固に結合している。この酵素は４２℃ で急速に不活性する不安定なタンパク質である。ＤＮＡリガーゼIIは、補因子としてＡＴＰを必要とする点で他の真核ＤＮＡリガーゼと似ているが、ＡＴＰに対してずっと高い会合性を有する点においてＤＮＡリガーゼIと異なる。ＤＮＡリガーゼIIは、オリゴ（dＴ）・ポリ（rＡ）基質とのホスホジエステル結合の形成を触媒するが、オリゴ（rＡ）・ポリ（dＴ）基質については触媒しない。従ってこの点においてＤＮＡリガーゼＩとは完全に異なる(Ａrrand，Ｊ.Ｅ.等，Ｊ．Ｂ iol．Ｃhem. ，２６１：９０７９−８２(１９８６))。ＤＮＡリガーIIより大きく、そのタンパク質とは明らかに関係のない、最近検出された酵素はＤＮＡリガーゼIIIと名付けられた(Ｔomkinson，Ａ.Ｅ.等，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem. ，２６６：２１７２８−３５(１９９１))。ＤＮＡリガーゼIIIは、ＡＴＰの場合低い親和力を有しヒドロキシアパタイトに弱くのみ結合する点においてＤＮＡリガーゼＩに類似し、ＤＮＡリガーゼIIとは異なる。しかしながらＤＮＡリガーゼＩおよびIIIは密接に関係していない。ＤＮＡリガーゼIIIはＤＮＡにおける一本鎖破断点を有効に修復するが、ブラント末端結合またはスーパーコイルＤＮＡのＡＭＰ依存性緩和を行うことができない(Ｅlder,Ｒ.Ｈ.等、Ｅur ．Ｊ．Ｂiochem. ，２０３：５３−５８(１９９２))。ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ鎖中断の結合についてのメカニズムは広く記載されている。その反応は共有結合的酵素−アデニレート複合体の形成により開始される。哺乳動物およびウイルスＤＮＡリガーゼはＡＴＰを補助因子として用い、一方細菌ＤＮＡリガーゼはアデニリル基を生成するためにＮＡＤを用いる。ＡＴＰは、ＡＭＰ、およびタンパク質の活性部位にある特異的なリジン残基のε−基へホスホルアミデート結合により結合したアデニリル残基を有するピロホスフェートに切断される(Ｇumport，Ｒ.Ｉ.等、ＰＮＡＳ，６８：２５５９−６３(１９７１))。ＤＮＡリガーゼ−アデニレート中間体の再活性化されたＡＭＰ残基は２本鎖ＤＮＡ中の１本鎖破断点の５′リン酸末端に移され、５′−５′ホスホ無水物結合を有する共有結合性ＤＮＡ−ＡＭＰ複合体を生ずる。この反応中間体は微生物および哺乳動物リガーゼについても単離されたが、アデニル化された酵素より短命である。ＤＮＡライゲーションの最終段階において、ホスホジエステル結合の生成に必要なアデニル化されていないＤＮＡリガーゼは、アデニル化部位の隣接３′−ヒドロキシル基による攻撃を介してＡＭＰ残基の置換を触媒する。本発明のポリペプチドはアミノ酸配列相同性の結果として、ヒトＤＮＡリガーゼIIIと推定的に同定された。本発明の一態様によればヒトＤＮＡリガーゼIIIである新規な成熟ポリペプチド、並びに生物学的に活性な、そして診断または治療上有用なその断片、アナログ、および誘導体が提供される。本発明の他の態様によれば、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ並びにそのアナログおよび生物学的に活性で診断または治療上有用なフラグメントを含む、ヒトＤＮＡリガーゼIIIをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明の異なる態様によれば組換え技術によるそのようなポリペプチドの製造方法が提供され、その方法は、ヒトＤＮＡリガーゼIII核酸配列を有する組換え原核および／または真核宿主細胞を、該タンパク質の発現を促進する条件下に培養し、次にそのタンパク質を回収することを含んでなる。本発明の更なる態様によれば、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡ合成およびＤＮＡベクターの製造に関するインビトロ目的のために利用する方法が提供される。本発明の更なる態様によれば、遺伝子治療によって、不十分なヒトＤＮＡリガーゼIII活性に関する状態を処置する方法が提供され、その方法はＤＮＡリガーゼIII遺伝子を患者の細胞にin vivoまたはex vivoで入れることを含んでなる。その遺伝子はトランスデュースされた細胞中で発現され、その結果として、該遺伝子によりコードされるタンパク質を治療に、例えば異常な細胞増殖、例えば腫瘍等のＤＮＡの欠陥に関連する障害を防止し、激しい免疫抑制、発育阻止された生長およびリンパ腫、並びにＤＮＡ破損剤に対する細胞の過敏性を治療する。本発明の更なる態様によれば、ヒト配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子よりなる核酸プローブが提供され、ＤＮＡリガーゼIIIをコードする遺伝子中の変異を検出するのに診断的に使用し得る。本発明の更なる態様によれば、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、それは細胞内で製造されるかまたは遺伝子治療により投与され、そのようなポリペプチドの作用を阻げ、例えば望ましくない細胞、例えば癌細胞を標的にし、破壊する。本発明のこれらのおよび他の態様は本明細書の教示から当業者に明らかであろう。次の図は本発明の態様の説明であり、請求の範囲に包含される本発明の範囲を制限することを意図しない。図１は、ＤＮＡリガーゼIIIポリペプチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ配列を示す。アミノ酸についての標準的な１文字省略を用いる。図２は、ヒトＤＮＡリガーゼＩ（上の列）およびヒトＤＮＡリガーゼIII（下の列）間のアミノ酸相同性を示す。図３は、異なるヒト組織におけるＤＮＡリガーゼIIIの存在を説明するゲルのコピーである。パネルＡはヒトＤＮＡリガーゼIII遺伝子のノーザン分析のオートラジオグラフであり、パネルＢはローディングレファレンスとしてのエチジウムブロマイド染色ゲルである。結果は、ヒトＤＮＡリガーゼIIIが、胸腺、精巣および心臓で主に発現することを示す。本発明の一態様により、第１図の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年８月３１日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８８０号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、胸腺、精巣および心臓から得ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの活性化されたＴ細胞から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見された。それは、構造的に、ＤＮＡリガーゼファミリーに関係がある。それは、８９９個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。そのタンパク質は、ウサギＤＮＡリガーゼに対し、最も大きい相同性を有し、全タンパク質にわたって、２９％の同一性および５１％の類似性を有する。疎水性アミノ酸残基がいずれかの側で隣接する保存された活性なリジン残基が存在し、配列Ｅ−ＫＹＤＧ− Ｒは、哺乳動物細胞、酵母、ワクシニアウイルスおよびバクテリオファージＴ７等の異なる源からの酵素に共通することも重要である。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、第１図に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。第１図の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列(また場合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。従って、本発明には、第１図に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１図に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する( Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチドをコードする。本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＤＮＡリガーゼIIIポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）は成熟ポリペプチドの精製に使用される、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＤＮＡリガーゼ III遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lac またはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyc es 、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ＤrosophilaおよびＳf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢow esメラノーマといったような動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ− ９(Ｑiagen)、pＢＳ、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄibner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology（１９８６）)。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaborato ry Ｍanual，第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、(１９８９)により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクターpＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals,，Ｕppsala、スウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。ＤＮＡリガーゼIIIポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペブチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。該ＤＮＡリガーゼポリペプチド、並びにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペブチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することもできる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知であって、本明細書中の教示から明らかである。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用により、公知の方法により、細胞を操作することができる。同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。例えば、細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。ＤＮＡリガーゼIIIポリペプチドが遺伝子治療を介して細胞内でひとたび発現されると、ＤＮＡ損壊剤、例えばＵＶ照射により生ずるＤＮＡの一本鎖切断を修復するのに用い得る。いくつかのヒトの症候群はＤＮＡリガーゼ遺伝子の常染色体劣性遺伝から生ずる。これらの症候群は重篤な免疫不全を起こし、ＤＮＡが修復されないため異常な細胞分化になりやすさを大いに増加させ、一方細胞レベルではそれらは染色体の不安定性およびＤＮＡ損壊剤に対する過度の感受性により特徴付られる。これらの症候群にはＦanconi貧血およびＢlackfan-diamond貧血がある。本発明のポリペプチドを用いて、ＤＮＡIII遺伝子の欠陥の結果である重篤な免疫抑制およびＤＮＡ再結合欠陥から生じる発育を妨げられた増殖およびリンパ腫を処置し得る。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、同様の生物学的活性を有する他の分子を同定するのにも有用である。これについてのスクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を用いることによりＤＮＡリガーゼIII遺伝子のコード鎖を単離することである。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするか決める。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、科学研究、ＤＮＡの合成に関して、およびＤＮＡベクターの製造のためにも用い得る。本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは研究市場で販売し得る。例えばＤＮＡリガーゼIIIを、他のリガーゼに類似する方法でＤＮＡ配列のin vitroinライゲーションに用い得る。本発明はヒトＤＮＡリガーゼIIIにより触媒されるＤＮＡ結合反応を促進し（アゴニスト）、また妨げる（アンタゴニスト）化合物を同定する、化合物スクリーニング方法を提供する。そのような方法の例は、ＡＴＰ、ＤＮＡリガーゼおよび一本鎖破断点を有するＤＮＡを該化合物と、ＤＮＡリガーゼがＡＴＰをＡＭＰに正常に分解し、そのＡＭＰが二本鎖ＤＮＡの一本鎖破断点の５'リン酸末端に移り、共有結合性ＤＮＡ−ＡＭＰ複合体を生じ、一本鎖破断点がその後修復するような条件下に混合することを含んでなる。一本鎖破断点を有するＤＮＡは変異体細胞により上記例で提供され、その細胞は鎖破断修復に働くタンパク質を欠いており、例えばＸＲＣＣＩを欠く変異体ゲッ歯類細胞、およびcdc９Ｓ、Ｃerevi siaeＤＮＡリガーゼ変異体である。この反応の触媒を促進し、または妨げる化合物の能力を次に測定し、化合物が有効なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを決める。ヒトＤＮＡリガーゼIIIは細胞内で産生され、機能する。それ故いずれのアンタゴニストも細胞内性でなければならない。ヒトＤＮＡリガーゼIIIに対する可能性あるアンタゴニストには、細胞内で産生される抗体を含む、例えばＤＮＡリガーゼIIIをアンタゴナイズすると同定された抗体を、公知の方法、例えば適当な細胞を一本鎖抗体をコードするＤＮＡでトランスフォームし、ヒトＤＮＡリガーゼIIIの機能を阻害することにより、一本鎖抗体として細胞内で産生され得る。別の可能性のあるアンタゴニストは、アンチセンス技術を利用して調製されたアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａcids Ｒ es.、６：３０７３（１９７９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）を参照、そのことによって、転写およびＤＮＡリガーゼIIIの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＤＮＡリガーゼIIIへの翻訳をブロックする(アンチセンス− Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣ.Ｐress、Ｂoca Ｒ aton、ＦＬ（１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り込み、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＤＮＡリガーゼ111の産生を阻害することができる。他の可能性あるアンタゴニストには、ＤＮＡは認識するが一本鎖破断を修復せず、従ってヒトＤＮＡリガーゼIIIが機能するのを妨げるよう機能する、ＤＮＡリガーゼIIIの変異した形、またはムテインが含まれる。アンタゴニストを用いて望ましくない細胞、例えばがん細胞を標識化し得る。何故ならＤＮＡリガーゼ111の阻害はＤＮＡにおける一本鎖破断の修復を妨げ、事実上細胞死をもたらすからである。本発明の小分子アゴニストおよびアンタゴニストは、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量の該化合物、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明の医薬組成物は、他の治療化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０ μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。完全な長さのヒトＤＮＡリガーゼIII遺伝子のフラグメントは、完全な長さのＤＮＡリガーゼIII遺伝子を単離するために、また該遺伝子に対する高い配列類似性活性を有する他の遺伝子を単離するために、cＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。この種類のプローブは、例えば、３０、４０、５０、７５、９０、１００または１５０であり得る。好ましくは、しかし、該プローブは、３０〜５０塩基対を有する。該プローブはまた、完全な長さの転写物、並びにゲノムクローン、または調節およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンが含まれる、完全な長さの転写物に対応するcＤＮＡクローンを同定するのに使用することもできる。プローブは、ハイブリダイゼーションの同定を容易にするため標識してもよい。本発明は診断薬としてのヒトＤＮＡリガーゼIIIの使用をも提供する。例えばある病気は固有の遺伝子欠損から生ずる。これらの遺伝子は欠損遺伝子の配列を正常なもののそれと比較することにより検出できる。すなわち変異体遺伝子をＤＮＡ損壊剤に過度の感受性、異常な細胞増殖へのかかりやすさの増加、例えば腫瘍および癌に関連づける。ヒトＤＮＡリガーゼIIIにおいて変異が起こっている個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓa ikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６）)を利用することにより、酵素的に増幅することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズの変化により検出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化ＤＮＡリガーゼIIIＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化ＤＮＡリガーゼIIIアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定することができる。完全に対合している配列は、ＲＮアーゼＡ消化により、または融解温度の相違により、対合していない複合物(duplexes)と区別することができる。ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラジエントゲルを変性することで区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それらの特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法により示すことができる(例えば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５）)。従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用( 例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およびサザンブロッティングといったような方法により成し遂げることができる。変異体はin situ分析により検出し得る。更にある病気は、mＲＮＡにおける変化により検出できる遺伝子発現の変化の結果であり、またはそれにより特徴付けできる。或いはＤＮＡリガーゼIIを比較として用い、低レベルのＤＮＡリガーゼIIIタンパク質を発現する個体を、例えばＮorthernブロッティングにより同定できる。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。cＤＮＡのコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをスパン(s pan)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、in situハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光in situハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、発現配列タグ(ＥＳＴ)が得られるクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２,０００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、４,０００以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔechni ques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniv ersity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。本発明の遺伝子は染色体１３ｑ３３−３４にマップされた。次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo hlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmm unology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒe s.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相捕的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶa n der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。実施例１ＤＮＡリガーゼIIIの細菌における発現と精製ＤＮＡリガーゼIIIをコードするＤＮＡ、ＡＴＣＣ＃７５８８０をプロセシングされたＤＮＡリガーゼIIIタンパク質の５'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。その５'オリゴヌクレオチドプライマーは配列：を有し、Ｂam ＨＩ制限酵素部位（下線）、続いてプロセシングされたタンパク質コドンの推定の末端アミノ酸から出発するＤＮＡリガーゼIIIコード配列の２１ヌクレオチドを含む。という３′配列は、ＰstＩ部位（下線）に対する相補的な配列を含み、ＤＮＡリガーゼIIIのＣ末端のＤＮＡリガーゼIIIの２１ヌクレオチドが続く。その制限酵素部位は細菌発現ベクターpＱＥ−９（Ｑiagen，Ｉnc．９２５９Ｅton Ａven ue，Ｃhatsworth，ＣＡ，９１３１１）の制限酵素部位に対応する。pＱＥ−９は抗生物質耐性（Ａmp^r)、細菌の複製起源(ori)、ＩＰＴＧ調節可能なプロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコードする。pＱＥ−９を次にＢam Ｈ１およびＰＳＴＩで消化する。増幅した配列をpＱＥ−９にライゲートし、ヒスチジンのtagおよびＲＢＳをコードする配列と共に枠内に挿入する。ライゲーション混合物を用いて、Ｑiagenから商標Ｍ１５／rep４の名前で入手できるＥ．coli株Ｍ１５／rep４を、Ｓambroo k，Ｊ等、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８９）に記載された方法によりトランスホームする。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピーを有し、該プラスミドは lacＩリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（Ｋan^r）も与える。トランスホーマントを、ＬＢプレートで増殖するその能力により同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により確認する。所望の構築物を有するクローンを、Ａmp（１００μg／ml）およびk an（２５μg／ml）の両方を補ったＬＢ培地で液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。そのＯ／Ｎ培養を用いて、大量培養物を１：１００〜１：２５０の割合で接種する。細胞を０.４〜０.６の間の光学密度６００（Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰）まで増殖させる。ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度１mＭになるまで次に加える。ＩＰＴＧはlacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングして遺伝子発現の増加をもたらすことによって誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次に細胞を遠心分離により収穫する。細胞ペレットをカオトロピック剤６モルグアニシジンＨＣlで可溶化する。清澄後可溶化タンパク質抽出物を、以下の条件下にニッケル−キレートカラムでのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製する。その条件は６−Ｈis tagを含むタンパク質による強固な結合を可能にするものであり(Ｈochuli，Ｅ等、Ｊ．Ｃhromatogr aphy ４１１：１７７−１８４（１９８４）)、そのカラムから６モルのグアニシジンＨＣl pＨ５で溶出し、再生のために３モルグアニジンＨＣl、１.００m Ｍリン酸ナトリウム、１０ミリモルのグルタチオン(還元形)、および２ミリモルのグルタチオン（酸化形）で調節する。この溶液で１２時間インキュベーション後、タンパク質を１０ミリモルのリン酸ナトリウムに対し透析する。実施例２バキュロウイルス発現系を用いるＤＮＡリガーゼIIIのクローニングおよび発現完全長のＤＮＡリガーゼIIIタンパクをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５８８０を、その遺伝子の５′および３′配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５′プライマーは配列：を有し、Ｓma Ｉ制限酵素部位(太線)、およびそれに続く真核細胞中での翻訳開始のための有効シグナルに似た２１ヌクレオチドが続く(Ｋozak，Ｍ.，Ｊ．Ｍol ．Biol.，１９６：９４７−９５０，(１９８７))。（翻訳開始コドンＡＴＧには下線を引く）。３′プライマーは配列：を有し、制限エンドヌクレアーゼＡsp７１８開裂部位（太線）およびＤＮＡリガーゼIII遺伝子のＣ末端配列に相補的な２１ヌクレオチドを有する。増幅した配列を商業的に入手できるキット（「Ｇeneclean」ＢＩＯ１０１Ｉnc.，Ｌa Ｊ olla，Ｃa）を用いて１％アガロースゲルから単離した。その断片を制限エンドヌクレアーゼＳma ＩおよびＡsp７１８で次に消化し、次に１％アガロースゲルで再度精製した。この断片をＦ２と名付ける。ベクターpＲＧ１（pＶＬ９４１ベクターの改変物、以下で論ずる）を、バキュロウイルス発現システム（総説については、Ｓummers，Ｍ.Ｄ.およびＳmith，Ｇ．Ｅ．１９８７，Ａ manual of methods for baculovirus rectors and insect cell culture procedures，Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimenta l Ｓtation Ｂulletin Ｎo １５５５を参照）を用いるＤＮＡリガーゼIIIタンパク質発現に用いる。この発現ベクターはＡutographa california nuclear polyhedrosis virus（ＡcＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、およびその後に制限エンドヌクレアーゼＳma ＩおよびＡsp７１８の認識部位を含む。サルウイル（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を有効なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスの選択を容易にするためにE.coliからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同じ方向に挿入し、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。そのポリヘドリン配列の両側にコトランスフェクトされる野性型ウイルスＤＮＡの細胞媒介ホモロガス組換えのためのウイルス配列を隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターをpＡc３７３、 pＶＬ９４１およびpＡcＩＭ１等pＲＧ１の代りに用い得るであろう(Ｌuckow，Ｖ .Ａ.およびＳummers，Ｍ.Ｄ.，Ｖirology，１７０：３１−３９)。そのプラスミドを制限酵素Ｓma ＩおよびＡsp７１８で消化し、ウシの腸ホスファターゼを用いて公知の方法により脱ホスホリル化する。そのＤＮＡを商業的に入手できるキット（「Ｇene clean」ＢＩＯ１０１Ｉnc.，Ｌa Ｊolla，Ｃ a）を用いて１％アガロースゲルから次に単離できる。このベクターをＶ２と呼ぶ。断片Ｆ２および脱ホスホリル化プラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞を次にトランスフォームし、酵素Ｓma ＩおよびＡsp７１８を用いてＤＮＡリガーゼIII遺伝子を有するプラスミド（pＢac ＤＮＡリガーゼIII）を含む細菌を同定する。クローン化した断片の配列をＤＮＡ配列決定により確認する。プラスミドpＢacＤＮＡリガーゼIII５μgを、商業的に入手できる線形化バクロウイルス１.０μg（「Ｂaculo Ｇold、バキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐharming en，Ｓan Ｄiego ＣＡ）でリポフェクション法（Ｆelgner等、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７）を用いてコトランスフェクトした。１μgのＢaculo ＧoldウイルスＤＮＡおよび５μgのプラスミドpＢac ＤＮＡリガーゼIIIを、５０μlの血清を含まないＧrace培地（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc，Ｇaithersburg、ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウエル中で混合する。その後１０μlのリポフェクチンおよび９０μlのＧrace培地を加え、混合し、室温で１５分インキュベートする。次にトランスフェクション混合物を、血清を含まない１mlのＧrace培地を有する３５mmの組織培養プレートに接種したＳf９昆虫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）に滴下する。そのプレートを前後にゆすり、新しく加えた溶液を混合する。そのプレートを次に２７℃で５時間インキュベートする。５時間後トランスフェクション溶液をプレートから除き、１０％ウシ胎児血清を補ったＧraceの昆虫培地１mlを加える。そのプレートをインキュベートに戻し、培養を２７℃で４日間続ける。４日後、上清を集め、プラーク検定をＳummersおよびＳmith（上記）に記載と同様に行う。一変形として「Ｂlue Ｇal」（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.，Ｇ aithersburg）を用い、青色に染色されたプラークの単離を行う。(「プラーク検定」の詳細な記述は、Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.，Ｇaithersburg，９−１０頁により配布された昆虫細胞培養およびbaculovirologyのためのユーザスガイドにも見出すことができる)。ウイルスの連続希釈の４日後、細胞に加え、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで選ぶ。組換えウイルスを有する寒アガーを次に２００nlのＧrace培地を含むエッペンドルフ管に再懸濁する。アガーを短時間の遠心分離により取り除き、組換えバキュロウイルスを含む上清を用いて、３５mmデイッシュに接種したＳf９細胞に感染させる。４日後、これらの培養皿の上清を集めて４℃で貯蔵する。Ｓf９細胞を１０％の熱不活性化ＦＢＳを補ったＧrace培地中で培養する。その細胞を組換えバキュロウイルスＶ−ＤＮＡリガーゼIIに感染多重度（ＭＯＩ）２で感染させる。６時間後、培地を取り除き、メチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００II培地で置換する（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.,Ｇaithersburg ）。４２時間後、５μＣiの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣiの³⁵Ｓ−システイン（Ａmersham）を加える。更にその細胞を１６時間インキュベートした後、遠心分離により収穫し、標識化されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化する。実施例３ＣＯＳ細胞における組換えＤＮＡリガーゼの発現プラスミドＤＮＡリガーゼIII ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０複製起源２）アンピシリン耐性遺伝子３）Ｅ．coli複製起源４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を含むベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp（Ｉnvitrogen）に由来する。完全なＤＮＡリガーゼI II前駆体およびその３'末端に枠内で融合されたＨＡtagをコードするＤＮＡ断片をベクターのポリリンカー領域にクローンし、それ故組換えタンパク質発現をＣＭＶプロモーター下に置く。ＨＡtagは上記のようにインフルエンザヘマググルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson，Ｈ.Ｎiman,Ｒ. Ｈeighten,Ａ.Ｃherenson,Ｍ.ＣonnollyおよびＲ.Ｌerner,Ｃell 37:767(1984)) 。ＨＡtagの標的タンパク質への融合により、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いた組換えタンパク質の検出が容易になる。プラスミド構築戦略を次の如く記述できる：ＤＮＡリガーゼIIIをコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ#７５８８０を、２つのプライマーを用いてクローン化された元のＥＳＴ上でのＰＣＲにより構築する。５ 'プライマー：は、ＥcoＲＩ部位（下線）およびそれに続く開始コドンから出発するＤＮＡリガーゼIIIコード配列の２１のヌクレオチドを含む。３'配列：は、ＸhoＩ部位（下線）に相捕的な配列、翻訳停止コドン、ＨＡtagおよびＤＮＡリガーゼIIIコード配列（停止コドンを含まず）の最後の２１ヌクレオチドを含む。それ故、そのＰＣＲ産物はＥcoＲＩ部位、ＤＮＡリガーゼIIIコード配列、それに続く枠内に融合したＨＡtag、ＨＡtagに隣接した翻訳終了停止コドンおよびＸhoＩ部位を含む。そのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片およびベクターpcＤＮＡＩ／ＡmpをＥcoＲＩおよびＸhoＩ制限酵素で消化し、ライゲートする。ライゲーション混合物をＥ．coli株ＳＵＲＥ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems,11099 Ｎorth Ｔerrey Ｐines Ｒoad,Ｌa Ｊolla ＣＡ92037から入手可能）にトランスホームし、トランスホームした培養物をアンピシリン培地のプレートにプレートし耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡをトランスホーマントから単離し、制限分析により正しい断片の存在について調べる。組換えＤＮＡリガーゼIIIの発現のためにＣＯＳ細胞をその発現ベクターでＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法によりトランスフェクトする（Ｊ.Ｓambrook,Ｅ.Ｆritsch,Ｔ.Ｍaniatis,Ｍolecular Ｃl oning：ＡＬaboratory Ｍanual,Ｃold Ｓpring Ｌaboratry Ｐress(1989)）。ＤＮＡリガーゼIIIＨＡタンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法により検出する（E.Harlow,D.Lane,Antibodies:A Laboratory Mannual,Cold Spring Ha rbor Laboratory Press,(1988)）。細胞をトランスフェクション２日後に³⁵Ｓ− システインで８時間標識する。媒地を集め、細胞を洗剤で溶菌する（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０mＭＮａＣl、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭＴris,pＨ７.５）（Ｗilson,Ｉ等、上書37：767(1984)）。細胞溶菌物および媒地の両方をＨＡ特異的なモノクローナル抗体を用いて沈殿させる。沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析する。実施例４ヒト組織におけるＤＮＡリガーゼIIIの発現パターンノーザンブロット分析を行いヒト組織におけるＤＮＡリガーゼIIIの発現レベルを調べ得る。全細胞ＲＮＡ試料をＲＮＡzol Ｂシステムを用いて単離する（Ｂ iotecx Ｌaboratories,Ｉnc.6023 Ｓouth Ｌoop Ｅast,Ｈouston,ＴＸ77033）。特定した各ヒト組織から単離した全ＲＮＡ約１５μｇを１％アガロースゲルで分離し、ナイロンフィルターにブロットする（Ｓambrook,ＦrischおよびＭaniatis ,Ｍolecular Ｃloning,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress(1989)）。標識化反応を、５０μｇのＤＮＡ断片を用いてＳtratagene Ｐrime−Ｉtキットに従って行う。その標識したＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラムを用いて精製する（５プライム−３プライム，Ｉnc.5603 Ａrapahoe Ｒoad,Ｂoulder,ＣＯ80303）。個々のＲＮＡブロットを含むフィルターを放射活性の標識した完全長ＤＮＡリガーゼIII 遺伝子と、1,000,000 cpm／mlで、０.５ＭＮaＰＯ₄、pＨ７.４および７％ＳＤＳ中で一晩６５℃でハイブリダイズする。０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで室温で２回および６０℃で２回洗浄後、そのフィルターを−７０℃で一晩インテンシファイングスクリーンにさらす。ＤＮＡリガーゼIIIのメッセージＲＮＡは胸腺、精巣および心臓に豊富である(第３図参照)。本発明の多くの改変および変形が上の教示に照らして可能である。それ故請求の範囲内で本発明を特に記載した方法以外の方法で実施し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/99 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 9/88 33/53 Ｄ 9/99 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ 33/53 ＡＣＣ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログ若しくは誘導体、（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８８０号に含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは誘導体、よりなる群から選択される単離したポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．ポリヌクレオチドが図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号第７５８８０号のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．図１に示すポリペプチドのコード配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ＡＴＣＣ寄託番号第７５８８０号に寄託したポリペプチドのコード配列を有する請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のＤＮＡを有するベクター。１０．請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。１１．該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項１０に記載の宿主細胞から発現させることを含むポリペプチドの製造方法。１２．請求項９に記載のベクターで細胞を遺伝的に操作することを含有するポリペプチドを発現できる細胞の製造方法。１３．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズでき、ＤＮＡリガーゼIII活性を有するポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。１４．（ｉ）図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドおよびそのフラグメント、アナログおよび断片、および（ii）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８８０号のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドおよび該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体、よりなる群から選択されるポリペプチド。１５．該ポリペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有する請求項１４に記載のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。１８．ＤＮＡリガーゼIII活性の必要を有する患者の処置方法であって、該方法は、その患者に該ポリペプチドをコードするＤＮＡを与え、インビボで該ポリペプチドを発現させることにより、治療的に有効量の請求項１４に記載のポリペプチドを該患者に投与することを含んでなる方法。１９．ＤＮＡリガーゼIIIを阻害する必要を有する患者を処置する方法であって、該方法は治療的に有効量の請求項１７に記載のアンタゴニストを該患者に投与する方法。２０．アンタゴニストをコードするＤＮＡを患者に与え、インビボでアンタゴニストを発現させることにより、アンタゴニストを投与する請求項１９に記載の方法。２１．アンタゴニストおよびアゴニスト同定方法であって、その方法は、ＤＮＡリガーゼIII、一本鎖破断点を有するＤＮＡ、スクリーニングすべき化合物を、一本鎖破断点が該ＤＮＡリガーゼIIIにより修復されるような条件下に混合し；そして該化合物がその修復を促進するかまたは阻害するか測定することを含んでなる方法。２２．患者の異常な細胞増殖または異常な細胞増殖になりやすさを診断する方法であって、その方法は患者由来の試料における、請求項１に記載の核酸配列中の変異を検出することを含んでなる方法。