JPH0870860A - 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法 - Google Patents
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法Info
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- JPH0870860A JPH0870860A JP6196778A JP19677894A JPH0870860A JP H0870860 A JPH0870860 A JP H0870860A JP 6196778 A JP6196778 A JP 6196778A JP 19677894 A JP19677894 A JP 19677894A JP H0870860 A JPH0870860 A JP H0870860A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 アスパラギン酸によって実質的に阻害されな
いホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを提供す
る。 【構成】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のＮ−末端から６２５番目のグルタミン酸をリジンに置
換させる変異を有するホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子を保持する大腸菌を培養し、アスパラ
ギン酸によって実質的に阻害されないホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼを得、これを保持する微生物
をアミノ酸生産に用いる。
いホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを提供す
る。 【構成】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のＮ−末端から６２５番目のグルタミン酸をリジンに置
換させる変異を有するホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子を保持する大腸菌を培養し、アスパラ
ギン酸によって実質的に阻害されないホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼを得、これを保持する微生物
をアミノ酸生産に用いる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、変異型ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ、それをコードする遺伝子
及びアミノ酸の製造法に関し、詳しくは、アスパラギン
酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する遺
伝子とその利用に関する。
ピルビン酸カルボキシラーゼ、それをコードする遺伝子
及びアミノ酸の製造法に関し、詳しくは、アスパラギン
酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する遺
伝子とその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼは、大部分の細菌や全ての植物に見いだされる酵素
である。本酵素の役割は、アスパラギン酸やグルタミン
酸の生合成および、クエン酸サイクルに回転維持のため
にＣ４ジカルボン酸を供給することにある。しかし、微
生物を用いたアミノ酸の発酵生産において本酵素が及ぼ
す影響を示した報告は少なく、その重要性は明らかでは
ない（Atushi, Yokota and Isamu, Shiio, Agric. Bio
l. Chem., 52, 455-463 (1988)、Josef, Cremer et a
l., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (199
1)、Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Le
tters, 112, 269-274 (1993)）。
ーゼは、大部分の細菌や全ての植物に見いだされる酵素
である。本酵素の役割は、アスパラギン酸やグルタミン
酸の生合成および、クエン酸サイクルに回転維持のため
にＣ４ジカルボン酸を供給することにある。しかし、微
生物を用いたアミノ酸の発酵生産において本酵素が及ぼ
す影響を示した報告は少なく、その重要性は明らかでは
ない（Atushi, Yokota and Isamu, Shiio, Agric. Bio
l. Chem., 52, 455-463 (1988)、Josef, Cremer et a
l., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (199
1)、Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Le
tters, 112, 269-274 (1993)）。
【０００３】ところで、アミノ酸はタンパクの成分とし
て細胞に普遍的に存在する化合物であるが、経済的なエ
ネルギー代謝及び物質代謝のために、その生産は厳密に
制御されている。この制御は、主としてフィードバック
制御、すなわち代謝経路の下流における産物が上流の反
応を触媒する酵素の活性を阻害することによる制御であ
り、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼも、活
性発現に様々な調節を受けている。
て細胞に普遍的に存在する化合物であるが、経済的なエ
ネルギー代謝及び物質代謝のために、その生産は厳密に
制御されている。この制御は、主としてフィードバック
制御、すなわち代謝経路の下流における産物が上流の反
応を触媒する酵素の活性を阻害することによる制御であ
り、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼも、活
性発現に様々な調節を受けている。
【０００４】例えば、エシェリヒア（Escherichia）
属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌の
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼでは、アス
パラギン酸によって活性が阻害される。
属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌の
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼでは、アス
パラギン酸によって活性が阻害される。
【０００５】従来、アミノ酸醗酵においては効率的な生
産のために種々の技術が開発され、フィードバック制御
に非感受性になった変異株を使用したロイシン、イソロ
イシン、トリプトファン、フェニルアラニン等の醗酵生
産が行われている。しかしながら、アスパラギン酸によ
る阻害に非感受性になったホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ変異酵素や、これをアスパラギン酸族や
グルタミン酸族のアミノ酸の醗酵生産に利用するという
試みは知られていない。
産のために種々の技術が開発され、フィードバック制御
に非感受性になった変異株を使用したロイシン、イソロ
イシン、トリプトファン、フェニルアラニン等の醗酵生
産が行われている。しかしながら、アスパラギン酸によ
る阻害に非感受性になったホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ変異酵素や、これをアスパラギン酸族や
グルタミン酸族のアミノ酸の醗酵生産に利用するという
試みは知られていない。
【０００６】一方、大腸菌（エシェリヒア・コリ：Escherichia
coli）のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードする遺伝子である ppc 遺伝子はすでにクローニ
ングされ、塩基配列も決定されている（Fujita,N.,Miw
a,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki H. J.Biochem.
95,909-916(1984)）が、同酵素においてもアスパラギン
酸による阻害が解除された変異体の報告はない。
coli）のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードする遺伝子である ppc 遺伝子はすでにクローニ
ングされ、塩基配列も決定されている（Fujita,N.,Miw
a,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki H. J.Biochem.
95,909-916(1984)）が、同酵素においてもアスパラギン
酸による阻害が解除された変異体の報告はない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、アスパラギン酸によるフィード
バック阻害が実質的に解除されたホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ及びその遺伝子及びその利用法を
提供することを課題とする。
らなされたものであり、アスパラギン酸によるフィード
バック阻害が実質的に解除されたホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ及びその遺伝子及びその利用法を
提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌のホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼの特定の部位のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、アスパ
ラギン酸による阻害が実質的に解除されることを見いだ
し、そのような変異酵素をコードする遺伝子を取得する
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。
解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌のホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼの特定の部位のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、アスパ
ラギン酸による阻害が実質的に解除されることを見いだ
し、そのような変異酵素をコードする遺伝子を取得する
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】すなわち本願発明は、エシェリヒア属に属
する微生物由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック阻害を解
除する変異を有することを特徴とする変異型ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びこの変異型ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤ
ＮＡ配列である。
する微生物由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック阻害を解
除する変異を有することを特徴とする変異型ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びこの変異型ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤ
ＮＡ配列である。
【００１０】本発明はさらに、このＤＮＡ断片を保持す
るエシェリヒア属又はコリネホルム細菌に属する微生
物、及びこれらの微生物を好適な培地で培養し、この培
地からＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン
及びＬ−プロリンから選ばれるアミノ酸を分離すること
を特徴とするアミノ酸の製造方法を提供する。
るエシェリヒア属又はコリネホルム細菌に属する微生
物、及びこれらの微生物を好適な培地で培養し、この培
地からＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン
及びＬ−プロリンから選ばれるアミノ酸を分離すること
を特徴とするアミノ酸の製造方法を提供する。
【００１１】尚、本明細書において、変異型ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配
列あるいはこれにプロモーターを含むＤＮＡ配列を、単
に「本発明のＤＮＡ配列」、「変異遺伝子」あるいはホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子という
ことがある。
ールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配
列あるいはこれにプロモーターを含むＤＮＡ配列を、単
に「本発明のＤＮＡ配列」、「変異遺伝子」あるいはホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子という
ことがある。
【００１２】以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】＜１＞変異型ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ 本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（以下、単に「変異型酵素」ともいう）は、エシェ
リヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック
阻害を解除する変異を有するものである。
ルボキシラーゼ 本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（以下、単に「変異型酵素」ともいう）は、エシェ
リヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック
阻害を解除する変異を有するものである。
【００１４】このような変異としては、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性を失わないま
ま、上記フィードバック阻害を実質的に解除するもので
あればどのようなものでもよいが、例えば、その変異を
有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼをエシェリヒア属に属する微生物の細胞内に存在させ
たときに、下記性質を有する化合物に対する耐性を細胞
に付与する変異が挙げられる；野生型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼを産生するエシェリヒア属に
属する微生物に対して生育阻害作用を示し、前記生育阻
害作用はＬ−グルタミン酸またはＬ−アスパラギン酸の
存在によって回復され、かつ、野生型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
ピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性を失わないま
ま、上記フィードバック阻害を実質的に解除するもので
あればどのようなものでもよいが、例えば、その変異を
有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼをエシェリヒア属に属する微生物の細胞内に存在させ
たときに、下記性質を有する化合物に対する耐性を細胞
に付与する変異が挙げられる；野生型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼを産生するエシェリヒア属に
属する微生物に対して生育阻害作用を示し、前記生育阻
害作用はＬ−グルタミン酸またはＬ−アスパラギン酸の
存在によって回復され、かつ、野生型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
【００１５】さらに具体的には、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から ６２５番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変
異、 ２２２番目のアルギニンをヒスチジンに、２２３番目
のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、 ２８８番目のセリンをフェニルアラニンに、２８９番
目のグルタミン酸をリジンに、５５１番目のメチオニン
をイソロイシンに、８０４番目のグルタミン酸をリジン
に各々置換させる変異、 ８６７番目のアラニンをスレオニンに置換させる変
異、が挙げられる。
ン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から ６２５番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変
異、 ２２２番目のアルギニンをヒスチジンに、２２３番目
のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、 ２８８番目のセリンをフェニルアラニンに、２８９番
目のグルタミン酸をリジンに、５５１番目のメチオニン
をイソロイシンに、８０４番目のグルタミン酸をリジン
に各々置換させる変異、 ８６７番目のアラニンをスレオニンに置換させる変
異、が挙げられる。
【００１６】尚、エシェリヒア属に属する微生物のホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとして、大腸菌
のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子か
ら推定されるアミノ酸配列（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishiji
ma,S.,Izui,K. and KatsukiH. J.Biochem.95,909-916(1
984)）を、配列表配列番号１に示す。
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとして、大腸菌
のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子か
ら推定されるアミノ酸配列（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishiji
ma,S.,Izui,K. and KatsukiH. J.Biochem.95,909-916(1
984)）を、配列表配列番号１に示す。
【００１７】上記変異型酵素は、下記の本発明のＤＮＡ
配列によってコードされ、このＤＮＡ配列を大腸菌等で
発現させることにより生産される。
配列によってコードされ、このＤＮＡ配列を大腸菌等で
発現させることにより生産される。
【００１８】＜２＞本発明のＤＮＡ配列及びそれを保持
する微生物 一方、本発明のＤＮＡ配列は、上記変異型酵素をコード
するＤＮＡ配列であり、エシェリヒア属に属する微生物
のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコード
するＤＮＡ断片において、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック
阻害を解除する変異をコーディング領域内に有する。
する微生物 一方、本発明のＤＮＡ配列は、上記変異型酵素をコード
するＤＮＡ配列であり、エシェリヒア属に属する微生物
のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコード
するＤＮＡ断片において、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック
阻害を解除する変異をコーディング領域内に有する。
【００１９】具体的には、上記〜の変異を有するホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする
ＤＮＡ配列、例えば、配列表配列番号１の塩基配列にお
いて、 ｉ） 塩基番号２１１１〜２１１３のＧＡＡが、ＡＡＡ
またはＡＡＧに変換する変異、 ii） 塩基番号９０２〜９０４のＣＧＣがＣＡＴまたは
ＣＡＣに、及び９０５〜９０７のＧＡＡがＡＡＡまたは
ＡＡＧに各々変換する変異、 iii）塩基番号１１００〜１１０２のＴＣＴがＴＴＴま
たはＴＴＣに、１１０３〜１１０５のＧＡＡがＡＡＡま
たはＡＡＧに、１８８９〜１８９１のＡＴＧがＡＴＴ、
ＡＴＣまたはＡＴＡに、及び２６４８〜２６５０のＧＡ
ＡがＡＡＡまたはＡＡＧに各々変換する変異 iv） ２８３７〜２８３９のＧＣＧがＡＣＴ、ＡＣＣ、
ＡＣＡ、ＡＣＧのいずれかに変換する変異 のいずれかを有するＤＮＡ配列が挙げられる。
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする
ＤＮＡ配列、例えば、配列表配列番号１の塩基配列にお
いて、 ｉ） 塩基番号２１１１〜２１１３のＧＡＡが、ＡＡＡ
またはＡＡＧに変換する変異、 ii） 塩基番号９０２〜９０４のＣＧＣがＣＡＴまたは
ＣＡＣに、及び９０５〜９０７のＧＡＡがＡＡＡまたは
ＡＡＧに各々変換する変異、 iii）塩基番号１１００〜１１０２のＴＣＴがＴＴＴま
たはＴＴＣに、１１０３〜１１０５のＧＡＡがＡＡＡま
たはＡＡＧに、１８８９〜１８９１のＡＴＧがＡＴＴ、
ＡＴＣまたはＡＴＡに、及び２６４８〜２６５０のＧＡ
ＡがＡＡＡまたはＡＡＧに各々変換する変異 iv） ２８３７〜２８３９のＧＣＧがＡＣＴ、ＡＣＣ、
ＡＣＡ、ＡＣＧのいずれかに変換する変異 のいずれかを有するＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２０】このような変異型遺伝子は、野生型酵素遺
伝子あるいは他の変異を有するホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子と宿主に適合するベクターＤ
ＮＡとを連結して得られる組換えＤＮＡを変異処理し、
この組換えＤＮＡによる形質転換体からスクリーニング
することにより得られる。あるいは、野生型酵素を生産
する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株
を創成した後、該変異株から変異型遺伝子をスクリーニ
ングしてもよい。組換えＤＮＡの変異処理には、ヒドロ
キシルアミン等が使用される。また、微生物自体を変異
処理する場合は、通常人工突然変異に用いられている薬
剤あるは方法を用いればよい。
伝子あるいは他の変異を有するホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子と宿主に適合するベクターＤ
ＮＡとを連結して得られる組換えＤＮＡを変異処理し、
この組換えＤＮＡによる形質転換体からスクリーニング
することにより得られる。あるいは、野生型酵素を生産
する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株
を創成した後、該変異株から変異型遺伝子をスクリーニ
ングしてもよい。組換えＤＮＡの変異処理には、ヒドロ
キシルアミン等が使用される。また、微生物自体を変異
処理する場合は、通常人工突然変異に用いられている薬
剤あるは方法を用いればよい。
【００２１】上記野生型酵素遺伝子あるいは他の変異を
有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝
子は、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子であれ
ば、いかなるものでもよく、塩基配列が決定されており
クローン化されていることが好ましい。クローン化され
ていない場合には、ＰＣＲ法等を用いて該遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を増幅単離した後、適当なベクターを用いて
クローン化することができる。
有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝
子は、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子であれ
ば、いかなるものでもよく、塩基配列が決定されており
クローン化されていることが好ましい。クローン化され
ていない場合には、ＰＣＲ法等を用いて該遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を増幅単離した後、適当なベクターを用いて
クローン化することができる。
【００２２】上記のような遺伝子として、例えば、すで
にクローニングされ塩基配列も決定されている、大腸菌
の遺伝子（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. an
d Katsuki, H. J.Biochem.95,909-916(1984)）が挙げら
れる。この遺伝子のコーディング領域の配列は、配列表
の配列番号１に示したとおりである（塩基番号２３９〜
２８９０）。
にクローニングされ塩基配列も決定されている、大腸菌
の遺伝子（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. an
d Katsuki, H. J.Biochem.95,909-916(1984)）が挙げら
れる。この遺伝子のコーディング領域の配列は、配列表
の配列番号１に示したとおりである（塩基番号２３９〜
２８９０）。
【００２３】変異遺伝子を有する宿主のスクリーニング
は、アスパラギン酸のアナログ化合物を用いて行うこと
ができる。アナログ化合物としては、次の性質を有して
いることが好ましい。すなわち、野生型ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼを生産するエシェリヒア属
に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、前記生育
阻害作用はＬ−グルタミン酸又はＬ−アスパラギン酸の
存在によって回復され、かつ、野生型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
は、アスパラギン酸のアナログ化合物を用いて行うこと
ができる。アナログ化合物としては、次の性質を有して
いることが好ましい。すなわち、野生型ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼを生産するエシェリヒア属
に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、前記生育
阻害作用はＬ−グルタミン酸又はＬ−アスパラギン酸の
存在によって回復され、かつ、野生型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
【００２４】上記のようなアナログ化合物を、野生型酵
素を生産するエシェリヒア属に属する微生物、例えばエ
シェリヒア・コリＨＢ１０１の生育の阻害を指標として
選択し、そのアナログ化合物に耐性な変異株をスクリー
ニングすれば、アスパラギン酸によるフィードバック阻
害が解除されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼを生産する宿主が得られる可能性が高い。
素を生産するエシェリヒア属に属する微生物、例えばエ
シェリヒア・コリＨＢ１０１の生育の阻害を指標として
選択し、そのアナログ化合物に耐性な変異株をスクリー
ニングすれば、アスパラギン酸によるフィードバック阻
害が解除されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼを生産する宿主が得られる可能性が高い。
【００２５】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼの阻害剤の一般的な構造として、Ｃ４ジカルボン酸構
造をとることが必須であると提唱されている。このよう
な観点から、本発明者は種々の化合物をスクリーニング
した。エシェリヒア・コリＨＢ１０１をＬＢ培地で前培
養し、DL-2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、ブロモコハク酸メ
ソ-2,3-ジブロモコハク酸、2,2-ジフルオロコハク酸、3
-ブロモピルビン酸、α-ケト酪酸、α-ケトアジピン
酸、DL-スレオ-β-ヒドロキシアスパラギン酸、L-アス
パラギン酸-β-メチルエステル、α-メチル-DL-アスパ
ラギン酸、2,3-ジアミノコハク酸又はアスパラギン酸-
β-ヒドラジドを含むＭ９培地（チアミン ２０μｇ／ｍ
ｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ各３μｇ／ｍｌ含む）で本培養し、
経時的に６６０ｎｍで吸光度を測定することにより、生
育を調べた。
ゼの阻害剤の一般的な構造として、Ｃ４ジカルボン酸構
造をとることが必須であると提唱されている。このよう
な観点から、本発明者は種々の化合物をスクリーニング
した。エシェリヒア・コリＨＢ１０１をＬＢ培地で前培
養し、DL-2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、ブロモコハク酸メ
ソ-2,3-ジブロモコハク酸、2,2-ジフルオロコハク酸、3
-ブロモピルビン酸、α-ケト酪酸、α-ケトアジピン
酸、DL-スレオ-β-ヒドロキシアスパラギン酸、L-アス
パラギン酸-β-メチルエステル、α-メチル-DL-アスパ
ラギン酸、2,3-ジアミノコハク酸又はアスパラギン酸-
β-ヒドラジドを含むＭ９培地（チアミン ２０μｇ／ｍ
ｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ各３μｇ／ｍｌ含む）で本培養し、
経時的に６６０ｎｍで吸光度を測定することにより、生
育を調べた。
【００２６】さらに、それらの化合物が生育阻止濃度で
存在するときに、核酸（ウリジン、アデノシン各１０ｍ
ｇ／ｄｌ）、グルタミン酸、あるいはアスパラギン酸族
のアミノ酸（Asp 0.025%、Met、Thr、Lys各0.1％)の添
加により阻害が回復するか否かを調べた。
存在するときに、核酸（ウリジン、アデノシン各１０ｍ
ｇ／ｄｌ）、グルタミン酸、あるいはアスパラギン酸族
のアミノ酸（Asp 0.025%、Met、Thr、Lys各0.1％)の添
加により阻害が回復するか否かを調べた。
【００２７】その結果、３種の化合物、３−ブロモピル
ビン酸（３ＢＰ）（化１）、アスパラギン酸−β−ヒド
ラジド（ＡＨＹ）（化２）、ＤＬ−スレオ−β−ヒドロ
キシアスパラギン酸（βＨＡ）（化３）を選択した。
ビン酸（３ＢＰ）（化１）、アスパラギン酸−β−ヒド
ラジド（ＡＨＹ）（化２）、ＤＬ−スレオ−β−ヒドロ
キシアスパラギン酸（βＨＡ）（化３）を選択した。
【００２８】
【化１】
【００２９】
【化２】
【００３０】
【化３】
【００３１】これらのアナログ化合物による大腸菌の生
育阻害を図１〜３に示す。さらに、上記阻害回復物質を
単独で、あるいは２種類もしくは３種類の混合物として
加えたときの、大腸菌の生育回復を図４〜６に示す。ま
た、対照として、阻害物質非存在下で阻害回復物質を添
加したときの生育を図７に示す。尚、図４〜７中、添加
物１、２、３は、各々核酸、グルタミン酸、あるいはア
スパラギン酸族のアミノ酸を示す。
育阻害を図１〜３に示す。さらに、上記阻害回復物質を
単独で、あるいは２種類もしくは３種類の混合物として
加えたときの、大腸菌の生育回復を図４〜６に示す。ま
た、対照として、阻害物質非存在下で阻害回復物質を添
加したときの生育を図７に示す。尚、図４〜７中、添加
物１、２、３は、各々核酸、グルタミン酸、あるいはア
スパラギン酸族のアミノ酸を示す。
【００３２】さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼに対するアナログ化合物による活性阻害を調
べた。Yoshinaga, T., Izui, K. and Katsuki, H., J.
Biochem., 68, 747-750 (1970)に記載の方法に準じて、
酵素活性を測定した。
キシラーゼに対するアナログ化合物による活性阻害を調
べた。Yoshinaga, T., Izui, K. and Katsuki, H., J.
Biochem., 68, 747-750 (1970)に記載の方法に準じて、
酵素活性を測定した。
【００３３】ＬＢ培地で培養したエシェリヒア・コリＨ
Ｂ１０１を破砕し、懸濁液を遠心分離して上清を粗酵素
液とした。酵素活性の測定は、２ｍＭホスホエノールピ
ルビン酸カリウム、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１Ｍ ト
リス−酢酸（ｐＨ８．５）、１．５Ｕマレートデヒドロ
ゲナーゼ、及び粗酵素を含む測定系中に、活性に影響す
る事が知られているアセチルコエンザイムＡを０．１ｍ
Ｍの濃度で存在させて、３４０ｎｍの吸光度の減少を測
定することにより行った。結果を図８に示す。
Ｂ１０１を破砕し、懸濁液を遠心分離して上清を粗酵素
液とした。酵素活性の測定は、２ｍＭホスホエノールピ
ルビン酸カリウム、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１Ｍ ト
リス−酢酸（ｐＨ８．５）、１．５Ｕマレートデヒドロ
ゲナーゼ、及び粗酵素を含む測定系中に、活性に影響す
る事が知られているアセチルコエンザイムＡを０．１ｍ
Ｍの濃度で存在させて、３４０ｎｍの吸光度の減少を測
定することにより行った。結果を図８に示す。
【００３４】以上の結果から、上記の３種のアナログ化
合物は、大腸菌の生育を阻害し、核酸単独ではこの阻害
を回復できないが、グルタミン酸あるいはアスパラギン
酸族アミノ酸の添加により阻害を回復できることが明ら
かである。したがって、これらのアナログ化合物はホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの選択的な阻害
剤であると推定された。本発明において、後記実施例に
示したように、これら３種の化合物を用いて変異型ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する大腸
菌を選択することに成功している。
合物は、大腸菌の生育を阻害し、核酸単独ではこの阻害
を回復できないが、グルタミン酸あるいはアスパラギン
酸族アミノ酸の添加により阻害を回復できることが明ら
かである。したがって、これらのアナログ化合物はホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの選択的な阻害
剤であると推定された。本発明において、後記実施例に
示したように、これら３種の化合物を用いて変異型ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する大腸
菌を選択することに成功している。
【００３５】上記化合物を用いて目的とする変異型酵素
遺伝子を有する形質転換体をスクリーニングし、組換え
ＤＮＡを回収すれば、その変異型酵素遺伝子が得られ
る。また、微生物自体を変異処理した場合には、上記化
合物を用いて目的とする変異型酵素遺伝子を有する変異
株をスクリーニングし、該株より目的とする変異型酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、適当なベクターに連
結すれば、その変異型酵素遺伝子が得られる。
遺伝子を有する形質転換体をスクリーニングし、組換え
ＤＮＡを回収すれば、その変異型酵素遺伝子が得られ
る。また、微生物自体を変異処理した場合には、上記化
合物を用いて目的とする変異型酵素遺伝子を有する変異
株をスクリーニングし、該株より目的とする変異型酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、適当なベクターに連
結すれば、その変異型酵素遺伝子が得られる。
【００３６】このようにして変異が導入されたホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ
断片を、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させるこ
とによって、変異型酵素を生産させることができる。ま
た、本発明のＤＮＡ断片を、宿主染色体ＤＮＡ内に組み
込むことにより形質転換しても、目的の変異型酵素を産
生できる。
ノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ
断片を、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させるこ
とによって、変異型酵素を生産させることができる。ま
た、本発明のＤＮＡ断片を、宿主染色体ＤＮＡ内に組み
込むことにより形質転換しても、目的の変異型酵素を産
生できる。
【００３７】宿主としては、エシェリヒア属に属する微
生物、例えば、大腸菌、コリネホルム細菌等が挙げられ
る。コリネホルム細菌は、コリネバクテリウム属細菌、
従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリ
ネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリ
ウム属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌と非常に近
縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。尚、アミノ酸製
造に好適な宿主については、後述する。
生物、例えば、大腸菌、コリネホルム細菌等が挙げられ
る。コリネホルム細菌は、コリネバクテリウム属細菌、
従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリ
ネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリ
ウム属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌と非常に近
縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。尚、アミノ酸製
造に好適な宿主については、後述する。
【００３８】一方、ベクターＤＮＡとしては、プラスミ
ドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能な
ものが好ましい。宿主が大腸菌の場合には、例えば pUC
19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙
げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用でき
る。
ドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能な
ものが好ましい。宿主が大腸菌の場合には、例えば pUC
19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙
げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用でき
る。
【００３９】また、宿主がコリネホルム細菌の場合に使
用できるベクター及びそれを保持する宿主を以下に例示
する。尚、かっこ内に国際寄託機関の寄託番号を示し
た。
用できるベクター及びそれを保持する宿主を以下に例示
する。尚、かっこ内に国際寄託機関の寄託番号を示し
た。
【００４０】 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ 11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ 11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ 11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ 11901(FERM BP-140)
【００４１】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００４２】本発明のＤＮＡ配列を上記ベクターに挿入
して得られる組換えベクターで大腸菌を形質転換するに
は、例えば細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透
過性を高める方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol.
Biol., 53, 159 (1977)）等、通常大腸菌の形質転換に
用いられる方法を用いることができる。
して得られる組換えベクターで大腸菌を形質転換するに
は、例えば細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透
過性を高める方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol.
Biol., 53, 159 (1977)）等、通常大腸菌の形質転換に
用いられる方法を用いることができる。
【００４３】また、コリネホルム細菌の形質転換法とし
ては、上記の細胞を塩化カルシウムで処理する方法、ま
たは細胞がＤＮＡを取込可能な特定の成長時期に取り込
む方法（Duncan, C. H. et al.によるバチルス・ズブチ
リスに関する報告）がある。さらに、プラチミドＤＮＡ
を容易に取り込むＤＮＡ受容体のプロトプラストまたは
スフェロプラストを成形することによって細菌細胞内に
取り込むことが可能である。これらは、バチルス・ズブ
チリス、アクチノマイセス及び酵母について知られてい
る（Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111,
(1979)、Bibbet al., Nature, 274, 398, (1978)、Hin
nen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 19
29 (1978)）。 その他、特開平２−２０７７９１号公報
にコリネホルム細菌の形質転換法が開示されている。
ては、上記の細胞を塩化カルシウムで処理する方法、ま
たは細胞がＤＮＡを取込可能な特定の成長時期に取り込
む方法（Duncan, C. H. et al.によるバチルス・ズブチ
リスに関する報告）がある。さらに、プラチミドＤＮＡ
を容易に取り込むＤＮＡ受容体のプロトプラストまたは
スフェロプラストを成形することによって細菌細胞内に
取り込むことが可能である。これらは、バチルス・ズブ
チリス、アクチノマイセス及び酵母について知られてい
る（Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111,
(1979)、Bibbet al., Nature, 274, 398, (1978)、Hin
nen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 19
29 (1978)）。 その他、特開平２−２０７７９１号公報
にコリネホルム細菌の形質転換法が開示されている。
【００４４】本発明のＤＮＡ配列を上記宿主内で発現さ
せるには、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で効率よ
く働くプロモーターを用いてもよく、本発明のＤＮＡ配
列がホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
のプロモーターを含んでいる場合は、これをそのまま用
いてもよい。また、コリネホルム細菌を宿主とする場合
は、公知のブレビバクテリウム属細菌由来のｔｒｐプロ
モーター（特開昭６２−２４４３８２号公報）等を使用
することもできる。
せるには、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で効率よ
く働くプロモーターを用いてもよく、本発明のＤＮＡ配
列がホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
のプロモーターを含んでいる場合は、これをそのまま用
いてもよい。また、コリネホルム細菌を宿主とする場合
は、公知のブレビバクテリウム属細菌由来のｔｒｐプロ
モーター（特開昭６２−２４４３８２号公報）等を使用
することもできる。
【００４５】また、上記のように、本発明のＤＮＡ配列
を自立複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主
に導入し、プラスミドとして宿主に保持させてもよい
が、本発明のＤＮＡ配列を、トランスポゾン（Berg,D.
E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕ
ファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換
え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring
Habor Lab.(1972)）を用いた方法で微生物の染色体に
組み込んでもよい。また、コリネホルム細菌の染色体に
本発明のＤＮＡを組み込むには、特開平５−７４９１号
公報に開示される温度感受性プラスミドが利用できる。
を自立複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主
に導入し、プラスミドとして宿主に保持させてもよい
が、本発明のＤＮＡ配列を、トランスポゾン（Berg,D.
E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕ
ファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換
え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring
Habor Lab.(1972)）を用いた方法で微生物の染色体に
組み込んでもよい。また、コリネホルム細菌の染色体に
本発明のＤＮＡを組み込むには、特開平５−７４９１号
公報に開示される温度感受性プラスミドが利用できる。
【００４６】上記のようにして本発明のＤＮＡ配列で形
質転換された微生物を培養し、このＤＮＡ配列を発現さ
せると、変異型酵素が得られる。このようにして得られ
た変異型酵素が、アスパラギン酸によるフィードバック
阻害が解除されているかどうかは、酵素反応系にアスパ
ラギン酸を添加して活性を測定することにより、明かと
なる。
質転換された微生物を培養し、このＤＮＡ配列を発現さ
せると、変異型酵素が得られる。このようにして得られ
た変異型酵素が、アスパラギン酸によるフィードバック
阻害が解除されているかどうかは、酵素反応系にアスパ
ラギン酸を添加して活性を測定することにより、明かと
なる。
【００４７】また、本発明のＤＮＡ配列は、アスパラギ
ン酸によるフィードバック阻害が解除された変異酵素を
コードしているので、このＤＮＡ配列を有する微生物
を、以下に示すように、アスパラギン酸族やグルタミン
酸族のアミノ酸の効率的な醗酵生産に利用することがで
きる。
ン酸によるフィードバック阻害が解除された変異酵素を
コードしているので、このＤＮＡ配列を有する微生物
を、以下に示すように、アスパラギン酸族やグルタミン
酸族のアミノ酸の効率的な醗酵生産に利用することがで
きる。
【００４８】後記実施例で得られた変異型酵素遺伝子を
保持するエシェリヒア・コリＡＪ１２９０７、ＡＪ １
２９０８、ＡＪ １２９０９、ＡＪ １２９１０は、平
成５年８月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に、各々順にＦＥＲＭ Ｐ−１３７７４、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３７７５、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７６、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３７７７として寄託されており、平成６年７
月１１日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国
際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4
735、FERM BP-4736、FERM BP-4737として寄託されてい
る。
保持するエシェリヒア・コリＡＪ１２９０７、ＡＪ １
２９０８、ＡＪ １２９０９、ＡＪ １２９１０は、平
成５年８月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に、各々順にＦＥＲＭ Ｐ−１３７７４、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３７７５、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７６、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３７７７として寄託されており、平成６年７
月１１日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国
際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4
735、FERM BP-4736、FERM BP-4737として寄託されてい
る。
【００４９】＜３＞アミノ酸の製造方法 本発明のＤＮＡ配列を保持する微生物を好適な培地で培
養し、生じたアミノ酸を分離することにより、アミノ酸
を製造することができる。このようなアミノ酸として、
Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−
プロリンが挙げられる。
養し、生じたアミノ酸を分離することにより、アミノ酸
を製造することができる。このようなアミノ酸として、
Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−
プロリンが挙げられる。
【００５０】以下に、本発明のＤＮＡ配列を導入し各ア
ミノ酸の製造に使用するのに好適な宿主及び培養法を例
示する。
ミノ酸の製造に使用するのに好適な宿主及び培養法を例
示する。
【００５１】（１）本発明のアミノ酸の製造方法に好適
な宿主 (i)Ｌ−リジン製造に好適な宿主 本発明によるＬ−リジン製造に用いる宿主として、エシ
ェリヒア属細菌、好ましくはＬ−リジン生産性の大腸菌
が挙げられる。具体的には、リジンアナログに耐性を有
する変異株が例示できる。このリジンアナログは、エシ
ェリヒア属の微生物の増殖を阻害するようなものである
が、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれば、全体
的または部分的に解除されるようなものである。例え
ば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−
（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」
と略記する）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラ
クタム等がある。これらのリジンアナログに耐性を有す
る変異株は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微
生物に施すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用い
る菌株として、具体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ
１１４４２（ＦＥＲＭ Ｐ−５０８４として寄託されて
いる。特開昭５６−１８５９６号公報第４７１頁左下欄
参照）が挙げられる。
な宿主 (i)Ｌ−リジン製造に好適な宿主 本発明によるＬ−リジン製造に用いる宿主として、エシ
ェリヒア属細菌、好ましくはＬ−リジン生産性の大腸菌
が挙げられる。具体的には、リジンアナログに耐性を有
する変異株が例示できる。このリジンアナログは、エシ
ェリヒア属の微生物の増殖を阻害するようなものである
が、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれば、全体
的または部分的に解除されるようなものである。例え
ば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−
（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」
と略記する）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラ
クタム等がある。これらのリジンアナログに耐性を有す
る変異株は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微
生物に施すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用い
る菌株として、具体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ
１１４４２（ＦＥＲＭ Ｐ−５０８４として寄託されて
いる。特開昭５６−１８５９６号公報第４７１頁左下欄
参照）が挙げられる。
【００５２】一方、コリネホルム細菌の種々の人工変異
株が、Ｌ−リジン生産菌として用いられており、これら
を本発明に使用することができる。このような人工変異
株としては次のようなものがある。ＡＥＣ耐性変異株、
その成長にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とす
る変異株（特公昭４８−２８０７８号，特公昭５６−６
４９９号），ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、
Ｌ−ホモセリン，Ｌ−プロリン，Ｌ−セリン，Ｌ−アル
ギニン，Ｌ−アラニン，Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求
する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２
５４７２号），ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタ
ム，α−アミノ−ラウリルラクタム，キノイド，Ｎ−ラ
ウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株，
オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラ−ゼ）または
呼吸系酵素の阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株
（特開昭５０−５３５８８号，特開昭５０−３１０９３
号，特開昭５２−１０２４９８号，特開昭５３−８６０
８９号，特開昭５５−９７８３号，特開昭５５−９７５
９号，特開昭５６−３２９９５号，特開昭５６−３９７
７８号，特公昭５３−４３５９１号，特公昭５３−１８
３３号），イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジ
ン生産変異株（特開昭５５−９７８４号，特開昭５６−
８６９２号），フルオロピルビン酸または３４℃以上の
温度に対して感性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭
５５−９７８３号，特開昭５３−８６０９０号）、エチ
レングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブ
レビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株
（米国特許出願第３３３４５５号参照）。
株が、Ｌ−リジン生産菌として用いられており、これら
を本発明に使用することができる。このような人工変異
株としては次のようなものがある。ＡＥＣ耐性変異株、
その成長にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とす
る変異株（特公昭４８−２８０７８号，特公昭５６−６
４９９号），ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、
Ｌ−ホモセリン，Ｌ−プロリン，Ｌ−セリン，Ｌ−アル
ギニン，Ｌ−アラニン，Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求
する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２
５４７２号），ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタ
ム，α−アミノ−ラウリルラクタム，キノイド，Ｎ−ラ
ウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株，
オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラ−ゼ）または
呼吸系酵素の阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株
（特開昭５０−５３５８８号，特開昭５０−３１０９３
号，特開昭５２−１０２４９８号，特開昭５３−８６０
８９号，特開昭５５−９７８３号，特開昭５５−９７５
９号，特開昭５６−３２９９５号，特開昭５６−３９７
７８号，特公昭５３−４３５９１号，特公昭５３−１８
３３号），イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジ
ン生産変異株（特開昭５５−９７８４号，特開昭５６−
８６９２号），フルオロピルビン酸または３４℃以上の
温度に対して感性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭
５５−９７８３号，特開昭５３−８６０９０号）、エチ
レングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブ
レビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株
（米国特許出願第３３３４５５号参照）。
【００５３】リジン製造に用いる具体的なコリネホルム
細菌としては、次のものが挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12031 (FERM BP-277) 特
開昭60-62994号公報第525頁左下欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム ATCC39134 特開昭60-62994号
公報第473頁右下欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3463 (FERM P-1987) 特公
昭51-34477号公報参照 また、以下に示すコリネホルム細菌の野生株も同様に本
発明に使用することができる。
細菌としては、次のものが挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12031 (FERM BP-277) 特
開昭60-62994号公報第525頁左下欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム ATCC39134 特開昭60-62994号
公報第473頁右下欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3463 (FERM P-1987) 特公
昭51-34477号公報参照 また、以下に示すコリネホルム細菌の野生株も同様に本
発明に使用することができる。
【００５４】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ １３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ １５８０６ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ １５９９１ コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２ ＡＴＣＣ １３０６０ （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ＡＴＣＣ １４０２０ （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム） ＡＴＣＣ １３８６９ （コリネバクテリウム・リリウム） ＡＴＣＣ １５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ １７９６５ ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ＡＴＣＣ １４０６６ ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ １４０６８ ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ １３８２５ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ １３８２６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ １９２４０ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ １５３５４
【００５５】(ii)Ｌ−スレオニン製造に好適な宿主エシェリヒア・コリ B-3996 (RIA 1867) 特表平3-501682号
公報参照エシェリヒア・コリ AJ 12349 (FERM P-9574) 特開平2-458号公
報第887頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12351 (FERM P-9576) 特開平2-458号公
報第887頁右下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12352 (FERM P-9577) 特開平2-458号公
報第888頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11332 (FERM P-4898) 特開平2-458号公
報第889頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12350 (FERM P-9575) 特開平2-458号公
報第889頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12353 (FERM P-9578) 特開平2-458号公
報第889頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12358 (FERM P-9764) 特開平2-458号公
報第890頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12359 (FERM P-9765) 特開平2-458号公
報第890頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11334 (FERM P-4900) 特公平1-29559号
公報第201頁６欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11333 (FERM P-4899) 特公平1-29559号
公報第201頁６欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11335 (FERM P-4901) 特公平1-29559号
公報第202頁７欄参照
公報参照エシェリヒア・コリ AJ 12349 (FERM P-9574) 特開平2-458号公
報第887頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12351 (FERM P-9576) 特開平2-458号公
報第887頁右下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12352 (FERM P-9577) 特開平2-458号公
報第888頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11332 (FERM P-4898) 特開平2-458号公
報第889頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12350 (FERM P-9575) 特開平2-458号公
報第889頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12353 (FERM P-9578) 特開平2-458号公
報第889頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12358 (FERM P-9764) 特開平2-458号公
報第890頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 12359 (FERM P-9765) 特開平2-458号公
報第890頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11334 (FERM P-4900) 特公平1-29559号
公報第201頁６欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11333 (FERM P-4899) 特公平1-29559号
公報第201頁６欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11335 (FERM P-4901) 特公平1-29559号
公報第202頁７欄参照
【００５６】コリネホルム細菌としては、以下の菌株が
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11188 (FERM P-4190) 特
開昭60-87788号公報第473頁右上欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 11682 (FERM BP-118) 特公平2-
31956号公報第230頁８欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 11683 (FERM BP-119) 特公平2-
31956号公報第231頁10欄参照
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11188 (FERM P-4190) 特
開昭60-87788号公報第473頁右上欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 11682 (FERM BP-118) 特公平2-
31956号公報第230頁８欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 11683 (FERM BP-119) 特公平2-
31956号公報第231頁10欄参照
【００５７】(iii)Ｌ−メチオニン製造に好適な宿主 Ｌ−メチオニン製造には、以下の菌株が挙げられる。エシェリヒア・コリ AJ 11457 (FERM P-5175) 特開昭56-35992号
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11458 (FERM P-5176) 特開昭56-35992号
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11459 (FERM P-5177) 特開昭56-35992号
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11539 (FERM P-5479) 特開昭56-144092
号公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11540 (FERM P-5480) 特開昭56-144092
号公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11541 (FERM P-5481) 特開昭56-144092
号公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11542 (FERM P-5482) 特開昭56-144092
号公報第435頁左下欄参照
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11458 (FERM P-5176) 特開昭56-35992号
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11459 (FERM P-5177) 特開昭56-35992号
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11539 (FERM P-5479) 特開昭56-144092
号公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11540 (FERM P-5480) 特開昭56-144092
号公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11541 (FERM P-5481) 特開昭56-144092
号公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11542 (FERM P-5482) 特開昭56-144092
号公報第435頁左下欄参照
【００５８】(iv)Ｌ−アスパラギン酸製造に好適な宿主 Ｌ−アスパラギン酸製造には以下の菌株が挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 3859 (FERM P-2799) 特開昭51-
61689号公報第524頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3860 (FERM P-2800) 特開
昭51-61689号公報第524頁 左上欄参照コリネハ゛クテリウム・アセトアシト゛フィラム AJ 3877 (FERM P-2803) 特開
昭51-61689号公報第524頁左上欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 3876 (FERM P-2802) 特開昭51-
61689号公報第524頁左上欄参照
61689号公報第524頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3860 (FERM P-2800) 特開
昭51-61689号公報第524頁 左上欄参照コリネハ゛クテリウム・アセトアシト゛フィラム AJ 3877 (FERM P-2803) 特開
昭51-61689号公報第524頁左上欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 3876 (FERM P-2802) 特開昭51-
61689号公報第524頁左上欄参照
【００５９】(v)Ｌ−イソロイシン製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ KX141 (VKPM-
B4781)（特開平4-330275号公報４５段落参照）が、コリ
ネホルム細菌としては、フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 1
2404 (FERM P-10141)（特開平2-42988号公報第603頁左
下欄参照）、フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 12405 (FERM P-10
142)（特開平2-42988号公報第524頁左下欄参照）が挙げ
られる。
B4781)（特開平4-330275号公報４５段落参照）が、コリ
ネホルム細菌としては、フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 1
2404 (FERM P-10141)（特開平2-42988号公報第603頁左
下欄参照）、フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 12405 (FERM P-10
142)（特開平2-42988号公報第524頁左下欄参照）が挙げ
られる。
【００６０】(vi)Ｌ−グルタミン酸製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられ
る。エシェリヒア・コリ AJ 12628 (FERM P-12380) '93年フランス特
許公開No. 2 680 178号参照エシェリヒア・コリ AJ 12624 (FERM P-12379) '93年フランス特
許公開No. 2 680 178号参照
る。エシェリヒア・コリ AJ 12628 (FERM P-12380) '93年フランス特
許公開No. 2 680 178号参照エシェリヒア・コリ AJ 12624 (FERM P-12379) '93年フランス特
許公開No. 2 680 178号参照
【００６１】コリネホルム細菌としては、以下の菌株が
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12745 (FERM BP-2922) 特
開平3-49690号公報第561頁右下欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12746 (FERM BP-2923) 特
開平3-49690号公報第562頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12747 (FERM BP-2924) 特
開平3-49690号公報第562頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12748 (FERM BP-2925) 特
開平3-49690号公報第562頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム ATCC 14067 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム ATCC 21492 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12745 (FERM BP-2922) 特
開平3-49690号公報第561頁右下欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12746 (FERM BP-2923) 特
開平3-49690号公報第562頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12747 (FERM BP-2924) 特
開平3-49690号公報第562頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12748 (FERM BP-2925) 特
開平3-49690号公報第562頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム ATCC 14067 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム ATCC 21492 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照
【００６２】(vii)Ｌ−アルギニン製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられ
る。エシェリヒア・コリ AJ 11593 (FERM P-5616) 特開昭57-5693号公
報第468頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11594 (FERM P-5617) 特開昭57-5693号公
報第468頁右上欄参照
る。エシェリヒア・コリ AJ 11593 (FERM P-5616) 特開昭57-5693号公
報第468頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11594 (FERM P-5617) 特開昭57-5693号公
報第468頁右上欄参照
【００６３】コリネホルム細菌としては、以下の菌株が
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 12144 (FERM P-7642) 特公平5-
27388号公報第174頁４欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 12145 (FERM P-7643) 特公平5-
27388号公報第174頁４欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム ATCC 21493 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム ATCC 21659 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 12144 (FERM P-7642) 特公平5-
27388号公報第174頁４欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 12145 (FERM P-7643) 特公平5-
27388号公報第174頁４欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム ATCC 21493 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム ATCC 21659 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照
【００６４】(viii)Ｌ−プロリン製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられ
る。エシェリヒア・コリ AJ 11543 (FERM P-5483) 特開昭56-144093号
公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11544 (FERM P-5484) 特開昭56-144093号
公報第435頁左下欄参照
る。エシェリヒア・コリ AJ 11543 (FERM P-5483) 特開昭56-144093号
公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ 11544 (FERM P-5484) 特開昭56-144093号
公報第435頁左下欄参照
【００６５】コリネホルム細菌としては、以下の菌株が
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11225 (FERM P-4370) 特
開昭60-87788号公報第473頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 11512 (FERM P-5332) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 11513 (FERM P-5333) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 11514 (FERM P-5334) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 11522 (FERM P-5342) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 11523 (FERM P-5343) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11225 (FERM P-4370) 特
開昭60-87788号公報第473頁左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 11512 (FERM P-5332) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 11513 (FERM P-5333) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ 11514 (FERM P-5334) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 11522 (FERM P-5342) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ 11523 (FERM P-5343) 特公昭62
-36679号公報第185頁２欄 参照
【００６６】（２）培養法 上記宿主を培養する方法は、従来のアミノ酸生産菌の培
養方法と特に変わらない。すなわち、培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じてアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のもの
である。
養方法と特に変わらない。すなわち、培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じてアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のもの
である。
【００６７】炭素源としては、グルコース、シュクロー
ス、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解
液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が
使用できる。尚、アミノ酸等の栄養要求性変異株を宿主
に使用する場合は、その株が要求するアミノ酸等の栄養
素を培地に適宜加える必要がある。以下に、アミノ酸製
造に用いる培地として、リジン製造用の培地の一例を表
１に示す。尚、炭酸カルシウムは別個に殺菌後、他成分
に添加する。
ス、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解
液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が
使用できる。尚、アミノ酸等の栄養要求性変異株を宿主
に使用する場合は、その株が要求するアミノ酸等の栄養
素を培地に適宜加える必要がある。以下に、アミノ酸製
造に用いる培地として、リジン製造用の培地の一例を表
１に示す。尚、炭酸カルシウムは別個に殺菌後、他成分
に添加する。
【００６８】
【表１】
【００６９】培養は、好気的条件下で培地のｐＨ及び温
度を適宜調節しつつ、実質的にアミノ酸の生成蓄積が停
止するまで行われる。こうして培養液中に蓄積されたア
ミノ酸を採取するには、通常の方法を適用できる。
度を適宜調節しつつ、実質的にアミノ酸の生成蓄積が停
止するまで行われる。こうして培養液中に蓄積されたア
ミノ酸を採取するには、通常の方法を適用できる。
【００７０】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。
に説明する。
【００７１】
【実施例１】 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子の取得 すでにクローニングされ、塩基配列も決定されているホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をベク
タープラスミドｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位に挿入して
得られたプラスミドｐＳ２を用いて、変異型遺伝子の作
製を行った。ｐＳ２は、薬剤耐性マーカー遺伝子とし
て、アンピシリン耐性遺伝子を有する（Sabe, H. et a
l., Gene, 31, 279-283, 1984）。
キシラーゼ遺伝子の取得 すでにクローニングされ、塩基配列も決定されているホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をベク
タープラスミドｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位に挿入して
得られたプラスミドｐＳ２を用いて、変異型遺伝子の作
製を行った。ｐＳ２は、薬剤耐性マーカー遺伝子とし
て、アンピシリン耐性遺伝子を有する（Sabe, H. et a
l., Gene, 31, 279-283, 1984）。
【００７２】ｐＳ２ＤＮＡを、ヒドロキシルアミン処理
溶液（２０μｇ／ｍｌ ｐＳ２ＤＮＡ、０．０５Ｍ リン
酸ナトリウム（pH6.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４Ｍヒ
ドロキシルアミン）で、７５℃、２時間処理した。ヒド
ロキシルアミン処理は、ｐＨの影響を受けるので、水酸
化ナトリウムでｐＨを６．０に調整した１Ｍヒドロキシ
ルアミン・ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８０μｌと、
０．１Ｍ リン酸ナトリウム（pH6.0）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ溶液１００μｌと、２μｇのｐＳ２ＤＮＡを含むＴＥ
（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）緩衝液とを混合し、最終
的に水で２００μｌとした。
溶液（２０μｇ／ｍｌ ｐＳ２ＤＮＡ、０．０５Ｍ リン
酸ナトリウム（pH6.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４Ｍヒ
ドロキシルアミン）で、７５℃、２時間処理した。ヒド
ロキシルアミン処理は、ｐＨの影響を受けるので、水酸
化ナトリウムでｐＨを６．０に調整した１Ｍヒドロキシ
ルアミン・ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８０μｌと、
０．１Ｍ リン酸ナトリウム（pH6.0）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ溶液１００μｌと、２μｇのｐＳ２ＤＮＡを含むＴＥ
（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）緩衝液とを混合し、最終
的に水で２００μｌとした。
【００７３】上記条件は、処理後のｐＳ２でエシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１を形質転換したときに、アンピシリ
ン含有培地での形質転換体の生存率が処理前の０．２％
となる条件である。
ア・コリＨＢ１０１を形質転換したときに、アンピシリ
ン含有培地での形質転換体の生存率が処理前の０．２％
となる条件である。
【００７４】ヒドロキシルアミン処理したｐＳ２でエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリン
を含む平板培地に塗布し、約１００００コロニーの形質
転換体を得た。これらを液体培地に懸濁し、アスパラギ
ン酸のアナログ化合物である３−ブロモピルビン酸（３
ＢＰ）、アスパラギン酸−β−ヒドラジド（ＡＨＹ）、
ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸（βＨ
Ａ）のいずれかを最小阻止濃度付近の濃度で含む平板培
地に、培地１枚あたり１０3〜１０5個となるように塗布
し、生育するコロニーを選択した。
ェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリン
を含む平板培地に塗布し、約１００００コロニーの形質
転換体を得た。これらを液体培地に懸濁し、アスパラギ
ン酸のアナログ化合物である３−ブロモピルビン酸（３
ＢＰ）、アスパラギン酸−β−ヒドラジド（ＡＨＹ）、
ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸（βＨ
Ａ）のいずれかを最小阻止濃度付近の濃度で含む平板培
地に、培地１枚あたり１０3〜１０5個となるように塗布
し、生育するコロニーを選択した。
【００７５】こうして得られたアナログ化合物耐性株１
００株から、The Journal of Biochemistry, Vol.67, N
o.4, 1970に記載の方法に準じて、各々の生産するホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを粗精製し、ア
ナログ化合物による活性阻害を調べた。酵素活性の測定
は、前記と同様にして行った。
００株から、The Journal of Biochemistry, Vol.67, N
o.4, 1970に記載の方法に準じて、各々の生産するホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを粗精製し、ア
ナログ化合物による活性阻害を調べた。酵素活性の測定
は、前記と同様にして行った。
【００７６】さらに、アナログ化合物により活性を阻害
されない変異型酵素を生産する菌株からプラスミドを単
離し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損
変異株であるエシェリヒア・コリＰＣＲ１（Sabe, H. e
t al., Gene, 31, 279-283,1984）に導入し、変異型酵
素を産生することを確認した。
されない変異型酵素を生産する菌株からプラスミドを単
離し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損
変異株であるエシェリヒア・コリＰＣＲ１（Sabe, H. e
t al., Gene, 31, 279-283,1984）に導入し、変異型酵
素を産生することを確認した。
【００７７】こうして、変異型酵素遺伝子を有する５株
の形質転換体を得た。これらの遺伝子の塩基配列を決定
した結果、２株については同一の変異を有しており、４
種類の変異型遺伝子が得られた。これらを保持する形質
転換体は、ＡＪ １２９０７、ＡＪ １２９０８、ＡＪ
１２９０９、ＡＪ １２９１０と命名され、平成５年８
月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号
３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、
各々順にＦＥＲＭ Ｐ−１３７７４、ＦＥＲＭＰ−１３
７７５、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７６、ＦＥＲＭ Ｐ−１３
７７７として寄託されており、平成６年７月１１日に、
この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管
され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP
-4736、FERM BP-4737として寄託されている。また、こ
れらの保持するプラスミドは、各々順にｐＢＰ５、ｐＨ
Ａ１９、ｐＢＰ１２２、ｐＲ６と名付けた。各々のプラ
スミドに含まれるホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子が有する変異を、表２に示す。表中の数字
は、配列番号１におけるヌクレオチド番号またはアミノ
酸番号を表す。
の形質転換体を得た。これらの遺伝子の塩基配列を決定
した結果、２株については同一の変異を有しており、４
種類の変異型遺伝子が得られた。これらを保持する形質
転換体は、ＡＪ １２９０７、ＡＪ １２９０８、ＡＪ
１２９０９、ＡＪ １２９１０と命名され、平成５年８
月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号
３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、
各々順にＦＥＲＭ Ｐ−１３７７４、ＦＥＲＭＰ−１３
７７５、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７６、ＦＥＲＭ Ｐ−１３
７７７として寄託されており、平成６年７月１１日に、
この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管
され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP
-4736、FERM BP-4737として寄託されている。また、こ
れらの保持するプラスミドは、各々順にｐＢＰ５、ｐＨ
Ａ１９、ｐＢＰ１２２、ｐＲ６と名付けた。各々のプラ
スミドに含まれるホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子が有する変異を、表２に示す。表中の数字
は、配列番号１におけるヌクレオチド番号またはアミノ
酸番号を表す。
【００７８】
【表２】
【００７９】尚、ＡＪ １２９０７、ＡＪ １２９０９
は、５００μｇ／ｍｌの３ＢＰを含む培地で、ＡＪ １
２９０８は、１０００μｇ／ｍｌのβＨＡを含む培地
で、ＡＪ１２９１０は、５００μｇ／ｍｌのＡＨＹを含
む培地で選択されたものである。
は、５００μｇ／ｍｌの３ＢＰを含む培地で、ＡＪ １
２９０８は、１０００μｇ／ｍｌのβＨＡを含む培地
で、ＡＪ１２９１０は、５００μｇ／ｍｌのＡＨＹを含
む培地で選択されたものである。
【００８０】
【実施例２】 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ 上記４株の形質転換体の産生するホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼについて、アスパラギン酸に対す
る感受性を調べた。これらの菌株は、宿主由来のホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠損して
いるので、産生するホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼは、プラスミド由来のものである。
キシラーゼ 上記４株の形質転換体の産生するホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼについて、アスパラギン酸に対す
る感受性を調べた。これらの菌株は、宿主由来のホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠損して
いるので、産生するホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼは、プラスミド由来のものである。
【００８１】アスパラギン酸に対する感受性は、既知の
方法（Yoshinaga,T.,Izui,K and Katsuki,H. J.Bioche
m.,68,747-750(1970)）に従って調べた。すなわち、活
性測定系中に、活性に影響することが知られているアセ
チルコエンザイムＡを０．１ｍＭあるいは１ｍＭの濃度
で存在させて、各形質転換体及びｐＳ２を保持する大腸
菌が産生する酵素の活性を測定したところ、アスパラギ
ン酸に対する感受性は、図９、１１のように測定され
た。
方法（Yoshinaga,T.,Izui,K and Katsuki,H. J.Bioche
m.,68,747-750(1970)）に従って調べた。すなわち、活
性測定系中に、活性に影響することが知られているアセ
チルコエンザイムＡを０．１ｍＭあるいは１ｍＭの濃度
で存在させて、各形質転換体及びｐＳ２を保持する大腸
菌が産生する酵素の活性を測定したところ、アスパラギ
ン酸に対する感受性は、図９、１１のように測定され
た。
【００８２】この結果から、アスパラギン酸が高濃度に
なると、野生型の酵素は活性を失うのに対し、本発明の
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、
活性を実質的に保持し続けていることが明らかである。
なると、野生型の酵素は活性を失うのに対し、本発明の
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、
活性を実質的に保持し続けていることが明らかである。
【００８３】
【実施例３】 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるＬ−ス
レオニンの発酵生産 エシェリヒア・コリのスレオニン生産菌としてはＢ−３
９９６株（特表平3-501682号公報）が現在知られている
内で最も高い生産能力を持っている。そこで変異型ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの評価を行うに
あたり、Ｂ−３９９６を宿主として用いることにした。
このＢ−３９９６株は、Research Institute for Genet
ics and Industrial Microorganism Breeding に、登録
番号 RIA1867 のもとに寄託されている。また評価する
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとし
てはｐＢＰ５を選び、実験に供した。
キシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるＬ−ス
レオニンの発酵生産 エシェリヒア・コリのスレオニン生産菌としてはＢ−３
９９６株（特表平3-501682号公報）が現在知られている
内で最も高い生産能力を持っている。そこで変異型ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの評価を行うに
あたり、Ｂ−３９９６を宿主として用いることにした。
このＢ−３９９６株は、Research Institute for Genet
ics and Industrial Microorganism Breeding に、登録
番号 RIA1867 のもとに寄託されている。また評価する
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとし
てはｐＢＰ５を選び、実験に供した。
【００８４】エシェリヒア・コリＢ−３９９６に変異型
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラ
スミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.106,
p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を分離
した。対照として、野生型ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＳ
２でエシェリヒア・コリＢ−３９９６を同様に形質転換
した。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラ
スミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.106,
p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を分離
した。対照として、野生型ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＳ
２でエシェリヒア・コリＢ−３９９６を同様に形質転換
した。
【００８５】エシェリヒア・コリＢ−３９９６及びその
形質転換体を、それぞれ表３の組成の培地２０ｍｌを注
入した５００ｍｌ坂口フラスコに接種して３７℃にて４
０時間培養し、Ｌ−スレオニンの生産量を調べたとこ
ろ、表４に示す結果を得た。尚、前記培地は、グルコー
スとＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及びそれ以外の成分とに２分
し、ＫＯＨでpH7.0 に調整した後に、１１５℃で１０分
間オートクレーブし、これらを混合した後に別殺菌した
ＣａＣＯ3を３０ｇ／ｌ添加した。
形質転換体を、それぞれ表３の組成の培地２０ｍｌを注
入した５００ｍｌ坂口フラスコに接種して３７℃にて４
０時間培養し、Ｌ−スレオニンの生産量を調べたとこ
ろ、表４に示す結果を得た。尚、前記培地は、グルコー
スとＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及びそれ以外の成分とに２分
し、ＫＯＨでpH7.0 に調整した後に、１１５℃で１０分
間オートクレーブし、これらを混合した後に別殺菌した
ＣａＣＯ3を３０ｇ／ｌ添加した。
【００８６】
【表３】
【００８７】
【表４】
【００８８】この結果から明らかなように、本発明のＤ
ＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持する
エシェリヒア・コリＢ−３９９６は、野生型酵素を発現
するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＢ−３９
９６よりもスレオニン生産能が向上した。
ＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持する
エシェリヒア・コリＢ−３９９６は、野生型酵素を発現
するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＢ−３９
９６よりもスレオニン生産能が向上した。
【００８９】
【実施例４】 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるＬ−グ
ルタミン酸の発酵生産 エシェリヒア・コリ グルタミン酸生産菌としては、特
開平４−１１４６１号公報に示されるエシェリヒア・コ
リＡＪ １２６２８が、現在知られている内で最も高い
生産能力を持っている。そこで変異型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼを評価するにあたり、ＡＪ
１２６２８を宿主として用いることにした。ＡＪ １２
６２８株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所
に登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５３のもとに寄託され
ている。また評価する変異型ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼとしてはｐＢＰ５を選び、実験に供し
た。
キシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるＬ−グ
ルタミン酸の発酵生産 エシェリヒア・コリ グルタミン酸生産菌としては、特
開平４−１１４６１号公報に示されるエシェリヒア・コ
リＡＪ １２６２８が、現在知られている内で最も高い
生産能力を持っている。そこで変異型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼを評価するにあたり、ＡＪ
１２６２８を宿主として用いることにした。ＡＪ １２
６２８株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所
に登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５３のもとに寄託され
ている。また評価する変異型ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼとしてはｐＢＰ５を選び、実験に供し
た。
【００９０】エシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８に変
異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つ
プラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.
106,p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を
分離した。同様に、ｐＳ２によるエシェリヒア・コリ
ＡＪ １２６２８の形質転換体を分離した。
異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つ
プラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.
106,p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を
分離した。同様に、ｐＳ２によるエシェリヒア・コリ
ＡＪ １２６２８の形質転換体を分離した。
【００９１】エシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８に変
異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つ
プラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.
106,p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を
分離した。同様に、ｐＳ２によるエシェリヒア・コリ
ＡＪ １２６２８の形質転換体を分離した。
異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つ
プラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.
106,p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を
分離した。同様に、ｐＳ２によるエシェリヒア・コリ
ＡＪ １２６２８の形質転換体を分離した。
【００９２】し、これらを混合した後に別殺菌したＣａ
ＣＯ3を３０ｇ／ｌ添加した。
ＣＯ3を３０ｇ／ｌ添加した。
【００９３】
【表５】
【００９４】
【表６】
【００９５】この結果から明らかなように、本発明のＤ
ＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持する
エシェリヒア・コリＡＪ １２６２８は、野生型酵素を
発現するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＡＪ
１２６２８よりもグルタミン酸生産能が向上した。
ＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持する
エシェリヒア・コリＡＪ １２６２８は、野生型酵素を
発現するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＡＪ
１２６２８よりもグルタミン酸生産能が向上した。
【００９６】
【実施例５】 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼを導入したコリネホルム細菌によるリジンの
生産 変異型遺伝子をコリネホルム細菌に導入して発現させる
ために、ブレビバクテリウム属細菌由来のプロモーター
の取得を行い、変異型遺伝子に連結し、発現型プラスミ
ドを作製した。さらに、これをブレビバクテリウム属細
菌に導入し、Ｌ−リジンの製造を行った。
キシラーゼを導入したコリネホルム細菌によるリジンの
生産 変異型遺伝子をコリネホルム細菌に導入して発現させる
ために、ブレビバクテリウム属細菌由来のプロモーター
の取得を行い、変異型遺伝子に連結し、発現型プラスミ
ドを作製した。さらに、これをブレビバクテリウム属細
菌に導入し、Ｌ−リジンの製造を行った。
【００９７】＜１＞ブレビバクテリウム属細菌由来アス
パルトキナーゼ（ＡＫ）遺伝子の取得 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム）野生株ATCC13869株より常
法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCR（p
olymerase chain reaction；White,T.J. et al. ;Trend
s Genet., 5,185(1989)参照）によりＡＫ遺伝子を増幅
した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウ
ム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Mole
cular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Ge
net.(1990)224,317-324参照）を基にしてＡＫ遺伝子を
コードする約1643bpの領域を増幅すべく、23merのオリ
ゴヌクレオチド（配列番号２）及び21merのオリゴヌク
レオチド（配列番号３）を合成した。
パルトキナーゼ（ＡＫ）遺伝子の取得 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム）野生株ATCC13869株より常
法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCR（p
olymerase chain reaction；White,T.J. et al. ;Trend
s Genet., 5,185(1989)参照）によりＡＫ遺伝子を増幅
した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウ
ム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Mole
cular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Ge
net.(1990)224,317-324参照）を基にしてＡＫ遺伝子を
コードする約1643bpの領域を増幅すべく、23merのオリ
ゴヌクレオチド（配列番号２）及び21merのオリゴヌク
レオチド（配列番号３）を合成した。
【００９８】ＤＮＡの合成は、Applied Biosystems社製
ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト
法（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）を用い
て、常法に従って合成した。PCR反応は、宝酒造（株）
製ＤＮＡサーマルサイクラーPJ2000型を用い、TaqDNAポ
リメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従っ
て遺伝子増幅を行なった。
ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト
法（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）を用い
て、常法に従って合成した。PCR反応は、宝酒造（株）
製ＤＮＡサーマルサイクラーPJ2000型を用い、TaqDNAポ
リメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従っ
て遺伝子増幅を行なった。
【００９９】増幅した1643kbの遺伝子断片をアガロース
ゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該
断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造（株）
製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断した。遺伝
子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Takeshit
a, S. et al.;Gene(1987),61,63-74参照）を用いた。pH
SG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び制限酵素E
coRIにて切断し、増幅したＡＫ遺伝子断片と接続した。
ゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該
断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造（株）
製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断した。遺伝
子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Takeshit
a, S. et al.;Gene(1987),61,63-74参照）を用いた。pH
SG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び制限酵素E
coRIにて切断し、増幅したＡＫ遺伝子断片と接続した。
【０１００】ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行な
った。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム染色
体より増幅されたＡＫ遺伝子断片の接続されたプラスミ
ドを作製した。野生株であるATCC13869由来のＡＫ遺伝
子を有するプラスミドをp399AKYと命名した。
ト（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行な
った。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム染色
体より増幅されたＡＫ遺伝子断片の接続されたプラスミ
ドを作製した。野生株であるATCC13869由来のＡＫ遺伝
子を有するプラスミドをp399AKYと命名した。
【０１０１】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムのＡＫ遺伝子の塩基配列の決定 ＡＫプラスミドp399AKYを調製し、ＡＫ遺伝子の塩基配
列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方
法（F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74,54
63(1977)などがある）によった。結果を配列表配列番号
４に記す。同ＤＮＡ断片は２つのオープン・リーディン
グ・フレームをもち、これらはおのおの、ＡＫのαサブ
ユニットとβサブユニットに対応する。各々のオープン
・リーディング・フレームに対応するアミノ酸配列を、
配列番号４及び配列番号５に示す。
メンタムのＡＫ遺伝子の塩基配列の決定 ＡＫプラスミドp399AKYを調製し、ＡＫ遺伝子の塩基配
列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方
法（F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74,54
63(1977)などがある）によった。結果を配列表配列番号
４に記す。同ＤＮＡ断片は２つのオープン・リーディン
グ・フレームをもち、これらはおのおの、ＡＫのαサブ
ユニットとβサブユニットに対応する。各々のオープン
・リーディング・フレームに対応するアミノ酸配列を、
配列番号４及び配列番号５に示す。
【０１０２】＜３＞ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ発現型プラスミドの作製 野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝
子を保持するプラスミドであるｐＳ２、及び取得した変
異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
を保持するプラスミドであるｐＢＰ５より、ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含む約４．４
ｋｂのSalI断片を抽出し、大腸菌に汎用されているプラ
スミドベクターｐＨＳＧ３９９のSalIサイトに導入し
た。作製したプラスミドを、野生型をｐＨＳ２、変異型
をｐＨＢＰ５と各々命名した。
シラーゼ発現型プラスミドの作製 野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝
子を保持するプラスミドであるｐＳ２、及び取得した変
異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
を保持するプラスミドであるｐＢＰ５より、ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含む約４．４
ｋｂのSalI断片を抽出し、大腸菌に汎用されているプラ
スミドベクターｐＨＳＧ３９９のSalIサイトに導入し
た。作製したプラスミドを、野生型をｐＨＳ２、変異型
をｐＨＢＰ５と各々命名した。
【０１０３】ｐＨＳ２およびｐＨＢＰ５をブレビバクテ
リウム中で発現するプラスミドとすべく、ブレビバクテ
リウム中で機能するプロモーター、及びプラスミドの複
製起点の導入を行った。プロモーターとしては、クロー
ン化したＡＫ遺伝子のプロモーター領域と推定される、
塩基配列の１番目のNruIサイトから２０７番目のApaLI
サイトまでを含む遺伝子断片をp399AKYより抽出し、ｐ
ＨＳ２およびｐＨＢＰ５の構造遺伝子の約６０ｂｐ手前
にあるAvaIサイトに転写方向が順方向となるよう挿入し
た。
リウム中で発現するプラスミドとすべく、ブレビバクテ
リウム中で機能するプロモーター、及びプラスミドの複
製起点の導入を行った。プロモーターとしては、クロー
ン化したＡＫ遺伝子のプロモーター領域と推定される、
塩基配列の１番目のNruIサイトから２０７番目のApaLI
サイトまでを含む遺伝子断片をp399AKYより抽出し、ｐ
ＨＳ２およびｐＨＢＰ５の構造遺伝子の約６０ｂｐ手前
にあるAvaIサイトに転写方向が順方向となるよう挿入し
た。
【０１０４】更に、ベクター上にあるサイトにブレビバ
クテリウム中でプラスミドの自律増殖を可能にする遺伝
子断片、すなわちプラスミドの複製起点を導入した。プ
ラスミドの複製起点を含む遺伝子断片は、ブレビバクテ
リウム用ベクターｐＨＣ４（特開平５−７４９１号公報
段落番号１０参照、同プラスミドを保持するエシェリヒ
ア・コリAJ 12036は工業技術院微生命工学工業技術研究
所に寄託されており、寄託番号FERM P12215が付されて
いる）より抽出し、両末端の制限酵素部位をリンカーの
導入によりPstIサイトに改変した。
クテリウム中でプラスミドの自律増殖を可能にする遺伝
子断片、すなわちプラスミドの複製起点を導入した。プ
ラスミドの複製起点を含む遺伝子断片は、ブレビバクテ
リウム用ベクターｐＨＣ４（特開平５−７４９１号公報
段落番号１０参照、同プラスミドを保持するエシェリヒ
ア・コリAJ 12036は工業技術院微生命工学工業技術研究
所に寄託されており、寄託番号FERM P12215が付されて
いる）より抽出し、両末端の制限酵素部位をリンカーの
導入によりPstIサイトに改変した。
【０１０５】この断片を、ブレビバクテリウムのプロモ
ーターを付加したプラスミドの、ベクター部分であるPs
tIサイトに導入した。構築した発現型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼプラスミドを、ｐＳ２に由来
する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
プラスミドをｐＨＳ２Ｂ、ｐＢＰ５に由来する変異型ホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドを
ｐＨＢＰ５Ｂと各々命名した。
ーターを付加したプラスミドの、ベクター部分であるPs
tIサイトに導入した。構築した発現型ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼプラスミドを、ｐＳ２に由来
する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
プラスミドをｐＨＳ２Ｂ、ｐＢＰ５に由来する変異型ホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドを
ｐＨＢＰ５Ｂと各々命名した。
【０１０６】＜４＞ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ発現型プラスミドを用いたＬ−リジンの生産 作成したｐＨＳ２Ｂ、ｐＨＢＰ５Ｂを各々ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌である
ＡＪ ３４６３（特公平51-34477号公報参照）に導入し
た。遺伝子の導入は、電気パルスを用いた形質転換法を
用いた（特開平２−２０７７９１号公報参照）。宿主及
び形質転換体を表７の組成のリジン生産培地にて７２時
間、３１．５℃にて振蘯培養を行った。前記培地は、表
に記載の成分のうちＣａＣＯ3以外を１ｌの水に添加
し、KOHを用いてpH8.0に調整後、115℃、15分間オートクレーフ
゛した後、乾熱滅菌したＣａＣＯ3をさらに添加して調製
した。培養後の培地中のＬ−リジンの蓄積量を表８に示
す。
シラーゼ発現型プラスミドを用いたＬ−リジンの生産 作成したｐＨＳ２Ｂ、ｐＨＢＰ５Ｂを各々ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌である
ＡＪ ３４６３（特公平51-34477号公報参照）に導入し
た。遺伝子の導入は、電気パルスを用いた形質転換法を
用いた（特開平２−２０７７９１号公報参照）。宿主及
び形質転換体を表７の組成のリジン生産培地にて７２時
間、３１．５℃にて振蘯培養を行った。前記培地は、表
に記載の成分のうちＣａＣＯ3以外を１ｌの水に添加
し、KOHを用いてpH8.0に調整後、115℃、15分間オートクレーフ
゛した後、乾熱滅菌したＣａＣＯ3をさらに添加して調製
した。培養後の培地中のＬ−リジンの蓄積量を表８に示
す。
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
【表８】
【０１０９】この結果に示されるように、本発明のＤＮ
Ａ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ ３４６
３は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ ３４６３
よりもリジン生産能が向上した。
Ａ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ ３４６
３は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ ３４６３
よりもリジン生産能が向上した。
【０１１０】
【発明の効果】本発明のＤＮＡ配列は、変異型ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードし、このＤ
ＮＡ配列を保持する微生物は、前記酵素を産生する。
ノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードし、このＤ
ＮＡ配列を保持する微生物は、前記酵素を産生する。
【０１１１】本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼは、アスパラギン酸による活性阻害を
実質的に受けないので、アスパラギン酸により生合成の
調節を受けるアミノ酸の醗酵生産等に利用することがで
きる。
カルボキシラーゼは、アスパラギン酸による活性阻害を
実質的に受けないので、アスパラギン酸により生合成の
調節を受けるアミノ酸の醗酵生産等に利用することがで
きる。
【０１１２】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：3106 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 株名： 配列の特徴：CDS 存在位置：239..2890 配列 TTACTTGGGG CGATTTTTTA ACATTTCCAT AAGTTACGCT TATTTAAAGC GTCGTGAATT 60 TAATGACGTA AATTCCTGCT ATTTATTCGT TTGCTGAAGC GATTTCGCAG CATTTGACGT 120 CACCGCTTTT ACGTGGCTTT ATAAAAGACG ACGAAAAGCA AAGCCCGAGC ATATTCGCGC 180 CAATGCGACG TGAAGGATAC AGGGCTATCA AACGATAAGA TGGGGTGTCT GGGGTAAT 238 ATG AAC GAA CAA TAT TCC GCA TTG CGT AGT AAT GTC AGT ATG CTC GGC 286 Met Asn Glu Gln Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly 1 5 10 15 AAA GTG CTG GGA GAA ACC ATC AAG GAT GCG TTG GGA GAA CAC ATT CTT 334 Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu 20 25 30 GAA CGC GTA GAA ACT ATC CGT AAG TTG TCG AAA TCT TCA CGC GCT GGC 382 Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly 35 40 45 AAT GAT GCT AAC CGC CAG GAG TTG CTC ACC ACC TTA CAA AAT TTG TCG 430 Asn Asp Ala Asn Arg Gln Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser 50 55 60 AAC GAC GAG CTG CTG CCC GTT GCG CGT GCG TTT AGT CAG TTC CTG AAC 478 Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gln Phe Leu Asn 65 70 75 80 CTG GCC AAC ACC GCC GAG CAA TAC CAC AGC ATT TCG CCG AAA GGC GAA 526 Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gln Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu 85 90 95 GCT GCC AGC AAC CCG GAA GTG ATC GCC CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA 574 Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys 100 105 110 AAC CAG CCG GAA CTG AGC GAA GAC ACC ATC AAA AAA GCA GTG GAA TCG 622 Asn Gln Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser 115 120 125 CTG TCG CTG GAA CTG GTC CTC ACG GCT CAC CCA ACC GAA ATT ACC CGT 670 Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg 130 135 140 CGT ACA CTG ATC CAC AAA ATG GTG GAA GTG AAC GCC TGT TTA AAA CAG 718 Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gln 145 150 155 160 CTC GAT AAC AAA GAT ATC GCT GAC TAC GAA CAC AAC CAG CTG ATG CGT 766 Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gln Leu Met Arg 165 170 175 CGC CTG CGC CAG TTG ATC GCC CAG TCA TGG CAT ACC GAT GAA ATC CGT 814 Arg Leu Arg Gln Leu Ile Ala Gln Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg 180 185 190 AAG CTG CGT CCA AGC CCG GTA GAT GAA GCC AAA TGG GGC TTT GCC GTA 862 Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val 195 200 205 GTG GAA AAC AGC CTG TGG CAA GGC GTA CCA AAT TAC CTG CGC GAA CTG 910 Val Glu Asn Ser Leu Trp Gln Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu 210 215 220 AAC GAA CAA CTG GAA GAG AAC CTC GGC TAC AAA CTG CCC GTC GAA TTT 958 Asn Glu Gln Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe 225 230 235 240 GTT CCG GTC CGT TTT ACT TCG TGG ATG GGC GGC GAC CGC GAC GGC AAC 1006 Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn 245 250 255 CCG AAC GTC ACT GCC GAT ATC ACC CGC CAC GTC CTG CTA CTC AGC CGC 1054 Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg 260 265 270 TGG AAA GCC ACC GAT TTG TTC CTG AAA GAT ATT CAG GTG CTG GTT TCT 1102 Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gln Val Leu Val Ser 275 280 285 GAA CTG TCG ATG GTT GAA GCG ACC CCT GAA CTG CTG GCG CTG GTT GGC 1150 Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly 290 295 300 GAA GAA GGT GCC GCA GAA CCG TAT CGC TAT CTG ATG AAA AAC CTG CGT 1198 Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg 305 310 315 320 TCT CGC CTG ATG GCG ACA CAG GCA TGG CTG GAA GCG CGC CTG AAA GGC 1246 Ser Arg Leu Met Ala Thr Gln Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly 325 330 335 GAA GAA CTG CCA AAA CCA GAA GGC CTG CTG ACA CAA AAC GAA GAA CTG 1294 Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Glu Glu Leu 340 345 350 TGG GAA CCG CTC TAC GCT TGC TAC CAG TCA CTT CAG GCG TGT GGC ATG 1342 Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gln Ser Leu Gln Ala Cys Gly Met 355 360 365 GGT ATT ATC GCC AAC GGC GAT CTG CTC GAC ACC CTG CGC CGC GTG AAA 1390 Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys 370 375 380 TGT TTC GGC GTA CCG CTG GTC CGT ATT GAT ATC CGT CAG GAG AGC ACG 1438 Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr 385 390 395 400 CGT CAT ACC GAA GCG CTG GGC GAG CTG ACC CGC TAC CTC GGT ATC GGC 1486 Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly 405 410 415 GAC TAC GAA AGC TGG TCA GAG GCC GAC AAA CAG GCG TTC CTG ATC CGC 1534 Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ala Phe Leu Ile Arg 420 425 430 GAA CTG AAC TCC AAA CGT CCG CTT CTG CCG CGC AAC TGG CAA CCA AGC 1582 Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gln Pro Ser 435 440 445 GCC GAA ACG CGC GAA GTG CTC GAT ACC TGC CAG GTG ATT GCC GAA GCA 1630 Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gln Val Ile Ala Glu Ala 450 455 460 CCG CAA GGC TCC ATT GCC GCC TAC GTG ATC TCG ATG GCG AAA ACG CCG 1678 Pro Gln Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro 465 470 475 480 TCC GAC GTA CTG GCT GTC CAC CTG CTG CTG AAA GAA GCG GGT ATC GGG 1726 Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly 485 490 495 TTT GCG ATG CCG GTT GCT CCG CTG TTT GAA ACC CTC GAT GAT CTG AAC 1774 Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn 500 505 510 AAC GCC AAC GAT GTC ATG ACC CAG CTG CTC AAT ATT GAC TGG TAT CGT 1822 Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gln Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg 515 520 525 GGC CTG ATT CAG GGC AAA CAG ATG GTG ATG ATT GGC TAT TCC GAC TCA 1870 Gly Leu Ile Gln Gly Lys Gln Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser 530 535 540 GCA AAA GAT GCG GGA GTG ATG GCA GCT TCC TGG GCG CAA TAT CAG GCA 1918 Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gln Tyr Gln Ala 545 550 555 560 CAG GAT GCA TTA ATC AAA ACC TGC GAA AAA GCG GGT ATT GAG CTG ACG 1966 Gln Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr 565 570 575 TTG TTC CAC GGT CGC GGC GGT TCC ATT GGT CGC GGC GGC GCA CCT GCT 2014 Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala 580 585 590 CAT GCG GCG CTG CTG TCA CAA CCG CCA GGA AGC CTG AAA GGC GGC CTG 2062 His Ala Ala Leu Leu Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu 595 600 605 CGC GTA ACC GAA CAG GGC GAG ATG ATC CGC TTT AAA TAT GGT CTG CCA 2110 Arg Val Thr Glu Gln Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro 610 615 620 GAA ATC ACC GTC AGC AGC CTG TCG CTT TAT ACC GGG GCG ATT CTG GAA 2158 Glu Ile Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Ile Leu Glu 625 630 635 640 GCC AAC CTG CTG CCA CCG CCG GAG CCG AAA GAG AGC TGG CGT CGC ATT 2206 Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile 645 650 655 ATG GAT GAA CTG TCA GTC ATC TCC TGC GAT GTC TAC CGC GGC TAC GTA 2254 Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val 660 665 670 CGT GAA AAC AAA GAT TTT GTG CCT TAC TTC CGC TCC GCT ACG CCG GAA 2302 Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu 675 680 685 CAA GAA CTG GGC AAA CTG CCG TTG GGT TCA CGT CCG GCG AAA CGT CGC 2350 Gln Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg 690 695 700 CCA ACC GGC GGC GTC GAG TCA CTA CGC GCC ATT CCG TGG ATC TTC GCC 2398 Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala 705 710 715 720 TGG ACG CAA AAC CGT CTG ATG CTC CCC GCC TGG CTG GGT GCA GGT ACG 2446 Trp Thr Gln Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr 725 730 735 GCG CTG CAA AAA GTG GTC GAA GAC GGC AAA CAG AGC GAG CTG GAG GCT 2494 Ala Leu Gln Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Leu Glu Ala 740 745 750 ATG TGC CGC GAT TGG CCA TTC TTC TCG ACG CGT CTC GGC ATG CTG GAG 2542 Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu 755 760 765 ATG GTC TTC GCC AAA GCA GAC CTG TGG CTG GCG GAA TAC TAT GAC CAA 2590 Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gln 770 775 780 CGC CTG GTA GAC AAA GCA CTG TGG CCG TTA GGT AAA GAG TTA CGC AAC 2638 Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn 785 790 795 800 CTG CAA GAA GAA GAC ATC AAA GTG GTG CTG GCG ATT GCC AAC GAT TCC 2686 Leu Gln Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala Asn Asp Ser 805 810 815 CAT CTG ATG GCC GAT CTG CCG TGG ATT GCA GAG TCT ATT CAG CTA CGG 2734 His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gln Leu Arg 820 825 830 AAT ATT TAC ACC GAC CCG CTG AAC GTA TTG CAG GCC GAG TTG CTG CAC 2782 Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gln Ala Glu Leu Leu His 835 840 845 CGC TCC CGC CAG GCA GAA AAA GAA GGC CAG GAA CCG GAT CCT CGC GTC 2830 Arg Ser Arg Gln Ala Glu Lys Glu Gly Gln Glu Pro Asp Pro Arg Val 850 855 860 GAA CAA GCG TTA ATG GTC ACT ATT GCC GGG ATT GCG GCA GGT ATG CGT 2878 Glu Gln Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg 865 870 875 880 AAT ACC GGC TAATCTTCCT CTTCTGCAAA CCCTCGTGCT TTTGCGCGAG 2927 Asn Thr Gly GGTTTTCTGA AATACTTCTG TTCTAACACC CTCGTTTTCA ATATATTTCT GTCTGCATTT 2987 TATTCAAATT CTGAATATAC CTTCAGATAT CCTTAAGGAA TTGTCGTTAC ATTCGGCGAT 3047 ATTTTTTCAA GACAGGTTCT TACTATGCAT TCCACAGAAG TCCAGGCTAA ACCTCTTTT 3106
【０１１３】配列番号：２ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23
【０１１４】配列番号：３ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21
【０１１５】配列番号：４ 配列の長さ：1643 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ATCC13869 配列の特徴：mat peptide 存在位置：217..1482 特徴を決定した方法：S 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234 Met Ala Leu Val Val Gln 1 5 AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val 10 15 20 GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val 25 30 35 GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala 40 45 50 GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu 55 60 65 70 ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu 75 80 85 TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val 90 95 100 CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro 105 110 115 GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala 120 125 130 GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly 135 140 145 150 CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn 155 160 165 GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala 170 175 180 GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe 185 190 195 GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu 200 205 210 CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg 215 220 225 230 TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu 235 240 245 GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys 250 255 260 TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050 Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu 265 270 275 GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp 280 285 290 ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile 295 300 305 310 ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194 Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu 315 320 325 AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp 330 335 340 CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290 Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro 345 350 355 GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn 360 365 370 ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg 375 380 385 390 GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln 395 400 405 CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 410 415 420 421 AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643
cum) 株名：ATCC13869 配列の特徴：mat peptide 存在位置：217..1482 特徴を決定した方法：S 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234 Met Ala Leu Val Val Gln 1 5 AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val 10 15 20 GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val 25 30 35 GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala 40 45 50 GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu 55 60 65 70 ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu 75 80 85 TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val 90 95 100 CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro 105 110 115 GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala 120 125 130 GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly 135 140 145 150 CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn 155 160 165 GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala 170 175 180 GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe 185 190 195 GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu 200 205 210 CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg 215 220 225 230 TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu 235 240 245 GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys 250 255 260 TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050 Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu 265 270 275 GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp 280 285 290 ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile 295 300 305 310 ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194 Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu 315 320 325 AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp 330 335 340 CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290 Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro 345 350 355 GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn 360 365 370 ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg 375 380 385 390 GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434 Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln 395 400 405 CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482 Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 410 415 420 421 AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643
【０１１６】配列番号：５ 配列の長さ：1643 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：コリネハ゛クテリウム ク゛ルタミカム(Corynebacterium glutami
cum) 株名：ATCC13869 配列の特徴：mat peptide 存在位置：964..1482 特徴を決定した方法：S 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu 1 5 10 15 GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala 20 25 30 AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val 35 40 45 CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe 50 55 60 ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys 65 70 75 CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val 80 85 90 95 GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val 100 105 110 ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu 115 120 125 TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp 130 135 140 GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly 145 150 155 GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 160 165 170 172 AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643
cum) 株名：ATCC13869 配列の特徴：mat peptide 存在位置：964..1482 特徴を決定した方法：S 配列 TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu 1 5 10 15 GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala 20 25 30 AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val 35 40 45 CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe 50 55 60 ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys 65 70 75 CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val 80 85 90 95 GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val 100 105 110 ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu 115 120 125 TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp 130 135 140 GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly 145 150 155 GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 160 165 170 172 AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643
【０１１７】
【図１】 ３−ブロモピルビン酸による生育阻害を示す
図。
図。
【図２】 アスパラギン酸−β−ヒドラジドによる生育
阻害を示す図。
阻害を示す図。
【図３】 ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン
酸による生育阻害を示す図。
酸による生育阻害を示す図。
【図４】 ３−ブロモピルビン酸に対する阻害回復物質
の効果を示す図。
の効果を示す図。
【図５】 アスパラギン酸−β−ヒドラジドに対する阻
害回復物質の効果を示す図。
害回復物質の効果を示す図。
【図６】 ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン
酸に対する阻害回復物質の効果を示す図。
酸に対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図７】 生育に与える生育回復因子の影響。
【図８】 生育阻害物質のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ活性に対する阻害を示す図。
ルボキシラーゼ活性に対する阻害を示す図。
【図９】 本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。
シラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。
【図１０】 本発明のホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。
キシラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:185） Ｃ１２Ｒ 1:185）
Claims (12)
- 【請求項１】 エシェリヒア属に属する微生物由来のホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおいて、ホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギ
ン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する
ことを特徴とする変異型ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼ。 - 【請求項２】 エシェリヒア属に属する微生物の細胞内
に存在させたときに、下記性質を有する化合物に対する
耐性を細胞に付与することを特徴とする請求項１記載の
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；前
記微生物の野生株に対して生育阻害作用を示し、 前記生育阻害作用はＬ−グルタミン酸又はＬ−アスパラ
ギン酸の存在によって回復され、かつ、 野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性
を阻害する。 - 【請求項３】 前記化合物が、３−ブロモピルビン酸、
アスパラギン酸−β−ヒドラジド、ＤＬ−スレオ−β−
ヒドロキシアスパラギン酸から選ばれることを特徴とす
る請求項２記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼ。 - 【請求項４】 前記変異が、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼのＮ−末端から６２５番目のグルタミ
ン酸をリジンに置換させる変異であることを特徴とする
請求項１記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ。 - 【請求項５】 前記変異が、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼのＮ−末端から２２２番目のアルギニ
ンをヒスチジンに、２２３番目のグルタミン酸をリジン
に各々置換させる変異であることを特徴とする請求項１
記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ。 - 【請求項６】 前記変異が、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼのＮ−末端から２８８番目のセリンを
フェニルアラニンに、２８９番目のグルタミン酸をリジ
ンに、５５１番目のメチオニンをイソロイシンに、８０
４番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異で
あることを特徴とする請求項１記載の変異型ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ。 - 【請求項７】 前記変異が、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼのＮ−末端から８６７番目のアラニン
をスレオニンに置換させる変異であることを特徴とする
請求項１記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項に記載の変
異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコー
ドするＤＮＡ断片。 - 【請求項９】 請求項８記載のＤＮＡ断片が染色体ＤＮ
Ａ内に組み込まれて形質転換されたエシェリヒア属また
はコリネホルム細菌に属する微生物。 - 【請求項１０】 請求項８記載のＤＮＡ断片とエシェリ
ヒア属細菌またはコリネホルム細菌の細胞内で自律複製
可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の組換えＤＮＡで形質
転換されたエシェリヒア属またはコリネホルム細菌に属
する微生物。 - 【請求項１２】 請求項９又は１１に記載の微生物を好
適な培地で培養し、この培地からＬ−リジン、Ｌ−スレ
オニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グル
タミン酸、Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンから選ばれ
るアミノ酸を分離することを特徴とするアミノ酸の製造
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19677894A JP3680324B2 (ja) | 1993-08-24 | 1994-08-22 | 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20977693 | 1993-08-24 | ||
| JP5-209776 | 1993-08-24 | ||
| JP6-153876 | 1994-07-05 | ||
| JP15387694 | 1994-07-05 | ||
| JP19677894A JP3680324B2 (ja) | 1993-08-24 | 1994-08-22 | 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870860A true JPH0870860A (ja) | 1996-03-19 |
| JP3680324B2 JP3680324B2 (ja) | 2005-08-10 |
Family
ID=27320551
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| JP19677894A Expired - Fee Related JP3680324B2 (ja) | 1993-08-24 | 1994-08-22 | 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3680324B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007532114A (ja) * | 2004-04-09 | 2007-11-15 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | バチルスにおけるｐｃｋＡ修飾および増強されたタンパク質発現 |
| WO2020208842A1 (ja) | 2019-04-12 | 2020-10-15 | Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 株式会社 | 遺伝子組換え微生物及びこれを用いた目的物質の生産方法 |
-
1994
- 1994-08-22 JP JP19677894A patent/JP3680324B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007532114A (ja) * | 2004-04-09 | 2007-11-15 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | バチルスにおけるｐｃｋＡ修飾および増強されたタンパク質発現 |
| WO2020208842A1 (ja) | 2019-04-12 | 2020-10-15 | Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 株式会社 | 遺伝子組換え微生物及びこれを用いた目的物質の生産方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3680324B2 (ja) | 2005-08-10 |
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