JPH08501455A - Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属の細菌の検出のための核酸プローブおよび在郷軍人病の病因物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Legionella sp.、L.pneumophi1a、L.micdadei、L.pneumophila亜種またはLegionella亜種の１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする核酸配列を調べた。これらの生物は、レジオネア病、ポンティアック熱、ピッツバーグ肺炎及び他の感染症の原因物質である。核酸はこれらの病原体の検出に有効である。これらの配列に基づいたプローブ及びこのプローブを含むキットもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ＬＥＧＩＯＮＥＬＬＡ属の細菌の検出のための核酸プローブおよび在郷軍人病の 病因物質の検出方法 本発明は、在郷軍人病（Legionnaire's disease）、ポンティアック熱（Ponti ac fever）、ピッツバーグ肺炎（Pittsburgh pneumonia）および数種の他の疾病 に関与すると考えられているLegionella sp.を含む病原体の検出のための核酸、 プローブ、キット及び方法に関するものである。発明の背景 Legionellaは、１９７６年にペンシルベニア州フィラデルフィアでの米国在郷 軍人会の公式定期大会で大量発症し、２９名の死者を出した（在郷軍人病と呼ば れる）肺炎の１８２の症例から初めて発見された。現在L.pneumophilaの血清型 １として知られるものは、初めはリケッチア分離の為の標準的な方法で分離され 、後に呼吸系の合併症のない不定型の肺炎の型である在郷軍人病の原因物質であ ることが示された。最初の症例以来、Legionellaはポンティアック熱およびピッ ツバーグ肺炎と関連づけられた。ポンティアック熱はL.pneumophilaによって引 き起こされる非肺炎性、熱性、自己限定性の疾患である。ピッツバーグ肺炎は、 L.micdadeiによって引き起こされる肺性レジオネラ症である。 Legionellaはグラム陰性、好気性、細胞内侵入性の、淡水の給水（蒸発冷却機 、冷却塔、飲料水を含む）中に特に遍在することが見い出された寄生性の細菌で ある。Legionellaは、汚染された水を吸入した時に発症し、しばしば流行性また は複合性の症例を起こすと信じられている。社会が関与するケースに加え、Legi onellaは病院内感染の主な原因であるかも知れない。入院の他に、宿主の危険因 子として、喫煙、高齢、慢性肺疾患および免疫抑制がある。 Legionellaceae科は、２９種、２１血清型、及び５つの仮に名付けた種を含む 単一のLegionella属を含む。ＤＮＡホモロジーの研究によれば、L.micdadeiはL. pneumophilaと最も離れた種であり、L.micdadeiはTatlockia属に分類するのが適 当であると主張する者がいる。 在郷軍人病の主要な原因であるL.pneumophilaは、ヒトから最もよく分離され るものである。この細菌は正常なヒトの微生物叢には存在しないと考えられてい るため、ヒトの臨床試料におけるLegionellaの存在は常に臨床的に明白な情報を 提供する。 Legionellaは培養の難しい成長の遅い生物である。従って、実験室におけるL. pneumophilaの分離は困難で時間のかかるものである。疾患が重篤であり、間違 いのない抗生物質を処方する必要がある場合、医師はこれらの生物の存在を迅速 かつ正確に診断することが望ましい。現在のLegionellaの検出方法としては、（ ａ）培養；（ｂ）直接蛍光抗体（ＤＦＡ）；（ｃ）培養確認の為の核酸プローブ ；及び（ｄ）血清学（ＩＦＡ）がある。血清学は現時点において最も高感度かつ 特異的な試験法である。しかしながら、抗体が感染後数年間血清中に存在する可 能性があるという制限がある。 Legionella ｒＲＮＡに基づいたある種のプローブが、１９８８年６月２日発 行、出願人：Gen-Probe、発明者：Hogan他のＷＯ８８／０３９５７号“非ウイル ス性生物の検出及び／または定量の為の核酸プローブ”に開示されている。しか しながらこの出願は、Legionella菌を非Legionella菌と区別するために用いるこ とのできる３つの異なるプローブの混合物を開示したものである。単独で使用す るのに適したプローブは報告されていない。単独または２つひと組みで用いる時 にLegionellaの関与する様々な診断アッセイに使用できるプローブが望まれてい る。発明の説明 本発明の１つの目的は、LegionellaのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の独特な 核酸配列に相補的で、単独またはペアで使用できる核酸を提供することである。 本発明の目的は更に、（１）L.pneumophilaと他のLegionellaを特異的に識別す る；（２）L.pneumophi1a、Legionellaの他の種（Legionellaクラスター）、お よび他の細菌を含む細菌のグループを特異的に識別する；（３）L.micdadeiと他 のLegionellaを特異的に識別する；あるいは（４）Legionellaと他の属を特異的 に識別するプローブを提供することである。 細菌のリボソームには３種の異なるＲＮＡ分子があり、少なくとも大腸菌にお いては、５Ｓ、１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡと呼ばれている。真核生物では、一 般に５Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓおよび５．８Ｓと呼ばれる４種の異なるｒＲＮＡがあ る。これらの名前は、歴史的に、沈降速度で決定されるＲＮＡ分子の大きさに関 連している。しかしながら実際には、ｒＲＮＡ分子の大きさは生物によって異な っている。それにもかかわらず、５Ｓ、１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡは、Legionel laを含むどの細菌のｒＲＮＡ分子にも用いられる、当該技術分野で認知された名 前であり、本明細書においてもこの慣用法を使用する。 本発明のプローブは、Legionella属の様々な生物の１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮ Ａ分子を標的とする。図面の説明 図１はサンドイッチ法の図である。 本出願及び請求の範囲を通して用いられる場合、“プローブ”の語は、合成ま たは生物学的に製造される、１０から２５０塩基対の長さの核酸を指し、これは 設計または選択によって、予め決められた条件下で標的核酸配列と特異的及び優 先的にハイブリダイズしうる特異的なヌクレオチド配列を有し、さらに、場合に より検出の為の、またはアッセイの性能を上げる為の部分を有する。最小限度の １０ヌクレオチドは、統計的に特異性を有し、安定なハイブリダイゼーション生 産物を形成する為に一般に必要であり、最大限度の２５０ヌクレオチドは、一般 に不適合配列を決定し、優先的なハイブリダイゼーションを行なうために反応パ ラメーターを調整できる配列の上限を示す。従って、一般に、好ましいプローブ の長さは１０から２５０ヌクレオチドの間であろう。プローブは、ある特定のア ッセイ条件下で有効にまたは最適に機能するために適する成分を場合によって含 有してもよい。例えば、（エンドキャッピング等により）核酸分解酵素による分 解に対する抵抗性を改良する為、（フルオレセイン、３２Ｐ、ビオチン等のよう な）検出リガンドをつける為、あるいは固体の支持体への捕捉を容易にする（例 えばポリ−デオキシアデノシンの“テール”をつける）為にプローブを修飾して もよい。 “優先的なハイブリダイゼーション”または“優先的にハイブリダイズする” とは、所望の標的核酸とのハイブリダイゼーションの結果、同一の条件で非標的 核酸とのハイブリダイゼーションにより生じるどのハイブリダイゼーション反応 生産物よりもより安定なハイブリダイゼーション反応生産物が生じることを意味 する。ハイブリダイゼーション反応生産物の安定性を比較し、どちらがより安定 かを評価する、すなわちどちらが“優先的に”結合しているかを決定するのは通 常の技術者の能力の範囲内である。 ここで用いる場合、“ホモロジー”及び“相同である”の語は、２個またはそ れ以上の核酸配列間の類似の度合を指すことを意味し、生物間の分類学的な類似 度合を意味するものではない。類似の度合はパーセンテージで表わし、例えば２ 個の配列間が９０％ホモロジーであるとは、第１の配列の塩基の９０％が第２の の配列の塩基に等しくマッチすることを意味する。 “Legionellaクラスター”とはLegionella属の少なくとも２個の構成員子を意 味する。Legionellaクラスターを同定するプローブは典型的には（全てのLegion ellaではないが）調べたLegionella種の複数のｒＲＮＡにハイブリダイズするで あろう。 “L.pneumophilaクラスター”の語は、L.pneumophila種の少なくとも２個の菌 株を意味する。L.pneumophilaクラスターを同定するプローブは典型的には（全 てのL.pneumophilaではないが）調べたL.pneumophila菌株の複数のｒＲＮＡにハ イブリダイズするであろう。 “特異的”とは、ヌクレオチド配列が予め決められた標的配列にハイブリダイ ズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしないことを意味する。 “特異的に識別する”とは、プローブが予め決められた標的配列に実質的にハ ィブリダイズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしないことを意味する 。 “ハイブリダイゼーション”は、予め決められた反応条件下で、核酸の２本の 部分的にもしくは完全に相補的な鎖が逆平行になるように並び、特異的かつ安定 な水素結合で核酸の２本鎖を形成する、核酸の塩基が互いに対になるという明白 な規則に従って行われる過程である。 “実質的なハイブリダイゼーション”とは、観察されるハイブリダイゼーショ ンの度合が臨床的な状態において陽性の結果と考えられるようなものを意味する 。“バックグラウンドノイズ”と考えられるデータは実質的なハイブリダイゼー ションではない。 “ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”とは、約０．９モルのNa Clの塩溶液中で約３５℃から６５℃の条件を意味する。ストリンジェンシーはま たハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及びタイプ、存在す る変性剤のタイプ及び濃度、およびハイブリダイゼーション時の温度のような反 応パラメーターによって左右されるかも知れない。一般にハイブリダイゼーショ ン条件がよりストリンジェントになると、安定なハイブリッドが形成されるため にはより長いプローブが好ましくなる。一般に、ハイブリダイゼーションが行な われる条件のストリンジェンシーによって、用いられるべき好ましいプローブの 性質が決められるだろう。当業者はそのような関係をよく理解しており、たやす く操作し得る。 “Legionella sp.”とは、種にかかわらず、Legionella属のいずれのメンバ ーをも指す。 本発明によれば、１）レジュネラ・ニューモフィラ、２）レジュネラ・ミクダ デイ、３）レジュネラクラスター、もしくは４）レジュネラ・ニューモフィラク ラスター、または５）レジュネラ属のすべての種よりなる群から選ばれる標的生 物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする、約１０−２５０ヌ クレオチドを含む核酸が提供される。本発明の核酸は、これらと同じハイブリダ イゼーション条件下で被験試料中に存在する可能性のある非標的生物または宿主 もしくは周囲のマトリックスのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに実質的にハイブリダイ ズすることはない。レジュネラ・ニューモフィラとレジュネラ属の他の種とを特 異的に識別するプローブは、在郷軍人病またはポンティアック熱の診断に有用で ある。レジュネラ・ミクダデイとレジュネラ属の他の種とを特異的に識別するプ ローブは、ピッツバーグ肺炎の診断に有用である。レジュネラクラスターに特異 的にハイブリダイズするプローブは、細菌の個々のクラスターを構成する１また は２以上の生物の存在の検出に有用である。レジュネラ属細菌と非レジュネラ属 細菌の構成員子を特異的に識別するプローブは、レジュネラ属に属する１または ２以上の生物の存否を検出するのに有用である。レジュネラ・ニューモフィラク ラスターに特異的にハイブリダイズするプローブは、レジュネラ・ニューモフィ ラのどの菌株（血清型）が存在するかを判定するのに有用である。上記ヌクレオ チドの少なくとも１０個の連続した核酸に対して相補的であるか、またはそれと 少なくとも９０％相同であるプローブも、本発明の他の観点をなす。 本発明の核酸およびプローブの１態様は、１）レジュネラ・ニューモフィラ、 ２）レジュネラ・ミクダデイ、３）レジュネラクラスター、４）レジュネラ・ニ ューモフィラクラスター、または５）レジュネラ属のすべての種のうちいずれか の１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの領域に対して相補的であるか、それと少な くとも９０％相同であるか、またはそれと優先的にハイブリダイズするものであ る。特に重要な１６Ｓ ｒＲＮＡの領域には、下記に示すものが含まれる。これ らの領域の番号は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒＲＮＡの表示に用いた番号を参照し たものである。 レジュネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ 位置６０−１１０，１１０ ５−１１６５および１２５０−１３１５； レジュネラ・ミクダデイ１６Ｓ ｒＲＮＡ 位置６０−１１０，および８１ ５−８７５； レジュネラｓｐ．１６Ｓ ｒＲＮＡ 位置２０５−２５５，４２５−４７５ ，７１５−７６５，および８４５−８９５（レジュネラクラスタープローブにつ いて）； レジュネラｓｐ．１２０−１７５，および８００−８７０（レジュネラ属プ ローブについて）。 本発明の他の態様には、１）レジュネラ・ニューモフィラクラスター、２）レ ジュネラ・ミクダデイ、３）レジュネラクラスター、または４）レジュネラ属の すべての種のうちいずれかの２３Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの領域に対して相 補的であるか、それと少なくとも９０％相同であるか、またはそれと優先的にハ イブリダイズする核酸およびプローブが含まれる。特に重要な２３Ｓ ｒＲＮＡ の領域には、下記のものが含まれる。 レジュネラ・ミクダデイ２３Ｓ ｒＲＮＡ 位置２８５−３３５，１１９５ −１２４５，１４８５−１５６５，および１７０５−１７５５； レジュネラｓｐ．２３Ｓ ｒＲＮＡ 位置２８５−３３５，１４８５−１５ ６０，および１７０５−１７５５（レジュネラクラスタープローブについて）； レジュネラｓｐ．２３Ｓ ｒＲＮＡ 位置１５６５−１６１５，および２２ ７０−２３１０（レジュネラ属プローブについて）。 好ましくは核酸組成物は、下記よりなるプローブ群により定められる配列群か ら選ばれる配列内のいずれか１０個の連続したヌクレオチドよりなる配列のうち 少なくとも９０％に対して相補的であるか、またはそれと相同である： ２７０１，２７０３，２７０４，２７０５，２６９７，２６９０，２６９８， ２６９５，２６９６，２６９３，２７０８，２６９９，２９２４，２９２６， ２９３０，２９３２，２９５６，２９５８，２９６３，２９６８，２９２８， ２９５７，２９２７，２９２９，２９５４，２９５５，および ２９５９。 これらのプローブの配列は後記に提示される。 本発明のさらに他の態様には、１）レジュネラ・ニューモフィラ、２）レジュ ネラ・ミクダデイ、３）レジュネラクラスター、４）レジュネラ・ニューモフィ ラクラスター、または５）レジュネラ属のいずれかの種のうちいずれかを検出す るためのキットが含まれる。このキットは、少なくとも２種類の核酸よりなる１ 組の核酸を含む。それぞれの核酸は長さ１０−２５０ヌクレオチドであり、異な る塩基配列組成のものである。それぞれの核酸は、下記プローブにより定められ る配列群から選ばれるいずれか１０個の連続したヌクレオチドよりなる配列のう ち少なくとも９０％に対して相補的であるか、またはそれと相同である： ２７０１，２７０３，２７０４，２７０５，２６９７，２６９０，２６９８， ２６９５，２６９６，２６９３，２７０８，２６９９，２９２４，２９２６， ２９３０，２９３２，２９５６，２９５８，２９６３，２９６８，２９２８， ２９５７，２９２７，２９２９，２９５４，２９５５，および ２９５９。 レジュネラの検出に特に適した１組の核酸は、２プローブサンドイッチアッセイ である。このキットはさらに試薬、組成物、指示書、使い捨て器具、および簡便 なアセンブリーで市販しうるパッケージを含む。 本発明のさらに他の態様には、１）レジュネラ・ニューモフィラ、２）レジュ ネラ・ミクダデイ、３）レジュネラクラスター、４）レジュネラ・ニューモフィ ラクラスター、または５）レジュネラ属のいずれかの種の存在を検出するための 方法が含まれる。この方法は、標的を含有する疑いのある試料を少なくとも１種 類の核酸と接触させる工程を含む。この核酸は、１）レジュネラ・ニューモフィ ラ、２）レジュネラ・ミクダデイ、３）レジュネラクラスター、４）レジュネラ ・ニューモフィラクラスター、または５）レジュネラ属のいずれかの種のｒＲＮ ＡまたはｒＤＮＡと優先的にハイブリダイズする約１０−２５０ヌクレオチドを 含む。本方法は、核酸が標的ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的に結合して核酸コ ンプレックスを形成するハイブリダイゼーション条件を試料に付与し、そして標 的生物（１または２以上）の存在を指示するものとしてコンプレックスを検出す る工程を含む。好ましくは本発明の核酸は、下記プローブにより定められる配列 よりなる群から選ばれるいずれか１０個の連続したヌクレオチドよりなる配列に 対して少なくとも９０％相同である： ２７０１，２７０３，２７０４，２７０５，２６９７，２６９０，２６９８， ２６９５，２６９６，２６９３，２７０８，２６９９，２９２４，２９２６， ２９３０，２９３２，２９５６，２９５８，２９６３，２９６８，２９２８， ２９５７，２９２７，２９２９，２９５４，２９５５，および ２９５９。 本発明のプローブは、環境試料、たとえば水試料、および臨床試料、たとえば ヒトまたは動物被験体からの喀痰、咽喉スワブ、血液、尿、脳脊髄液、皮膚、生 検材料、唾液、滑液、気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｗａｓｈ，ｂｒｏｎ ｃｈｉａｌ ｌａｖａｇｅ）、または他の組織試料中の在郷軍人病またはその病 因物質の特異的検出のための核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法の開発の基 礎を提供する。本発明のプローブは、１）レジュネラ・ニューモフィラ、２）レ ジュネラ・ミクダデイ、３）レジュネラ・ニューモフィラクラスター、４）レジ ュネラ・ニューモフィラクラスター、または５）レジュネラ属のすべての種の存 在を確認するための基礎をも提供する。 本発明のプローブの開発に際して最初にとられた段階は、目的とする感受性を 備えた特異的核酸プローブに対して標的として作用する可能性のある１６Ｓまた は２３Ｓ ｒＲＮＡ領域を同定することであった。これには、どのプローブ標的 部位がレジュネラ・ニューモフィラおよびレジュネラ・ミクダデイにユニークで あるかを見出し、かつレジュネラ属に共通なプローブ部位を見出すことが含まれ ていた。 上記の分析を行うために、レジュネラ属１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の 正確な配列様式を明らかにした。レジュネラ・ニューモフィラおよびレジュネラ ・ミクダデイ双方の本質的に完全な１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列が、標準 的な実験室プロトコルにより決定された。こうして得られたｒＤＮＡを酵素増幅 法（たとえばワイスバーグ（Weissburg），1991,J.Bacteriol.173:697-703に記 載されたもの，これを本明細書に参考として引用する）により産生された生成物 に由来するプラスミドベクター中へクローニングした。レジュネラ・ニューモフ ィラおよびレジュネラ・ミクダデイの配列を他のレジュネラおよび非レジュネラ ｒＲＮＡ配列の相同配列と対比した。 決定されたレジュネラ・ニューモフィラおよびレジュネラ・ミクダデイの１６ Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に基づいて、種々のプローブを設計および合成し た。これらのプローブの特異的挙動は、それらを用いるアッセイ形式に著しく依 存する。逆にアッセイ形式は個々のプローブの特定の最適特色を指示するであろ う。 不都合なほどの交差反応性を生じることなく、１）レジュネラ・ニューモフィ ラ、２）レジュネラ・ミクダデイ、３）レジュネラクラスター、４）レジュネラ ・ニューモフィラクラスター、または５）レジュネラ属のいずれかの種に対して 本発明の異例な包括性および排他性を備えた単一プローブまたはプローブ対を形 成しうるという知見は、予想および予期できないものであった。さらに、標的生 物に対して診断アッセイに有用であるのに十分なハイブリダイゼーション能力お よび選択性を備えた単一プローブが得られるという知見も、予期できないもので あった。 第１群の好ましいプローブはレジュネラ・ニューモフィラとレジュネラ属の他 の種とを識別することができ、試料中のレジュネラ・ニューモフィラの存在を判 定するのに有用である。これらのプローブはレジュネラ・ニューモフィラのみに 優先的にハイブリダイズし、プローブ２７０４、２７０５、２７０８および２６ ９０と呼ばれる。プローブ２９５７は若干弱いハイブリダイゼーションシグナル を生じるが、レジュネラ・ニューモフィラに対して特異的である。同様に２プロ ーブ２９２９および２９５４が挙げられる。これらは試験したレジュネラ・ニュ ーモフィラの幾つかの菌株に優先的にハイブリダイズするにすぎないが、それら は他の生物には実質的にハイブリダイズしない。以下“レジュネラ・ニューモフ ィラクラスター”プローブと呼ばれるこれら２プローブは、特定の菌株および／ または血清型の判定に有用である。 レジュネラ・ニューモフィラ16S rRNAプローブ レジュネラ・ニューモフィラ プローブ 2704(31mer 48% G+C)配列番号(SEQ ID NO:1) 5'-TCG CCA TCT GTC TAG CAA GCT AGA CAA TGC T-3' レジュネラ・ニューモフィラ プローブ 2705(30mer 50% G+C)配列番号(SEQ ID NO:2) 5'-ACT TTT AAG GAT TTG CTC CAG GTC GCC CCT-3' レジュネラ・ニューモフィラ プローブ 2708(31mer 45% G+C)配列番号(SEQ ID NO:3) 5'-ACT ACG ACC GAC TTT TAA GGA TTT GCT CCA G-3' レジュネラ・ニューモフィラ プローブ 2690(36mer 50% G+C)配列番号(SEQ ID NO:4) 5'-TAG AGT CCC CAC CAT CAC ATG CTG GCA ACT AAG GAT-3' レジュネラ・ニューモフィラ23S rRNAプローブ レジュネラ・ニューモフィラ プローブ 2957(36mer 42% G+C)配列番号(SEQ ID NO:5) 5'-TCA ATG ACT TCT CTA TAC CAA AAG GGT CAG AAC CAC-3' レジユネラ・ニューモフィラクラスター 23S rRNAプローブ レジュネラ・ニューモフィラクラスター プローブ 2929(31mer 42% G+C)配列番 号(SEQ ID NO:6) 5'-CTC TAT CGC CAA CTT TCC CAA ATT GTT CTA C-3' レジュネラ・ニューモフィラクラスター プローブ 2954(31mer 48% G+C)配列番 号（SEQID NO:7） 5'-GCA CCT CAG AGT TAT GGA AAA CCG GAT TTG C-3' 第２群の好ましいプローブはレジュネラ・ミクダデイに優先的にハイブリダイ ズするので、これらのプローブはレジュネラ・ミクダデイと実質的にレジュネラ 属の他のすべての種とを識別することができる。それらは試料中のレジュネラ・ ミクダデイの存在を判定するのに有用であり、プローブ２６９９、２７０３、２ ９３２、２９５６、２９５８、２９６３および２９６８と表示される。 プローブ２７０３は、レジュネラ・ミクダデイおよびレジュネラ・デュモフィ （Ｌ．ｄｕｍｏｆｆｉ）にハイブリダイズするが、レジュネラ属の他のいずれの 種にもハイブリダイズせず、これらの微生物の一方または両方の存在を検出する ために用いることができる。 レジュネラ・ミクダデイ16S rRNAプローブ レジュネラ・ミクダデイ プローヨ 2699(34mer 41% G+C)配列番号(SEQ ID NO:8 ) 5'-TTC GTC ACT AAC CTC ATT CAT AAG GCC AAC AAC T-3' レジュネラ・ミクダデイ23S rRNAプローブ レジュネラ・ミクダデイ プローブ 2932(31mer 48% G+C)配列番号(SEQ ID NO:9 ) 5'-CTG TAT CGT GGT ACT TCC CAG AAC CTT CTA C-3' レジュネラ・ミクダデイ プローブ 2956(30mer 57% G+C)配列番号(SEQ ID NO:1 0) 5'-GCC CAC CTC TCA GTG AAC CTT CTT CAG CCT-3' レジュネラ・ミクダデイ プローブ 2958(32mer 59% G+C)配列番号(SEQ ID NO:1 1) 5'-GCA CCT CAG CCT TAA CAA GGG GCC GGA TTT GC-3' L.micdadei プローブ 2963(32mer 44% G+C)配列番号(SEQ ID NO:12) 5'-CCT CTT CAG CTC ATT AAG CAT GTC AAT TCA CC-3' L.micdadei プローブ 2968(37mer 47% G+C)配列番号(SEQ ID NO:13) 5'-TCA ATG ACT TCT CCG CAC ACC GTA GTG TCA GAA CCA C-3' L.micdadeiおよびL.dumoffi １６Ｓ ｒＲＮＡプローブ L.micdadeiおよびL.dumoffi プローブ 2703(31mer 52% G+C）配列番号(SEQ ID NO:14 )5'-TCG CCA CCC ATC TAG TAA ACT AGA CCG TGC T-3' 好ましいプローブの第３の群は、他の細菌と比較してLegionella種のクラスタ ーと優先的にハイブリダイズする。これらのプローブは各種のLegionella細菌間 および株間での区別をするのに有用である。 プローブ２６９７はすべてのL.pneumophilaおよび３つの他のLegionella種とハ イブリダイズする。 プローブ２６９８は弱くハイブリダイズするL.bozemaniiを除くすべてのLegio nellaと優先的にハイブリダイズする。いくつかの本質的でないハイブリダイゼ ーションがEnterobacter agglomeransおよびCoxiella burnetiiとで観察された 。 プローブ２６９３はL.micdadeiを除くすべてのLegionella種とハイブリダイズ した。Acholeplasma Iaidlawiiとのハイブリダイゼーションがいくらか観察され たが、これは実験操作の誤りによるものであると思われるので、この観察は決 定的なものではない。このプローブはPseudomonas aeruginosaともハイブリダイ ズし、Actinobacillus actinomycetamcomitansおよびAlteromonas putrefaciens 、Coxiella burnetiiおよびWolbachia persicaとの少量のハイブリダイゼーショ ンが観察された。 プローブ２９２８はすべてのLegionella種とハイブリダイズし、またいくつか の他の細菌種、すなわちHafnia alvei、Morganella morganii、Proteus mirabil is、Providencia alcafifaciens、Serratia marcescens、Yersinia enterocolit ica、Y.pseudotuberculosisおよびFrancisella tularensisとハイブリダイズす る。Edwardsiella tardaおよびEnterobacter agglomeransとの弱いハイブリダイ ゼーションが観察された。 プローブ２９２７はすべてのLegione11a、ならびにAcinetobacter calcoaceti cus、Aeromonas sobria、Edwardsiella tarda、Vibrio parahaemolyticus、Yers inia enterocoliticaおよびY.pseudotuberculosisとハイブリダイズする。より 少ないハイブリダイゼーションがHafnia a1vei、Proteus mirabiIis、Providenc ia alcalifaciens、Serratia marcescensおよびMycoplasma hominisとの間で観 察される。さらに少ないハイブリダイゼーションがPlesiomonas shige11oides、 Salmonella typhimuriumおよびCornebacterium glutamicumとで観察される。 プローブ２９５５はすべてのLegionellaとハイブリダイズする（ただしL.micd adeiおよびL.bozemaniiとは十分ハイブリダイズしない）。また、このプローブ はNeisseriae gonorrhoeaeともハイブリダイズし、さらにN.meningitidisとはる かに少なくハイブリダイズする。 プローブ２４９４は各種のLegionella種と優先的にハイブリダイズするが、非 Legionella種とはハイブリダイズしない。 プローブ２９５９はL.pneumophila株群およびL.dumoffii（そしてL.gormanii とも弱く）ハイブリダイズする。 Legionellaクラスター１６Ｓ ｒＲＮＡプローブ Legionella クラスター プローブ 2697(33mer 48% G+C)配列番号(SEQ ID NO:15 ) 5'-TTT CCC CAA GTT GTC CCC CTC TTC AAG GCA TAT-3' Legionella クラスター プローブ 2698(33mer 48% G+C)配列番号(SEQ ID NO:16 ) 5'-TCT TAA CCT ATC AAC CCT CCT CCC CAC TGA AAG-3' Legionella クラスター プローブ 2693(30mer 60% G+C)配列番号(SEQ ID NO:17 ) 5'-AGG CGG TCA ACT TAT CGC GTT TGC TGC GCC-3' Legionellaクラスター２３Ｓ ｒＲＮＡプローブ Legionella クラスター プローブ 2928(31mer 51% G+C)配列番号(SEQ ID NO:18 ) 5'-TAA GAC CAA CTT TCG TTC CTG CTC GAG CCG T-3' Legionella クラスター プローブ 2927(30mer 47% G+C)配列番号(SEQ ID NO:19 ) 5'-TCA GAC TCG ATT TCT CTA CGG CTC CCT TAT-3' Legionella クラスター プローブ 2955(30mer 50% G+C)配列番号(SEQ ID NO:20 ) 5'-GCA CAC TTC TCA ATG CAC CTT CAT CAG CCT-3' Legionella クラスター プローブ 2924(31mer 42% G+C)配列番号(SEQ ID NO:21 ) 5'-CAC AGT CAT CAT CAA AGT CCA GTG CAA AAC T-3' Legionella クラスター プローブ 2959(32mer 50% G+C)配列番号(SEQ ID NO:22 ) 5'-CCT CTC CAG CTC TGA AAG TAA ATC CCA TCA CC-3' 好ましいプローブの第４の群はLegionella種と非Legionella種との区別をする ことができる。これらのプローブはすべてのLegionella種と優先的にハイブリダ イズするが、非Legionella種とは実質的にハイブリダイズしない。これらをLegi onellaジーナスプローブと呼ぶ。 プローブ２６９６は、L.micdadeiを除くすべてのLegionellaとハイブリダイズ するが、弱くハイブリダイズするのみである。 Legionellaジーナス２３Ｓ ｒＲＮＡプローブ Legionella ジーナス プローブ 2926(31mer 58% G+C)配列番号(SEQ ID NO:23) 5'-TGT CCG ACC GTA CCG AGG GTA CCT TTG TGC T-3' Legionella ジーナス プローブ 2930(33mer 55% G+C)配列番号(SEQ ID NO:24) 5'-CGG TAC GGT TCT CTG TAA GTT ATG GCT AGC GGC-3' Legionellaジーナス１６Ｓ ｒＲＮＡプローブ Legionella ジーナス プローブ 2701(32mer 59% G+C)配列番号(SEQ ID NO:25) 5'-TCG GAC GCA GGC TAA TCT TAA AGC GCC AGG CC-3' Legionella ジーナス ブローブ 2696(34mer 40% G+C)配列番号(SEQ ID NO:26) 5'-TTC ATA TGG CCA ACA GCT AGT TGA CAT CGT TTA C-3' Legionella ジーナス プローブ 2695(30mer 57% G+C)配列番号(SEQ ID NO:27) 5'-TGT CAG TAT TAG GCC AGG TAG CCG CCT TCG-3' 本発明のプローブは「サンドイッチ」アッセイに用いることができる。図１に 示すように、「サンドイッチ」アッセイでは１対のプローブを同時に使用する。 「捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）」プローブ１２と命名される１つのプローブは、好ま しくは高い標的特異性をもつプローブにホモポリマー３’テールを加えることに よって作製される二官能性ヌクレオチドである。このテールは、ガラスビーズま たはフィルターディスクなどの固体表面１０上で、相補的ホモポリマー１１とハ イブリダイズする。Legionella ｒＲＮＡの場合における、捕捉プローブ１２の その標的１５へのハイブリダイゼーションは、標的１５と固体支持体１０との複 合体形成をもたらす。好ましくはある程度の特異性をもつ検出プローブ１３は、 放射能活性、蛍光、化学発光、着色またはその他の検出部分を含む実際上あらゆ る種類の検出部分１４を使用することのできる検出機構の一部を構成する。検出 プローブは、KramerおよびLizardi（Nature 339,1989：参照としてここに包含す る）が記載するように、ＲＮＡ配列として増幅可能なＱ−ベータミディバリアン ト中に組み込むことができる。 綿棒、痰、または組織などの環境試料や臨床試料は全部の核酸含量を放出する ように処理される。破砕されたLegionellaeを含むと推定される試料を、捕捉プ ローブ、検出プローブ、ならびにグアニジンイソチオシアネートなどのカオトロ ピックバッファー中においてオリゴ−デオキシチミジンであらかじめ誘導体化し ておいた磁気粒子ビーズの存在下にインキュベートする。 もしも標的分子（例えば、Legionella種ｒＲＮＡ）が存在するならば、ビーズ −捕捉プローブ−標的−検出プローブのハイブリダイゼーション複合体が形成さ れる。反応管の底部付近に磁石が存在すると、磁気粒子−ハイブリダイゼーショ ン複合体を管の側面に付着させることになり、試料マトリックス、未結合プロー ブ、およびハイブリダイズしないその他の成分を除去することができる。ビーズ −捕捉プローブ−標的−検出プローブ複合体の再水和および変性を繰り返すと、 有意にバックグラウンドを減少することができる。最終的検出はビーズを膜上に スポットして、検出プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオート ラジオグラフィーなどの適当な方法によってアッセイを行う。若しくは、検出プ ローブは増幅可能なミディバリアントプローブでありうる。 本発明をよりよく説明するために、以下の非限定的な実施例を示す。 実施例１ ドットブロット法による、プローブのハイブリダイゼーションの挙動 の分析 周知の方法によるドットブロット分析は、市販品として容易に入手可能なニト ロセルロース、ナイロンまたは他の誘導化膜のようなフィルター上に、核酸また は１群の核酸を固定化することを含んでいる。ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを そのように固定化し、続いて種々の条件下（緊縮度：ストリンジェンシー）で、 興味ある核酸配列もしくはプローブとのハイブリダイゼーションを調べることが できる。緊縮条件下では、標的配列に対する相補性が大きい核酸配列を有するプ ローブは、配列の相補性が小さいプローブに比べて、高レベルのハイブリダイゼ ーションを生じるであろう。 本発明のプローブをドットブロットで調べる。１００ナノグラムのＲＮＡをフ ェノール抽出およびトリフルオロ酢酸セシウム勾配上での遠心分離で精製し、変 性させ、そしてナイロン膜上にスポットする。オリゴヌクレオチドの５’末端に 、確立されているポリヌクレオチドキナーゼ反応によって³²Ｐ−リン成分を付加 して、プローブを放射性標識する。プローブのハイブリダイゼーションは、１０ ｍｌの６×ＳＳＰＥ，０．３％ＳＤＳ，および１０⁷ＣＰＭのプローブを用いて 、６０℃の温度で一夜行う。ハイブリダイズしなかったプローブは０．５×ＳＳ Ｃおよび０．１％ＳＤＳで６０℃，２０分間洗浄して除去する。次にこのフィル ターで−７０℃でＸ線フィルムを露光し、３時間オートラジオグラフィーの露光 をした後、ハイブリダイゼーションのシグナルの強さを調べる。 結果の概要を次に示す。 ドッドブロットアッセイのデータを下記表２に示す。この表中で、++++は最も 強いシグナルの観察を示し；+++は強いシグナルの観察を示し；++は若干弱いシ グナルが観察されたが、確かにハイブリダイゼーション陽性であることを示し； +は弱いシグナルを示し；+-は非常に弱く、実質的に存在しない、ようやく検知 できるシグナルを示し；-はシグナルが観察されないことを示す。プローブが少 なくとも一つの標的に強く結合する（++++または+++）が、第二の標的に対して は弱いハイブリダイゼーション（+または+-）しか示さないときは、当該プロー ブは、実質的に++++または+++の結果を与える標的にのみハイブリダイズすると みなされる。 ハイブリダイゼーション = 10ML 6×SSPE,0.3% SDS, 10^-7CPMプローブ,60℃一夜 洗浄 = 0.5×SSC,0.1% SDS, 60℃,20MIN 露光 = Ｘ線フィルム, -70℃, ３時間 実施例２ 二重プローブハイブリダイゼーション サンドイッチアッセイにおいては次のプローブ対を用いる： Legionella属 16S rRNA：プローブ2701＋プローブ1660（プローブ1660は現在ま でに調べられた全ての細菌種に結合する。このプローブはＰＣＴ ＷＯ90/15157 に記載されており、その内容は参照により本明細書に援用される） プローブ2695＋プローブ2696 L.pneumophila 16S rRNA：プローブ2704＋プローブ2697 プローブ2705＋プローブ2690 L.micdadei 23S rRNA：プローブ2958＋プローブ2968 プローブ2956＋プローブ2958 Legionella属 23S rRNA：プローブ2926＋プローブ2931 L.micdadei 16S rRNA：プローブ2699＋プローブ2695 各場合に、標的微生物は検出され、非標的ＤＮＡは検出されなかった。 実施例３ レジュネラ病(Legionellosis)の臨床診断 レジュネラ病の疑いのある患者のサンプルを処理してＤＮＡを得る。本発明の プローブを逆向き相補性の本発明の第二プローブと一緒に用いて、ポリメラーゼ 連鎖反応で、レジュネラのｒＲＮＡをコードするL.pneumophilaまたはL.micadei の遺伝子セグメントを酵素的に増幅する。得られた材料を続いてサンドイッチア ッセイでアッセイする。本明細書に記載したプローブ／プライマーを用いてポリ メラーゼ連鎖反応自体を非常に特異的にしてもよく、または同時出願中のUSSN35 9,158（その内容は参照により本明細書に援用される）に記載されているような プローブを用いて反応をより一般化し、そしてサンドイッチアッセイを用いて 増幅産物をL.pneumophilaとして同定してもよい。 実施例４ 細胞染色によるin situハイブリダイゼーション 本発明のプローブを細胞学的染色試薬として使用できる。痰などのサンプルを 顕微鏡スライドに載せる。固定および溶解（ライシス）の後、プローブのハイブ リダイゼーションをその場で行う。例えば、プローブ2705（L.pneumophilaの全 セロタイプにハイブリダイズする）を蛍光標識で標識して、試料の染色に用いる 。試料中にL.pneumophilaが存在すると、蛍光顕微鏡の視野に蛍光を発する小体 が観察される。 実施例５ 培養後のLegionella種の存在の確認 例えば緩衝化チャコール酵母エキス寒天プレート上または強化培養液中でLegi onellaを標準的培養工程に付した後、Legionellaの存在を試験する。一つの方法 は実施例２に記載したサンドイッチアッセイを用いることによる。純粋な培養物 は必要ない。 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 卜ポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 卜ポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：３ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 卜ポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：４ 配列の長さ：３６塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：５ 配列の長さ：３６塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：６ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：７ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 卜ポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：８ 配列の長さ：３４塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：９ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１０ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１１ 配列の長さ：３２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１２ 配列の長さ：３２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１３ 配列の長さ：３７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１４ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１５ 配列の長さ：３３塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１６ 配列の長さ：３３塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１７ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１８ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：１９ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２０ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２１ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２２ 配列の長さ：３２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２３ 配列の長さ：３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２４ 配列の長さ：３３塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２５ 配列の長さ：３２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２６ 配列の長さ：３４塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列 配列番号：２７ 配列の長さ：３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．本質的に、少なくとも１つの標的Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌の２３Ｓもしく は１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０から２ ５０ヌクレオチドからなる核酸であって、該標的Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌が： ａ） Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ細菌； ｂ） Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉ細菌； ｃ） Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａクラスター； ｄ） Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａクラスター； からなる群より選択される核酸、および任意に、検出または増強部分を含むプロ ーブ。 ２．２３Ｓ ｒＲＮＡに優先的にハイブリダイズする請求項１記載のプローブ。 ３．１６Ｓ ｒＲＮＡに優先的にハイブリダイズする請求項１記載のプローブ。 ４．プローブ２７０１、２７０３、２７０４、２７０５、２６９７、２６９０、 ２６９８、２６９５、２６９３、２７０８、２６９９、２９２４、２９２６、２ ９３０、２９３２、２９５６、２９５８、２９６３、２９６８、２９２８、２９ ５７、２９２７、２９２９、２９５４、２９５５および２９５９により定義され る配列の群より選択されるいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列に 相補的であるかまたは少なくとも９０％のホモロジーを有するプローブ。 ５．本質的に、少なくとも１つの標的Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌の２３Ｓもしく は１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０から２ ５０ヌクレオチドからなる核酸であって、該標的Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌が： ａ） Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ細菌； ｂ） Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉ細菌； ｃ） Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａクラスター； ｄ） Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａクラスター； からなる群より選択される核酸。 ６．プローブ２７０１、２７０３、２７０４、２７０５、２６９７、２６９０、 ２６９８、２６９５、２６９６、２６９３、２７０８、２６９９、２９２４、２ ９２６、２９３０、 ２９３２、２９５６、２９５８、２９６３、２９６８、２ ９２８、２９５７、２９２７、２９２９、２９５４、２９５５および２９５９に より定義される配列の群より選択されるいずれか１０個の連続したヌクレオチド を含む配列に相補的であるかまたは少なくとも９０％のホモロジーを有する核酸 。 ７．Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを含むと疑われる試料中のＬ．ｐｎｅｕｍｏｐ ｈｉｌａの存在を検出する方法であって、 ａ） 試料を、核酸がハイブリダイズしうる条件下でＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ ａのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的にハイブリダイズする１０から２５０ヌク レオチドを有する少なくとも１つの核酸組成物と接触させ； ｂ） 試料にハイブリダイゼーション条件を付与してＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ ａの存在下でハイブリダイゼーション生成物を形成させ；そして ｃ） Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの存在の指標としてハイブリダイゼーション 生成物を検出する； ことを含む方法。 ８．核酸組成物が、プローブ２７０４、２７０５、２７０８、２６９０、２９５ ７、２９２９および２９５４により定義される配列からなる群より選択されるい ずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列に相補的であるかまたは少なく とも９０％のホモロジーを有する、請求項７記載の方法。 ９．接触工程が第１の核酸および第２の核酸を含み、それぞれの核酸は異なる配 列を有し、かつ、プローブ２７０４、２７０５、２７０８、２６９０、２９５７ 、２９２９および２９５４により定義される配列からなる群より選択されるいず れか１０個の連続したヌクレオチドに相補的であるかまたは少なくとも９０％の ホモロジーを有する、請求項７記載の方法。 １０．第１の核酸および第２の核酸が、プローブセット：２７０４および２６９ ７、および２７０５および２６９０からなる群より選択される、請求項９記載の 方法。 １１．Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉを含むと疑われる試料中のＬ．ｍｉｃｄａｄｅｉの 存在を検出する方法であって、 ａ） 試料を、核酸がハイブリダイズしうる条件下でＬ．ｍｉｃｄａｄｅｉのｒ ＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的にハイブリダイズする１０から２５０ヌクレオチ ドを有する少なくとも１つの核酸組成物と接触させ； ｂ） 試料にハイブリダイゼーション条件を付与してＬ．ｍｉｃｄａｄｅｉの存 在下でハイブリダイゼーション生成物を形成させ；そして ｃ） Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉの存在の指標としてハイブリダイゼーション生成物 を検出する； ことを含む方法。 １２．核酸組成物が、プローブ２６９９、２９３２、２９５６、２９５８、２９ ６３、２９６８および２７０３により定義される配列からなる群より選択される いずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列に相補的であるかまたは少な くとも９０％のホモロジーを有する、請求項１１記載の方法。 １３．接触工程が第１の核酸および第２の核酸を含み、それぞれの核酸は異なる 配列を有し、かつ、２６９９、２９３２、２９５６、２９５８、２９６３、２９ ６８および２７０３からなる群より選択されるいずれか１０個の連続したヌクレ オチドに相補的であるかまたは少なくとも９０％のホモロジーを有する、請求項 １１記載の方法。 １４．第１の核酸および第２の核酸が、プローブセット：２９５８および２９６ ８、および２９５６および２９５８からなる群より選択される、請求項１３記載 の方法。 １５．Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａを含むと疑われる試料中のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種 の存在を検出する方法であって、 ａ） 試料を、核酸がハイブリダイズしうる条件下でＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのｒ ＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的にハイブリダイズする１０から２５０ヌクレオチ ドを有する少なくとも１つの核酸組成物と接触させ； ｂ） 試料にハイブリダイゼーション条件を付与してＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの存 在下でハイブリダイゼーション生成物を形成させ；そして ｃ） Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの存在の指標としてハイブリダイゼーション生成物 を検出する； ことを含む方法。 １６．核酸組成物が、プローブ２６９７、２６９８、２６９３、２９２８、２９ ２７、２９５５、２９２４および２９５９により定義される配列の群より選択さ れるいずれか１０個の連続したヌクレオチドを含む配列に相補的であるかまたは 少なくとも９０％のホモロジーを有する、請求項１５記載の方法。 １３．接触工程が第１の核酸および第２の核酸を含み、それぞれの核酸は異なる 配列を有し、かつ、２６９７、２６９８、２６９３、２９２８、２９２７、２９ ５５、２９２４および２９５９からなる群より選択されるいずれか１０個の連続 したヌクレオチドに相補的であるかまたは少なくとも９０％のホモロジーを有す る、請求項１５記載の方法。 １８．第１の核酸および第２の核酸が、プローブセット：２９２６および２９３ １、および２６９５および２６９６からなる群より選択される、請求項１７記載 の方法。 １９．Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａを含むと疑われる試料中のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ属 の構成員子の存在を検出する方法であって、 ａ） 試料を、プローブ２９２６、２９３０、２７０１、２６９６および２６９ ５からなる群より選択されるいずれか１０個の連続したヌクレオチドに相補的で あるかまたは少なくとも９０％のホモロジーを有する少なくとも１つの核酸組成 物と接触させ； ｂ） 試料にハイブリダイゼーション条件を付与してＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの存 在下でハイブリダイゼーション生成物を形成させ；そして ｃ） Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの存在の指標としてハイブリダイゼーション生成物 を検出する； ことを含む方法。 ２０．１または２以上のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの存在を検出するためのキットで あって、プローブ２７０１、２７０３、２７０４、２７０５、２６７９、２６９ ０、２６９８、２６９５、２６９６、２６９３、２７０８、２６９９、２９２４ 、２９２６、２９３０、２９３２、２９５６、２９５８、２９６３、２９６８、 ２９２８、２９５７、２９２７、２９２９、２９５４、２９５５および２９５９ により定義される配列の群より選択されるいずれか１０個の連続したヌクレオチ ド を含む配列に相補的であるかまたは少なくとも９０％のホモロジーを有するプロ ーブを含むキット。