JP2795503B2 - サルモネラ菌の検出 - Google Patents
サルモネラ菌の検出Info
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- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はサルモネラ（Salmonella）属に属する細菌の
検出に関する〔ここで使用する用語“サルモネラ（Salm
onella）”は細菌学分類法のバージェイのマニアルの中
で分類されているごとき細菌を意味する〕。サルモネラ
（Salmonella）菌の検出は多方面の医学および公衆衛生
に関連して重要である。ヒト疾病の観点からは、サルモ
ネラ（Salmonella）種は最も重要な細菌の１つである。
サルモネラ（Salmonella）菌は軽い胃腸炎からより重度
の病気の範囲の種々の感染症を起こすことができる。
検出に関する〔ここで使用する用語“サルモネラ（Salm
onella）”は細菌学分類法のバージェイのマニアルの中
で分類されているごとき細菌を意味する〕。サルモネラ
（Salmonella）菌の検出は多方面の医学および公衆衛生
に関連して重要である。ヒト疾病の観点からは、サルモ
ネラ（Salmonella）種は最も重要な細菌の１つである。
サルモネラ（Salmonella）菌は軽い胃腸炎からより重度
の病気の範囲の種々の感染症を起こすことができる。
標準的実験室法に従うと、臨床標本（例えば大便）中
のサルモネラ（Salmonella）の存在は、適切に調製され
た材料を微生物学的培地上でこれらの微生物の増殖に良
好な条件下培養することにより検出される。得られるコ
ロニーは形態学的および生化学的特性が試験され、その
方法は典型的には試料を得てから48時間後に開始され、
完了するのに数日かかる。
のサルモネラ（Salmonella）の存在は、適切に調製され
た材料を微生物学的培地上でこれらの微生物の増殖に良
好な条件下培養することにより検出される。得られるコ
ロニーは形態学的および生化学的特性が試験され、その
方法は典型的には試料を得てから48時間後に開始され、
完了するのに数日かかる。
Taberらは（米国特許第4,689,295号）、食品中のサル
モネラ（Salmonella）属の細菌の存在を検出するための
サルモネラ（Salmonella）DNAに特異的なDNAプローブの
使用について記載している。
モネラ（Salmonella）属の細菌の存在を検出するための
サルモネラ（Salmonella）DNAに特異的なDNAプローブの
使用について記載している。
Kohneらは（1968）、バイオフィジカル ジャーナル
８:1104−1118、rRNA配列のプローブを調製する１つの
方法について議論している。
８:1104−1118、rRNA配列のプローブを調製する１つの
方法について議論している。
Pace（1971）、ジャーナル オブ バクテリオロジー
107:543−547、およびCampbell（1971）は異った細菌
種からのリボソームリボ核酸の相同性およびこれらの相
同性の程度を定量化するためのハイブリダイゼーション
法について議論している。
107:543−547、およびCampbell（1971）は異った細菌
種からのリボソームリボ核酸の相同性およびこれらの相
同性の程度を定量化するためのハイブリダイゼーション
法について議論している。
Soginらは（1972）、ジャーナル オブ モレキュラ
ーエボルーション1:173−184、系統発生論的関係の評価
のために異ったリボソームRNA分子の一次構造特性を用
いる論理的および実際的観点について議論している。
ーエボルーション1:173−184、系統発生論的関係の評価
のために異ったリボソームRNA分子の一次構造特性を用
いる論理的および実際的観点について議論している。
Foxらは、（1977）、インターナショナル ジャーナ
ル オブ システマティック バクテリオロジー27:44
−57、原核生物分類への比較カタログ化（16Sリボソー
ムRNAの）法について議論している。
ル オブ システマティック バクテリオロジー27:44
−57、原核生物分類への比較カタログ化（16Sリボソー
ムRNAの）法について議論している。
Kohneらは（1983）、Gen−Probe社の特許出願中で、
リボソームRNA分子に対するプローブとして使用するた
めの核酸断片を得るための戦略について記載している。
リボソームRNA分子に対するプローブとして使用するた
めの核酸断片を得るための戦略について記載している。
本発明は以下の定義を明らかにするとより良く理解さ
れるであろう： DNA−デオキシリボ核酸の略号、糖成分としてデオキ
シリボースを含む核酸の種類で、遺伝的特性の貯蔵所と
考えられている；即ち、遺伝子から構成される遺伝物
質。
れるであろう： DNA−デオキシリボ核酸の略号、糖成分としてデオキ
シリボースを含む核酸の種類で、遺伝的特性の貯蔵所と
考えられている；即ち、遺伝子から構成される遺伝物
質。
RNA−リボ核酸の略号、糖成分としてリボースを含む
核酸の種類で、最も一般的にはDNAから転写（コピー）
される。RNA分子は情報的（例えばメッセンジャーRN
A）、触媒的（例えばRNaseP）または構造的（例えばリ
ボソームRNA、下記参照）細胞機能を果たすであろう。
核酸の種類で、最も一般的にはDNAから転写（コピー）
される。RNA分子は情報的（例えばメッセンジャーRN
A）、触媒的（例えばRNaseP）または構造的（例えばリ
ボソームRNA、下記参照）細胞機能を果たすであろう。
rRNA−リボソームRNA（rRNA）分子はリボソーム、複
合体タンパク質およびRNA含有“細胞小器官”の鍵とな
る要素であり、トランスファーRNAと一緒になって転送
装置を構成する。リボソームはすべて生物体にとってす
ごく重要であり、なぜならそれらは生命の主たる構造物
であり触媒的要素である細胞タンパク質へ遺伝情報を翻
訳する唯一の既知の手段として働いているからである。
この重要性の現われは、すべての細胞がリボソームを持
っていることが観察されることである。
合体タンパク質およびRNA含有“細胞小器官”の鍵とな
る要素であり、トランスファーRNAと一緒になって転送
装置を構成する。リボソームはすべて生物体にとってす
ごく重要であり、なぜならそれらは生命の主たる構造物
であり触媒的要素である細胞タンパク質へ遺伝情報を翻
訳する唯一の既知の手段として働いているからである。
この重要性の現われは、すべての細胞がリボソームを持
っていることが観察されることである。
リボソームは３つの異ったRNA分子を含んでおり、大
腸菌においてはそれらは5S、16Sおよび23S rRNAと称さ
れている。これらの名称は歴史的には沈降速度により決
定されたRNA分子の大きさに関連している。しかしなが
ら、それらは生物間では大きさは実質的には実際に変化
している。5S、16Sおよび23S rRNAは通常任意の細菌に
おける相同的RNA分子のための遺伝子的名前として使用
されており、ここでもそのように使用されるであろう。
これら３つのRNA分子の進化的相同体はすべての生物体
のリボソーム中に存在する。真核生物においては、相同
的RNAは5S、18S、および28S rRNAと各々称されている。
真核生物は、加えてさらに5.8S rRNAと名付けられた第
４のrRNA種を含んでおり、この構造および多分機能的相
同体は細菌23S rRNAの５′末端にか観察される。
腸菌においてはそれらは5S、16Sおよび23S rRNAと称さ
れている。これらの名称は歴史的には沈降速度により決
定されたRNA分子の大きさに関連している。しかしなが
ら、それらは生物間では大きさは実質的には実際に変化
している。5S、16Sおよび23S rRNAは通常任意の細菌に
おける相同的RNA分子のための遺伝子的名前として使用
されており、ここでもそのように使用されるであろう。
これら３つのRNA分子の進化的相同体はすべての生物体
のリボソーム中に存在する。真核生物においては、相同
的RNAは5S、18S、および28S rRNAと各々称されている。
真核生物は、加えてさらに5.8S rRNAと名付けられた第
４のrRNA種を含んでおり、この構造および多分機能的相
同体は細菌23S rRNAの５′末端にか観察される。
ハイブリダイゼーション−規定された反応条件下、２
つの部分的にまたは完全に相補的な核酸が逆平行様式で
一緒になり、特異的で安定な水素結合を形成する過程。
ハイブリダイゼーション条件の特定の組のげ厳密さはプ
ローブ／標的複合体の塩基組成同様、２つの核酸の間の
誤対合のレベルおよび結合構造によっても規定される。
厳密さはまたハイブリダイゼーション溶液中に存在する
イオン性種の濃度および種類、存在する変性剤の型およ
び濃度および／またはハイブリダイゼーションの温度に
より支配される。
つの部分的にまたは完全に相補的な核酸が逆平行様式で
一緒になり、特異的で安定な水素結合を形成する過程。
ハイブリダイゼーション条件の特定の組のげ厳密さはプ
ローブ／標的複合体の塩基組成同様、２つの核酸の間の
誤対合のレベルおよび結合構造によっても規定される。
厳密さはまたハイブリダイゼーション溶液中に存在する
イオン性種の濃度および種類、存在する変性剤の型およ
び濃度および／またはハイブリダイゼーションの温度に
より支配される。
プローブ−合成または生物学的に産生される核酸（DN
AまたはRNA）で設計または選択により、規定された厳密
さで標的核酸配列へ特異的に（すなわち優先的に）ハイ
ブリダイズすることを可能にする特異的ヌクレオチド配
列を含んでいる。
AまたはRNA）で設計または選択により、規定された厳密
さで標的核酸配列へ特異的に（すなわち優先的に）ハイ
ブリダイズすることを可能にする特異的ヌクレオチド配
列を含んでいる。
標的分子−特定のプローブが優先的にハイブリダイズ
できる核酸分子。
できる核酸分子。
標的配列−標的分子内の核酸配列で、それに対し特定
のプローブが優先的にハイブリダイズできる。
のプローブが優先的にハイブリダイズできる。
サルモネラ−特異的配列−標的分子内のヌクレオチド
配列で、サルモネラ（Salmonella）および非サルモネラ
（Salmonella）腸内細菌間で著しい配列の相違を示す。
配列で、サルモネラ（Salmonella）および非サルモネラ
（Salmonella）腸内細菌間で著しい配列の相違を示す。
他の定義は本文中でそれらが最初に使用された時に与
えられる。
えられる。
発明の概要 本発明は本質的にDNAまたはRNA配列から成る核酸プロ
ーブまたはプローブの組を特徴とし、それらは特定のハ
イブリタイゼーション条件下、サルモネラ（Salmonell
a）菌のリボソームRNA（rRNA）分子の存在を検出でき、
同一条件試験試料中に存在する非サルモネラ（Salmonel
la）菌のrRNAを検出できない。
ーブまたはプローブの組を特徴とし、それらは特定のハ
イブリタイゼーション条件下、サルモネラ（Salmonell
a）菌のリボソームRNA（rRNA）分子の存在を検出でき、
同一条件試験試料中に存在する非サルモネラ（Salmonel
la）菌のrRNAを検出できない。
本発明はまた前記プローブを利用する検定系を特徴と
し、その構成は前記のプローブの望ましい挙動を促進で
きる。本発明は以下の促進された作業能力を示す。
し、その構成は前記のプローブの望ましい挙動を促進で
きる。本発明は以下の促進された作業能力を示す。
ａ） 感度の増加：すなわち、現在利用できる方法よ
り、与えられた任意の試料中のより少ないサルモネラ
（Salmonella）を検出する能力； ｂ） 生物学的というより化学的に合成されたプローブ
の使用により、プローブ生産コストの著しい軽減の可能
性。
り、与えられた任意の試料中のより少ないサルモネラ
（Salmonella）を検出する能力； ｂ） 生物学的というより化学的に合成されたプローブ
の使用により、プローブ生産コストの著しい軽減の可能
性。
ｃ） rRNA配列特性がそのような同定の基礎を提供する
ことにより生化学的に異常なサルモネラ（Salmonella）
さえも正確に同定。
ことにより生化学的に異常なサルモネラ（Salmonella）
さえも正確に同定。
標的分子としてサルモネラ（Salmonella）rRNAを使用
すると多数の利点があり、その中でも： １） rRNAは細胞塊のかなりの成分を構成する。細胞リ
ボソーム含量の推定値はバラついているが、活撥に増殖
しているサルモネラ（Salmonella）菌は細胞当り5.4×1
04以上のリボソームを、およびそれ故各々のrRNAの5.0
×104のコピーを（リボソーム中1:1:1の化学当量で存在
する）含んでいる。対照的に、ほとんどの他の潜在的細
胞標的分子（遺伝子またはそのRNA転写物）はより低い
頻度で存在している。
すると多数の利点があり、その中でも： １） rRNAは細胞塊のかなりの成分を構成する。細胞リ
ボソーム含量の推定値はバラついているが、活撥に増殖
しているサルモネラ（Salmonella）菌は細胞当り5.4×1
04以上のリボソームを、およびそれ故各々のrRNAの5.0
×104のコピーを（リボソーム中1:1:1の化学当量で存在
する）含んでいる。対照的に、ほとんどの他の潜在的細
胞標的分子（遺伝子またはそのRNA転写物）はより低い
頻度で存在している。
２） rRNA（およびそれをコードしている遺伝子）は同
時代の生物間の側方伝搬を受けていないようである。そ
れ故、rRNA一次構造は同時代の生物体間の側方伝搬を受
けるであろう例えば、プラスミドー運搬遺伝子またはそ
の産生物の場合にありがちな遺伝子−特異的標的という
よりも生物体−特異的分子標的を提供している。
時代の生物間の側方伝搬を受けていないようである。そ
れ故、rRNA一次構造は同時代の生物体間の側方伝搬を受
けるであろう例えば、プラスミドー運搬遺伝子またはそ
の産生物の場合にありがちな遺伝子−特異的標的という
よりも生物体−特異的分子標的を提供している。
上記rRNA検出の固有の利点を提供するのに加え、本発
明は相当な数のサルモネラ（Salmonella）において十分
に類似しているため１つまたは２、３のプローブがそれ
らのサルモネラ（Salmonella）の中の標的領域にハイブ
リダイズでき、ほとんどまたはすべての非サルモネラ
（Salmonella）rRNAにおいては十分に相違しているた
め、プローブ（類）がサルモネラ（Salmonella）rRNAに
ハイブリダイズするいくつかの条件下、ほとんど非サル
モネラ（Salmonella）rRNAとはハイブリダイズできない
か、非常に弱くしかハイブリダイズできないサルモネラ
（Salmonella）rRNA標的配列へのプローブを提供する。
これらのプローブ特性は各々包含性および排他性として
定義される。
明は相当な数のサルモネラ（Salmonella）において十分
に類似しているため１つまたは２、３のプローブがそれ
らのサルモネラ（Salmonella）の中の標的領域にハイブ
リダイズでき、ほとんどまたはすべての非サルモネラ
（Salmonella）rRNAにおいては十分に相違しているた
め、プローブ（類）がサルモネラ（Salmonella）rRNAに
ハイブリダイズするいくつかの条件下、ほとんど非サル
モネラ（Salmonella）rRNAとはハイブリダイズできない
か、非常に弱くしかハイブリダイズできないサルモネラ
（Salmonella）rRNA標的配列へのプローブを提供する。
これらのプローブ特性は各々包含性および排他性として
定義される。
以下に詳細に記載するごとく、すべてのサルモネラ
（Salmonella）にハイブリダイズし、非サルモネラ（Sa
lmonella）菌にはハイブリダイズしないプローブ（また
はプローブの組）と単純に規定するより実際の状況はよ
り複雑である。ある種の興味ある有用なサルモネラ（Sa
lmonella）の部分集合に特異的にハイブリダイズする多
数のプローブが記載されている；個々にはより低い排外
性の性質を示すにもかかわらず適当な検定系に組合わせ
ると全体で望まれる作業特性を示すプロープの組の有益
な成分である他のプローブが記載される。以下に記載す
る新規の検定構成の１つにおいて（二重−特異性、捕捉
／検定オリゴ）、各々のプローブの100％排他性への理
想的要求は、もし組となった個々のプローブが望ましく
ない交差ハイブリダイゼーションの非−重複パターンを
持つならば、プローブの組の全体の排他的挙動を犠牲に
することなく和らげられるであろう。
（Salmonella）にハイブリダイズし、非サルモネラ（Sa
lmonella）菌にはハイブリダイズしないプローブ（また
はプローブの組）と単純に規定するより実際の状況はよ
り複雑である。ある種の興味ある有用なサルモネラ（Sa
lmonella）の部分集合に特異的にハイブリダイズする多
数のプローブが記載されている；個々にはより低い排外
性の性質を示すにもかかわらず適当な検定系に組合わせ
ると全体で望まれる作業特性を示すプロープの組の有益
な成分である他のプローブが記載される。以下に記載す
る新規の検定構成の１つにおいて（二重−特異性、捕捉
／検定オリゴ）、各々のプローブの100％排他性への理
想的要求は、もし組となった個々のプローブが望ましく
ない交差ハイブリダイゼーションの非−重複パターンを
持つならば、プローブの組の全体の排他的挙動を犠牲に
することなく和らげられるであろう。
さらに、本発明のプローブは通常の検定条件下プロー
ブが近づくことができるようにされた標的領域へハイブ
リダイズする。
ブが近づくことができるようにされた標的領域へハイブ
リダイズする。
本発明の他の特色および利点は以下のその好適な態様
の説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
の説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
好ましい態様の説明 最初に図を簡単に説明した後、本発明の好適な態様を
説明する。
説明する。
図 図１は大腸菌23S rRNAの図式的表示である。
図２は大腸菌16S rRNAの図式的表示である。
図３は図１の〜1405−1597領域のヌクレオチド配列で
あり、ある種の関連する菌株の配列およびその領域の一
部に対応するプローブを含んでいる。図３−1:この標的
領域を通るS.チフィムリウム（typhimurium）23S rRNA
の二次構造。図３−2:この領域に対するサルモネラ（Sa
lmonella）プローブが２つのサルモネラ（Salmonella）
23S rRNA中のその標的配列の下に並べて示されており、
この領域を通して観察されたかぎりでは２つの異なった
配列パターンがあることを示している。ピーナッツバタ
ーから単離された１つの重要な“拮抗”生物体であるエ
ンテロバクター アグロメランス（Enterobactor agglo
merans）（EagglPB）からの対応する領域も示してあ
る。位置番号は大腸菌番号系に対応している。大腸菌と
異った位置のみが示してある。使用されている記号は：
（・）は一列整列において他の配列に関して欠失、
（−）大腸菌に現われるものと同一のヌクレオチド。小
文字“a"または“g"非相補的塩基を示し、小文字“c"は
ビオチン標識を受けることができるシトシン類似体を示
し、小文字“t"は後からの“c"の付加を可能にするため
の“c"から５′に位置するチミンを示している。
あり、ある種の関連する菌株の配列およびその領域の一
部に対応するプローブを含んでいる。図３−1:この標的
領域を通るS.チフィムリウム（typhimurium）23S rRNA
の二次構造。図３−2:この領域に対するサルモネラ（Sa
lmonella）プローブが２つのサルモネラ（Salmonella）
23S rRNA中のその標的配列の下に並べて示されており、
この領域を通して観察されたかぎりでは２つの異なった
配列パターンがあることを示している。ピーナッツバタ
ーから単離された１つの重要な“拮抗”生物体であるエ
ンテロバクター アグロメランス（Enterobactor agglo
merans）（EagglPB）からの対応する領域も示してあ
る。位置番号は大腸菌番号系に対応している。大腸菌と
異った位置のみが示してある。使用されている記号は：
（・）は一列整列において他の配列に関して欠失、
（−）大腸菌に現われるものと同一のヌクレオチド。小
文字“a"または“g"非相補的塩基を示し、小文字“c"は
ビオチン標識を受けることができるシトシン類似体を示
し、小文字“t"は後からの“c"の付加を可能にするため
の“c"から５′に位置するチミンを示している。
図４は図１の〜1700−1760領域のヌクレオチド配列
で、ある種の関連する菌株の配列およびその領域の一部
に対応するプローブが含まれている。図４−1:この標的
領域を通る大腸菌23S rRNAの二次構造。S.アリゾナ（ar
izona）およびS.チフィムリウム（typhimurium）（丸で
囲んだ）配列の相違が示されている。図４−2:この領域
に対するサルモネラ（Salmonella）プローブが３つのサ
ルモネラ（Salmonella）23S rRNA中のその標的配列の下
に並べて示されており、この領域を通して観察されたか
ぎりでは３つの配列パターンがあることを示している。
位置番号および記号は図３と同一である。
で、ある種の関連する菌株の配列およびその領域の一部
に対応するプローブが含まれている。図４−1:この標的
領域を通る大腸菌23S rRNAの二次構造。S.アリゾナ（ar
izona）およびS.チフィムリウム（typhimurium）（丸で
囲んだ）配列の相違が示されている。図４−2:この領域
に対するサルモネラ（Salmonella）プローブが３つのサ
ルモネラ（Salmonella）23S rRNA中のその標的配列の下
に並べて示されており、この領域を通して観察されたか
ぎりでは３つの配列パターンがあることを示している。
位置番号および記号は図３と同一である。
図５は、図２の〜430−510領域のヌクレオチド配列で
あり、その領域の位置に対応するある種の関連する菌株
の配列を含む図５−1:この標的領域を通る大腸菌16S rR
NAの二次構造。S.ナリゾナ（arizona）およびS.チフィ
ムリウム（typhimurium）（丸で囲んだ）配列間の相違
が示されている。図５−2:この領域に対するサルモネラ
（salmonella）プローブが４つの23S rRNAの中の標的配
列の下に並べて示されており、この領域を通して観察さ
れたかぎり４つの配列パターンがあることを示してい
る。位置番号および記号は図３のとうりである。
あり、その領域の位置に対応するある種の関連する菌株
の配列を含む図５−1:この標的領域を通る大腸菌16S rR
NAの二次構造。S.ナリゾナ（arizona）およびS.チフィ
ムリウム（typhimurium）（丸で囲んだ）配列間の相違
が示されている。図５−2:この領域に対するサルモネラ
（salmonella）プローブが４つの23S rRNAの中の標的配
列の下に並べて示されており、この領域を通して観察さ
れたかぎり４つの配列パターンがあることを示してい
る。位置番号および記号は図３のとうりである。
図６は図２の〜991−1045領域のヌクレオチド配列を
示しており、その領域の位置に対応するある種の関連す
る菌株の配列を含んでいる。図６−1:この標的領域を通
る大腸菌16S rRNAの二次構造。図６−2:この領域に対す
るサルモネラ（Salmonella）プローブがその標的配列の
下に並べて示されている。大腸菌位置番号が使用されて
いる。
示しており、その領域の位置に対応するある種の関連す
る菌株の配列を含んでいる。図６−1:この標的領域を通
る大腸菌16S rRNAの二次構造。図６−2:この領域に対す
るサルモネラ（Salmonella）プローブがその標的配列の
下に並べて示されている。大腸菌位置番号が使用されて
いる。
図７は図１の〜512−580領域のヌクレオチド配列であ
り、その領域の位置に対応するある種の関連する菌株の
配列を含んでいる。図７−1:この標的領域の位置を通る
大腸菌23S rRNAの二次構造。図７−2:この領域に対する
サルモネラ（Salmonella）プローブがその標的配列の下
に並べて示されている。番号付けおよび記号は図３のと
うりである。
り、その領域の位置に対応するある種の関連する菌株の
配列を含んでいる。図７−1:この標的領域の位置を通る
大腸菌23S rRNAの二次構造。図７−2:この領域に対する
サルモネラ（Salmonella）プローブがその標的配列の下
に並べて示されている。番号付けおよび記号は図３のと
うりである。
図８は16Sおよび／または23S rRNA標的分子の捕捉お
よび検出に利用されるであろう種々の型の二重プローブ
戦略を例示している。２つのサルモネラ（Salmonella）
−特異的（ＡおよびＢ）および１つの非特異的（Ｇ＝一
般的）プローブが示されている。ライン１および７は二
重特異的構成の２つの最も単純な例である。
よび検出に利用されるであろう種々の型の二重プローブ
戦略を例示している。２つのサルモネラ（Salmonella）
−特異的（ＡおよびＢ）および１つの非特異的（Ｇ＝一
般的）プローブが示されている。ライン１および７は二
重特異的構成の２つの最も単純な例である。
図９は二重（特異的／一般的）かまたは二重特異的捕
捉／検出プローブ構成を用いる種々の異った可能な結果
を例示している。図８を参照すると戦略１はライン２ま
たは８に対応している。戦略２は要求される包含性を達
成するため、“組”へ多サルモネラ（Salmonella）−特
異性捕捉プローブを加える考えに対応している。
捉／検出プローブ構成を用いる種々の異った可能な結果
を例示している。図８を参照すると戦略１はライン２ま
たは８に対応している。戦略２は要求される包含性を達
成するため、“組”へ多サルモネラ（Salmonella）−特
異性捕捉プローブを加える考えに対応している。
図10は代表的なドットブロットハイブリダイゼーショ
ンの結果を表にしたものでここに記載されているある種
のプローブの排他的挙動を示している。
ンの結果を表にしたものでここに記載されているある種
のプローブの排他的挙動を示している。
プローブ開発戦略 本発明のプローブの開発の最初の工程はサルモネラ
（Salmonella）−特異性核酸プローブのための標識部位
として働くことができる16Sおよび23S rRNAの領域を同
定することである。実際的には、前もってどの非−サル
モネラ（Salmonella）微生物が試験試料に存在している
であろうかを予測するのは困難である。多数のそのよう
な潜在的な非−サルモネラ（Salmonella）細菌が与えら
れたプローブ配列に排他性を示すことは非常に困難であ
り、労力の無駄である。しかしながら、研究および開発
の最初の段階の間にプローブを用いて最終的にスクリー
ニングされるすべての試験試料中にどの非サルモネラ
（Salmonella）菌が存在するであろうかを知る必要性を
除去できる厳しい基準が適応できる。これにはサルモネ
ラ（Salmonella）間およびサルモネラ（Salmonella）と
他の群の細菌間の系統発生的関係の知識が伴われる。特
に、サルモネラ（Salmonella）rRNA中の特定の標的領域
がサルモネラ（Salmonella）の代表的な進化的に近縁の
種のrRNA中の相同的領域と十分に異っており、サルモネ
ラ（Salmonella）および近縁種がサルモネラ（Salmonel
la）配列に特異的なプローブを用いるハイブリダイゼー
ションにより区別できることを決定することにより排他
的基準が満足されるであろうという作業仮説を採用す
る。一般的規則として、系統発生論的原理に基づくと、
より距離的に近い生物体のrRNA配列は、（その実際の同
一性は必ず知られていなくとも）前述のサルモネラ（Sa
lmonella）の進化的近縁種より配列の特定の領域で少な
くとも異っているごとく予想できる。
（Salmonella）−特異性核酸プローブのための標識部位
として働くことができる16Sおよび23S rRNAの領域を同
定することである。実際的には、前もってどの非−サル
モネラ（Salmonella）微生物が試験試料に存在している
であろうかを予測するのは困難である。多数のそのよう
な潜在的な非−サルモネラ（Salmonella）細菌が与えら
れたプローブ配列に排他性を示すことは非常に困難であ
り、労力の無駄である。しかしながら、研究および開発
の最初の段階の間にプローブを用いて最終的にスクリー
ニングされるすべての試験試料中にどの非サルモネラ
（Salmonella）菌が存在するであろうかを知る必要性を
除去できる厳しい基準が適応できる。これにはサルモネ
ラ（Salmonella）間およびサルモネラ（Salmonella）と
他の群の細菌間の系統発生的関係の知識が伴われる。特
に、サルモネラ（Salmonella）rRNA中の特定の標的領域
がサルモネラ（Salmonella）の代表的な進化的に近縁の
種のrRNA中の相同的領域と十分に異っており、サルモネ
ラ（Salmonella）および近縁種がサルモネラ（Salmonel
la）配列に特異的なプローブを用いるハイブリダイゼー
ションにより区別できることを決定することにより排他
的基準が満足されるであろうという作業仮説を採用す
る。一般的規則として、系統発生論的原理に基づくと、
より距離的に近い生物体のrRNA配列は、（その実際の同
一性は必ず知られていなくとも）前述のサルモネラ（Sa
lmonella）の進化的近縁種より配列の特定の領域で少な
くとも異っているごとく予想できる。
この原理はかなり大きな進化的距離にわたって）例え
ば門間のレベルで）充分に示されてきたが、ここで調べ
ているような近い距離ではいまだ示されていない。事
実、平均としてはこの原理はサルモネラ（Salmonella）
および近縁種に対し非常に良好に保たれていることが観
察されたが、時々標的領域中の無作為な配列変異の例が
観察され、原理は予言できずに破られた。そに故、代表
的なサルモネラ（Salmonella）および非−サルモネラ
（Salmonella）菌の多数の名簿に対するプローブの実験
的試験をプローブ作業の最終基準に残さねばならなかっ
た。
ば門間のレベルで）充分に示されてきたが、ここで調べ
ているような近い距離ではいまだ示されていない。事
実、平均としてはこの原理はサルモネラ（Salmonella）
および近縁種に対し非常に良好に保たれていることが観
察されたが、時々標的領域中の無作為な配列変異の例が
観察され、原理は予言できずに破られた。そに故、代表
的なサルモネラ（Salmonella）および非−サルモネラ
（Salmonella）菌の多数の名簿に対するプローブの実験
的試験をプローブ作業の最終基準に残さねばならなかっ
た。
サルモネラ（Salmonella）rRNAの領域を同定する最初
の工程が核酸ハイブリダイゼーションプローブのための
標的部位として有用にちがいないので、サルモネラ（Sa
lmonella）の２つの種、S.チフィムリウム（typhimuriu
m）およびS.アリゾナ（arizona）からの16Sおよび23Sの
両方のほとんど完全なヌクレオチド配列を決定した。こ
れらは２つの主たるサルモネラ（Salmonella）DNA相同
群の代表として選択され、それ故にそれらはサルモネラ
（Salmonella）属の進化の幅の代表である（６つのその
ような群が全体で定義されている。しかし、４つは“不
定型の”サルモネラ（Salmonella）の小さなコレクショ
ンからなっていた）。rRNAの種々の部分のヌクレオチド
配列はクローニング（Maniatisら、1982、モノキュラー
クローニング；実験手引）およびrRNAを特定している遺
伝子の配列決定（MaxamおよびGilbert、1977、プロシー
ディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンスUSA74:560−564、Sangerら、1977、プロシー
ディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンスUSA74:5463−5467）、および／または逆転写
酵素を用いるrRNA自身の直接配列決定（Laneら、1985、
プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミー
オブ サイエンスUSA82:6955−6959）などによる標準
的実験室プロトコールにより決定した。誘導されたヌク
レオチド配列は互いにまた他の入手可能なrRNAヌクレオ
チド配列、特に腸内細菌である大腸菌に密接に関連した
配列と比較する。大腸菌rRNA配列に関して潜在的に有用
な排他特性を示す多数の配列の領域が発見された（すな
わち、サルモネラ（Salmonella）−特異性配列を含
む）。これらは以下に記載される。
の工程が核酸ハイブリダイゼーションプローブのための
標的部位として有用にちがいないので、サルモネラ（Sa
lmonella）の２つの種、S.チフィムリウム（typhimuriu
m）およびS.アリゾナ（arizona）からの16Sおよび23Sの
両方のほとんど完全なヌクレオチド配列を決定した。こ
れらは２つの主たるサルモネラ（Salmonella）DNA相同
群の代表として選択され、それ故にそれらはサルモネラ
（Salmonella）属の進化の幅の代表である（６つのその
ような群が全体で定義されている。しかし、４つは“不
定型の”サルモネラ（Salmonella）の小さなコレクショ
ンからなっていた）。rRNAの種々の部分のヌクレオチド
配列はクローニング（Maniatisら、1982、モノキュラー
クローニング；実験手引）およびrRNAを特定している遺
伝子の配列決定（MaxamおよびGilbert、1977、プロシー
ディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンスUSA74:560−564、Sangerら、1977、プロシー
ディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンスUSA74:5463−5467）、および／または逆転写
酵素を用いるrRNA自身の直接配列決定（Laneら、1985、
プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミー
オブ サイエンスUSA82:6955−6959）などによる標準
的実験室プロトコールにより決定した。誘導されたヌク
レオチド配列は互いにまた他の入手可能なrRNAヌクレオ
チド配列、特に腸内細菌である大腸菌に密接に関連した
配列と比較する。大腸菌rRNA配列に関して潜在的に有用
な排他特性を示す多数の配列の領域が発見された（すな
わち、サルモネラ（Salmonella）−特異性配列を含
む）。これらは以下に記載される。
上で議論したごとく、この予備的分析は可能性を示し
ただけである。上に議論した望まれる特性、即ち:1）ほ
とんどまたはすべての密接に相関する微生物に対する充
分な排外性、２）サルモネラ（Salmonella）に関する有
用な包含性パターン、および３）実際に用いられるであ
ろう種々の検定条件下における標的領域への到達可能性
を厳密に示すには各々の核酸プローブの更なる実験的試
験が必要とされる。非常に多数の微生物が試験プローブ
の排他性（現在約22の属、約69の種および29の種として
未分化の“バイオグループ”から成る、Farmerら、198
5、ジャーナル オブ クリニカル マイクロバイオロ
ジー21:46−76）および包含性（2000の位のサルモネラ
（Salmonella）の種および血清型）特性の定義に潜在的
に関連しているので我々は潜在的プローブの試験および
精製に関してここに説明した相互活性戦略を適用した。
ただけである。上に議論した望まれる特性、即ち:1）ほ
とんどまたはすべての密接に相関する微生物に対する充
分な排外性、２）サルモネラ（Salmonella）に関する有
用な包含性パターン、および３）実際に用いられるであ
ろう種々の検定条件下における標的領域への到達可能性
を厳密に示すには各々の核酸プローブの更なる実験的試
験が必要とされる。非常に多数の微生物が試験プローブ
の排他性（現在約22の属、約69の種および29の種として
未分化の“バイオグループ”から成る、Farmerら、198
5、ジャーナル オブ クリニカル マイクロバイオロ
ジー21:46−76）および包含性（2000の位のサルモネラ
（Salmonella）の種および血清型）特性の定義に潜在的
に関連しているので我々は潜在的プローブの試験および
精製に関してここに説明した相互活性戦略を適用した。
第一世代のプローブはサルモネラ（Salmonella）およ
び非サルモネラ（Salmonella）菌の標的領域中に観察さ
れたヌクレオチオチド配列変異を最大に利用するという
原理に基づいて設計された。“ドットブロット”分析に
より第一世代のプローブの包含的および排他性質の予備
的試験が実施された。ドットブロット分析は多くの異っ
た方法で実施できるが、しかし一般的に核酸または核酸
の集団のフィルター（例えばニトロセルロース、ナイロ
ンまたは他の誘導膜でそれらは市販されておりこの目的
に有用である）上への固定化が含まれる。RNAは容易に
そのように固定され、任意の種々の核酸ハイブリダイゼ
ーション条件下（すなわち、ストリンジェンシー）、問
題とするヌクレオチド配列かどうか証明される。問題と
する核酸を最初に精製する必要なく粗（未精製）細胞溶
菌物中に存在するRNAもまたこの技術では利用可能であ
る。この後者の方法は任意の特定の微生物の核酸中に存
在するであろう特定のヌクレオチド配列のスクリーニン
グに必要とされる労力の量を著しく減少させ、多数の微
生物の大量スクリーニングに乗り易い。それ故、それが
多数の微生物に対しての潜在的核酸ハイブリダイゼーシ
ョンプローブの排他性および包含性を試験するのに選択
されるべき方法である。
び非サルモネラ（Salmonella）菌の標的領域中に観察さ
れたヌクレオチオチド配列変異を最大に利用するという
原理に基づいて設計された。“ドットブロット”分析に
より第一世代のプローブの包含的および排他性質の予備
的試験が実施された。ドットブロット分析は多くの異っ
た方法で実施できるが、しかし一般的に核酸または核酸
の集団のフィルター（例えばニトロセルロース、ナイロ
ンまたは他の誘導膜でそれらは市販されておりこの目的
に有用である）上への固定化が含まれる。RNAは容易に
そのように固定され、任意の種々の核酸ハイブリダイゼ
ーション条件下（すなわち、ストリンジェンシー）、問
題とするヌクレオチド配列かどうか証明される。問題と
する核酸を最初に精製する必要なく粗（未精製）細胞溶
菌物中に存在するRNAもまたこの技術では利用可能であ
る。この後者の方法は任意の特定の微生物の核酸中に存
在するであろう特定のヌクレオチド配列のスクリーニン
グに必要とされる労力の量を著しく減少させ、多数の微
生物の大量スクリーニングに乗り易い。それ故、それが
多数の微生物に対しての潜在的核酸ハイブリダイゼーシ
ョンプローブの排他性および包含性を試験するのに選択
されるべき方法である。
潜在的にサルモネラ（Salmonella）−含有試料中に存
在するであろう細菌の型を例示する非−サルモネラ（Sa
lmonella）腸内細菌のリストが表１に与えられている。
これらはサルモネラ（Salmonella）に最も密接に関連し
た多くの属も示している。先に議論したごとく、そのよ
うな広範囲の腸サルモネラ（Salmonella）近縁種の代表
に対し良好な排他性特性を示すプローブは、実際に試験
されたものよりも、より広い腸微生物のリストに対し同
様に振まうと道理上予想される。
在するであろう細菌の型を例示する非−サルモネラ（Sa
lmonella）腸内細菌のリストが表１に与えられている。
これらはサルモネラ（Salmonella）に最も密接に関連し
た多くの属も示している。先に議論したごとく、そのよ
うな広範囲の腸サルモネラ（Salmonella）近縁種の代表
に対し良好な排他性特性を示すプローブは、実際に試験
されたものよりも、より広い腸微生物のリストに対し同
様に振まうと道理上予想される。
表 １ 可能性のあるプローブのスクリーニングに使用された非
サルモネラ（Salmonella）腸内細菌のリストの一部 エシェリキア コリ （Esherichia coli） エンテロバクター クロヤカエ （Enterobacter cloac
ae） エンテロバクター アグロメランス （Enterobacter a
gglomerans） エンテロバクター ジェルゴビエ （Enterobacter ger
goviae） エンテロバクター エロゲネス （Enterobacter aerog
enes） エンテロバクター アムニゲナス （Enterobacter amn
igenus） エンテロバクター インターメジウム （Enterobacter
intermedium） エンテロバクター サカザキ （Enterobacter sakazak
ii） エンテロバクター タイロエ （Enterobacter taylora
e） シトロバクター フロインジ （Citrobacter freundi
i） シトロバクター ダイバーサス （Citrobacter divers
us） シトロバクター アマロナクチカス （Citrobacter am
alonacticus） ハフニア アルベイ （Hafnia alvei） クリブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumonin
e） モルガネラ オキツトカ （Morganella oxytoca） プロテウス ブルガリス （Proteus vulgaris） クレブシエラ オザエナエ （Klebsiella ozaenae） クレブシエラ プランチコラ （Klebsiella planticol
a） クレブシエラ テリゲナ （Klebsiella terrigena） プロビデンシア レトゲリ （Providencia rettgeri） プロテウス ミラブリス （Proteus mirablis） シュードモナス エルギノサ （Pseudomonas aerugino
sa） セラチア オドリフェラ （Serratia odorifera） セラチア リクファシエンス （Serratia liquefacien
s） セラチア マルセッセンス （Serratia marcescens） シゲラ フレキシネリ （Shigella flexneri） シゲラ ゾンネイ （Shigella sonneii） シゲラ ボイジ （Shigella boydii） シゲラ ボイジＣ−13 （Shigella boydii C−13） シゲラ ディセンテリエ （Shigella dysenteriae） エルシニア エンテロコリチカ（Yersinia enterocolit
ica） アルテロモナス プトレファシエンス （Alteromonas
putrefaciens） サルモネラ（Salmonella）−特異性プローブが包含的
であることが望まれるサルモネラ（Salmonella）菌を備
えた類似のリストは表１にリストされた“排他的パネ
ル”よりも非常に長いものであろう。DNA/DNAハイブリ
ダイゼーションのデータはサルモネラ（Salmonella）種
および血清型に多くの属内グループ分けが存在している
ことを示唆しているが、多くの株、特に新しく記載され
た株はDNA/DNAハイブリダイゼーション分析にたよらな
ければこれらのグループ群の１つに確信をもって帰属で
きない。我々のサルモネラ（Salmonella）標準物のコレ
クションは現在約345株があり、すべての主たるおよび
従たる病原的、生化学的および血清学的グループ群のみ
ならず多数の分類学的に未同定のサルモネラ（Salmonel
la）を含んでいる。すべての可能性のある有用なプロー
ブ（またはプローブの組）の包含的挙動はこのコレクシ
ョンに関しては特性付けられた。
サルモネラ（Salmonella）腸内細菌のリストの一部 エシェリキア コリ （Esherichia coli） エンテロバクター クロヤカエ （Enterobacter cloac
ae） エンテロバクター アグロメランス （Enterobacter a
gglomerans） エンテロバクター ジェルゴビエ （Enterobacter ger
goviae） エンテロバクター エロゲネス （Enterobacter aerog
enes） エンテロバクター アムニゲナス （Enterobacter amn
igenus） エンテロバクター インターメジウム （Enterobacter
intermedium） エンテロバクター サカザキ （Enterobacter sakazak
ii） エンテロバクター タイロエ （Enterobacter taylora
e） シトロバクター フロインジ （Citrobacter freundi
i） シトロバクター ダイバーサス （Citrobacter divers
us） シトロバクター アマロナクチカス （Citrobacter am
alonacticus） ハフニア アルベイ （Hafnia alvei） クリブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumonin
e） モルガネラ オキツトカ （Morganella oxytoca） プロテウス ブルガリス （Proteus vulgaris） クレブシエラ オザエナエ （Klebsiella ozaenae） クレブシエラ プランチコラ （Klebsiella planticol
a） クレブシエラ テリゲナ （Klebsiella terrigena） プロビデンシア レトゲリ （Providencia rettgeri） プロテウス ミラブリス （Proteus mirablis） シュードモナス エルギノサ （Pseudomonas aerugino
sa） セラチア オドリフェラ （Serratia odorifera） セラチア リクファシエンス （Serratia liquefacien
s） セラチア マルセッセンス （Serratia marcescens） シゲラ フレキシネリ （Shigella flexneri） シゲラ ゾンネイ （Shigella sonneii） シゲラ ボイジ （Shigella boydii） シゲラ ボイジＣ−13 （Shigella boydii C−13） シゲラ ディセンテリエ （Shigella dysenteriae） エルシニア エンテロコリチカ（Yersinia enterocolit
ica） アルテロモナス プトレファシエンス （Alteromonas
putrefaciens） サルモネラ（Salmonella）−特異性プローブが包含的
であることが望まれるサルモネラ（Salmonella）菌を備
えた類似のリストは表１にリストされた“排他的パネ
ル”よりも非常に長いものであろう。DNA/DNAハイブリ
ダイゼーションのデータはサルモネラ（Salmonella）種
および血清型に多くの属内グループ分けが存在している
ことを示唆しているが、多くの株、特に新しく記載され
た株はDNA/DNAハイブリダイゼーション分析にたよらな
ければこれらのグループ群の１つに確信をもって帰属で
きない。我々のサルモネラ（Salmonella）標準物のコレ
クションは現在約345株があり、すべての主たるおよび
従たる病原的、生化学的および血清学的グループ群のみ
ならず多数の分類学的に未同定のサルモネラ（Salmonel
la）を含んでいる。すべての可能性のある有用なプロー
ブ（またはプローブの組）の包含的挙動はこのコレクシ
ョンに関しては特性付けられた。
プローブ設計の次の工程は望まれない（偽）陽性物お
よび見逃されたサルモネラ（Salmonella）（偽陽性）の
配列分析である。各々のプローブの最初のドットプロッ
トから集められた包含性および排他性情報から時々試験
プローブが非常に弱くかまたは少しもハイブリダイズし
ないサルモネラ（Salmonella）株およびプローブがハイ
ブリダイスする非−サルモネラ（Salmonella）株が同定
される。得られるプローブの新しいバージョンを無作為
に改変および再試験するよりも、問題にする微生物の望
ましくないハイブリダイゼーション挙動のもとになる関
連するヌクレオチド配列が決定されるより情報に富んだ
方法が応用された。この目的の為には、問題とするrRNA
領域へ直接接近するように特異的に設計されている配列
決定プライマーを使用する逆転写酵素配列決定法（Lane
ら、1985;Quら、1983、ヌクレイックアシッズ リサー
チII:5903−5920）が用いられた。
よび見逃されたサルモネラ（Salmonella）（偽陽性）の
配列分析である。各々のプローブの最初のドットプロッ
トから集められた包含性および排他性情報から時々試験
プローブが非常に弱くかまたは少しもハイブリダイズし
ないサルモネラ（Salmonella）株およびプローブがハイ
ブリダイスする非−サルモネラ（Salmonella）株が同定
される。得られるプローブの新しいバージョンを無作為
に改変および再試験するよりも、問題にする微生物の望
ましくないハイブリダイゼーション挙動のもとになる関
連するヌクレオチド配列が決定されるより情報に富んだ
方法が応用された。この目的の為には、問題とするrRNA
領域へ直接接近するように特異的に設計されている配列
決定プライマーを使用する逆転写酵素配列決定法（Lane
ら、1985;Quら、1983、ヌクレイックアシッズ リサー
チII:5903−5920）が用いられた。
次の工程はプローブ幾何構造の洗練化および再試験で
ある。前記配列決定分析で集められた情報を使用し、標
的領域に関して幾何構造が変えられた（例えば、標的領
域内のわずかに異ったヌクレオチド配列と相補的な）、
および／またはヌクレオチド配列が変えられた（しかし
例えば同一の標的領域を標的とする）新しいプローブが
設計され、合成された。これらは次に前記ドットブロッ
ト法および／または以下に説明する溶液ハイブリダイゼ
ーション検出により再試験する。プローブ配列および標
的配列間の厳密な相補性はプローブ設計の最初の基準で
は必要とされない。より重要な点は満足できる包含性お
よび排他性の性質である。
ある。前記配列決定分析で集められた情報を使用し、標
的領域に関して幾何構造が変えられた（例えば、標的領
域内のわずかに異ったヌクレオチド配列と相補的な）、
および／またはヌクレオチド配列が変えられた（しかし
例えば同一の標的領域を標的とする）新しいプローブが
設計され、合成された。これらは次に前記ドットブロッ
ト法および／または以下に説明する溶液ハイブリダイゼ
ーション検出により再試験する。プローブ配列および標
的配列間の厳密な相補性はプローブ設計の最初の基準で
は必要とされない。より重要な点は満足できる包含性お
よび排他性の性質である。
プローブ配列の至適設計特性に他の考察も影響を及ぼ
す。第１にはプローブそれ自身の幾何構造に対する考察
である。16Sおよび23S rRNAの可能性のある標的領域は
しばしばそれ自身で相補性を示す領域に位置しているこ
とが観察されている。したがって、これらの領域に対す
るプローブも自己相補性を示すこともできる。プローブ
および標的配列間の可能な相互作用は標的またはプロー
ブ配列のそれ自身への分子内アニーリングを支配する相
互作用と同じ型のものにより支配されているので、特に
溶液ハイブリダイゼーション条件下、自己相補性プロー
ブは分子内または分子間プローブ／プローブ相互作用に
より、それらの標的配列へのハイブリダイゼーションの
ための接近が不可能になる。それ故プローブ設計の１つ
の観点はそのような自己−相補性を最小にすることであ
る。このことはサルモネラ（Salmonella）−特異性配列
の最大利用および受入れ可能なプローブ幾何構造間の妥
協をしばしば必要とさせる。
す。第１にはプローブそれ自身の幾何構造に対する考察
である。16Sおよび23S rRNAの可能性のある標的領域は
しばしばそれ自身で相補性を示す領域に位置しているこ
とが観察されている。したがって、これらの領域に対す
るプローブも自己相補性を示すこともできる。プローブ
および標的配列間の可能な相互作用は標的またはプロー
ブ配列のそれ自身への分子内アニーリングを支配する相
互作用と同じ型のものにより支配されているので、特に
溶液ハイブリダイゼーション条件下、自己相補性プロー
ブは分子内または分子間プローブ／プローブ相互作用に
より、それらの標的配列へのハイブリダイゼーションの
ための接近が不可能になる。それ故プローブ設計の１つ
の観点はそのような自己−相補性を最小にすることであ
る。このことはサルモネラ（Salmonella）−特異性配列
の最大利用および受入れ可能なプローブ幾何構造間の妥
協をしばしば必要とさせる。
プローブ設計におけるさらなる考察は包含性基準に関
して生じてくる。好適なプローブは適当な排他的挙動を
示す一方、すべての望まれるサルモネラ（Salmonella）
菌のrRNAへハイブリダイズできるものであろう。サルモ
ネラ（Salmonella）属それ自体かなりの表現型および遺
伝型（以下に記載するようなrRNA多様性を含む）を示す
ので、そのような“理想的なプローブを設計（または発
見）することは不可能である。実際的には、“普遍的
な”サルモネラ（Sslmonella）プローブを要求するよ
り、サルモネラ（Salmonella）−特異性プローブ組（各
々は適当な排他性およびいくつかの包含性の有用な水準
を示す）が考えられた。集合体として、プローブの組は
ほとんどまたはすべてのサルモネラ（Salmonella）を検
出するであろうし、非サルモネラ（Salmonella）はほと
んどまたはまったく検出しないであろう。そのような組
においては、例えば１つのプローブは１つまたはわずか
の重要なサルモネラ（Salmonella）株を除いて検出で
き、別のプローブは第１のプローブにより見逃されたわ
ずかなサルモネラ（Salmonella）株のみに良好な排他性
でハイブリダイズするであろう。それ故、以下に記載す
るプローブは包含性特性に関しての個々の基準で特徴付
けられているが、上に詳述した特異的プローブの“組”
の慨念は個々のプローブの重要性の決定の際考慮されな
ければならないことをいつも頭の中に入れておかねばな
らない。
して生じてくる。好適なプローブは適当な排他的挙動を
示す一方、すべての望まれるサルモネラ（Salmonella）
菌のrRNAへハイブリダイズできるものであろう。サルモ
ネラ（Salmonella）属それ自体かなりの表現型および遺
伝型（以下に記載するようなrRNA多様性を含む）を示す
ので、そのような“理想的なプローブを設計（または発
見）することは不可能である。実際的には、“普遍的
な”サルモネラ（Sslmonella）プローブを要求するよ
り、サルモネラ（Salmonella）−特異性プローブ組（各
々は適当な排他性およびいくつかの包含性の有用な水準
を示す）が考えられた。集合体として、プローブの組は
ほとんどまたはすべてのサルモネラ（Salmonella）を検
出するであろうし、非サルモネラ（Salmonella）はほと
んどまたはまったく検出しないであろう。そのような組
においては、例えば１つのプローブは１つまたはわずか
の重要なサルモネラ（Salmonella）株を除いて検出で
き、別のプローブは第１のプローブにより見逃されたわ
ずかなサルモネラ（Salmonella）株のみに良好な排他性
でハイブリダイズするであろう。それ故、以下に記載す
るプローブは包含性特性に関しての個々の基準で特徴付
けられているが、上に詳述した特異的プローブの“組”
の慨念は個々のプローブの重要性の決定の際考慮されな
ければならないことをいつも頭の中に入れておかねばな
らない。
この組の慨念は個々のプローブの排他的挙動の評価に
も拡張される。例えば、以下に説明する二重−特異的捕
捉／検出型においては、有用なプローブまたはプローブ
の組による非−サルモネラ（Salmonella）菌への望まし
くないハイブリダイゼーションはプローブの組の組成お
よび用いられる検定法を操作することにより減少または
除くことができる。
も拡張される。例えば、以下に説明する二重−特異的捕
捉／検出型においては、有用なプローブまたはプローブ
の組による非−サルモネラ（Salmonella）菌への望まし
くないハイブリダイゼーションはプローブの組の組成お
よび用いられる検定法を操作することにより減少または
除くことができる。
属−レベルのサルモネラ（Salmonella）−特異性プロ
ーブの“組”の慨念の結果は、特定の検定条件下、個々
のプローブの挙動が組内の他のプローブの“挙動”と一
致しているという必要性を個々のプローブの設計のある
種の様相が反映しているであろうという事である。
ーブの“組”の慨念の結果は、特定の検定条件下、個々
のプローブの挙動が組内の他のプローブの“挙動”と一
致しているという必要性を個々のプローブの設計のある
種の様相が反映しているであろうという事である。
プローブが溶液ハイブリダイゼーション型で使用され
る場合プローブ設計に対してさらなる束縛が生じる。種
々の応用のながで、溶液ハイブリダイゼーション型は検
定設計の好適な選択にちがいない。溶液ハイブリダイゼ
ーション検定の潜在的利点としては:a）固相ハイブリダ
イゼーション（例えば前に概説したドットブロット分
析）に比べてハイブリダイゼーションの動力学的性質が
促進され、ｂ）検定（検出）システムのバックグラウン
ド減少特性が潜在的に促進され、およびｃ）検定システ
ム試験の末端使用者への“親切”が増す。
る場合プローブ設計に対してさらなる束縛が生じる。種
々の応用のながで、溶液ハイブリダイゼーション型は検
定設計の好適な選択にちがいない。溶液ハイブリダイゼ
ーション検定の潜在的利点としては:a）固相ハイブリダ
イゼーション（例えば前に概説したドットブロット分
析）に比べてハイブリダイゼーションの動力学的性質が
促進され、ｂ）検定（検出）システムのバックグラウン
ド減少特性が潜在的に促進され、およびｃ）検定システ
ム試験の末端使用者への“親切”が増す。
溶液ハイブリダイゼーション検定は種々の幾何構造の
プローブへの標的領域が到達し易くする。溶液ハイブリ
ダイゼーションにおいてはプローブ／標的領域の相互作
用の強さは、プローブ長、標的領域への相補性の程度、
自己相補性、プローブ内の標的−配列−相補性の位置決
定、新規（例えば誘導体化された）ヌクレオチドの取り
入れ、プローブおよび標的配列間の種々の非標準塩基対
の取り入れ（例えばグアノシン−ウリジン、アデノシン
−グアノシンまたはイノシン−シトシン塩基対）などの
ごときパラメーターを変化されることによりある程度制
御することができる。
プローブへの標的領域が到達し易くする。溶液ハイブリ
ダイゼーションにおいてはプローブ／標的領域の相互作
用の強さは、プローブ長、標的領域への相補性の程度、
自己相補性、プローブ内の標的−配列−相補性の位置決
定、新規（例えば誘導体化された）ヌクレオチドの取り
入れ、プローブおよび標的配列間の種々の非標準塩基対
の取り入れ（例えばグアノシン−ウリジン、アデノシン
−グアノシンまたはイノシン−シトシン塩基対）などの
ごときパラメーターを変化されることによりある程度制
御することができる。
特定のプローブ／標的相互作用の強さは検定条件によ
っても影響できる。例えば前述の検定パラメータに加
え、rRNA標的の選択的脱タンパク質、rRNA標的の選択的
リボヌクレアーゼ処理、標的／標的相互作用を緩和しお
よび／または／プローブ／標的相互作用を促進する第２
−部位（サルモネラ（Salmonella）−特異的である必要
はない）プローブの選択的使用、および二重−プローブ
捕捉／検出戦略（以下を参照のこと）における第２−部
位プローブの選択的使用すべてが検定結果を改善でき
る。
っても影響できる。例えば前述の検定パラメータに加
え、rRNA標的の選択的脱タンパク質、rRNA標的の選択的
リボヌクレアーゼ処理、標的／標的相互作用を緩和しお
よび／または／プローブ／標的相互作用を促進する第２
−部位（サルモネラ（Salmonella）−特異的である必要
はない）プローブの選択的使用、および二重−プローブ
捕捉／検出戦略（以下を参照のこと）における第２−部
位プローブの選択的使用すべてが検定結果を改善でき
る。
実際的には、液体ハイブリダイゼーション条件下プロ
ーブ挙動の分析はここで説明の明瞭さのために示された
ごとく、必ずしも分離工程で行われるわけではないが、
プローブ開発の方法の間に完全な様式でなされる。
ーブ挙動の分析はここで説明の明瞭さのために示された
ごとく、必ずしも分離工程で行われるわけではないが、
プローブ開発の方法の間に完全な様式でなされる。
プローブ設計および分析の最終工程は実際の試料（例
えば食品／臨床試験物）の試験である。
えば食品／臨床試験物）の試験である。
本発明のプローブは種々の型で使用でき、そのいくつ
かを以下に議論する。
かを以下に議論する。
抗体捕捉型 1.ある実施態様においては、低濃度の塩基（例えばNaO
H）で処理することにより細菌を溶菌する。
H）で処理することにより細菌を溶菌する。
2.溶菌後、溶液はビオチニル化プローブまたはプローブ
類を含む緩衝液により約pH7に中和され、必要なら、0.6
モル濃度までナトリウムまたはカリウム塩が添加され
る。ある実施態様では、中和、塩添加およびプローブ添
加がリン酸ナトリウムおよびプローブの濃縮溶液により
同時に実施される。
類を含む緩衝液により約pH7に中和され、必要なら、0.6
モル濃度までナトリウムまたはカリウム塩が添加され
る。ある実施態様では、中和、塩添加およびプローブ添
加がリン酸ナトリウムおよびプローブの濃縮溶液により
同時に実施される。
3.放置によりハイブリダイゼーションが起きる。
4.ある実施態様においては、試料は次のプローブ（類）
の非−特異的ハイブリダイゼーションによるプローブ／
標的複合体を分解させるために、高温にて高濃度のリボ
ヌクレアーゼおよび界面活性剤で処理される。
の非−特異的ハイブリダイゼーションによるプローブ／
標的複合体を分解させるために、高温にて高濃度のリボ
ヌクレアーゼおよび界面活性剤で処理される。
5.標的−プローブ複合体を含む溶液はDNA/RNAハイブリ
ッドに対して方向付けられた精製抗体（ポリクローナル
またはモノクローナル）を含む表面と接触させる。この
表面はプラスチックチューブ；マイクロタイタープレー
トウェル、計量棒、磁気ビーズまたはポリスチレンマイ
クロまたはマクロビーズの内側または外側にある。標的
−プローブ複合体は放置して抗体に結合させ、ハイブリ
ダイズしていないプローブおよび非サルモネラ（Slmone
lla）標的を室温で緩衝化溶液を用いて洗い流す。
ッドに対して方向付けられた精製抗体（ポリクローナル
またはモノクローナル）を含む表面と接触させる。この
表面はプラスチックチューブ；マイクロタイタープレー
トウェル、計量棒、磁気ビーズまたはポリスチレンマイ
クロまたはマクロビーズの内側または外側にある。標的
−プローブ複合体は放置して抗体に結合させ、ハイブリ
ダイズしていないプローブおよび非サルモネラ（Slmone
lla）標的を室温で緩衝化溶液を用いて洗い流す。
6.ストレプトアビジン−酵素複合体が添加され、インキ
ュベーション後過剰の複合体は洗浄して除去する。
ュベーション後過剰の複合体は洗浄して除去する。
7.次に酵素に対する発色物質をプラスチック表面に添加
すると溶液に生成物が形成される。
すると溶液に生成物が形成される。
8.チューブ内で発色した色は特異的標的に捕捉された量
の関数であり、分光光度計またはELISAプレート読みと
り器を用いて定量する。
の関数であり、分光光度計またはELISAプレート読みと
り器を用いて定量する。
ストレプトアビジン捕捉型 1.ある実施態様においては、細菌が溶菌され、中和後、
前記のごとくビオチニル化プローブまたはプローブの組
でハイブリダイズされる。もしくは、微生物細胞壁が酵
素処理により弱くされ、カオトロピック塩（例えばグア
ニジウム チオシアナート）およびプローブまたはプロ
ーブ類の添加により溶菌される。
前記のごとくビオチニル化プローブまたはプローブの組
でハイブリダイズされる。もしくは、微生物細胞壁が酵
素処理により弱くされ、カオトロピック塩（例えばグア
ニジウム チオシアナート）およびプローブまたはプロ
ーブ類の添加により溶菌される。
2.ある実施態様においてはハイブリダイゼーション後、
プローブ（類）の非特異的ハイブリダイゼーションによ
るプローブ／標的複合体を分解するため、高温にて高濃
度のリボヌクレアーゼおよび界面活性剤で試料を処理す
る。
プローブ（類）の非特異的ハイブリダイゼーションによ
るプローブ／標的複合体を分解するため、高温にて高濃
度のリボヌクレアーゼおよび界面活性剤で試料を処理す
る。
3.標的−プローブ複合体を含む溶液はここで結合ストレ
プトアビジン含有の表面と接触させる。抗体捕捉法にお
けるごとく、この表面は種々の構造でありえる。標的−
プローブ複合体および遊離プローブがビオチン−アビジ
ン架橋を通して表面に結合され、ハイブリダイズされて
いない核酸は一連の洗浄により除去される。
プトアビジン含有の表面と接触させる。抗体捕捉法にお
けるごとく、この表面は種々の構造でありえる。標的−
プローブ複合体および遊離プローブがビオチン−アビジ
ン架橋を通して表面に結合され、ハイブリダイズされて
いない核酸は一連の洗浄により除去される。
4.結合標的−プローブ複合体（DNA/RNAハイブリッド）
は過剰の表面結合遊離プローブから、DNA/RNAハイブリ
ッドに対して向かう特定の抗体を（ポリクローナルまた
はモノクローナル）添加することにより区別される。あ
る実施態様においては、この抗体は西洋ワサビペルオキ
シダーゼまたはアルカリホスファターゼのごとき酵素に
直接複合されている。
は過剰の表面結合遊離プローブから、DNA/RNAハイブリ
ッドに対して向かう特定の抗体を（ポリクローナルまた
はモノクローナル）添加することにより区別される。あ
る実施態様においては、この抗体は西洋ワサビペルオキ
シダーゼまたはアルカリホスファターゼのごとき酵素に
直接複合されている。
5.もし抗体酵素複合体がDNA/RNAハイブリッドとの結合
に使用されたら、次に基質が加えられ、結合酵素−プロ
ーブ−標的複合体は前述のごとく着色生成物の発生によ
り検出される。非複合第１次抗体は第１の抗体に対して
特異的な第２の抗体−酵素複合体（例えば、ヤギ抗マウ
ス西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体がモノクローナル
に対し）を添加し、続いて基質を添加し、着色生成物を
発生させることにより検出される。
に使用されたら、次に基質が加えられ、結合酵素−プロ
ーブ−標的複合体は前述のごとく着色生成物の発生によ
り検出される。非複合第１次抗体は第１の抗体に対して
特異的な第２の抗体−酵素複合体（例えば、ヤギ抗マウ
ス西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体がモノクローナル
に対し）を添加し、続いて基質を添加し、着色生成物を
発生させることにより検出される。
ホモポリマー捕捉−単−プローブ型 1. 細菌は前述の２つの溶菌法のどちらかで溶菌され
る。
る。
2. ３′末端に酵素的に20−200dA残基の尾を付けたプ
ローブまたはプローブ類でハブリダイゼーションを実施
する。
ローブまたはプローブ類でハブリダイゼーションを実施
する。
3. ある実施態様においては高濃度のRNAaseおよび界面
活性剤を添加し、非特異的にハイブリダイズした標的RN
Aを消化させる。
活性剤を添加し、非特異的にハイブリダイズした標的RN
Aを消化させる。
4. 標的−プローブ複合体を含む溶液は15−3000ヌクレ
オチドの長さの結合dTホモポリマーを含む表面とdTおよ
びプローブのdA“尾”間のハイブリダイゼーションが起
こるのであろう条件下接触させ、それにより残存する遊
離プローブのみでなく標的−プローブ複合体も捕捉す
る。
オチドの長さの結合dTホモポリマーを含む表面とdTおよ
びプローブのdA“尾”間のハイブリダイゼーションが起
こるのであろう条件下接触させ、それにより残存する遊
離プローブのみでなく標的−プローブ複合体も捕捉す
る。
5. ハイブリダイズしなかった核酸および細胞被片を洗
い流し、dA−dTホモポリマーを通して結合している捕捉
されたDNA/RNA複合体を残す。
い流し、dA−dTホモポリマーを通して結合している捕捉
されたDNA/RNA複合体を残す。
6. 結合標的−プローブ複合体（DNA/RNAハイブリッ
ド）はDNA/RNAハイブリッドに向かう特定の抗体（ポリ
クローナルまたはモノクローナル）の添加により表面結
合の過剰の遊離プローブから区別する。ある実施態様に
おいては、この抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼまた
はアルカリホスファターゼのごとき酵素へ直接複合され
ている。
ド）はDNA/RNAハイブリッドに向かう特定の抗体（ポリ
クローナルまたはモノクローナル）の添加により表面結
合の過剰の遊離プローブから区別する。ある実施態様に
おいては、この抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼまた
はアルカリホスファターゼのごとき酵素へ直接複合され
ている。
7. もし抗体酵素複合体がDNA/RNAハイブリッドへの結
合に使用されたら、次に基質を添加し、結合酵素−プロ
ーブ−標的複合体は着色生成物の発生により検出され
た。非複合第１の抗体は第１の抗体に対して特異的な第
２の抗体−酵素複合体（例えばモノクローナルに対する
ヤギ抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体）を
添加し、基質を添加し、着色生成物を発生させて検出で
きる。
合に使用されたら、次に基質を添加し、結合酵素−プロ
ーブ−標的複合体は着色生成物の発生により検出され
た。非複合第１の抗体は第１の抗体に対して特異的な第
２の抗体−酵素複合体（例えばモノクローナルに対する
ヤギ抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体）を
添加し、基質を添加し、着色生成物を発生させて検出で
きる。
ホモポリマー捕捉−二重プローブ型 1.細菌は、前述の２つの溶菌法のいずれかで溶菌する。
2.ハイブリダイゼーションは２つの異ったプローブで実
施し、少くともそのうちの１つは（両方である必要はな
い）良好にサルモネラ（Salmonella）標的分子とアニー
ルしなければならない。捕捉プローブまたはプローブ類
は３′末端に酵素的に20−200dA残基の尾を付け、レポ
ータープローブ（オリゴマーまたはボリマーDNAまたはR
NA）は化学的または酵素的にビオチンで標識する。
施し、少くともそのうちの１つは（両方である必要はな
い）良好にサルモネラ（Salmonella）標的分子とアニー
ルしなければならない。捕捉プローブまたはプローブ類
は３′末端に酵素的に20−200dA残基の尾を付け、レポ
ータープローブ（オリゴマーまたはボリマーDNAまたはR
NA）は化学的または酵素的にビオチンで標識する。
3.標的−プローブ複合体を含む溶液は15−3000ヌクレオ
チド長の結合dTホモポリマーを含む表面と、dTおよびプ
ローブのdA“尾”間でハイブリダイゼーションが起こる
であろう条件下接触させ、それにより残存する遊離捕捉
プローブのみでなく標的−プローブ複合体も捕捉する。
チド長の結合dTホモポリマーを含む表面と、dTおよびプ
ローブのdA“尾”間でハイブリダイゼーションが起こる
であろう条件下接触させ、それにより残存する遊離捕捉
プローブのみでなく標的−プローブ複合体も捕捉する。
4.ハイブリダイズされなかった核酸および細胞破片は洗
い流し、dA−dTポリマーを経て結合された捕捉DNA/RNA
複合体を残す。
い流し、dA−dTポリマーを経て結合された捕捉DNA/RNA
複合体を残す。
5.結合されたビオチニル化レポータープローブは、前記
抗体捕捉型で記載されたごとく、ストレプトアビジン−
酵素複合体を添加し、インキュベーションして特異的結
合をおこさせ、非結合複合体を洗浄して除去し、基質を
添加し、続いての発色により検出する。
抗体捕捉型で記載されたごとく、ストレプトアビジン−
酵素複合体を添加し、インキュベーションして特異的結
合をおこさせ、非結合複合体を洗浄して除去し、基質を
添加し、続いての発色により検出する。
検定においてどのおよびどのようなサルモネラ（Salm
onella）−特異性および非特異性プローブが用いられる
かに依存して、すぐ前に記載した二重プローブ型の異っ
たバージョンから異った結果が導かれるであろう。いく
つかの可能な変異体が図８に例示してあり、16Sおよび2
3S rRNAの両方が（個々にまたは一緒に）二重プローブ
（特異的捕捉／一般的検出）または二重特異的（捕促／
検出）戦略にかけることができることが強調されてい
る。例示された組合せの基本的相違は捕捉／検出プロー
ブの特異的／一般的または特異的／特異的な組合せの別
個の使用法から導かれる。最も簡単な場合の考察が例示
されている。例えば図８のライン１および２を比較せ
よ。ライン１は特異的／特異的二重プローブ検出スキー
ムを例示し；ライン２は特異的／一般的二重プローズス
キームを例示している。
onella）−特異性および非特異性プローブが用いられる
かに依存して、すぐ前に記載した二重プローブ型の異っ
たバージョンから異った結果が導かれるであろう。いく
つかの可能な変異体が図８に例示してあり、16Sおよび2
3S rRNAの両方が（個々にまたは一緒に）二重プローブ
（特異的捕捉／一般的検出）または二重特異的（捕促／
検出）戦略にかけることができることが強調されてい
る。例示された組合せの基本的相違は捕捉／検出プロー
ブの特異的／一般的または特異的／特異的な組合せの別
個の使用法から導かれる。最も簡単な場合の考察が例示
されている。例えば図８のライン１および２を比較せ
よ。ライン１は特異的／特異的二重プローブ検出スキー
ムを例示し；ライン２は特異的／一般的二重プローズス
キームを例示している。
これらの異った戦略を用いたいくつかの可能な仮定の
結果が図９に示してある。例示の結果は仮定のサルモネ
ラ（Salmonella）プローブＡおよびＢに対しハイブリダ
イゼーション陽性および陰性がほとんど無作為に分布す
るのを反映するように任意に選択してある。実際にはこ
こに記載された多くのサルモネラ（Salmonella）−特異
性プローブに対する適切な分布は無作為からはかけ離れ
ている。プローブＧは通常検定条件下任意の16Sまたは2
3S rRNA標的分子にハイブリダイズするであろう（一般
的プローブの特異性に依存して；すなわち16Sのためま
たは23Sのため）非特異的（すなわちＧ＝一般的）検出
プローブを例示している。
結果が図９に示してある。例示の結果は仮定のサルモネ
ラ（Salmonella）プローブＡおよびＢに対しハイブリダ
イゼーション陽性および陰性がほとんど無作為に分布す
るのを反映するように任意に選択してある。実際にはこ
こに記載された多くのサルモネラ（Salmonella）−特異
性プローブに対する適切な分布は無作為からはかけ離れ
ている。プローブＧは通常検定条件下任意の16Sまたは2
3S rRNA標的分子にハイブリダイズするであろう（一般
的プローブの特異性に依存して；すなわち16Sのためま
たは23Sのため）非特異的（すなわちＧ＝一般的）検出
プローブを例示している。
結果１は単一の特異的（捕捉）プローブ（Ａ）および
一般的検出プローブ（Ｇ）も用いることに基づいてい
る。本質において、結果はプローブＡの包含的および非
他的性質により規定される。プローブＧはプローブＡが
捕捉したすべてのものを検出する。
一般的検出プローブ（Ｇ）も用いることに基づいてい
る。本質において、結果はプローブＡの包含的および非
他的性質により規定される。プローブＧはプローブＡが
捕捉したすべてのものを検出する。
結果２は戦略１の拡張であり、特異的捕捉プローブＡ
およびＢに付随する包含的および排他的性質の加成性に
基づいている。２の場合には包含性が１より改良されて
いるが排他性は悪くなっていることに注目されたい。
およびＢに付随する包含的および排他的性質の加成性に
基づいている。２の場合には包含性が１より改良されて
いるが排他性は悪くなっていることに注目されたい。
戦略３（二重特異性オリゴ型）の結果は慨念的に戦略
１または２の結果と異っている。プローブＡおよびＢに
付随する包含的および排他的組を加えるというより、Ａ
およびＢの両方にハイブリダイズする微生物のみが二重
特異的オリゴ型では陽性として含まれている。例えば、
微生物N7の標的分子はプローブＡで捕捉されるがプロー
ブＢでは検出できない。反対に、微生物N8の標的分子は
プローブＢで検出できるのであろうがＡにより捕捉され
ないので検出するために利用できない。
１または２の結果と異っている。プローブＡおよびＢに
付随する包含的および排他的組を加えるというより、Ａ
およびＢの両方にハイブリダイズする微生物のみが二重
特異的オリゴ型では陽性として含まれている。例えば、
微生物N7の標的分子はプローブＡで捕捉されるがプロー
ブＢでは検出できない。反対に、微生物N8の標的分子は
プローブＢで検出できるのであろうがＡにより捕捉され
ないので検出するために利用できない。
戦略３は、最初の２つよりも理論的に有用ではないよ
うに思われ、なぜなら包含性および排他性のプロフィー
ルは等しくおよび“交互の使用”を相殺しているようで
ある。しかしながら、種々の腸内細菌（サルモネラ（Sl
monella）を含む）の16Sおよび23S rRNA中のヌクレオチ
ド配列のパターンについての我々の観察および異なった
標的部に種々の特異性を持つプローブの観察されたハイ
ブリダイゼーションパターンに基づくと： １） 異なった潜在的サルモネラ（Salmonella）−特異
的標的領域はサルモネラ（Salmonella）間のみではなく
サルモネラ（Salmonella）および種々の非サルモネラ
（Salmonella）菌間の配列変異の明らかに異なり、しか
もランダムではないパターンを示すこと、 ２） 特に、シトロバクター（Citrobacter）およびエ
ンテロバクター（Enterobacter）属に属する細菌（他の
腸内属は除く）は種々のさもなくば事実上のサルモネラ
（Salmonella）−特異性プローブへのハイブリダイゼー
ションに関しても最も“問題”であること、および ３） 既知の情報に基づくと（系統発生的および／また
は生化学的特性の情報を含む）、配列変異の観察された
パターンは完全に予測できないことが結論された。
うに思われ、なぜなら包含性および排他性のプロフィー
ルは等しくおよび“交互の使用”を相殺しているようで
ある。しかしながら、種々の腸内細菌（サルモネラ（Sl
monella）を含む）の16Sおよび23S rRNA中のヌクレオチ
ド配列のパターンについての我々の観察および異なった
標的部に種々の特異性を持つプローブの観察されたハイ
ブリダイゼーションパターンに基づくと： １） 異なった潜在的サルモネラ（Salmonella）−特異
的標的領域はサルモネラ（Salmonella）間のみではなく
サルモネラ（Salmonella）および種々の非サルモネラ
（Salmonella）菌間の配列変異の明らかに異なり、しか
もランダムではないパターンを示すこと、 ２） 特に、シトロバクター（Citrobacter）およびエ
ンテロバクター（Enterobacter）属に属する細菌（他の
腸内属は除く）は種々のさもなくば事実上のサルモネラ
（Salmonella）−特異性プローブへのハイブリダイゼー
ションに関しても最も“問題”であること、および ３） 既知の情報に基づくと（系統発生的および／また
は生化学的特性の情報を含む）、配列変異の観察された
パターンは完全に予測できないことが結論された。
プローブ 前述のプローブ選択戦略により、試料中のサルモネラ
（Salmonella）菌を同定するのに多くのプローブが得ら
れた。プローブ選択法の最初の工程はS.チフィミリウム
（typhimurium）およびS.アリゾナ（arizona）の16Sお
よび23S rRNAのヌクレオチド配列分析を実施することで
ある。これらのサルモネラ（Salmonella）配列と非サル
モネラ（Salmonella）rRNA配列（特に大腸菌）の比較に
より排他性基準を満足する配列が同定された、即ち、そ
れらは本質的にサルモネラ（Salmonella）特異的であ
り、それ故それらはプローブが方向付けられる潜在的標
的領域である。
（Salmonella）菌を同定するのに多くのプローブが得ら
れた。プローブ選択法の最初の工程はS.チフィミリウム
（typhimurium）およびS.アリゾナ（arizona）の16Sお
よび23S rRNAのヌクレオチド配列分析を実施することで
ある。これらのサルモネラ（Salmonella）配列と非サル
モネラ（Salmonella）rRNA配列（特に大腸菌）の比較に
より排他性基準を満足する配列が同定された、即ち、そ
れらは本質的にサルモネラ（Salmonella）特異的であ
り、それ故それらはプローブが方向付けられる潜在的標
的領域である。
この分析により有用なまたは潜在的に有用なサルモネ
ラ（Salmonella）特異的配列を含むrRNAの５つの領域を
得た（３つは23S中であり２つは16S中である）。これら
の領域の位置は、大腸菌rRNA中の構造および進化的相同
体の位置に関連して図１（23S rRNA）および図２（16 r
RNA）で円で囲んだ領域で示されている。相同的rRNAは
微生物から微生物でその大きさがいく分異っているた
め、および、すべての場合でサルモネラ（Salmonella）
rRNAの正確な５′ヌクレオチド（慣例により位置番号１
と名付けられる）が証明されていないので、通常行われ
ているごとき大腸菌番号付けシステムを使用すると細菌
rRNA配列の領域の呼称のあいまいさが最小となる。
ラ（Salmonella）特異的配列を含むrRNAの５つの領域を
得た（３つは23S中であり２つは16S中である）。これら
の領域の位置は、大腸菌rRNA中の構造および進化的相同
体の位置に関連して図１（23S rRNA）および図２（16 r
RNA）で円で囲んだ領域で示されている。相同的rRNAは
微生物から微生物でその大きさがいく分異っているた
め、および、すべての場合でサルモネラ（Salmonella）
rRNAの正確な５′ヌクレオチド（慣例により位置番号１
と名付けられる）が証明されていないので、通常行われ
ているごとき大腸菌番号付けシステムを使用すると細菌
rRNA配列の領域の呼称のあいまいさが最小となる。
図１および２を参照すると決定的サルモネラ（Salmon
ella）−特異性配列は： １） 領域 〜1405−1597;23S rRNA; ２） 領域 〜1700−1760;23S rRNA; ３） 領域 〜430−510;16S rRNAである。
ella）−特異性配列は： １） 領域 〜1405−1597;23S rRNA; ２） 領域 〜1700−1760;23S rRNA; ３） 領域 〜430−510;16S rRNAである。
さらに図１および２を参照すると可能なサルモネラ
（Salmonella）−特異性配列は： １） 領域 〜997−1045;16S rRNA; ２） 領域 〜512−580;23S rRNAである。
（Salmonella）−特異性配列は： １） 領域 〜997−1045;16S rRNA; ２） 領域 〜512−580;23S rRNAである。
これらのサルモネラ（Salmonella）−特異的領域およ
び関連するプローブについて以下に詳細に説明する。こ
れらの領域へのプローブを用いる液体ハイブリダイゼー
ション検定はカオトロピックおよび非カオトロピック条
件下、これらの領域中の標的配列の良好な到達可能性を
示す。一般に、良好な感度もまた達成された。図中に示
したすべてのプローブは議論されないが各々のプローブ
は本発明に有用であった。さらに、上に議論されたガイ
ドラインを用いて他のプローブも容易に構築されるであ
ろう。これらの実施例は本発明を制限するものではな
い。
び関連するプローブについて以下に詳細に説明する。こ
れらの領域へのプローブを用いる液体ハイブリダイゼー
ション検定はカオトロピックおよび非カオトロピック条
件下、これらの領域中の標的配列の良好な到達可能性を
示す。一般に、良好な感度もまた達成された。図中に示
したすべてのプローブは議論されないが各々のプローブ
は本発明に有用であった。さらに、上に議論されたガイ
ドラインを用いて他のプローブも容易に構築されるであ
ろう。これらの実施例は本発明を制限するものではな
い。
１） 23S rRNA領域1405−1597 この領域は図３に示さ
れている。その23S rRNA配列がこの領域を通って調べら
れたかぎりのサルモネラ（Salmonella）株では、１つの
構造パターンが観察されている。その１つ（パターン１
と称される）は大腸菌において観察されるものと同一で
あり、それ故定義によりサルモネラ（Salmonella）−特
異的配列ではない。それにもかかわらず、この配列パタ
ーンに相補的なプローブはある種のサルモネラ（Salmon
ella）rRNAと有用で重要な様式でハイブリダイズする
（以下参照）。他のもの（パターン２と称される）はS.
チフィムリウム（typhimurium）株e23566の23S rRNA中
に存在すると元々決定されていたものと同一である（図
３に示されている）。パターン２は、この領域を通して
大腸菌（パターン１）配列に関して示されたヌクレオチ
ド配列相違に加えて２つのヌクレオチド挿入物を含んで
おり、パターン１含有rRNAと比較して異った二次構造を
採っていることが予想できる。
れている。その23S rRNA配列がこの領域を通って調べら
れたかぎりのサルモネラ（Salmonella）株では、１つの
構造パターンが観察されている。その１つ（パターン１
と称される）は大腸菌において観察されるものと同一で
あり、それ故定義によりサルモネラ（Salmonella）−特
異的配列ではない。それにもかかわらず、この配列パタ
ーンに相補的なプローブはある種のサルモネラ（Salmon
ella）rRNAと有用で重要な様式でハイブリダイズする
（以下参照）。他のもの（パターン２と称される）はS.
チフィムリウム（typhimurium）株e23566の23S rRNA中
に存在すると元々決定されていたものと同一である（図
３に示されている）。パターン２は、この領域を通して
大腸菌（パターン１）配列に関して示されたヌクレオチ
ド配列相違に加えて２つのヌクレオチド挿入物を含んで
おり、パターン１含有rRNAと比較して異った二次構造を
採っていることが予想できる。
図３を参照すると、“414"と称される合成プローブは
S.チフィムリウム（typhimurium）23S 1405−1597領域
（図３にまた示してある）の部分と相補的配列を持って
いる。プローブ414はサルモネラ（Salmonella）および
非サルモネラ（Salmonella）株を用いるドットブロット
分析において良好な排他的特性を示すことが示されてい
る、即ち、それがパターン２含有rRNAにハイブリダイズ
する条件下、大腸菌または表１にリストした腸内細菌種
の代表的株外の64のほとんどのrRNAへはハイブリダイズ
しない。広範囲なドットブロットハイブリダイゼーショ
ン試験によりプローブ414が検定または検定に近い条件
下ハイブリダイズするであろう若干のシトロバクター
（Citrobacter）ｏおよびエンテロバクター（Enterobac
ter）が明らかにされた。（排他的データは図10に提供
されている） プローブ414の包含性特性もまた有用であるのが観察
されている； プローブは試験されたサルモネラ（Salmonella）株の
91％（311/343）のrRNAへハイブリダイズしたが、ドッ
トプロットハイブリダイゼーション検定においては試験
されたS.アリゾナ（arizona）株の66％（27/41）しか検
出されず;94％（285〜303）の非S.アリゾナ（arizona）
株がプローブ414により検出された。
S.チフィムリウム（typhimurium）23S 1405−1597領域
（図３にまた示してある）の部分と相補的配列を持って
いる。プローブ414はサルモネラ（Salmonella）および
非サルモネラ（Salmonella）株を用いるドットブロット
分析において良好な排他的特性を示すことが示されてい
る、即ち、それがパターン２含有rRNAにハイブリダイズ
する条件下、大腸菌または表１にリストした腸内細菌種
の代表的株外の64のほとんどのrRNAへはハイブリダイズ
しない。広範囲なドットブロットハイブリダイゼーショ
ン試験によりプローブ414が検定または検定に近い条件
下ハイブリダイズするであろう若干のシトロバクター
（Citrobacter）ｏおよびエンテロバクター（Enterobac
ter）が明らかにされた。（排他的データは図10に提供
されている） プローブ414の包含性特性もまた有用であるのが観察
されている； プローブは試験されたサルモネラ（Salmonella）株の
91％（311/343）のrRNAへハイブリダイズしたが、ドッ
トプロットハイブリダイゼーション検定においては試験
されたS.アリゾナ（arizona）株の66％（27/41）しか検
出されず;94％（285〜303）の非S.アリゾナ（arizona）
株がプローブ414により検出された。
プローブ414（またはその誘導体）が結局利用される
プローブの組の他のプローブの挙動特性と“つり合わせ
る”ためにプローブ414の変異体が設計された。それら
のいくつかは図３に示してある。
プローブの組の他のプローブの挙動特性と“つり合わせ
る”ためにプローブ414の変異体が設計された。それら
のいくつかは図３に示してある。
図３を参照すると“791"と称される合成プローブはS.
アリゾナ（arizona）（および大腸菌）23S 1405−1597
領域（図３に示されている）の部分と相補的な配列を持
っている。プローブ791は前に使用された同一のサルモ
ネラ（Salmonella）および非サルモネラ（Salmonella）
株を用いる（また本研究を通して使用される）、ドット
ブロット分析において、プローブ414により示された包
含的特性と相補的な包含的特性を示した。即ち、２つの
プローブを合わせると我々の試験パネル中に含まれるす
べてのサルモネラ（Salmonella）株のrRNAとハイブリダ
イズ（検出）した（即ち、サルモネラ（Salmonella）に
対し100％の包含性であり、最近記載された新しいサル
モネラ群−群VIに属する多数のサルモネラ（Salmonell
a）を含む）。プローブ791のハイブリダイゼーションプ
ロフィールは厳密にはプローブ414のものと相補的では
ない；プローブ414がハイブリダイズしなかったサルモ
ネラ（Salmonella）株にハイブリダイズする（期待され
たごとく）一方、プローブ414がハイブリダイズするも
のと同一の多くの菌株ともきわめて強くハイブリダイズ
した。このことはこれらの菌株のrRNA集団に潜在的な配
列不均一性の証拠となるであろう−これまで観測されて
いない何か。プローブ791の貧しい排他特性の為、前述
のおよび以下により詳細に記載される二重特異的捕捉／
検出戦略を除いて前記のほとんどの検出型での使用は除
外される。
アリゾナ（arizona）（および大腸菌）23S 1405−1597
領域（図３に示されている）の部分と相補的な配列を持
っている。プローブ791は前に使用された同一のサルモ
ネラ（Salmonella）および非サルモネラ（Salmonella）
株を用いる（また本研究を通して使用される）、ドット
ブロット分析において、プローブ414により示された包
含的特性と相補的な包含的特性を示した。即ち、２つの
プローブを合わせると我々の試験パネル中に含まれるす
べてのサルモネラ（Salmonella）株のrRNAとハイブリダ
イズ（検出）した（即ち、サルモネラ（Salmonella）に
対し100％の包含性であり、最近記載された新しいサル
モネラ群−群VIに属する多数のサルモネラ（Salmonell
a）を含む）。プローブ791のハイブリダイゼーションプ
ロフィールは厳密にはプローブ414のものと相補的では
ない；プローブ414がハイブリダイズしなかったサルモ
ネラ（Salmonella）株にハイブリダイズする（期待され
たごとく）一方、プローブ414がハイブリダイズするも
のと同一の多くの菌株ともきわめて強くハイブリダイズ
した。このことはこれらの菌株のrRNA集団に潜在的な配
列不均一性の証拠となるであろう−これまで観測されて
いない何か。プローブ791の貧しい排他特性の為、前述
のおよび以下により詳細に記載される二重特異的捕捉／
検出戦略を除いて前記のほとんどの検出型での使用は除
外される。
プローブ791（またはその誘導体）が最終的に使用さ
れるプローブの組の他のプローブの挙動特性と“つり合
わせる”ためにプローブ791の変異体が設計できる。そ
れらのいくつかは図３に示されている。
れるプローブの組の他のプローブの挙動特性と“つり合
わせる”ためにプローブ791の変異体が設計できる。そ
れらのいくつかは図３に示されている。
プローブ414および791は前述のごとき種々の溶液ハイ
ブリダイゼーション検定型下その標的領域への到達可能
を示すために試験された。これらの試験は各々の場合に
おいて標的領域はプローブに到達可能であることを示し
た。
ブリダイゼーション検定型下その標的領域への到達可能
を示すために試験された。これらの試験は各々の場合に
おいて標的領域はプローブに到達可能であることを示し
た。
２） 23S rRNA領域1700−1760 この領域は図４に示さ
れており、ヌクレオチド1712および1746の間に濃縮され
ている“サルモネラ（Salmonella）特異的”配列から成
っている。
れており、ヌクレオチド1712および1746の間に濃縮され
ている“サルモネラ（Salmonella）特異的”配列から成
っている。
２つの主たるサルモネラ（Salmonella）特異的配列パ
ターンはこの領域に観察されている。パターン１はS.チ
フィムリウム（typhimurium）株e23566から誘導された
配列により定義される。図４を参照すると、パターン１
の配列のこの領域の部分と相補的な“411"と称されるプ
ローブが構築されている。プローブ411はドットブロッ
ト（包含性および排他性）および溶液ハイブリダイゼー
ション（到達性）試験にかけられ、そのすべてがプロー
ブ、その誘導体、変異体および断片の有用性を示してい
る。
ターンはこの領域に観察されている。パターン１はS.チ
フィムリウム（typhimurium）株e23566から誘導された
配列により定義される。図４を参照すると、パターン１
の配列のこの領域の部分と相補的な“411"と称されるプ
ローブが構築されている。プローブ411はドットブロッ
ト（包含性および排他性）および溶液ハイブリダイゼー
ション（到達性）試験にかけられ、そのすべてがプロー
ブ、その誘導体、変異体および断片の有用性を示してい
る。
ドットブロット分析において411プローブは非常に多
数のサルモネラ（Salmonella）株（317/323＝92％）のr
RNAとハイブリダイズした。これらと同一の条件下411プ
ローブは前述のヌクレオチド配列分析から予測されるご
とく、試験された多数のS.アリゾナ（arizona）株（S.
アリゾナ（arizona）株の22で“失敗した”）のrRNAと
はハイブリダイズしなかった。残りの“失敗”はほとん
どDNA相同性群Ｖに属する“非定型”サルモネラ（Salmo
nella）の混合物である。
数のサルモネラ（Salmonella）株（317/323＝92％）のr
RNAとハイブリダイズした。これらと同一の条件下411プ
ローブは前述のヌクレオチド配列分析から予測されるご
とく、試験された多数のS.アリゾナ（arizona）株（S.
アリゾナ（arizona）株の22で“失敗した”）のrRNAと
はハイブリダイズしなかった。残りの“失敗”はほとん
どDNA相同性群Ｖに属する“非定型”サルモネラ（Salmo
nella）の混合物である。
プローブ411の排地特性もまたドットブロット分析に
より試験された。非サルモネラ（Salmonella）菌へのハ
イブリダイゼーションは若干のC.フロインジ（freundi
i）およびC.ダイバーサス（diversus）株に限定されて
いる事が観測され、プローブ411の変異体は非常に弱く
しかハイブリダイズしなかった（図10）。
より試験された。非サルモネラ（Salmonella）菌へのハ
イブリダイゼーションは若干のC.フロインジ（freundi
i）およびC.ダイバーサス（diversus）株に限定されて
いる事が観測され、プローブ411の変異体は非常に弱く
しかハイブリダイズしなかった（図10）。
プローブ441（またはその誘導体）が最終的に使用さ
れるプローブの組の他のプローブの挙動特性に“つり合
わせる”ためにプローブ441の変異体が設計された。そ
れらのいくつかは図３に示されている。
れるプローブの組の他のプローブの挙動特性に“つり合
わせる”ためにプローブ441の変異体が設計された。そ
れらのいくつかは図３に示されている。
1700−1760領域中に観察される第２の配列パターン
（パターン２）はS.アリゾナ（arizona）株RF 908から
由来する配列から定義される（図４）。それはパターン
１配列から十分に異っているのでRF 908はプローブ411
により検出されない。
（パターン２）はS.アリゾナ（arizona）株RF 908から
由来する配列から定義される（図４）。それはパターン
１配列から十分に異っているのでRF 908はプローブ411
により検出されない。
図４を参照すると“690"、“799"および“800"と称さ
れる合成プローブはS.アリゾナ（arizona）RF 908 23S
1700−1760領域（図４に同様に示してある）の種々の部
分と相補的な配列を持っている。前記のプローブ791の
場合と類似の方法において、すべてがこの標的領域に対
するプローブ411の包含性プロフィールを補う。即ち、
プローブ411にプローブ690、799、または800の任意の１
つを加えると一緒に合わせて、我々の標準コレクション
中のすべてのサルモネラ（Salmonella）に対し100％の
包含的である。３つのパターン２−特異的プローブはそ
の排地的挙動において幾分異っており、プローブ800が
（わずかな差で）現在最良の排地プロフィールを示して
いる。これらの種々のプローブを組合わせた合計の排地
プロフィールは図９に見ることができる。種々のC.フロ
インジ（freundii）およびC.ダイバーサス（diversus）
株への交差ハイブリダイゼーションは明らかである。い
くつかのサルモネラ（Salmonella）診断検定には、非サ
ルモネラ（Salmonella）交差ハイブリダイゼーションの
このパターンは受け入れられるであろう。なぜなら例え
ば、これらの特定の非サルモネラ（Salmonella）菌は特
定の適用においては通常遭遇しない；または本試験の速
度、感度；価格効率および／または包含性のため得られ
たいくつかの陽性物を経済的にも容易に再試験できる。
れる合成プローブはS.アリゾナ（arizona）RF 908 23S
1700−1760領域（図４に同様に示してある）の種々の部
分と相補的な配列を持っている。前記のプローブ791の
場合と類似の方法において、すべてがこの標的領域に対
するプローブ411の包含性プロフィールを補う。即ち、
プローブ411にプローブ690、799、または800の任意の１
つを加えると一緒に合わせて、我々の標準コレクション
中のすべてのサルモネラ（Salmonella）に対し100％の
包含的である。３つのパターン２−特異的プローブはそ
の排地的挙動において幾分異っており、プローブ800が
（わずかな差で）現在最良の排地プロフィールを示して
いる。これらの種々のプローブを組合わせた合計の排地
プロフィールは図９に見ることができる。種々のC.フロ
インジ（freundii）およびC.ダイバーサス（diversus）
株への交差ハイブリダイゼーションは明らかである。い
くつかのサルモネラ（Salmonella）診断検定には、非サ
ルモネラ（Salmonella）交差ハイブリダイゼーションの
このパターンは受け入れられるであろう。なぜなら例え
ば、これらの特定の非サルモネラ（Salmonella）菌は特
定の適用においては通常遭遇しない；または本試験の速
度、感度；価格効率および／または包含性のため得られ
たいくつかの陽性物を経済的にも容易に再試験できる。
プローブ411（またはその誘導体）が最終的に使用さ
れるプローブの組の他のプローブの挙動特性“つり合わ
せる”ためにこれらのパターン２特異性プローブの変異
体が設計できる。特に、上述の２つのプローブ組は二重
特異性オリゴ捕捉／検出検定型（これも上述されてい
る）に乗りやすい。図10を参照すると、例えばプローブ
411にプローブ800を加えてオリゴアデノシン−尾標的−
捕捉プローブとして、およびプローブ414にプローブ791
を加えて例えばヒチオニル検定プローブとして使用し、
この二重特異性型において、集合的にすべてのサルモネ
ラ（Salmonella）菌を検出し（100％包含性）、ほとん
ど非サルモネラ（Salmonella）菌を検出しないプローブ
“組”が創り出される。（逆もまた働くであろう。即
ち、41プラス7914捕捉および411プラス800検出、しか
し、プローブ791のわずかに広範囲な交差ハイブリダイ
ゼーションのため捕捉効率が多分少し悪くなるであろ
う。） ある種のC.ダイバーサス（diversus）株への低レベル
でのハイブリダイゼーションが予測される。しかし、捕
捉および検出プローブ組の両方がC.ダイバーサス（dive
rsus）にごく弱くしか各々ハイブリダイズしないので合
計された捕捉／検出プローブのC.ダイバーサス（divers
us）へのハイブリダイゼーションのレベルは受け入れら
れるぐらい小さいであろう。S.ダレッサラム（daressal
aam）により示される第３のサルモネラ（Salmonella）
−特異性配列パターンもまた図４に示されている。プロ
ーブ802はこの第３のパターンに相補的である。
れるプローブの組の他のプローブの挙動特性“つり合わ
せる”ためにこれらのパターン２特異性プローブの変異
体が設計できる。特に、上述の２つのプローブ組は二重
特異性オリゴ捕捉／検出検定型（これも上述されてい
る）に乗りやすい。図10を参照すると、例えばプローブ
411にプローブ800を加えてオリゴアデノシン−尾標的−
捕捉プローブとして、およびプローブ414にプローブ791
を加えて例えばヒチオニル検定プローブとして使用し、
この二重特異性型において、集合的にすべてのサルモネ
ラ（Salmonella）菌を検出し（100％包含性）、ほとん
ど非サルモネラ（Salmonella）菌を検出しないプローブ
“組”が創り出される。（逆もまた働くであろう。即
ち、41プラス7914捕捉および411プラス800検出、しか
し、プローブ791のわずかに広範囲な交差ハイブリダイ
ゼーションのため捕捉効率が多分少し悪くなるであろ
う。） ある種のC.ダイバーサス（diversus）株への低レベル
でのハイブリダイゼーションが予測される。しかし、捕
捉および検出プローブ組の両方がC.ダイバーサス（dive
rsus）にごく弱くしか各々ハイブリダイズしないので合
計された捕捉／検出プローブのC.ダイバーサス（divers
us）へのハイブリダイゼーションのレベルは受け入れら
れるぐらい小さいであろう。S.ダレッサラム（daressal
aam）により示される第３のサルモネラ（Salmonella）
−特異性配列パターンもまた図４に示されている。プロ
ーブ802はこの第３のパターンに相補的である。
３） 16S rRNA領域430−510 この領域は図５に示して
あり、455−477の位置に濃縮された“サルモネラ（Salm
onella）特異性”配列からなる。この領域を通してその
16S rRNA配列が得られているサルモネラ（Salmonella）
株には少くとも４つの異ったサルモネラ（Salmonella）
−特異的構造パターンが観察されている（図５に示され
ている）。パターン１は最初S.チフィムリウム（typhim
urium）e23566からクローン化された16S rRNA遺伝子の
ヌクレオチド配列決定で発見された。このおよび他のサ
ルモネラ（Salmonella）からの16S rRNA中のこの標的領
域の続いての配列分析はパターン１は属内で広く表現さ
れていることを示した。
あり、455−477の位置に濃縮された“サルモネラ（Salm
onella）特異性”配列からなる。この領域を通してその
16S rRNA配列が得られているサルモネラ（Salmonella）
株には少くとも４つの異ったサルモネラ（Salmonella）
−特異的構造パターンが観察されている（図５に示され
ている）。パターン１は最初S.チフィムリウム（typhim
urium）e23566からクローン化された16S rRNA遺伝子の
ヌクレオチド配列決定で発見された。このおよび他のサ
ルモネラ（Salmonella）からの16S rRNA中のこの標的領
域の続いての配列分析はパターン１は属内で広く表現さ
れていることを示した。
図５を参照すると、“643"、“676"、“788"、“806"
および“807"と称される多数の合成プローブは16S 430
−510領域を含むパターン１の種々の部分に相補的な配
列を持っている。これらのプローブのすべてが、異った
効率で“典型的な”サルモネラ（Salmonella）の大部分
と（329/全体は343）ハイブリダイズするが、“不定型
の”群（群IV、ＶおよびVI）に対しては“むら”に振ま
い、なお我々のS.アリゾナ（arizona）単離物の5/43に
はハイブリダイズしなかった。
および“807"と称される多数の合成プローブは16S 430
−510領域を含むパターン１の種々の部分に相補的な配
列を持っている。これらのプローブのすべてが、異った
効率で“典型的な”サルモネラ（Salmonella）の大部分
と（329/全体は343）ハイブリダイズするが、“不定型
の”群（群IV、ＶおよびVI）に対しては“むら”に振ま
い、なお我々のS.アリゾナ（arizona）単離物の5/43に
はハイブリダイズしなかった。
排地的挙動に関しては、これらのパターン１プローブ
はシトロバクター フロインジ（Citrobacter freundi
i）,C.ダイバーサス（diversus），エンテロバクター
クロアカエ（Enterobacter cloacae）およびE.サカザキ
（sakazakii）のあるものと交差ハイブリダイズするが
全部ではない（図10）。これらの微生物の16S rRNAから
のこの領域の配列分析はこれらの種および‘典型的’な
サルモネラ（Salmonella）間の進化的関係は現在一般的
に認められているよりも近いことを示している。
はシトロバクター フロインジ（Citrobacter freundi
i）,C.ダイバーサス（diversus），エンテロバクター
クロアカエ（Enterobacter cloacae）およびE.サカザキ
（sakazakii）のあるものと交差ハイブリダイズするが
全部ではない（図10）。これらの微生物の16S rRNAから
のこの領域の配列分析はこれらの種および‘典型的’な
サルモネラ（Salmonella）間の進化的関係は現在一般的
に認められているよりも近いことを示している。
この標的領域中に発見された第２のサルモネラ（Salm
onella）特異的 配列はS.アリゾナ（arizona）（RF 908）の16S rRNA
（および16S rRNA遺伝子）から由来している（パターン
２）。
onella）特異的 配列はS.アリゾナ（arizona）（RF 908）の16S rRNA
（および16S rRNA遺伝子）から由来している（パターン
２）。
パターン２はヌクレオチド配列がパターン１とは十分
に異っており、パターン１に対するプローブが受け入れ
られる排地的挙動を示すハイブリダイゼーション条件下
（ストリンジェンシー）、それらはパターン２含有rRNA
にはハイブリダイズしない。これまでこの標的領域パタ
ーンに特異的な１つのプローブが構成され（第678プロ
ーブおよび標的配列は図５に与えてある）、試験され
た。それはある種のS.アリゾナ（arizona）株のみにし
かハイブリダイズしない。プローブ678はS.アリゾナ（a
rizona）株のその亜集団に非常に特異的であり、我々の
コレクションの他のサルモネラ（Salmonella）または非
サルモネラ（Salmonella）のどれともハイブリダイズし
ない。
に異っており、パターン１に対するプローブが受け入れ
られる排地的挙動を示すハイブリダイゼーション条件下
（ストリンジェンシー）、それらはパターン２含有rRNA
にはハイブリダイズしない。これまでこの標的領域パタ
ーンに特異的な１つのプローブが構成され（第678プロ
ーブおよび標的配列は図５に与えてある）、試験され
た。それはある種のS.アリゾナ（arizona）株のみにし
かハイブリダイズしない。プローブ678はS.アリゾナ（a
rizona）株のその亜集団に非常に特異的であり、我々の
コレクションの他のサルモネラ（Salmonella）または非
サルモネラ（Salmonella）のどれともハイブリダイズし
ない。
この標的領域中に発見された第３のサルモネラ（Salm
onella）−特異的配列（パターン３）は最初S.ウェスラ
コ（weslaco）の16S rRNAで観察された。他のサルモネ
ラ（Salmonella）の16S rRNAの続いての配列分析により
S.ボンガー（bongor）およびS.リオグランデ（riogrand
e）のrRNAを含む多数の他の株中にこのパターンの存在
が明らかにされた。パターン３は一次構造においてパタ
ーン１非常に密接に関連しており、パターン１とただ１
つの位置が異っている（図５参照）。通常用いられるハ
イブリダイゼーション、ストリンジェンシーにおいて、
（即ち、受け入れ可能な排地的挙動を提供するように実
験的に決定される）この１つのヌクレオチドの相違はパ
ターン１プローブ（例えば676）およびパターン３の標
的配列（例えばS.ボンガー（bongor））間の交差ハイブ
リダイゼーションを消滅させるわけではないが、有意に
減少させる（約６倍）のに十分である。非常に高いハイ
ブリダイゼーション ストリンジェンシーまたはリボヌ
クレアーゼ処理工程を用いる型においてはこの不適合の
レベルは容易に区別できる。
onella）−特異的配列（パターン３）は最初S.ウェスラ
コ（weslaco）の16S rRNAで観察された。他のサルモネ
ラ（Salmonella）の16S rRNAの続いての配列分析により
S.ボンガー（bongor）およびS.リオグランデ（riogrand
e）のrRNAを含む多数の他の株中にこのパターンの存在
が明らかにされた。パターン３は一次構造においてパタ
ーン１非常に密接に関連しており、パターン１とただ１
つの位置が異っている（図５参照）。通常用いられるハ
イブリダイゼーション、ストリンジェンシーにおいて、
（即ち、受け入れ可能な排地的挙動を提供するように実
験的に決定される）この１つのヌクレオチドの相違はパ
ターン１プローブ（例えば676）およびパターン３の標
的配列（例えばS.ボンガー（bongor））間の交差ハイブ
リダイゼーションを消滅させるわけではないが、有意に
減少させる（約６倍）のに十分である。非常に高いハイ
ブリダイゼーション ストリンジェンシーまたはリボヌ
クレアーゼ処理工程を用いる型においてはこの不適合の
レベルは容易に区別できる。
この標的領域中に発見された第４のサルモネラ（Salm
onella）特異的配パターン（パターン４）は我々のコレ
クションからの１つのサルモネラ（Salmonella）種（CD
C stk.N55 1925として同定されている株）において観察
された。このパターンに特異的なプローブ（プローブ78
4,図５）のハイブリダイゼーションパターンから推定す
ると、それはサルモネラ（Salmonella）群Ｖの一員であ
る。プローブ784はこの群の一員に全く特異的であり、
我々のコレクションの他のサルモネラ（Salmonella）ま
たは非サルモネラ（Salmonella）に有意のハイブリダイ
ゼーションを示さない。それ故、前述のプローブ784様
プローブ678は、サルモネラ（Salmonella）菌の限られ
た小群に対し高度に排地的であり特異的である。両方の
プローブは他のより広い特異性のプローブを用いて同定
されたサルモネラ（Salmonella）のより小さなサブタイ
プに分けに使用できる。
onella）特異的配パターン（パターン４）は我々のコレ
クションからの１つのサルモネラ（Salmonella）種（CD
C stk.N55 1925として同定されている株）において観察
された。このパターンに特異的なプローブ（プローブ78
4,図５）のハイブリダイゼーションパターンから推定す
ると、それはサルモネラ（Salmonella）群Ｖの一員であ
る。プローブ784はこの群の一員に全く特異的であり、
我々のコレクションの他のサルモネラ（Salmonella）ま
たは非サルモネラ（Salmonella）に有意のハイブリダイ
ゼーションを示さない。それ故、前述のプローブ784様
プローブ678は、サルモネラ（Salmonella）菌の限られ
た小群に対し高度に排地的であり特異的である。両方の
プローブは他のより広い特異性のプローブを用いて同定
されたサルモネラ（Salmonella）のより小さなサブタイ
プに分けに使用できる。
この16S rRNA標的領域、およびすぐ下で説明される領
域（領域991−1045、図６）はサルモネラ（Salmonell
a）で遭遇したものでは最も高い価値をもっている。こ
の高レベルの配列変異性のためそれらはサルモネラ（Sa
lmonella）の種々の小群の区別に有用であるが、“典型
的”サルモネラ（Salmonella）の大部分に特徴的な配列
は典型的なサルモネラ（Salmonella）と有効に限界を画
する多数のシトロバクター（Citrobacter）およびエン
テロバクター（Enterobacter）種のそれと非常に類似し
ている。それ故、特定の領域中に配列変異体が存在する
という決定だけでは（その中およびそれ自身の）微生物
または群特異性プローブが得られると予言するには不十
分である。
域（領域991−1045、図６）はサルモネラ（Salmonell
a）で遭遇したものでは最も高い価値をもっている。こ
の高レベルの配列変異性のためそれらはサルモネラ（Sa
lmonella）の種々の小群の区別に有用であるが、“典型
的”サルモネラ（Salmonella）の大部分に特徴的な配列
は典型的なサルモネラ（Salmonella）と有効に限界を画
する多数のシトロバクター（Citrobacter）およびエン
テロバクター（Enterobacter）種のそれと非常に類似し
ている。それ故、特定の領域中に配列変異体が存在する
という決定だけでは（その中およびそれ自身の）微生物
または群特異性プローブが得られると予言するには不十
分である。
４） 16S領域991−1045 図６を参照すると“754"およ
び“755"と称される２つの合成プローブが16S領域991−
1045中に同定された２つの主たる配列パターンに相補的
な配列を持っている。２つのプローブは一緒になって我
々のコレクションのほとんどのサルモネラ（Salmonell
a）とハイブリダイズしたが個々には、確立されたDNA相
同性グループ分けもまたrRNA配列を標的とする他の組の
プローブにより示されるパターンもまた反映しないハイ
ブリダイゼーションパターンを示す。両方のプローブで
多数のサルモネラ（Salmonella）が見逃されていること
はサルモネラ（Salmonella）の間のこの領域に他の小さ
い配列パターンが存在することを示唆している。この見
逃されたサルモネラ（Salmonella）に特異的なプローブ
が設計できた。
び“755"と称される２つの合成プローブが16S領域991−
1045中に同定された２つの主たる配列パターンに相補的
な配列を持っている。２つのプローブは一緒になって我
々のコレクションのほとんどのサルモネラ（Salmonell
a）とハイブリダイズしたが個々には、確立されたDNA相
同性グループ分けもまたrRNA配列を標的とする他の組の
プローブにより示されるパターンもまた反映しないハイ
ブリダイゼーションパターンを示す。両方のプローブで
多数のサルモネラ（Salmonella）が見逃されていること
はサルモネラ（Salmonella）の間のこの領域に他の小さ
い配列パターンが存在することを示唆している。この見
逃されたサルモネラ（Salmonella）に特異的なプローブ
が設計できた。
プローブ754は個々には多くのサルモネラ（Salmonell
a）へハイブリダイズし、ある種の非サルモネラ（Salmo
nella）とは非常に弱くしかハイブリダイズしないため
それは（またはその誘導体）は他のプローブと共同して
サルモネラ（Salmonella）特異的プローブの組の一部と
して使用できた。プローブ755は、多くのおよび全く異
った非サルモネラ（Salmonella）腸内細菌の代表物と強
く、広範囲の交差ハイブリダイゼーションを示した。し
かしながら、ここに記載した他の非排地的“サルモネラ
（Salmonella）”プローブと一緒に、広範囲に特異的な
“腸内菌特異的”プローブセットの一部としてプローブ
755は有益であろう。
a）へハイブリダイズし、ある種の非サルモネラ（Salmo
nella）とは非常に弱くしかハイブリダイズしないため
それは（またはその誘導体）は他のプローブと共同して
サルモネラ（Salmonella）特異的プローブの組の一部と
して使用できた。プローブ755は、多くのおよび全く異
った非サルモネラ（Salmonella）腸内細菌の代表物と強
く、広範囲の交差ハイブリダイゼーションを示した。し
かしながら、ここに記載した他の非排地的“サルモネラ
（Salmonella）”プローブと一緒に、広範囲に特異的な
“腸内菌特異的”プローブセットの一部としてプローブ
755は有益であろう。
５） 23S rRNA 領域512−560 この領域は図７に示し
てあり、ヌクレオチド542−551に濃縮された“サルモネ
ラ（Salmonella）特異性”配列から成っている。この領
域の分析は２つの理由から特に困難である。いくつかの
（しかも全部ではない）サルモネラ（Salmonella）rRNA
遺伝子は大きなイントロンを含んでおり、それは位置53
2から560から成るらせん軸を中断させる。このイントロ
ンはこの遺伝子構造を含む細胞中に観察される23SrRNA
分子の集団中には現われない。この構造を持つ遺伝子は
不活性であるようである（データは示されていない）。
第２に、この領域を通る23S rRNAの直接逆転写酵素配列
決定は、少なくともいくつかのサルモネラ（Salmonell
a）には532−560軸内に位置する多数の位置で点配列不
均一性である。それ故ある種のサルモネラ（Salmonell
a）のための多rRNA遺伝子コピーのクローニングおよび
配列決定にはこの領域を通るヌクレオチド配列の明瞭な
決定が必要とされてきた。ある種の微生物において、こ
の領域は組換え的な“ホットスポット”であろう。
てあり、ヌクレオチド542−551に濃縮された“サルモネ
ラ（Salmonella）特異性”配列から成っている。この領
域の分析は２つの理由から特に困難である。いくつかの
（しかも全部ではない）サルモネラ（Salmonella）rRNA
遺伝子は大きなイントロンを含んでおり、それは位置53
2から560から成るらせん軸を中断させる。このイントロ
ンはこの遺伝子構造を含む細胞中に観察される23SrRNA
分子の集団中には現われない。この構造を持つ遺伝子は
不活性であるようである（データは示されていない）。
第２に、この領域を通る23S rRNAの直接逆転写酵素配列
決定は、少なくともいくつかのサルモネラ（Salmonell
a）には532−560軸内に位置する多数の位置で点配列不
均一性である。それ故ある種のサルモネラ（Salmonell
a）のための多rRNA遺伝子コピーのクローニングおよび
配列決定にはこの領域を通るヌクレオチド配列の明瞭な
決定が必要とされてきた。ある種の微生物において、こ
の領域は組換え的な“ホットスポット”であろう。
図７を参照すると、２つのサルモネラ（Salmonella）
特異的パターンがこれまでこの領域において観察されて
いる。パターン１はS.チフィムリウム（typhimurium）
株e23566のrRNAから誘導される配列より定義された。パ
ターン２はS.アリゾナ（arizona）株RF908のイントロン
非含有遺伝子から誘導された。両方ともこの領域を通る
大腸菌配列に関して２つの“余分な”ヌクレオチドを53
2−560軸に含み、１つの塩対により軸を効果的に長くし
ている。この領域のパターン１の部分相補的は848、849
および892の称される一組のプローブが構築された。プ
ローブ848および849はドットプローブ型においてサルモ
ネラ（Salmonella）および非サルモネラ（Salmonella）
菌へハイブリダイズするその能力が試験された。両方の
プローブは試験されたサルモネラ（Salmonella）菌の68
％（233/343）へハイブリダイズした。これらの“見逃
されたもの”の多くは、同じサルモネラ（Salmonella）
種の多重株であるのでこのパーセントは当てにならない
低さである。さらに、見逃されたものの31がS.アリゾナ
（arizona）株であり、それゆえこの領域に対するパタ
ーン１−相補的プローブは非−アリゾナ（arizona）サ
ルモネラ（Salmonella）種に対してはかなり良く働いて
いる。
特異的パターンがこれまでこの領域において観察されて
いる。パターン１はS.チフィムリウム（typhimurium）
株e23566のrRNAから誘導される配列より定義された。パ
ターン２はS.アリゾナ（arizona）株RF908のイントロン
非含有遺伝子から誘導された。両方ともこの領域を通る
大腸菌配列に関して２つの“余分な”ヌクレオチドを53
2−560軸に含み、１つの塩対により軸を効果的に長くし
ている。この領域のパターン１の部分相補的は848、849
および892の称される一組のプローブが構築された。プ
ローブ848および849はドットプローブ型においてサルモ
ネラ（Salmonella）および非サルモネラ（Salmonella）
菌へハイブリダイズするその能力が試験された。両方の
プローブは試験されたサルモネラ（Salmonella）菌の68
％（233/343）へハイブリダイズした。これらの“見逃
されたもの”の多くは、同じサルモネラ（Salmonella）
種の多重株であるのでこのパーセントは当てにならない
低さである。さらに、見逃されたものの31がS.アリゾナ
（arizona）株であり、それゆえこの領域に対するパタ
ーン１−相補的プローブは非−アリゾナ（arizona）サ
ルモネラ（Salmonella）種に対してはかなり良く働いて
いる。
さらに図７を参照すると、この領域の部分に相補的な
893、894および895と称される別の組のプローブが構築
され試験されている。
893、894および895と称される別の組のプローブが構築
され試験されている。
この領域を通るさらなる配列パターンが種々のサルモ
ネラ（Salmonella）に存在するらしい。パターン１およ
び２に対するプローブを用いたハイブリダイゼーション
の結果はこれらの付加的配列パターンが観察されるサル
モネラ（Salmonella）を正確に指摘するであろう。前記
の512−560領域プローブの変異体はこれらのサルモネラ
（Salmonella）を“包含する”ように設計できる。ま
た、これらのプローブ（またはその誘導体）が最終的に
利用されるプローブの組の他のプローブの挙動特性と
“つり合う”ように512−560領域プローブの変異体が設
計できる。
ネラ（Salmonella）に存在するらしい。パターン１およ
び２に対するプローブを用いたハイブリダイゼーション
の結果はこれらの付加的配列パターンが観察されるサル
モネラ（Salmonella）を正確に指摘するであろう。前記
の512−560領域プローブの変異体はこれらのサルモネラ
（Salmonella）を“包含する”ように設計できる。ま
た、これらのプローブ（またはその誘導体）が最終的に
利用されるプローブの組の他のプローブの挙動特性と
“つり合う”ように512−560領域プローブの変異体が設
計できる。
他の実施態様も以下の請求の範囲に含まれる：
フロントページの続き (72)発明者 パロドス，キリアキ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01701，フレイミンガム，ワン・スタン レイ・ドライブ （番地なし) (56)参考文献 米国特許4689295（ＵＳ，Ａ) 欧州公開272009（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．, 26 （1988） Ｐ．223−228 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＡＰＳ ＷＰＩ Ｍｅｄｌｉｎｅ
Claims (12)
- 【請求項１】少なくとも25ヌクレオチドの長さのプロー
ブであって、前記プローブは、S.チフィムリウム 23S
rRNAサブユニットのヌクレオチド1474と1527との間、
S.チフィムリウム 23S rRNAサブユニットのヌクレオ
チド1707と1755との間、S.チフィムリウム 23S rRNA
サブユニットのヌクレオチド524と569との間、S.アリゾ
ナ 16S rRNAサブユニットのヌクレオチド443と491と
の間、S.チフィムリウム 16S rRNAサブユニットのヌ
クレオチド991と1045との間、またはCDC stk.N55 192
5の16S rRNAサブユニットのヌクレオチド443と491との
間の任意の25またはそれ以上の連続するヌクレオチドに
相補的であるかこれと同一である該酸配列からなるプロ
ーブ。 - 【請求項２】前記配列が、S.チフィムリウム 23S rRN
Aサブユニットのヌクレオチド1474と1527との間の任意
の25またはそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的で
あるかこれと同一である、請求項１記載のプローブ。 - 【請求項３】前記配列が、S.チフィムリウム 23S rRN
Aサブユニットとヌクレオチド1707と1755との間の任意
の25またはそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的で
あるかこれと同一である、請求項１記載のプローブ。 - 【請求項４】前記配列が、S.チフィムリウム 23S rRN
Aサブユニットのヌクレオチド524と569との間の任意の2
5またはそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的であ
るかこれと同一である、請求項１記載のプローブ。 - 【請求項５】前記配列が、S.アリゾナ 16S rRNAサブ
ユニットのヌクレオチド443と491との間の任意の25また
はそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的であるかこ
れと同一である、請求項１記載のプローブ。 - 【請求項６】前記配列が、S.チフィムリウム 16S rRN
Aサブユニットのヌレオチド991と1045との間の任意の25
またはそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的である
かこれと同一である、請求項１記載のプローブ。 - 【請求項７】前記配列が、CDC stk.N55 1925の 16S
rRNAサブユニットのヌクレオチド443と491との間の任
意の25またはそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的
であるかこれと同一である、請求項１記載のプローブ。 - 【請求項８】以下の配列： を有する核酸からなるプローブ。
- 【請求項９】前記核酸が以下の配列： を有する請求項８記載のプローブ。
- 【請求項１０】前記核酸が以下の配列： を有する請求項８記載のプローブ。
- 【請求項１１】前記核酸が以下の配列： を有する請求項８記載のプローブ。
- 【請求項１２】前記核酸が以下の配列： を有する請求項８記載のプローブ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12748487A | 1987-12-01 | 1987-12-01 | |
| US127,484 | 1987-12-01 | ||
| PCT/US1988/004266 WO1989005359A1 (en) | 1987-12-01 | 1988-11-30 | Detection of salmonella |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03503000A JPH03503000A (ja) | 1991-07-11 |
| JP2795503B2 true JP2795503B2 (ja) | 1998-09-10 |
Family
ID=22430379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1501420A Expired - Lifetime JP2795503B2 (ja) | 1987-12-01 | 1988-11-30 | サルモネラ菌の検出 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5495008A (ja) |
| EP (1) | EP0389564B1 (ja) |
| JP (1) | JP2795503B2 (ja) |
| AT (1) | ATE133454T1 (ja) |
| AU (1) | AU2932889A (ja) |
| DE (1) | DE3854943T2 (ja) |
| WO (1) | WO1989005359A1 (ja) |
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| CA2025178A1 (en) * | 1989-10-02 | 1991-04-03 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes for the detection of lyme disease spirochetes |
| CA2025180A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts |
| CA2025181A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting fungi |
| GB2262987A (en) * | 1990-09-21 | 1993-07-07 | Imp Cancer Res Tech | Identification of organisms |
| GB9020621D0 (en) * | 1990-09-21 | 1990-10-31 | Imp Cancer Res Tech | Identification of organisms |
| WO1992015883A1 (en) * | 1991-03-08 | 1992-09-17 | Amoco Corporation | Improved assays including colored organic compounds |
| EP0707651A1 (en) * | 1993-04-26 | 1996-04-24 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF $i(SALMONELLA) |
| LT3828B (en) | 1993-11-10 | 1996-03-25 | Fermentas Biotech Inst | Process for detecting salmonella bacteries and probe for the same |
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| CN1069925C (zh) * | 1995-03-10 | 2001-08-22 | 华南理工大学 | 沙门氏菌rDNA间隔子核酸分子探针及其应用方法 |
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| GB9827585D0 (en) * | 1998-12-15 | 1999-02-10 | Celsis Int Plc | Assay method |
| US6821770B1 (en) | 1999-05-03 | 2004-11-23 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms |
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| EP2116617A3 (en) * | 2000-09-26 | 2010-01-20 | Boston Probes, Inc. | Probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection, identification and/or enumeration of bacteria |
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| US11262979B2 (en) | 2019-09-18 | 2022-03-01 | Bank Of America Corporation | Machine learning webpage accessibility testing tool |
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| US4228238A (en) * | 1979-08-23 | 1980-10-14 | The Allor Foundation | Method of laboratory testing in water-based culture media for zones of inhibition |
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-
1988
- 1988-11-30 AU AU29328/89A patent/AU2932889A/en not_active Abandoned
- 1988-11-30 JP JP1501420A patent/JP2795503B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-30 DE DE3854943T patent/DE3854943T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-30 EP EP89901508A patent/EP0389564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-30 WO PCT/US1988/004266 patent/WO1989005359A1/en active IP Right Grant
- 1988-11-30 AT AT89901508T patent/ATE133454T1/de not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-04-17 US US07/870,804 patent/US5495008A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-06 US US08/465,987 patent/US5792854A/en not_active Expired - Lifetime
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|---|
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Also Published As
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| DE3854943D1 (de) | 1996-03-07 |
| US5792854A (en) | 1998-08-11 |
| US5495008A (en) | 1996-02-27 |
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| WO1989005359A1 (en) | 1989-06-15 |
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| EP0389564A4 (en) | 1993-03-17 |
| DE3854943T2 (de) | 1996-09-05 |
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| AU2932889A (en) | 1989-07-05 |
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