JPH0739397A - 塩素イオンの定量方法 - Google Patents
塩素イオンの定量方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キレー
ト剤により失活させたα−アミラーゼを用いて定量する
方法において、試料に予めアデノシン三リン酸及びグル
コキナーゼ活性を持つ酵素を添加して試料中のグルコー
スを消去し、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を失活さ
せた後、オリゴ糖を基質とする塩素イオンにより賦活化
されたα−アミラーゼ反応により生成するグルコース量
を測定することを特徴とする塩素イオンの定量方法。 【効果】 試料中に共存するグルコースやマルトースの
影響を受けず、測定精度も高い。
ト剤により失活させたα−アミラーゼを用いて定量する
方法において、試料に予めアデノシン三リン酸及びグル
コキナーゼ活性を持つ酵素を添加して試料中のグルコー
スを消去し、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を失活さ
せた後、オリゴ糖を基質とする塩素イオンにより賦活化
されたα−アミラーゼ反応により生成するグルコース量
を測定することを特徴とする塩素イオンの定量方法。 【効果】 試料中に共存するグルコースやマルトースの
影響を受けず、測定精度も高い。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査方法に適用可
能である生体中の塩素イオンの定量方法に関する。
能である生体中の塩素イオンの定量方法に関する。
【0002】
【従来の技術】キレート剤で失活させたα−アミラーゼ
が塩素イオンにより賦活化する現象を利用して、該α−
アミラーゼに塩素イオンを含んだ試料とp−ニトロフェ
ニルマルトシド、デンプン等の基質を反応させて、塩素
イオンを定量する方法が知られている〔ヨーロピアン・
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur. J. Bioc
hem.) 、41巻、171頁、1974年〕。また、該定
量方法においてα−アミラーゼ活性測定過程を簡便化す
るため、基質として2−クロロ−4−ニトロフェニル−
β−D−マルトヘプタオシドを用いる塩素イオンの定量
方法が知られている〔クリニカルケミストリー(Clin.
Chem.)、34巻、552頁、1988年〕。
が塩素イオンにより賦活化する現象を利用して、該α−
アミラーゼに塩素イオンを含んだ試料とp−ニトロフェ
ニルマルトシド、デンプン等の基質を反応させて、塩素
イオンを定量する方法が知られている〔ヨーロピアン・
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur. J. Bioc
hem.) 、41巻、171頁、1974年〕。また、該定
量方法においてα−アミラーゼ活性測定過程を簡便化す
るため、基質として2−クロロ−4−ニトロフェニル−
β−D−マルトヘプタオシドを用いる塩素イオンの定量
方法が知られている〔クリニカルケミストリー(Clin.
Chem.)、34巻、552頁、1988年〕。
【0003】α−アミラーゼの活性測定法として、オリ
ゴ糖を基質として用いてマルトースを生成させ、得られ
たマルトースをグルコースに変換して、得られたグルコ
ース量を定量することにより対応するα−アミラーゼ活
性を測定する方法が知られている〔ジャーナル・オブ・
クリニカル・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイ
オケミストリー(J. Clin. Chem. Clin. Biochem.)、1
7巻、705頁、1979年〕。
ゴ糖を基質として用いてマルトースを生成させ、得られ
たマルトースをグルコースに変換して、得られたグルコ
ース量を定量することにより対応するα−アミラーゼ活
性を測定する方法が知られている〔ジャーナル・オブ・
クリニカル・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイ
オケミストリー(J. Clin. Chem. Clin. Biochem.)、1
7巻、705頁、1979年〕。
【0004】試料中に共存するグルコースが試料中の物
質の定量方法に影響を与えるため、ヘキソキナーゼ等を
用いて試料中のグルコースを消去する方法が特開平5−
76397号公報に開示されている。
質の定量方法に影響を与えるため、ヘキソキナーゼ等を
用いて試料中のグルコースを消去する方法が特開平5−
76397号公報に開示されている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】塩素イオンの定量方法
のうち、α−アミラーゼ活性の測定に2−クロロ−4−
ニトロフェニル−β−D−マルトヘプタオシド等の合成
基質を用いる方法は、検量線の直線性が得難く2点検量
法によらねばならない。また、α−アミラーゼ反応の基
質にデンプンを用いて、生成物のグルコース、マルトー
ス等の還元糖を測定する公知方法は、血液中にグルコー
スやマルトースが存在するため、血液を試料として用い
た場合、正確に塩素イオンを定量することができない。
このため、新規にα−アミラーゼ反応の基質として有用
なマルトオリゴ糖を用いる方法を用いようとしても、血
液中のグルコース等の妨害により正確な定量ができない
と思われる。
のうち、α−アミラーゼ活性の測定に2−クロロ−4−
ニトロフェニル−β−D−マルトヘプタオシド等の合成
基質を用いる方法は、検量線の直線性が得難く2点検量
法によらねばならない。また、α−アミラーゼ反応の基
質にデンプンを用いて、生成物のグルコース、マルトー
ス等の還元糖を測定する公知方法は、血液中にグルコー
スやマルトースが存在するため、血液を試料として用い
た場合、正確に塩素イオンを定量することができない。
このため、新規にα−アミラーゼ反応の基質として有用
なマルトオリゴ糖を用いる方法を用いようとしても、血
液中のグルコース等の妨害により正確な定量ができない
と思われる。
【0006】本発明は、血液を試料とした場合でも正確
に塩素イオンが測定できる塩素イオンの定量方法を提供
することを目的とする。
に塩素イオンが測定できる塩素イオンの定量方法を提供
することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明の塩素イオンの定
量方法は、水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キレー
ト剤により失活させたα−アミラーゼを用いて定量する
方法において、試料に予めアデノシン三リン酸及びグル
コキナーゼ活性を持つ酵素を添加して試料中のグルコー
スを消去し、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を失活さ
せた後、オリゴ糖を基質とする塩素イオンにより賦活化
されたα−アミラーゼ反応により生成するグルコース量
を測定することを特徴とするものである。
量方法は、水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キレー
ト剤により失活させたα−アミラーゼを用いて定量する
方法において、試料に予めアデノシン三リン酸及びグル
コキナーゼ活性を持つ酵素を添加して試料中のグルコー
スを消去し、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を失活さ
せた後、オリゴ糖を基質とする塩素イオンにより賦活化
されたα−アミラーゼ反応により生成するグルコース量
を測定することを特徴とするものである。
【0008】本発明方法は、水性媒体中、試料中の塩素
イオンを、キレート剤により失活させたα−アミラーゼ
を用いて定量する方法において、試料の前処理を行った
後に、オリゴ糖を基質として用い、最終生成物のグルコ
ースを定量して、塩素イオンにより賦活化されたα−ア
ミラーゼ活性を測定すれば、塩素イオンの定量が正確に
行えるとの知見のもとになされた。特に、試料の前処理
方法は、試料中のグルコースを単にグルコキナーゼ活性
を持つ酵素を添加して消去するだけでなく、グルコキナ
ーゼ活性を持つ酵素がグルコースの測定系を妨害しない
ように、該酵素を阻害する阻害剤で、かつα−アミラー
ゼ、グルコースの測定系への酵素、試薬等に影響を与え
ない阻害剤をも見出し、これを試料に添加すれば、塩素
イオンの定量がより正確に行えるとの知見のもとになさ
れた。
イオンを、キレート剤により失活させたα−アミラーゼ
を用いて定量する方法において、試料の前処理を行った
後に、オリゴ糖を基質として用い、最終生成物のグルコ
ースを定量して、塩素イオンにより賦活化されたα−ア
ミラーゼ活性を測定すれば、塩素イオンの定量が正確に
行えるとの知見のもとになされた。特に、試料の前処理
方法は、試料中のグルコースを単にグルコキナーゼ活性
を持つ酵素を添加して消去するだけでなく、グルコキナ
ーゼ活性を持つ酵素がグルコースの測定系を妨害しない
ように、該酵素を阻害する阻害剤で、かつα−アミラー
ゼ、グルコースの測定系への酵素、試薬等に影響を与え
ない阻害剤をも見出し、これを試料に添加すれば、塩素
イオンの定量がより正確に行えるとの知見のもとになさ
れた。
【0009】本発明において行う前記試料の前処理とは
アデノシン三リン酸及びグルコキナーゼ活性を持つ酵素
を試料に予め添加することにより試料中のグルコースを
消去した後、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を、キレ
ート剤等のグルコース測定系試薬及びα−アミラーゼに
影響を与えないグルコキナーゼ活性を持つ酵素の阻害剤
で失活させることである。該前処理操作を行うことによ
り、塩素イオンの定量を妨害する試料中のグルコースが
除去される。
アデノシン三リン酸及びグルコキナーゼ活性を持つ酵素
を試料に予め添加することにより試料中のグルコースを
消去した後、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を、キレ
ート剤等のグルコース測定系試薬及びα−アミラーゼに
影響を与えないグルコキナーゼ活性を持つ酵素の阻害剤
で失活させることである。該前処理操作を行うことによ
り、塩素イオンの定量を妨害する試料中のグルコースが
除去される。
【0010】更に、本発明において、α−アミラーゼの
種類とその基質であるオリゴ糖を選択することにより、
試料中にマルトースが共存する場合においても影響を受
けない塩素イオンの定量方法が提供される。本発明にお
いて、水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キレート剤
により失活させたα−アミラーゼを用いて定量する方法
とは、水性媒体中、キレート剤と混和させることにより
失活させたα−アミラーゼが、試料中の塩素イオンによ
り賦活化された状態で、α−アミラーゼの基質を分解
し、その分解産物量を測定することにより対応する塩素
イオン量を定量する方法をいう。
種類とその基質であるオリゴ糖を選択することにより、
試料中にマルトースが共存する場合においても影響を受
けない塩素イオンの定量方法が提供される。本発明にお
いて、水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キレート剤
により失活させたα−アミラーゼを用いて定量する方法
とは、水性媒体中、キレート剤と混和させることにより
失活させたα−アミラーゼが、試料中の塩素イオンによ
り賦活化された状態で、α−アミラーゼの基質を分解
し、その分解産物量を測定することにより対応する塩素
イオン量を定量する方法をいう。
【0011】本発明において、水性媒体とは、緩衝液、
生理食塩水等、水を含有する液体をいい、緩衝液として
は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−硝酸緩
衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−硫酸
緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、
フタル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、バル
ビタ−ル緩衝液又はグッド(GOOD)の緩衝液等があ
げられる。緩衝液のpHは6〜9.5で、濃度は50〜
500mMである。
生理食塩水等、水を含有する液体をいい、緩衝液として
は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−硝酸緩
衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−硫酸
緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、
フタル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、バル
ビタ−ル緩衝液又はグッド(GOOD)の緩衝液等があ
げられる。緩衝液のpHは6〜9.5で、濃度は50〜
500mMである。
【0012】塩素イオンを含む試料としては、水性媒体
に混和する試料であればどのようなものでもよく、例え
ば、全血、細胞等、イオン電極法では測定しにくい生体
中の試料があげられる。α−アミラーゼとしては、酵素
番号〔EC.3.2.1.1〕に属する酵素であればよ
く、ブタ膵臓、ヒト唾液等の動物から採取したα−アミ
ラーゼ又はそれらを遺伝子工学により改変し製造した酵
素があげられるが、ブタ膵臓由来のα−アミラーゼは、
基質であるオリゴ糖としてマルトヘプタオース、マルト
ヘキサオース、マルトテトラオースを用いた場合、該基
質をマルトトリオースとグルコースに分解しマルトース
を生産せず、マルトースの消去操作を必要としないの
で、本発明においてはブタ膵臓由来のα−アミラーゼを
用いることが好ましい。
に混和する試料であればどのようなものでもよく、例え
ば、全血、細胞等、イオン電極法では測定しにくい生体
中の試料があげられる。α−アミラーゼとしては、酵素
番号〔EC.3.2.1.1〕に属する酵素であればよ
く、ブタ膵臓、ヒト唾液等の動物から採取したα−アミ
ラーゼ又はそれらを遺伝子工学により改変し製造した酵
素があげられるが、ブタ膵臓由来のα−アミラーゼは、
基質であるオリゴ糖としてマルトヘプタオース、マルト
ヘキサオース、マルトテトラオースを用いた場合、該基
質をマルトトリオースとグルコースに分解しマルトース
を生産せず、マルトースの消去操作を必要としないの
で、本発明においてはブタ膵臓由来のα−アミラーゼを
用いることが好ましい。
【0013】キレート剤としては、エチレンジアミン四
酢酸(EDTA)、2−ヒドロキシエチルエチレンジア
ミン三酢酸(HEDTA)、エチレングリコール−ビス
(2−アミノエチルエーテル)四酢酸(EGTA)、ジ
エチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,2−ジア
ミノシクロヘキサン四酢酸(DCTA)等があげられ
る。
酢酸(EDTA)、2−ヒドロキシエチルエチレンジア
ミン三酢酸(HEDTA)、エチレングリコール−ビス
(2−アミノエチルエーテル)四酢酸(EGTA)、ジ
エチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,2−ジア
ミノシクロヘキサン四酢酸(DCTA)等があげられ
る。
【0014】α−アミラーゼの基質として用いるオリゴ
糖としては、マルトオクタオース、マルトヘプタオー
ス、マルトヘキサオース、マルトペンタオース、マルト
テトラオース等があげられる。オリゴ糖がα−アミラー
ゼにより分解されグルコースの他にマルトースが生じる
場合は、必要によりマルトースを基質とする酵素を加え
て、マルトースをグルコースに変換してもよい。オリゴ
糖としてマルトヘプタオース、マルトヘキサオース、マ
ルトテトラオースを用い、α−アミラーゼとしてブタ膵
臓由来の酵素を用いることにより、グルコースが選択的
に生成するので、これらのオリゴ糖を用いることが好ま
しい。
糖としては、マルトオクタオース、マルトヘプタオー
ス、マルトヘキサオース、マルトペンタオース、マルト
テトラオース等があげられる。オリゴ糖がα−アミラー
ゼにより分解されグルコースの他にマルトースが生じる
場合は、必要によりマルトースを基質とする酵素を加え
て、マルトースをグルコースに変換してもよい。オリゴ
糖としてマルトヘプタオース、マルトヘキサオース、マ
ルトテトラオースを用い、α−アミラーゼとしてブタ膵
臓由来の酵素を用いることにより、グルコースが選択的
に生成するので、これらのオリゴ糖を用いることが好ま
しい。
【0015】グルコースの定量法は、グルコースの定量
法であればどのような方法を用いてもよく、例えば、グ
ルコースをピラノースオキシダーゼによりグルコソンに
変換し、発生する過酸化水素をペルオキシダーゼと呈色
試薬により定量する方法(Ann. Clin. Biochem. 、6
巻、24頁、1969年) 又はグルコースデヒドロゲナ
ーゼによりグルコノラクトンに変換しNAD(P)から
NAD(P)Hへの変換量を測定する方法(Z. Kin. Ch
em. Klin. Biochem.、13巻、101頁、1975年)
等により測定することができる。
法であればどのような方法を用いてもよく、例えば、グ
ルコースをピラノースオキシダーゼによりグルコソンに
変換し、発生する過酸化水素をペルオキシダーゼと呈色
試薬により定量する方法(Ann. Clin. Biochem. 、6
巻、24頁、1969年) 又はグルコースデヒドロゲナ
ーゼによりグルコノラクトンに変換しNAD(P)から
NAD(P)Hへの変換量を測定する方法(Z. Kin. Ch
em. Klin. Biochem.、13巻、101頁、1975年)
等により測定することができる。
【0016】呈色試薬としては、例えば4−アミノアン
チピリンとN−エチル−N−(3−メチルフェニル)−
N’−アセチルエチレンジアミン(EMSA)の組み合
わせ等があげられる。該グルコースの定量法において、
試料中に内因性のグルコース又はマルトースが共存する
と、塩素イオンの定量値に影響を与えるため、該定量法
の前処理法として、予めアデノシン三リン酸及びグルコ
キナーゼ活性を持つ酵素、必要により前記のマルトース
を基質とする酵素を試料に添加して試料中のグルコース
又はマルトースを消去した後、共存するグルコキナーゼ
活性を持つ酵素が塩素イオンの定量過程を阻害しないよ
う、キレート剤を添加してグルコキナーゼ活性を持つ酵
素を失活させる。
チピリンとN−エチル−N−(3−メチルフェニル)−
N’−アセチルエチレンジアミン(EMSA)の組み合
わせ等があげられる。該グルコースの定量法において、
試料中に内因性のグルコース又はマルトースが共存する
と、塩素イオンの定量値に影響を与えるため、該定量法
の前処理法として、予めアデノシン三リン酸及びグルコ
キナーゼ活性を持つ酵素、必要により前記のマルトース
を基質とする酵素を試料に添加して試料中のグルコース
又はマルトースを消去した後、共存するグルコキナーゼ
活性を持つ酵素が塩素イオンの定量過程を阻害しないよ
う、キレート剤を添加してグルコキナーゼ活性を持つ酵
素を失活させる。
【0017】グルコキナーゼ活性を持つ酵素としては、
グルコースをグルコース−6−リン酸に変換する活性を
有する酵素であればどのようなものでもよく、赤血球、
肝臓等の動物又は微生物由来のヘキソキナーゼ〔EC.
2.7.1.1〕、肝臓等の動物又は細菌、酵母等の微
生物由来のヘキソキナーゼ タイプIV〔EC.2.7.
1.2〕等があげられる。
グルコースをグルコース−6−リン酸に変換する活性を
有する酵素であればどのようなものでもよく、赤血球、
肝臓等の動物又は微生物由来のヘキソキナーゼ〔EC.
2.7.1.1〕、肝臓等の動物又は細菌、酵母等の微
生物由来のヘキソキナーゼ タイプIV〔EC.2.7.
1.2〕等があげられる。
【0018】マルトースを基質とする酵素は、マルトー
スホスホリラーゼ〔EC.2.4.1.8〕又はα−グ
ルコシダーゼ〔EC.3.2.1.20〕等、マルトー
スをグルコースに変換し得る酵素であればよく、マルト
ースホスホリラーゼを用いる場合、リン酸緩衝液を用い
ないときはリン酸イオンを該酵素と共に反応液に加え
る。リン酸イオンの供給源としては、無機リン酸、リン
酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウ
ム、リン酸二ナトリウム等があげられる。なお、マルト
ースを基質とする酵素は、ブタ膵臓由来のα−アミラー
ゼとその基質としてマルトヘプタオース、マルトヘキサ
オース又はマルトテトラオースを用いる場合は、マルト
ースが発生しないので、加える必要がない。
スホスホリラーゼ〔EC.2.4.1.8〕又はα−グ
ルコシダーゼ〔EC.3.2.1.20〕等、マルトー
スをグルコースに変換し得る酵素であればよく、マルト
ースホスホリラーゼを用いる場合、リン酸緩衝液を用い
ないときはリン酸イオンを該酵素と共に反応液に加え
る。リン酸イオンの供給源としては、無機リン酸、リン
酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウ
ム、リン酸二ナトリウム等があげられる。なお、マルト
ースを基質とする酵素は、ブタ膵臓由来のα−アミラー
ゼとその基質としてマルトヘプタオース、マルトヘキサ
オース又はマルトテトラオースを用いる場合は、マルト
ースが発生しないので、加える必要がない。
【0019】以下に本発明の塩素イオンの定量方法の好
ましい態様について説明する。水性媒体(pHは6〜
9.5)に、グルコキナーゼ活性を持つ酵素(1〜4U
/ml)、アデノシン三リン酸(ATP)(5〜20m
M)、マグネシウムイオン(2〜25mM)、必要によ
りマルトースを基質とする酵素〔マルトースホスホリラ
ーゼを用いる場合は、マルトース1g/dlに対して該
酵素4〜20U/ml、リン酸300mM以上;α−グ
ルコシダーゼを用いる場合は、マルトース1g/dlに
対して該酵素100〜300U/ml〕を加え前処理液
を調製する。該前処理液に塩素イオンを含む試料を加
え、25〜40℃、好ましくは37℃で、1〜30分
間、好ましくは3〜5分間反応させる。
ましい態様について説明する。水性媒体(pHは6〜
9.5)に、グルコキナーゼ活性を持つ酵素(1〜4U
/ml)、アデノシン三リン酸(ATP)(5〜20m
M)、マグネシウムイオン(2〜25mM)、必要によ
りマルトースを基質とする酵素〔マルトースホスホリラ
ーゼを用いる場合は、マルトース1g/dlに対して該
酵素4〜20U/ml、リン酸300mM以上;α−グ
ルコシダーゼを用いる場合は、マルトース1g/dlに
対して該酵素100〜300U/ml〕を加え前処理液
を調製する。該前処理液に塩素イオンを含む試料を加
え、25〜40℃、好ましくは37℃で、1〜30分
間、好ましくは3〜5分間反応させる。
【0020】オリゴ糖は前記の前処理液に添加してもよ
いが、好ましくは前処理終了後に2〜10mMを加え、
更にキレート剤(反応液中10〜50mM)及びキレー
ト剤により失活させたα−アミラーゼ(反応液中20〜
100U/ml)を添加し8〜50℃で反応させる。α
−アミラーゼ反応により基質のオリゴ糖は、マルトー
ス、グルコース、マルトトリオースに分解されるが、マ
ルトースが生じた場合は、前記のマルトースを基質とす
る酵素により、グルコースに分解される。得られたグル
コースを前記のグルコースの定量法により定量すること
により、対応する塩素イオン量を定量することができ
る。
いが、好ましくは前処理終了後に2〜10mMを加え、
更にキレート剤(反応液中10〜50mM)及びキレー
ト剤により失活させたα−アミラーゼ(反応液中20〜
100U/ml)を添加し8〜50℃で反応させる。α
−アミラーゼ反応により基質のオリゴ糖は、マルトー
ス、グルコース、マルトトリオースに分解されるが、マ
ルトースが生じた場合は、前記のマルトースを基質とす
る酵素により、グルコースに分解される。得られたグル
コースを前記のグルコースの定量法により定量すること
により、対応する塩素イオン量を定量することができ
る。
【0021】なお、本反応液中には、アルブミン、ピラ
ノースオキシダーゼの補酵素であるフラビンアデニンジ
ヌクレオチド(FAD)、グリセロール、ポリエチレン
グリコールモノ−p−イソオクチルフェニルエーテル、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物等の塩
素イオンを含まない界面活性剤、硝酸ナトリウム、硫酸
ナトリウム等の可溶化剤、硝酸カリウム、硫酸カリウム
等の安定化剤を添加することができる。また前処理液に
グルコース(0.08〜0.2mg/ml)を添加して
おくことにより、ブランクの吸収を消去することができ
る。
ノースオキシダーゼの補酵素であるフラビンアデニンジ
ヌクレオチド(FAD)、グリセロール、ポリエチレン
グリコールモノ−p−イソオクチルフェニルエーテル、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物等の塩
素イオンを含まない界面活性剤、硝酸ナトリウム、硫酸
ナトリウム等の可溶化剤、硝酸カリウム、硫酸カリウム
等の安定化剤を添加することができる。また前処理液に
グルコース(0.08〜0.2mg/ml)を添加して
おくことにより、ブランクの吸収を消去することができ
る。
【0022】本発明に使用する酵素、マルトースホスホ
リラーゼ(EC.2.4.1.8)、α−グルコシダー
ゼ(EC.3.2.1.20)、グルコキナーゼ活性を
持つ酵素としてのヘキソキナーゼ(EC.2.7.1.
1)又はヘキソキナーゼ タイプIV〔グルコキナーゼ
(EC.2.7.1.2)〕等は、各酵素とも市販品が
容易に入手可能である。
リラーゼ(EC.2.4.1.8)、α−グルコシダー
ゼ(EC.3.2.1.20)、グルコキナーゼ活性を
持つ酵素としてのヘキソキナーゼ(EC.2.7.1.
1)又はヘキソキナーゼ タイプIV〔グルコキナーゼ
(EC.2.7.1.2)〕等は、各酵素とも市販品が
容易に入手可能である。
【0023】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 (実施例1)ブタ膵臓α−アミラーゼとマルトペンタオ
ースを用いる方法 (1)塩素イオン検量線用標準液の調製 塩化ナトリウム(和光純薬工業製)を蒸留水で希釈し、
反応液中60、100、140mMの塩素イオン検量線
用標準液を調製した。 (2)塩素イオンの定量 試験管に塩素イオン検量線用標準液0.10ml、グル
コース水溶液(1g/dl)0.10ml、マルトース
水溶液(1g/dl)0.10mlを添加し、ついで、
これにマルトースホスホリラーゼ(協和メデックス製)
7U/ml、ヘキソキナーゼ(オリエンタル酵母製)
2.4U/ml、マルトペンタオース(協和メデックス
製)10mM、4−アミノアンチピリン0.5mM、硫
酸マグネシウム2.5mM、ATP(オリエンタル酵母
製)10mMを含む350mMリン酸緩衝液(pH6.
8、25℃)2.0mlを加えた。該試験管を37℃の
恒温水槽につけ、5分間インキュベーションし、マルト
ース及びグルコースを消去した。
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 (実施例1)ブタ膵臓α−アミラーゼとマルトペンタオ
ースを用いる方法 (1)塩素イオン検量線用標準液の調製 塩化ナトリウム(和光純薬工業製)を蒸留水で希釈し、
反応液中60、100、140mMの塩素イオン検量線
用標準液を調製した。 (2)塩素イオンの定量 試験管に塩素イオン検量線用標準液0.10ml、グル
コース水溶液(1g/dl)0.10ml、マルトース
水溶液(1g/dl)0.10mlを添加し、ついで、
これにマルトースホスホリラーゼ(協和メデックス製)
7U/ml、ヘキソキナーゼ(オリエンタル酵母製)
2.4U/ml、マルトペンタオース(協和メデックス
製)10mM、4−アミノアンチピリン0.5mM、硫
酸マグネシウム2.5mM、ATP(オリエンタル酵母
製)10mMを含む350mMリン酸緩衝液(pH6.
8、25℃)2.0mlを加えた。該試験管を37℃の
恒温水槽につけ、5分間インキュベーションし、マルト
ース及びグルコースを消去した。
【0024】次に、リン酸一カリウム20g/L、ED
TA18g/Lを含み水酸化ナトリウムでpHを6.8
とした溶液(25℃)に、ブタ膵臓α−アミラーゼ(ベ
ーリンガーマンハイム山之内製)50U/ml、グルコ
ースオキシダーゼ(和光純薬工業製)30U/ml、E
MSA2.2mM、硝酸カリウム1mMを含む発色液を
加えて、37℃でインキュベート後、その1mlを前記
溶液に添加し、攪拌した後、555nmにおける吸光度
変化量を分光光度計(日立製UV3400)で測定し
た。得られた検量線を図1に示した。
TA18g/Lを含み水酸化ナトリウムでpHを6.8
とした溶液(25℃)に、ブタ膵臓α−アミラーゼ(ベ
ーリンガーマンハイム山之内製)50U/ml、グルコ
ースオキシダーゼ(和光純薬工業製)30U/ml、E
MSA2.2mM、硝酸カリウム1mMを含む発色液を
加えて、37℃でインキュベート後、その1mlを前記
溶液に添加し、攪拌した後、555nmにおける吸光度
変化量を分光光度計(日立製UV3400)で測定し
た。得られた検量線を図1に示した。
【0025】(実施例2)ブタ膵臓α−アミラーゼとマ
ルトテトラオースを用いる方法 (1)塩素イオン検量線用標準液の調製 塩化ナトリウム(和光純薬工業製)を蒸留水で希釈し、
反応液中50、100、150mMの塩素イオン検量線
用標準液を調製した。 (2)塩素イオンの定量 試験管に塩素イオン検量線用標準液0.05ml、グル
コース水溶液(1g/dl)0.05ml、マルトース
水溶液(2g/dl)0.05mlを添加し、ついで、
これにヘキソキナーゼ(オリエンタル酵母製)2.4U
/ml、マルトテトラオース(和光純薬製)7.5m
M、4−アミノアンチピリン0.5mM、硫酸マグネシ
ウム5mM、ATP(オリエンタル酵母製)10mMを
含む100mMリン酸緩衝液(pH6.6、25℃)
2.0mlを加え、37℃で5分間インキュベーション
し、グルコースを消去した。
ルトテトラオースを用いる方法 (1)塩素イオン検量線用標準液の調製 塩化ナトリウム(和光純薬工業製)を蒸留水で希釈し、
反応液中50、100、150mMの塩素イオン検量線
用標準液を調製した。 (2)塩素イオンの定量 試験管に塩素イオン検量線用標準液0.05ml、グル
コース水溶液(1g/dl)0.05ml、マルトース
水溶液(2g/dl)0.05mlを添加し、ついで、
これにヘキソキナーゼ(オリエンタル酵母製)2.4U
/ml、マルトテトラオース(和光純薬製)7.5m
M、4−アミノアンチピリン0.5mM、硫酸マグネシ
ウム5mM、ATP(オリエンタル酵母製)10mMを
含む100mMリン酸緩衝液(pH6.6、25℃)
2.0mlを加え、37℃で5分間インキュベーション
し、グルコースを消去した。
【0026】次に、リン酸一カリウム20g/L、ED
TA36g/Lを含み水酸化ナトリウムでpHを6.6
とした溶液(25℃)に、ブタ膵臓α−アミラーゼ(ベ
ーリンガーマンハイム山之内製)70U/ml、グルコ
ースオキシダーゼ(和光純薬工業製)30U/ml、E
MSA2.2mM、硝酸カリウム1mMを含む発色液を
加えて、37℃でインキュベート後、その1mlを前記
溶液に添加し、攪拌した後、555nmにおける吸光度
変化量を分光光度計(日立製UV3400)で測定し
た。得られた検量線を図2に示した。更に、電量滴定で
塩素イオン濃度が105mMの血清の塩素イオン濃度を
前記方法により測定したところ104mMであった。
TA36g/Lを含み水酸化ナトリウムでpHを6.6
とした溶液(25℃)に、ブタ膵臓α−アミラーゼ(ベ
ーリンガーマンハイム山之内製)70U/ml、グルコ
ースオキシダーゼ(和光純薬工業製)30U/ml、E
MSA2.2mM、硝酸カリウム1mMを含む発色液を
加えて、37℃でインキュベート後、その1mlを前記
溶液に添加し、攪拌した後、555nmにおける吸光度
変化量を分光光度計(日立製UV3400)で測定し
た。得られた検量線を図2に示した。更に、電量滴定で
塩素イオン濃度が105mMの血清の塩素イオン濃度を
前記方法により測定したところ104mMであった。
【0027】図2によれば、本測定法では検量線が原点
を通り一点検量が可能である。またブランクの吸収がほ
とんどなく、試料中のマルトースや内因性の唾液腺由来
又は膵臓由来のアミラーゼの影響も受けない優れた測定
法であることが示された。
を通り一点検量が可能である。またブランクの吸収がほ
とんどなく、試料中のマルトースや内因性の唾液腺由来
又は膵臓由来のアミラーゼの影響も受けない優れた測定
法であることが示された。
【0028】
【発明の効果】本発明により、試料中に共存するグルコ
ースやマルトースの影響を受けず、測定精度も高い塩素
イオンの測定法が提供される。
ースやマルトースの影響を受けず、測定精度も高い塩素
イオンの測定法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】マルトペンタオースを基質に用いた場合の検量
線。
線。
【図2】マルトテトラオースを基質に用いた場合の検量
線。
線。
Claims (2)
- 【請求項1】 水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キ
レート剤により失活させたα−アミラーゼを用いて定量
する方法において、試料に予めアデノシン三リン酸及び
グルコキナーゼ活性を持つ酵素を添加して試料中のグル
コースを消去し、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を失
活させた後、オリゴ糖を基質とする塩素イオンにより賦
活化されたα−アミラーゼ反応により生成するグルコー
ス量を測定することを特徴とする塩素イオンの定量方
法。 - 【請求項2】 α−アミラーゼがブタ膵臓由来のα−ア
ミラーゼで、オリゴ糖がマルトテトラオース、マルトヘ
キサオース又はマルトヘプタオースである請求項1記載
の定量方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5193728A JPH0739397A (ja) | 1993-08-04 | 1993-08-04 | 塩素イオンの定量方法 |
PCT/JP1994/001279 WO1995004831A1 (fr) | 1993-08-04 | 1994-08-03 | Procede de determination des ions chlorure |
US08/586,785 US5962248A (en) | 1993-08-04 | 1994-08-03 | Quantitative determination method for chloride ions |
EP94923062A EP0712937A4 (en) | 1993-08-04 | 1994-08-03 | METHOD FOR DETERMINING CHLORIDE IONS |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5193728A JPH0739397A (ja) | 1993-08-04 | 1993-08-04 | 塩素イオンの定量方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0739397A true JPH0739397A (ja) | 1995-02-10 |
Family
ID=16312822
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5193728A Withdrawn JPH0739397A (ja) | 1993-08-04 | 1993-08-04 | 塩素イオンの定量方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5962248A (ja) |
EP (1) | EP0712937A4 (ja) |
JP (1) | JPH0739397A (ja) |
WO (1) | WO1995004831A1 (ja) |
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---|---|---|---|---|
US5948632A (en) * | 1995-11-28 | 1999-09-07 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method and reagent for measuring chlorine and calcium ions using a maltose derivative |
JP3087891B2 (ja) * | 1998-03-31 | 2000-09-11 | 東洋紡績株式会社 | 電解質測定用試薬組成物 |
US6953694B2 (en) * | 2000-12-06 | 2005-10-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Attachment of second harmonic-active moiety to molecules for detection of molecules at interfaces |
US9182406B2 (en) | 2008-08-04 | 2015-11-10 | Biodesy, Inc. | Nonlinear optical detection of molecules comprising an unnatural amino acid possessing a hyperpolarizability |
GB2503604B (en) | 2011-03-21 | 2020-04-22 | Biodesy Llc | Classification of kinase inhibitors using second harmonic optical techniques |
GB2520111A (en) | 2012-02-05 | 2015-05-13 | Biodesy Inc | Methods for identifying modulators of Ras using nonlinear techniques |
US9395358B2 (en) | 2012-02-05 | 2016-07-19 | Biodesy, Inc. | Methods for detecting allosteric modulators of protein |
US20130288271A1 (en) | 2012-04-25 | 2013-10-31 | Biodesy, Llc | Methods for detecting allosteric modulators of protein |
WO2016003936A1 (en) | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Biodesy, Inc. | Systems and methods for high throughput analysis of conformation in biological entities |
EP3237906B8 (en) | 2014-12-23 | 2020-10-28 | Bluelight Therapeutics, Inc. | Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection |
US10672502B2 (en) | 2015-04-02 | 2020-06-02 | Biodesy, Inc. | Methods for determining protein structure using a surface-selective nonlinear optical technique |
CN113189028A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-07-30 | 深圳市锦瑞生物科技有限公司 | 一种血清氯检测试剂球及血清氯检测芯片 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5768798A (en) * | 1980-10-14 | 1982-04-27 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel measurement of amylase activity |
US5380649A (en) * | 1987-04-10 | 1995-01-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Enzymatic determination of analyte ions in fluids by optimizing measurement levels |
JPH07203991A (ja) * | 1994-01-24 | 1995-08-08 | Kyowa Medex Co Ltd | カリウムイオンの定量方法 |
-
1993
- 1993-08-04 JP JP5193728A patent/JPH0739397A/ja not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-08-03 WO PCT/JP1994/001279 patent/WO1995004831A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1994-08-03 US US08/586,785 patent/US5962248A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-03 EP EP94923062A patent/EP0712937A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0712937A4 (en) | 1997-12-10 |
WO1995004831A1 (fr) | 1995-02-16 |
EP0712937A1 (en) | 1996-05-22 |
US5962248A (en) | 1999-10-05 |
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