JP3566976B2 - 生体成分中の測定対象の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、臨床検査の分野で利用される生体成分中の測定対象の新規な測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、臨床検査分野において、血清、血漿、尿などの生体中の成分（酵素、基質など）を測定するための反応系に、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応が多く利用されている。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは３４０ｎｍに吸収極大をもつので、ＮＡＤ（Ｐ）（酸化型補酵素）を生成する反応においてはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）の減少が、反対に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）を生成する反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）の増加が３４０ｎｍの吸収度変化により測定される。
しかし、デヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応は、ほとんどが可逆反応であるため、例えばＮＡＤ（Ｐ）を生成する反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）が増加するに従って逆反応が大きくなり反応性が低下する、つまり、測定範囲が狭くなり、反応直線性が伸びなくなるという問題がある。同様に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを増加させる方法も、ＮＡＤＰ（Ｈ）が増加するに従って逆反応が大きくなり反応性が低下する。
また、生体成分中には、本来目的とする物質の測定に影響を及ぼす干渉物質、いわゆる内因性物質が存在する場合がある。このような場合、この内因性物質も測定すべき物質と同時に測定されることから、測定精度に悪い影響を与えるという問題がある。
一方、微量の基質や酵素活性を増幅定量する方法として、「酵素的サイクリング」が知られている。一般には、基質または酵素活性から生成した基質の「基質サイクリング」として測定される。ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を繰り返す「ＮＡＤ（Ｐ）サイクリング」もこの酵素的サイクリングの一例である。「酵素的サイクリング」は、目的の基質や酵素が微量であっても、これらが増幅されることにより高感度に測定できるので微量定量法としては有用であるが、「ＮＡＤ（Ｐ）サイクリング」の場合は、酸化型〔ＮＡＤ（Ｐ）〕または、還元型〔ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ〕のいずれか一方だけを測定する必要がある。従って、ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈが共存するため測定不能となる。これを解決するためにＨＰＬＣを用いて両者を分別したり、熱処理してどちらか一方を分解する方法があるが、操作が複雑になる。また、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ法は酸化性基質と還元性基質の両方を測定するが、胆汁酸においては基質によりサイクリング率が異なるため、物質の定量として問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を含む測定方法における上記の問題点を改良し、高精度で迅速な生体成分中の測定対象の測定方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが鋭意研究した結果、下記の本発明により上記目的が達成されることを見出した。
即ち、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を含み、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させることによる生体成分中の測定対象の新規な各測定方法であり、その態様としては次の通りである。
（１）生体成分中に含まれる測定対象をＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とするデヒドロゲナーゼを用いて測定する反応において、当該反応により生成したＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて消費し、当該反応を促進させることを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法１）、
（２）測定対象の測定に影響を及ぼす干渉物質を、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを用いて消去し、残存するＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて消費することを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法２）、
（３）工程Ａ：測定対象物にＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを反応させる工程、
工程Ｂ：ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて、工程Ａにて残存しているＮＡＤ（Ｐ）を消費する工程、
工程Ｃ：工程ＢにおけるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用をその抗体及びその阻害剤の１種または２種以上を用いて停止させる工程、
工程Ｄ：工程Ｃに引き続いて、ＮＡＤ（Ｐ）サイクリングを行う工程、
を含むことを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法３）。
【０００５】
本発明において測定される測定対象とは、血液、血漿、尿、髄液、血球、唾液、涙液等の生体成分中の酵素、基質である。
【０００６】
本発明に使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼは、動物組織由来、微生物由来のいずれも用いることができる。市販品として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． 由来のものを用いてもよい。
【０００７】
本発明にいう主反応とは、デヒドロゲナーゼ、またはレダクターゼ、オキシゲンナーゼ等、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする酸化還元反応をいう。
【０００８】
以下、本発明の各測定方法を具体的に説明する。
（１）生体成分中に含まれる測定対象をＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とするデヒドロゲナーゼを用いて測定する反応において、当該反応により生成したＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて消費し、当該反応を促進させることを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法１）：
本方法は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）を生成する反応に用いることができる。具体的には、主反応で生成したＮＡＤ（Ｐ）にＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて消費することにより、この主反応が不可逆反応となり、反応が促進される。測定は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費量を３４０ｎｍの吸光度の減少として求める。ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）に反応しても生成されるものは３４０ｎｍに吸収がないため、主反応の測定に影響を与えない。
【０００９】
本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは５〜５０単位／ｍｌあればよい。
【００１０】
本方法の測定対象となる酵素としては、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＢＤ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、コリンエステラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、ロイシンアミノペプチダーゼ等が挙げられる。
【００１１】
また、本方法の測定対象となる基質としては、尿素窒素（ＵＮ）、トリグリセリド（ＴＧ）、遊離型（非結合型）脂肪酸（ＮＥＦＡ）、クレアチン（ＣＲＮ）、シアル酸等が挙げられる。
【００１２】
尚、ＵＮはＧｌＤＨを、ＧＯＴはＭＤＨを、ＧＰＴはＬＤＨを、ＴＧはＬＤＨをそれぞれ共役反応させて測定する。
【００１３】
（２）測定対象の測定に影響を及ぼす干渉物質を、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを用いて消去し、残存するＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて消費することを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法２）：
本方法は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応に用いることができる。本方法においては、まず、内因性物質に起因する物質に、ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するデヒドロゲナーゼを反応させる。その後、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを加えてＮＡＤ（Ｐ）に反応させ、これを消費し、かくしてＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼの反応を停止させる。
このあと、本来測定すべき目的物質の測定をするが、そのときはＮＡＤ（Ｐ）の関与しない反応系に導いて測定する。それには、例えば、オキシダーゼによりＨ２Ｏ２を生成する反応や、ＮＡＤ（Ｐ）の代わりにＴｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）を基質とする反応などがある。これらの反応ではＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼにより消費させられるため、デヒドロゲナーゼによりＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成されることはない。
【００１４】
本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは１〜５０単位／ｍｌあれば良い。
【００１５】
本方法の測定対象となる酵素としては、代表的にはアミラーゼ（ＡＭＹ）が挙げられる。
【００１６】
また、本方法の測定対象となる基質としては、代表的にはトリグリセリド（ＴＧ）が挙げられる。
【００１７】
本方法を使用する例として、アミラーゼ（ＡＭＹ）の測定を挙げる。まず試料中の内因性物質であるグルコースにヘキソキナーゼ（ＨＫ）を作用させてグルコース−６−リン酸とし、さらにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）を作用させて６−ホスホグルコン酸とする。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させると、ＮＡＤが消費され、Ｇ−６−ＰＤＨの反応は進行しないようになる。この状態で、ＡＭＹを測定するべく、ＡＭＹの酵素活性により生成したグルコースにグルコースオキシダーゼを加えてＨ２ Ｏ２ を生成するか、またはＴｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）を加えてＴｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成を測定する（下式参照）。
【００１８】
【化１】
【００１９】
また他の例として、トリグリセリド（ＴＧ）の測定においては、まず試料中の内因性物質であるグリセロールにグリセロールキナーゼ（ＧＫ）を作用させてグリセロール３−リン酸とし、それと同時にＡＴＰからＡＤＰを生成する。ホスホエールピルビン酸を基質としてピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）を作用させ、そのＡＤＰを消費し、ピルビン酸を生成し、ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）を用いてグリセロールを消去する。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させると、ＮＡＤが消費され、ＰＤＨの反応は進行しないようになる。この状態で、ＴＧを測定するべく、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤを加えてＴｈｉｏ−ＮＡＤＨの生成を測定する（下式参照）。
【００２０】
【化２】
【００２１】
（３）工程Ａ：測定対象物にＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを反応させる工程、
工程Ｂ：ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて、工程Ａにて残存しているＮＡＤ（Ｐ）を消費する工程、
工程Ｃ：工程ＢにおけるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用をその抗体及びその阻害剤の１種または２種以上を用いて停止させる工程、
工程Ｄ：工程Ｃに引き続いて、ＮＡＤ（Ｐ）サイクリングを行う工程、
を含むことを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法３）：
本方法は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応に用いることができる。本方法においては、まず、測定対象物質に、ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するデヒドロゲナーゼを反応させる。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて残存しているＮＡＤ（Ｐ）を消費する。このあと生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、サイクリング反応をさせるが、ここでＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに対する抗体またはその阻害物質を加えることにより、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを不活性化し、サイクリング反応におけるＮＡＤ（Ｐ）には反応しないようにする。
一方、サイクリング反応においては、上記で生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、第一のデヒドロゲナーゼの作用を受けてＮＡＤ（Ｐ）となり、続いて第二のデヒドロゲナーゼの作用を受けてもとのＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換される反応が数回繰り返される（ＮＡＤ（Ｐ）サイクリング）。このサイクリング反応をｎ回繰り返すと、もとのＮＡＤ（Ｐ）Ｈをｎ倍に増幅し測定可能となる。
【００２２】
本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは１〜５０単位／ｍｌあれば良い。
【００２３】
本方法の測定対象となる酵素としては、具体的には、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、ＡＭＹ、ＣＰＫ等が挙げられる。
【００２４】
また、本方法の測定対象となる基質としては、３α−ヒドロキシステロイド、ｍｙｏ−イノシトール、Ｌ−リンゴ酸、α−アミノ酸、グルコース、Ｄ−ガラクトース−６−リン酸、Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸、乳酸、ピルビン酸、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、グリセロール、カルニチン、コレステロール等が挙げられる。
【００２５】
ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ阻害剤には、ニコチンアミド、アデノシンジホスフェートリボース、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェートリボース等が挙げられる。
抗ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ抗体は、ＡＳＯ陽性血漿、血清から、またはマウス、ウサギ、ヤギなどにＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを感作させて得ることができる。
【００２６】
本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ阻害剤、抗ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ抗体の使用量は、使用するＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに対し、瞬時、あるいは１〜１０分以内に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼが完全に反応を停止する量を使用すればよい。
ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ阻害剤、抗ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ抗体は単独で、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
本方法を使用する例として、３α−ヒドロキシステロイドの測定を挙げることができる。まず試料にＮＡＤを補酵素として３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）を作用させる。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させ、残存しているＮＡＤを消費し、続いてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに対する抗体または阻害物質を加えてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用を停止させる。引き続いて、生成したＮＡＤＨを、ニトロテトラブルーを基質とし、第一のデヒドロゲナーゼとしてダイアフォラーゼを作用させてＮＡＤとし、またグルコース−６−リン酸を基質とし、第二のデヒドロゲナーゼとしてグルコース−６─リン酸デヒドロゲナーゼを作用させてＮＡＤＨにもどすサイクリング反応を数回行う（下式参照）。
【００２８】
【化３】
【００２９】
また他の例として、グルコースの測定においては、まず試料にＮＡＤＰを補酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を作用させる。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させ、残存しているＮＡＤＰを消費し、続いてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに対する抗体または阻害物質を加えてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用を停止させる。引き続いて、生成したＮＡＤＰＨを、α−ケトグルタル酸を基質とし、第一のデヒドロゲナーゼとしてグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌＤＨ）を作用させてＮＡＤＰとし、またグルコース−６−リン酸を基質とし、第二のデヒドロゲナーゼとしてグルコース−６─リン酸デヒドロゲナーゼを作用させてＮＡＤＰＨにもどすサイクリング反応を数回行う（下式参照）。
【００３０】
【化４】
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。
【００３３】
【００３４】
【００３５】
これらの試薬を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）酵素測定用試薬として、以下の測定に供した。
まず、試料７μｌと試薬１を３２０μｌ混和し、５分間３７℃に恒温後、試薬２または試薬３を８０μｌ加え、攪拌後、３７℃で３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（１〜３分後）を求めた。盲検として、試料の代わりに生理的食塩水を用いて同様の操作を行った。試料にはブタ心筋由来の高値の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を１０段階希釈したものを使用した。
その結果を図１、２に示す。本方法（試薬１＋試薬２による）は従来法（試薬１＋試薬３による）に比べ、測定範囲が広がり、反応直線性が向上した。
【００３６】
実施例２
以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。
【００３７】
【００３８】
【００３９】
これらの試薬を、血清尿素窒素（ＵＮ）測定用試薬とし、以下の測定に供した。
まず、試料６μｌと試薬４を２５０μｌ混和し、５分間３７℃に恒温後、試薬５または試薬６を１００μｌを添加し、３７℃で３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（２〜４分後）を求めた。盲検として、試料の代わりに生理的食塩水を用いて同様の操作を行った。試料には尿素窒素として約５００ｍｇ／ｄｌとなるように調製したものを１０段階希釈したものを使用した。
その結果を図３に示す。本方法（試料４＋試料５による）は従来法（試料４＋試料６による）に比べ、測定範囲が広がり、反応直線性が向上した。
【００４０】
実施例３
以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。
【００４１】
【００４２】
・ＡＭＹ試薬・Ａ（国際試薬（株）製／従来品）
【００４３】
これらの試薬を、アミラーゼ測定用試薬として、以下の測定に供した。
まず、試料７μｌと試薬７を２８０μｌを混和し、５分間３７℃に恒温する。次に、試薬８を７０μｌ添加し、３７℃で４０５ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（３〜５分後）を求めた。
ＡＭＹ試薬・Ａ（国際試薬（株）製）を用いたＧ７ ＰＮＰ法による測定は、使用説明書に従い、検体８μｌと第一試薬３２０μｌを混和し、３７℃で５分間恒温し、次に第二試薬を８０μｌ添加し、３７℃で４０５ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（３〜４分後）を求めた。
試料として、患者血清検１４例及びプール血清に最大２ｇ／ｄｌのグルコースを添加し、消去効果を確認した。
従来法のＧ７ ＰＮＰ法との血清検体における相関性は、相関係数０．９９９、回帰式１．０１６ｘ−３．１となり、良好な結果を得た（図４）。
また、本法によれば、アミラーゼ測定値へのグルコースの干渉も２ｇ／ｄｌまでないことが確認できた（図５）。
【００４４】
実施例４
以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。
【００４５】
【００４６】
【００４７】
【００４８】
・胆汁酸・Ｅ「コクサイ」（国際試薬（株）製／従来品）
【００４９】
これらの試薬を、血清中総胆汁酸濃度測定用試薬として、以下の測定に供した。尚、試薬１１中の抗ＮＡＤ（Ｐ）ａｓｅ抗体は、ＡＳＬＯ陽性血漿の高力価のものをゲル濾過して精製したものを用いた。
まず、試料１００μｌと試薬９を１．０ｍｌ混和し、５分間３７℃に恒温後、試薬１０を５００μｌ加え、５分間３７℃で反応させ、さらに試薬１１を５００μｌ加え、５分間３７℃で反応させる。最後に試薬１２を１．０ｍｌ加え、３７℃で５５０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（１〜３分後）を求めた。
胆汁酸・Ｅ「コクサイ」（国際試薬（株）製）は、使用説明書に従い、検体２０μｌに第一試薬３２０μｌを添加し、３７℃で５分間恒温し、次に第二試薬を８０μｌ添加後、５分後の吸光度を５４６ｎｍで測定した。また、検体ブランクとして第一試薬から３α−ＨＳＤを抜いたブランク試薬を同様に操作し、この測定値を差し引いて、胆汁酸濃度を求めた。
試料には血清２０例、標準液（コール酸ナトリウム ５０μｍｏｌ／ｌ）を１００μｍｏｌ／ｌを最高に１０段階希釈したものを使用した。盲検として、試料の代わりに生理的食塩水を用いて同様の操作を行った。
その結果を図６に示す。本方法（試料９〜１２による）によれば、約８０μｌｍｏｌ／ｌまで直線性が確認された。
一方、従来法（３ α−ＨＳＤ−ホルマザン法）との相関係数は、ｒ＝０．９５３、回帰式ｙ＝０．９７４ｘ−０．２８７となり、良好な相関性を示した。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の各測定方法によれば、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を含む生体成分中の測定対象の各種の測定方法を改良でき、高精度で迅速な測定が実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定方法１と従来法による乳酸脱水素酵素測定の検量線を示す。
【図２】本発明の測定方法１と従来法による乳酸脱水素酵素測定時の経時変化を示す。
【図３】本発明の測定方法１と従来法による尿素窒素測定の検量線を示す。
【図４】本発明の測定方法２と従来法によるアミラーゼ測定における相関性を示す。
【図５】本発明の測定方法２での、アミラーゼ測定値へのグルコースの干渉を示す。
【図６】本発明の測定方法３による血清中総胆汁酸濃度測定の検量線を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、臨床検査の分野で利用される生体成分中の測定対象の新規な測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、臨床検査分野において、血清、血漿、尿などの生体中の成分（酵素、基質など）を測定するための反応系に、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応が多く利用されている。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは３４０ｎｍに吸収極大をもつので、ＮＡＤ（Ｐ）（酸化型補酵素）を生成する反応においてはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）の減少が、反対に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）を生成する反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型補酵素）の増加が３４０ｎｍの吸収度変化により測定される。
しかし、デヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応は、ほとんどが可逆反応であるため、例えばＮＡＤ（Ｐ）を生成する反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）が増加するに従って逆反応が大きくなり反応性が低下する、つまり、測定範囲が狭くなり、反応直線性が伸びなくなるという問題がある。同様に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを増加させる方法も、ＮＡＤＰ（Ｈ）が増加するに従って逆反応が大きくなり反応性が低下する。
また、生体成分中には、本来目的とする物質の測定に影響を及ぼす干渉物質、いわゆる内因性物質が存在する場合がある。このような場合、この内因性物質も測定すべき物質と同時に測定されることから、測定精度に悪い影響を与えるという問題がある。
一方、微量の基質や酵素活性を増幅定量する方法として、「酵素的サイクリング」が知られている。一般には、基質または酵素活性から生成した基質の「基質サイクリング」として測定される。ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を繰り返す「ＮＡＤ（Ｐ）サイクリング」もこの酵素的サイクリングの一例である。「酵素的サイクリング」は、目的の基質や酵素が微量であっても、これらが増幅されることにより高感度に測定できるので微量定量法としては有用であるが、「ＮＡＤ（Ｐ）サイクリング」の場合は、酸化型〔ＮＡＤ（Ｐ）〕または、還元型〔ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ〕のいずれか一方だけを測定する必要がある。従って、ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈが共存するため測定不能となる。これを解決するためにＨＰＬＣを用いて両者を分別したり、熱処理してどちらか一方を分解する方法があるが、操作が複雑になる。また、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ法は酸化性基質と還元性基質の両方を測定するが、胆汁酸においては基質によりサイクリング率が異なるため、物質の定量として問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を含む測定方法における上記の問題点を改良し、高精度で迅速な生体成分中の測定対象の測定方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが鋭意研究した結果、下記の本発明により上記目的が達成されることを見出した。
即ち、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を含み、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させることによる生体成分中の測定対象の新規な各測定方法であり、その態様としては次の通りである。
（１）生体成分中に含まれる測定対象をＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とするデヒドロゲナーゼを用いて測定する反応において、当該反応により生成したＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて消費し、当該反応を促進させることを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法１）、
（２）測定対象の測定に影響を及ぼす干渉物質を、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを用いて消去し、残存するＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて消費することを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法２）、
（３）工程Ａ：測定対象物にＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを反応させる工程、
工程Ｂ：ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて、工程Ａにて残存しているＮＡＤ（Ｐ）を消費する工程、
工程Ｃ：工程ＢにおけるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用をその抗体及びその阻害剤の１種または２種以上を用いて停止させる工程、
工程Ｄ：工程Ｃに引き続いて、ＮＡＤ（Ｐ）サイクリングを行う工程、
を含むことを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法３）。
【０００５】
本発明において測定される測定対象とは、血液、血漿、尿、髄液、血球、唾液、涙液等の生体成分中の酵素、基質である。
【０００６】
本発明に使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼは、動物組織由来、微生物由来のいずれも用いることができる。市販品として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． 由来のものを用いてもよい。
【０００７】
本発明にいう主反応とは、デヒドロゲナーゼ、またはレダクターゼ、オキシゲンナーゼ等、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする酸化還元反応をいう。
【０００８】
以下、本発明の各測定方法を具体的に説明する。
（１）生体成分中に含まれる測定対象をＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とするデヒドロゲナーゼを用いて測定する反応において、当該反応により生成したＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて消費し、当該反応を促進させることを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法１）：
本方法は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）を生成する反応に用いることができる。具体的には、主反応で生成したＮＡＤ（Ｐ）にＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて消費することにより、この主反応が不可逆反応となり、反応が促進される。測定は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費量を３４０ｎｍの吸光度の減少として求める。ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）に反応しても生成されるものは３４０ｎｍに吸収がないため、主反応の測定に影響を与えない。
【０００９】
本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは５〜５０単位／ｍｌあればよい。
【００１０】
本方法の測定対象となる酵素としては、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＢＤ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、コリンエステラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、ロイシンアミノペプチダーゼ等が挙げられる。
【００１１】
また、本方法の測定対象となる基質としては、尿素窒素（ＵＮ）、トリグリセリド（ＴＧ）、遊離型（非結合型）脂肪酸（ＮＥＦＡ）、クレアチン（ＣＲＮ）、シアル酸等が挙げられる。
【００１２】
尚、ＵＮはＧｌＤＨを、ＧＯＴはＭＤＨを、ＧＰＴはＬＤＨを、ＴＧはＬＤＨをそれぞれ共役反応させて測定する。
【００１３】
（２）測定対象の測定に影響を及ぼす干渉物質を、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを用いて消去し、残存するＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを用いて消費することを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法２）：
本方法は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応に用いることができる。本方法においては、まず、内因性物質に起因する物質に、ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するデヒドロゲナーゼを反応させる。その後、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを加えてＮＡＤ（Ｐ）に反応させ、これを消費し、かくしてＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼの反応を停止させる。
このあと、本来測定すべき目的物質の測定をするが、そのときはＮＡＤ（Ｐ）の関与しない反応系に導いて測定する。それには、例えば、オキシダーゼによりＨ２Ｏ２を生成する反応や、ＮＡＤ（Ｐ）の代わりにＴｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）を基質とする反応などがある。これらの反応ではＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼにより消費させられるため、デヒドロゲナーゼによりＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成されることはない。
【００１４】
本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは１〜５０単位／ｍｌあれば良い。
【００１５】
本方法の測定対象となる酵素としては、代表的にはアミラーゼ（ＡＭＹ）が挙げられる。
【００１６】
また、本方法の測定対象となる基質としては、代表的にはトリグリセリド（ＴＧ）が挙げられる。
【００１７】
本方法を使用する例として、アミラーゼ（ＡＭＹ）の測定を挙げる。まず試料中の内因性物質であるグルコースにヘキソキナーゼ（ＨＫ）を作用させてグルコース−６−リン酸とし、さらにグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）を作用させて６−ホスホグルコン酸とする。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させると、ＮＡＤが消費され、Ｇ−６−ＰＤＨの反応は進行しないようになる。この状態で、ＡＭＹを測定するべく、ＡＭＹの酵素活性により生成したグルコースにグルコースオキシダーゼを加えてＨ２ Ｏ２ を生成するか、またはＴｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）を加えてＴｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成を測定する（下式参照）。
【００１８】
【化１】
また他の例として、トリグリセリド（ＴＧ）の測定においては、まず試料中の内因性物質であるグリセロールにグリセロールキナーゼ（ＧＫ）を作用させてグリセロール３−リン酸とし、それと同時にＡＴＰからＡＤＰを生成する。ホスホエールピルビン酸を基質としてピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）を作用させ、そのＡＤＰを消費し、ピルビン酸を生成し、ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）を用いてグリセロールを消去する。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させると、ＮＡＤが消費され、ＰＤＨの反応は進行しないようになる。この状態で、ＴＧを測定するべく、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤを加えてＴｈｉｏ−ＮＡＤＨの生成を測定する（下式参照）。
【００２０】
【化２】
（３）工程Ａ：測定対象物にＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを反応させる工程、
工程Ｂ：ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて、工程Ａにて残存しているＮＡＤ（Ｐ）を消費する工程、
工程Ｃ：工程ＢにおけるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用をその抗体及びその阻害剤の１種または２種以上を用いて停止させる工程、
工程Ｄ：工程Ｃに引き続いて、ＮＡＤ（Ｐ）サイクリングを行う工程、
を含むことを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法（測定方法３）：
本方法は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応のうち、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応に用いることができる。本方法においては、まず、測定対象物質に、ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するデヒドロゲナーゼを反応させる。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて残存しているＮＡＤ（Ｐ）を消費する。このあと生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、サイクリング反応をさせるが、ここでＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに対する抗体またはその阻害物質を加えることにより、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを不活性化し、サイクリング反応におけるＮＡＤ（Ｐ）には反応しないようにする。
一方、サイクリング反応においては、上記で生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、第一のデヒドロゲナーゼの作用を受けてＮＡＤ（Ｐ）となり、続いて第二のデヒドロゲナーゼの作用を受けてもとのＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換される反応が数回繰り返される（ＮＡＤ（Ｐ）サイクリング）。このサイクリング反応をｎ回繰り返すと、もとのＮＡＤ（Ｐ）Ｈをｎ倍に増幅し測定可能となる。
【００２２】
本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの量は、反応液中に通常０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは１〜５０単位／ｍｌあれば良い。
【００２３】
本方法の測定対象となる酵素としては、具体的には、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、ＡＭＹ、ＣＰＫ等が挙げられる。
【００２４】
また、本方法の測定対象となる基質としては、３α−ヒドロキシステロイド、ｍｙｏ−イノシトール、Ｌ−リンゴ酸、α−アミノ酸、グルコース、Ｄ−ガラクトース−６−リン酸、Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸、乳酸、ピルビン酸、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、グリセロール、カルニチン、コレステロール等が挙げられる。
【００２５】
ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ阻害剤には、ニコチンアミド、アデノシンジホスフェートリボース、アデノシンモノホスフェート、アデノシンジホスフェートリボース等が挙げられる。
抗ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ抗体は、ＡＳＯ陽性血漿、血清から、またはマウス、ウサギ、ヤギなどにＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを感作させて得ることができる。
【００２６】
本方法で使用されるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ阻害剤、抗ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ抗体の使用量は、使用するＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに対し、瞬時、あるいは１〜１０分以内に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼが完全に反応を停止する量を使用すればよい。
ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ阻害剤、抗ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼ抗体は単独で、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
本方法を使用する例として、３α−ヒドロキシステロイドの測定を挙げることができる。まず試料にＮＡＤを補酵素として３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）を作用させる。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させ、残存しているＮＡＤを消費し、続いてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに対する抗体または阻害物質を加えてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用を停止させる。引き続いて、生成したＮＡＤＨを、ニトロテトラブルーを基質とし、第一のデヒドロゲナーゼとしてダイアフォラーゼを作用させてＮＡＤとし、またグルコース−６−リン酸を基質とし、第二のデヒドロゲナーゼとしてグルコース−６─リン酸デヒドロゲナーゼを作用させてＮＡＤＨにもどすサイクリング反応を数回行う（下式参照）。
【００２８】
【化３】
また他の例として、グルコースの測定においては、まず試料にＮＡＤＰを補酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を作用させる。次に、ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを反応させ、残存しているＮＡＤＰを消費し、続いてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼに対する抗体または阻害物質を加えてＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用を停止させる。引き続いて、生成したＮＡＤＰＨを、α−ケトグルタル酸を基質とし、第一のデヒドロゲナーゼとしてグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌＤＨ）を作用させてＮＡＤＰとし、またグルコース−６−リン酸を基質とし、第二のデヒドロゲナーゼとしてグルコース−６─リン酸デヒドロゲナーゼを作用させてＮＡＤＰＨにもどすサイクリング反応を数回行う（下式参照）。
【００３０】
【化４】
【実施例】
以下、本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。
これらの試薬を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）酵素測定用試薬として、以下の測定に供した。
まず、試料７μｌと試薬１を３２０μｌ混和し、５分間３７℃に恒温後、試薬２または試薬３を８０μｌ加え、攪拌後、３７℃で３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（１〜３分後）を求めた。盲検として、試料の代わりに生理的食塩水を用いて同様の操作を行った。試料にはブタ心筋由来の高値の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を１０段階希釈したものを使用した。
その結果を図１、２に示す。本方法（試薬１＋試薬２による）は従来法（試薬１＋試薬３による）に比べ、測定範囲が広がり、反応直線性が向上した。
【００３６】
実施例２
以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。
これらの試薬を、血清尿素窒素（ＵＮ）測定用試薬とし、以下の測定に供した。
まず、試料６μｌと試薬４を２５０μｌ混和し、５分間３７℃に恒温後、試薬５または試薬６を１００μｌを添加し、３７℃で３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（２〜４分後）を求めた。盲検として、試料の代わりに生理的食塩水を用いて同様の操作を行った。試料には尿素窒素として約５００ｍｇ／ｄｌとなるように調製したものを１０段階希釈したものを使用した。
その結果を図３に示す。本方法（試料４＋試料５による）は従来法（試料４＋試料６による）に比べ、測定範囲が広がり、反応直線性が向上した。
【００４０】
実施例３
以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。
・ＡＭＹ試薬・Ａ（国際試薬（株）製／従来品）
【００４３】
これらの試薬を、アミラーゼ測定用試薬として、以下の測定に供した。
まず、試料７μｌと試薬７を２８０μｌを混和し、５分間３７℃に恒温する。次に、試薬８を７０μｌ添加し、３７℃で４０５ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（３〜５分後）を求めた。
ＡＭＹ試薬・Ａ（国際試薬（株）製）を用いたＧ７ ＰＮＰ法による測定は、使用説明書に従い、検体８μｌと第一試薬３２０μｌを混和し、３７℃で５分間恒温し、次に第二試薬を８０μｌ添加し、３７℃で４０５ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（３〜４分後）を求めた。
試料として、患者血清検１４例及びプール血清に最大２ｇ／ｄｌのグルコースを添加し、消去効果を確認した。
従来法のＧ７ ＰＮＰ法との血清検体における相関性は、相関係数０．９９９、回帰式１．０１６ｘ−３．１となり、良好な結果を得た（図４）。
また、本法によれば、アミラーゼ測定値へのグルコースの干渉も２ｇ／ｄｌまでないことが確認できた（図５）。
【００４４】
実施例４
以下の組成の試薬をそれぞれ調製する。
・胆汁酸・Ｅ「コクサイ」（国際試薬（株）製／従来品）
【００４９】
これらの試薬を、血清中総胆汁酸濃度測定用試薬として、以下の測定に供した。尚、試薬１１中の抗ＮＡＤ（Ｐ）ａｓｅ抗体は、ＡＳＬＯ陽性血漿の高力価のものをゲル濾過して精製したものを用いた。
まず、試料１００μｌと試薬９を１．０ｍｌ混和し、５分間３７℃に恒温後、試薬１０を５００μｌ加え、５分間３７℃で反応させ、さらに試薬１１を５００μｌ加え、５分間３７℃で反応させる。最後に試薬１２を１．０ｍｌ加え、３７℃で５５０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量（１〜３分後）を求めた。
胆汁酸・Ｅ「コクサイ」（国際試薬（株）製）は、使用説明書に従い、検体２０μｌに第一試薬３２０μｌを添加し、３７℃で５分間恒温し、次に第二試薬を８０μｌ添加後、５分後の吸光度を５４６ｎｍで測定した。また、検体ブランクとして第一試薬から３α−ＨＳＤを抜いたブランク試薬を同様に操作し、この測定値を差し引いて、胆汁酸濃度を求めた。
試料には血清２０例、標準液（コール酸ナトリウム ５０μｍｏｌ／ｌ）を１００μｍｏｌ／ｌを最高に１０段階希釈したものを使用した。盲検として、試料の代わりに生理的食塩水を用いて同様の操作を行った。
その結果を図６に示す。本方法（試料９〜１２による）によれば、約８０μｌｍｏｌ／ｌまで直線性が確認された。
一方、従来法（３ α−ＨＳＤ−ホルマザン法）との相関係数は、ｒ＝０．９５３、回帰式ｙ＝０．９７４ｘ−０．２８７となり、良好な相関性を示した。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の各測定方法によれば、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼが関与する酸化還元反応を含む生体成分中の測定対象の各種の測定方法を改良でき、高精度で迅速な測定が実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定方法１と従来法による乳酸脱水素酵素測定の検量線を示す。
【図２】本発明の測定方法１と従来法による乳酸脱水素酵素測定時の経時変化を示す。
【図３】本発明の測定方法１と従来法による尿素窒素測定の検量線を示す。
【図４】本発明の測定方法２と従来法によるアミラーゼ測定における相関性を示す。
【図５】本発明の測定方法２での、アミラーゼ測定値へのグルコースの干渉を示す。
【図６】本発明の測定方法３による血清中総胆汁酸濃度測定の検量線を示す。
Claims (1)
- 工程Ａ：測定対象物にＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを反応させる工程、
工程Ｂ：ＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼを作用させて、工程Ａにて残存しているＮＡＤ（Ｐ）を消費する工程、
工程Ｃ：工程ＢにおけるＮＡＤ（Ｐ）ヌクレオシダーゼの作用をその抗体及びその阻害剤の１種または２種以上を用いて停止させる工程、及び
工程Ｄ：工程Ｃに引き続いて、ＮＡＤ（Ｐ）サイクリングを行う工程
を含むことを特徴とする生体成分中の測定対象の測定方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP27715793A JP3566976B2 (ja) | 1993-11-05 | 1993-11-05 | 生体成分中の測定対象の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27715793A JP3566976B2 (ja) | 1993-11-05 | 1993-11-05 | 生体成分中の測定対象の測定方法 |
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|---|---|
| JPH07124000A JPH07124000A (ja) | 1995-05-16 |
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|---|---|---|---|
| JP27715793A Expired - Fee Related JP3566976B2 (ja) | 1993-11-05 | 1993-11-05 | 生体成分中の測定対象の測定方法 |
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| JP (1) | JP3566976B2 (ja) |
-
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- 1993-11-05 JP JP27715793A patent/JP3566976B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH07124000A (ja) | 1995-05-16 |
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