JPH05507191A

JPH05507191A - Ｃｍｐ―活性化蛍光性シアル酸ならびにその製造方法

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Publication number: JPH05507191A
Application number: JP91506300A
Authority: JP
Inventors: ブロースマー，ラインハルト; グロース，ハンス　ユルゲン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-03-26
Filing date: 1991-03-19
Publication date: 1993-10-21
Also published as: EP0521941A1; US5405753A; WO1991014697A1; DE4009630A1; DE4009630C2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＭＰ−活性化蛍光性シアル酸ならびにその製造方法本発明の対象は、ＣＭＰ− 活性化蛍光性ないしは吸収性シアル酸ならびに新規ＣＭＰ−活性化蛍光ないしは吸収性シアル酸である。

シアル酸（アシルノイラミン酸とも呼ばれる）は、多くの細菌および動物の糖タンパク質および糖脂質の成分である。炎症、組織破壊過程および特定の腫瘍疾病の場合、血漿中にも高濃度のシアル酸、殊に５−Ｎ−アセチルノイラミン酸および活性の高められたいわゆるシアリルトランスフェラーゼが見出される。後者は、生理学的に細胞内で糖複合体中ヘシアル酸を取込み：これはシアル酸が取込まれる糖複合体受容体のグリカン配列および取込まれたシアル酸が化学的に結合するグリコシド結合に対し゛決定的特殊性を有する糖タンパク質酵素である。血液および組織中のシアル酸濃度の検出、殊に細胞膜表面上のシアリル化モデル、ならびに細胞または体液中のシアリルトランスフェラーゼの活性および特異性の検出は、最近の医療的診断に対し次第に重視されている。

かかる酵素の検出の際に問題なのは、該酵素が通常極めて低い活性で存在するので、直接的検出法が困難であることである。従りて、先行技術によれば、シアリルトランスフェラーゼの触媒反応を測定するために、放射能標識したＣＭＰ−活性化シアル酸が基質として使用された（　Ｂｅｙｅｒおよび協力者、“＾ｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｒｅ−１ａｔ、＾ｒｅａｓ　ｌ１ｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、” 　、第５２巻、第２３頁〜第１７５頁（１９８１年）参照）。この方法は、放射性物質を取扱うことが多くの場所で困難であること以外に、時間がかかりかつ高価である。

従って、シアリルトランスフェラーゼ反応の少量の反応生成物をも確実、簡単かつ敏感に検出することのできる問題なく取扱える簡単な標識物質をめる要求が存在した。

それ故、“Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　”　、第１７７巻、第５８３頁〜第５８９頁（１９８８年）には９−アミノ−５−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸をフルオレセイニルーインチオシアネートと結合する方法が記載されており、後者の化合物はグロス（Ｇｒｏｓｓ）およびブロスマー（Ｂｒｏｓｓｍｅｒ）　（Ｇｌｙｃｏｃｏｒｉｊｕｇａｔｅ　Ｊ、”　（１９８７年）、第４巻、第１４５頁〜第１７６頁ないしは”　Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｂｆｏｃｈｅｍ、　”　（１９８７年）、第１６８巻、第５９５頁〜第６０２頁）により記載された方法によりＣＭＰと結合することができる。こうして製造されたフルオレセイン標識したＣＭＰ−シアル酸はインジケータとして、公知の放射能標識したＣＭＰ−シアル酸に比してすぐれていることが判明した。フルオレ上イニル−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造ならびに引き続（ＣＭＰ−活性化は、不良の反応および頻繁な精製に基づき、最初に使用した９−アミノ−５ −Ｎ−アセチルノイラミン酸に対して、約５％の収率で進行するにすぎない。従って、この物質を簡単にかつ高い収率で製造し、それと共に妥当な価格で入手するという要求が意外にも、この化合物ならびに他の、従来未知の他のＣＭＰ−活性化蛍光性シアル酸誘導体は、差当り９−アミノ−５−Ｎ−アセチルノイラミン酸を、文献に記載されているように、ＣＭＰと結合することによって製造しうろことが判明した（　Ｇｒｏｓｓおよび協力者、５９５頁〜第６０２頁参照）。この反応は、高い収率（９５％）で進行し、最終生成物の精製も比較的簡単である。望ましい５−アセチル基の代りに、他のアシル基が存在していてもよい。遊離の５−アミノ基は適当でない。それというのも゛これらの化合物は安定でないからである。こうして得た生成物は、本発明により活性化蛍光性化合物、たとえばフルオレセイン−イソチオシアネートと結合することができる。この反応も、多数の可能な反応性中心により多数の副反応が起きかつＣＭＰ−グルコシドのかなりの分解が起きることが予測されたが、意外にも非常に高い収率で進行し、最終生成物の精製も比較的簡単である。他の研究は、この方法がフルオレセイン化合物の場合に使用できるだけでなく、結合性ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、トリアジニル基またはスルホン酸基を含有する実際にすべての他の蛍光性化合物も、適当な活性化剤ないしは結合性化合物を用いてＣＭＰ−活性化９− アミノ−Ｎ−アセチルノイラミン酸に結合することができることを示した。さらに、かかる化合物の生化学的活性（つまり酵素反応速度のデータ）は、蛍光性基がＮ−アシルノイラミン酸の９位のアミノ基ではなく、５位のアミノ基を介して結合し、その際後者の場合に差当りもう１つのω−アミノ−アシル基、たとえば β−アミノアセチル基がスペーサとして５−アミノ基に結合する場合、むしろさらに増加することが判明した。この場合この蛍光性基は配糖体の中心、それと共に酵素的触媒反応に対し極めて重要な位置に立体チル基は常に、酵素基質の相互作用に対する重要な構造特徴とみなされたが、種々のシアリルトランスフェラーゼはかかる化合物に対し、９位における相応する置換基と比べてそれぞれむしろ高い親和力（つまり小さいミカエリス定数）を有する。同様に、比較的疎水性である蛍光性基は、ＣＭＰ−配糖体に対するたいていのシアリルトランスフェラーゼの親和力を増加し、従ってインジケータとして有利に使用できることが判明した。

それ故、本発明方法は、式ｌ［式中Ｒ１はアミノ基を表わし　Ｒ２はアシル基を表わすか、またはＲ１はヒドロキシル基またはアシルアミノ基を表わし　Ｒ２はアミノアシル基を表わす］で示される５−アシルアミド−９−アミノ−３，５，９−ドリデオキシーβ−Ｄ− グリセロ−Ｄ−ガラクトーノヌロソン酸または５−アミノアシルアミノ−３，５ −ジデオキシ−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロンン酸（ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｓａｅｕｒｅ）　（以下９−アミノ−５−Ｎ−アシル−Ｎｅｕないしは５ −アミノアシル−Ｎｅｕと略称）を、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼの存在でシチジン三リン酸（ＣＴＰ）と反応させて式■［式中Ｒ１およびＲ２は上記のものを表わす］で示されるＣＭＰ−活性化シアル酸を得、これを式■Ｆｊ−５ｐ−Ｘ　（Ｉｎ）［式中Ｆｌは蛍光性化合物を表わし、Ｓｐは原子価または結合スペーサ基を表わし、Ｘは活性化カルボキシル基またはチオカルボニル基、トリアジニル基またはスルホン酸基を表わす］で示される蛍光性化合物と反応させて式■ ［式中Ｒ３は基ＦＺ−Ｓｐ−Ｘ’−ＮＨ−を表わし　Ｒ４はアシル基を表わすかまたはＲ３はヒドロキシル基またはアシルアミノ基を表わし　Ｒ４は基Ｆ／−５ｐ−Ｘ’−ＮＨ−アシルを表わし、ＦｌおよびＳｐはそれぞれ上記のものを表わしＸ　ｌは一〇〇−１−ＣＳ−１−９Ｏ２−またはトリアジニル基を表わす］で示されるＣＭＰ−活性化蛍光性シアル酸を得ることを要旨とする。

活性化酸基Ｘはアミノ基と化学的に反応する基、しかもアミドについてたとえばエステル−１酸クロリド−１酸アジド基であるか、または尿素ないしはチオ尿素についてたとえばイソシアネート−、イソチオシアネート基であるか、またはアミノトリアジンについてたとえばトリアジニルジクロリド基である。相応する反応は、酸アミドの生成のために良く知られている。

従って、等価の基は同様に一緒に包含されている。

基Ｓｐは主として原子価である。それというのも吸収ないしは蛍光性化合物はしばしば結合性基Ｘ′を直接発色団に含有しているからである。しかし、他の場合には側鎖、殊に１〜１０、とくに２〜６のＣ原子を有するアルキル鎖が接続されていてもよい。かかる基は、ハロゲンアルキルカルボン酸またはハロゲンアルキルスルホン酸を用いて容易に結合基Ｘと一緒に発色団のヒドロキシル基またはアミノ基に結合することができる。

反応原理：ＣＭＰ−活性化蛍光ノイラミン酸類似体合成の出発物質は、ＣＭＰ−９−アミノ −Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＣＭＰ−５−アミノアセトアミド−ノイラミン酸であり；さらに５−アミノアセチル基と同様にＣ−５位に長い連輪を有するすべての５−置換類似体（たとえばＮ−（ε−アミノカプロイル）−ノイラミン酸）も適当である。

反応は、出発物質をＣ−９位またはＣ−５位の第一級アミノ基を介して、容易にアミノ官能基と反応する種々の反応性蛍光または吸収性物質と結合することによって行なわれる。活性化置換基は、インチオシアネート、インシアネートとして、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、スルホン酸クロリドとして、トリアジンクロリドとしてまたは酸アジドとして存在しうる。

反応は、部分的に水性媒体中、中性またはアルカリ性ｐＨ範囲（７，５〜１０；最良には反応はｐＨ８，５〜９で行なわれる）内で、２０℃またはより良くは３７℃で、反応物質の可溶化のための有機溶剤（たとえばメタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ，アセトンまたはアセトニトリル等３０％〜８０％）を添加して行なわれる。出発物質ＣＭＰ−グリコシドおよび形成したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ類似体は上記のｐＨ範囲内で安定である（分解５％以下）。活性化蛍光試剤の過剰量は、変換したＣＭＰ−グリコシド９０％以上を達成するために、イソチオシアネートの場合には２倍だけでよく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの場合には、同じ変換率を達成するために良好には３〜５倍であり：原則的には反応時間短縮のため１０倍の過剰量が有利である（イソチオシアネートの場合通常の事例では３７℃で１０〜１５分、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの場合２０〜３０分まで）。活性基としてトリアジニルクロリドの場合にはより高い過剰量（６〜工５倍）が推奨され、完全な変換率（９０％）までの反応時間は３７℃で少なくとも１５〜２０時間である。

すべての場合、蛍光ないしは吸収性ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ類似体への９０％またはそれ以上の変換が達成される。引き続き、合成した蛍光ないしは吸収性ＣＭＰ　 −ＮｅｕＡｃＨ似体は分取ＨＰＬＣにより精製する（　ＧｒｏｓｓおよびＢｒａｓｓｎｅｒＳ”Ｈｕｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、’　、第１７７巻、第５８３頁〜第５８９頁参照）。（固定相として“５ｐｈｅ−ｒｉｓｏｒｄ　ＮＨ＠”　（Ｚｉｎｓｓｅｔ）　、　”Ａｍ１ｎｏｐｒｅｐｙｌ″　（５ｅｒｖａ）　、” Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ　Ｎｌ２”　（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ）および水中ＫＨｘＰ　Ｏ４／　５　ｍＭ　／移動相としてアセトニトリル５０〜７０％）。

新規方法の利点最初に、この方法を用いて新規ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ類似体を直接にＣＭＰ−グリコシドから化学的に製造した。ここに示した方法の利点は、反応性置換基とＣＭＰ−グリコシドのアミノ基どの直接結合であり：これにより差当り相応する遊離ＮｅｕＡｃ類似体の時間および費用のかかる化学的合成、それの精製および引き続く各遊離ＮｅｕＡｃ類似体のＣＭＰ−シアル酸シンターゼによる酵素的活性化と後続の精製がなくなる。本発明による化学的合成によれば、たんに簡単な精製操作を実施すればよい。さらに、収率は、Ｃ−９位またはｃ−５位に大きい蛍光性置換基を有する遊離のＮｅｕＡ　ｃ類似体のこの酵素的反応の場合には、ＣＭＰ−９−フルオレセイニルーＮｅｕＡｃの酵素的合成につき判明したように、著しく低い（約１５％）。これとは異なり、ＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡｃは９５％の最適収率でＣＭＰ−ＮｅｕＡ　ｃシンターゼ反応により製造することができる。

ＣＭＰ−９−アミノＮｅｕＡｃに対する蛍光性置換基の結合反応は、同様に９０％以上の変換率で進行するので、新規方法は最適の収率を保証する。この方法はまた経済的、簡単かつ時間節約型であり、多種多様のＣＭＰ　−ＮｅｕＡ　ｃ類似体を多種多様の可能な活性化置換基により製造することが可能である。この場合、ＣＭＰ〜グリコシドの公知不安定性は障害理由ではない。それというのも殊にＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡｃは上述したｐＨ範囲（ｐＨ７，５〜９．５）内で意外にも安定であるからである。

製造したＣ　Ｍ　Ｐ　−ＮｅｕＡ　ｃ類似体の特性：新規蛍光または吸収性ＣＭＰ−グリコシドは、精製後、種々の方法で特性確認゛された（下記の表参照）。

１、　分析ＨＰＬＣ装置（２７５ｎｍ）における保持時間は、ＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡｃないしはＣＭＰ−５−アミノアセトアミド−Ｎｅｕとは異なり、２７５ｎｍにおけるＨＰＬＣ装置中での新規ＣＭＰ−グリコシドの吸収係数（ε ）は１．０以上（ＣＭＰのεｔ７ｓｓａに対して）であった。

２、　緩和な酸性加水分解（ＩＮ　ＨＣＬ、室温で４５分）により、新規ＣＭＰ −グリコシドは完全にＣＭＰに分解し、次いで分析ＨＰＬＣ（２７５ｎｍ）ｌ、 −よって確認した。分析ＨＰＬＣ装置中で、酸性加水分解後、遊離した蛍光ないしは吸収性ＮｅｕＡ　ｃ類似体のピークは２００ｎｍに出現する。

３、　新規ＣＭＰ−グリコシドの吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した；蛍光ないしは吸収性置換基の吸収最大または蛍光最大は実際に新規ＣＭＰ− グリコシドにおいては同じ波長に見出すことができた（下記表参照）。

４、　遊離ＣＭＰまたは遊離ＮｅｕＡ　ｃｐ導体による汚染は、新規ＣＭＰ−グリコシドでは６％以下であり、ＣＴＰは０．１％より小さくかつ無機リン酸塩は５０％以下であつた。

本発明による新規基質は次の分析に使用できる：１、　シアリルトランスフェラーゼの活性測定２、　シアリルトランスフェラーゼの受容体特異性測定および受容体の反応速度データの測定３、　細胞表面の蛍光標識化 ■、シアリルトランスフェラーゼ活性の測定試験は、相応するＣＭＰ−グリコシドからの蛍光性ノイラミン酸誘導体の、シアリルトランスフェラーゼによる受容体、たとえば糖タンパク質またはガングリオシド中、の取込み、置換および非置換の受容体分子の、ゲル濾過または沈殿による過剰の試剤からの分離および相応する分光法による受容体に結合した蛍光の測定に基づく。この方法は、異なる結合特異性（α２．３−：β２．６−）および受容体特異性（Ｇａｌβ１、ＧｌｃＮ　Ａ　ｃ　−；　Ｇａｌβ１．４　（３）　Ｇｌｃ−ＮＡｃ　−；Ｇａｌβ１．３ＧａｌＮＡ　ｃ　−；　Ｇａ１ＮＡ　ｃ−）にも拘らず、従来公知のすべてのシアリルトランスフェラーゼの測定に適当である。それというのもＣＭＰ−活性化ノイラミン酸のＣ−９またはＣ−５位置に関する基質特異性はあまり顕著でないからである。上述したように、Ｃ−５置換ノイラミン酸および疎水性置換基によって置換されたノイラミン酸はとくに高い親和力を有する基質であることが判明する。

合により１０μｌまでの反応溶液が必要である。この酵素反応は、たとえばｐＨ６または６．５を有する緩衝液中で実施され（シアリルトランスフェラーゼの最適ｐＨによる）、その際受容体［（Ａｓ１ａｌｏ）糖タンノくり質またはガングリオシド］０．１〜１０，０す／１１１、（ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトースアミン受容体６９０〜１８７５μＭおよびそれぞれのＣＭＰ−活性化蛍光Ｎ−アセチルノイラミン酸試剤１０〜１００μＭに相当）が添加される。反応溶液は通常の場合１０分ないしは４５分３７℃に保たれ、引き続きセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ　５０−カラム（０，４〜１２Ｃ露）で０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８，６）を用いて分離する［ガングリオシド受容体の場合緩衝液は付加的にＮａＣｊｌｏｏｇＭおよび洗剤（たとえばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）］の０．３％を含有する。反応の程度は、高分子結合した蛍光ノイラミン酸の蛍光測定により定量され、また場合によっては未反応の蛍光ＣＭＰ−グリコシドの測定によっても確認される。シアリルトランスフェラーゼ活性の放射分析試験とは真なり、酵素をＣＭＰ−グリコシドで飽和するために、蛍光ＣＭＰ−グリコシドの著しく低い濃度（５〜１５倍小さい）で足り、蛍光測定のために必要な僅かな体積が少ない反応溶液（少な（とも１０μＩまで）を可能にし、これが方法を全体で非常に経済的にする。それにも拘らず、蛍光分析試験の測定感度は放射分析試験においては達成するのが極めて困難である（非常に高い特殊放射能標識化が必要）。

この試験は、この形で殊に培養細胞系統、手術または生検材料中および体液中、殊に血漿または血清中の僅かなシアリルトランスフェラーゼ活性の測定のために適当である。

ゲル濾過の代替として、糖タンパク質受容体の場合、供与体を分離するための沈殿も可能であり：このために上記のような効力検定を０．５Ｎ　ＨＣｌ中の１％ＰＷ８１ｍｊを用い４℃で２０分沈殿させる。沈降物をエタノール１０．１ＭトリスｐＨ７，５（９／１）で２回洗浄し、適量のｌＮ　ＮａＣＨに溶かす（ＰＷＳ−リンタングステン酸）。

■１種々の出所のシアリルトランスフェラーゼは、その受容体基質特異性に部分的に著しい相違を有する。

従って、本発明によるインジケータを使用して容易な識別反応を、標準化条件下で上記の試験をそれぞれ種々の受容体（つまりグリカン配列を有する糖タンパク質−１糖脂質−またはオリゴ糖受容体）を用いて実施し、そのっど見出された活性を比較することを基礎にすることができる。この試験は、それぞれの受容体に関する酵素反応速度のデータ（ミカエリス定数、■＃＃１）の作製も可能である。血゛漿ないしは血清中で、この試験は最初に２つのシアリルトランスフェラーゼ（一方はＮ結合末端グリカン配列Ｇａｌβ１．４　ＧｌｃＮ　Ａ　ｃに特異性を有し、他方はＯ結合Ｇａ１Ｎ　Ａ　ｃ基に特異性を有する）の鑑別を可能にする。

■、さらに、細胞膜上のシアル酸受容体は、本発明によるインジケータを用い、ＣＭＰ−活性化蛍光シアル酸の相応する反応溶液をシアリルトランスフェラーゼの存在で作用させ、過剰のインジケータを洗浄し、単離した細胞の蛍光の程度で検査すべき特定の細胞の表面性質を確かめることによって標識することが可能である。さらに、細胞をこのようにして、化学的熱処理なしに、選択的にグリカン部分に蛍光標識することもできる。表面に結合した蛍光の測定は細胞計算器中で非常に簡単に行なわれるが、蛍光顕微鏡下で観察することもできる。

■、さらに、本発明による化合物は、その立体構造がとくに敏感な特定のタンパク質を、生物系中で使用する場合蛍光により追跡することができるようにするため、蛍光標識すべき場合に有利であることが判明した。かかる標識化は、酵素的に比較的慎重にかつ完全に実施することができ、タンパク質固有のアミノ酸配列を変更せず、選択的に特定のグリカン配列で行ないかつ過剰のインジケータ物質は容易に再び分離することも可能である。方法は原則的には、■、に記述したと同じである。

望ましい蛍光ないしは吸収性ＣＭＰ−グリコシド（短縮命名は上述と同様）ＣＭＰ−９−ＴＲＩＴＣ−ＮｅｕＡｃ　：この物質は実際にＧａｌβ１．４ＧａｌＮＡｃａ２．６シアリルトランスフエラーゼによってのみ糖タンパク質に伝達され、従って識別化のために使用することができ；さらに他の励起および発光（赤色蛍光）。

ＣＭＰ−９−ＤＴＡＦ−ＮｅｕＡｃ　：強い疎水性、種々のシアリルトランスフェラーゼに対する良好な反応速度データ、殊にＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼに対する反応速度データＶ□ｘ／ＫｉｎはＣＭＰ−フルオレセイニルーＮＡｃに対するデータよりも０．５倍高いＣＭＰ−９ −ＲＥＳＯＳ−ＮｅｕＡｃ　：可視領域に非常に良好な吸収；蛍光においてＦＩＴＣと異なる発光、励起も；蛍光はＦＩＴＣと異なり酸性ｐＨ領域中でも。

ＣＭＰ−９−ＡＭＣＡ−ＮｅｕＡｃ　：ＵＶ領域中で励起、励起と発光の間の間隔１１００ｎによる“内部消光“　；蛍光は他の領域ではｐｌ（依存せず。

ＣＭＰ−９−ＤＡＢ−ＮｅｕＡｃ　：ＵＶ領域中で励起：ＵＶ領域中で高い吸収、従ってＵＶ流動、分光光度計用゛吸収定量に好適ＣＭＰ−５−Ｆ　ＩＴＣ−Ｎｅｕ：高い蛍光収率において有利な発光および励起周波数。極めて種々の受容体特異性のシアリルトランスフェラーゼの場合の反応速度データは、常にＣＭＰ−９−フルオレセイニルーＮｅｕ　Ａ　ｃのものにまさる（Ｖ　ｍ＊、／　Ｋｉｎ　：　２　、８〜２０倍高い）。

群から選択したＣＭＰ−シアル酸誘導体それぞれ：慣用名正確な化学名短縮慣用名ＣＭＰ−９−テトラメチルローダミニルアミ／−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−［５−アセトアミド−９−（３−テトラメチルローダミニルチオウレイド）−３，５，９−トリデオキシ］−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトーノーヌロソン酸（ＣＭＰ−９−ＴＲＩ　ＴＣ−ＮｅｕＡｃ）ＣＭＰ−９−ｏ−ダミニルアミノ− ＮｅｕＡ　ｃＣＭ、Ｐ−［５−アセトアミド−９−（３−ローダミニルチオウレイド）−３，５，９−トリデオキシ］−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトーノヌロソン酸（−・−）ＣＭＰ−９−エオシニルアミノーＮｅｕＡ　ｃＣＭＰ−Ｃ５−アセトアミド−９ −（３−エオシニルチオウレイド）−３，５，９−トリデオキシ］−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトーノヌロソン酸（−・−）ＣＭＰ−９−（４−Ｎ、Ｎ’　−ジメチルアミノアゾベンゾ−４）アミノ−ＮｅｕＡ　ｃＣＭＰ−［５−アセトアミド−９−（４−Ｎ、Ｎ’　−ジメチルアミノアゾベンゾ−４′−チオウレイド）−３，５，９−トリデオキシ］−β−Ｄ−グリセロ− Ｄ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−９−ＤＡＢ−ＮｅｕＡｃ）Ｏｆ（ＯＨＣＭＰ−９−フルオレセイニル−（５，６）カルボキサミド−ＮｅｕＡ　ｃＣＭＰ−５−アセトアミド−［９−フルオレセイニル−（５，６）カルボキサミド］−３，５，９−トリデオキシ−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−９−ＦｊＵＯ８−ＮｅｕＡｃ）ＣＭＰ−９−ローダミニルー（５，６）カルボキサミド−ＮｅｕＡ　ｃＣＭＰ−５−アセトアミド−［９−ローダミニルー（５，６）カルボキサミド］ −３，５，９−トリデオキシ］−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−９−ＲＨＯＤＯ３−ＮｅｕＡｃ）ＣＭＰ−９−レゾルフィニル−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃＣＭＰ−５−アセトアミド−９−［（Ｎ−レゾルフィン−４− カルボニル）−ピペリジン−４−カルボキサミド）］−３，５，９−）リゾオキシ−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−９−ＲＥＳＯ８ −ＮｅｕＡｃ）ＣＭＰ−９−（７−アミノ−４−メチルーフマリニルアセトアミド）　−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−５−アセトアミド−９−（７−アミノ−４−メチルーフマリニルアセトアミド）−３，５，９−トリデオキシ−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−９−ＡＭＣＡ−ＮｅｕＡｃ）ＣＭＰ−９−Ｎ−（フルオレセイニルアミノークロロトリアジニル）−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃＣＭＰ−５−アセトアミド −９−フルオレセイニルアミノークロロトリアジニルアミノ−３，５，９−トリデオキシ−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−９−ＤＴＡＦ−ＮｅｕＡ、ｃ）ＯＢ　ＯＦＩＣＭＰ−９−ダンシルアミノ−ＮｅｕＡ　ｃＣＭＰ−５−アセトアミド−９−（ダンシルアミド）−３，５，９−）リゾオキシ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトーノヌロソン酸ＣＭＰ−９−（テキサス−レッド）アミノ−ＮｅｕＡ　ｃＣＭＰ−５−アセトアミド−９−Ｎ−（テキサス−レッド）アミノ−３，５，９−１リゾオキシ−β− Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸ＣＭＰ−５−フルオレセイニルアミノアセチルーＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−（フルオレセイニルチオウレイド）−アセトアミド−β−Ｄ−グリセロー〇−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−５−Ｆ　Ｉ　ＴＣ−ＮｅｕＡｃ）ＣＭＰ−５−テトラメチルローダミニルアミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−（テトラメチルローダミニルチオウレイド） −アセトアミド〜β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−５ −ＴＲＩ　ＴＣ−Ｎｅｕ）ＣＭＰ−５−〇−ダミニルアミノアセチルーＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−（ローダミニルチオウレイド）−アセトアミド −β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（−・−）ＣＭＰ−５−エオシニルアミノアセチルーＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ− ５−（エオシニルチオウレイド）−アセトアミド−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸ＣＭＰ−５−キサンチンローダミニルアミノアセチル　ＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−（キサンチンローダミニルチオウレイド）− アセトアミド−β−Ｄ−グリセロー〇−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−５− ＸＲＩＴＣ−Ｎｅｕ）ＣＭＰ−５−（４−Ｎ、Ｎ’−ジメチルアミノアゾベンゾ−４′−）アミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−（４−Ｎ、Ｎ’−ジメチルアミノアゾベンゾ −４′−チオウレイド）−アセトアミド−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−５−ＤＡＢ　−Ｎｅｕ）ＣＭＰ＝５−フルオレセイニル−（５，６）カルボキサミド−アセチル−ＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−フルオレセイニル−（５，６）−カルボキサミド−アセトアミド−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ −５ＦＬＵＯ８−Ｎｅｕ）ＣＭＰ−５−ローダミニルー（５，６）カルボキサミド−アセチル−ＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−ローダミニルー（５，６）カルボキサミド− アセトアミド−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−５− ＲＨＯＤＯ３−Ｎｅｕ）ＣＭＰ−５−レゾルフィニルアセチル−ＮｅｕＣＭＰ− ３，５−ジデオキシ−５−Ｎ−（レゾルフィン−４−カルボニル）−ピペリジン −４−カルボキサミド）−アセトアミド−β−Ｄ−グリセロー〇−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−５−ＲＥＳＯＳ−Ｎｅｕ）ＣＭＰ−５−（７−アミノ−４−メチルーフマリニルアセトアミド）−アセチル −ＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−Ｎ−（７−アミノ７ミＦ−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−５−ＡＭＣＡ−Ｎｅｕ）ＣＭＰ−５−フルオレセイニルアミノークロロトリアジニルーアミノアセチルーＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−Ｎ−（フルオレセイニルアミノークロロトリアジニル）−アミノアセトアミド−β−Ｄ−グリセロー〇−ガラクトーノヌロソン酸（ＣＭＰ−５−ＤＴＡＦ−Ｎｅｕ）ＣＭＰ−５−ダンシル−アミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−ダンシルアミノ− アセトアミド−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸ＣＭＰ−５−（テキサス−レッド）−アミノアセチルＮｅｕＣＭＰ−３，５−ジデオキシ−５−Ｎ−（テキサス−レッド）アミノ−アセトアミド−β−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトーノヌロソン酸蛍光助剤ＣＭＰ−グリコシドの詳細な”製造ａ）合成ＣＭＰ−９−フルオレセイニルアミ／　−ＮｅｕＡｃ（命名上記と同様）フルオレセイニルイソチオシアネート（異性体重または■）をメタノールまた′ はＤＭＦに溶かしく１〜４ｇｇ乙約２．５〜１０μモル：２００μｌ中）、次いでＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃ　１．２５１１モル（水２００μ！中に溶解）を添加しくＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡｃ１モルあたりフルオレセイニルインチオシアネート２モルで十分）：次に緩衝液ｐＨ９〜９．５　２０μ！（たとえばＮａＨＣＯａｏ、５モル／Ｎａ２Ｃ０３）を加えて、ｐＨ５，８〜９を達成する。ＣＭＰ−グリコシドのＮｅｕＡｃ部分のＣ−９位にあるアミノ基とフルオレセイニルインチオシアネートとの反応は、遅くとも１５分で完結した（９０％以上）。反応は、分析ＨＰＬＣで観察し、ＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃ　（Ｆ）反応時間は生成した蛍光ＣＭＰ−グリコシドよりも短かい。得られたＣＭＰ−９−フルオレセイニルーＮｅｕＡ　ｃ（１）　精ＩＩは、分取ＨＰＬＣおよびエタノール沈殿により記載したように行なう（ＧｒｏｓｓおよびＢｒｏｓｓｎｅｒ　（１９８ｇ　）、’Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ’　、第１７７巻、５８３頁〜第５８９頁）。

ｂ）　ＣＭＰ−９−レゾルフィニル−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃの合成Ｎ−（レゾルフィン−４−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＲＥＳＯ３０，５露ｇム約１，１μモル）をＤＭＦ１００μ／に溶かし；次にＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡＣ（０，５ｕモル）の水溶液２０〜８０ｔｔｌを加え、緩衝液ｐＨ９〜９．５　２０μｊを加える（ＣＭＰ−９−フルオレセイニルーＮｅｕＡ　ｃの合成参照）。反応溶液はＲ８，５〜９を有すべきであり、ＣＭＰ−９−レゾルフィニル−ＮｅｕＡ　ｃの生成（収率９０％以上）は、２０分後に完結した（分析ＨＰＬＣは上記と同様）。精製はＣＭＰ−９−フルオレセイニルーＮｅｕＡｃの場合と同様に行なう。

ｃ　）　ＣＭ　Ｐ　−５−フルオレセイニルアミノアセチル−Ｎｅｕの合成合成は、正確にＣＭＰ−９−フルオレセイニルＮｅｕＡＣにつき上述したと同様であるが、出発物質としてＣＭＰ−５−アミノアセトアミドＮｅｕを用いて行なう（ＣＭＰ−５−アミノアセトアミド−Ｎｅｕ１モルあたりフルオレ上イニルイソチオシアネート２モル）。結合は、９０％以上の収率で１５分で達成される（分析ＨＰＬＣは上記と同様）。精製は、ＣＭＰ−９−フルオレセイニルＮｅｕＡ　ｃの場合と同様に実施する。

ｄ）　ＣＭＰ−９−Ｎ−（フルオレセイニルアミノークロロトリアジニル）−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃの合成ジクロロトリアジニルアミノフルオレセ、イン（ＤＴＡＦ）２．０す（＝３．７５μモル）をＤＭＦ　Ｉ　Ｑ　Ｑμ！に溶かし：次いでＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡｃ（最大０．５μモル）を水溶液２０〜５０μ ！および緩衝液ｐＨ９〜９．５　（ＣＭＰ−９−フルオレセイニルーＮｅｕＡｃの合成と同様）を加えた（ＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃ　１モルあたりＤＴＡＦ　７．５〜ｉ　９モル）。３時間後にＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃの約７５％、１５時間後に９０％以上が変換した（分析ＨＰＬＣは上記と同様）。精製は、ＣＭＰ−９−フルオレセイニル−ＮｅｕＡ　ｃの場合に記載したように行なう。

ｅ）　ＣＭＰ−９−（７−アミノ−４−メチルーフマリニル−アセトアミド）　 −ＮｅｕＡｃの合成ＡＭＣＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３０藁ｇ（約１μモル）をＤＭＦ　１３０μ！に溶かし；次１：　ＣＭ　Ｐ　−９−アミノ−ＮｅｕＡｃ（約０．５μモル）の水溶液７０μ！および緩衝液ｐＨ９〜９．５　（ＣＭＰ−９−フルオレセイニルーＮｅｕＡ　ｃの合成と同様）３０μｌを加えた（ＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃ　１　モルあたりＡＭＡｃ／ＣＭＰ −９−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃ　ｌ　モルあたりＡＭＡｃ　２モル）。２０分後に、ＣＭＰ−９−アミノ−ＮｅｕＡ　ｃ約９０〜９５％が変換した（分析ＨＰＬＣは上記と同様）。

精製は、ＣＭＰ−９−フルオレセイニルーＮｅｕＡ　ｃの場合に記載したように行なう。

要　約　書本発明は、弐■ ［式中Ｒ８は基Ｆｌ−ｓｐ−ｘ’−ＮＨ−１Ｒ４はアシル基を表わすか、またはＲ８はヒドロキシルまたはアシルアミノ基、Ｒ４１を基Ｆｊ−８ｐ−Ｘ’−ＮＨ −７シルであり、Ｆｌは蛍光性基を表わし、Ｓｐは原子価または結合スペーサ基であり　Ｘ　Ｉは−ＣＯ−１−ＣＳ−１−ＳＯ，−またはトリアジニル基である］で示されるＣＭＰ−活性化蛍光インジケータ標識したシアル酸Ｃ製造方法、ならびに新規ＣＭＰ−活性化蛍光インジケータ標識したシアル酸、およびそれのａ）シアリルトランスフェラーゼの活性測定のため、ｂ）受容体特異性測定および受容体の反応速度データの測定のため、Ｃ）細胞表面の蛍光標識化のため、ｄ）糖タンパク質およびガングリオシドの標識化のための使用に関する。

国際調査報告１１ＩＩＩｍｍ〜−−−ｍ　Ｋコ／ＥＰ９１１００５３０

Claims

【特許請求の範囲】

１．式ＩＶ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）〔式中Ｒ３は基Ｆｌ−Ｓｐ−Ｘ′− ＮＨ−を表わし、Ｒ４はアシル基を表わすか、またはＲ３はヒドロキシル基またはアシルアミノ基を表わし、Ｒ４は基Ｆｌ−Ｓｐ−Ｘ′−ＮＨ−アシルを表わし、Ｆｌは蛍光性基を表わし、Ｓｐは原子価または結合スペーサ基を表わし、Ｘ′ は−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＳＯ２−またはトリアジニル基を表わす］で示されるＣＭＰ−活性化蛍光インジケータ標識したシアル酸の製造方法において、式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中Ｒ１はアミノ基を表わし、Ｒ２はアシル基を表わすか、またはＲ１はヒドロキシル基ないしはアシルアミノ基を表わし、Ｒ２はアミノアシル基を表わす〕で示される９−アミノ−５−Ｎ−アシル−または５−アミノアシル−ノイラミン酸を、酵素ＣＭＰ−シアル酸シンターゼの存在でシチジン三リン酸（ＣＴＰ）と反応させて式ＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）［式中Ｒ１およびＲ２は上記のものを表わす］で示されるＣＭＰ−活性化シアル酸を得、これを式ＩＩＩＦｌ−Ｓｐ −Ｘ（ＩＩＩ）［式中Ｆｌは蛍光性基を表わし、Ｓｐは原子価または結合スペーサ基を表わし、Ｘは活性化カルボキシル基、チオカルボニル基、トリアジニル基またはスルホン酸基を表わす］で示される蛍光性化合物と反応させて式ＩＶで示されるＣＭＰ− 活性化蛍光性シアル酸を得ることを特徴とするＣＭＰ活性化蛍光インジケータ標識したシアル酸の製造方法。
２．式ＶＦ１−Ｒ５（Ｖ）［式中Ｒ５はアミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、トリアジニル基またはスルホニル基を表わし、Ｆｌは蛍光性基を表わす］で示される蛍光インジケータを、差当り活性ないしは結合作用化合物と反応させて式ＩＩＩＦｌ−Ｓｐ−Ｘ（ＩＩＩ）［式中Ｆｌ、ＳｐおよびＸは請求項１におけると同じものを表わす〕で示される活性化化合物を得、その後該化合物を式ＩＩで示されるシアル酸の９−ないしは５−アミノ基と反応させることを特徴とする請求項１記載の方法。
３．式ＩＶ′ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ′）〔式中Ｒ３は基Ｆｌ−Ｓｐ−Ｘ′− ＮＨ−を表わし、Ｒ４はアシル基を表わすか、またはＲ８はヒドロキシル基またはアシルアミノ基を表わし、Ｒ４は基Ｆｌ−Ｓｐ−Ｘ′−ＮＨ−アシルを表わし、ＦｌおよびＳｐはそれぞれ請求項１に記載したものを表わし、Ｘ′は−ＣＯ− 、−ＣＳ−または−ＳＯ２−またはトリアジニル基を表わし、この場合Ｒ３はフルオレセイニル基ではない］で示されるＣＭＰ−活性化蛍光インジケータ標識したシアル酸。
４．基−Ｓｐ−が１〜１０、殊に２〜６のＣ原子を有するアルキル基であることを特徴とする請求項３記載のＣＭＰ−シアル酸。
５．蛍光性基Ｆｌ−Ｓｐ−Ｘ′がノイラミン酸の５位に結合していて、殊にフルオレセイニル−チオウレイド−アセチル基であることを特徴とする請求項３または４記載のＣＭＰ−シアル酸。
６．ＣＭＰ−９−テトラメチルローダミニルアミノ−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−ローダミニルアミノ−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−エオシニルアミノ− ＮｅｕＡｃＣＭＰ−キサンテノローダミニル−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−（４−Ｎ，Ｎ′−ジメチルアミノアゾベンゾ−４）アミノ−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−フルオレセイニル−（５，６）−カルボキサミド−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−ローダミニル−（５，６）カルボキサミド−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−レゾルフィニル−アミノ−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−（７−アミノ− ４−メチル−クマリニルアセトアミド）−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−Ｎ−（フルオレセイニルアミノ−クロロトリアジニル）−アミノ− ＮｅｕＡｃＣＭＰ−９−ダンシルアミノ−ＨｅｕＡｃＣＭＰ−９−（テキサスーレッド）アミノ−ＮｅｕＡｃＣＭＰ−５−フルオレセイニルアミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−テトラメチルローダミニルアミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−ローダミニルアミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−エオシニルアミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−キサンテノローダミニルアミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−（４−Ｎ，Ｎ′−ジメチルアミノアゾベンゾ−４′）アミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−フルオレセイニル−（５，６）−カルボキサミド−アセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−ローダミニル−（５，６）−カルボキサミド−アセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−レゾルフィニルアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−（７−アミノ−４− メチル−クマリニルアセトアミド）−アセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−フルオレセイユルアミノ−クロロトリアジニル−アミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−ダンシル−アミノアセチル−ＮｅｕＣＭＰ−５−（テキサスーレッド）アミノアセチル−Ｎｅｕの群から選択したＣＭＰ−シアル酸誘導体。
７．基Ｘ′がウレイド基またはチオウレイド基であることを特徴とする請求項３から６までのいずれか１項記載のＣＭＰ−シアル酸。
８．基Ｘ′がＮ−ヒドロキシスクシンアミド基であることを特徴とする請求項３から６までのいずれか１項記載のＣＭＰ−シアル酸。
９．ａ）シアリルトランスフェラーゼの活性測定のため、ｂ）受容体特異性測定および受容体反応速度データの測定のため、ｃ）細胞表面の蛍光標識化のため、またはｄ）糖タンパク質およびガンダリオシドの標識化のための式ＩＶで示されるＣＭＰ−活性化蛍光インジケータ標識したシアル酸の使用。