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ES2593318T3 - Derivados de ácido siálico - Google Patents

Derivados de ácido siálico Download PDF

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ES2593318T3
ES2593318T3 ES05794259.1T ES05794259T ES2593318T3 ES 2593318 T3 ES2593318 T3 ES 2593318T3 ES 05794259 T ES05794259 T ES 05794259T ES 2593318 T3 ES2593318 T3 ES 2593318T3
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ES
Spain
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reagent
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ES05794259.1T
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Sanjay Jain
Ioannis Papaioannou
Smita Thobhani
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Lipoxen Technologies Ltd
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Lipoxen Technologies Ltd
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Abstract

Un proceso para formar un derivado de un compuesto de ácido siálico en el que un compuesto de partida que comprende una unidad de ácido siálico terminal se somete a un intermedio preliminar -etapa de formación que comprende las etapas secuenciales de oxidación y reducción o viceversa en las que un grupo seleccionado a partir de un grupo amina primaria, un grupo amina secundaria y una hidrazina se forma en la unidad de ácido siálico terminal, seguido por una etapa de reacción en la que se hace reaccionar el intermedio con un reactivo bifuncional, de fórmula I**Fórmula** en la que R es H o sulfonilo; R1 es un grupo enlazante; y X es un grupo funcional, por el cual el grupo éster se escinde y el grupo amina o hidrazina del intermedio se acila por -CO-R1-X para formar el derivado.

Description

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DESCRIPCIÓN
Derivados de ácido siálico
La presente invención se refiere a derivados de compuestos de ácido siálico, preferiblemente los polisacáridos que tienen unidades de ácido siálico terminales o intracatenarias. Preferiblemente, el polisacárido se compone sólo de unidades de ácido siálico, por ejemplo, alfa-2,8, 2,9 unidas entre sí. Los productos son útiles para la conjugación a sustratos tales como péptidos, proteínas, fármacos, sistemas de administración de fármacos, virus, células, microbios, polímeros sintéticos, etc. La reacción implica la conjugación de un reactivo que contiene un grupo N- hidroxi succinimida (NHS), ya sea con un derivado de ácido siálico funcional amino o hidrazida.
Los ácidos polisiálico (PSA) son polímeros de origen natural no ramificados de ácido siálico producidos en ciertas cepas bacterianas y en mamíferos en ciertas células [Roth et. al., 1993]. Ellos pueden ser producidos en diversos grados de polimerización: desde n=aproximadamente 80 o más residuos de ácido siálico hacia abajo para n=2, ya sea por hidrólisis ácida limitada, digestión con neuraminidasas o por fraccionamiento de las formas derivadas de células o bacterianas, naturales del polímero. La composición de los diferentes PSA también varía de tal manera que hay formas homopoliméricas, esto es, el PSA unido a alfa-2,8 que comprende el polisacárido capsular de la cepa de E. coli K1 y de meningococci del grupo B, que también se encuentra en la forma embrionaria de la molécula de adhesión celular neuronal (N-CAM). También existen formas heteropoliméricas, tales como el alfa-2,8 alfa-2,9 PSA alternante de cepa de E. coli K92 y los polisacáridos del grupo C de N. meningitidis. Además, el ácido siálico también se puede encontrar en los copolímeros alternantes con monómeros distintos del ácido siálico tales como grupo W135 o grupo Y de N. meningitidis. Los PSA tienen importantes funciones biológicas, incluyendo la evasión de los sistemas inmune y complemento por bacterias patógenas y la regulación de la adhesividad de la glía de las neuronas inmaduras durante el desarrollo fetal (en donde el polímero tiene una función antiadherente) [Muhlenhoff et. al., 1998; Rutishauser, 1989; Troy, 1990, 1992; Cho and Troy, 1994], aunque no existen receptores conocidos para PSA en los mamíferos. El PSA unido a alfa-2,8 de la cepa de E. coli K1 también se conoce como "ácido colomínico” y se utiliza (en diversas longitudes) para ejemplificar la presente invención.
La forma unida alfa-2,8 de PSA, entre los polisacáridos bacterianos, es singularmente no inmunogénica (no provoca las respuestas de anticuerpos o células T en sujetos mamíferos), incluso cuando se conjuga a la proteína portadora inmunogénica, lo que puede reflejar su existencia como un polímero de mamífero (así como bacteriana). Las formas más cortas del polímero (hasta n=4) se encuentran en los gangliósidos de la superficie celular, que están ampliamente distribuidos en el cuerpo, y se cree que imponen y mantienen eficazmente la tolerancia inmunológica a PSA. En los últimos años, las propiedades biológicas de PSA, en particular los del PSA homopolimérico unido a alfa- 2,8, han sido explotados para modificar las propiedades farmacocinéticas de las proteínas y moléculas de fármacos de bajo peso molecular [Gregoriadis, 2001; Jain et. al., 2003; US-A-5,846,951; WO-A-0187922]. Derivación de PSA de un número de proteínas terapéuticas, incluyendo catalasa y asparaginasa [Fernandes y Gregoriadis, 1996 y 1997] da lugar a mejoras sorprendentes en la vida media de circulación, su estabilidad y también permite que tales proteínas sean utilizadas en la cara de anticuerpos preexistentes construidos como una consecuencia indeseable (y a veces inevitable) de la exposición previa a la proteína terapéutica Fernandes y Gregoriadis, 2001], En muchos aspectos, las propiedades modificadas de proteínas polisialiladas son comparables a las proteínas derivadas con polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, en cada caso, la vida media se incrementa, y las proteínas y péptidos son más estables a la digestión proteolítica, pero la retención de la actividad biológica parece ser mayor con PSA que con PEG [Hreczuk-Hirst et. al., 2002], También, hay preguntas sobre el uso de PEG con agentes terapéuticos que tienen que administrarse crónicamente, como PEG es sólo muy lentamente biodegradable [Beranova et al, 2000] y las formas de peso molecular tanto alto como bajo tienden a acumularse en los tejidos [Bendele, et. al., 1998; Convers, et. al., 1997], Proteínas PEGiladas se han encontrado para generar anticuerpos anti PEG, que también podría influir en el tiempo de permanencia del conjugado en la circulación de la sangre [Cheng et. al., 1990], A pesar de la historia establecida de PEG como un polímero administrado parenteralmente conjugado con agentes terapéuticos, se requerirá una mejor comprensión de su inmunotoxicología, farmacología y metabolismo [Hunter and Moghimi, 2002; Brocchini, 2003], Del mismo modo existen dudas acerca de la utilidad de PEG en agentes terapéuticos que requieren dosis elevadas, (y, por tanto, en última instancia, las altas dosis de PEG), ya que la acumulación de PEG puede conducir a la toxicidad. Por consiguiente, el PSA unido a alfa 2,8 ofrece una alternativa atractiva a PEG, siendo un polímero biodegradable inmunológicamente "invisible" que es naturalmente parte del cuerpo humano, y que puede degradar, a través de neuraminidasas de tejido, al ácido siálico, un sacárido no tóxico.
Se ha descrito, en trabajos científicos anteriores y en las patentes concedidas, la utilidad de los PSA naturales en la mejora de las propiedades farmacocinéticas de la proteína terapéutica [Gregoriadis, 2001; Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997, 2001; Gregoriadis et. al., 1993, 1998, 2000; Hreczuk-Hirst et. al., 2002; Mital, 2004; Jain et al., 2003, 2004; USA- 05846,951; WO-A-0187922], Ahora, se describen nuevos derivados de PSA, que permiten nuevas composiciones y métodos de producción de proteínas derivadas de PSA (y otras formas de agentes terapéuticos). Estos nuevos materiales y métodos son particularmente apropiados para la producción de agentes terapéuticos derivados de PSA pretendidos para uso en seres humanos y animales, donde la sustancia química y definición molecular de las entidades de la droga es de gran importancia debido a los requisitos de seguridad de la ética médica y de las autoridades reguladoras (por ejemplo, FDA, EMEA).
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Los métodos se han descrito anteriormente para la unión de polisacáridos con los agentes terapéuticos, tales como proteínas [Jennings and Lugowski, 1981; US-A-5,846,951; WO-A-0187922], Algunos de estos métodos dependen de la derivación química del extremo “no reductor” del polímero para crear una unidad estructural de aldehido de reactivo con la proteína (Fig. 1). El extremo reductor de PSA (y otros polisacáridos) es sólo débilmente reactivo con las proteínas en las condiciones leves necesarias para preservar la conformación de proteínas y la integridad química de PSA durante la conjugación. La unidad de ácido siálico, en el terminal no reductor de PSA que contiene un diol vecinal, puede ser fácilmente (y selectivamente) oxidada con peryodato para dar un derivado de mono- aldehido. Este derivado es mucho más reactivo hacia las proteínas y se compone de un elemento adecuadamente reactivo para la unión de proteínas a través de aminación reductora y otras químicas. Se describe previamente en US-A-5,846,951 y WO-A-0187922. La reacción se ilustra en la Fig. 1 en la que:
a) muestra la oxidación del ácido colomínico (CA) (unido a alfa-2,8 a partir de E. coli) con peryodato de sodio para formar un aldehido reactivo con la proteína en el extremo no reductor del ácido siálico terminal y
b) muestra la reacción del aldehido con un grupo amina primaria de una proteína, seguido de la reducción selectiva de la base de Schiff con cianoborohidruro sódico (NaCNBHs) para formar un enlace covalente irreversible estable con el grupo amino de la proteína.
WO-A-9114697 revela un proceso para formar un derivado de un compuesto de ácido siálico.
En PCT/GB04/03488 se describen derivados de polisacáridos que tienen un grupo sulfhidrilo reactivo introducido a través de una unidad de ácido siálico terminal. Esta unidad por lo general está introducida por derivación de una unidad de ácido siálico en el extremo no reductor del polisacárido. El grupo reactivo de sulfhidrilo es preferiblemente un grupo maleimido. La reacción para introducir este grupo puede implicar la reacción de un reactivo heterobifuncional que tiene un grupo sulfhidrilo reactivo en un extremo y un grupo tal como una hidrazida o un éster en el otro extremo, con un grupo aldehido o amina en la unidad terminal derivada del ácido siálico del polisacárido. El producto es útil para la derivación específica del sitio de proteínas, por ejemplo, en las unidades de Cys o grupos sulfhidrilo introducida.
A pesar de los diversos métodos que se han descrito para unir PSA a agentes terapéuticos [US-A-5,846,961; WO-A- 0187922], son teóricamente útiles, la consecución de rendimientos aceptables de conjugado a través de la reacción de las proteínas con el extremo (forma de aldehido) no reductor del PSA requiere tiempos de reacción que no son propicias para la estabilidad de la proteína a temperatura más alta (por ejemplo, interferón alfa-2b). En segundo lugar, se requieren las concentraciones de reactivos (esto es, exceso de polímero) que pueden ser inalcanzables o poco rentables.
En la invención, se proporciona un nuevo proceso para la formación de derivados de un compuesto de ácido siálico en el que un compuesto de partida que comprende una unidad de ácido siálico terminal se somete a un intermedio preliminar -etapa de formación que comprende la etapa secuencial de oxidación y reducción o vice versa en la que se forma un grupo seleccionado de un grupo amina primaria, un grupo amina secundaria y una hidrazina en la unidad de ácido siálico terminal, seguido por una etapa de reacción en la que se hace reaccionar el intermedio con un reactivo bifuncional
imagen1
en la que R es H o sulfonilo:
R1 es un grupo enlazante; y X es un grupo funcional,
por el cual el grupo éster se escinde y el grupo amina o hidrazina del intermedio se acila por -CO-R1-X para formar el derivado.
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En una primera realización, el compuesto de partida tiene una unidad de ácido siálico terminal unida a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 2 esto es, como una unidad terminal no reductora, y en el que la etapa preliminar implica la oxidación del grupo diol C-7, C-8 del ácido siálico para formar un grupo aldehido seguido de aminación reductora con H2NR4, en el que R4 es H o alquilo inferior, o sal de adición de ácido del mismo para formar el intermedio. Esta etapa preliminar se muestra en la figura 3.
En esta primera realización el compuesto de partida tiene la siguiente fórmula:
imagen2
J!
en la que R2 es la dicha otra unidad estructural y se selecciona de un grupo mono-, di-, oligo- o poli-sacárido, una proteína o péptido, un lípido, un fármaco y un sistema de administración de fármacos (tal como un liposoma) y en el que el producto derivado de amida tiene la siguiente fórmula:
imagen3
en la que X, R1 y R4 son los mismos grupos que en los compuestos de partida, respectivos y R3 es el mismo que R2 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de oxidación, aminación reductora y la reacción con el reactivo I. La formación de un compuesto de acuerdo con esta realización se muestra en la figura 6, en donde el reactivo I es un reticulante bis-NHS.
En una segunda realización, el compuesto de partida tiene un ácido siálico terminal reductor, unido a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 8, y en el que la etapa preliminar implica una etapa de reducción de apertura de anillo cetal por el cual, se forma un grupo que tiene dioles vecinales seguido de una etapa de oxidación selectiva en la que el grupo diol vecinal se oxida a un grupo aldehido, seguido por aminación reductora con H2NR4 o sal de adición de ácido para formar el intermedio.
En esta realización, el compuesto de partida tiene la siguiente fórmula
imagen4
en la que R5 es la dicha otra unidad estructural y se selecciona de un grupo sacárido un grupo oligo- o poli-sacárido, un grupo alquilo, un grupo acilo, un lípido, un sistema de administración de fármacos, y en el que el producto de amida tiene la siguiente fórmula:
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HO
N
R4
T
en la que R1, Xy R4 son los mismos grupos que en los compuestos de partida respectivos y R6 es el mismo que R5 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de reducción, oxidación, amlnaclón y reacción con el reactivo I. La formación de un compuesto de fórmula V se muestra en la figura 2.
En una tercera realización, el compuesto de partida tiene una unidad de ácido siálico terminal unida a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 2 (esto es, como una unidad terminal no reductora), y en el que la etapa preliminar Implica la oxidación del grupo diol C-7, C-8 del ácido siálico para formar un grupo aldehido seguido de la reacción con hidrazina y la reducción para formar el intermedio.
En esta realización en la que el compuesto de partida tiene la siguiente fórmula:
imagen5
R2
II
en la que R2 es la dicha otra unidad estructural y se selecciona de un grupo mono-, di-, oligo- o poli-sacárido, una proteína o péptido, un lípido, un fármaco o un sistema de administración de fármacos y en el que el derivado de producto tiene la siguiente fórmula
imagen6
imagen7
vni
en la que Xy R1 son los mismos que en los respectivos materiales de partida y R3 es el mismo que R2 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de oxidación, reacción con hidrazida, reducción y reacción con el reactivo I.
En una cuarta realización el compuesto de partida tiene un ácido siálico terminal extremo reductor, unido a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 8, y en el que la etapa preliminar Implica una etapa de reducción de apertura de anillo cetal por el cual, se forma un grupo que tiene dioles vecinales seguido de una selectiva en la que X y R1 son los mismos que en los respectivos materiales de partida y R3 es el mismo que R2 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de oxidación, reacción con hidrazina, reducción y reacción con el reactivo I .
En una cuarta realización el compuesto de partida tiene un ácido siálico terminal extremo reductor, unido a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 8, y en el que la etapa preliminar implica una etapa de reducción de apertura de anillo cetal por el cual, se forma un grupo que tiene dioles vecinales seguido de una etapa de oxidación selectiva en la que el grupo diol vecinal se oxida a un grupo aldehido, seguido de la reacción con hidrazina y la reducción para formar el intermedio.
En esta realización en la que el compuesto de partida tiene la siguiente fórmula
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imagen8
en la que R5 es la dicha otra unidad estructural y se selecciona de un grupo mono-, di-, oligo- y poli-sacárido, un grupo alquilo, un grupo acilo, un lípido y un sistema de administración de fármacos, y en el que el derivado de producto tiene la siguiente fórmula
imagen9
en la que X, R1 son los mismos grupos que en los compuestos de partida respectivos y en el que R6 es el mismo que R5 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de reducción, oxidación, reacción con hidrazina, reducción y reducción de la reacción o viceversa de los agentes oxidantes o agentes reductores de la primera etapa deben ser inactivados antes de adicionar el reactivo para la etapa posterior.
En el proceso de la invención, es conveniente que la reacción entre el intermedio y el reactivo de fórmula I se realice en un solvente aprótico, preferiblemente que comprende una pequeña cantidad de un solvente prótico. Minimizando el nivel de solvente prótico presente en la reacción evita la desactivación prematura del grupo NHS del reactivo de fórmula I. En solventes apróticos generales se encuentran para dañar moléculas biológicas. Es sorprendente que el uso de dlmetllsulfóxido DMSO, específicamente para solubilizar PSA, resulta en buenos niveles de la conjugación con reactivos de NHS, sin niveles excesivos de desactivación de los grupos NHS antes de la reacción, y permite la recuperación del derivado de la mezcla del producto. Preferiblemente, por lo tanto, el solvente aprótico es DMSO.
El reactivo de la fórmula I se utiliza generalmente en una cantidad que está en exceso estequiométrico para la reacción con el intermedio, y está presente preferiblemente en una cantidad al menos dos veces, más preferiblemente al menos cinco veces la cantidad para la reacción estequiométrica con el intermedio.
En una realización del reactivo de fórmula I, X es un grupo
imagen10
en la que R tiene la misma definición que anteriormente.
En una realización alternativa X es un grupo seleccionado del grupo que consiste en vlnilsulfona, N-maleimido, N- yodoacetamido, disulfuro de ortopiridilo, hidroxilo protegido, amino protegido, y azido.
El reactivo de la fórmula I se selecciona preferiblemente de:
N-(a-male¡m¡doacetoxi)succ¡n¡m¡da éster, (AMAS),
N-(P-maleim¡doprop¡lox¡)succ¡n¡m¡da éster, (BMPS),
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N-(e-maleim¡docapr¡lox¡)succ¡n¡m¡da éster, (EMCS), o su análogo sulfo,
N-(y-maleim¡dobut¡r¡lox¡)succ¡n¡mida éster, (GMBS), o su análogo sulfo, succ¡n¡m¡d¡l-4-(N-male¡m¡dometil)-c¡clohexano-1-carbox¡-(6-am¡docaproato), (LC-SMCC), m-malelmldo benzoll-N-hldroxisuccinimida éster (MBS), o, su análogo sulfo, succ¡n¡m¡d¡l-4-(N-male¡m¡domet¡l)-ciclohexano-1-carbox¡lato) (SMCC) o su análogo sulfo, succ¡nlm¡d¡l-4-(p-male¡m¡do fenil) butirato (SMPB) o su análogo sulfo, succ¡n¡m¡d¡l-6-(P-male¡m¡do-propionam¡do) hexanoato (SMPH),
N-(k-malelm¡doundecano¡lox¡) sulfosuccin¡m¡da-éster(sulfo-KMUS),
succinimldll 6-[3-2(2-p¡r¡d¡ldit¡o)-prop¡onam¡do]hexanoato (LC-SPDP) o su análogo sulfo,
4-succin¡m¡diloxicarbonil-metil-cx.-(2-piridilditio) tolueno (SMPT) o su análogo sulfo-LC,
N-succin¡midil-3-(2-p¡ridilditio)propionato (SPDP),
N-succinimldll [4-vlnllsulfonil) benzoato (SVSB), succinimidil 3-(bromoacetamido)prop¡onato (SBAP), y N-succinimidilyodoacetato (SIA) y
N-succ¡n¡m¡dil(4-yodoacet¡l)am¡nobenzoato (SIAB) o su análogo sulfo.
Otra categoría de reactivos heterobifuncionales de fórmula I tienen grupos fotorreactivos como X, tales como grupos azida. Ejemplos de tales reactivos son:
N-5-Azldo-2-nltrobenzo¡loxisuccinimida insoluble en agua (ANB-NOS),
Ácido N-Hidroxisuccinimidil-4-azidosalicílico insoluble en agua, no escindible (NHS-ASA),
N-Succinimidil (4-azidofenil)-1 ,3’-ditiopropionato (SADP),
Sulfosuccinimidil 2-(7-az¡do-4-metil-coumarin-3-acetamido) etil-1,3’-ditiopropionato (SAED),
Sulfosuccinimidil 2-(m-azido-o-nitro-benzamido)etil-1,3’-ditiopropionato (SAND),
A/-Succin¡midil 6-(4’-azido-2’-nitro-fenilamino)hexanoato (SANPAH),
Sulfosuccinimidil 2-(p-azido-o-salicilamida)etil-1,3’-ditiopropionato (SASD), Sulfosuccinimidil-(perfluoroazidobenzamido) etil-1,3’-ditiopropionato (SFAD), y A/-Hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato (Sulfo-HSAB).
El reactivo de la fórmula I se pueden seleccionar de bis [2- (succinimidiloxicarbonil-oxi) etil] sulfona (BSOCOES) y su análogo sulfo,
bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3), disuccinimidil glutarato (DSG), ditiobis (succinimidil propionato) (DSP), disuccinimidil suberato (DSS), disuccinimidil tartrato (DST) o su análogo sulfo,
3,3’-dltlob¡s (sulfosuccinimidil propionato) (DTSSP), y
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etilenglicol bis(succinimidil succinato) (EGS) y su análogo sulfo.
El grupo R1 es un radical orgánico difunclonal. Preferiblemente, R1 se selecciona del grupo que consiste en alcanodiilo, arileno, alcarileno, heteroarileno y alqullheteroarlleno, cualquiera de los cuales se puede sustituir y/o interrumpir por enlaces carbonilo, áster, sulfuro, éter, amida y/o amina. Se prefiere particularmente el alcanodiilo C3- Ce. Más preferiblemente, R1 corresponde a la parte apropiada de uno de los reactivos preferidos 1 enumerados anteriormente. El grupo sustituyente puede ser elegido entre los enumerados para R1 anteriormente, o alternativamente puede ser una cadena lateral de aminoácido.
En el proceso preferiblemente el derivado del producto se aísla sustancialmente por completo de cualquier exceso de reactivo.
Las condiciones de reacción para las reacciones generalmente utilizadas también se pueden utilizar en este documento, por ejemplo, con referencia a Hermanson, (1995).
Más preferiblemente, el derivado de amida del producto se aísla de forma sustancialmente por completo de la mezcla del producto. Tal aislamiento y recuperación pueden implicar una etapa de secado llevada a cabo preferiblemente a presión reducida y más preferiblemente una etapa de liofilización.
Por lo tanto, los derivados de ácido siálico reactivos útiles para la posterior reacción con compuestos biológicamente útiles pueden estar disponibles en una forma estable.
La invención se ¡lustra adicionalmente en los ejemplos y las figuras adjuntas.
La siguiente es una breve descripción de los dibujos:
La figura 1a es un esquema de reacción que muestra la activación de la técnica anterior de la unidad terminal no reductora de ácido siálico;
La figura 1b es un esquema de reacción que muestra la aminación reductora de la técnica anterior de la unidad estructural de aldehido del esquema de reacción 1a utilizando una unidad estructural de proteína-amina;
La figura 2 muestra la preparación de la reducción y ácido colomínico NHS derivado (cuando el extremo no reductor no tiene diol vecinal);
La figura 3 muestra la preparación del ácido colomínico NH2-CA derivado del extremo reductor (diol vecinal eliminado en extremo no reductor);
La figura 4 muestra el esquema general para la preparación de la conjugación CA-NHS-proteína;
La figura 5 muestra la preparación de conjugados de CA-proteína a través de NHS en el extremo reductor;
La figura 6 muestra la preparación de CA derivado extremo no reductor;
La figura 7 muestra la preparación de conjugados de CA-proteína utilizando bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) en el extremo no reductor;
La figura 8 muestra la representación esquemática de la conjugación CA-proteína utilizando el disuccinimidilglutarato (DSG) reticulante;
La figura 9 muestra la HPLC de las reacciones de conjugación ácido colomínico -GH (CA-GH);
La figura 10 muestra la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)-dodecil sulfato de sodio (SDS) de los conjugados de CA-NHS-GH (CA 35 kDa);
La figura 11 muestra PAGE nativa de los CA que no han reaccionado;
La figura 12 muestra la SDS-PAGE de los productos del Ejemplo 3;
La figura 13 muestra el análisis SDS-PAGE de los productos del Ejemplo 4; y
La figura 14 muestra el análisis de cromatografía de exclusión por tamaño de los productos del Ejemplo 4.
Ejemplos
Materiales
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Los marcadores de metaperyodato sódico y de peso molecular se obtuvieron de Sigma Chemical Laboratory, UK. Los CA utilizados, alfa-(2,8) unida E. coli K1 PSA(22.7 kDa promedio, polidispersidad (p.d.) 1.34; 39 kDa p.d. 1.4; 11 kDa, p.d. 1.27) lineal fueron de Camida, Ireland. Otros materiales incluyen 2,4 dinitrofenil hidrazina (Aldrich Chemical Company, UK), un tubo de diálisis (3.5 kDa y 10 kDa límites de corte (Medicell International Limited, UK); columnas Sepharose SP HiTrap, PD-10 (Pharmacia, UK); columna XK50 (Amersham Biosciences, UK): Sepharose Q FF (Amersham Biosciences); geles de Tris-glicina poliacrilamida (4-20% y 16%), solución reguladora de análisis dodecilsulfato de sodio Tris-glicina y solución reguladora de carga (Novex, UK). El agua desionizada se obtuvo a partir de una unidad de purificación de agua Elgastat Option 4 (Elga Limited, UK). Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico. Se utilizó un lector de placas (Dynex Technologies, UK) para las determinaciones espectrofotométricas en los ensayos de proteínas o CA.
Métodos
Determinación de proteínas y CA
La estimación cuantitativa de CA, como el ácido siálico, se llevó a cabo por el método de resorcinol [Svennerholm 1957] como se describe en otro lugar [Gregoriadis et. al., 1993; Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997], GH se midió por el método colorimétrico del ácido bicinconínico (BCA).
Ejemplo de Referencia 1: Fraccionamiento de CA por IEC (CA, 22.7 kDa, p.d. 1.34)
Una columna XK50 se rellenó con 900 mL de Sepharose Q FF y se equilibró con 3 volúmenes de columna de solución reguladora de lavado (trietanolamina 20 mM, pH 7.4) a una velocidad de flujo de 50 mL/min. CA (25 gramos en 200 mL solución reguladora de lavado) se cargó en la columna a 50 mL/min a través de un puerto de jeringa. Esto fue seguido por el lavado de la columna con 1.5 volúmenes de columna (1350 mL) de solución reguladora de lavado.
El CA unido se eluyó con 1.5 volúmenes de columna de diferentes soluciones reguladoras de elución (solución reguladora de trietanolamina, 20 mM pH 7.4, con etapas de NaCI 0 mM a 475 mM en NaCI 25 mM) y finalmente con NaCI 1000 mM en la misma solución reguladora para eliminar todo el CA residual y otros residuos (si existen).
Las muestras se concentran hasta 20 mL mediante ultrafiltración a alta presión a través de una membrana de 5 kDa (Vivascience, UK). Estas muestras fueron de intercambio de solución reguladora en agua desionizada mediante ultrafiltración repetida a 4°C. Las muestras se analizaron para el peso molecular promedio y otros parámetros por GP) y PAGE nativa (tinción con azul de Alcian). Las fracciones estrechas de CA producidas utilizando el proceso anterior se oxidan con peryodato de sodio y se analizaron por GPC y PAGE nativa de alteración burda para el polímero.
Ejemplo de Referencia 2: Activación de CA
La solución de metaperyodato de sodio 0.02 M recién preparado (Nal04; 6 veces de exceso molar sobre CA) se mezcló con CA a 20°C y la mezcla de reacción se agitó magnéticamente durante 15 min en la oscuridad (como se muestra en la primera etapa de la figura 3). El CA oxidado se precipitó con etanol al 70% (concentración final) y por centrifugación de la mezcla a 3000 g durante 20 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se disolvió en una cantidad mínima de agua desionizada. El CA se precipitó de nuevo con 70% de etanol y después se centrifugó a 12.000 g. El sedimento se disolvió en una cantidad mínima de agua, se liofilizó y se almacenó a -20°C hasta su uso posterior.
Ejemplo de Referencia 3: Determinación del estado de oxidación de CA y derivados
La estimación cuantitativa del grado de oxidación CA se llevó a cabo con 2.4 dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH), que produce 2,4 dinitrofenilo-hidrazonas bastante solubles en la interacción con compuestos de carbonilo. (CA) no oxidado y CA oxidado (CAO) (5 mg cada uno) se adicionaron al reactivo 2,4-DNPH (1.0 mL), las soluciones se agitaron y luego se dejaron reposar a 37°C hasta que se observó un precipitado cristalino [Shriner et. al., 1980], El grado (cuantitativo) de la oxidación de CA se midió con un método de [Park and Johnson, 1949] basado en la reducción de los iones de ferricianuro en solución alcalina para ferrocianuro férrico (azul persa), que se mide a continuación a 630 nm. En este caso, la glucosa se utiliza como un estándar.
Ejemplo de Referencia 4a: Preparación de ácido amino colomínico (CA-NH2)
CAO producido como en el Ejemplo de Referencia 2 en 10-100 mg/mL se disolvió en 2 mL de agua desionizada con un exceso molar de 300 veces de NH4CI, en un tubo de 50 mL y luego NaCNBH4 (5 M stock de NaOH 1 N (aq)), se adicionó a una concentración final de 5 mg/mL (Figura 4, primera etapa). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 días. Una reacción de control también se creó con CA en lugar de la CAO. El producto derivado de amina de ácido colomínico se precipitó por la adición de 5 mL de etanol enfriado con hielo. El precipitado se recuperó por centrifugación a 4000 rpm, 30 minutos, temperatura ambiente en una centrífuga de mesa. El sedimento
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se conservó y se resuspendió en 2 mL de agua desionizada, a continuación, se precipitó de nuevo con 5 mL de etanol enfriado con hielo en un tubo de ultracentrífuga de 10 mL. El precipitado se recogió por centrifugación a 30,000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. El sedimento se resuspendió de nuevo en 2 mL de agua desionizada y se liofilizó.
Ejemplo de Referencia 4b: Ensayo para determinar el contenido de amina
El ensayo de TNBS (ácido picrilsulfónico, esto es, ácido 2,4,6-tri-nitro-benceno sulfónico) se utilizó para determinar la cantidad de grupos amino presentes en el producto [Satake et. al., 1960].
En el pozo de una placa de microtitulación se adicionó TNBS (0.5 pL de TNBS 15 mM) a 90 pL de solución reguladora de borato 0.1 M pH 9.5. A esto se le adicionaron 10 pL de una solución de 50 mg/mL de CA-am¡na, la placa se dejó en reposo durante 20 minutos a temperatura ambiente, antes de leer la absorbancia a 405 nm. Se utilizó glicina como un estándar, en un intervalo de concentración de 0.1 a 1 mM. Grupos amina primaria trinitrofenilatos TNBS. Se detecta el aducto de TNP de la amina.
La prueba del producto purificado con una precipitación doble de etanol frío utilizando el ensayo de TNBS mostraron cerca del 90% de conversión.
Ejemplo 1: Preparación de CA-NHS
CA-NH2 (35 kDa) (15-20 mg) sintetizado en el Ejemplo de Referencia 4a anterior se disolvió en 0.15 M de solución salina regulada con fosfato (PBS) (350 uL, pH 7.2) y luego se adicionó ya sea 50 o 75 equivalentes molares de BS3 en PBS (150 pL, pH 7.2). La mezcla se agitó en vértex durante 5 segundos y después se hace reaccionar durante 30 minutos a 20°C. Esto se muestra generalmente en la figura 4, segunda etapa, para un reticulante homobifuncionales y más específicamente en la figura 7 para BS3. El producto CA-NHS se purificó por columna PD-10 utilizando PBS como eluyente (pH 7.2) y se utilizó inmediatamente para la conjugación específica de sitio de los grupos NH2 en proteínas y péptldos. La determinación de la concentración de CA a partir de las fracciones PD 10 se consiguió mediante el análisis del contenido de ácido siálico utilizando el ensayo de resorcinol. El contenido de NHS en el polímero de CA se midió por espectroscopia UV mediante el análisis de la solución de reacción de CA y NHS a 260 nm y también por cromatografía de capa fina con la visualización a 254 nm.
CA-NH2 (35 kDa) (15-20 mg) sintetizado en el Ejemplo 4a de Preferencia anteriormente se disolvió, ya sea en la cantidad mínima de agua (50-65 pL) al que se adicionó dimetilsulfóxido (DMSO) (300-285 pL) o en > 95% de DMSO (350 pL) con la ayuda de calor (100 a 125°C). 75 equivalentes molares de disuccinimidil glutarato DSG en DMSO (150 L) se adicionó a la solución de CA-NH2, se agitó en vórtex durante 5 segundos y después se hicieron reaccionar durante 30 minutos a 20°C (Figura 8). El producto CA-NHS se purificó ya sea con precipitación de dioxano (x2) o por la columna PD-10 utilizando PBS como eluyente (pH 7.2) y se utilizó inmediatamente para la conjugación específica de sitio de los grupos NH2 en proteínas y péptidos. Como antes de la determinación de la concentración de CA a partir de las fracciones PD-10 se midió utilizando el ensayo de resorcinol. El contenido de NHS en el polímero de CA se midió por espectroscopia de UV (260 nm) y por cromatografía de capa fina (254 nm).
Ejemplo 2: Preparación de conjugados de CA-NHS-proteína (utilizando BS3 y DSG)
GH en bicarbonato de sodio (pH 7.4) se une covalentemente al CA-NHS (35 kDa), del Ejemplo 4 con un exceso de bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS)3 La reacción se lleva a cabo en PBS 0.15 M (pH 7.2; 1.5 mL) utilizando una relación molar de 25:1 o 50:1 de CA-NHS:GH durante un período de 30 minutos a 20°C. GH polisialilada se caracterizó por SDS-PAGE y el rendimiento de conjugación determinado por cromatografía de exclusión de tamaño FPLC. Los controles incluían someter la proteína nativa con el proceso de conjugación utilizando BS3 en ausencia de cualquier CA-NHS. CA-NH2 también se sometió al proceso de conjugación utilizando BS3 en ausencia de GH nativa.
GH en bicarbonato de sodio (pH 7.4) se une covalentemente a CA-NHS (35 kDa), que se preparó como se describe en el ejemplo 1, utilizando un exceso de DSG. La reacción se lleva a cabo en PBS 0.15 M (pH 7.2; 1.5 mL) utilizando una relación molar de 50:1 de CA-NHS:GH durante un período de 30 minutos a 20°C. GH polisialilada se caracterizó por SDS-PAGE y el rendimiento de conjugación determinado por cromatografía de exclusión de tamaño HPLC (SEC). Los controles incluían someter la proteína nativa con el proceso de conjugación utilizando DSG en ausencia de cualquier CA-NHS.
Los conjugados CA-GH se disolvieron en solución reguladora de bicarbonato de amonio (0.2 M; pH 7) y se realizó la cromatografía en una columna de Superóse 6 con detección por índice de UV (Agilent, sistema 10/50, UK). Las muestras (1 mg/mL) se filtraron sobre una membrana de nylon de 0.45 mm, se inyectaron 175 pL y se analizaron a 0.25 cm/min con solución reguladora de bicarbonato de amonio como fase móvil (Fig. 9).
SDS-PAGE (MiniGel, Vertical Gel Unit, modelo VGT 1, modelo de fuente de alimentación Consort E132; VWR, UK) se empleó para detectar cambios en el tamaño molecular de la GH sobre polisialilación. SDS-PAGE de GH y sus
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conjugados (con CA-NHS) de 0 (control) y 30 minutos muestras de las mezclas de reacción, así como un control del proceso (CA no oxidado), se llevó a cabo utilizando un gel de pollacrilamida al 4-20%. Las muestras fueron calibradas frente a un amplio rango de marcadores de peso molecular (Flgs. 10 y 11).
Resultados
CA y sus derivados (22.7 kDa) se fraccionaron con éxito en diversas especies estrechas con una polldlspersidad de menos de 1.1 con pesos moleculares promedios de hasta 46 kDa con % diferente de la población. La Tabla 2 muestra los resultados de separar el material 22.7 kDa.
Tabla 2: Cromatografía de Intercambio Iónico de CA22.7 (p.d. 1.3)
Soluciones reguladoras de elución (en solución reguladora de trletanolamina 20 mM + NaCI mM, pH 7.4)
M. W. Pd % de Población
325 mM
12586 1.091 77.4%
350 mM
20884 1.037 3.2%
375 mM
25542 1.014 5.0%
400 mM
28408 1.024 4.4%
425 mM*
7.4%
450 mM
43760 1.032 2.3%
475 mM
42921 1.096 0.2%
* No realizado
Este proceso fue escalable desde 1 mL a 900 mL de la matriz con el perfil de fraccionamiento casi idéntica en cada escala (no se muestran todos los resultados).
El fraccionamiento del polímero más grande (CA, 39 kDa, p.d. 1.4) produjo especies de hasta 90 kDa. Este proceso se puede utilizar con éxito para el fraccionamiento de incluso grandes cantidades de polímero. Los resultados muestran que las fracciones de intercambio iónico se dispersan de forma restrictiva. Esto es consistente con los datos de GPC.
Todas las fracciones estrechas se oxidan con éxito con peryodato 20 mM y las muestras tomadas de las diferentes etapas del proceso de producción y analizadas por GPC y PAGE nativa no mostraron cambios en el peso molecular y polidispersidad.
La medición cuantitativa del estado de oxidación de CA se realizó por reducción de iones de ferricianuro en solución alcalina a ferrocianuro (azul de Prusia) [Park and Johnson, 1949] utilizando glucosa como patrón. Se encontró que el CA oxidado tenía un casi 100% mol de contenido de aldehido aparente en comparación con el polímero nativo. Los resultados de ensayo cuantitativo de intermedios de CA en el proceso de oxidación utilizando ferricianuro fueron consistentes con los resultados de los ensayos cualitativos realizados con 2,4 dinitrofenilhidrazina que dio un precipitado de color amarillo pálido con el CA nativo, y de intenso color naranja con el aldehido que contiene las formas del polímero, dando como resultado un precipitado de color naranja intenso después de diez minutos de reacción a temperatura ambiente.
Se encontró que la aminación del polímero era del 85% y el CA-NHS fue positivo para el NHS. Además, se encontró que el contenido de tiol del polímero era 60%
La integridad de los residuos internos de Neu5Ac unido a alfa-2,8 con enlaces después del tratamiento con peryodato y borohidruro se analizó por GPC y los cromatogramas obtenidos para el (CAO) oxidado, amino CA (CA- NH2), materiales de CA-NHS se compararon con el del CA nativo, se encontró (Fig. 9) que todos los CA muestran perfiles de elución casi idénticos, sin evidencia de que las diversas etapas dan lugar a la fragmentación o la reticulación significativa (en el caso de CA-NHS) de la cadena polimérica. Los pequeños picos son indicativos de sales de solución reguladora.
La formación de los conjugados CA-GH se analizó mediante SEC-HPLC y SDS-PAGE. Para la reacción de conjugación con DSG la SDS-PAGE mostró que no había GH libre restante, y que la reacción de conjugación se
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había completado. Esto fue confirmado por SEC-HPLC, con lo cual los conjugados CA-GH se eluyeron antes del tiempo de elución esperado del GH libre (un pico de GH libre no se observó). Por otra parte, el análisis por SDS- PAGE de la reacción de conjugación de CA-NH2 a GH utilizando BS3 mostró la presencia de GH libre, que se confirmó mediante SEC-HPLC con un pico de elución alrededor de 70 minutos para la proteína libre. Además, la SEC-HPLC permite que el grado de conjugación sea determinado en 53%.
Los resultados (Fig. 10) muestran que en los carriles de conjugados hay cambios en las bandas que normalmente Indican un aumento de masa Indicativo de una GH pollslaliladas, en comparación con GH. Además, los conjugados de GH fueron separados en diferentes especies de SEC-HPLC.
Ejemplo 3: Preparación de derivado de yodoacetato de CA (CAI)
imagen11
3.1 Síntesis
A 40 mg de amina de ácido colomínico (85% en moles de amina) como (se describe en el Ejemplo de Referencia 4a) disuelto en 1 mL de PBS pH 7.4, se adicionaron 5 mg de N-succInlmldll yodoacetato (SIA). La mezcla se dejó reaccionar durante 1 hora a 25°C en la oscuridad, después de lo cual el exceso de SIA se eliminó por filtración en gel sobre una columna de desalación Hlghtrap™ de 5 mL (AP Blosclence) se eluyó con PBS. Se recogieron fracciones de 0.5 mL de la columna y las muestras de cada fracción a prueba para el contenido de ácido colomínico (ensayo de resorclnol) y reactividad con clsteína que Indica yoduro (ensayo de Ellman). Se reunieron las fracciones positivas tanto para yoduro como para CA.
3.2 Conjugación del CAI de |3-galactos¡dasa
Para E. coli (3-galactosidasa (5.0 mg, 4.3 x10'8 mol) en PBS 1 mL, se adicionaron 15 mg de CAI (6.59 x10-7 mol, 15 eq molar). El tubo se cerró herméticamente envuelto en papel de aluminio y la reacción se dejó proceder a temperatura ambiente, durante 1 h mientras se mezcla suavemente. El conjugado resultante se analizó mediante SDS PAGE y después se purificó de acuerdo con los protocolos aceptados para eliminar CAI libre. Las muestras se ensayaron para el contenido de polímero y proteína como se describe anteriormente.
Las reacciones de control se realizaron con CA como un control negativo.
Todas las muestras se analizaron para la actividad de (3-gal como se describe más adelante en la sección 3.3.
3.3 Ensayo de la actividad enzimática
Estándares de 60 pg/mL a 3.75 pg/mL de P-galactosidasa fresca se prepararon en PBS. Muestra de U-galactosidasa derivada se diluyeron a 60 pg/mL en la misma solución reguladora. La actividad enzimática de los conjugados se midió de la siguiente manera:
En una placa de microtitulaclón, a 100 pL de muestra o estándar se adicionaron 100 pL de sustrato p-gal (Pierce) todo en uno. La placa se incubó a 37°C, durante 30 min y se leyó la absorbancia a 405 nm. Una curva de calibración
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se preparó a partir de los estándares y la actividad de las muestras calculadas a partir de la ecuación de la regresión lineal de la curva.
3.4 Conclusiones
Las fracciones 3-6 fueron positivas para ambos polímeros y acetato de yodo y se agruparon. La SDS PAGE (4-12% de gel Bls/Trls; Figura 12) mostró un aumento de la masa molecular aparente de las muestras Incubadas con el derivado de yodoacetamida, pero no con el polímero de control. A partir de los ensayos de proteínas y polímeros la relación de conjugación se determinó que era 1.63 CAI:1 (3-gal.
La actividad |3-gal se calculó en 100.9% para la muestra de conjugado, en comparación con la enzima libre.
Ejemplo 4: Preparación de hidrazida de ácido colomínico (CAH)
4.1 Síntesis
50 mg de ácido colomínico oxidado (19 kDa) se hizo reaccionar con 2.6 mg de hidrazina (líquido) en 400 pL de solución reguladora de acetato de sodio 20 mM, pH 5.5, durante 2 horas a 25°C. A continuación, el ácido colomínico se precipitó con 70% de etanol. El precipitado se disolvió de nuevo en 350 pL de solución salina solución reguladora de fosfato, pH 7.4 y se adicionó NaCNBhb a 5 mg/mL. La mezcla se dejó reaccionar durante 4 horas a 25°C, después se congeló durante la noche. NaCNBhb y los subproductos de reacción se separaron por cromatografía de permeación en gel en una columna PD10 rellena de Sephadex G25, utilizando NH4HCO3 0.15 M como la fase móvil. Las fracciones (0.5 mL cada una) se analizaron mediante el ensayo de TNBS (específico para grupos amino; descritos anteriormente). Las fracciones 6, 7, 8 y 9 (las fracciones de volumen vacío) tenían una fuerte señal, muy por encima del fondo. El fondo fue alto debido a la presencia de los iones NH/. Las fracciones 6, 7, 8 y 9 también contenían ácido colomínico. Estas cuatro fracciones, se liofilizaron para recuperar el CA-hidrazida (CAH).
4.2 Preparación de ácido colomínico NHS (CA-NHS) y conjugados ácido colomínico -proteína
10 mg de CA-hidrazida 19 kDa se hicieron reaccionar con 9 mg de BS3, en 400 pL de PBS (pH 7.4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se aplicó a una columna PD-10 rellena con Sephadex G25 recolectándose las fracciones de 0.5 mL. Se adicionaron 0.1 mg de BSA a cada fracción entre 5 y 9. Después de 2 horas a temperatura ambiente las fracciones reaccionaron con BSA
Estas muestras se analizaron por SDS-PAGE y SEC HPLC.
Estas fracciones tienen poco ácido colomínico. Las fracciones ricas en ácido colomínico (6 y 7) tienen una banda de proteína, además de las bandas presentes en las otras muestras y BSA, que es una evidencia clara de la
conjugación (Fig. 13).
El cromatograma HPLC de la fracción 6 muestra que hay un gran cambio en el tiempo de retención para el conjugado, en comparación con la proteína libre confirmando la conjugación (Fig. 14a y b).
El BSA utilizado contiene impurezas. El pico de BSA está a 56 minutos (Fig. 14a).
Además del pico a los 56 minutos, hay especies de mayor tamaño que son conjugados. Hay un gran pico a los 80 minutos, que es el NHS liberado del CA-NHS ya que reacciona con la proteína. Esto no puede ser BS3 libre como el CAH se pasó a través de una columna de cromatografía de exclusión molecular, que se habrá eliminado. Esto sugiere fuertemente que un grupo éster de NHS fue creado en la molécula de CA (Fig. 14b).
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Claims (30)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    Reivindicaciones
    1. Un proceso para formar un derivado de un compuesto de ácido siálico en el que un compuesto de partida que comprende una unidad de ácido siálico terminal se somete a un intermedio preliminar -etapa de formación que comprende las etapas secuenciales de oxidación y reducción o viceversa en las que un grupo seleccionado a partir de un grupo amina primaria, un grupo amina secundaria y una hidrazina se forma en la unidad de ácido siálico terminal, seguido por una etapa de reacción en la que se hace reaccionar el intermedio con un reactivo bifuncional, de fórmula I
    imagen1
    en la que R es H o sulfonilo;
    R1 es un grupo enlazante; y X es un grupo funcional,
    por el cual el grupo éster se escinde y el grupo amina o hidrazina del intermedio se acila por -CO-R1-X para formar el derivado.
  2. 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto de partida tiene una unidad de ácido siálico terminal unida a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 2, y en el que la etapa preliminar implica la oxidación del grupo 7, 8-diol del ácido siálico para formar un grupo aldehido seguido de animación reductora con H2NR4 en el que R4 es H o alquilo Inferior, o sal de adición de ácido del mismo para formar el intermedio.
  3. 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el compuesto de partida tiene la siguiente fórmula:
    imagen2
    en la que R2 es la dicha otra unidad estructural y se selecciona de un grupo mono-, di-, oligo- o poli-sacárido, una proteína o péptido, un lípido, un fármaco o un sistema de administración de fármaco y en la que el producto derivado de amida tiene la siguiente fórmula:
    A
    R4
    imagen3
    R3
    III
    en la que X, R1 y R4 son los mismos grupos que en los compuestos de partida respectivos y R3 es el mismo que R2 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de oxidación, animación reductora y reacción con el reactivo I.
  4. 4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto de partida tiene un ácido siálico terminal reductor, unido a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 8, y en el que la etapa preliminar implica una etapa de reducción de apertura de anillo cetal por el cual, se forma un grupo que tiene dioles vecinales, seguido de una etapa de oxidación selectiva en la que el grupo diol vecinal se oxida a un grupo aldehido, seguido por
    5 aminación reductora con H2NR4 en la que R4 es H o alquilo inferior, o sal de adición de ácido para formar el intermedio.
  5. 5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el compuesto de partida tiene la siguiente fórmula
    imagen4
    en la que R5 es la dicha otra unidad estructural y se selecciona de un grupo sacárido un grupo oligo- o poli-sacárido, 10 un grupo alquilo, un grupo acilo, un lípido y un sistema de administración de fármacos, y en el que el producto de amida tiene la siguiente fórmula
    imagen5
    V
    en la que R1, Xy R4 son los mismos grupos que en los compuestos de partida respectivos y R6 es el mismo que R5 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de reducción, oxidación, aminación y reacción con el reactivo 15 I.
  6. 6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto de partida tiene una unidad de ácido siálico terminal unido a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 2, y en el que la etapa preliminar implica la oxidación del grupo 7,8-diol del ácido siálico para formar un grupo aldehido seguido de la reacción con hidrazina y la reducción para formar el intermedio.
    20 7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6 en el que el compuesto de partida tiene la siguiente fórmula:
    imagen6
    en la que R2 es la dicha otra unidad estructural y se selecciona de un grupo mono-, di-, oligo- o poli-sacárido, una proteína o péptido, un lípido, un fármaco o un sistema de administración de fármacos y en el que el derivado de producto tiene la siguiente fórmula
    5
    10
    15
    20
    25
    imagen7
    VIII
    en la que X y R1 son los mismos que en los respectivos materiales de partida y R3 es el mismo que R2 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de oxidación, reacción con hidrazina, reducción y reacción con el reactivo I.
  7. 8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto de partida tiene un ácido siálico terminal reductor, unido a otra unidad estructural a través de su átomo de carbono 8, y en el que la etapa preliminar implica una etapa de reducción de apertura de anillo cetal por el cual, se forma un grupo que tiene dioles vecinales seguido de una etapa de oxidación selectiva en la que el grupo diol vecinal se oxida a un grupo aldehido, seguido de reacción con hidrazina y la reducción para formar un intermedio.
  8. 9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el compuesto de partida tiene la siguiente fórmula
    imagen8
    en la que R5 es la dicha otra unidad estructural y se selecciona de un grupo mono-, di-, oligo- o poli-sacárido, un grupo alquilo, un grupo acilo, un lípido y un sistema de administración de fármacos, y en el que el derivado de producto tiene la siguiente fórmula
    imagen9
    en la que X, R1 son los mismos grupos que en los compuestos de partida respectivos y en el que R6 es el mismo que R5 o es el producto de la reacción del mismo en las etapas de reducción, oxidación, reacción con hidrazina, reducción y reacción con el reactivo I.
  9. 10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se aísla el intermedio sustancialmente de la mezcla del producto de la etapa preliminar antes de ponerse en contacto con el reactivo de fórmula I.
  10. 11. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la reacción entre el intermedio y el reactivo de fórmula general I se lleva a cabo en un solvente aprótico, que comprende preferiblemente una pequeña cantidad de un solvente prótico.
  11. 12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el solvente aprótico es dimetilsulfóxido, y el solvente prótico es agua.
  12. 13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el reactivo de fórmula I está presente en exceso estequiométrico para la reacción con el intermedio, y está presente preferiblemente en una
    5
    10
    15
    20
    25
    cantidad de al menos dos veces, más preferiblemente al menos 5 veces la cantidad para la reacción estequiométrlca con el intermedio.
  13. 14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13 en la que X es un grupo
    en el que R tiene la misma definición que en la reivindicación 1.
  14. 15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el reactivo de fórmula I se selecciona del grupo que consiste en
    bis[2-succinimidiloxicarbonil-oxi)etil]sulfona (BSOCOES) y su análogo sulfo,
    bis(sulfosuccinimidil)suberato) (BS3),
    disuccinimidil glutarato (DSG),
    ditiobis (succinimidil propionato) (DSP),
    disuccinimidil suberato (DSS),
    disuccinimidil tartrato (DST) o su análogo sulfo,
    3,3’-ditiobis (sulfosuccinimidil propionato) (DTSSP), y etilenglicol bls(succinimidil succlnato) (EGS) y su análogo sulfo.
  15. 16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que X es un grupo funcional seleccionado de vinilsulfona, N-maleimido, N-yodoacetamido, ortopiridilo disulfuro, hidroxilo protegido, amino protegido, adazido.
  16. 17. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el reactivo se selecciona del grupo que consiste en N-(a-maleimidoacetoxi)succinimida éster, (AMAS),
    de N-(P-maleimidopropiloxi)succinimida éster, (BMPS),
    N-(e-maleimidocapriloxi)succinimida éster, (EMCS), o su análogo sulfo,
    N-(Y-maleimidobutiriloxi)succinimida éster, (GMBS), o su análogo sulfo, succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), (LC-SMCC), m-maleimido benzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), o, su análogo sulfo, succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato) (SMCC) o su análogo sulfo, succ¡n¡mid¡l-4-(p-male¡m¡do fenil) butirato (SMPB) o su análogo sulfo, succ¡n¡mid¡l-6-(P-male¡m¡do-prop¡onam¡do) hexanoato (SMPH),
    N-(k-maleim¡doundecano¡lox¡) sulfosuccinim¡da-éster(sulfo-KMUS), succinimidil 6-[3-2(2-piridilditio)-propionamido]
    O
    imagen10
    R
    O
    5
    10
    15
    20
    25
    hexanoato (LC-SPDP) o su análogo sulfo,
    4-succinimidiloxicarbonil-metil-cx.-(2-piridildit¡o) tolueno (SMPT) o su análogo sulfo-LC,
    N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP),
    N-succinimidll [4-vlnilsulfonil) benzoato (SVSB), succinimidil 3-(bromoacetamido)prop¡onato (SBAP), y N-succinimldlIyodoacetato (SIA) y
    N-succ¡nim¡d¡l(4-yodoacet¡l)am¡nobenzoato (SiAB) o su análogo sulfo.
  17. 18. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que R1 se selecciona del grupo que consiste de alcanodiilo, arileno, alcarileno, heteroarileno y alquilheteroarileno, cualquiera de los cuales puede estar sustituido y/o interrumpido por enlaces carbonilo, áster, sulfuro, éter, amida y/o amina.
  18. 19. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que R1 es alcanodiilo C3-C6.
  19. 20. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que se aísla el derivado de producto sustancialmente por completo de cualquier exceso de reactivo.
  20. 21. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que se aísla el derivado de amida o hidrazina del producto de forma sustancialmente por completo de la mezcla del producto.
  21. 22. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la recuperación del producto se termina con una etapa de secado a presión reducida para eliminar el solvente, preferiblemente liofilización.
  22. 23. Un proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el compuesto de partida es un polisacárido.
  23. 24. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el polisacárido tiene unidades de ácido siálico terminales.
  24. 25. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el polisacárido se compone de unidades de ácido siálico.
  25. 26. Un compuesto de fórmula III o de fórmula VIII
    R*
    imagen11
    HO
    IH
    vm
    en la que X es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en ásteres de NHS, sulfona de vlnilo, N- malelmido, N-yodoacetamido, disulfuro de ortoplrldllo, hidroxi, hidroxilo protegido, arrimo, arrimo protegido, carboxilo, carboxilo protegido, o azido;
    R1 es un enlazante;
    R4 es hidrógeno o alquilo C1.4; y
    R3 es un mono-, di-, oligo- o poli-sacárido, una proteína, un péptido, un lípido, un fármaco o un sistema de administración de fármacos.
  26. 27. Un compuesto de fórmula V o fórmula IX
    5
    imagen12
    V
    IX
    en la que X es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en NHS-ésteres, vinilsulfona, N-maleimido, N-yodoacetamido, disulfuro de ortopiridilo, hidroxi, hidroxilo protegido, amino, amino protegido, carboxilo, carboxilo protegido, o azido;
    10 R1 es un enlazante;
    R4 es hidrógeno o alquilo C1.4; y
    R6 es un grupo mono-, di-, oligo- o polisacárido.
  27. 28. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 26 o 27, en el que R1 se selecciona del grupo que consiste en alcanodiilo, arileno, alcarileno, heteroarileno y alquilheteroarileno, cualquiera de los cuales puede estar interrumpido
    15 por enlaces carbonilo, áster, sulfuro, éter, amida y/o amina.
  28. 29. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 28, en el que R1 es alcanodiilo C3-C6.
  29. 30. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, en el que R3 o R6 como en su caso es un oligo o poli-sacárido.
  30. 31. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el oligo- o polisacárido es un ácido oligo- o
    20 polisiálico.
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