JPH05506233A - 赤血球の表面に結合した抗原を含むワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 赤血球の表面に結合した抗原を含むワクチン本発明は、一般的にいえばワクチン に関するもので、具体的にいえば、制限されるものでないが、経口投与に適当な インフルエンザワクチンに関する。

現在、大部分のワクチンは非経口で投与されるが、その結果として投与経路の優 しゅう的な性質から起こる問題を生ずる。例えば、アメリカ合衆国特許Ｎｏ。

４１５７３９０に、分娩前の雌ブタに非経口投与されたワクチン中に入れた腸病 原性抗原の供与のための担体として赤血球を使用することを提案されている。別 の非経口投与の欠点は、一般に、それは粘膜の免疫反応よりすぐれた血１＆骨髄 免疫反応を誘導するが、それにもかかわらずある種の感染因子の予防および治療 は、強い粘膜免疫により処理されるのが適当だということである。従来の技術の ワクチンの非経口的性質は、一般に強い粘膜作用をもたらさなかった。

それらの問題の数個を改良するために、経口投与ワクチンが、様々な感染因子に 対して提案された。残念ながら消化管が敵対環境を与えるので、セービングワク チンにみられるようにそれらが有効であるのは幸運にすぎない。

過去に経験された欠点のいくつかを改良したワクチンを得ることが、本発明の課 題である。

赤血球および誘導体が、粘膜免疫系に対する抗原の供与のために有効な経口投与 担体を与え得るということが判明した。従って、本発明の最初の態様によれば、 赤血球またはその誘導体の表面に結合した抗原を含む経口ワクチンが提供される 。

本発明の第２の態様は、哺乳動物における免疫反応、特に粘膜免疫反応を誘発す る方法であって、上に記載のワクチンの経口投与を含む方法を提供することであ る。

一般に、抗原は、病原体を起源とする。そのような病原体は、ウィルス、特に粘 膜免疫反応が予防または急性感染において重要であると思われるウィルスであり 得る。それらの具体例は、呼吸器性ウィルス、例えばインフルエンザまたはライ ノウィルス、ポリオおよびある種の胃腸性ウィルス、例えばロタウィルスを含む 。他の粘膜株組織の感染は、エシェリキア・コリの尿路感染およびトラコーマに おける眼のクラミジア感染を含む。本発明は、肝炎または破傷風のような全身性 感染での使用を提案する全身免疫もまた提供し得る。抗アレルギーまたは避妊処 置のためのような他の免疫適用もまた適当である。抗原は、例えば−季節に存在 する全ての株のインフルエンザに対する多価ワクチンを産生ずる複数の抗原を含 み得る。別法としてまたは付加法として、抗原は、複数の疾患または症状に対し て有効な単一ワクチンをもたらす種々の微生物からの複数の抗原を含み得る。

本発明は、ゴーストまたは属調製品のように誘導体が所望の強い粘膜免疫原性を 生じ得るため、ワクチン中における完全赤血球の使用に限定されるものではない 。赤血球の使用は、バイアー環により最適に取られた５〜１０μｍの範囲中に入 る極めて均一な型の粒子を得るとういうことが観察された（例えば、ジョーンズ 等、（１９８８年）、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムロジー（Ｓｃ ａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　、第２７巻、６４５頁、参照）。即ち 、本発明の使用により、抗原は、一般粘膜系の賦活のための「粘膜運動」である バイアー環に効果的に標的化され得る。バイアー環を標的する先の試みは、クロ イテル等、（１９８１年）、ジャーナル・オブ・ファーマンニーティカル・サイ エンス（Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ。

Ｓｃｉ、）、第７０巻、３６７頁に記載のように分離した均一型の粒子をつくる のが困難なために失敗した。

本発明の経口投与される赤血球（または誘導体）系の利点は、あらかじめ食餌で さらされるために、赤血球は、たいていの個体により免疫学的に非常に寛大に扱 われることである。したがって、赤血球は、ニワトリ、アヒル、ウシまたはヒツ ジのような畜産動物を起源とすることが所望される。別法として、低アレルギー 性を確実に得るために、ヒトの赤血球を用いることも可能である。

赤血球または誘導体と抗原の表面結合は、吸着または配位結合または他の化学的 修飾により起こり得る。１つの別法は、レクチンまたは赤血球マーカーに対する 特異性を有する抗体（画分）に対する抗原の結合である。しかし好ましくは、結 合は、抗原それ自身または抗原に結合した連結基またはハブテン基に対して特異 性を赤血球上の固有の受容体の相互作用により起こる。

例えば、インフルエンザ赤血球凝集素糖蛋白質（ＨＡ）は、ニワトリ赤血球（Ｃ ＲＢＣ）の表面受容体に烈しく結合する。弱毒化または不活性化された生インフ ルエンザ調製品は、ＨＡおよび表面受容体により赤血球（または誘導体）に対し て直接に結合され得る。培養上清およびワクチン調製品からのウィルス精製は、 上清に赤血球（または誘導体）の単に添加することにより単一工程で達成され得 る。ウィルス性抗原の調製のための好ましい技術は、調製品の抗原性を有効に維 持するを思われるガンマ線照射を利用する方法である。

赤血球（または誘導体）に対する抗原の供与の効力は、非常に少量の抗原で有効 な反応を誘発され得るというこであり、この系の相乗作用またはアジュバント性 を示唆する。必要とされる少量の抗原は、上記の多価ワクチンの供与を可能とす る。

本発明の意外な特徴は、有効な局所性および全身性刺激を与え明確な予防効果を 表す循環性および局所性抗体をもたらすことを示したことである。

本発明のワクチンの具体例を、下記の実施例および実施例で検討された様々な実 験結果を詳細に説明する添付の第１図〜第１１図に基づいて記載するが、これは 例示することのみを目的とするものである。特に、第１図は、Ａ／Ｑ１ｄ／６／ ７２ウィルスを吸着したＣＲＢＣのワクチン経口投与後のＨ３Ｎ２に対するマウ スの防御を記載する棒グラフである：第２図は、ウィルス吸着ＣＲＢＣのワクチ ン経口投与後マウスから得た肺ホモジネートのウィルス特異性抗体のタイターを 記載した棒グラフである。

第３図は、肺抗体タイターとＡ／Ｑｌｄ／６／７２ウィルスを吸着したＣＲＢＣ の勾配用量のワクチン経口投与後のマウスの防御を記載する棒グラフである；第 ４図は、マウスを皮下投与で免疫化した点を除いて第３図と同様な実験を記載す る棒グラフである； 第５図は、３種の吸着ウィルスでの経口免疫後のＡ／Ｑｌｄ／６／７２、Ａ／Ｖ ｉｃ／３６／８８およびＡ／ＨＫ／１２３／７７ウイルスニ対するマウスの防御 を記載する棒グラフである。

第６図は、３種の吸着ウィルスでの経口免疫で後のＡ／ＱＬｄ／６／７７、Ａ／ Ｖｉｃ／３６／８８およびＡ／ＨＫ／１２３／７７ウイルスに特異的なウィルス 抗体を示す棒グラフである： 第７図は、生きたＨ３Ｎ３ウィルス（Ａ／Ｑｌｄ／６／７２）でのワクチン経口 投与後における８２Ｎ２およびＨＩＮＩウィルスに対するマウスの交差防御を記 載する比較実験の棒グラフである； 第８図は、Ａ／Ｑｌｄ／６／７２　（Ｈ３Ｎ３）を経口投与後３．６および１２ 週のマウスで異型の攻撃に対する交差防御を記載する棒グラフである：第９図は 、Ａ／Ｑｌｄ／６／７２　（Ｈ３Ｎ３）ウィルスを吸着したＣＲＢＣによるを経 口免疫後のマウスの肺ホモジネート中の赤血球凝集阻害タイターを記載する棒グ ラフである； 第１０図は、Ｈ３Ｎ２サブタイプ中の種々のウィルスに対してＡ／Ｑｌｄ／６／ ７２　（Ｈ３Ｎ２）により誘発されるおける同型の交差防御を記載する棒グラフ である； 第１１図は、抗体タイターと同型交差防御の間の相関作用を記載する棒グラフで ある。

実施例　担体としてニワトリ赤血球を使用した不活性インフルエンザ・ウィルス での経口免疫 本実施例は、抗原の種類にかかわらず、赤血球凝集糖タンパク質を通じてニワト リ赤血球表面受容体へ結合するインフルエンザ・ウィルスの性質に基づいている 。即ち、ウィルスの精製およびワクチンの製造は、単一工程で行われ得る。簡単 に言えば、ニワトリ赤血球をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ついで ＰＢＳ中１０ＩＯ個／ｍｌに再懸濁した。それらは、ウィルス吸着に完全なまま またはトリス緩衝化塩化アンモニウム溶液で溶解した後「ゴースト」として使用 した。吸着は、特異的な病原体のない卵中で発育させたウィルスを含むガンマ線 照射（２ｘ　１０’ｒａｄｓ、６０　（ｏ　）尿腹腔液の様々な希釈液で室温で ３０分間行った。ＰＢＳで３回洗浄し、卵由来物質および過剰のウィルスを除去 した後、ウィルス吸着ＣＲＢＣを、ついで２％炭酸ナトリウム水溶液中５Ｘ１０ ”粒子／ｍｌに再懸濁した。

ワクチン経口投与については、スイス雄マウスに、１．３．５日の各々で炭酸水 素ナトリウム中０．４ｍｌリン酸緩衝化（非免疫化コントロール）または０．４ ｍｌ不活化ウィルス単独またはガンマ線照射ウィルス（免疫化）吸着（全または 溶解）ＣＲＢＣを投与した。最終投与後１０日後、マウスを、ミクロピペットを 使用して各々鼻孔にリン酸緩衝食塩水中生ウイルス懸濁液５０μｌを接種して生 ウィルスで鼻内攻撃した。攻撃後４日後、マウスを殺した。肺ホモジネート中つ ルスおよび抗体のタイターをＭＣＤＫウィルス感染分析およびＥＬＩＳＡにより 測定した。

代表的な実験を第１図および第２図に示す。ＰＢＳまたは不活性ウイノにスで免 疫化されたウィルスは、ガンマ線照射されたウィルスを吸着したＣＲＢＣで免疫 化されたマウスと比較してウィルスでの攻撃に対して防御されなかった。更に、 防御および呼吸分泌ウィルス特異性抗体の存在間で相関作用があった（第２図） 。

ＣＲＢＣに吸着されたＡ／Ｑｌｄ／６／７２ウィルスの勾配濃度で経口ワクチン 投与した後の肺感染からのマウスの抗体反応および防御を示す第１表に記載のよ うに、ｌｏｇ、。２７ＣＩＤという低いウィルス量を吸着したＣＲＢＣで免疫し たときマウスは防御され、防御および抗体反応は用量依存性である。

第１表：不活化Ａ／Ｑｌｄ／６／７２　（Ｈ３Ｎ３）ウィルスの勾配濃度を吸着 したＣＲＣでの経口免疫化後の抗体反応および肺感染からのマウスの防御免疫用 量　１ｇＧＩＷ／＋ｍｌｌ　ＰＦＬＩ／Ｌｕｎｇ　ＩｇＡ（Ｅｔｊ／ｌｌｌ１ｌ 　Ｐｒｔｊ／ｍｌ第３図および第４図を比較すると、本発明の生産物を経口ワク チン投与した後の肺抗体タイターは、皮下投与のタイター以上に増強されること が判る。ＣＲＢＣ担体系の融通性は、Ａ／Ｑｌｄ／６／７２、Ａ／Ｖｉ　ｃ／３ ６／８８およびＡ／ＨＫ／１２３／７７ウイルスを使用して３重吸着ウィルスＣ ＲＢＣを試験した実験により示された。３種のウィルス全ては、攻撃後節から取 り除かれ反応は呼吸分泌中ウィルス特異性抗体のレベルに相関していた（第５表 および第６表）。

経口投与されたとき、明らかにウィルス吸着ＣＲＢＣ粒子は、気道中防御免疫の 強力な誘発因子である。次頁の第２表は、吸着されたウィルスでの経口免疫後の 交差防御を示す本研究の予備データを含む。

異型交差防御および防御の持続期間は、４　Ｘ　１０’Ａ／Ｑ　Ｉ　ｄ／６／７ ２　（Ｈ３Ｎ３）ウィルスを吸着したＣＲＢＣでマウス類を免疫およびＬｏｇ１ ０５．５ＴＣＩＤ　Ａ／Ｑｌｄ／８／７２　（Ｈ３Ｎ３）　、Ａ／ＡＡ／６／６ ０ｃａ　（ＨＩＮｌ）およびＡ／ＨＫ／１２３／７７　（Ｈ２Ｎ２）で各々グル ープを攻撃して評価した。経口免疫後３週間、６週問および１２週間で、マウス を種々のサブタイプの野生型生ウィルスで攻撃した。第８図に示すように、ウィ ルスは、肺から完全に取り除かれた。

ウィルスの除去は、同種株に対する抗体ならびに異種株に対する交差防御抗体と 相関する。類似の結果は、ウィルスの除去および抗体濃度に関して鼻洗浄液中で 観察された。その結果はＨＩ試験を使用して有効とされ、肺ホモジネートおよび 鼻洗浄液中の抗体濃度を測定し、それは防御と相関する。

Ｈ３Ｎ３サブタイプ内でウィルスを変えてＡ／Ｑ１ｄ／６／７２て誘発される同 種交差防御を第１０図に示し、第１１図はこの系の抗体タイターと同種交差防御 の相関を示す。

交差防御の注目される濃度（赤血球凝集素関門を通って）は、ＥＬＩＳＡ抗体分 析を使用して表された。この交差防御は、インビボでの攻撃で直接的に表される 。この防御（抗体産生および肺クリアランス）は、１次免疫後すくなくとも３力 月間相対的に衰えないことを示した。抗原特異性は、赤血球凝集素阻害タイター を使用して更に試験され、１２週間まで抗体タイター下がり続けたけれども、交 差防御は認められ、この場合も赤血球凝集素特異性抗体の異常な産生を示した（ 第９図）。即ち、本発明の実施態様での免疫は非零に少量のウィルスを用いて全 身性の「赤血球凝集素関門」を通過する広範な免疫を刺激することを表す。例と して、第７図は、交差防御が赤血球（または誘導体）不存在下で経口投与された インフルエンザワクチンの場合に見られないこを示す。

本発明は、ニワトリ赤血球誘導体に結合したガンマ線照射インフルエンザウィル スを使用したマウスモデルを使用して詳細に示したけれども、ヒトを含む池の系 が本発明の意図および範囲に含まれることはいうまでもない。

Ｆｉｇ、　１ Ｆ１ａ、　５ ウィルス吸着ｃｇａｃ用量　（Ｌａｇ　１０）ウィルス吸着ＣＲＢＣ用量　（Ｌ ａｇ　１０）Ｆ１ａ、　４゜ ９　θ　７　６　５　対照 ’ｙ　イルスＵＩｋｌｌｃＲＢｒ３１１ｒ　（Ｌｏｇ　１０）ウィルス吸着ＣＲ ８Ｃ（ＬｏｇＩＯ） Ｆｌｉｐ、　５ ＾　ＢＣＡ６Ｃ 非免疫対照　免疫 Ｆ１６．６ ＢＣＡＢＣ 非免疫対照　免疫 ＰＦＵ　／　ＭＬ　（Ｌｏｇ　１０） Ｆ（９−１１ Ｆ匈、り 対照　免疫 免疫　非免疫 免疫　非免疫 免疫　非免疫 要約書 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１０月２２日４シ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．赤血球または誘導体の表面に結合した抗体を含む経口ワクチン。
2. ２．抗原がウイルス性抗原である請求項１記載のワクチン。
3. ３．ウイルス性抗原がインフルエンザ抗原である請求項１記載のワクチン。
4. ４．インフルエンザ抗原がガンマ線照射インフルエンザウイルスを含む請求項３ のワクチン。
5. ５．抗原が赤血球または誘導体表面に吸着される請求項１記載のワクチン。
6. ６．抗原が赤血球の固有表面受容体に結合する請求項５記載のワクチン。
7. ７．誘導体が赤血球ゴースト調製品を含む請求項１記載のワクチン。
8. ８．赤血球または誘導体がニワトリ赤血球をである請求項１記載のワクチン。
9. ９．抗原が複数の異なる抗原を含んで多価ワクチンを定義する請求項１記載のワ クチン。
10. １０．哺乳動物に請求項１記載のワクチンを経口投与することを含む、哺乳動物 に免疫反応を誘発する方法。
11. １１．免疫反応が粘膜免疫反応である請求項１０記載の方法。