TWI732738B

TWI732738B - 抗TNF-α醣抗體及其用途

Info

Publication number: TWI732738B
Application number: TW104117109A
Authority: TW
Inventors: 翁啟惠; 吳宗益
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2021-07-11
Also published as: IL249184A0; TW201609135A; US11332523B2; JP7063538B2; KR102494193B1; EP3154582A4; JP2020176144A; JP2017518990A; KR20170004023A; US20150344559A1; AU2015267044A1; EP3154582A1; CN106714829A; WO2015184001A1; IL249184B; WO2015184001A8; CA2950433A1

Abstract

本揭示係關於新穎種類之抗TNFα單株抗體或抗原結合片段，其包括在每一Fc上具有相同N-聚醣之抗TNFα IgG分子之均質群體。本發明抗體可自抗TNFα單株抗體由Fc醣改造產生。與未經醣改造之相應單株抗體相比，本發明醣抗體可具有改良之治療價值。

Description

抗TNF-α醣抗體及其用途

Fc醣基化已成為治療性單株抗體領域中之重要主題。Fc醣基化可顯著改質Fc效應物功能(例如Fc受體結合及補體活化)，且由此影響治療抗體之活體內安全及功效特徵。

基於基因改造之若干表現系統已報導會產生治療性單株抗體。該等表現系統包含酵母(例如嗜甲醇酵母菌)、昆蟲細胞系及甚至細菌。然而，該等表現系統具有諸多可不利地影響治療抗體之效應物功能之缺陷。

大部分經批准生物藥物係在哺乳動物細胞培養系統中產生以遞送具有具有期望醣基化模式之蛋白質且由此確保減小之免疫原性及較高活體內功效及穩定性。非哺乳動物表現系統(例如CHO或NS0細胞)具有添加複雜人類型聚醣所需之機制。然而，該等系統中所產生之聚醣可不同於人類中所產生之聚醣。其醣基化機制通常添加不期望碳水化合物污染物，此可改變蛋白質摺疊，誘導免疫原性，且減小藥物之循環壽命。顯而易見，呈N-乙醯基神經胺酸形式之唾液酸不能有效添加於大部分哺乳動物細胞中且6-鏈接在該等細胞中丟失。唾液酸轉移所需之具有各種酶活性之改造細胞尚未成功提供醣型至蛋白質藥物之人類樣模式。迄今為止，需要將動物細胞或醣蛋白改造成儘可能類似於人類蛋白質之高度唾液酸化產物。

另外，哺乳動物細胞培養遞送並不皆具有相同性質之醣基化模式之異質混合物。該等醣基化模式可影響諸如治療性蛋白質之安全性、功效及血清半衰期等性質。

自體免疫性病症係重大且廣泛之醫學問題。TNFα(壞死因子α)係自體免疫性疾病(例如類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)及牛皮癬)中之發炎之主要促成者。

TNF在發炎中之重要性已藉由抗TNF抗體在控制類風濕性關節炎及其他發炎性病狀中之疾病活性中之功效突出顯示。當前存在4種批准用於治療類風濕性關節炎之抗TNFα mAb，包含REMICADE^TM(英夫利昔單抗(Infliximab))、嵌合抗TNFα mAb、ENBREL^TM(依那西普(Etanercept))、TNFR-Ig Fc融合蛋白、HUMIRA^TM(阿達木單抗(Adalimumab))、人類抗TNFα mAb及CIMZIA®(賽妥珠單抗(Certolizumab pegol))、聚乙二醇化Fab片段。

阿達木單抗(Humira®)係藉由基因技術改造之人類源重組IgG1單株抗體。阿達木單抗結合至TNF-α但並不結合至TNF-β且具有大約2週之半衰期。其已在2002年12月31日批准用於RA患者。

阿達木單抗係在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生且在Fc結構域中之醣基化模式具有高度異質性。異質混合物中之每一IgG分子可能並不皆具有相同性質，且某些結合至治療蛋白之N-連接寡醣可在患者中觸發不期望效應，由此可視為安全問題。

因此，本揭示內容之一態樣係關於抗TNFα醣抗體之組合物，其包括在每一Fc上具有相同N-聚醣之抗TNFα IgG分子之均質群體。本發明之抗TNFα醣抗體可自抗TNFα單株抗體由Fc醣改造產生。重要的是，與未醣改造之相應單株抗體相比，本文所闡述之抗TNFα醣抗體具有改良之治療價值以及增加之TNFα結合親和力。

在較佳實施例中，N-聚醣連接至Fc區之Asn-297。

在一些實施例中，本文所闡述之抗TNFα醣抗體包括具有SEQ ID NO：1中所陳述胺基酸序列之重鏈及具有SEQ ID NO：2中所陳述胺基酸序列之輕鏈。在一較佳實施例中，該醣抗體包括阿達木單抗(Humira®)之輕鏈序列及重鏈序列。

本文揭示衍生自阿達木單抗之功能活性抗TNFα醣抗體。該等抗TNFα醣抗體與阿達木單抗相比展現類似或改良之TNFα結合親和力。

在一些實施例中，本發明醣抗體中之N-聚醣具有雙觸角(biantennary)結構。在一些實施例中，N-聚醣包括二等分(bisecting)GlcNAc。

在一些實施例中，本文所闡述之N-聚醣包括至少一個α2-6末端唾液酸。在某些實施例中，N-聚醣包括一個α2-6末端唾液酸。在一較佳實施例中，N-聚醣包括兩個α2-6末端唾液酸。

在一些實施例中，本文所闡述之N-聚醣包括至少一個α2-3末端唾液酸。在某些實施例中，N-聚醣包括一個α2-3末端唾液酸。在一較佳實施例中，N-聚醣包括兩個α2-3末端唾液酸。

在一些實施例中，本文所闡述之N-聚醣包括至少一種半乳醣。在某些實施例中，N-聚醣包括一種半乳醣。在一較佳實施例中，N-聚醣包括兩種半乳醣。

在較佳實施例中，N-聚醣發生岩藻醣基化。在一些實施例中，N-聚醣發生去岩藻醣基化。

在一些實施例中，N-聚醣具有選自由以下組成之群之聚醣序列：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-3)GalGlcNAc₃ Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)。

在較佳實施例中，N-聚醣具有選自由以下組成之群之聚醣序列：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia2(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)。

本揭示內容之另一態樣描述一種醫藥組合物，其包括本文所闡述之抗TNFα醣抗體之組合物及醫藥上可接受之載劑。

本揭示內容之醫藥組合物可用於治療。本文所揭示者包含治療人類患者之TNF介導之發炎性疾病之方法，該方法包括向有需要之人類投與有效量之本文所闡述之醫藥組合物。

在一些實施例中，該投與包括向該人類經口投與該醫藥組合物。TNF介導之發炎性疾病之實例包含但不限於發炎性腸病(包含潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎及幼年型特發性關節炎。

在一些實施例中，本文所闡述之治療方法進一步包括向患者投與抗TNFα治療劑。在一些實施例中，抗TNFα治療劑係阿達木單抗、英夫利昔單抗或依那西普。

本發明之抗TNFα醣抗體可自在細胞中產生之抗TNFα單株抗體生成。在較佳實施例中，抗TNFα單株抗體用於治療應用。在一些實施例中，治療性單株抗體市面有售或處於研發中。抗TNFα單株抗體可為人類化、人類或嵌合抗體。

可在活體外產生本文所闡述之抗TNFα醣抗體。可藉由Fc醣改造生成抗TNFα醣抗體。在某些實施例中，自在諸如哺乳動物細胞等細胞中產生之抗TNFα單株抗體以酶方式或以化學酶方式改造抗TNFα醣抗體。

本文闡述製備岩藻醣基化醣抗體之方法，該方法包括以下步驟：(a)使單株抗體與至少一種醣苷內切酶接觸，由此得到在Fc上具有二醣(GlcNAc-Fuc)之抗體，及(b)在適宜條件下將碳水化合物部分添加至二醣之GlcNAc中。

本文所闡述者亦包含製備去岩藻醣基化醣抗體之方法，該方法包括以下步驟：(a)使單株抗體與α-岩藻醣苷酶及至少一種醣苷內切酶接觸，由此得到在Fc上具有單醣(GlcNAc)之抗體，及(b)在適宜條件下將碳水化合物部分添加至GlcNAc中。

本發明方法中之單株抗體可為抗TNFα單株抗體。在一些實施例中，本發明方法中之抗TNFα單株抗體係阿達木單抗、英夫利昔單抗或依那西普。

在一些實施例中，碳水化合物部分係選自由以下組成之群：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia2(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)。

可藉由轉醣苷酶實施步驟(b)中之添加。轉醣苷酶包含但不限於EndoS、EndoH、EndoA、EndoM、EndoF1、EndoF2及EndoF3。

在一些實施例中，本發明方法中之醣苷內切酶係EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS或其變體。

在一些實施例中，α-岩藻醣苷酶包括具有與SEQ ID NO：5至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致之胺基酸序列之多肽。

在某些實施例中，α-岩藻醣苷酶係重組類桿菌(Bacteroides)α-岩藻醣苷酶。

在一些實施例中，碳水化合物部分係醣噁唑啉。

本發明一或多個實施例之詳細內容陳述於下文說明書中。根據下列圖式及若干實施例之詳細說明亦及隨附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將顯而易見。

圖1.抗TNFα GAb 201及101(上圖)以及GAb 200及401(下圖)之 SDS-PAGE分析。抗TNFα GAb 101(上圖)及GAb 401(下圖)之N-聚醣特徵分析。

圖2.展示TNFα與抗TNFα GAb 200、401及阿達木單抗之結合親和力。

因此，仍需要使用改良之抗TNFα抗體來改良單株抗體療法。醣基化模式之異質混合物中之少數特異性醣型已知會賦予期望生物功能。因此，極為關注生成含有充分定義之聚醣結構及序列作為用於治療目的之期望醣型之治療抗體。

本揭示內容係關於新穎種類之單株抗體(稱為「醣抗體」)之研發。術語「醣抗體」係由發明者Dr.Chi-Huey Wong創造，其係指在Fc上具有單一均勻醣型之單株抗體(較佳地治療性單株抗體)之均質群體。構成均質群體之個別醣抗體相同，結合相同表位，且含有具有充分定義之聚醣結構及序列之相同Fc聚醣。

除非另外指示，否則本發明實踐將採用熟習此項技術者熟知之分子生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習用技術。該等技術全面闡釋於文獻中。例如參見Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，由Sambrook、Fritsch及Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)；DNA Cloning，第I及II卷(D.N.Glover編輯，1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss公司，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press公司，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller及M.P.Calos編輯，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，第154及155卷(Wu等人，編輯),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及Walker編輯，Academic Press,London,1987)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow及Lanes(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)；及Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell，編輯，1986)。

定義：

如本文中所使用，術語「抗TNFα醣抗體」(「anti-TNFα glycoantibodies，抗TNFα GAbs」)係指在Fc上具有相同醣型之抗TNFα IgG分子之均質群體。術語「抗TNFα醣抗體」(「anti-TNFα glycoantibody，抗TNFα GAb」)係指抗TNFα醣抗體(anti-TNFα glycoantibodies)中之個別IgG分子。

如本文中所使用，術語「聚醣」係指多醣、寡醣或單醣。聚醣可為醣殘基之單體或聚合物且可為直鏈或具支鏈。聚醣可包含天然醣殘基(例如葡萄醣、N-乙醯基葡醣胺、N-乙醯基神經胺酸、半乳醣、甘露醣、岩藻醣、己醣、阿拉伯醣、核醣、木醣等)及/或改質醣(例如2'-氟核醣、2'-去氧核醣、磷酸甘露醣、6'硫N-乙醯基葡醣胺等)。如本文中所使用，術語「聚醣」係指多醣、寡醣或單醣。聚醣可為醣殘基之單體或聚合物且可為直鏈或具支鏈。聚醣可包含天然醣殘基(例如葡萄醣、N-乙醯基葡醣胺、N-乙醯基神經胺酸、半乳醣、甘露醣、岩藻醣、己醣、阿拉伯醣、核醣、木醣等)及/或改質醣(例如2'-氟核醣、2'-去氧核醣、磷酸甘露醣、6'硫N-乙醯基葡醣胺等)。聚醣在本文中亦用於係指醣偶聯物(例如醣蛋白、醣脂、醣肽、醣蛋白質組、肽多醣、脂多醣或蛋白聚醣)之碳水化合物部分。聚醣通常僅由單醣之間之O-醣苷鏈接組成。舉例而言，纖維素係由ß-1,4-連接D-葡萄醣構成之聚醣(或更具體而言葡聚醣)，且甲殼質係由ß-1,4-連接N-乙醯基-D-葡醣胺構成之聚醣。聚醣可為單醣殘基之均聚物或異聚物，且可為直鏈或具支鏈。聚醣可發現連接至蛋白質，如在醣蛋白及蛋白聚醣中。其通常發現於細胞之外表面上。O-及N-連接聚醣極常見於真核細胞中，但亦可發現(但較不常見)於原核細胞中。N-連接聚醣發現連接至序列子中天門冬醯胺之R-基團氮(N)。序列子係Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X係除堅果醣外之任一胺基酸。

如本文中所使用，術語「岩藻醣」、「核心岩藻醣」及「核心岩藻醣殘基」可互換使用且係指在α1,6-位連接至N-乙醯基葡醣胺之岩藻醣。

如本文中所使用，術語「岩藻醣基化」係指在Fc之N-聚醣中存在核心岩藻醣，而術語「去岩藻醣基化」係指在Fc之N-聚醣中不存在核心岩藻醣。

如本文中所使用，術語「N-聚醣」、「N-連接聚醣」、「N-連接醣基化」、「Fc聚醣」及「Fc醣基化」可互換使用且係指由連接至含Fc多肽中天門冬醯胺殘基之醯胺氮之N-乙醯基葡醣胺(GlcNAc)連接之N-連接寡醣。術語「含Fc多肽」係指包括Fc區之多肽(例如抗體)。

如本文中所使用，術語「醣基化模式」及「醣基化特徵」可互換使用且係指以酶方式或以化學方式自醣蛋白或抗體釋放且然後(例如)使用LC-HPLC或MALDI-TOF MS及諸如此類分析碳水化合物結構之N-聚醣物質之特徵性「指紋」。例如參見Current Analytical Chemistry，第1卷，第1期(2005)，第28-57頁中之綜述；其全部內容以引用方式併入本文中。

如本文中所使用，術語「醣改造Fc」在本文中使用時係指Fc區上之N-聚醣以酶方式或以化學方式改變或改造。本文所用之術語「Fc醣改造」係指用於製備醣改造Fc之酶或化學製程。改造之方法實例闡述於(例如)Wong等人，USSN12/959,351中，其內容以引用方式併入本文中。在某些實施例中，聚醣可藉由使用內-GlcNACase及岩藻醣苷酶，然後藉由使用內-S突變體及聚醣噁唑啉製得。

本文所用之術語「效應物功能」係指源自抗體Fc區與Fc受體或配體之相互作用之生物化學事件。「效應物功能」實例包括C1q結合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體、BCR)下調。可使用業內已知之各種分析法來分析該等效應物功能。

如本文中所使用，「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指以下細胞毒性形式：其中與存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬球)上之Fc受體(FcR)結合之分泌Ig使該等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合帶抗原靶細胞且隨後利用細胞毒素殺死該靶細胞。抗體「武裝」該等細胞毒性細胞且為該殺死過程絕對所需。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR於造血細胞上之表現匯總於Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)之第464頁表3中。為評估所關注分子之ADCC活性，可實施活體外ADCC分析，例如闡述於美國專利第5,500,362號或美國專利第5,821,337號中者。可用於該等分析之效應細胞包含周邊血單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。另一選擇為或另外，可在活體內(例如在諸如揭示於Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中之動物模型中)評估所關注分子之ADCC活性。

本文所用之術語「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指靶細胞在補體存在下之裂解。經典補體途徑之活化係藉由補體系統之第一補體(Clq)與抗體(適當亞類)之結合來起始，該等抗體結合其同族抗原。為評估補體活化，可實施CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所闡述。

「誘導細胞凋亡」之抗體係誘導計畫性細胞死亡者，如藉由膜聯蛋白V結合、DNA斷裂、細胞收縮、內質網膨脹、細胞斷裂及/或膜囊(稱為凋亡小體)之形成所測定。較佳地，細胞係感染細胞。各種方法可用於評估與細胞凋亡有關之細胞事件。舉例而言，可藉由膜聯蛋白結合量測磷脂醯絲胺酸(PS)異位；可經由DNA解鏈評估DNA斷裂；且可藉由亞二倍體細胞之任何增加評估細胞核/染色質凝集以及DNA斷裂。較佳地，誘導細胞凋亡之抗體係在膜聯蛋白結合分析中相對於未處理細胞產生約2至50倍、較佳地約5至50倍及最佳地約10至50倍之膜聯蛋白結合誘導者。

「嵌合」抗體(免疫球蛋白)中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗體的相應序列相同或同源，而該(等)鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體的相應序列相同或同源；且包含該等抗體之片段，只要其展現期望生物活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文所用之人類化抗體係嵌合抗體之子組。

「人類化」形式之非人類(例如鼠類)抗體係含有最少量源自非人類免疫球蛋白之序列之嵌合抗體。在極大程度上，人類化抗體係如下人類免疫球蛋白(接受者或受體抗體)：其中接受者之超變區殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之超變區(供體抗體)之具有期望特異性、親和力及容量之殘基所代替。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基由相應非人類殘基代替。另外，人類化抗體可包括未在接受者抗體或供體抗體中發現之殘基。作出該等改質以進一步改善抗體性能，例如結合親和力。通常，人類化抗體將包括實質上全部之至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部超變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等超變環，且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等FR區，但FR區可包含改良結合親和力之一或多個胺基酸取代。FR中之該等胺基酸取代之數量通常在H鏈中不超過6，且在L鏈中不超過3。人類化抗體視情況亦包括通常人類免疫球蛋白之免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分。其他細節參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

治療「(treating或treatment)」或「緩解」係指治療性治療及預防性(prophylactic或preventative)措施；其中目標係預防或減緩(減弱)靶定病理學病狀或病症。彼等需要治療者包含彼等已患有病症者以及彼等易於患有病症者或彼等擬預防病症者。若在接受治療量之本發明方法之抗體之後，患者展示下列情形中之一或多者之可觀察及/或可量測減小或不存在，則個體或哺乳動物成功「治療」感染：減小感染細胞數量或不存在感染細胞；減小總感染細胞之百分比；及/或減輕(至一定程度)一或多種與特定感染有關之症狀；減小發病率及死亡率；及改良生活品質問題。用於評估疾病之成功治療及改良之上述參數可易於藉由醫師熟知之常規程序量測。

與一或多種其他治療劑「組合」投與包含以任一順序同時(並行)及連續投與。

本文所用之「載劑」包含在所用劑量及濃度下對所暴露細胞或哺乳動物無毒之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。通常，生理學上可接受之載劑係pH緩衝水溶液。生理學上可接受之載劑的實例包含緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸，低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包含葡萄醣、甘露醣或糊精；螯合劑，例如EDTA；醣醇，例如甘露醣醇或山梨醣醇；形成鹽之抗衡離子，例如鈉；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS^TM。

術語「醣抗體」係由發明者Dr.Chi-Huey Wong創造，其係指具有結合Fc區之單一均勻醣型之單株抗體(較佳地治療性單株抗體)之均質群體。構成基本上均質群體之個別醣抗體相同，結合相同表位，且含有具有充分定義之聚醣結構及序列之相同Fc聚醣。

在Fc區醣基化特徵背景中之術語「均質」、「均勻」、「均勻地」及「均質性」可互換使用且欲指由一種期望N-聚醣物質代表之單一醣基化模式，其中具有較少或並無痕量前體N-聚醣。在某些實施例中，前體N-聚醣之痕量係小於約2%。

「基本上純」蛋白質意指基於組合物之總重量包括至少約90重量%(包含(例如)至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99重量%)之蛋白質之組合物。

「基本上均質」蛋白質意指基於組合物之總重量包括至少約98重量%之蛋白質(包含(例如)至少約98.5%、至少約99%)之組合物。在某些實施例中，蛋白質係抗體、結構變體及/或其抗原結合片段。

如本文中所使用，術語「IgG」、「IgG分子」、「單株抗體」、「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白分子」可互換使用。

如本文中所使用，術語「Fc受體」或「FcR」闡述結合抗體之Fc區之受體。較佳FcR係原始序列人類FcR。另外，較佳FcR係結合IgG抗體者(γ受體)且包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)亞類之受體，包含該等受體之對偶基因變體及選擇性剪接形式。FcγRII受體包含FcγRIIA(「活化型受體」)及FcγRIIB(「抑制型受體」)，二者具有類似胺基酸序列，其主要差異在於其胞質結構域上。活化型受體FcγRIIA在其胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγRIIB在其胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)。(參見M.in Daëron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中之綜述)。在Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中對FcR進行綜述。本文之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包含彼等欲在將來鑑別者。該術語亦包含新生兒受體(FcRn)，該受體負責將母體IgG轉移至胎兒體內(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。

如本文中所使用，術語「抗原」定義為任一能夠誘發免疫反應之物質。如本文中所使用，術語「抗原特異性」係指特定抗原或抗原片段之供應產生特異性細胞增殖之細胞群體之性質。

如本文中所使用，術語「免疫原性」係指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫反應之能力。

如本文中所使用，術語「表位」定義為抗原分子中接觸抗體之抗原結合位點或T細胞受體之部分。

如本文中所使用，術語「特異性結合」係指結合對(例如抗體及抗原)之間之相互作用。在各種情況下，特異性結合可體現為親和力常數為約10^-6莫耳/公升、約10^-7莫耳/公升或約10^-8莫耳/公升或更小。

「分離」抗體係已經鑒定並自其天然環境組份中分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染組份係會干擾抗體之研究、診斷或治療用途之材料，且可包含酶、激素及其他蛋白質性溶質或非蛋白質性溶質。

本文所用之片語「實質上類似」、「實質上相同」、「等效」或「實質上等效」表示兩個數值(例如一個值與分子有關且另一者與參考/對比分子有關)之間具有足夠高相似度，從而熟習此項技術者會認為該兩個值之間之差異在藉由該等值(例如Kd值、抗病毒效應等)所量測生物特性之背景下具有較少或不具有生物及/或統計學顯著性。該兩個值之間之差異係(例如)小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%及/或小於約10%，其隨參考/對比分子之值而變化。

本文所用之片語「實質上減少」或「實質上不同」表示兩個數值(通常一個值與分子有關且另一值與參考/對比分子有關)之間具有足夠高差異度，從而熟習此項技術者會認為該兩個值之間之差異在藉由該等值(例如Kd值)所量測生物學特性之背景下具有統計學顯著性。該兩個值之間之差異係(例如)大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%及/或大於約50%，其隨參考/對比分子之值而變化。

「結合親和力」通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間之非共價相互作用的總強度。除非另外指示，否則本文所用之「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對之成員(例如抗體及抗原)之間之1：1相互作用。分子X對於其配偶體Y之親和力通常可表示為解離常數(Kd)。可藉由業內已知之常用方法(包含彼等闡述於本文中者)來量測親和力。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原且往往易於解離，而高親和力抗體通常較快結合抗原且往往較長時間保持結合。多種量測結合親和力之方法為業內已知，其任一者皆可用於本發明目的。具體闡釋性實施例闡述於下文中。

抗體之「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈之胺基末端結構域。該等結構域通常係抗體之最可變部分且含有抗原結合位點。

術語「可變」係指如下事實：在抗體之間可變結構域的某些部分於序列上存在廣泛差異且可用於實現每一特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。然而，可變性在整個抗體可變結構域中並非均勻分佈。在輕鏈及重鏈可變結構域二者中該可變性均集中在三個稱為互補決定區(CDR)或超變區之區段上。可變結構域之保守程度較高之部分稱為框架(FR)。原始重鏈及輕鏈之可變結構域各自包括4個由三個CDR連結之主要採用β薄片構形的FR區，該等CDR形成連結且在一些情形下形成β薄片結構之一部分的環。每一鏈中之CDR藉助FR區保持緊密靠近，且與來自另一鏈之CDR一起促進形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，Md(1991))。恆定結構域並不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應物功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。

抗體之木瓜酶消化產生兩個相同抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自具有單一抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其易於結晶之能力。經胃蛋白酶處理產生F(ab’)2片段，該片段具有兩個抗原組合位點且仍然能夠交聯抗原。

「Fv」係含有完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。在雙鏈Fv物質中，此區域係由一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域之緊密非共價結合二聚體組成。在單鏈Fv物質中，一個重鏈可變結構域及一個輕鏈可變結構域可藉由柔性肽連接體共價連接，從而該等輕鏈及重鏈可以與雙鏈Fv物質中類似之「二聚體」結構來締合。每一可變結構域之3個CDR以此構形相互作用以界定VH-VL二聚體之表面上之抗原結合位點。六個CDR共同賦予了該抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或Fv之一半，其僅包括三個對抗原具有特異性之CDR)亦具有識別並結合抗原之能力，但其親和力低於完整結合位點。

Fab片段亦含有輕鏈恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在重鏈CH1結構域之羧基末端添加幾個殘基，包含一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。在本文中，Fab'-SH係恆定結構域中之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab'之名稱。F(ab')2抗體片段最初係作為在其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。

根據恆定結構域之胺基酸序列，可將來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」指定為兩種完全不同類型(稱為卡帕(κ)及蘭布達(λ))中之一種。

端視抗體(免疫球蛋白)重鏈中恆定結構域之胺基酸序列，可將抗體(免疫球蛋白)指定為不同種類。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干可進一步分成子類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同種類之免疫球蛋白之亞單位結構及三維構形已眾所周知且通常闡述於(例如)Abbas等人，Cellular及Mol.Immunology，第4版(2000)中。抗體可為較大融合分子之一部分，其係藉由抗體與一或多種其他蛋白質或肽之共價或非共價締合來形成。

術語「全長抗體」、「完整抗體」與「全抗體」在本文中可互換使用，其係指呈實質上完整形式之抗體，且不為如下文所定義之抗體片段。該等術語尤其係指重鏈含有Fc區之抗體。

「抗體片段」僅包括完整抗體之一部分，其中該部分保留至少一種及(至多)大部分或所有通常在存在於完整抗體中時與該部分有關之功能。在一實施例中，抗體片段包括完整抗體之抗原結合位點且由此保留結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段(例如包括Fc區者)在存在於完整抗體中時保留通常與Fc區有關之至少一種生物功能，例如FcRn結合、抗體半衰期調變、ADCC功能及補體結合。在一實施例中，抗體片段係活體內半衰期實質上類似於完整抗體之單價抗體。舉例而言，此一抗體片段可包括連接至能賦予片段活體內穩定性之Fc序列的抗原結合臂。

本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體(亦即，構成該群體之個別抗體除了可能少量存在之可能天然突變外，其餘均相同)獲得之抗體。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵並非個別抗體之混合物。該單株抗體通常包括一種包含會結合靶之多肽序列之抗體，其中該靶結合多肽序列係藉由一種包含自多個多肽序列選擇單一靶結合多肽序列之方法獲得。舉例而言，選拔方法可為自多個純系(例如一組集合之雜交瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系)選拔一個獨特純系。應理解，可進一步改變所選之靶結合序列，以例如改良對靶之親和力、人類化該靶結合序列、改良其在細胞培養中之生產、降低其活體內免疫原性、產生多特異性抗體，等等，且該包括改變之靶結合序列之抗體亦係本發明之單株抗體。與通常包含針對不同決定基(表位)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體係針對抗原上之單一決定基。除特異性外，單株抗體製劑之優勢在於其通常未經其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特徵係自實質上均質之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任一特定方法來產生該抗體。舉例而言，擬用於本發明之單株抗體可由各種技術製得，包括例如雜交瘤方法(例如Kohler等人，Nature,256：495(1975)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)、噬菌體展示技術(參見例如Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))，及用於在具有一部分或所有編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因之動物中產生人類或人類樣抗體之技術(參見例如WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；WO91/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號；Marks等人，Bio.Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison,Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14：826(1996)及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。

具體而言，本文之單株抗體包含「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗體的相應序列相同或同源，而該(等)鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體的相應序列相同或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現期望生物學活性即可(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。

亦參見下列綜述文件及其中所引用之參考文獻：Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。

本文所用之術語「超變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變結構域中序列超變及/或結構上形成所定義環之區域。通常，抗體包括6個超變區；3個位於VH中(H1、H2、H3)，且3個位於VL中(L1、L2、 L3)。本文使用且涵蓋多個超變區之描述。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且使用最為廣泛(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia係指結構環之位置(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM超變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷方案且用於Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體中。「接觸」超變區係基於對可獲得複雜晶體結構之分析。來自該等超變區中每一者之殘基如下所述。

Loop Kabat AbM Chothia Contact

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Kabat編號)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Chothia編號)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

超變區可包括如下「經延伸超變區」：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56或50-56或49-56(L2)及89-97或89-96(L3)以及VH中之26-35(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。對於該等定義中之每一者，根據Kabat等人(見上文)對可變結構域殘基編號。

「框架」或「FR」殘基係彼等除如本文所定義超變區殘基外之可變結構域殘基。

術語「依Kabat中之可變結構域殘基編號」或「依Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中用於抗體編譯之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有較少或額外之對應於可變結構域FR或HVR之縮短或插入之胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可包含在H2之殘基52後之單胺基酸插入(根據Kabat編號之殘基52a)及重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如，根據Kabat編號之殘基82a、82b及82c等)。可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定所指定抗體殘基之Kabat編號。

單鏈「Fv」或「scFv」抗體片段包括抗體之VH及VL結構域，其中該等結構域係以單一多肽鏈存在。通常，scFv多肽進一步包括VH結構域與VL結構域之間之多肽連接體，其使得scFv能夠形成用於結合抗原之期望結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。

術語「雙價抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包括在同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變結構域(VL)連結之重鏈可變結構域(VH)。藉由使用過短而不容許在同一鏈上之兩個結構域之間配對之連接體，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙價抗體更全面地闡述於(例如)EP 404,097；WO93/1161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)中。

「人類抗體」指其擁有之胺基酸序列係對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列及/或係使用如本文所揭示製備人類抗體的任一技術所製備者。此人類抗體之定義明確排除包括非人類抗原結合殘基之人類化抗體。

「親和力成熟」抗體係在其一或多個HVR中存在一或多處改變之抗體，該等改變之結果會使該等抗體比沒有彼等改變之親代抗體更改良對抗原之親和力。在一實施例中，親和力成熟抗體對靶抗原具有毫微莫耳或甚至皮莫耳親和力。親和力成熟抗體係藉由業內已知程序產生。Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)闡述藉由VH及VL結構域改組達成親和力成熟。CDR及/或框架殘基之隨機突變誘發闡述於以下文獻中：Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。

「阻斷性」抗體或「拮抗劑」抗體係抑制或降低所結合抗原之生物活性的抗體。某些阻斷性抗體或拮抗劑抗體實質上或完全地抑制抗原之生物活性。

本文所用之「激動劑抗體」係模擬所關注多肽之功能活性中之至少一者的抗體。

「病症」係任一受益於本發明抗體之治療之病狀。此包含慢性及急性病症或疾病，包含使哺乳動物易患所討論病症之彼等病理學病狀。本文擬治療病症之非限制性實例包含癌症。

術語「細胞增殖性病症」及「增殖性病症」係指與一定程度之異常細胞增殖有關之病症。在一實施例中，細胞增殖性病症係癌症。

本文所用之「腫瘤」係指所有腫瘤性細胞生長及增殖(無論係惡性的抑還係良性的)以及所有癌前期及癌性細胞及組織。本文中所提及之術語「癌症」、「癌性」、「細胞增殖性病症」、「增殖性病症」及「腫瘤」並不相互排斥。

術語「癌症」及「癌性」通常係指或闡述哺乳動物之特徵通常在於細胞生長/增殖失調之生理學病狀。癌症之實例包含但不限於癌瘤、淋巴瘤(例如何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))、母細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定實例包含鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌瘤、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌瘤、唾液腺癌瘤、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌瘤、白血病及其他淋巴組織增殖性病症及各種類型之頭頸癌。

如本文中所使用，術語「抗原」定義為任一能夠誘發免疫反應之物質。

如本文中所使用，術語「抗原特異性」係指供應特定抗原或抗原片段造成特異性細胞增殖之一種細胞群體之性質。

如本文中所使用，「治療」係指試圖改變所治療個體或細胞之自然過程之臨床介入，且可用於預防或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包含防止疾病發生或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理結果、防止或降低發炎及/或組織/器官損害、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態，及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病或病症之發生。

「個體(individual或subject)」係脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物係哺乳動物。哺乳動物包含(但不限於)農場動物(例如牛)、運動動物、寵物(例如貓、狗及馬)、靈長類動物、小鼠及大鼠。在某些實施例中，脊椎動物係人類。

用於治療目的之「哺乳動物」係指任何歸類為哺乳動物之動物，包含人類、家畜及農場動物，以及動物園動物、運動動物或寵物(例如狗、馬、貓、牛等)。在某些實施例中，哺乳動物係人類。

「有效量」係指在所需劑量及時間段內有效達成期望治療或預防結果之量。

本發明之物質/分子之「治療有效量」可根據諸如以下因素而變化：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及物質/分子於該個體內引發期望反應之能力。治療有效量亦為物質/分子之治療有益效應勝過其任何毒性或有害效應的量。「預防有效量」係指在所需劑量及時間段內有效達成期望預防結果之量。通常(但未必)，因預防劑量係在患病之前或患病早期用於個體中，故預防有效量會小於治療有效量。

本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包含放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素)；化學治療劑(例如胺甲蝶呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；及毒素，例如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包含其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑闡述於下文中。殺腫瘤劑引起腫瘤細胞破壞。

「化學治療劑」係可用於治療癌症之化學化合物。化學治療劑之實例包含烷基化劑，例如噻替哌(thiotepa)及CYTOXAN®(環磷醯胺(cyclosphosphamide))；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮雜環丙烷，例如苯得哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)及烏得哌 (uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包含六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基嘧胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基嘧胺；多聚乙醯(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)、MARINOL®)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸；喜樹鹼(camptothecin)(包含合成類似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、莨菪素及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利司他汀(callystatin)；CC-1065(包含其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包含合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥膽甾醇酯(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI 1(例如參見Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；達內黴素(dynemicin)，包含達內黴素A；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素發色團 (neocarzinostatin chromophore)及有關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素(bleomycin)、放線菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺基、ADRIAMYCIN®多柔比星(包含嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星及去氧阿黴素)、泛艾黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycm)、絲裂黴素(例如絲裂黴素C)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波弗黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑，例如胺甲蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、胺甲蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-阿紮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿醣胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺醣苷；胺基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯特布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elfornithine)；依利乙銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣；氯尼達明(lonidamine)；類美坦辛(maytansinoids)，例如美坦辛(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；美得眠(mopidanmol)；硝基胺；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌索(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿醣胞苷(arabinoside)(「Ara-C」)；噻替哌(thiotepa)；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL®)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、太平洋紫杉醇之無克列莫佛(Cremophor)、經白蛋白改造之奈米顆粒調配物(ABRAXANE^TM)(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)及多西紫杉醇(doxetaxel)(TAXOTERE®)(Rhône-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR®)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；胺甲蝶昤；鉑類似物，例如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(VELBAN®)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(ONCOVIN®)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；醛氫葉酸；長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE®)；諾肖林(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)(XELODA®)；上述藥劑中任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物；以及上述藥劑中之兩者或更多者之組合，例如環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及潑尼松龍(prednisolone)之組合療法之縮寫CHOP及利用與5-FU及醛氫葉酸組合之奧沙利鉑(ELOXATIN^TM)之治療方案的縮寫FOLFOX。

如本文中所使用，「治療」係指試圖改變所治療個體或細胞之自然過程之臨床介入，且可用於預防或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包含防止疾病發生或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理結果、防止或降低發炎及/或組織/器官損害、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病或病症之發生。

本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包含放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素)；化學治療劑(例如胺甲蝶呤、阿黴素、長春花生物鹼(長春新鹼、長春鹼、依託泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、道諾黴素或其他嵌入劑)；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；及毒素，例如來自細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包含其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑闡述於下文中。殺腫瘤劑引起腫瘤細胞破壞。

醣抗體

自培養物中之哺乳動物細胞所產生重組蛋白之醣基化係確保有效使用治療抗體之重要過程(Goochee等人，1991；Jenkins及Curling,1994)。哺乳動物細胞培養遞送並不皆具有相同性質之醣基化模式之異質混合物。該等醣基化模式可影響諸如治療性蛋白質之安全性、功效及血清半衰期等性質。已藉由研發新穎種類之單株抗體(稱為「醣抗體」)來成功解決醣型異質性問題。

術語「醣抗體」係由發明者Dr.Chi-Huey Wong創造，其係指在Fc上具有單一均勻醣型之單株抗體(較佳地治療性單株抗體)之均質群體。構成均質群體之個別醣抗體相同，結合相同表位，且含有具有充分定義之聚醣結構及序列之相同Fc聚醣。

可自在細胞中產生之單株抗體、較佳地治療性單株抗體生成醣抗體。醣抗體可市面有售或處於研發中。用於治療性應用之單株抗體可為人類化、人類或嵌合單株抗體。用於治療應用之經批准單株抗體之實例包含但不限於莫羅單抗(Muromomab)、阿昔單抗(Abciximab)、利妥昔單抗(Rituximab)、達克珠單抗(Daclizumab)、巴利昔單抗(Basiliximab)、帕利珠單抗(Palivizumab)、英夫利昔單抗、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、依那西普、吉姆單抗(Gemtuzumab)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、伊布莫單抗(Ibritomomab)、阿達木單抗、阿來塞普(Alefacept)、奧馬珠單抗(Omalizumab)、依法珠單抗(Efalizumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、貝伐珠單抗(Bevacizumab)、那他珠單抗(Natalizumab)、蘭尼單抗(Ranibizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、艾庫珠單抗(Eculizumab)及賽妥珠單抗。

本文闡述藉由Fc醣改造衍生自治療性單株抗體之功能活性醣抗體。具有最佳化醣型之醣抗體與治療性單株抗體相比展現類似或較佳之活性。具有最佳化醣型之醣抗體預計可提供用於治療性應用之替代方式。

抗TNFα醣抗體

單核球及巨噬球因應於內毒素或其他刺激分泌稱為腫瘤壞死因子-α(TNFα)及腫瘤壞死因子-β(TNFβ)之細胞介素。TNFα係17kD蛋白質亞單位之可溶性同源三聚體(Smith，等人，J.Biol.Chem.262：6951-6954(1987))。亦存在膜結合26kD前體形式之TNF(Kriegler等人，Cell 53：45-53(1988))。TNF-α係發炎性反應之強力誘導劑，係先天免疫性之關鍵調控劑且在調控針對細胞內細菌及某些病毒感染之Th1免疫反應中發揮重要作用。然而，失調TNF亦可有助於諸多病理學情況。該等病理性情況包含免疫介導之發炎性疾病(IMID)，包含類風濕性關節炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、潰瘍性結腸炎及嚴重慢性斑塊狀牛皮癬。

本揭示內容描述新穎種類之抗TNFα單株抗體，稱為「抗TNFα醣抗體」(「抗TNFα GAb」)。抗TNFα醣抗體可自抗TNFα單株抗體(「親代抗體」)由Fc醣改造生成。本文所用之術語「親代抗體」係指用於產生抗TNFα醣抗體之抗TNFα單株抗體。構成均質群體之個別抗TNFα醣抗體相同且含有具有充分定義之聚醣結構及序列之相同Fc聚醣。本發明之抗TNFα醣抗體可結合人類TNFα抗原之相同表位作為其親代抗體。

親代抗體可在諸如哺乳動物細胞、嗜甲醇酵母菌或昆蟲細胞等細胞中產生。較佳地，親代抗體係在哺乳動物細胞中產生。親代抗體可為FDA批准或正處於研發中。經批准或處於研發中之抗TNFα單株抗體包含英夫利昔單抗、阿達木單抗、戈利木單抗(Golimumab)、CDP870(賽妥珠單抗)、TNF-TeAb及CDP571。

本發明之抗TNFα醣抗體可包括具有SEQ ID NO：1中所陳述胺基酸序列之重鏈及具有SEQ ID NO：2中所陳述胺基酸序列之輕鏈。本發明之抗TNFα醣抗體可包括阿達木單抗(Humira®)之輕鏈序列及重鏈序列。

下表1展示阿達木單抗之重鏈及輕鏈序列

如本文所闡述，N-聚醣可連接至Fc區之Asn-297。

本發明之N-聚醣具有Man₃GlcNAc₂之共有五醣核心，其亦稱為「三甘露醣核心」或「五醣核心」，其中「Man」係指甘露醣，「Glc」係指葡萄醣，「NAc」係指N-乙醯基，且GlcNAc係指N-乙醯基葡醣胺。

本文所闡述之N-聚醣可具有雙觸角結構。

N-聚醣可具有鏈內取代，包括「二等分(bisecting)」GlcNAc。在聚醣於三甘露醣核心上包括二等分GlcNAc時，該結構表示為Man₃GlcNAc₃。在聚醣包括連接至三甘露醣核心之核心岩藻醣時，該結構表示為Man₃GlcNAc₂(F)。N-聚醣可包括一或多個末端唾液酸(例如N-乙醯基神經胺酸)。表示為「Sia」之結構係指末端唾液酸。唾液酸化可發生於雙觸角結構之α1-3或α1-6臂上。

本文所闡述之N-聚醣可包括至少一個α2-6末端唾液酸。在一些實施例中，N-聚醣包括一個α2-6末端唾液酸。在一較佳實施例中，N-聚醣包括兩個α2-6末端唾液酸。

N-聚醣可包括至少一個α2-3末端唾液酸。在某些實施例中，N-聚醣包括一個α2-3末端唾液酸。在一較佳實施例中，N-聚醣包括兩個α2-3末端唾液酸。

N-聚醣可包括至少一種半乳醣。在某些實施例中，N-聚醣包括一種半乳醣。在一較佳實施例中，N-聚醣包括兩種半乳醣。

N-聚醣可發生岩藻醣基化或去岩藻醣基化。較佳地，N-聚醣發生岩藻醣基化。

表2列示抗TNFα醣抗體中之實例性N-聚醣。本揭示內容實施例可包含或不包含本文所列示之任一N-聚醣。

實例性抗TNFα醣抗體之製備

本發明之抗TNFα醣抗體可自抗TNFα單株抗體(「親代抗體」)由Fc醣改造產生。在一些實施例中，親代抗體係阿達木單抗(Humira®)。

本發明方法中之單株抗體可為抗TNFα單株抗體。在一些實施例中，抗TNFα單株抗體係阿達木單抗、英夫利昔單抗或依那西普。

本發明方法中所使用之醣苷內切酶可為EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS或其變體。

在本發明方法中，藉由向GlcNAc中添加碳水化合物部分以延伸醣鏈來實施步驟(b)中使用轉醣苷酶之後續酶介導之醣基化。轉醣苷酶之實例包含(但不限於)EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS及其變體。

業內眾所周知，使用醣噁唑啉作為醣供體進行醣基化可用於合成寡醣，因為醣基化反應係加成反應且其進行並不伴隨任何酸、水或諸如此類之去除(Fujita等人，Biochim.Biophys.Acta 2001,1528,9-14)。

在一些實施例中，碳水化合物部分係醣噁唑啉。

本文所述者亦包含製備去岩藻醣基化醣抗體之改良方法，該方法包括以下步驟：(a)使單株抗體與α-岩藻醣苷酶及至少一種醣苷內切酶接觸，由此得到在Fc上具有單醣(GlcNAc)之抗體，及(b)在適宜條件下將碳水化合物部分添加至GlcNAc中。

本發明改良方法中之單株抗體可為抗TNFα單株抗體。在一些實施例中，抗TNFα單株抗體係阿達木單抗。

本發明改良方法之α-岩藻醣苷酶包括含有與SEQ ID NO：5之序列具有至少85%一致性之胺基酸序列之多肽、其功能變體。

α-岩藻醣苷酶可包括含有與SEQ ID NO：5之序列(列示於表3中)具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之多肽、其變體或片段。在某些實施例中，α-岩藻醣苷酶係重組類桿菌α-岩藻醣苷酶。

應理解，本發明之α-岩藻醣苷酶之多肽可進行衍生或改質以有助於其分離或純化。因此，在本發明之一實施例中，藉由添加能夠直接及特異性結合分離構件之配體來衍生或改質用於本發明之多肽。另一選擇為，藉由添加結合對之一個成員來衍生或改質多肽且分離構件包括藉由添加結合對之另一成員來衍生或改質之試劑。可使用任何適宜結合對。在藉由添加結合對之一個成員來衍生或改質用於本發明之多肽之一較佳實施例中，多肽較佳地加組胺酸標籤或加生物素標籤。通常，在基因層面上包含組胺酸或生物素標籤之胺基酸編碼序列且蛋白質重組表現於大腸桿菌(E.coli.)中。組胺酸或生物素標籤通常存在於多肽之一端(在N-末端或C-末端處)。組胺酸標籤通常係由6個組胺酸殘基組成，但其可長於此長度(通常長達7、8、9、10或20個胺基酸)或較短(例如5、4、3、2或1個胺基酸)。另外，組胺酸標籤可含有一或多種胺基酸取代、較佳地如上文所定義之保守取代。

如本文所闡述之變體多肽係彼等胺基酸序列自SEQ ID NO：5中之胺基酸序列有所變化者，但與包括具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列之多肽之酶展現相同或類似功能。

如本文中所使用，關於序列之序列一致性百分比(%)定義為在比對序列且引入間隙(若需要)以達成最大百分比序列之後，候選多肽序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基之一致性百分比。出於確定序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之多種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包含在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。

本發明之一些較佳實施例顯示於實例中。

醫藥組合物及調配物

在製備如本文所闡述之抗TNFα GAb之後，可產生「預凍乾調配物」。用於製備調配物之抗TNFα GAb較佳地基本上純且期望地基本上均質(亦即不含污染蛋白質等)。「基本上純」蛋白質意指基於組合物之總重量包括至少約90重量%蛋白質、較佳地至少約95重量%之組合物。「基本上均質」蛋白質意指基於組合物之總重量包括至少約99重量%蛋白質之組合物。在某些實施例中，蛋白質係抗體。

考慮期望劑量體積、投與模式等來確定預凍乾調配物中之抗TNFα GAb量。在所選蛋白質係完整抗體(全長抗體)之情形下，約2mg/mL至約50mg/mL、較佳地約5mg/mL至約40mg/mL及最佳地約20-30mg/mL係實例性起始蛋白質濃度。蛋白質通常存在於溶液中。舉例而言，蛋白質可存在於pH為約4-8及較佳地約5-7之pH緩衝溶液中。實例性緩衝劑包含組胺酸、磷酸鹽、Tris、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽及其他有機酸。緩衝劑濃度可為約1mM至約20mM或約3mM至約15mM，此端視(例如)緩衝劑及調配物(例如復原調配物)之期望等滲性而定。較佳緩衝劑係組胺酸，其中如下文所顯示此可具有凍乾保護性質。經證實，琥珀酸鹽為另一有用緩衝劑。

將凍乾保護劑添加至預凍乾調配物中。在較佳實施例中，凍乾保護劑係非還原醣，例如蔗醣或海藻醣。預凍乾調配物中凍乾保護劑之量通常應使得在復原後所得調配物等滲。然而，高滲復原調配物亦可適宜。此外，凍乾保護劑之量不應過低而使蛋白質在凍乾後發生不可接受之程度的降解/聚集。在凍乾保護劑係醣(例如蔗醣或海藻醣)且蛋白質係抗體之情形下，預凍乾調配物中之實例性凍乾保護劑濃度為約10mM至約400mM及較佳地約30mM至約300mM及最佳地約50mM至約100mM。

選擇用於每一蛋白質及凍乾保護劑之蛋白質對凍乾保護劑之組合比率。在使用抗體作為所選蛋白質且使用醣(例如蔗醣或海藻醣)作為凍乾保護劑以用於生成具有高蛋白質濃度之等滲復原調配物之情形下，凍乾保護劑對抗體之莫耳比率可為約100莫耳至約1500莫耳凍乾保護劑對1莫耳抗體及較佳地約200莫耳至約1000莫耳凍乾保護劑對1莫耳抗體、例如約200莫耳至約600莫耳凍乾保護劑對1莫耳抗體。

在本發明之較佳實施例中，已發現期望將表面活性劑添加至預凍乾調配物中。另一選擇為，或此外，可將表面活性劑添加至凍乾調配物及/或復原調配物中。實例性表面活性劑包含非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)；曲拉通(Triton)；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基醣苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻油基-或硬脂醯基-磺基甜菜鹼；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻油基-或硬脂醯基-肌胺酸；亞麻油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯胺基丙基-、椰子醯胺基丙基-、亞麻油醯胺基丙基-、肉豆蔻醯胺基丙基-、棕櫚油醯胺基丙基-或異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼(例如月桂醯胺基丙基)；肉豆蔻醯胺基丙基-、棕櫚油醯胺基丙基-或異硬脂醯胺基丙基-二甲胺；甲基椰油基牛黃酸鈉或甲基油基牛磺酸二鈉；及MONAQUAT系列(Mona Industries公司，Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇與丙二醇之共聚物(例如Pluronics、PF68等)。所添加表面活性劑之量應可減少復原蛋白質之聚集並使在復原後微粒之形成最小化。舉例而言，表面活性劑可以約0.001-0.5%及較佳地約0.005-0.05%之量存在於預凍乾調配物中。

在本發明之某些實施例中，在製備預凍乾調配物時使用凍乾保護劑(例如蔗醣或海藻醣)及增積劑(例如甘露醇或甘胺酸)之混合物。增積劑可使得產生均勻凍乾餅狀物且其中並無過量氣穴等。

其他醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(例如彼等闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中者)可包含於預凍乾調配物(及/或凍乾調配物及/或復原調配物)中，前提係其不會不利地影響調配物之期望特性。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒且包含：額外緩衝劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包含抗壞血酸及甲硫胺酸；螯合劑，例如EDTA；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；生物可降解聚合物，例如聚酯；及/或成鹽抗衡離子，例如鈉。

本文所闡述之醫藥組合物及調配物較佳地較為穩定。「穩定」調配物/組合物係以下物質：其中抗體在儲存後基本上保持其物理及化學穩定性及完整性。用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術在業內可獲得且綜述於Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee編輯，Marcel Dekker公司，New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中。可於所選時間段之所選溫度下量測穩定性。

用於活體內投與之調配物必須無菌。此易於藉由過濾經由無菌過濾膜在凍乾及復原之前或之後達成。另一選擇為，舉例而言，可藉由在約120℃下對除蛋白質外之成份實施高壓滅菌約30分鐘來達成整個混合物之無菌性。

在將蛋白質、凍乾保護劑及其他可選組份混合至一起之後，將調配物凍乾。許多不同凍乾劑可用於此目的，例如Hull50®(Hull,USA)或GT20®(Leybold-Heraeus,Germany)凍乾劑。冷凍-乾燥係藉由冷凍調配物且隨後使來自冷凍內容物之冰在適於初級乾燥之溫度下昇華來達成。在此條件下，產物溫度低於調配物之共熔點或陷縮溫度。通常，在通常介於約50毫托至250毫托之間之適宜壓力下，用於初級乾燥之擱板溫度將介於約-30℃至25℃之間(前提係產物在初級乾燥期間保持冷凍)。容納試樣之容器(例如玻璃小瓶)之調配物、大小及類型以及液體體積主要取決於乾燥所需之時間，其可介於幾小時至數天(例如40-60hr)之間。二級乾燥階段可在約0-40℃下實施，其主要取決於容器之類型及大小及所採用蛋白質之類型。然而，在本文中發現，二級乾燥步驟可能未必需要。舉例而言，凍乾之整個除水期中之擱板溫度可介於約15℃-30℃(例如約20℃)之間。二級乾燥所需之時間及壓力將使得產生適宜凍乾餅狀物，此端視(例如)溫度及其他參數而定。二級乾燥時間取決於產物中之期望殘餘水分含量，且通常持續至少約5小時(例如10-15小時)。壓力可與初級乾燥步驟期間所採用之壓力相同。冷凍-乾燥條件可端視調配物及小瓶大小而變化。

在一些情況下，可期望在容器中凍乾蛋白質調配物，其中復原蛋白質以避免轉移步驟。此情況下之容器可為(例如)3、5、10、20、50或100cc小瓶。作為一般主張，凍乾將得到凍乾調配物，其中其水分含量小於約5%及較佳地小於約3%。

在期望階段、通常在向患者投與蛋白質時，可使用稀釋劑復原凍乾調配物，從而復原調配物中之蛋白質濃度為至少50mg/mL、例如約50mg/mL至約400mg/mL、更佳地約80mg/mL至約300mg/mL及最佳地約90mg/mL至約150mg/mL。復原調配物中之該等高蛋白質濃度可視為尤其可用於預期皮下遞送復原調配物之情形。然而，對於其他投與途徑(例如靜脈內投與)而言，可能期望復原調配物中之蛋白質濃度較低(例如在復原調配物中約5-50mg/mL或約10-40mg/mL蛋白質)。在某些實施例中，復原調配物中之蛋白質濃度顯著高於預凍乾調配物。舉例而言，復原調配物中之蛋白質濃度可為預凍乾調配物之約2-40倍、較佳地3-10倍及最佳地3-6倍(例如至少三倍或至少四倍)。

此外，本揭示內容亦提供適於單一療法或組合療法之組合醫藥組合物，其包括本文所闡述之實質上均質醣抗體及其他抗體及/或其他治療劑。醫藥組合物可以共同調配物形式投與或以共同投與治療方案使用。

通常在約25℃之溫度下進行復原，以確保完全水合，但可視需要採用其他溫度。復原所需之時間將端視(例如)稀釋劑之類型、賦形劑及蛋白質之量而定。稀釋劑實例包含無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。稀釋劑視情況含有防腐劑。防腐劑實例已在上文中加以闡述，且諸如苄醇或酚醇等芳族醇為較佳防腐劑。藉由評估不同防腐劑濃度與蛋白質及防腐劑功效測試之相容性來決定所採用防腐劑之量。舉例而言，若防腐劑係芳族醇(例如苄醇)，則其可以約0.1%-2.0%及較佳地約0.5%-1.5%但最佳地約1.0%-1.2%之量存在。較佳地，復原調配物具有小於6000個顆粒/小瓶，該等顆粒之大小>10μm。

免疫偶聯物

在另一態樣中，本發明提供免疫偶聯物或抗體-藥物偶聯物(ADC)，其包括偶聯至細胞毒性劑(例如化學治療劑)、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性偶聯物)之抗體。

使用抗體-藥物偶聯物局部遞送細胞毒性劑或細胞生長抑制劑(亦即在癌症治療中殺死或抑制腫瘤細胞之藥物)(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；美國專利第4,975,278號)容許藥物部分體靶向遞送至腫瘤且累積在細胞內，而全身性投與該等未偶聯藥物藥劑則可能對正常細胞及欲消除之腫瘤細胞產生不可接受程度之毒性(Baldwin等人(1986)Lancet(Mar.15,1986)：第603-05頁；Thorpe,(1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編輯)，第475-506頁)。由此尋求具有最小毒性之最大功效。已報導多株抗體及單株抗體二者均可用於該等策略中(Rowland等人(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21：183-87)。該等方法中所使用之藥物包含道諾黴素、多柔比星、胺甲喋呤及長春地辛(Rowland等人(1986)，見上文)。抗體-毒素偶聯物中所使用之毒素包含細菌毒素(例如白喉毒素(diphtheria toxin))、植物毒素(例如蓖麻毒素)、小分子毒素(例如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、類美登素(maytansinoid)(EP 1391213；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623))及卡奇黴素(calicheamicin)(Lode等人(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可藉由包含微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來實現其細胞毒性及細胞生長抑制效應。當偶聯至大抗體或蛋白質受體配體時，一些細胞毒性藥物傾向為無活性或具有較小活性。

抗體衍生物

可進一步改質本發明抗體以含有業內已知且易於獲得之其他非蛋白質性部分。在一實施例中，適於衍生抗體之部分係水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包含但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。連接至抗體之聚合物的數量可有所變化，且若連接一個以上之聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。通常，用於衍生之聚合物之數量及/或類型可基於包含但不限於以下在內之考慮因素來確定：欲改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。

在另一實施例中，提供抗體與非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.102：11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長，且包含但不限於如下波長之輻射：其不會危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至可將毗鄰抗體-非蛋白質性部分之細胞殺死的溫度。

治療應用

自體免疫性病症係重大且廣泛之醫學問題。舉例而言，類風濕性關節炎(RA)係在美國影響200萬以上人之自體免疫性疾病。RA引起關節之慢性發炎且通常係可引起關節破壞及功能失能之進展性病況。類風濕性關節炎之病因未知，但基因誘因、感染劑及環境因素皆與疾病之病因有關。在活動性RA中，症狀可包含疲乏、食欲缺乏、低熱、肌肉及關節疼痛與僵硬。另外，在疾病發作期間，因滑膜發炎，關節通常變得發紅、腫脹、疼痛及觸痛。另外，因RA係全身性疾病，故發炎可影響身體中除關節外之器官及區域，包含眼睛及口腔之腺、肺內襯、心包及血管。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)係藉由諸多細胞類型(包含單核球及巨噬球)產生之細胞介素，其最初係基於其誘導某些小鼠腫瘤之壞死之能力來鑑別。隨後，稱為惡病質素之因子(與惡病質有關)展示與TNF-α相同。TNF-α與諸多其他人類疾病及病症(包含休克、敗血症、感染、自體免疫性疾病、RA、克羅恩氏病、移植排斥及移植物抗宿主病)之病理生理學有關。

本揭示內容提供治療人類之TNF介導之發炎性疾病之方法，該方法包括向有需要之人類投與發炎有效量之實例性抗TNFα醣抗體或其抗原結合片段及本文所闡述之其醫藥調配物/組合物。

本發明方法之實例性發炎性疾病可選自以下群：發炎性腸病(包含潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎及幼年型特發性關節炎。

本發明包含下列實例以證明本發明之較佳實施例。彼等熟習此項技術者應瞭解，下列實例中揭示之技術代表本發明者發現在實踐本發明中運行良好之技術，且因此可認為構成其實踐之較佳方式。然而，彼等熟習此項技術者借助於本揭示內容應瞭解，可對所揭示特定實施例作出多種改變且仍獲得相同或類似結果，此並不背離本發明之精神及範圍。

實例 實例1：用於分析抗TNFα之N-醣基化之一般程序

研發質譜方法以藉由施加至醣肽前體之碰撞誘導解離(CID)能量監測寡醣源片段離子(水合氫離子)之產率。水合氫離子之多反應監測(MRM)方法可達成對未來生物類似治療劑之常規品質控制分析之規章性要求。

將5ug阿達木單抗(Humira®)(購自Abbvie)溶於25ul 2M胍-HCl中，且添加二硫蘇醣醇(DTT)至最終濃度為5mM。在110℃培育10分鐘之後，將經還原半胱胺酸殘基在37℃下於10mM碘乙醯胺(IAA)中實施烷基化1小時。添加5mM DTT以在室溫下淬滅過量IAA 10分鐘。將產物在50mM碳酸氫銨中稀釋15次，然後使用旋轉管柱進行微量離心(10kDa蛋白質截留MW)。使用1：25(w/w)之酶：蛋白質比率在37℃下實施胰蛋白酶消化4小時。將試樣在-20℃下冷凍以用於LC-MS/MS分析。

儀器

藉由m/z 204水合氫離子(HexNAc)監測使用具有Aglient 1200 HPLC系統之4000 QTrap三相四極柱質譜儀(AB Sciex)實施醣肽量化。為相對量化醣肽微異質性，在電腦上獲得前體離子m/z，其涵蓋所有可能聚醣組合物，且監測每一前體離子之單一定量轉變(Q3 m/z=204)。

MS數據分析

使用Analyst 1.5(AB Sciex)處理所獲取原始數據。將每一轉變之質量層析圖且藉由峰面積進行量化。針對所有組合組份之總和來計算每一組份之百分比組成。

實例2：實例性抗TNFα GAb之生成 抗TNFα GAb301

藉助PNGase F自阿達木單抗之Fc區完全去除Asn²⁹⁷處之N-連接聚醣，且使用4-12%Bis-Tris NeuPAGE及來自經改質及未改質IgG之胰蛋白酶醣肽之LC-MS/MS分析進行評估。使用胰蛋白酶醣肽之分子量測定每一天門冬醯胺酸處之N-連接醣基化之潛在位點且有助於闡明主要聚醣之物質。

抗TNFα GAb200

將存於磷酸鈉緩衝劑(50mM,pH 7.0,1.25mL)中之阿達木單抗(2.5mg)與Endo S(125μg)在37℃下一起培育5h以得到阿達木單抗(抗TNFα GAb200)之Fc上之二醣(GlcNAc-Fuc)。在使用磷酸鈉緩衝劑(20mM,pH 7.0)預平衡之蛋白質A-瓊脂樹脂(1mL)之管柱上對反應混合物實施親和層析。使用磷酸鈉緩衝劑(20mM,pH 7.0,10mL)洗滌管柱。使用甘胺酸-HCl(50mM,pH 3.0,10mL)釋放結合之IgG，且立即使用Tris-Cl緩衝劑(1.0M,pH 8.3)中和洗脫部分。合併含有Fc片段之部分且藉由離心過濾(Amicon Ultra離心過濾器，Millipore,Billerica,MA)濃縮以得到抗TNFα GAb201。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb200之醣基化模式。抗TNFα GAb200之N-聚醣特徵分析之結果展示於圖1中。

抗TNFα GAb201

將存於磷酸鈉緩衝劑(50mM,pH 7.0,1.25mL)中之阿達木單抗(2.5mg)與Endo S(125μg)及重組類桿菌α-L-岩藻醣苷酶(2.5mg)之混合物在37℃下一起培育5h以得到阿達木單抗(抗TNFα GAb201)之Fc上之單醣(GlcNAc)。在使用磷酸鈉緩衝劑(20mM,pH 7.0)預平衡之蛋白質A-瓊脂樹脂(1mL)之管柱上對反應混合物實施親和層析。使用磷酸鈉緩衝劑(20mM,pH 7.0,10mL)洗滌管柱。使用甘胺酸-HCl(50mM,pH 3.0,10mL)釋放結合之IgG，且立即使用Tris-Cl緩衝劑(1.0M,pH 8.3)中和洗脫部分。合併含有Fc片段之部分且藉由離心過濾(Amicon Ultra離心過濾器，Millipore,Billerica,MA)濃縮以得到抗TNFα GAb201。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb201之醣基化模式。

抗TNFα GAb101

根據公開方法自雞蛋黃分離唾液酸醣肽(SGP)。簡言之，離心雞蛋黃之酚提取物，過濾，且藉由層析管柱(包含Sephadex G-50、Sephadex G-25、DEAE-Toyoperarl 650M、CM-Sephadex C-25及Sephadex G-25)純化。將存於磷酸鈉緩衝劑(50mM,pH 6.0,5mM)中之唾液酸醣肽(SGP)(52mg)之溶液與Endo M(53μg)在37℃下一起培育。在7小時之後，在藉由水洗脫之Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析。合併含有產物之部分且凍乾以得到白色粉末產物(聚醣-101)(30mg，產率為82%)。

將存於水中之聚醣-101(Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(62.7mg)及Et₃N(89μL)之溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析且藉由0.05%Et₃N水溶液洗脫。合併含有產物之部分(聚醣噁唑啉-101)且凍乾以得到白色粉末。

將聚醣噁唑啉-101添加至存於50mM Tris緩衝劑(pH 7.8)中之醣苷內切酶及Gab 201之混合物中且在室溫下培育一小時。使用蛋白質A親和力管柱純化反應混合物，隨後使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產物抗TNFα GAb101。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb101之醣基化模式。

抗TNFα GAb104

將存於水中之聚醣-104(Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc)(30 mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(64mg)及Et₃N(95μL)之溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析且藉由0.05%Et₃N水溶液洗脫。合併含有產物之部分(聚醣噁唑啉-104)且凍乾以得到白色粉末。

將聚醣噁唑啉-104添加至存於50mM Tris緩衝劑(pH 7.8)中之醣苷內切酶及GAb201之混合物中且在室溫下培育一小時。使用蛋白質A親和力管柱純化反應混合物，隨後使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產物抗TNFα GAb104。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb104之醣基化模式。

抗TNFα GAb107

將存於水中之聚醣-107(Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(62.7mg)及Et₃N(89μL)之溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析且藉由0.05%Et₃N水溶液洗脫。合併含有產物之部分(聚醣噁唑啉-107)且凍乾以得到白色粉末。

將聚醣噁唑啉-107添加至存於50mM Tris緩衝劑(pH 7.8)中之醣苷內切酶及GAb201之混合物中且在室溫下培育一小時。使用蛋白質A親和力管柱純化反應混合物，隨後使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產物抗TNFα GAb107。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb107之醣基化模式。

抗TNFα GAb109

將存於水中之聚醣-109(Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(64mg)及Et₃N(95μL)之溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析且藉由0.05%Et₃N水溶液洗脫。合併含有產物之部分(聚醣噁唑啉-109)且凍乾以得到白色粉末。

將聚醣噁唑啉-109添加至存於50mM Tris緩衝劑(pH 7.8)中之醣苷內切酶及GAb201之混合物中且在室溫下培育一小時。使用蛋白質A親和力管柱純化反應混合物，隨後使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產物抗TNFα GAb109。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb109之醣基化模式。

抗TNFα GAb401

將存於水中之聚醣-101(Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(62.7mg)及Et₃N(89μL)之溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析且藉由0.05%Et₃N水溶液洗脫。合併含有產物之部分(聚醣噁唑啉-401)且凍乾以得到白色粉末。

將聚醣噁唑啉-401添加至存於50mM Tris緩衝劑(pH 7.8)中之醣苷內切酶及GAb 200之混合物中且在室溫下培育一小時。使用蛋白質A親和力管柱純化反應混合物，隨後使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產物抗TNFα GAb401。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb401之醣基化模式。N-聚醣特徵分析之結果展示於圖1中。

抗TNFα GAb404

將存於水中之聚醣-104(Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(64mg)及Et₃N(95μL)之溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析且藉由0.05%Et₃N水溶液洗脫。合併含有產物之部分(聚醣噁唑啉-404)且凍乾以得到白色粉末。

將聚醣噁唑啉-404添加至存於50mM Tris緩衝劑(pH 7.8)中之醣苷內切酶及GAb200之混合物中且在室溫下培育一小時。使用蛋白質A親和力管柱純化反應混合物，隨後使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產物抗TNFα GAb404。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb404之醣基化模式。

抗TNFα GAb407

將存於水中之聚醣-107(Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(62.7mg)及Et₃N(89μL)之溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析且藉由0.05%Et₃N水溶液洗脫。合併含有產物之部分(聚醣噁唑啉-407)且凍乾以得到白色粉末。

將聚醣噁唑啉-407添加至存於50mM Tris緩衝劑(pH 7.8)中之醣苷內切酶及Gab 200之混合物中且在室溫下培育一小時。使用蛋白質A親和力管柱純化反應混合物，隨後使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產物抗TNFα GAb407。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb407之醣基化模式。

抗TNFα GAb409

將存於水中之聚醣-109(Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(64mg)及Et₃N(95μL)之溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對反應混合物實施凝膠過濾層析且藉由0.05%Et₃N水溶液洗脫。合併含有產物之部分(聚醣噁唑啉-409)且凍乾以得到白色粉末。

將聚醣噁唑啉-409添加至存於50mM Tris緩衝劑(pH 7.8)中之醣苷內切酶及Gab 200之混合物中且在室溫下培育一小時。使用蛋白質A親和力管柱純化反應混合物，隨後使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產物抗TNFα GAb409。產物經過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實GAb409之醣基化模式。

實例3：實例性抗TNFα GAb之結合親和力

在大腸桿菌(PROSPEC)中產生含有158個胺基酸之人類重組TNF-α(MW=17.5kDa)且純化。滴定重組人類TNF-α蛋白質且在HBS-EP緩衝劑中製備50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.125nM之連續稀釋液。將阿達木單抗及抗TNFα GAb 200及401在HBS-EP緩衝劑中稀釋至10μg/ml之濃度，且然後捕獲至預固定抗人類Fc結構域抗體之CM5晶片上。然後以30μl/min之流速注入連續濃度之重組人類TNF-α作為分析物且結合至晶片上之所捕獲抗體。在結合之後，藉由再生緩衝劑10mM pH1.5甘胺酸-HCl以50μl/min之流速洗滌抗體-分析物複合物。將CM5晶片在4℃下維持於pH7.4 PBS中以共進一步使用。使用Biacore T200評估軟體將單一循環動力學數據擬合至1：1結合模型以量測平衡常數(Ka/Kd)。圖2中之結果展示，GAb200、GAb401及阿達木單抗之結合親和力常數相當且介於1.27至1.95E-11M之間。

實例4：實例性抗TNFα GAb與FcγRIIIA之結合親和力

自經轉染HEK-293細胞系純化FcγRIIIA重組蛋白，且然後以0.5ug/mL在ELISA塗覆緩衝劑(50mM Na₂CO₃,50mM NaHCO₃,pH20)中製備。將抗TNFα GAb在2%BSA/PBST中自150nM 5倍滴定至1.54*10^-5nM，且然後施加至預固定重組FcγRIIIA之ELISA板上。在室溫下培育1小時之後，使用抗人類IgG-HRP在室溫下於2%BSA/TBST中將板處理0.5hr。在使用TBST洗滌3次之後，添加色原體以產生顏色且然後藉由添加2.5N H₂SO₄終止。在OD450下讀取吸光度，且藉由軟體SoftMax Pro 6.0獲得EC₅₀。表4中之結果展示，抗TNFα GAb101及GAb401與Humira相比在EC₅₀及最大結合程度方面展現較強FcγRIIIA結合親和力。

‧相對於Humira之增加倍數。

實例性實施例中之Fc受體結合增加至少約1.35倍、1.5倍、1.75倍、2倍、2.5倍、3倍或更高。

Claims

一種抗TNFα醣抗體或抗TNFα結合片段之組合物，其包括在每一抗TNFα IgG分子之Fc區上具有相同N-聚醣之抗TNFα IgG分子之均質群體，其中該N-聚醣包括二等分(bisecting)GlcNAc及至少一個α2-6唾液酸，同時該N-聚醣連接至該Fc區之Asn-297，其中該N-聚醣係選自由以下組成之群：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-3)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)。
如請求項1之組合物，其中該抗TNFα IgG分子包括具有SEQ ID NO：1中所述胺基酸序列之重鏈及具有SEQ ID NO：2中所述胺基酸序列之輕鏈。
如請求項1之組合物，其中該抗TNFα IgG分子包括阿達木單抗(Adalimumab)(Humira)之輕鏈序列及重鏈序列。
如請求項1之組合物，其中該等抗TNFα醣抗體展現比阿達木單抗(Humira)改良之TNFα結合性。
如請求項4之組合物，其中該結合性改良至少約3倍。
如請求項1之組合物，其中該N-聚醣不含核心岩藻醣。
如請求項1之組合物，其中該N-聚醣包括兩個α2-6唾液酸。
如請求項1之組合物，其中該N-聚醣係選自由以下組成之群：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia2(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)。
一種醫藥調配物，其包括如請求項1至8之抗TNFα醣抗體或抗TNFα結合片段之組合物及醫藥上可接受之載劑。
一種如請求項9之醫藥調配物之用途，其係用於製備在有需要之人類中治療TNF介導之發炎疾病之藥劑，其中該藥劑包括向該人類投與之有效量之該醫藥調配物。
如請求項10之用途，其中該投與包括向該人類投與如請求項9之醫藥調配物。
如請求項10之用途，其中該TNF介導之發炎疾病係選自發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎或幼年型特發性關節炎。
如請求項10之用途，其中該醫藥進一步包括向該人類投與至少一種抗TNF治療劑。
如請求項13之用途，其中該抗TNF治療劑係阿達木單抗、英夫利昔單抗(Infliximab)或依那西普(Etanercept)。
如請求項10之用途，其中該醫藥進一步包括以共同投與或共同調配向該患者投與之第二治療劑。
一種製備去岩藻醣基化醣之抗TNFα醣抗體或抗TNFα結合片段之方法，該方法包括：(a)使抗TNFα抗體或抗TNFα結合片段與α-岩藻醣苷酶及至少一種醣苷內切酶接觸，由此得到在Fc區上具有單一N-乙醯基葡醣胺(GlcNAc)之去岩藻醣基化抗體，其中該單一N-乙醯基葡醣胺(GlcNAc)連接至該Fc區之Asn-297；及(b)在適宜條件下向GlcNAc中添加碳水化合物部分；其中該碳水化合物部分係選自有下組成之群：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-3)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂ GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man3GlcNAc(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)。
一種製備岩藻醣基化醣抗TNFα醣抗體或抗TNFα結合片段之方法，該方法包括：(a)使抗TNFα抗體或抗TNFα結合片段與至少一種醣苷內切酶接觸，由此得到在Fc區上具有二醣(GlcNAc-Fuc)之抗體，其中該二醣連接至該Fc區之Asn-297；及(b)在適宜條件下向該二醣之GlcNAc中添加碳水化合物部分，其中該碳水化合物部分係選自由以下組成之群：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-3)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂ GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)。
如請求項16或17之方法，其中該抗TNFα抗體係阿達木單抗、英夫利昔單抗，該抗TNFα結合片段係依那西普。
如請求項16或17之方法，其中該等抗TNFα醣抗體或抗TNFα結合片段係在活體外產生。
如請求項16或17之方法，其中該等抗TNFα醣抗體或抗TNFα結合片段係從細胞培養獲得之抗體經過酶改造。
如請求項20之方法，其中該方法包括使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系進行饋料批式培養(fed batch culturing)。
如請求項16或17之方法，其中步驟(b)中之該碳水化合物部分係選自由以下組成之群：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia2(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂ Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)。
如請求項16或17之方法，其中步驟(b)中之該添加係藉由轉醣苷酶進行。
如請求項16或17之方法，其中該醣苷內切酶係EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS或其變體。
如請求項16之方法，其中該α-岩藻醣苷酶包括具有與SEQ ID NO：5至少90%一致之胺基酸序列之多肽。
如請求項16之方法，其中該α-岩藻醣苷酶係重組類桿菌(Bacteroides)α-岩藻醣苷酶。