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JP7191155B2 - 修飾ＲＮＡｉ剤 - Google Patents

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JP7191155B2 JP2021087577A JP2021087577A JP7191155B2 JP 7191155 B2 JP7191155 B2 JP 7191155B2 JP 2021087577 A JP2021087577 A JP 2021087577A JP 2021087577 A JP2021087577 A JP 2021087577A JP 7191155 B2 JP7191155 B2 JP 7191155B2
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Description

関連出願
本出願は、参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる、２０１１年１１月１８日出願の米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号の優先権を主張するものである。
本発明は、標的遺伝子の発現の阻害に有利な特定のモチーフを含むＲＮＡｉ二重鎖剤、および治療用途に適したＲＮＡｉ組成物に関する。加えて、本発明は、例えば、様々な疾患の処置のために、これらのＲＮＡｉ二重鎖剤を投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を阻止できるという観察を説明するためにＦｉｒｅおよび同僚によって最初に作成された語である（非特許文献１）。短鎖ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む様々な生物における遺伝子特異的な翻訳後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能の研究の新たなツールを提供する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼによって媒介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短鎖ＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含むことが知られているが、この活性のタンパク質成分はいまだ未知である。
良好な遺伝子サイレンシング特性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づいた薬物の開発に必要である。ＲＮＡｉの最初のステップは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化であり、この活性化には、ｄｓＲＮＡの二重鎖のセンス鎖の分解が必要である。センス鎖は、二重鎖領域の中央にあるＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２によって切断される最初のＲＩＳＣ基質として機能することが知られていた。センス鎖の切断された５’末端および３’末端の断片がエンドヌクレアーゼＡｇｏ２から除去された直後に、ＲＩＳＣが、アンチセンス鎖によって活性化される（非特許文献２）。
センス鎖の切断が阻害されると、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断が妨げられると考えられていた（非特許文献３）。Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒらが、センス鎖のＡｇｏ２切断部位への２’－Ｏ－Ｍｅリボースの取り込みが、ＨｅＬａ細胞におけるＲＮＡｉを阻害することを示した（非特許文献４）。同様の効果が、ホスホロチオエート修飾で観察され、センス鎖の切断が、哺乳動物における効率的なＲＮＡｉに必要であることを示した。
Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙらが、他の部位および修飾の中で、Ａｇｏ２切断部位における２’－Ｆ修飾残基を含むｓｉＲＮＡ二重鎖を使用して、無修飾ｓｉＲＮＡと比較して適合したサイレンシングを得た（非特許文献５）。しかしながら、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙの修飾は、モチーフ特異的ではない、例えば、１つの修飾が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方にピリミジン残基が存在すれば、一切の選択性なしに全てのピリミジンに２’－Ｆ修飾を含む；従って、これらの教示に基づくと、センス鎖の切断部位における特定のモチーフ修飾が遺伝子サイレンシング活性に対して実際の効果を有し得るかは不明である。
Ｍｕｈｏｎｅｎらが、センス鎖またはアンチセンス鎖のＡｇｏ２切断部位に２つの２’－Ｆ修飾残基を含むｓｉＲＮＡ二重鎖を使用して、このｓｉＲＮＡ二重鎖が許容されることを見出した（非特許文献６）。しかしながら、Ｍｕｈｏｎｅｎの修飾も配列特異的であり、例えば、それぞれの特定の鎖に対して、Ｍｕｈｏｎｅｎの修飾は、一切の選択性なしに全てのピリミジンまたは全てのプリンを修飾するだけである。
Ｃｈｏｕｎｇらが、２’－ＯＭｅによる選択的修飾または２’－Ｆ、２’－ＯＭｅ、およびホスホロチオエート修飾の様々な組み合わせを含むｓｉＲＮＡ二重鎖を使用して、血清中のｓｉＲＮＡをＳｕｒ１００５８に対して安定させた（非特許文献７）。Ｃｈｏｕｎｇは、アンチセンス鎖の切断部位における残基は、ｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、２’－ＯＭｅで修飾するべきではないことを示唆した。
従って、ｓｉＲＮＡ遺伝子治療の遺伝子サイレンシングの有効性を改善するためにｉＲＮＡ二重鎖剤が現在要望されている。本発明は、この要望に関する。
Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６－８１１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５，１８８－２００ Ｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ １２３，６２１ Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．，７，３１４；Ｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ １２３，６２１；Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４，７８７ Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．，７，３１４ Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１，１３４９ Ｍｕｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ４，８５８－８７３ Ｃｈｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３４２，９１９-９２７
本発明は、標的遺伝子の発現の阻害に有利な、任意選択で少なくとも１つのリガンドがコンジュゲートする、ｄｓＲＮＡ剤の有効なヌクレオチドまたは化学モチーフ、および治療用途に適したＲＮＡｉ組成物を提供する。
本発明者らは、驚くべきことに、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを、修飾されたセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成されるｄｓＲＮＡ剤の切断部位またはその近傍に導入することにより、ｄｓＲＮＡ剤の遺伝子サイレンシング活性が高まることを見出した。
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有する。ｄｓＲＮＡ二重鎖は、以下の式（ＩＩＩ）によって表される：
センス鎖：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’－Ｎａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）、
式（ＩＩＩ）において、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；ｐおよびｑはそれぞれ独立して、０～６であり；ｎはヌクレオチドを表し；各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾されている、修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０～２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、これらの各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾されている、修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０～１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；各ｎｐおよびｎｑは独立して、０～６のヌクレオチドを含むオーバーハングヌクレオチド配列を表し；かつＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し；Ｎｂの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾が、Ｙ’の修飾とは異なる。Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、その相補的なＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、Ｙヌクレオチドの修飾が、Ｙ’ヌクレオチドの修飾とは異なる。
各ｎｐおよびｎｑは独立して、０～６のヌクレオチドを含むオーバーハングヌクレオチド配列を表し；各ｎおよびｎ’は、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐおよびｑはそれぞれ独立して０～６である。
別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも２つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、センス鎖内の切断部位またはその近傍に存在し、モチーフの少なくとも１つが、切断部位のモチーフから少なくともヌクレオチド１つ離れたセンス鎖の別の部分に存在する。アンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、アンチセンス鎖内の切断部位またはその近傍に存在し、モチーフの少なくとも１つが、切断部位のモチーフから少なくともヌクレオチド１つ離れたアンチセンス鎖の別の部分に存在する。センス鎖の切断部位またはその近傍に存在するモチーフの修飾は、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在するモチーフの修飾とは異なる。
別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近傍に、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
別の態様では、本発明は、皮下投与または静脈内投与によって対象の特定の標的にｄｓＲＮＡを送達する方法をさらに提供する。
詳細な説明
３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖、特に切断部位またはその近傍に導入することにより優れた結果を得ることができる。ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、そうではなく、完全に修飾しても良い。これらのモチーフの導入により、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に修飾パターンが存在する場合は、修飾パターンが中断される。ｄｓＲＮＡ剤は、任意選択で、例えば、センス鎖において、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドにコンジュゲートする。得られるｄｓＲＮＡ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
本発明者らは、驚くべきことに、ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも一方の鎖の切断部位またはその近傍に、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを含むことにより、ｄｓＲＮＡ剤の遺伝子サイレンシング活性が非常に高まることを見出した。
従って、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、１２～３０のヌクレオチド長さの範囲とすることができる。例えば、各鎖は、１４～３０のヌクレオチド長さ、１７～３０のヌクレオチド長さ、２５～３０のヌクレオチド長さ、２７～３０のヌクレオチド長さ、１７～２３のヌクレオチド長さ、１７～２１のヌクレオチド長さ、１７～１９のヌクレオチド長さ、１９～２５のヌクレオチド長さ、１９～２３のヌクレオチド長さ、１９～２１のヌクレオチド長さ、２１～２５のヌクレオチド長さ、または２１～２３のヌクレオチド長さの範囲とすることができる。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖ｄｓＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡ剤の二重鎖領域は、１２～３０のヌクレオチド対の長さとすることができる。例えば、二重鎖領域は、１４～３０のヌクレオチド対の長さ、１７～３０のヌクレオチド対の長さ、２５～３０のヌクレオチド対の長さ、２７～３０のヌクレオチド対の長さ、１７～２３のヌクレオチド対の長さ、１７～２１のヌクレオチド対の長さ、１７～１９のヌクレオチド対の長さ、１９～２５のヌクレオチド対の長さ、１９～２３のヌクレオチド対の長さ、１９～２１のヌクレオチド対の長さ、２１～２５のヌクレオチド対の長さ、または２１～２３のヌクレオチド対の長さとすることができる。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７のヌクレオチド対の長さから選択される。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、鎖の３’末端、５’末端、または両末端にｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、１～６のヌクレオチド長さ、例えば、２～６のヌクレオチド長さ、１～５のヌクレオチド長さ、２～５のヌクレオチド長さ、１～４のヌクレオチド長さ、２～４のヌクレオチド長さ、１～３のヌクレオチド長さ、２～３のヌクレオチド長さ、または１～２のヌクレオチド長さとすることができる。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長い結果、または同じ長さの２本の鎖がシフトした結果として起こり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、もしくは他の配列であっても良い。第１の鎖と第２の鎖は、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって接続することができる。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のオーバーハング領域におけるヌクレオチドはそれぞれ独立して、限定されるものではないが、２’－糖修飾、例えば、２－Ｆ、２’－Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせを含め、修飾されたヌクレオチドであっても良いし、または非修飾ヌクレオチドであっても良い。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列とすることができる。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、もしくは他の配列であっても良い。
本発明のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖における５’または３’オーバーハングは、リン酸化されても良い。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、この２つのヌクレオチドは、同じヌクレオチドでも良いし、異なるヌクレオチドでも良い。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖に存在する。
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、全体の安定性に影響を与えずに、ｄｓＲＮＡの干渉活性を高めることができる１つのオーバーハングのみを含む。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、あるいはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置する平滑末端を有しても良いし、またはこの逆であっても良い。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端のヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に拘束されるものではないが、非対称な、アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端とアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングは、ＲＩＳＣプロセスに添加されるガイド鎖を好む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両末端に２つの平滑末端を有しても良い。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１９のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端の７位、８位、９位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２０のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端の８位、９位、１０位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２１のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端の９位、１０位、１１位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２１のヌクレオチド（ｎｔ）長さのセンス鎖および２３のヌクレオチド（ｎｔ）長さのアンチセンスを含み、センス鎖は、５’末端の９位、１０位、１１位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み：アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑であり、他方の末端は、２つのヌクレオチドのオーバーハングを有する。好ましくは、２つのヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。任意選択で、ｄｓＲＮＡは、リガンド（好ましくはＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５～３０のヌクレオチド残基の長さであり、５’末端のヌクレオチド（１位）から始まり、前記第１の鎖の１位～２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６のヌクレオチド残基の長さであり、３’末端のヌクレオチドから始まり、二重鎖を形成するセンス鎖の１位～２３位と対を形成する位置に少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端のヌクレオチドは、センス鎖と対を形成せず、最大６つの連続した３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対を形成せず、これにより、１～６のヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングが形成され；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対を形成しない１０～３０の連続したヌクレオチドを含み、これにより、１０～３０のヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングが形成され；少なくともセンス鎖の５’末端および３’末端のヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖が最大の相補性となるように整列したときに、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、これにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二重鎖領域が形成され；アンチセンス鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物の細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を低減するように、アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに十分に相補的であり；センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、この少なくとも１つのモチーフが、切断部位またはその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近傍の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも２５、最大で２９のヌクレオチド長さを有する第１の鎖、および５’末端から１１位、１２位、１３位にある３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを有する、最大で３０のヌクレオチド長さを有する第２の鎖を含み；前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、平滑末端を形成し、第２の鎖は、３’末端で第１の鎖よりも１～４ヌクレオチド長く、二重鎖領域は、少なくとも２５のヌクレオチド長さであり、第２の鎖は、ｄｓＲＮＡ剤が哺乳動物の細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を低減するように、前記第２の鎖の長さの少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ｄｓＲＮＡ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、優先的に前記第２の鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡをもたらし、これにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減する。任意選択で、前記ｄｓＲＮＡ剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖も、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含んでも良く、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。
１７～２３のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有するｄｓＲＮＡ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には、５’末端から１０位、１１位、および１２位の付近である。従って、３つの同一の修飾からなるモチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；１３位、１４位、１５位に存在しても良く、この位置は、アンチセンス鎖の５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる、またはアンチセンス鎖の５’末端の二重鎖領域内の最初の対を形成したヌクレオチドから数え始められる。アンチセンス鎖の切断部位はまた、５’末端のｄｓＲＮＡ剤の二重鎖領域の長さに従って変更され得る。
ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、その鎖の切断部位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、その鎖の切断部位またはその近傍の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖とアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合は、センス鎖とアンチセンス鎖は、センス鎖の３つのヌクレオチドからなる１つのモチーフおよびアンチセンス鎖の３つのヌクレオチドからなる１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーラップ、即ち、センス鎖のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列させることができる。あるいは、両方の鎖からのモチーフの少なくとも２つのヌクレオチドがオーバーラップする、または３つ全てのヌクレオチドがオーバーラップしても良い。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる２つ以上のモチーフを含む。第１のモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在するべきであり、他方のモチーフは、ウィング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であっても良い。本明細書の「ウィング修飾」という語は、鎖の切断部位またはその近傍のモチーフから離れた同じ鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウィング修飾は、第１のモチーフの近傍であるか、または少なくとも１つ以上のヌクレオチドによって離隔している。モチーフが、その性質化学的よりも互いに接近している場合は、モチーフは互いに異なり、モチーフが、モチーフの化学的性質よりも１つ以上のヌクレオチドによって離隔している場合は、モチーフは、同じであるか、または異なることもある。２つ以上のウィング修飾が存在しても良い。例えば、２つのウィング修飾が存在する場合、両方のウィング修飾が、切断部位またはその近傍にある第１のモチーフに対する二重鎖領域の一方の末端に存在しても良いし、またはウィング修飾のそれぞれが、第１のモチーフの両側に存在しても良い。
センス鎖と同様に、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも２つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。このアンチセンス鎖も、センス鎖に存在するウィング修飾と同様の配列で１つ以上のウィング修飾を有しても良い。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端、または両末端における最初の１つまたは２つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端、または両末端における二重鎖領域内の最初の１つまたは２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウィング修飾を含む場合、ウィング修飾は、二重鎖領域の同じ末端に位置しても良く、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する。
ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウィング修飾を含む場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、一方の鎖の２つのウィング修飾がそれぞれ、二重鎖領域の一方の末端に位置して、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有するように；一方の鎖の２つの修飾が二重鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有するように、センス鎖とアンチセンス鎖を整列させることができる。
一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖における各ヌクレオチドを修飾しても良い。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾しても良く、この修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「脱リン酸」リンカー（“ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ”ｌｉｎｋｅｒ）での大量の置換；天然の塩基の修飾または置換；およびリボース－リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
核酸がサブユニットの重合体であるため、多くの修飾、例えば、塩基、リン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾は、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸内の全ての目的の位置に存在するが、多くの場合はそうではない。一例として、修飾は、３’または５’末端位置のみに存在しても良く、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドの位置または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、または１０のヌクレオチドのみに存在しても良い。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方に存在し得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在しても良いし、またはＲＮＡの一本鎖領域のみに存在しても良い。例えば、非結合酸素位置でのホスホロチオエート修飾は、一方もしくは両方の末端のみに存在しても良いし、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドのある位置、または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは１０のヌクレオチドのみに存在しても良いし、あるいは二本鎖領域および一本鎖領域、特に末端に存在しても良い。５’末端または両末端は、リン酸化されても良い。
例えば、安定性を高めること、オーバーハングに特定の塩基を含めること、あるいは一本鎖オーバーハング、例えば、５’もしくは３’オーバーハング、または両方のオーバーハングに修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能であろう。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合もある。一部の実施形態では、３’または５’オーバーハングの全てまたは一部の塩基を、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾しても良い。修飾は、例えば、当分野で公知の修飾を用いたリボース糖の２’位での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖ではなくデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）、または２’－Ｏ－メチル修飾の使用、およびリン酸基の修飾、例えば、ホスホチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、または２’－フルオロで修飾される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。これらの２つの修飾は、２’－Ｏ－メチルもしくは２’－フルオロ、または他のものであっても良い。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロから選択される２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシフルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチド、または２’－ａｒａ－Ｆヌクレオチドで修飾される。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を有する。本明細書で使用される「交互モチーフ」または「交互パターン」という語は、各修飾が１つの鎖の交互ヌクレオチドに存在する１つ以上の修飾を有するモチーフを指す。交互ヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ、３つおきのヌクレオチドに１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ、およびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１種類の修飾を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」などであり得る。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。本明細書で使用される「交互モチーフ」または「交互パターン」という語は、各修飾が１つの鎖の交互ヌクレオチドに存在する１つ以上の修飾を有するモチーフを指す。交互ヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ、３つおきのヌクレオチドに１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ、およびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１種類の修飾を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」などであり得る。
交互モチーフに含まれる修飾の種類は、同じであっても良いし、または異なっていても良い。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチドの１種類の修飾を表す場合、交互パターン、即ち、１つおきのヌクレオチドの修飾は、同じでも良いが、センス鎖またはアンチセンス鎖はそれぞれ、交互モチーフ、例えば、「ＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＣＡＣＡＣ．．．」、「ＢＤＢＤＢＤ．．．」、または「ＣＤＣＤＣＤ．．．」などの内部の修飾のいくつかの可能性から選択することができる。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖における交互モチーフの修飾パターンに対してシフトしている、センス鎖における交互モチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応するようなシフトであっても良いし、この逆のシフトでも良い。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二重鎖におけるアンチセンス鎖と塩基対を形成した場合、センス鎖における交互モチーフが、センス鎖の５’から３’へ「ＡＢＡＢＡＢ」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフが、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の３’から５’へ「ＢＡＢＡＢＡ」で始まり得る。別の例として、センス鎖における交互モチーフは、センス鎖の５’から３’へ「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフは、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の３’から５’へ「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で始まり得るため、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な、または部分的なシフトが存在する。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、最初に、センス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾との交互モチーフのパターンを有し、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾との交互モチーフのパターンに対してシフトを有する、即ち、センス鎖における２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖における２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、逆の場合も同様である。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾で始まることができ、アンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾で始まることができる。
３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖への導入は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンを中断する。３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖への導入による、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を驚くほど高める。
一実施形態では、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなるモチーフが、いずれの鎖に導入される場合も、モチーフの次のヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「．．．ＮａＹＹＹＮｂ．．．」であり、「Ｙ」は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなるモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、Ｙの修飾とは異なる、モチーフ「ＹＹＹ」の次のヌクレオチドの修飾を表し、ＮａおよびＮｂは、同じ修飾でも異なる修飾でも良い。あるいは、Ｎａおよび／またはＮｂは、ウィング修飾が存在する場合は、存在しても存在しなくても良い。
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖、または両鎖のいずれかの位置のどのヌクレオチドにも存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖およびアンチセンス鎖のどのヌクレオチドにも存在し得る；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖における交互パターンに存在し得る；あるいはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンにおける両方のヌクレオチド間結合の修飾を含む。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでも異なっても良く、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンに対してシフトを有しても良い。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間結合の修飾は、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の塩基対形成ヌクレオチドに結合させるために形成することもできる。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって結合することができ、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをその次の塩基対形成ヌクレオチドに結合する追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合が存在しても良い。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホチオエートのヌクレオチド間結合が存在しても良く、この末端の３つのヌクレオチドのうちの２つは、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の塩基対形成ヌクレオチドである。好ましくは、これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された２～１０のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１～１０のブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記センス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むアンチセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された３つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、もしくは１４のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された４つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、もしくは１２のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された６つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つのリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された７つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された８つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、もしくは４つのリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された９つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の１つが、オリゴヌクレオチド配列の任意の位置に存在し、前記アンチセンス鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびリン酸塩のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエート、メチルホスホネート、もしくはリン酸塩の結合の何れかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の１～１０の末端位置（複数可）の範囲内の１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のヌクレオチドを、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の一方の末端または両末端におけるホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって連結することができる。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のそれぞれの二重鎖の１～１０の内部領域の範囲内の１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のヌクレオチドを、センス鎖の５’末端から数えて、８位～１６位の二重鎖領域にあるホスホロチオエート、メチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって連結することができ；ｄｓＲＮＡは、任意選択で、１～１０の末端位置（複数可）の範囲内の１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含み得る。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の１～５のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾（複数可）および１８位～２３位の範囲内の１～５のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾（複数可）、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（５’末端から数えて）における１～５のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１～５のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位～５位（５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および１８位～２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２０位と２１位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２０位と２１位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位と２２位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位と２２位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２２位と２３位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖の１位（５’末端から数えて）における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２１位における１つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位と２位（５’末端から数えて）における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾および２３位と２３位における２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の修飾をさらに含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、標的とのミスマッチ（複数可）、二重鎖内のミスマッチ（複数可）、またはこれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域、または二重鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離または融解（例えば、特定の対合の結合または解離の自由エネルギーに対してであり、最も単純なアプローチは、個々の塩基対ベースで塩基対を評価することであるが、類縁または同様の分析を用いることもできる）を促進する傾向に基づいてランク付けすることができる。解離の促進に関しては、Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｉ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシンである）。ミスマッチ、例えば、非正準な対合または正準以外の対合（本明細書の他の部分に記載）は、正準な対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく；ユニバーサル塩基を含む塩基対は、正準な対合よりも好ましい。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択することができるアンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの塩基対の少なくとも１つ、および二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対合、例えば、非正準な対合もしくは正準以外の対合、またはユニバーサル塩基を含む対合を含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の１位にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、ンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、または３つの塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）で表すことができる：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉ）
式中、
ｉおよびｊはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐおよびｑはそれぞれ独立して、０～６であり；
各Ｎａは独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＮｂおよびＹは、同じ修飾を有しておらず；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、およびＺＺＺはそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表している。好ましくは、ＹＹＹは、２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ｄｓＲＮＡ剤が、１７～２３のヌクレオチド対長さの二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し得（例えば、６位、７位、８位；７位、８位、９位；８位、９位、１０位；９位、１０位、１１位；１０位、１１位，１２位；または１１位、１２位、１３位に存在し得）、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる；または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる。
一実施形態では、ｉが１でｊが０である、ｉが０でｊが１である、またはｉとｊの両方が１である。従って、センス鎖は、以下の式で表すことができる：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉｂ）；または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉｃ）。
センス鎖が、式（Ｉａ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉｂ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉｃ）で表される場合、各Ｎｂは独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
Ｘ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）によって表すことができる：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’３’ （ＩＩ）
式中、
ｋおよびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐ’およびｑ’はそれぞれ独立して、０～６であり；
各Ｎａ’は独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立して、０～６の修飾ヌクレオチドを含むオーバーハングヌクレオチドを表し；
Ｎｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有しておらず；かつ
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表している。
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、１７～２３のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有し、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる；または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋが１でｌが０である、ｋが０でｌがｌである、またはｋとｌの両方が１である。
従って、アンチセンス鎖は、以下の式で表すことができる：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’ （ＩＩａ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’ （ＩＩｂ）；または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’ （ＩＩｃ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）で表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａ’は独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）で表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａ’は独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）で表される場合、各Ｎｂ’は独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａ’は独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。
Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’はそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、または２’－フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。特に、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’はそれぞれ、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表すことができる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１のヌクレオチドである場合にセンス鎖の９位、１０位、および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含み、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められ、または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められ；かつＹは、２’－Ｆ修飾を表している。センス鎖は、二重鎖領域の反対の末端におけるウィング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフを追加的に含むことができ；かつＸＸＸおよびＺＺＺはそれぞれ独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表している。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、このセンス鎖の１１位、１２位、および１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含むことができ、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる、または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められ；かつＹ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表している。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の反対の末端におけるウィング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを追加的に含むことができ；かつＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表している。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）の何れかによって示されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、および（ＩＩｃ）の何れかによって示されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
従って、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有し、ｄｓＲＮＡ二重鎖が次の式（ＩＩＩ）によって表される：
センス鎖：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐおよびｑはそれぞれ独立して、０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
式中、
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは独立して、オーバーハングヌクレオチド配列を表し；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表す。
一実施形態では、ｉは１で、ｊは０である；ｉは０で、ｊは１である；またはｉとｊの両方が１である。別の実施形態では、ｋは１で、ｌは０である；ｋは０で、ｌは１である；またはｋとｌの両方が１である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有し、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、次の式（Ｖ）によって表される：
センス鎖：５’Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ ’５’
（Ｖ）
式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐおよびｑはそれぞれ独立して２であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
式中、
各ｎｐ’およびｎｑは独立して、オーバーハングヌクレオチド配列を表し；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はぞれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表す。
一実施形態では、ｉは１で、ｊは０である；ｉは０で、ｊは１である；またはｉとｊの両方が１である。別の実施形態では、ｋは１で、ｌは０である；ｋは０で、ｌは１である；またはｋとｌの両方が１である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有し、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、次の式（Ｖａ）によって表される：
センス鎖：５’Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ３’
アンチセンス鎖：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’５’
（Ｖａ）
式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐおよびｑはそれぞれ独立して２であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
式中、
各ｎｐ’は、オーバーハングヌクレオチド配列を表し；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はぞれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表す。
ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組み合わせは、以下の式を含む：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）。
ｄｓＲＮＡ剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～１０、１～７、１～５、または１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各ＮａおよびＮａ’は独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡ剤が式（ＩＩＩｂ）として表される場合、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各ＮａおよびＮａ’は独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡ剤が式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各ＮａおよびＮａ’は独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、およびＮｂ’はそれぞれ独立して、交互パターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、および（ＩＩＩｃ）におけるＸ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
ｄｓＲＮＡ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）で表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＹヌクレオチドの３つ全てが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＮａヌクレオチドはＮａ’と塩基対を形成し、ＮｂヌクレオチドはＮｂ’と塩基対を形成し、ＸヌクレオチドはＸ’と塩基対を形成し、ＹヌクレオチドはＹ’と塩基対を形成し、かつＺヌクレオチドはＺ’と塩基対を形成することを理解されたい。
ｄｓＲＮＡ剤が、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｃ）で表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＺヌクレオチドの３つ全てが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡ剤が、式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｃ）で表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＸヌクレオチドの３つ全てが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一実施形態では、Ｙヌクレオチドの修飾は、Ｙ’ヌクレオチドの修飾とは異なり、Ｚヌクレオチドの修飾は、Ｚ’ヌクレオチドの修飾とは異なり、かつ／またはＸヌクレオチドの修飾は、Ｘ’ヌクレオチドの修飾とは異なる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）で表される少なくとも２つの二重鎖を含む多量体であり、前記二重鎖はリンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、前記多量体は、リガンドをさらに含む。ｄｓＲＮＡはそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいはｄｓＲＮＡはそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）で表される３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の二重鎖を含む多量体であり、前記二重鎖は、リンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、この多量体は、リガンドをさらに含む。ｄｓＲＮＡはそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいはｄｓＲＮＡはそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、または（ＩＩＩｃ）で表される２つのｄｓＲＮＡ剤は、５’末端で互いに結合され、その３’末端の一方または両方が、任意選択で、リガンドによってコンジュゲートされる。ｄｓＲＮＡはそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいはｄｓＲＮＡはそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
様々な刊行物に、多量体ｓｉＲＮＡが記載されており、このようなｓｉＲＮＡは全て、本発明のｄｓＲＮＡと共に使用することができる。このような刊行物としては、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、国際公開第２００７／０９１２６９号、米国特許第７８５８７６９号、国際公開第２０１０／１４１５１１号、同第２００７／１１７６８６号、同第２００９／０１４８８７号、および同第２０１１／０３１５２０号が挙げられる。
１つ以上の糖質部分のｄｓＲＮＡ剤に対するコンジュゲーションを含むｄｓＲＮＡ剤は、このｄｓＲＮＡ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、糖質部分は、ｄｓＲＮＡ剤の修飾サブユニットに付着する。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、糖質リガンドが付着する非糖質担体（好ましくは環状）で置換することができる。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書では、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系、即ち全ての環原子が炭素原子である環系であっても良いし、または複素環系、即ち１つ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る環系であっても良い。環状担体は、単環系であっても良いし、または２つ以上の環、例えば、融合環を含んでも良い。環状担体は、完全に飽和した環系であっても良いし、または１つ以上の二重結合を含んでも良い。
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着することができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書で使用される「骨格付着点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えば、リン酸塩の骨格、もしくは、例えば、硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、かつ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。この選択された部分は、例えば、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。従って、環状担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、または、一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成環への組み込みまたは連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を可能にする。
実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、担体を介してリガンドにコンジュゲートし、この担体は、環状基または非環状基であり得；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、任意選択で、１つ以上のリガンドとコンジュゲートしても良い。リガンドは、３’末端、５’末端、または両末端でセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖に付着することができる。例えば、リガンドは、センス鎖、特にセンス鎖の３’末端にコンジュゲートすることができる。
リガンド
多種多様な物質が、本発明のオリゴヌクレオチドに結合することができる。好ましい部分は、直接的にまたは介在テザーを介して間接的に、好ましくは共有結合で結合されるリガンドである。
好ましい実施形態では、リガンドは、このリガンドが取り込まれる分子の分布、標的化、または寿命を変更する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して、選択される標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞型、区画、受容体、例えば、細胞もしくは器官の区画、組織、器官、または体の領域に対する親和性を高める。選択される標的に対する親和性を高めるリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性および融合性を示すポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。一実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型立体構造をとると推定される。「活性型」立体構造とは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４－２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１－１５８６）、およびこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６－６８）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応じて電荷またはプロトン化の変化を起こす化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖であっても、分岐鎖であっても良い。
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を向上させることができ、結果として得られる天然オリゴリボヌクレオチドもしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載されるモノマーおよび／もしくは天然リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性も向上させることができる。
リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療用修飾因子；例えば、分布を監視するための診断化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を付与する部分を含み得る。一般的な例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体が挙げられる。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質を挙げることができる。リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であっても良い。ポリアミノ酸を含むポリアミノ酸としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリエド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファへリックスペプチドが挙げられる。
リガンドとして、標的化基、例えば、細胞標的化剤または組織標的化剤、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質、もしくはタンパク質、例えば、抗体も挙げることができる。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであっても良い。表２に、標的リガンドおよびそれらの関連する受容体のいくつかの例を示す。
リガンドの他の例として、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼまたはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であっても良い。リガンドとして、ホルモンおよびホルモン受容体も挙げることができる。リガンドとして、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーも挙げることができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ－κＢの活性化因子であっても良い。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増大させることができる物質、例えば、薬物であっても良い。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であっても良い。
リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン－１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
一態様では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートが、標的組織、例えば、体の非腎臓標的組織に分布するのを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であっても良い。ＨＳＡに結合し得る他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させることができ、かつ／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡに対する結合を調節するために使用することができる。
脂質ベースのリガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節、例えば、制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、従って、体内から除去される可能性が低い。ＨＳＡにそれほど強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが腎臓を標的にするように使用することができる。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが、好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、好ましくは、この親和性は、ＨＳＡ－リガンド結合が逆行できないほど強力ではない。
別の好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに対して弱く結合するかまたは全く結合しないため、コンジュゲートが、好ましくは腎臓に分布する。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはこれに加えて使用することができる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性型または非悪性型、例えば、癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）もが挙げられる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス型の細胞透過剤である。好ましくは、作用剤は両親媒性である。例示的な作用剤は、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）である。作用剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、反転異性体、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸の使用を含む修飾を施すことができる。好ましくは、このヘリックス型の細胞透過剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス型の作用剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の定められた３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分は、約５～５０のアミノ酸長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０のアミノ酸長さであっても良い。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、もしくはＰｈｅから構成される）であっても良い。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドであっても良い。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）も標的化部分であっても良い。ペプチド部分は、「送達」ペプチドであっても良く、この送達ペプチドは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を、細胞膜を通過して運搬することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体、例えば、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドは、ＤＮＡのランダム配列によってコードされても良い（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してｉＲＮＡ剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸長さ～約４０のアミノ酸長さの範囲とすることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を高めるための、構造変化を有し得る。下記の構造変化のいずれも利用することができる。ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９－４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進することができる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３－７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であっても良く、特定の組織に対する標的化を促進するために修飾する、例えば、グリコシル化またはメチル化することができる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６－３３６，２００１）。増殖細胞に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびＲＧＤ含有ペプチド模倣体は、癌細胞、特に、インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。従って、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ－アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することもできる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｉｓ）を制御するために使用することができる。この種のリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子を標的とする。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α－ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－ディフェンシン、β－ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、または１種もしくは２種の優勢なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９もしくはインドリシジン）であっても良い。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来する二部両親媒性ペプチド、例えば、ＭＰＧであっても良い（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
一実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α－ヘリックスペプチドであっても良い。例示的な両親媒性α－ヘリックスペプチドとしては、限定されるものではないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン－様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン－２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス－１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ－１）、およびカエリンが挙げられる。好ましくは、多数の因子が、ヘリックス安定性の完全性を維持すると見なされる。例えば、最大数のヘリックス安定化残基（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）を利用し、最小数のヘリックス不安定化残基（例えばプロリン、または環状モノマー単位を利用する。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは、例示的なＮ－キャッピング残基であり、かつ／またはＣ末端アミド化は、追加的な水素結合を実現してヘリックスを安定させるために使用することができる。ｉ±３位、またはｉ±４位離間した、反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって安定させることができる。カチオン性残基、例えば、リジン、アルギニン、ホモ－アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンは、アニオン性残基であるグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
ペプチドリガンドおよびペプチド模倣体リガンドとしては、天然ペプチドまたは修飾ペプチド、例えば、ＤペプチドもしくはＬペプチド；αペプチド、βペプチド、もしくはγペプチド；Ｎ－メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上の尿素結合、チオ尿素結合、カルバミン酸結合、もしくはスルホニル尿素結合で置換された１つ以上のアミド結合、即ち、ペプチ結合を有するペプチド；または環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。
標的化リガンドは、特定の受容体を標的とすることができるあらゆるリガンドであっても良い。例として、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、糖クラスター、例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマーが挙げられる。クラスターは、２つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬリガンド、およびＨＤＬリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えば、アプタマーをベースにしても良い。アプタマーは、未修飾でも良いし、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有しても良い。
エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカーボキシレート（ｐｏｌｙｃａｂｏｘｙｌａｔｅ）、ポリカチオン（ｐｏｌｙａｃａｔｉｏｎ）、マスクオリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケチアル（ｐｏｌｙｋｅｔｙａｌ）、オルトエステル、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するポリマー、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。
ＰＫモジュレーターとは、薬物動態学的モジュレーターのことである。ＰＫモジュレーターとしては、脂肪親和物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。多数のホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に多数のホスホロチオエート連結を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適用可能である。
加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして本発明に適用可能である。
本発明に適用可能な他のリガンドコンジュゲートは、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年８月１０日出願の米国特許出願第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日出願の同第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日出願の同第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日出願の同第１１／１１５，９８９号明細書、および２００７年１１月２１日出願の同第１１／９４４，２２７号明細書に記載されている。
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有しても良いし、全てが異なる特性を有しても良く、または一部のリガンドが、同じ特性を有する一方、他のリガンドが異なる特性を有しても良い。例えば、リガンドは、標的化特性を有しても良いし、エンドソーム的活性を有して良いし、またはＰＫ調節特性を有しても良い。好ましい実施形態では、全てのリガンドが異なる特性を有する。
リガンドは、様々な位置、例えば３’末端、５’末端、および／または内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合することができる。好ましい実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば、本明細書に記載される担体を介してオリゴヌクレオチドに結合している。前記モノマーが成長している鎖に組み込まれる場合、リガンドまたはテザーリガンドは、このモノマーに存在しても良い。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長している鎖に組み込まれた後で、前記「前駆体」モノマーへの結合によって組み込むことができる。例えば、末端がアミノであるテザー（即ち、リガンドが結合されていない）、例えば、ＴＡＰ－（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーを、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基との結合によって、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、その後、前駆体モノマーに結合させることができる。
別の例では、クリック化学反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーを、例えば、末端がアジドまたはアルキンのテザー／リンカーに組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、相補的な化学基、例えば、アルキンまたはアジドを有するリガンドを、アルキンおよびアジドを共に結合することによって前駆体モノマーに結合することができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドは、一方または両方の鎖に結合することができる。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。
一部の実施形態では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートすることができる。プリン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、または８位が、コンジュゲート部分に結合している。また、ピリミジン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、どの位置で生じても良い。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、および６位を、コンジュゲート部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分に対するコンジュゲーションは、どの炭素原子で生じても良い。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例には、２’、３’、および５’炭素原子が挙げられる。１’位も、コンジュゲート部分、例えば、脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合も、コンジュゲート部分を保持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｔａｔｅ）、およびホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に直接結合する、またはリン原子に結合しているＯ、Ｎ、またはＳ原子に結合することができる。アミンまたはアミドを含有するヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分は、アミンまたはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合することができる。
ＲＮＡ干渉の分野におけるあらゆる適切なリガンドを使用することができるが、このようなリガンドは、典型的には、糖質、例えば、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
リガンドを核酸にコンジュゲートさせるリンカーは、上述のリンカーを含む。例えば、リガンドは、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルグルコサミン）誘導体であっても良い。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、次の式（ＩＶ）～（ＶＩＩ）の何れかに示されている構造を含む二価および三価の分岐リンカーにコンジュゲートする：
Figure 0007191155000001
 式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは存在ごとに独立して、０～２０を表し、反復単位は、同じであっても良いし、または異なっていても良く；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏを表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンを表し、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上によって中断または終了させることができ；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 0007191155000002
 、またはヘテロシクリルを表し；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、リガンドを表す；即ち、それぞれ存在ごとに独立して、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し；かつ
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である。
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、式（ＶＩＩ）のような誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤と共に使用すると特に有用である：
Figure 0007191155000003
 式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、単糖、例えば、ＧａｌＮＡｃ誘導体を表す。
適切な二価および三価分岐リンカー基コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、限定されるものではないが、以下の化合物を含む：
Figure 0007191155000004
Figure 0007191155000005
Figure 0007191155000006
定義
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、および「ｉＲＮＡ剤」は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介することができる作用剤と互換的に使用される。便宜上、このようなｍＲＮＡは、本明細書ではサイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。このような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。一般に、サイレンシングされるＲＮＡは、内在性遺伝子または病原遺伝子である。加えて、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡも標的とすることができる。
本明細書で使用される「ＲＮＡｉを媒介する」という句は、標的ＲＮＡを配列特異的にサイレンシングする能力を指す。理論に拘束されることを望むものではないが、サイレンシングは、ＲＮＡｉ機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ、例えば、２１～２３のヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤を使用すると考えられる。
本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子との間に安定した特異的な結合が生じるような十分な相補性を示すために使用される語である。特異的な結合は、特異的な結合が望ましい条件下、即ち、アッセイもしくは治療の場合の生理的条件下、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが行われる条件下、オリゴマー化合物の非標的配列への特異的な結合を回避するために十分な相補性を必要とする。非標的配列は、典型的には、少なくとも５つのヌクレオチドが異なる。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、このｄｓＲＮＡ剤が、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに「十分に相補的」である。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに「厳密に相補的」である、例えば、標的ＲＮＡとｄｓＲＮＡ二重鎖剤とがアニーリングして、例えば、厳密に相補的な領域におけるワトソン－クリック型塩基対のみからなるハイブリッドを形成する。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的な内部領域（例えば、少なくとも１０のヌクレオチド）を含み得る。さらに、一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１つのヌクレオチドの違いを特異的に識別する。この場合、ｄｓＲＮＡ剤は、厳密な相補性が、１つのヌクレオチドの違いがある領域（例えば、７つのヌクレオチド以内）で見られる場合にのみＲＮＡｉを媒介する。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という語は、例えば、１００未満、２００未満、３００未満、または４００未満のヌクレオチドの核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。
「ハロ」という語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素のあらゆるラジカルを指す。「アルキル」という語は、任意選択でＮ、Ｏ、またはＳを挿入しても良い、指示数の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖であり得る飽和および不飽和非芳香族炭化水素鎖（これらには、限定されるものではないが、プロピル、アリル、またはプロパルギルが含まれる）を指す。例えば、Ｃ１～Ｃ１０は、基が、その中に１～１０（全てを含む）の炭素原子を有し得ることを示す。「アルコキシ」という語は、－Ｏ－アルキルラジカルを指す。「アルキレン」という語は、二価アルキル（即ち、－Ｒ－）を指す。「アルキレンジオキソ」という語は、構造－Ｏ－Ｒ－Ｏ－の二価種を指し、Ｒは、アルキレンを表す。「アミノアルキル」という語は、アミノで置換されたアルキルを指す。「メルカプト」という語は、－ＳＨラジカルを指す。「チオアルコキシ」という語は、Ｓ－アルキルラジカルを指す。
「アリール」という語は、６炭素単環式または１０炭素二環式芳香族環系を指し、各環の０、１つ、２つ、３つ、または４つの原子が置換基によって置換されても良い。アリール基の例としては、フェニルおよびナフチルなどが挙げられる。「アリールアルキル」または「アラルキル」という語は、アリールで置換されたアルキルを指す。「アリールアルコキシ」という語は、アリールで置換されたアルコキシを指す。
本明細書で使用される「シクロアルキル」という語は、３～１２の炭素、例えば、３～８の炭素、および、例えば、３～６の炭素を有する飽和および部分飽和環式炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、任意選択で置換されても良い。シクロアルキル基としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
「ヘテロアリール」という語は、単環式の場合には１～３のヘテロ原子、二環式の場合には１～６のヘテロ原子、または三環式の場合には１～９のヘテロ原子を有する芳香族の５～８員環単環式、８～１２員環二環式、または１１～１４員環三環式環系を指し、前記へテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合にはそれぞれ、炭素原子およびＮ、Ｏ、またはＳの１～３、１～６、または１～９のヘテロ原子）、各環の０、１つ、２つ、３つ、または４つの原子は、置換基で置換されても良い。ヘテロアリル基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリニル、およびチアゾリルなどが挙げられる。「ヘテロアリールアルキル」または「ヘテロアラルキル」という語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。
「ヘテロシクリル」という語は、単環式の場合には１～３のヘテロ原子、二環式の場合には１～６のヘテロ原子、または三環式の場合には１～９のヘテロ原子を有する非芳香族の５～８員環単環式、８～１２員環二環式、または１１～１４員環三環式環系を指し、前記へテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合にはそれぞれ、炭素原子およびＮ、Ｏ、またはＳの１～３、１～６、または１～９のヘテロ原子）、各環の０、１つ、２つ、または３つの原子は、置換基で置換されても良い。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリル（ｔｒｉｚｏｌｙｌ）、テトラゾリル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、およびテトラヒドロフラニルなどが挙げられる。
「オキソ」という語は、炭素に結合したときにカルボニルを形成し、窒素に結合したときにＮ－オキシドを形成し、硫黄に結合したときにスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
「アシル」という語は、アルキルカルボニル置換基、シクロアルキルカルボニル置換基、アリールカルボニル置換基、ヘテロシクリルカルボニル置換基、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、これらの何れも、置換基でさらに置換されても良い。
「置換された」という語は、所与の構造における１つ以上の水素ラジカルの特定の置換基のラジカルでの置換を指し、この特定の置換基としては、限定されるものではないが、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、および脂肪族が挙げられる。置換基は、さらに置換され得ることを理解されたい。
開裂可能連結基
開裂可能連結基は、細胞外で十分安定しているが、標的細胞に入ると開裂されてリンカーが一緒に保持する２つの部分を放出する、連結基である。好ましい実施形態では、開裂可能連結基は、対象の血液中または第２の基準条件下（例えば、血液または血清に存在する条件を模倣または実現するように選択することができる）よりも、標的細胞内または第１の基準条件下（例えば、細胞内の条件を模倣または実現するように選択することができる）において、少なくとも１０倍以上、好ましくは、少なくとも１００倍速く開裂する。
開裂可能連結基は、開裂剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、開裂剤は、血清または血液中よりも細胞内において、より行き渡る、またはより高いレベルもしくは活性で存在する。このような分解剤の例としては、還元によって酸化還元性開裂可能連結基を分解することができる、例えば、細胞内に存在する、酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤、例えば、メルカプタンを含む、特定の基質に対して選択されるか、もしくは基質特異性を有しない酸化還元剤；エステラーゼ；酸性環境を生じさせる、例えば、５以下のｐＨにすることができるエンドソームまたは作用剤；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であっても良い）、およびホスファターゼとしての機能を果たすことによって酸性開裂可能連結基を加水分解または分解することができる酵素が挙げられる。
開裂可能連結基、例えば、ジスルフィド結合は、ｐＨの影響を受けやすい。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、平均細胞内ｐＨは、わずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらに酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで開裂され、これにより、リガンドから細胞内へ、または細胞の所望の区画内にカチオン性脂質を放出する開裂可能連結基を有する。
リンカーは、特定の酵素によって開裂可能である、開裂可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる開裂可能連結基の種類は、標的とされる細胞によって異なり得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結することができる。肝細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞でより効率的に開裂する。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、および睾丸の細胞が挙げられる。
ペプチダーゼが豊富な細胞型、例えば、肝細胞および滑膜細胞を標的とする場合は、ペプチド結合を含むリンカーを使用することができる。
一般に、候補の開裂可能連結基の適合性は、候補連結基を開裂する分解剤（または条件）の能力を試験することによって評価することができる。また、血中での、または他の非標的組織と接触しているときの開裂に抵抗する能力について候補の開裂可能連結基を試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件との間の相対的な開裂のしやすさを決定することができ、この第１の条件は、標的細胞内の開裂を示すために選択され、この第２の条件は、他の組織または体液、例えば、血液もしくは血清中での開裂を示すために選択される。無細胞系、細胞、細胞培養物、器官もしくは組織培養物、または動物全体で評価を行うことができる。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液もしくは血清（または細胞外の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）と比較して細胞内（または細胞内の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）で少なくとも２倍、４倍、１０倍、または１００倍速く開裂する。
酸化還元性開裂可能連結基
開裂可能連結基の１つのクラスは、還元または酸化時に開裂する酸化還元性開裂可能連結基である。還元的に開裂可能な連結基の一例として、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）が挙げられる。候補の開裂可能連結基が適切な「還元的に開裂可能な連結基」であるか否か、または、例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用剤と共に使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書に記載される方法を確認することができる。例えば、候補は、細胞、例えば、標的細胞で観察され得る開裂速度を模倣する当分野で公知の試薬を使用してジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはた他の還元剤と共にインキュベートすることによって評価することができる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するために選択される条件下でも評価することができる。好ましい一実施形態では、候補化合物は、血中では最大で１０％開裂する。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）と比較して、細胞内（または細胞内の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）では少なくとも２倍、４倍、１０倍、または１００倍速く分解される。候補化合物の開裂速度は、細胞内培地を模倣するように選択される条件下で標準的な酵素反応速度アッセイを使用して決定して、細胞外培地を模倣するように選択される条件と比較することができる。
リン酸塩系開裂可能連結基
リン酸塩系開裂可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用剤によって開裂する。細胞内のリン酸基を開裂する作用剤の一例として、細胞内の酵素、例えば、ホスファターゼが挙げられる。リン酸塩系の連結基の例としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－が挙げられる。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
酸性開裂可能連結基
酸性開裂可能連結基は、酸性条件下で開裂する連結基である。好ましい実施形態では、酸性開裂可能連結基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、またはそれ以下）のｐＨの酸性環境において、または一般酸として機能し得る作用剤、例えば、酵素剤によって開裂する。細胞において、特定のｐＨの低い細胞小器官、例えば、エンドソームおよびリソソームは、酸性開裂可能連結基に開裂環境を提供することができる。酸性開裂可能連結基の例としては、限定されるものではないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられる。酸性開裂可能な基は、一般式：－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい一実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酵素に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、または第３級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである場合である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
エステル系開裂可能連結基
エステル系開裂可能連結基は、細胞内の酵素、例えば、エステラーゼおよびアミダーゼによって開裂する。エステル系開裂可能連結基の例としては、限定されるものではないが、アルキレン基、アルケニレン基、およびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル系開裂可能連結基は、一般式：－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
ペプチド系開裂連結基
ペプチド系開裂可能連結基は、細胞内の酵素、例えば、ペプチダーゼおよびプロテアーゼによって開裂する。ペプチド系開裂可能連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドが生じる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合である。ペプチド系開裂可能連結基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質が生成するアミノ酸間に形成されるアミド結合の特別な種類である。ペプチド系開裂基は、一般に、ペプチドおよびタンパク質が生じる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むものではない。ペプチド系開裂可能連結基は、一般式：－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。本明細書で使用される「糖質」は、それぞれの炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合した少なくとも６つの炭素原子（直鎖、分岐鎖、もしくは環状でも良い）を有する１つ以上の単糖単位から形成される糖質自体；または、それぞれの炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合した少なくとも６つの炭素原子（直鎖、分岐鎖、もしくは環状でも良い）をそれぞれ有する１つ以上の単糖単位から形成される糖質部分をその一部として有する化合物を指す。代表的な糖質としては、糖（単糖、二糖、三糖、および約４～９の単糖単位を含むオリゴ糖）、ならびに多糖、例えば、スターチ、グリコーゲン、セルロース、および多糖ガムが挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５および上記の（好ましくはＣ５～Ｃ８）糖が挙げられ；二糖および三糖としては、２つまたは３つの単糖単位（好ましくはＣ５～Ｃ８）を有する糖が挙げられる。
代替の実施形態
別の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。センス鎖およびアンチセンス鎖における各ヌクレオチドは修飾されている。センス鎖およびアンチセンス鎖における修飾はそれぞれ独立して、少なくとも２つの異なる修飾を有する。
別の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖の修飾パターンは、センス鎖の修飾パターンに対して１つ以上のヌクレオチドがずれている。
別の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも２つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、センス鎖の切断部位に存在し、モチーフの少なくとも１つが、切断部位のモチーフから少なくともヌクレオチド１つ離れたセンス鎖の別の部分に存在する。アンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し、モチーフの少なくとも１つが、切断部位またはその近傍のモチーフから少なくともヌクレオチド１つ離れたセンス鎖の別の部分に存在する。
別の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも２つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、センス鎖の切断部位に存在し、モチーフの少なくとも１つが、切断部位のモチーフから少なくともヌクレオチド１つ離れたセンス鎖の別の部分に存在する。アンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在し、モチーフの少なくとも１つが、切断部位またはその近傍のモチーフから少なくともヌクレオチド１つ離れたアンチセンス鎖の別の部分に存在する。センス鎖の切断部位に存在するモチーフの修飾は、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在するモチーフの修飾とは異なる。別の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ剤に関する。このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１２～３０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの少なくとも１つが、センス鎖の切断部位に存在する。アンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを含み、１つ以上の追加的なモチーフが、切断部位の３つの２’－Ｆ修飾から少なくともヌクレオチド１つ離れたセンス鎖の別の部分に存在する。アンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフを含み、１つ以上の追加的なモチーフが、３つの２’－Ｏ－メチルから少なくともヌクレオチド１つ離れたセンス鎖の別の部分に存在する。２’－Ｆ修飾を有するヌクレオチドの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチルを有するヌクレオチドの１つと塩基対を形成することができる。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、緩衝液に溶解して投与される。
一実施形態では、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物は、対象に投与するために製剤することができる。製剤されるｓｉＲＮＡ組成物は、様々な状態をとることができる。一部の例では、この組成物は、少なくとも部分的に結晶、均一に結晶、および／または無水（例えば、８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の水）である。別の例では、ｓｉＲＮＡは、水相、例えば、水を含む溶液に溶解される。
水相および結晶性組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に水相の場合）または粒子（例えば、結晶性組成物に適切であり得る微粒子）に含めることができる。一般に、ｓｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載される意図する投与法に適合するように製剤される。例えば、特定の実施形態では、この組成物は、少なくとも１つの次の方法によって調製される：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、もしくはこれらの技術の組み合わせ；または脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮、および他の自己集合。
ｓｉＲＮＡ調製物は、別の作用剤、例えば、別の治療剤、またはｓｉＲＮＡを安定させる作用剤、例えば、ｓｉＲＮＡと複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて製剤することができる。なお他の作用剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、二価のカチオン、例えば、Ｍｇ２＋を除去するための）、塩、およびＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、特異性の広いＲＮＡ分解酵素阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ調製物は、別のｓｉＮＡ化合物、例えば、第２の遺伝子または同じ遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる第２のｓｉＲＮＡを含む。なお他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００以上の異なるｓｉＲＮＡ種を含み得る。このようなｓｉＲＮＡは、同様の数の異なる遺伝子に対してＲＮＡｉを媒介することができる。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ調製物は、少なくとも第２の治療剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ以外の作用剤）を含む。例えば、ウイルス疾患、例えば、ＨＩＶの治療用のｓｉＲＮＡ組成物は、公知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）を含む。別の例では、癌治療用のｓｉＲＮＡ組成物は、化学療法剤をさらに含み得る。
例示的な製剤を以下に説明する
リポソーム。説明を容易にするために、このセクションにおける製剤、組成物、および方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡを用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、またはそれらの前駆体）調製物は、送達するために膜分子集合体、例えば、リポソームまたはミセルに製剤することができる。本明細書で使用される「リポソーム」という語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層または複数の二重層で構成された両親媒性脂質からなる小胞を指す。リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層小胞および多層小胞を含む。水性部分は、ｓｉＲＮＡ組成物を含む。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、この水性外部は、典型的にはｓｉＲＮＡ組成物を含まないが、一部の例では含むこともある。リポソームは、有効成分の作用部位への移送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜に構造的に類似しているため、リポソームが組織に接触すると、リポソーム二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞との一体化が進むと、ｓｉＲＮＡを含む内部水性成分が、細胞内に送達され、そこで、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合して、ＲＮＡｉを媒介することができる。場合によって、リポソームは、特異的に標的化され、例えば、ｓｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
ｓｉＲＮＡを含むリポソームは、様々な方法で調製することができる。一例では、リポソームの脂質成分は、洗剤に溶解され、これにより、ミセルが脂質成分で形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン脂質または脂質コンジュゲートとすることができる。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ｓｉＲＮＡ調製物が、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基が、ｓｉＲＮＡと相互作用して、ｓｉＲＮＡの周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、洗剤が、例えば、透析によって除去され、ｓｉＲＮＡのリポソーム調製物が得られる。
必要に応じて、凝縮を補助する担体化合物を、例えば、制御された添加によって、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）とすることができる。ｐＨを、凝縮に適するように調整することもできる。
送達ビヒクルの構造成分としてポリヌクレオチド／カチオン脂質複合体を包含する安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを形成するための方法のさらなる詳細が、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。リポソームの形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７； 米国特許第４，８９７，３５５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載されている例示的な方法の１つ以上の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質凝集体を調製するために一般的に使用される技術は、超音波処理および凍結融解と押し出しを含む（例えば、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）比較的均一な凝集体が望ましい場合は、微小流動化を使用することができる（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。このような方法は、ｓｉＲＮＡ剤調製物をリポソームの中にパッケージングするために容易に適合される。
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、核酸分子と複合体を形成するのではなく、核酸分子を取り込む。核酸分子および脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体が形成されるのではなく反発が起きる。とは言え、一部の核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に取り込まれる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達するために使用される。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２） ２６９－２７４）。
１つの重要な種類のリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、アニオン性融合性リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどから形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
リポソームをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入する他の方法の例として、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；同第９３／２４６４０号パンフレット；同第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、効率的には原形質膜と効率的に融合することができないが、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれるため、ｓｉＲＮＡをマクロファージに送達するために使用することができる。
リポソームのさらなる利点としては：天然リン脂質から得られるリポソームが、生体適合性かつ生体分解性であること；リポソームが、種々の水溶性および脂溶性薬物を取り込むことができること；リポソームが、内部区画内に取り込まれたｓｉＲＮＡを代謝および分解から保護できること（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）が挙げられる。リポソーム製剤の調製における重要な考慮すべき事項は、脂質表面の電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水中体積である。
正に帯電した合成カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自然に相互作用して脂質－核酸複合体を形成する小型リポソームを形成することができ、この脂質－核酸複合体は、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、結果としてｓｉＲＮＡを送達することができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７、ならびにＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの使用が記載されている米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
ＤＯＴＭＡ類似体、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体を形成する小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、高度にアニオン性の核酸を生きた組織培養細胞に送達するための有効な作用剤であり、この組織培養細胞は、負に帯電したポリヌクレオチドと自然に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームが使用されると、得られる複合体の正味荷電も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然に付着し、原形質膜に融合し、そして機能性核酸を、例えば、組織培養細胞に有効に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分が、エーテル結合ではなくエステルによって結合されているという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
他の報告されているカチオン性脂質化合物は、例えば、２種類のうちの１種類の脂質にコンジュゲートして、化合物、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）を含むカルボキシスペルミンを含め、様々な部分にコンジュゲートしたものを含む（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内に含められて製剤されたコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体を含む（Ｇａｏ， Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリシンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって形成されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株では、コンジュゲートカチオン性脂質を含むこのようなリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、かつより効率的なトランスフェクションを実現すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号明細書および同第９６／３７１９４号明細書に記載されている。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームには、他の製剤よりもいくつかの利点が存在する。このような利点は、投与された薬物の高い全身吸収に関連した副作用の低下、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、およびｓｉＲＮＡを皮膚に投与する能力が挙げられる。一部の実施では、リポソームは、ｓｉＲＮＡを上皮細胞に送達するために、そしてｓｉＲＮＡの皮膚組織、例えば、皮膚への浸透を促進するためにも使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用することができる。リポソームとして製剤された薬物の皮膚への局所送達は実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５－４１０ ａｎｄ ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２－５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５，１９８７を参照されたい）。
非イオン性リポソーム系もまた、特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系において、薬物の皮膚への送達における実用性を決定するために試験された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリル酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮に薬物を送達するために使用された。ｓｉＲＮＡを含むこのような製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。
ｓｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に形成することができる。このような変形性は、リポソームの平均半径よりも小さい孔にリポソームが進入するのを可能にし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの１種である。トランスファーソームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することによって作製することができる。ｓｉＲＮＡを含むトランスファーソームは、ｓｉＲＮＡを皮膚内のケラチノサイトに送達するために、例えば、皮下注射によって送達することができる。無傷の哺乳動物の皮膚を通過するためには、脂質小胞は、適当な経皮勾配の影響下で、直径がそれぞれ５０ｎｍ未満の一連の微孔を通って通過しなければならない。加えて、脂質の特性により、このようなトランスファーソームは、自己最適化性（例えば、皮膚の孔の形状に適応すること）、自己修復性であり得ると共に、多くの場合、断片化されずに標的に到達することができ、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ－ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
本発明に適用可能な他の製剤は、２００８年１月２日出願の米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日出願の同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日出願の同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日出願の同第６１／０４７，０８７号明細書；および２００８年５月８日出願の同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号パンフレットにも、本発明に適用可能な製剤が記載されている。
界面活性剤。説明を容易にするために、このセクションにおける製剤、組成物、および方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。界面活性剤は、製剤、例えば、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム（上記）において幅広い用途が見出されている。ｓｉＲＮＡ（または前駆体、例えば、プロセシングしてｓｉＲＮＡにすることができるより大きなｄｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくは前駆体をコードするＤＮＡ）組成物は、界面活性剤を含み得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、界面活性剤を含むエマルションとして製剤される。多数の異なる種類の天然および合成の両方の界面活性剤の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、この界面活性剤分子は、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品において幅広い用途が見出されており、広範囲のｐＨ値に対して使用可能である。一般に、これらのＨＬＢ値は、その構造によって２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスのうち最も一般的なメンバーである。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたときに負の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩、例えば、石鹸、アシル乳酸塩、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、硫酸アルキルおよび硫酸エトキシル化アルキル、スルホン酸塩、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウレート、およびスルホコハク酸塩、ならびにリン酸塩が挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスのうち最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたときに正の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩は、このクラスのうちで最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正または負のいずれの電荷も有する能力がある場合、この界面活性剤分子は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、およびホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
ミセルおよび他の膜状製剤。説明を容易にするために、このセクションにおけるミセルおよび他の製剤、組成物、および方法は、主に無修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらのミセルおよび他の製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、またはそれらの前駆体）組成物は、ミセル製剤として提供することができる。「ミセル」は、本明細書では、特定の種類の分子集合体として定義され、この分子集合体では、両親媒性分子の全ての疎水性部分が内側を向き、親水性部分が周囲の水相に接触するように両親媒性分子が球体構造に構成されている。環境が疎水性である場合は、反対の構成で存在する。
経皮膜を通る送達に適した混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液とアルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩とミセル形成化合物との混合によって調製することができる。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容される塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、およびこれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩と同時または添加後に、添加することができる。混合ミセルは、実質的にあらゆる種類の成分の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合が行われる。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物および少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次いで、第１のミセル組成物が、少なくとも３種類のミセル形成化合物と混合されて混合ミセル組成物が形成される。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属アルキル硫酸塩と少なくとも１種類のミセル形成化合物と混合され、次いで、残りのミセル形成化合物を添加して激しく混合することによって調製される。
フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定させて、細菌の増殖から保護することができる。あるいは、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールは、ミセル形成成分と共に添加しても良い。等張剤、例えば、グリセリンを、混合ミセル組成物の形成後に添加しても良い。
ミセル製剤を噴霧として送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることができ、このディスペンサーに噴霧剤を充填する。加圧下の噴霧剤は、ディスペンサー内で液体の形態である。水相と噴霧剤相とが１つになる、即ち、１つの相のみが存在するように、成分比が調整される。２つの相が存在する場合、内容物の一部を、例えば、計量弁によってディスペンスする前にディスペンサーを振盪する必要がある。医薬品のディスペンス量が、計量弁から微細な霧状で噴霧される。
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを挙げることができる。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）を使用しても良い。
必須成分の特定濃度を、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔からの吸収では、多くの場合、注射による投与または胃腸管を介した投与の投与量を、例えば、少なくとも２倍または３倍に増量するのが望ましい。
粒子。説明を容易にするために、このセクションにおける粒子、製剤、組成物、および方法は、主に修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明する。しかしながら、これらの粒子、製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、無修飾ｓｉＲＮＡ化合物を用いて実施することができ、このような実施が、本発明の範囲内であることを理解できよう。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、またはそれらの前駆体）調製物は、粒子、例えば、微粒子の中に含めることができる。微粒子は、噴霧乾燥によって製造することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって製造することもできる。
医薬組成物
本発明のｉＲＮＡ剤は、医薬用途用に製剤することができる。薬学的に許容される組成物は、単独で、あるいは１種以上の薬学的に許容される担体（添加剤）、賦形剤、および／または希釈剤と共に製剤される、前述の実施形態の何れかの１種以上のｄｓＲＮＡ剤を治療有効量、含む。
医薬組成物は、以下のように適合された投与を含め、固体または液体の形態で投与されるように特別に製剤することができる：（１）例えば、水薬（水性もしくは非水性溶液、または懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下、および体内吸収用の錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペーストの経口投与；（２）例えば、滅菌液もしくは懸濁液、または徐放製剤として、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射、もしくは硬膜外注射による非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、または放出制御パッチもしくはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム、フォームとして膣内または直腸内投与；（５）舌下投与；（６）眼内投与；（７）経皮的投与；あるいは（８）鼻内投与。皮下または点滴法を用いる送達は、特に有利であり得る。
本明細書で使用される「治療有効量」という句は、あらゆる治療に適用可能な妥当な効果／リスク比で、動物の細胞の少なくとも亜集団においてある程度の望ましい治療効果を得るのに有効な、本発明の化合物を含む化合物、材料、または組成物の量のことである。
「薬学的に許容される」という句は、本明細書では、妥当な効果／リスク比に見合った、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題や合併症が発生することなく、ヒトおよび動物の組織に接触させるのに適した、正当な医学的判断の範囲内である化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために利用される。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という句は、目的の化合物をある器官または体の一部から別の器官または体の一部への運搬または輸送に関与する薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、もしくはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ））、もしくは材料を被包する溶媒を意味する。各担体は、製剤の他成分と適合性であって、患者に有害でないという点で「許容可能」ではなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の一部の例として：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えば、マグネシウムステート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび座薬ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；（１０）グリコール、例えば、ポリエチレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天：（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ無水物；（２２）充填剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬ；（２２）医薬製剤に利用される他の無毒適合物質が挙げられる。
この製剤は、単位剤形で便利に提供することができ、薬学の分野で周知の任意の方法で調製することができる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療を受ける者および投与の特定の方式によって異なる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果が得られる化合物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、有効成分の約０．１％～約９９％、好ましくは約５％～約７０％、最も好ましくは約１０％～約３０％の範囲である。
特定の実施形態では、本発明の製剤としては、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物；および本発明の化合物からなる群から選択される賦形剤が挙げられる。特定の実施形態では、上述の製剤は、本発明の化合物を経口投与可能にする。
ｉＲＮＡ剤調製物は、別の作用剤、例えば、別の治療剤、またはｉＲＮＡを安定させる作用剤、例えば、ｉＲＮＡと複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて製剤することができる。なお他の作用剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、二価のカチオン、例えば、Ｍｇ２＋を除去するための）、塩、およびＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、特異性の広いＲＮＡ分解酵素阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体、および任意選択で１種以上の補助成分と結合させるステップを含む。一般に、この組成物は、本発明の化合物を液体担体、細かく分割された固体担体、または両方を均一に密着させて結合させ、次いで、必要に応じて製品を成形することによって調製する。
場合によっては、薬物の効果を持続させるために、皮下注射または筋肉注射による薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水に溶けにくい結晶または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。次に、薬物の吸収速度は、結晶のサイズおよび結晶の形態に依存し得る溶解速度によって決まる。あるいは、非経口投与される剤形（ｄｒｕｇ ｆｏｒｍ）の遅延吸収は、油性ビヒクル中に薬剤を溶解または懸濁することによって達成される。
本発明による化合物は、他の医薬品との類似性によって、ヒトまたは動物用の薬物に使用される任意の便利な方法で投与するために製剤することができる。
「治療」という語は、予防、療法、および治癒も包含するものとする。この治療を受ける患者は、霊長類、特にヒト、および他の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、およびヒツジ；ならびに一般的な家禽およびペットを含む、治療を必要とするあらゆる動物である。
二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、細胞に送達される外来性ＤＮＡ鋳型により、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞で産生される。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）、または定位注入（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４－３０５７を参照されたい）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得る、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリックスを含み得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写単位を含み得、１つの転写単位は、ｄｓＲＮＡ剤の上鎖を含む転写物を産生し、もう１つの転写単位は、ｄｓＲＮＡ剤の下鎖を含む転写物を産生する。鋳型が転写されると、ｄｓＲＮＡ剤が産生され、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤の断片にプロセシングされる。
送達経路
ｉＲＮＡを含む組成物は、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路としては：静脈、皮下、局所、直腸、肛門、膣、鼻、肺、眼が挙げられる。
本発明のｉＲＮＡ分子は、投与に適した医薬組成物に含めることができる。このような組成物は、典型的には、１種以上のｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語は、医薬品投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質用のこのような媒体および作用剤の使用は、当分野で周知である。あらゆる従来の媒体または作用剤が活性化合物と適合性でない場合を除き、その組成物中での使用が想定される。補助活性化合物を組成物に含めても良い。
本発明の組成物は、局所治療または全身治療が望ましいか否か、および治療される領域に基づいて様々な方式で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻、経皮を含む）、経口、または非経口とすることができる。非経口投与としては、点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、または気管支内もしくは脳室内投与が挙げられる。
投与の経路および部位は、標的化を強めるために選択することができる。例えば、筋細胞を標的とするためには、目的の筋肉内への筋肉注射は、論理的な選択であろう。肺細胞は、ｉＲＮＡを噴霧形態で投与することによって標的とすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをｉＲＮＡでコーティングして、ＤＮＡを機械的に導入することによって標的とすることができる。
用量
一態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤を対象（例えば、ヒト対象）に投与する方法を取り上げる。この方法は、（ａ）二本鎖部分が、１４～３０のヌクレオチド長さ、例えば、２１～２３のヌクレオチド長さである、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、外来性または病原体標的ＲＮＡ）に対して相補的である、かつ、任意選択で、（ｃ）１～５のヌクレオチド長さの少なくとも１つの３’オーバーハングを含む、ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ剤の単位用量を投与するステップを含む。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、５ｍｇ未満、２ｍｇ未満、１ｍｇ未満、０．５ｍｇ未満、０．１ｍｇ未満、０．０５ｍｇ未満、０．０１ｍｇ未満、０．００５ｍｇ未満、０．００１ｍｇ未満、０．０００５ｍｇ未満、０．０００１ｍｇ未満、０．００００５ｍｇ未満、または０．００００１ｍｇ未満であり、かつ体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤（例えば、約４．４×１０１６のコピー）、または体重１ｋｇ当たり１５００ｎｍｏｌ未満、７５０ｎｍｏｌ未満、３００ｎｍｏｌ未満、１５０ｎｍｏｌ未満、７５ｎｍｏｌ未満、１５ｎｍｏｌ未満、７．５ｎｍｏｌ未満、１．５ｎｍｏｌ未満、０．７５ｎｍｏｌ未満、０．１５ｎｍｏｌ未満、０．０７５ｎｍｏｌ未満、０．０１５ｎｍｏｌ未満、０．００７５ｎｍｏｌ未満、０．００１５ｎｍｏｌ未満、０．０００７５ｎｍｏｌ未満、０．０００１５ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤である。
規定量は、疾患または障害、例えば、標的ＲＮＡに関連した疾患または傷害を治療または予防するのに有効な量とすることができる。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内、皮下、もしくは筋肉内）、吸入投与、または局所適用によって投与することができる。一部の実施形態では、用量は、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ未満、５ｍｇ未満、２ｍｇ未満、１ｍｇ未満、または０．１ｍｇ未満とすることができる。
一部の実施形態では、単位用量は、１日に１回未満の頻度、例えば、２日に１回未満、４日に１回未満、８日に１回未満、または３０日に１回未満投与される。別の実施形態では、単位用量は、一定の頻度では投与されない（例えば、定期的な頻度ではない）。例えば、単位用量は、１回で投与することができる。
一実施形態では、有効量は、他の従来の治療様式で投与される。一実施形態では、対象は、ウイルス感染している患者であり、治療様式は、ｄｓＲＮＡ剤以外、例えば、ｓｉＲＮＡ剤以外の抗ウイルス剤である。別の実施形態では、対象は、アテローム性動脈硬化症であり、有効量のｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤が、例えば、外科介入後、例えば、血管形成術と組み合わせて投与される。
一実施形態では、対象に、初回量および１回以上の維持量のｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤にプロセシングすることができるより大きなｄｓＲＮＡ剤、またはｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤をコードするＤＮＡ、またはその前駆体）が投与される。１または複数の維持量は、初回量と同じ、または初回量よりも少なくする、例えば、初回量の半分とすることができる。維持療法は、１日に付き体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１５ｍｇの範囲、例えば、１日に付き体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．００１ｍｇ、または０．００００１ｍｇの１または複数の用量を用いて対象を治療するステップを含み得る。維持量は、例えば、２日に１回以下、５日に１回以下、１０日に１回以下、または３０日に１回以下投与される。さらに、治療法は、一定期間継続することができ、この期間は、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態によって異なり得る。特定の実施形態では、用量を、１日に１回以下、例えば、２４時間、３６時間、４８時間、またはそれ以上に１回、例えば、５日もしくは８日に１回投与することができる。治療後、患者の状態の変化および病態の症状の緩和について、患者を監視することができる。化合物の用量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しない場合は増量しても良いし、あるいは、疾患の状態の症状の緩和が観察された場合、疾患の状態が軽減された場合、または不所望の副作用が観察された場合は減量しても良い。
有効量は、必要に応じて、または特定の状況下で適切と見なされる場合、単回または２回以上の投与で投与することができる。反復または頻繁な注入を容易にしたい場合は、送達装置、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内、または関節内）、またはレザバーの植え込みを提案することができる。
一実施形態では、組成物は、複数のｄｓＲＮＡ剤種を含む。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤種は、天然の標的配列に関しては、別の種とオーバーラップも隣接もしていない配列を有する。別の実施形態では、複数のｄｓＲＮＡ剤種は、異なる天然の標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対立遺伝子特異的である。
本明細書に記載される本発明のｄｓＲＮＡ剤は、哺乳動物、特に大きい動物、例えば、非ヒト霊長類またはヒトに様々な方法で投与することができる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとして、または拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、くも膜下、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻、尿道、または眼内である。投与は、対象によって、または別の人間、例えば、医療提供者によって行うことができる。薬物治療は、測定した用量で、または測定した用量を送達するディスペンサで行うことができる。選択される送達方式は、以下に詳細に説明される。
本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ剤の直腸投与または送達のための方法、組成物、およびキットを提供する。
標的遺伝子の発現を阻害する方法
本発明の実施形態は、標的遺伝子の発現を阻害する方法にも関する。この方法は、前述のいずれかの実施形態のｄｓＲＮＡ剤を、標的遺伝子の発現を阻害するのに有効な量、投与するステップを含む。
別の態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を細胞に供給するステップを含む、前記細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。一実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ－Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ－２遺伝子、ヘプシデン（ｈｅｐｃｉｄｅｎ）、活性化プロテインＣ、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ－１遺伝子、β－カテニン遺伝子、ｃ－ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子の突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異、ＲＡＳ遺伝子の突然変異、カベオリンＩ遺伝子の突然変異、ＭＩＢ Ｉ遺伝子の突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異、Ｍ６８遺伝子の突然変異、腫瘍抑制遺伝子の突然変異、およびｐ５３腫瘍抑制遺伝子の突然変異からなる群から選択される。
本発明が、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらの実施例は、さらなる限定と解釈されるべきものではない。本出願で言及される全ての参照文献、出願中の特許出願、および公開特許の開示内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられるものとする。
実施例１：ｓｉＲＮＡ二重鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニング
細胞の培養およびトランスフェクション：
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞またはラットＨ．ＩＩ．４．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）が添加されたＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２の大気で、３７℃でほぼコンフルエンスになるまで増殖させてから、トリプシン処理によりプレートから剥離させた。１ウェルに付き１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８－１５０）を、９６ウェルプレートの５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖が入っている各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートすることによってトランスフェクションを行った。約２×１０４ Ｈｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質無添加の８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を、２４時間または１２０時間インキュベートしてから、ＲＮＡを精製した。単回投与実験を、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二重鎖濃度で行い、用量反応実験を、１０ｎＭの最終二重鎖濃度の最大投与量で８倍、４倍の段階希釈を用いて行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ ＃：６１０－１２）を用いた全ＲＮＡの単離
細胞を採取し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中で溶解し、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度を全過程で同じとした）。１０μｌの磁気ビーズおよび８０μｌの溶解／結合緩衝液の混合物を丸底プレートに添加し、１分間混合した。磁気ビーズを、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズをかく乱せずに上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに添加し、５分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを、１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再び捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加し、７０℃で５分間混合した。ビーズを磁気上に５分間捕捉した。４０μｌの上清を取り出し、別の９６ウェルプレートに添加した。
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：
１回の反応に付き、１μｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＴＮＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮＡ分解酵素阻害剤、および１．６μｌのＨ２Ｏを含むマスターミックスを５μｌの全ＲＮＡに添加した。ｃＤＮＡを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ－１０００またはＳ－１０００サーマルサイクラーを用いて、２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５秒、４℃に保持するステップによって作製した。
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）の各ウェルの０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃４３２６３１７Ｅ（ヒト） Ｃａｔ＃４３０８３１３（げっ歯類））、０．５μｌのＴＴＲ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＨＳ００１７４９１４＿ｍ１（ヒト）ｃａｔ＃Ｒｎ００５６２１２４＿ｍ１（ラット））、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲを、Ｒｏｃｈｅ ＬＣ ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）で行った。特段の記載がない限り、各二重鎖を、少なくとも２つの別個のトランスフェクションで試験し、各トランスフェクションを二連でアッセイした。
相対的な倍数変化を計算するために、リアルタイムデータをΔΔＣｔ法を用いて分析し、１０ｎＭ ＡＤ－１９５５でトランスフェクトされた細胞または模擬トランスフェクト細胞を用いて行われたアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０を、ＸＬＦｉｔを使用する４パラメーターフィットモデルを用いて計算し、同じ用量範囲もしくはそれ自体の最低用量に対して、ＡＤ－１９５５でトランスフェクトされた細胞または未処置細胞に対して正規化した。ＩＣ５０を、個々のトランスフェクションおよび組み合わせに対して計算し、１つのＩＣ５０を両方のトランスフェクションからのデータに対してフィットさせた。
本発明の様々なモチーフ修飾を有する例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の遺伝子サイレンシングの結果が、以下の表に示されている。
実施例２．ＲＮＡ合成および二重鎖アニーリング
１．オリゴヌクレオチド合成：
全てのオリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機またはＡＢＩ ３９４合成機で合成した。特段の記載がない限り、オリゴヌクレオチドの合成には、市販の制御された孔を有するガラス固体支持体（ｄＴ－ＣＰＧ，５００Å，Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、および標準的な保護基を有するＲＮＡホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル Ｎ６－ベンゾイル－２’－ｔ－ブチルジメチルシリル－アデノシン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ４－アセチル－２’－ｔ－ブチルジメチルシリル－シチジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル（ｉｓｏｂｕｔｒｙｌ）－２’－ｔ－ブチルジメチルシリル－グアノシン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホラミダイト、および５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－ｔ－ブチルジメチルシリル－ウリジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。２’－Ｆ ホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ４－アセチル－２’－フルオロ－シチジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチル－ホスホラミダイトおよび５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－フルオロ－ウリジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチル－ホスホラミダイトは（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入した。全てのホスホラミダイトは、１０％ ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中、０．２Ｍの濃度で使用したグアノシンを除いて、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中、０．２Ｍの濃度で使用した。１６分のカップリング／リサイクリング時間を使用した。活性化物質は、５－エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＯ酸化用にはヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化用には２，６－ルチジン／ＡＣＮ（１：１ ｖ／ｖ）に溶解したＰＡＤＳ（２％）を使用した。
リガンドコンジュゲート鎖を、対応するリガンドを含む固体支持体を用いて合成した。例えば、配列の３’末端の糖質部分／リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ用）の導入は、対応する糖質固体支持体で合成を開始することによって達成した。同様に、３’末端のコレステロール部分を、コレステロール支持体で合成を開始することによって導入した。一般に、リガンド部分は、前述の実施例で説明されたものから選択されるテザーを介してトランス－４－ヒドロキシプロリノールに連結してヒドロキシプロリノール－リガンド部分を得た。次いで、ヒドロキシプロリノール－リガンド部分を、コハク酸リンカーを介して固体支持体に結合する、または標準的なホスフィチル化条件によってホスホラミダイトに変換して、所望の糖質コンジュゲート構成要素を得た。フルオロフォア標識ｓｉＲＮＡを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した対応するホスホラミダイトまたは固体支持体で合成した。オレイルリトコール酸（ＧａｌＮＡｃ）３ポリマー支持体を、３８．６μｍｏｌ／グラムの添加（ｌｏａｄｉｎｇ）で社内で作製した。マンノース（Ｍａｎ）３ポリマー支持体も、４２．０μｍｏｌ／グラムの添加で社内で作製した。
所望の位置、例えば、配列の５’末端での、選択されたリガンドのコンジュゲーションは、特段の記載がない限り、標準的なホスホラミダイト結合条件下で、対応するホスホラミダイトを成長中の鎖に結合させることによって達成した。固体結合オリゴヌクレオチドに対する、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール活性化物質の存在下での無水ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍのホスホラミダイト溶液の１５分間の長時間の結合を行った。（１）に報告されているように標準的なヨウ素水を用いて、または１０分の酸化待ち時間でコンジュゲートオリゴヌクレオチドをｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いる処理によって、ヌクレオチド間亜リン酸塩のリン酸塩への酸化を行った。ホスホロチオエートは、硫黄転移試薬、例えば、ＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入）、ＰＡＤＳ、およびまたはＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用いて、亜リン酸塩からホスホロチオエートへの酸化によって導入した。コレステロールホスホラミダイトは、社内で合成し、ジクロロメタン中、０．１Ｍの濃度で使用した。コレステロールホスホラミダイトの結合時間は１６分とした。
２．脱保護－Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成の完了後、支持体を１００ｍｌガラスボトル（ＶＷＲ）に移した。８０ｍＬのエタノールアンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］の混合物を用いて、５５℃で６．５時間、塩基とリン酸基を脱保護すると同時にオリゴヌクレオチドを支持体から切断した。ボトルを氷上で短時間冷却し、次いで、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい２５０ｍＬのボトルに入れた。ＣＰＧを２×４０ｍＬ部のエタノール／水（１：１ ｖ／ｖ）で洗浄した。次いで、混合物の容量をロトバップで約３０ｍＬにまで減らした。次いで、この混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバックにより真空下で乾燥させた。
３．脱保護－ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍｌのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ．３ＨＦ）、またはピリジン－ＨＦとＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで、反応を５０ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調整し、精製までフリーザーで保存した。
４．分析
オリゴヌクレオチドは、精製の前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、緩衝液とカラムの選択は、配列およびまたはコンジュゲートしたリガンドの性質によって決まる。
５．ＨＰＬＣの精製
リガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを、逆相分取ＨＰＬＣによって精製した。非コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、社内で充填されたＴＳＫゲルカラム上のアニオン－交換ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ（緩衝液Ａ）中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）および１０％ＣＨ３ＣＮ、１ＭのＮａＢｒ（緩衝液Ｂ）中の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）とした。完全長オリゴヌクレオチドを含む分画をプールし、脱塩し、そして凍結乾燥させた。ＯＤが約０．１５の脱塩オリゴヌクレオチドを１５０μｌになるまで水で希釈し、次いで、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析用の特殊なバイアルにピペットで移した。最後に、化合物をＬＣ－ＥＳＭＳおよびＣＧＥによって分析した。
６．ｓｉＲＮＡの調製
ｓｉＲＮＡの調製のために、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、１×ＰＢＳ中、９５℃で５分間加熱し、ゆっくりと冷却して室温にした。二重鎖の完全性をＨＰＬＣ分析によって確認した。
Figure 0007191155000007
Figure 0007191155000008
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Figure 0007191155000021
Figure 0007191155000022
実施例３：ＴＴＲ ｓｉＲＮＡに対する様々な化学修飾を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏサイレンシング活性
各修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを用いた標準的な逆トランスフェクションによってＨｅｐ３Ｂ細胞で決定する。簡単に述べると、逆トランスフェクションは、９６ウェルプレートの各ウェルの５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖に５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを、１０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８－１５０）と共に添加し、室温で１５～２０分間インキュベートすることによって行う。インキュベーション後、１２，０００～１５，０００のＨｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質無添加の１００μＬの完全増殖培地を各ウェルに添加する。細胞を、５％ＣＯ２の大気、３７℃で２４時間インキュベートしてから溶解し、ｂＤＮＡ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ）によりＡｐｏＢおよびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを分析する。１０ｎＭ～０．６ｐＭの範囲の７つの異なるｓｉＲＮＡ濃度を、ＩＣ５０の決定のために評価し、ＡｐｏＢトランスフェクト細胞のＡｐｏＢ／ＧＡＰＤＨを、１０ｎＭのＬｕｃ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に対して正規化する。
Figure 0007191155000023
Figure 0007191155000024
Figure 0007191155000025
Figure 0007191155000026
Figure 0007191155000027
Figure 0007191155000028
Figure 0007191155000029
Figure 0007191155000030
実施例４：ＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡに対する様々な化学修飾を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏサイレンシング活性
細胞培養およびトランスフェクション
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）が添加されたＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２の大気で、３７℃でほぼコンフルエンスになるまで増殖させてから、トリプシン処理によりプレートから剥離させた。１ウェルに付き１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８－１５０）を、９６ウェルプレートの５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖が入っている各ウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートすることによってトランスフェクションを行った。約２×１０４のＨｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質無添加の８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を、２４時間または１２０時間インキュベートしてから、ＲＮＡを精製した。特段の記載がない限り、単回投与実験は、１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二重鎖濃度で行い、用量反応実験は、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０００５ｎＭ、０．０００１ｎＭ、０．００００５ｎＭ、および０．００００１ｎＭの最終二重鎖濃度で行った。
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
１回の反応に付き、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮＡ分解酵素阻害剤、および３．２μｌのＨ２Ｏを含むマスターミックスを１０μｌの全ＲＮＡに添加した。ｃＤＮＡを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ－１０００またはＳ－１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて次のステップ：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃に保持によって作製した。
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェル５０プレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）の各ウェルのマスターミックス（０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのＡＮＧＰＴＬ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃Ｈｓ００２０５５８１＿ｍ１）、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を含む）に添加した。リアルタイムＰＣＲを、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いてＡＢＩ ７９００ＨＴ リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。要約表に特段の記載がない限り、各二重鎖を２つの別個のトランスフェクションで試験し、各トランスフェクションを二連でアッセイした。
相対的な倍数変化を計算するために、リアルタイムデータをΔΔＣｔ法を用いて分析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５でトランスフェクトされた細胞または模擬トランスフェクト細胞を用いて行われたアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０を、ＸＬＦｉｔを使用する４パラメータフィットモデルを用いて計算し、同じ用量範囲もしくはそれ自体の最低用量に対してＡＤ－１９５５でトランスフェクトされた細胞または未処置細胞に対して正規化した。負のコントロールとして使用されるＡＤ－１９５５配列は、ルシフェラーゼを標的とし、以下の配列を有する：
センス鎖：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ；
アンチセンス鎖：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ。
上記の様々な実施形態を組み合わせて別の実施形態を作成することができる。本明細書で言及される全ての米国特許、公開米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられるものとする。様々な特許、特許出願、および公開特許出願の概念を利用してなお別の実施形態を作成する必要がある場合は、実施形態の態様を変更することができる。
上記の詳細な説明を鑑みて、これらおよび他の変更を実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される語は、以下の特許請求の範囲を本明細書および添付の特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきものではなく、このような特許請求の範囲に付与される等価物の全範囲における全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示によって限定されるものではない。

Claims (24)

  1. 標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記各鎖が、１４～３０のヌクレオチドを有し、二重鎖が、以下の式（ＩＩＩ）で表され：
    センス鎖：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
    アンチセンス鎖：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
    （ＩＩＩ）
    式中、
    ｉ、ｊ、ｋ、およびｌはそれぞれ独立して、０または１であり、ｉとｋが同じであり、そして、ｊとｌが同じであり；
    ｐおよびｑはそれぞれ独立して、０～６であり；
    各ＮａおよびＮａ’は独立して、２～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、前記各配列が、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は独立して、０～６のヌクレオチドを含むオーバーハングヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し；かつ
    ＹＹＹの次の各Ｎｂのヌクレオチドの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、Ｙ’Ｙ’Ｙ’の次の各Ｎｂ’のヌクレオチドの修飾が、Ｙ’の修飾とは異なり、
    Ｙ’が２’－ＯＭｅであり；
    Ｙが２’－Ｆであり；
    ＹＹＹモチーフが、前記センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し；
    各ＮａヌクレオチドはＮａ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、
    各ＮｂヌクレオチドはＮｂ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、
    ｉとｋが１であるとき、各ＸヌクレオチドはＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、
    各ＹヌクレオチドはＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、
    ｊとｌが１であるとき、各ＺヌクレオチドはＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、そして
    各ヌクレオチド修飾は独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され；そして
    アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８のリン酸塩のヌクレオチド間結合によって分離された２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む、
    二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  2. ｉが１である；ｊが１である；またはｉとｊの両方が１である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  3. ｋが１である；ｌが１である；またはｋとｌの両方が１である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  4. 二重鎖領域が１７～２３のヌクレオチド長さであるとき、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し、この位置は、アンチセンス鎖の５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる；またはアンチセンス鎖の５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  5. 式中、ｉとｋが１であり、ｊとｌが０であり、そして、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  6. 式中、ｉとｋが０であり、ｊとｌが１であり、そして、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  7. 前記式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩｃ）として表され：
    ５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
    ３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’－ｎｑ ’５’
    （ＩＩＩｃ）
    式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は独立して、２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  8. 二重鎖領域が、１７～３０のヌクレオチド対の長さである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  9. 二重鎖領域が、１７～１９のヌクレオチド対の長さである、請求項８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  10. 二重鎖領域が、２７～３０のヌクレオチド対の長さである、請求項８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  11. 前記各鎖が、１７～３０のヌクレオチドを有する、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  12. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－ＯＣＨ３または２’－Ｆの何れかで修飾されている、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  13. 少なくとも１つのリガンドをさらに含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  14. 前記リガンドが、二価または三価分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  15. 前記リガンドが、前記センス鎖の３’末端に付着している、請求項１３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  16. 少なくとも１つのメチルホスホネートのヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  17. 前記二重鎖の５’末端の１位の塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  18. 式
    ５’Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ３’
    ３’ｎｐ’－Ｎａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’５’
    として表される、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  19. 各Ｎａおよび／またはＮｂが、交互パターンの修飾を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  20. 交互パターンがＡＢ交互パターンである、請求項１９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  21. 請求項１～２０の何れか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を単独で、または薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と共に含む医薬組成物。
  22. 請求項１～２０の何れか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を標的遺伝子の発現を阻害するのに有効な量で含む、前記標的遺伝子の発現を阻害するための組成物。
  23. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下投与または静脈投与によって投与される、請求項２２に記載の組成物。
  24. 対象の特定の標的にポリヌクレオチドを送達するための組成物であって、前記組成物が、前記ポリヌクレオチドが前記対象の前記特定の標的に送達されるように、請求項１～２０の何れか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含み、皮下投与によって前記対象に投与される、組成物。
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