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JP2024504694A - 修飾二本鎖オリゴヌクレオチド - Google Patents

修飾二本鎖オリゴヌクレオチド Download PDF

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JP2024504694A
JP2024504694A JP2023544226A JP2023544226A JP2024504694A JP 2024504694 A JP2024504694 A JP 2024504694A JP 2023544226 A JP2023544226 A JP 2023544226A JP 2023544226 A JP2023544226 A JP 2023544226A JP 2024504694 A JP2024504694 A JP 2024504694A
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エイミー エム． ディートン
ジョナサン エドワード ファーリー
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バサント アール． ジャドハブ
シャラランボス カイッタニス
マーク キーティング
ジンシュアン リュウ
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スチュアート ミルシテイン
バウミク エイ． パーンディヤ
マンガラ ミーナクシ ソウンダラパンディアン
ジェフリー ツバー
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Abstract

本発明の一局面は、標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖RNA（dsRNA）剤に関する。本発明の別の局面は、治療的使用に適したそれらのdsRNA分子を含む薬学的組成物、およびそれらのdsRNA分子を例えばさまざまな疾患状態を処置するために投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法に関する。TIFF2024504694000123.tif92156

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第119条（e）に基づき、2021年1月22日に出願された米国仮出願第63/140,714号、2021年2月5日に出願された米国仮特許出願第63/146,115号、2021年2月12日に出願された米国仮特許出願第63/148,991号、2021年2月26日に出願された米国仮特許出願第63/153,983号、2021年3月4日に出願された米国仮特許出願第63/156,476号、2021年3月15日に出願された米国仮特許出願第63/161,313号、2021年3月22日に出願された米国仮特許出願第63/164,467号、2021年4月26日に出願された米国仮特許出願第63/179,607号、および2021年4月29日に出願された米国仮特許出願第63/141,748号の恩典を主張し、これらの各米国仮特許出願の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、標的遺伝子発現の阻害にとって有利な特定モチーフを有するdsRNA分子、および治療的使用に適したdsRNA剤組成物に関する。加えて、本発明は、例えばさまざまな疾患の処置のために、これらのdsRNA剤を投与することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
背景
RNA干渉、すなわち「RNAi」は、二本鎖RNAi（dsRNA）が遺伝子発現を遮断できるという観察を記述するために、Fireとその共同研究者らが最初に造語した用語である（Fire et al.（1998）Nature 391,806-811、Elbashir et al.（2001）Genes Dev.15,188-200（非特許文献1））。短鎖dsRNAは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを指示し、遺伝子機能を研究するための新しいツールになっている。RNAiは、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーRNAを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼであるRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）によって媒介される。RISCが、二本鎖RNAトリガーに由来する短鎖RNA（およそ22ヌクレオチド）を含有することは公知であるが、この活性のタンパク質構成要素は不明なままだった。
当技術分野では、標的遺伝子発現を阻害するのに有利な、dsRNA分子のための効果的なヌクレオチドモチーフまたは化学モチーフが、今なお必要とされている。本発明はその努力に向けられる。
Fire et al.（1998）Nature 391,806-811、Elbashir et al.（2001）Genes Dev.15,188-200
概要
本発明は、標的遺伝子発現の阻害にとって有利な、dsRNA分子のための効果的なヌクレオチドモチーフまたは化学モチーフ、および治療的使用に適したRNAi組成物を提供する。
本発明者は、特に、少なくともセンス鎖の位置10に2'-フルオロヌクレオチドを有する二本鎖RNA（dsRNA）分子が、予想外にまた驚いたことに、改良されたインビトロ効力、すなわち増加したRNA干渉（RNAi）活性を有することを発見した。したがって、一局面において、本明細書では、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、各鎖は独立して15～35ヌクレオチドの長さを有し、センス鎖がセンス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含む、二本鎖RNA（dsRNA）が提供される。
センス鎖が、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4または5つの、追加の2'-フルオロヌクレオチドをさらに含みうることに注意されたい。したがって、いくつかの態様において、センス鎖は、1、2、3、4または5つの追加の2'-フルオロヌクレオチドを含む。追加の2'-フルオロヌクレオチドはセンス鎖中のどこにでも位置することができる。したがって、いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置8、9、11または12に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む。言い換えると、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9および10に2'-フルオロヌクレオチドを含む。別の一例において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置11に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの別の態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置8、9および10に2'-フルオロヌクレオチドを含む。さらにいくつかの別の態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10、11および12に2'-フルオロヌクレオチドを含む。
上記局面のいずれか一つのいくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチドを含まない。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む。
本明細書記載のdsRNA分子のアンチセンス鎖は、1つまたは複数の2'-デオキシ、例えば2'-H、ヌクレオチドを含むことができる。例えばアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6つまたはそれ以上の2'-デオキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、2、3、4、5または6つの2'-デオキシヌクレオチドを含む。2'-デオキシヌクレオチドはアンチセンス鎖中のどこにでも位置することができる。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12、14および16のうちの1、2、3、4、5または6つに、2'-デオキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンスは、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5つまたはそれ以上の、2'-フルオロヌクレオチドを含むことができる。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に、2'-デオキシまたは2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に、2'-デオキシまたは2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつ位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-OMeヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に、2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、12および14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含みかつ位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む。
さまざまな態様において、dsRNA分子は、19～25塩基対の二本鎖（二重鎖）領域を有する。例えばdsRNA分子は、20、21、22、23または24塩基対の二重鎖領域を有する。いくつかの特定態様において、dsRNA分子は、20、21または22塩基対の二本鎖（二重鎖）領域を有する。
いくつかの態様において、dsRNA分子はリガンドを含む。例えばdsRNA分子のセンス鎖はリガンドを含む。例示的なリガンドとして、ASGPRリガンドおよび親油性基を含むリガンドが挙げられるが、それらに限定されない。
dsRNA分子は、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5、6、7、8つまたはそれ以上のホスホロチオエート連結部を含むことができる。ホスホロチオエート連結部は、dsRNAの鎖のうちの一方だけに、または両方の鎖に、存在することができる。例えばセンス鎖は1、2、3または4つのホスホロチオエート連結部を含むことができる。非限定的な別の一例において、アンチセンス鎖は、1、2、3、4、5または6つのホスホロチオエート連結部を含むことができる。いくつかの態様において、センス鎖は、1、2、3または4つのホスホロチオエート連結部を含み、アンチセンスは、独立して、1、2、3、4、5または6つのホスホロチオエート連結部を含む。例えばセンス鎖は1つまたは2つのホスホロチオエート連結部を含み、アンチセンス鎖は1、2、3または4つのホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含み、アンチセンスは、アンチセンス鎖の3'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部をさらに含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間にホスホロチオエート連結部を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えてヌクレオチド1と2の間、およびヌクレオチド2と3の間、ならびにアンチセンス鎖の3'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間に、ホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様において、dsRNA中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。例えばセンス鎖中の残りのヌクレオチドはすべて2'-OMeヌクレオチドである。言い換えると、センス鎖だけで、2'-フルオロヌクレオチドと2'-OMeヌクレオチドとを含む。
アンチセンス鎖はRNA干渉を媒介するために標的配列に対して十分な相補性を有すると理解される。言い換えると、本発明のdsRNA分子は標的遺伝子の発現を阻害することができる。
別の一局面において、本発明は、皮下投与または静脈内投与によって本発明のdsRNA分子を対象中の特異的標的に送達するための方法を、さらに提供する。本発明は、皮下投与または静脈内投与によって該剤を対象中の特異的標的に送達するための方法において使用するための本発明のdsRNA分子を、さらに提供する。
この特許書類または出願書類は、カラーで作成された図面を少なくとも1つ含んでいる。カラー図面を含むこの特許または特許出願公報の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。
図1Aおよび1Bは、本発明の例示的態様によるdsRNAが、10nM（図1A）または1nM（図1）で投与された場合に、親dsRNA分子と比較して改良されたインビトロ効力を有することを示すグラフである。 図2A～2Dは、本発明の態様によるdsRNA分子が親分子と比べて改良されたインビボ有効性を有することを示すグラフである。親二重鎖は、AD-1181401（配列1、図2A）、AD-1181410（配列2、図2B）、AD-1181426（配列3、図2C）およびAD-1181451（配列4、図2D）である。 図3A～3Dは、さまざまな標的を標的とする本発明の例示的態様によるdsRNAが、1nM（図3Aおよび3B）または0.1nM（図3C）で投与された場合に、親dsRNA分子と比較して改良されたインビトロ効力を有することを示すグラフである。 図4A～4Cは、センス鎖の5'端から数えてセンス鎖の位置10における2'-フルオロヌクレオチドの存在が、dsRNA分子のRNAi有効性を、親と比べて強化することを示すグラフである。 本発明の態様によるdsRNA分子のいくつかの例示的デザインの略図である。 本発明の態様によるdsRNA分子のいくつかの例示的デザインの略図である。 図6Aおよび6Bは、例示的親dsRNA分子と比較した、本開示のいくつかの態様による例示的dsRNAの、インビトロ標的ノックダウン（図6A）およびlog2活性（図6B）を示すグラフである。 図7Aおよび7Bは、AGTを標的とする例示的親dsRNA分子と比較した、本開示のいくつかの態様による例示的dsRNAの、インビトロ標的AGTノックダウン（図6A）およびlog2活性（図6B）を示すグラフである。 マウス肝ホモジネート（図8Aおよび8E）、ラット肝ホモジネート（図8Bおよび8F）、ラット脳ホモジネート（図8Cおよび8G）およびカニクイザル肝ホモジネート（図8Dおよび8H）における、例示的dsRNA分子のセンス鎖（図8A～8D）およびアンチセンス鎖（図8E～8H）の、類似する、または改良された、代謝安定性を示している。親二重鎖は、AD-1181401（TTR Seq 1）、AD-1181410（TTR Seq 2）およびAD-74210（F12）である。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図9Aおよび9Bは、マウスにおける、例示的dsRNA分子の、類似する、または改良された、代謝安定性を示している。親二重鎖は、AD-1181401（TTR Seq 1）、AD-1181410（TTR Seq 2）およびAD-74210（F12）である。 図10A～10Dは、本発明の態様によるdsRNA分子が、非ヒト霊長類、マウス（図10Aおよび10B）およびカニクイザル（図10Cおよび10D）において、親分子AD-74210（図10Aおよび10C）およびAD-75885（図10Bおよび10D）と比べて、改良されたインビボ有効性および/または持続時間を有することを示すグラフである。
詳細な説明
一局面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖RNA（dsRNA）剤を提供する。限定されるわけではないが、本発明のdsRNA剤はdsRNA分子に代えて使用することができ、限定するわけではないがインビトロ応用またはインビボ応用を含む、RNA干渉に基づく遺伝子サイレンシング技法において、使用することができる。
一般にdsRNA分子はセンス鎖（パッセンジャー鎖ともいう）とアンチセンス鎖（ガイド鎖ともいう）とを含む。dsRNA分子の各鎖は15～35ヌクレオチド長の範囲にあることができる。例えば各鎖は、17～35ヌクレオチド長、17～30ヌクレオチド長、25～35ヌクレオチド長、27～30ヌクレオチド長、17～23ヌクレオチド長、17～21ヌクレオチド長、17～19ヌクレオチド長、19～25ヌクレオチド長、19～23ヌクレオチド長、19～21ヌクレオチド長、21～25ヌクレオチド長、または21～23ヌクレオチド長であることができる。限定されるわけではないが、センス鎖とアンチセンス鎖は長さが等しくてもよいし、長さが等しくなくてもよい。例えばセンス鎖とアンチセンス鎖は、独立して、18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は15～35ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、15～35、17～35、17～30、25～35、27～30、17～23、17～21、17～19、19～25、19～23、19～21、21～25、21～25または21～23ヌクレオチド長である。例えばアンチセンス鎖は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35ヌクレオチド長であることができる。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド長である。例えばアンチセンス鎖は、21、22、23、24または25ヌクレオチド長である。いくつかの特定態様において、アンチセンス鎖は、22、23または24ヌクレオチド長である。例えばアンチセンス鎖は23ヌクレオチド長である。
アンチセンス鎖と同様に、センス鎖も、いくつかの態様において、15～35ヌクレオチド長であることができる。いくつかの態様において、センス鎖は、15～35、17～35、17～30、25～35、27～30、17～23、17～21、17～19、19～25、19～23、19～21、21～25、21～25または21～23ヌクレオチド長である。例えばセンス鎖は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35ヌクレオチド長であることができる。いくつかの態様において、センス鎖は、17、18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド長である。例えばセンス鎖は、19、20、21、22または23ヌクレオチド長である。いくつかの特定態様において、センス鎖は、20、21または22ヌクレオチド長である。例えばセンス鎖は21ヌクレオチド長である。
いくつかの態様において、センス鎖は15～35ヌクレオチド長であることができ、アンチセンス鎖はセンス鎖とは独立して15～35ヌクレオチド長であることができる。いくつかの態様において、センス鎖は、15～35、17～35、17～30、25～35、27～30、17～23、17～21、17～19、19～25、19～23、19～21、21～25、21～25または21～23ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、独立して、15～35、17～35、17～30、25～35、27～30、17～23、17～21、17～19、19～25、19～23、19～21、21～25、21～25または21～23ヌクレオチド長である。例えばセンス鎖とアンチセンス鎖は、独立して、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35ヌクレオチド長であることができる。いくつかの態様において、センス鎖とアンチセンス鎖は、独立して、17、18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド長であることができる。例えばセンス鎖は19、20、21、22または23ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は21、22、23、24または25ヌクレオチド長である。いくつかの特定態様において、センス鎖は20、21または22ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は22、23または24ヌクレオチド長である。例えばセンス鎖は21ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は23ヌクレオチド長である。
センス鎖とアンチセンス鎖は、典型的には、二本鎖領域または二重鎖領域を形成する。限定されるわけではないが、本明細書記載のdsRNA剤の二重鎖領域は、12～35ヌクレオチド（または塩基）対長であることができる。例えば二重鎖領域は、14～35ヌクレオチド対長、17～30ヌクレオチド対長、25～35ヌクレオチド長、27～35ヌクレオチド対長、17～23ヌクレオチド対長、17～21ヌクレオチド対長、17～19ヌクレオチド対長、19～25ヌクレオチド対長、19～23ヌクレオチド対長、19～21ヌクレオチド対長、21～25ヌクレオチド対長または21～23ヌクレオチド対長であることができる。別の一例において、二重鎖領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26および27ヌクレオチド対長から選択される。いくつかの態様において、二重鎖領域は18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド対長である。例えば二重鎖領域は、19、20、21、22または23ヌクレオチド対長である。いくつかの態様において、二重鎖領域は、20、21または22ヌクレオチド対長である。例えばdsRNA分子は21塩基対の二重鎖領域を有する。
本明細書に記載するとおり、本発明のdsRNA分子は、少なくとも1つの、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の、2'-デオキシ、例えば2'-H、ヌクレオチドをさらに含むことができる。例えばdsRNAは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-デオキシ、例えば2'-H、ヌクレオチドを含むことができる。2'-デオキシヌクレオチドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖の、または両方の鎖の、どの位置にあるどのヌクレオチドにも、存在しうる。非限定的な一例において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置11に2'-デオキシヌクレオチドを含まない。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖アンチセンス鎖は、1、2、3、4、5または6つの2'-デオキシヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、2、3、4、5または6つの2'-デオキシヌクレオチドを含むことができる。2'-デオキシヌクレオチドはアンチセンス鎖中のどこにでも位置することができる。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12、14および16のうちの1、2、3、4、5または6つに、2'-デオキシヌクレオチドを含む。非限定的な一例において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12のうちの1、2、3または4つに、2'-デオキシヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置5、7および12に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5および7に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12および14に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12、14および16に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2または12に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。例えばアンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置12に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、センス鎖はセンス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンスはアンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む。例えば、センス鎖はセンス鎖の5'端から数えて位置9および10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンスはアンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む。別の一例において、センス鎖はセンス鎖の5'端から数えて位置8、9および10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンスはアンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、センス鎖はセンス鎖の5'端から数えて位置10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンスはアンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む。例えば、センス鎖はセンス鎖の5'端から数えて位置10、11および12に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンスはアンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む。
上記局面のいずれか一つのいくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチドを含まない。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11のうちの少なくとも1つ、例えば1、2または3つに、2'-フルオロヌクレオチドを含むが、位置7には2'-フルオロヌクレオチドを含まない。いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9および10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9および10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、センス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
2'-フルオロ修飾（アンチセンス鎖）
本発明のdsRNA分子は、1つまたは複数の（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の）2'-フルオロヌクレオチドを含む。限定されるわけではないが、2'-フルオロヌクレオチドはすべてが1本の鎖中に存在することができる。いくつかの態様では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が少なくとも1つの2'-フルオロヌクレオチドを含む。2'-フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に存在することができる。例えば2'-フルオロ修飾はセンス鎖上および/またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチドに存在することができ、または各2'-フルオロ修飾はセンス鎖上もしくはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在することができ、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は両方の2'-フルオロ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の2'-フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであっても異なってもよく、センス鎖上の2'-フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の2'-フルオロ修飾の交互パターンに対してシフトしていてもよい。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、少なくとも2つ（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上）の2'-フルオロヌクレオチドを含む。限定されるわけではないが、アンチセンス鎖中の2'-フルオロ修飾は任意の位置に存在することができる。
いくつかの態様において、アンチセンスは、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5つまたはそれ以上の、2'-フルオロヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、1、2、3、4または5つ以上の2'-フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は1、2または3つの2'-フルオロヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は単一の2'-フルオロヌクレオチドを含む。2'-フルオロヌクレオチドはアンチセンス鎖中のどこにでも位置することができる点に注意されたい。例えば、2'-フルオロヌクレオチドは、アンチセンス鎖の、5'端から数えて位置2または14にあることができる。いくつかの態様において、アンチセンスは、アンチセンス鎖の、5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む。例えばアンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含む。さらなる一例において、アンチセンスは、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に、2'-デオキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に、2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつ位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置16に、2'-デオキシヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置16に、2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置16に2'-OMeヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシ以外のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-OMeヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつ位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖中およびセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12および14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12および14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖中およびセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖中およびセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12、14および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12、14および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖中およびセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
残りのヌクレオチド、すなわちセンス鎖および/またはアンチセンス鎖において明示的に規定されなかった位置にあるヌクレオチドは、無修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであることができる。したがっていくつかの態様において、残りのヌクレオチド、すなわちセンス鎖において明示的に規定されなかった位置にあるヌクレオチドは、無修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。例えば、残りのヌクレオチド、すなわちセンス鎖において明示的に規定されていない位置にあるヌクレオチドは、2'-OMe、2'-F、2'-Hおよび2'-O-C10～30脂肪族基からなる群より選択される修飾ヌクレオチドであることができ、任意で、ただし、2'-O-C10～30脂肪族基である修飾ヌクレオチドは1つ以下であるものとする。
いくつかの態様において、残りのヌクレオチド、すなわちアンチセンス鎖において明示的に規定されていない位置にあるヌクレオチドは、無修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。例えば、残りのヌクレオチド、すなわちアンチセンス鎖において明示的に規定されていない位置にあるヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであることができる。いくつかの態様において、残りのヌクレオチド、すなわちアンチセンス鎖において明示的に規定されていない位置にあるヌクレオチドは、2'-OMe、2'-F、2'-H、GNAおよび3'-RNAからなる群より選択することができ、3'-RNAは任意で3'-OHであり、ただし、GNAまたは3'-RNAである修飾ヌクレオチドは1つ以下であるものとする。
いくつかの態様において、センス鎖中および/またはアンチセンス鎖中の残りのヌクレオチドは2'-OMeヌクレオチドである。
本明細書に記載するとおり、dsRNA剤は、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の、修飾糖を含むヌクレオチドを含むことができる。「修飾糖」とは、2'-デオキシ（すなわち2'-H）、2'-OH、2'-Fまたは2'-OMeリボース糖以外の糖を意味する。修飾糖を含む例示的ヌクレオチドをいくつか挙げると、ロックト核酸（LNA）、HNA、CeNA、2'-メトキシエチル、2'-O-アリル、2'-C-アリル、2'-O-N-メチルアセトアミド（2'-O-NMA）、2'-O-ジメチルアミノエトキシエチル（2'-O-DMAEOE）、2'-O-アミノプロピル（2'-O-AP）および2'-ara-Fである。したがって、いくつかの態様において、dsRNA剤は、非環式ヌクレオチド、ロックト核酸（LNA）、HNA、CeNA、2'-メトキシエチル、2'-O-アリル、2'-C-アリル、2'-O-N-メチルアセトアミド（2'-O-NMA）、2'-O-ジメチルアミノエトキシエチル（2'-O-DMAEOE）、2'-O-アミノプロピル（2'-O-AP）および2'-ara-Fからなる群より独立して選択される1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の、ヌクレオチドを含むことができる。修飾糖を含むヌクレオチドはdsRNA分子中のどこにでも存在することができる。例えば、修飾糖を含むヌクレオチドはセンス鎖中に存在することができ、または修飾糖を含むヌクレオチドはアンチセンス鎖中に存在することができる。修飾糖を含むヌクレオチドがdsRNA分子中に2つ以上存在する場合、それらはすべて、センス鎖中、アンチセンス鎖中、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方に存在することができる。
いくつかの態様において、無修飾ヌクレオチドは、無修飾核酸塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシンまたはウラシルを含む2'-OHヌクレオチドである。
いくつかの態様において、dsRNAは、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の、非天然核酸塩基を含むヌクレオチドを含むことができる。「非天然核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミン以外の核酸塩基を意味する。例示的な非天然核酸塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（nubularine）、イソグアニシン（isoguanisine）、ツベルシジン、ならびにアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルの置換類似体または修飾類似体、例えば2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルその他のアルキル誘導体、5-ハロウラシルおよび5-ハロシトシン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン、6-アゾウラシル、6-アゾシトシンおよび6-アゾチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-（2-アミノプロピル）ウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルその他の8-置換アデニンおよび同8-置換グアニン、5-トリフルオロメチルその他の5-置換ウラシルおよび同5-置換シトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6およびO-6置換プリン、例えば2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6,N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノ-アリル-ウラシル、N3-メチルウラシル、置換1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3カルボキシプロピル）ウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N4-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、またはO-アルキル化塩基があるが、それらに限定されるわけではない。さらなるプリン類およびピリミジン類には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,Kroschwitz,J.I.編、John Wiley＆Sons,1990の858～859頁に開示されているもの、およびEnglisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613が開示しているものがある。
いくつかの態様において、非天然核酸塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、2-（ハロ）アデニン、2-（アルキル）アデニン、2-（プロピル）アデニン、2-（アミノ）アデニン、2-（アミノアルキル）アデニン、2-（アミノプロピル）アデニン、2-（メチルチオ）-N6-（イソペンテニル）アデニン、6-（アルキル）アデニン、6-（メチル）アデニン、7-（デアザ）アデニン、8-（アルケニル）アデニン、8-（アルキル）アデニン、8-（アルキニル）アデニン、8-（アミノ）アデニン、8-（ハロ）アデニン、8-（ヒドロキシル）アデニン、8-（チオアルキル）アデニン、8-（チオール）アデニン、N6-（イソペンチル）アデニン、N6-（メチル）アデニン、N6,N6-（ジメチル）アデニン、2-（アルキル）グアニン、2-（プロピル）グアニン、6-（アルキル）グアニン、6-（メチル）グアニン、7-（アルキル）グアニン、7-（メチル）グアニン、7-（デアザ）グアニン、8-（アルキル）グアニン、8-（アルケニル）グアニン、8-（アルキニル）グアニン、8-（アミノ）グアニン、8-（ハロ）グアニン、8-（ヒドロキシル）グアニン、8-（チオアルキル）グアニン、8-（チオール）グアニン、N-（メチル）グアニン、2-（チオ）シトシン、3-（デアザ）-5-（アザ）シトシン、3-（アルキル）シトシン、3-（メチル）シトシン、5-（アルキル）シトシン、5-（アルキニル）シトシン、5-（ハロ）シトシン、5-（メチル）シトシン、5-（プロピニル）シトシン、5-（プロピニル）シトシン、5-（トリフルオロメチル）シトシン、6-（アゾ）シトシン、N4-（アセチル）シトシン、3-（3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウラシル、2-（チオ）ウラシル、5-（メチル）-2-（チオ）ウラシル、5-（メチルアミノメチル）-2-（チオ）ウラシル、4-（チオ）ウラシル、5-（メチル）-4-（チオ）ウラシル、5-（メチルアミノメチル）-4-（チオ）ウラシル、5-（メチル）-2,4-（ジチオ）ウラシル、5-（メチルアミノメチル）-2,4-（ジチオ）ウラシル、5-（2-アミノプロピル）ウラシル、5-（アルキル）ウラシル、5-（アルキニル）ウラシル、5-（アリルアミノ）ウラシル、5-（アミノアリル）ウラシル、5-（アミノアルキル）ウラシル、5-（グアニジニウムアルキル）ウラシル、5-（1,3-ジアゾール-1-アルキル）ウラシル、5-（シアノアルキル）ウラシル、5-（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、5-（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、5-（ハロ）ウラシル、5-（メトキシ）ウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-（メトキシカルボニルメチル）-2-（チオ）ウラシル、5-（メトキシカルボニル-メチル）ウラシル、5-（プロピニル）ウラシル、5-（プロピニル）ウラシル、5-（トリフルオロメチル）ウラシル、6-（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、N3-（メチル）ウラシル、5-ウラシル（すなわちシュードウラシル）、2-（チオ）シュードウラシル、4-（チオ）シュードウラシル、2,4-（ジチオ）シュードウラシル、5-（アルキル）シュードウラシル、5-（メチル）シュードウラシル、5-（アルキル）-2-（チオ）シュードウラシル、5-（メチル）-2-（チオ）シュードウラシル、5-（アルキル）-4-（チオ）シュードウラシル、5-（メチル）-4-（チオ）シュードウラシル、5-（アルキル）-2,4-（ジチオ）シュードウラシル、5-（メチル）-2,4-（ジチオ）シュードウラシル、1-置換シュードウラシル、1-置換2（チオ）-シュードウラシル、1-置換4-（チオ）シュードウラシル、1-置換2,4-（ジチオ）シュードウラシル、1-（アミノカルボニルエチレニル）-シュードウラシル、1-（アミノカルボニルエチレニル）-2（チオ）-シュードウラシル、1-（アミノカルボニルエチレニル）-4-（チオ）シュードウラシル、1-（アミノカルボニルエチレニル）-2,4-（ジチオ）シュードウラシル、1-（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）-シュードウラシル、1-（アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル）-2（チオ）-シュードウラシル、1-（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）-4-（チオ）シュードウラシル、1-（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）-2,4-（ジチオ）シュードウラシル、1,3-（ジアザ）-2-（オキソ）-フェノキサジン-1-イル、1-（アザ）-2-（チオ）-3-（アザ）-フェノキサジン-1-イル、1,3-（ジアザ）-2-（オキソ）-フェンチアジン-1-イル、1-（アザ）-2-（チオ）-3-（アザ）-フェンチアジン-1-イル、7-置換1,3-（ジアザ）-2-（オキソ）-フェノキサジン-1-イル、7-置換1-（アザ）-2-（チオ）-3-（アザ）-フェノキサジン-1-イル、7-置換1,3-（ジアザ）-2-（オキソ）-フェンチアジン-1-イル、7-置換1-（アザ）-2-（チオ）-3-（アザ）-フェンチアジン-1-イル、7-（アミノアルキルヒドロキシ）-1,3-（ジアザ）-2-（オキソ）-フェノキサジン-1-イル、7-（アミノアルキルヒドロキシ）-1-（アザ）-2-（チオ）-3-（アザ）-フェノキサジン-1-イル、7-（アミノアルキルヒドロキシ）-1,3-（ジアザ）-2-（オキソ）-フェンチアジン-1-イル、7-（アミノアルキルヒドロキシ）-1-（アザ）-2-（チオ）-3-（アザ）-フェンチアジン-1-イル、7-（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）-1,3-（ジアザ）-2-（オキソ）-フェノキサジン-1-イル、7-（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）-1-（アザ）-2-（チオ）-3-（アザ）-フェノキサジン-1-イル、7-（グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ）-1,3-（ジアザ）-2-（オキソ）-フェンチアジン-1-イル、7-（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）-1-（アザ）-2-（チオ）-3-（アザ）-フェンチアジン-1-イル、1,3,5-（トリアザ）-2,6-（ジオキサ）-ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、2-アザ-イノシニル、7-デアザ-イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、3-（メチル）イソカルボスチリリル、5-（メチル）イソカルボスチリリル、3-（メチル）-7-（プロピニル）イソカルボスチリリル、7-（アザ）インドリル、6-（メチル）-7-（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、9-（メチル）-イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル-7-（アザ）インドリル、2,4,5-（トリメチル）フェニル、4-（メチル）インドリル、4,6-（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、4-（フルオロ）-6-（メチル）ベンゾイミダゾール、4-（メチル）ベンゾイミダゾール、6-（アゾ）チミン、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、6-（アザ）ピリミジン、2-（アミノ）プリン、2,6-（ジアミノ）プリン、5-置換ピリミジン、N2-置換プリン、N6-置換プリン、O6-置換プリン、置換1,2,4-トリアゾール、およびそれらの任意のO-アルキル化またはN-アルキル化誘導体からなる群より選択することができる。
非天然核酸塩基を含むヌクレオチドは、dsRNA分子中のどこにでも存在することができる。例えば、非天然核酸塩基を含むヌクレオチドはセンス鎖中に存在することができ、または非天然核酸塩基を含むヌクレオチドはアンチセンス鎖中に存在することができる。非天然核酸塩基を含むヌクレオチドがdsRNA分子中に2つ以上存在する場合、それらはすべて、センス鎖中、アンチセンス鎖中、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方に存在することができる。
本発明のdsRNA分子は、少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部を、さらに含むことができる。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾は、鎖のどの位置でも、センス鎖もしくはアンチセンス鎖またはその両方の任意のヌクレオチド上に存在しうる。例えばヌクレオチド間連結部修飾はセンス鎖上および/またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチドに存在してよく、または各ヌクレオチド間連結部修飾はセンス鎖上もしくはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在してよく、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は両方のヌクレオチド間連結部修飾を交互パターンで含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結部修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであっても異なってもよく、センス鎖上のヌクレオチド間連結部修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結部修飾の交互パターンに対してシフトしていてもよい。
いくつかの態様において、dsRNA分子は、オーバーハング領域中にホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、2つのヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部を有する2つのヌクレオチドを含む。オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端対合ヌクレオチドと連結するためにヌクレオチド間連結部修飾を行ってもよい。例えば、少なくとも2、3もしくは4つのまたはすべてのオーバーハングヌクレオチドをホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部で連結してもよく、任意で、オーバーハングヌクレオチドとオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドとを連結する追加のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部が存在してもよい。例えば、末端の3つのヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部が存在して、それら3つのヌクレオチドのうちの2つがオーバーハングヌクレオチドであり、3つ目がオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドであってもよい。好ましくは、これら3つの末端ヌクレオチドはアンチセンス鎖の3'端にありうる。
いくつかの態様において、dsRNA分子のセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、2～10個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、1～10個含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該センス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むアンチセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、2つ含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、3つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、2つ含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、4つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、2つ含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、2つ含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、6つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、2つ含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7または8個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、7つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、2つ含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5または6個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、8つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、2つ含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3または4個のホスフェートヌクレオチド間連結部で隔てられた、9つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のブロックを、2つ含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部のうちの1つはオリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に置かれ、該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部、メチルホスホネートヌクレオチド間連結部およびホスフェートヌクレオチド間連結部の任意の組合せを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結部もしくはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部もしくはホスフェートヌクレオチド間連結部のいずれかを含むアンチセンス鎖と、対合している。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の末端位置のうちの1～10個内に、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。例えばセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の一端または両端において、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結部またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部によって連結されうる。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖のそれぞれの二重鎖の内部領域のうちの1～10個内に、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾を含む。例えばセンス鎖の5'端から数えて二重鎖領域の位置8～16では、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチドが、ホスホロチオエート・メチルホスホネートヌクレオチド間連結部によって連結されていてよく、dsRNA分子は、任意で、末端位置のうちの1～10個内に、1つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾をさらに含むことができる。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に1～5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の3つの位置内に1～5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に1～5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1～5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの最後の6つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の4つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の4つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の4つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つ、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つ、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1～5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および最後の6つの位置内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、位置20および21に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および位置21に1つを、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、位置20および21に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、位置21および22に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、位置21および22に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、位置22および23に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、センス鎖の（5'端から数えて）位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、ならびにアンチセンス鎖の（5'端から数えて）位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾、位置22および23に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部修飾を、さらに含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間に、ホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間に、ホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む。例えばアンチセンス鎖は、ヌクレオチドnとn-1の間およびヌクレオチドn-1とn-2の間に、ホスホロチオエート連結部を含み、ここでnは、アンチセンス鎖の長さ、すなわちアンチセンス鎖中のヌクレオチドの数である。言い換えると、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間に、ホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含み、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えてヌクレオチド1と2の間、およびヌクレオチド2と3の間、ならびにアンチセンス鎖の3'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間に、ホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間にホスホロチオエート連結部を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間にホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む。例えばセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間にホスホロチオエート連結部を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'端から数えてヌクレオチド1と2の間およびヌクレオチド2と3の間にホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様において、本発明の化合物は、あるパターンのバックボーンキラル中心を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも5つの、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも6つの、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも7つの、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも8つの、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも9つの、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも10個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも11個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも12個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも13個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも14個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも15個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも16個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも17個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも18個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも19個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部を含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むRp立体配置のヌクレオチド間連結部は8つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むRp立体配置のヌクレオチド間連結部は7つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むRp立体配置のヌクレオチド間連結部は6つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むRp立体配置のヌクレオチド間連結部は5つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むRp立体配置のヌクレオチド間連結部は4つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むRp立体配置のヌクレオチド間連結部は3つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むRp立体配置のヌクレオチド間連結部は2つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むRp立体配置のヌクレオチド間連結部は1つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むキラルでないヌクレオチド間連結部（非限定的な例として、ホスホジエステル）は、8つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むキラルでないヌクレオチド間連結部は、7つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むキラルでないヌクレオチド間連結部は、6つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むキラルでないヌクレオチド間連結部は、5つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むキラルでないヌクレオチド間連結部は、4つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むキラルでないヌクレオチド間連結部は、3つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むキラルでないヌクレオチド間連結部は、2つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンが含むキラルでないヌクレオチド間連結部は、1つ以下である。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも10個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部と、8個以下の、キラルでないヌクレオチド間連結部とを含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも11個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部と、7個以下の、キラルでないヌクレオチド間連結部とを含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも12個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部と、6個以下の、キラルでないヌクレオチド間連結部とを含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも13個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部と、6個以下の、キラルでないヌクレオチド間連結部とを含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも14個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部と、5個以下の、キラルでないヌクレオチド間連結部とを含む。いくつかの態様において、バックボーンキラル中心の共通パターンは、少なくとも15個の、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部と、4個以下の、キラルでないヌクレオチド間連結部とを含む。いくつかの態様において、Sp立体配置のヌクレオチド間連結部は任意で連続していても連続していなくてもよい。いくつかの態様において、Rp立体配置のヌクレオチド間連結部は任意で連続していても連続していなくてもよい。いくつかの態様において、キラルでないヌクレオチド間連結部は任意で連続していても連続していなくてもよい。
いくつかの態様において、本発明の化合物は、立体化学ブロックであるブロックを含む。いくつかの態様において、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結部がRpであるRpブロックである。いくつかの態様において、5'-ブロックはRpブロックである。いくつかの態様において、3'-ブロックはRpブロックである。いくつかの態様において、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結部がSpであるSpブロックである。いくつかの態様において、5'-ブロックはSpブロックである。いくつかの態様において、3'-ブロックはSpブロックである。いくつかの態様において、提供されるオリゴヌクレオチドはRpブロックとSpブロックの両方を含む。いくつかの態様において、提供されるオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のRpブロックを含むが、Spブロックは含まない。いくつかの態様において、提供されるオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のSpブロックを含むが、Rpブロックは含まない。いくつかの態様において、提供されるオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチド間連結部が天然のホスフェート連結部である1つまたは複数のPOブロックを含む。
いくつかの態様において、本発明の化合物は、各糖部分が2'-フルオロ修飾を含むSpブロックである5'-ブロックを含む。いくつかの態様において、5'-ブロックは、ヌクレオチド間連結部のそれぞれが修飾ヌクレオチド間連結部であり、各糖部分が2'-フルオロ修飾を含む、Spブロックである。いくつかの態様において、5'-ブロックは、ヌクレオチド間連結部のそれぞれがホスホロチオエート連結部であり、各糖部分が2'-フルオロ修飾を含む、Spブロックである。いくつかの態様において、5'-ブロックは4つまたはそれ以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの態様において、5'-ブロックは5つまたはそれ以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの態様において、5'-ブロックは6つまたはそれ以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの態様において、5'-ブロックは7つまたはそれ以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの態様において、3'-ブロックは、各糖部分が2'-フルオロ修飾を含むSpブロックである。いくつかの態様において、3'-ブロックは、ヌクレオチド間連結部のそれぞれが修飾ヌクレオチド間連結部であり、各糖部分が2'-フルオロ修飾を含む、Spブロックである。いくつかの態様において、3'-ブロックは、ヌクレオチド間連結部のそれぞれがホスホロチオエート連結部であり、各糖部分が2'-フルオロ修飾を含む、Spブロックである。いくつかの態様において、3'-ブロックは4つまたはそれ以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの態様において、3'-ブロックは5つまたはそれ以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの態様において、3'-ブロックは6つまたはそれ以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの態様において、3'-ブロックは7つまたはそれ以上のヌクレオシド単位を含む。
いくつかの態様において、本発明の化合物は、ある領域またはオリゴヌクレオチド中のあるタイプのヌクレオシドであって、その後に、特定タイプのヌクレオチド間連結部、例えば天然のホスフェート連結部、修飾ヌクレオチド間連結部、Rpキラルヌクレオチド間連結部、Spキラルヌクレオチド間連結部などが続くヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、Aの後にSpが続く。いくつかの態様では、Aの後にRpが続く。いくつかの態様では、Aの後に天然のホスフェート連結部（PO）が続く。いくつかの態様では、Uの後にSpが続く。いくつかの態様では、Uの後にRpが続く。いくつかの態様では、Uの後に天然のホスフェート連結部（PO）が続く。いくつかの態様では、Cの後にSpが続く。いくつかの態様では、Cの後にRpが続く。いくつかの態様では、Cの後に天然のホスフェート連結部（PO）が続く。いくつかの態様では、Gの後にSpが続く。いくつかの態様では、Gの後にRpが続く。いくつかの態様では、Gの後に天然のホスフェート連結部（PO）が続く。いくつかの態様では、CおよびUの後にSpが続く。いくつかの態様では、CおよびUの後にRpが続く。いくつかの態様では、CおよびUの後に天然のホスフェート連結部（PO）が続く。いくつかの態様では、AおよびGの後にSpが続く。いくつかの態様では、AおよびGの後にRpが続く。
さまざまな刊行物が多量体型siRNAを記載しており、それらはいずれも本発明のdsRNAに使用することができる。そのような刊行物には、WO2007/091269、米国特許第7858769号、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887およびWO2011/031520が含まれ、それらはその全体が本明細書に組み入れられる。
リガンド
本明細書記載のdsRNA剤には、多種多様な実体をカップリングすることができる。好ましい部分はリガンドであり、これは好ましくは共有結合で、直接的に、または介在テザーを介して間接的にカップリングされる。一般に、リガンドは、それが組み入れられた本明細書記載のdsRNAの分布、標的化または寿命を改変する。いくつかの態様において、リガンドは、選択された標的、例えば分子、細胞もしくは細胞タイプ、コンパートメント、受容体、例えば細胞もしくは器官のコンパートメント、身体の組織、器官または領域に関して、例えばそのようなリガンドを欠く分子種と比べて、強化されたアフィニティーを与える。選択された標的に関して強化されたアフィニティーを提供するリガンドを、本明細書では標的化リガンドとも呼ぶ。
いくつかのリガンドはエンドソーム溶解特性を有することができる。エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームの溶解および/または本発明の組成物もしくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解性リガンドは、pH依存的な膜活性および膜融合性を示すポリアニオン性のペプチドまたはペプチドミメティックでありうる。いくつかの態様において、エンドソーム溶解性リガンドはエンドソームpHにおいてその活性コンフォメーションをとる。「活性」コンフォメーションとは、エンドソーム溶解性リガンドがエンドソームの溶解および/または本発明の組成物もしくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する際のコンフォメーションである。例示的なエンドソーム溶解性リガンドとして、GALAペプチド（Subbarao et al.,Biochemistry,1987,26:2964-2972、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、EALAペプチド（Vogel et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118:1581-1586、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、およびそれらの誘導体（Turk et al.,Biochem.Biophys.Acta,2002,1559:56-68、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）が挙げられる。いくつかの態様において、エンドソーム溶解性構成要素は、pHの変化に応答して電荷またはプロトン化の変化を起こすことになる化学基（例えばアミノ酸）を含有しうる。エンドソーム溶解性構成要素は線状または分枝状でありうる。
リガンドは、結果として生じる天然もしくは修飾オリゴリボヌクレオチドの、あるいは本明細書記載のモノマーおよび/または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子の、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性特性を改良することができ、ヌクレアーゼ耐性も改良することができる。
リガンドは、一般に、治療修飾因子（therapeutic modifier）、例えば取り込みを強化するためのもの;診断化合物またはレポーター基、例えば分布をモニターするためのもの;架橋剤;およびヌクレアーゼ耐性付与部分を含むことができる。一般的な例としては、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミンおよびペプチドミメティックが挙げられる。
リガンドには、天然物質、例えばタンパク質（例えばヒト血清アルブミン（HSA）、低密度リポタンパク質（LDL）、高密度リポタンパク質（HDL）、またはグロブリン）;炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）;または脂質が含まれうる。リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（PLL）、ポリL-アスパラギン酸、ポリL-グルタミン酸、スチレン-マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（L-ラクチド-co-グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル-無水マレイン酸コポリマー、N-（2-ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（HMPA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリウレタン、ポリ（2-エチルアクリル酸）、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（PLL）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド-ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの4級塩、またはアルファらせんペプチドが挙げられる。
リガンドには、標的化基、例えば細胞または組織標的化剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体、ナノボディ、または抗体もしくはナノボディのうち、腎臓細胞もしくは血液脳関門の細胞などといった指定された細胞タイプに結合する部分も、含まれうる。標的化基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン標的化基、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチドミメティックまたはアプタマーであることができる。
リガンドの他の例として、色素、挿入剤（例えばアクリジン類）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンC）、ポルフィリン（TPPC4、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼまたはキレート剤（例えばEDTA）、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-（オレオイル）リトコール酸、O3-（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えばアンテナペディアペプチド、Tatペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG（例えばPEG-40K）、MPEG、［MPEG］2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送/吸収促進物質（例えばアスピリン、ビタミンE、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状化合物のEu3＋錯体）、ジニトロフェニル、HRPまたはAPが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えば共リガンドに対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えばがん細胞、内皮細胞または骨細胞などの指定された細胞タイプに結合する抗体であることができる。リガンドには、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれうる。それらには、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーも含めることができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、p38 MAPキナーゼの活性化因子、またはNF-κBの活性化因子であることができる。
リガンドは、細胞へのiRNA剤の取り込みを、例えばその細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば細胞の微小管、微小線維および/または中間径フィラメントを破壊することによって、増加させることができる物質、例えば薬物であることができる。前記薬物は、例えばタクソン（taxon）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（japlakinolide）、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン（indanocine）、またはミオセルビン（myoservin）であることができる。
リガンドは、例えば炎症応答を活性化することによって、細胞へのdsRNAの取り込みを増加させることができる。そのような効果を有するであろう例示的リガンドとして、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-アルファ）、インターロイキン-1ベータ、またはガンマインターフェロンが挙げられる。
いくつかの態様において、リガンドは脂質または脂質ベースの分子である。そのような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（HSA）に結合する。HSA結合性リガンドは、標的組織への、例えば身体の非腎臓標的組織への、コンジュゲートの分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であることができる。HSAに結合することができる他の分子もリガンドとして使用することができる。例えばナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（a）コンジュゲートの分解に対する耐性を増加させることができ、（b）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増加させることができ、および/または（c）血清タンパク質、例えばHSAへの結合を調節するために使用することができる。脂質ベースのリガンドは、標的組織へのコンジュゲートの結合を調整、例えば制御するために使用することができる。例えば、HSAに強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドほど、腎臓に標的化される可能性は低くなり、それゆえに、身体から除去される可能性が低くなるだろう。HSAへの結合が弱い脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的化するために使用することができる。
好ましい一態様において、脂質ベースのリガンドはHSAに結合する。好ましくは、それは、コンジュゲートが非腎臓組織に好ましく分布することになるように十分なアフィニティーでHSAに結合する。ただしアフィニティーは、HSA-リガンド結合が可逆でなくなるほど強くないことが好ましい。
別の好ましい一態様において、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが腎臓に好ましく分布することになるように、HSAに弱く結合するか、または全く結合しない。脂質ベースのリガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞に標的化する他の部分も使用することができる。
いくつかの態様において、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性型または非悪性型の、例えばがん細胞の、不必要な細胞増殖を特徴とする障害を処置するのに、特に有用である。例示的なビタミンとして、ビタミンA、EおよびKが挙げられる。他の例示的ビタミンとして、ビタミンB群、例えば葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、またはがん細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。HAS、低密度リポタンパク質（LDL）および高密度リポタンパク質（HDL）も含まれる。
別の一局面において、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス細胞透過性剤である。好ましくは、前記剤は両親媒性である。例示的剤は、tatまたはアンテナペディアなどのペプチドである。剤がペプチドである場合は、それに、ペプチジルミメティック、インバートマー（invertomer）、非ペプチドまたはシュードペプチド連結部、およびD-アミノ酸の使用を含む修飾を加えることができる。ヘリックス剤は、好ましくはアルファ-ヘリックス剤、好ましくは親油性相と疎油性とを有するものである。
リガンドはペプチドまたはペプチドミメティックであることができる。ペプチドミメティック（本明細書ではオリゴペプチドミメティックともいう）は、天然ペプチドと同様の明確な三次元構造に折りたたまれうる分子である。ペプチドまたはペプチドミメティック部分は、約5～50アミノ酸長、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50アミノ酸長であることができる。ペプチドまたはペプチドミメティックは、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド（例えば主としてTyr、TrpまたはPheからなるもの）であることができる。ペプチド部分はデンドリマーペプチド、拘束されたペプチドまたは架橋されたペプチドであることができる。もう一つの選択肢として、ペプチド部分は疎水性膜トランスロケーション配列（MTS）を含むことができる。例示的な疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸配列
Figure 2024504694000002
を有するRFGFである。疎水性MTSを含有するRFGF類似体（例えばアミノ酸配列
Figure 2024504694000003
）も標的化部分であることができる。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大きな極性分子を細胞膜越しに運ぶ「送達」ペプチドであることができる。例えばHIV Tatタンパク質由来の配列:
Figure 2024504694000004
およびショウジョウバエ（Drosophila）アンテナペディアタンパク質由来の配列:
Figure 2024504694000005
は、送達ペプチドとして機能できることがわかっている。ペプチドまたはペプチドミメティックは、ファージディスプレイライブラリーまたは1ビーズ1化合物（one-bead-one-compound:OBOC）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなど、DNAのランダム配列によってコードされうる（Lam et al.,Nature,354:82-94,1991、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。組み込まれているモノマー単位を介してiRNA剤に繋がれるペプチドまたはペプチドミメティックは、好ましくは、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）ペプチドまたはRGDミミックなどの細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分の長さは約5アミノ酸～約40アミノ酸の範囲にあることができる。ペプチド部分は、例えば安定性を増加させ、またはコンフォメーション特性を方向付けるなどのために、構造修飾を有することができる。後述する構造修飾はいずれも利用可能である。RGDペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Zitzmann et al.,Cancer Res.,62:5139-43,2002、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。RGDペプチドは、肺、腎臓、脾臓または肝臓を含むさまざまな他の組織の腫瘍へのiRNA剤の標的化を容易にすることができる（Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8:783-787,2001、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。好ましくは、RGDペプチドは、腎臓へのiRNA剤の標的化を容易にするだろう。RGDペプチドは線状または環状であることができ、特異的組織への標的化を容易にするために、修飾、例えばグリコシル化、またはメチル化されていてもよい。例えばグリコシル化RGDペプチドは、iRNA剤を、αVβ3を発現する腫瘍細胞に送達することができる（Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42:326-336,2001、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。増殖細胞において濃縮されるマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、RGD含有ペプチドおよびペプチドミメティックは、がん細胞、特にインテグリンを呈する細胞を標的とすることができる。したがってRGDペプチド、RGDを含有する環状ペプチド、D-アミノ酸を含むRGDペプチド、ならびに合成RGDミメティックを使用することができるだろう。RGDに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分も使用することができる。一般に、そのようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。このタイプの好ましいコンジュゲートは、PECAM-1、VEGFまたは他のがん遺伝子、例えば本明細書記載のがん遺伝子を標的とするリガンドを有する。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば細菌細胞もしくは真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することができる。微生物細胞透過ペプチドは、例えば、α-ヘリックス線状ペプチド（例えばLL-37またはセロピンP1（Ceropin P1））、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα-ディフェンシン、β-ディフェンシンまたはバクテネシン）、またはわずか1種もしくは2種のアミノ酸を圧倒的に含有するペプチド（例えばPR-39またはインドリシジン）であることができる。細胞透過ペプチドは核局在化シグナル（NLS）を含むこともできる。例えば細胞透過ペプチドは、HIV-1 gp41の融合ペプチドドメインとSV40ラージT抗原のNLSとから誘導される二部分両親媒性ペプチド、例えばMPGであることができる（Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
いくつかの態様において、標的化ペプチドは両親媒性α-ヘリックスペプチドであることができる。例示的な両親媒性α-ヘリックスペプチドとして、セクロピン、リコトキシン、パラダキシン（paradaxin）、ブフォリン、CPF、ボンビニン様ペプチド（BLP）、カテリシジン、セラトトキシン（ceratotoxin）、エボヤ（S.clava）ペプチド、メクラウナギ腸抗微生物ペプチド（HFIAP）、マガイニン、ブレビニン-2、デルマセプチン、メリチン、プルーロシジン（pleurocidin）、H2Aペプチド、ツメガエル（Xenopus）ペプチド、エスクレンチニス（esculentinis）-1、およびカーリン（caerin）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ヘリックス安定性の完全性を維持するために、好ましくは、いくつかの因子が考慮されるだろう。例えば、最大数のヘリックス安定化残基が利用され（例えばleu、alaまたはlys）、最小数のヘリックス不安定化残基が利用されるだろう（例えばプロリンまたは環状モノマー単位）。キャッピング残基が考慮されるだろう（例えばGlyは例示的N-キャッピング残基であり、および/またはC末端のアミド化はヘリックスを安定化するための余分なH結合を提供するために使用することができる。i±3またはi±4離れた反対電荷を持つ残基間の塩橋の形成は、安定性を提供することができる。例えば、リジン、アルギニン、ホモ-アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンなどのカチオン性残基は、グルタミン酸またはアスパラギン酸などのアニオン性残基との塩橋を形成することができる。
ペプチドおよびペプチドミメティックリガンドには、天然ペプチドまたは修飾ペプチド、例えばDまたはLペプチド;α、βまたはγペプチド;N-メチルペプチド;アザペプチド;1つまたは複数のアミド連結部、すなわちペプチド連結部が、1つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素連結部で置き換えられているペプチド;または環状ペプチドを有するものが含まれる。
標的化リガンドは、特異的受容体を標的化することができる任意のリガンドであることができる。葉酸、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース-6P、糖のクラスター、例えばGalNAcクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマーが、その例である。クラスターは2つ以上の糖単位の組合せである。標的化リガンドには、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリン、GCPII,ソマトスタチン、LDLおよびHDLリガンドも含まれる。リガンドは、例えばアプタマーなど、核酸に基づくこともできる。アプタマーは、無修飾であるか、または本明細書において開示される修飾の任意の組合せを有することができる。
エンドソーム放出剤として、イミダゾール類、ポリまたはオリゴイミダゾール、PEI、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、遮蔽オリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール類、ポリアセタール、ケタール類/ポリケタール、オルトエステル類、遮蔽または非遮蔽カチオンまたはアニオン電荷を持つポリマー、遮蔽または非遮蔽カチオンまたはアニオン電荷を持つデンドリマーが挙げられる。
PK調整物質は薬物動態調整物質を意味する。PK調整物質として、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、PEG、ビタミンなどが挙げられる。例示的なPK調整物質として、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンE、ビオチンなどが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかのホスホロチオエート連結部を含むオリゴヌクレオチドは、血清タンパク質に結合することも公知であり、したがって複数のホスホロチオエート連結部をバックボーン中に含む短いオリゴヌクレオチド、例えば約5塩基、10塩基、15塩基または20塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えばPK調整リガンドとして）本発明に適用できる。
加えて、血清構成要素（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、PK調整リガンドとして本発明に適用できる。
本発明に適用できる他のリガンドコンジュゲートは、以下の米国特許出願に記載されており、これらは参照によりそれぞれの全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる:2004年8月10日に出願された米国特許出願第10/916,185号、2004年9月21日に出願された米国特許出願第10/946,873号、2007年8月3日に出願された米国特許出願第10/833,934号、2005年4月27日に出願された米国特許出願第11/115,989号、および2007年11月21日に出願された米国特許出願第11/944,227号。
いくつかの態様において、dsRNA分子は、2つ以上の、例えば2、3、4または5つのリガンドを含むことができる。2つ以上のリガンドが存在する場合、それらのリガンドはすべてが同じ性質を有するか、すべてが異なる性質を有するか、または一部のリガンドが同じ性質を有し、同時に他のリガンドは異なる性質を有することができる。例えばリガンドは、標的化特性を有し、エンドソーム溶解活性を有し、またはPK調整特性を有することができる。好ましい一態様では、すべてのリガンドが異なる性質を有する。
いくつかの態様において、dsRNA分子は2つのリガンドを含む。例えばdsRNA分子のセンス鎖は、センス鎖の3'端に取り付けられた第1リガンドと、センス鎖の5'端に取り付けられた第2リガンドとを含む。いくつかの態様において、dsRNA分子はセンス鎖に連結された2つのリガンドを含み、第1リガンドは反転（inverted）脱塩基ヌクレオチド（すなわち3'→3'連結部によって連結された脱塩基ヌクレオチド）を含み、第2リガンドはASGPRリガンドを含む。
リガンドは、さまざまな場所で、例えばセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の3'端、5'端、および/または内部位置で、dsRNAにカップリングすることができる。好ましい態様において、リガンドは、dsRNAのセンス鎖および/またはアンチセンス鎖に、リンカーまたはテザーを介して取り付けられる。リガンドまたは繋がれたリガンドは、成長する鎖にモノマーが組み入れられる時に、そのモノマー上に存在することができる。いくつかの態様において、リガンドは、成長する鎖に「前駆体」モノマーが組み入れられた後に、その「前駆体」モノマーに組み入れられうる。例えば、アミノ基を末端とするテザーを有するモノマー（すなわちリガンドを伴わないもの）、例えばTAP-（CH2）nNH2を、成長中のオリゴヌクレオチド鎖に組み入れることができる。その後の操作において、すなわち鎖への前駆体モノマーの組み入れ後に、求電子基を有するリガンド、例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を、続いて、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基とのカップリングによって、その前駆体モノマーに、取り付けることができる。
別の一例では、例えばアジドまたはアルキン末端テザー/リンカーなど、クリックケミストリー反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーを組み入れうる。その後の操作において、すなわち鎖への前駆体モノマーの組み入れ後に、相補的化学基、例えばアルキンまたはアジドを有するリガンドを、アルキンとアジドとを一つにカップリングすることによって、前駆体モノマーに取り付けることができる。
リガンドは一方の鎖または両方の鎖に取り付けることができる。いくつかの態様において、本明細書記載のdsRNAは、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含む。いくつかの態様において、本明細書記載のdsRNAは、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含む。
いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖にコンジュゲートされる。本明細書に記載するとおり、リガンドは、センス鎖の3'端、5'端または内部位置においてコンジュゲートすることができる。いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖の3'端にコンジュゲートされる。いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖の5'端にコンジュゲートされる。いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖の内部位置においてコンジュゲートされる。言い換えると、リガンドはセンス鎖の非末端ヌクレオチドにコンジュゲートされる。リガンドはセンス鎖の核酸塩基、糖部分またはヌクレオチド間連結部にコンジュゲートされうることに注意されたい。
いくつかの態様において、リガンドは、センス鎖中のヌクレオチドの2'位においてコンジュゲートされる。例えばリガンドは、センス鎖の内部位置、すなわち非末端位置にあるヌクレオチドの2'位においてコンジュゲートされる。
いくつかの態様において、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分またはヌクレオシド間連結部にコンジュゲートすることができる。プリン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む任意の位置で行うことができる。いくつかの態様では、プリン核酸塩基の2-、6-、7-または8-位が、コンジュゲート部分に取り付けられる。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションも、任意の位置で行うことができる。いくつかの態様では、ピリミジン核酸塩基の2-、5-および6-位をコンジュゲート部分で置換することができる。ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子において行うことができる。コンジュゲート部分に取り付けることができる糖部分の炭素原子の例には、2'、3'および5'炭素原子が含まれる。脱塩基残基などでは、1'位も、コンジュゲートに取り付けることができる。ヌクレオシド間連結部もコンジュゲート部分を保持することができる。リン含有連結部（例えばホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなど）については、コンジュゲート部分を、リン原子に直接取り付けるか、またはリン原子に結合しているO、NもしくはS原子に取り付けることができる。アミンまたはアミドを含有するヌクレオシド間連結部（例えばPNA）の場合は、コンジュゲート部分を、そのアミンもしくはアミドの窒素原子または隣接する炭素原子に取り付けることができる。
いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖にコンジュゲートされる。本明細書に記載するとおり、リガンドは、センス鎖の3'端、5'端または内部位置においてコンジュゲートすることができる。いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖の3'端にコンジュゲートされる。さらに、リガンドはセンス鎖の核酸塩基、糖部分またはヌクレオチド間連結部にコンジュゲートされうることに注意されたい。
RNA干渉の分野における任意の適切なリガンドを使用しうるが、リガンドは典型的には炭水化物、例えば単糖（GalNAcなど）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
リガンドを核酸にコンジュゲートするリンカーとしては、上で述べたものが挙げられる。例えばリガンドは、1つまたは複数の炭水化物、例えば一価、二価または三価分岐リンカーによって取り付けられたGalNAc（N-アセチルガラクトサミン）誘導体であることができる。
いくつかの態様において、本発明のdsRNAは、式（IV）～（VII）のいずれかに示される構造を含む二価および三価分岐リンカーにコンジュゲートされる:
Figure 2024504694000006
式中、
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5Bおよびq5Cは、出現ごとに独立して、0～20を表し、繰り返し単位は同じであるか、または異なることができ、
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T5A、T5B、T5Cはそれぞれ、出現ごとに独立して、存在しないか、またはCO、NH、O、S、OC（O）、NHC（O）、CH2、CH2NHもしくはCH2Oであり、
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5Cは、出現ごとに独立して、存在しないか、またはアルキレン、置換アルキレンであり、ここで、1つまたは複数のメチレンは、O、S、S（O）、SO2、N（RN）、C（R'）＝C（R”）、C≡CまたはC（O）のうちの1つまたは複数で中断されるか終わっていてもよく、
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5Cはそれぞれ、出現ごとに独立して、存在しないか、またはNH、O、S、CH2、C（O）O、C（O）NH、NHCH（Ra）C（O）、-C（O）-CH（Ra）-NH-、CO、CH＝N-O、
Figure 2024504694000007
もしくはヘテロシクリルであり、
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5BおよびL5Cは、リガンド、すなわち、それぞれ出現ごとに独立して、単糖（GalNAcなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖を表し、
Raは、Hまたはアミノ酸側鎖である。
例えば式（VII）:
Figure 2024504694000008
のものなど、GalNAc誘導体をコンジュゲートする三価は、標的遺伝子の発現を阻害するための本明細書記載のdsRNA剤に使用するのに、とりわけ有用であり、
式中、L5A、L5BおよびL5Cは、GalNAc誘導体などの単糖である。
GalNAc誘導体をコンジュゲートする適切な二価および三価分岐リンカー基として、以下の化合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない:
Figure 2024504694000009
Figure 2024504694000010
Figure 2024504694000011
。
いくつかの態様において、本明細書記載のdsRNAは、リガンド1、すなわち以下の構造を有するリガンドを含む:
Figure 2024504694000012
。
いくつかの態様において、本明細書記載のdsRNAは、米国特許第5,994,517号または米国特許第6,906,182号記載のリガンドを含み、これら各文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、リガンドは、米国特許第6,906,182号の図3に記載されているトリアンテナ型リガンドであることができる。例えば、本明細書記載のdsRNAは、以下のトリアンテナ型リガンドから選択されるリガンドを含むことができる:
Figure 2024504694000013
。
上記局面のいずれか一つのいくつかの態様において、アンチセンス鎖は、5'末端にホスホリル類似体またはホスフェートミミックを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、5'末端にアルケニルホスホネート、すなわちビニルホスホネートを含む。例えばアンチセンス鎖は5'-E-ビニルホスホネートを含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、5'末端にシクロプロピルホスホネートを含む。例えばアンチセンスは、5'末端に
Figure 2024504694000014
を含み、式中、＊は、5'末端にあるヌクレオチドのC5位への結合である。
上記局面のいずれか一つのいくつかの態様において、鎖、例えば二本鎖RNAのセンス鎖および/またはアンチセンス鎖のうちの少なくとも1つは、以下から選択されるモノマーまたはリガンドを含む:
Figure 2024504694000015
式中、＊は鎖の5',3'末端ヒドロキシル基への結合である;
Figure 2024504694000016
式中、＊は鎖中のヌクレオチドの2'-ヒドロキシルへの結合である;
Figure 2024504694000017
式中、＊は、鎖の5'末端または3'末端への結合である;
Figure 2024504694000018
式中、＊は、鎖の5'末端または3'末端への結合である;
Figure 2024504694000019
式中、-O-＊は、鎖の5'末端または3'末端への接続である;および/または
Figure 2024504694000020
式中、-P-＊は、鎖の5'または3'-ヒドロキシル基への接続である。
いくつかの態様において、リガンドは親油性基を含む。例えばリガンドはC6～30脂肪族基またはC10～30脂肪族基であることができる。本明細書にいう「脂肪族」とは、規定された数の炭素原子を有する、飽和または不飽和の直鎖、分岐および/または環状炭化水素を意味し、例としては、規定された数の炭素原子を有するアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルケニルおよびシクロアルキルアルキニルが挙げられる。いくつかの態様において、リガンドはC10～30アルキル基である。例えばリガンドは、直鎖または分岐ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、またはテトラコシル基である。例えばリガンドは、直鎖ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、またはテトラコシル基である。例えばリガンドは、直鎖ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、またはドコシル基である。例えばリガンドは直鎖ヘキサデシル基である。例えばリガンドは直鎖ドコシル基である。
一定の態様において、リガンドは、センス鎖の内部、すなわち非末端位置にあるヌクレオチドの2'位においてコンジュゲートされ、直鎖または分岐テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、またはテトラコシル基である。例えばリガンドは、センス鎖の内部、すなわち非末端位置にあるヌクレオチドの2'位においてコンジュゲートされ、直鎖または分岐ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、またはテトラコシル基である。例えばリガンドは、センス鎖の内部、すなわち非末端位置にあるヌクレオチドの2'位においてコンジュゲートされ、直鎖ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、またはテトラコシル基である。例えばリガンドは、センス鎖の内部、すなわち非末端位置にあるヌクレオチドの2'位においてコンジュゲートされ、直鎖ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、またはドコシル基である。
内部センス鎖ヌクレオチド位置は、センス鎖の各末端から3つの末端位置を除くどの位置であることもできる。いくつかの態様において、前記内部位置からは、センス鎖の切断部位領域は除外される。いくつかの態様において、前記内部位置からは、センス鎖の5'端から数えて位置9～12または位置11～13は除外される。例えば、内部ヌクレオチド位置は、センス鎖の5'端から数えて、センス鎖上の位置4～8および13～18のうちの1つまたは複数、例えばセンス鎖上の位置5、6、7、15および17のうちの1つまたは複数であることができる。一態様において、内部ヌクレオチド位置は、5'端から数えてセンス鎖の位置5、6、7または8のうちの1つであることができる。例えばこれらの態様のそれぞれにおいて、内部ヌクレオチド位置は5'端から数えてセンス鎖の位置6または7である。例えばこれらの態様のそれぞれにおいて、内部ヌクレオチド位置は5'端から数えてセンス鎖の位置6である。例えばこれらの態様のそれぞれにおいて、内部ヌクレオチド位置は5'端から数えてセンス鎖の位置7である。一定の態様において、リガンドを含む内部ヌクレオチドは、式:
Figure 2024504694000021
を有し、式中、Bはヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基類似体であり、任意で、Bはアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。
いくつかの態様において、リガンドは、反転ヌクレオチドまたは反転脱塩基ヌクレオチドを含む。例えばリガンドは、dsRNA分子の鎖に5'→5'または3'→3'連結部を介して連結された脱塩基ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、リガンドは、センス鎖の3'端に3'→3'連結部を介して連結された脱塩基ヌクレオチドを含む。
別の態様において、リガンドは、ステロイドの縮合環系を含む親油性基を含む。例えばリガンドはコレステロールまたはコルチコステロンを含むことができる。そのようなリガンドの例には、例えば、
Figure 2024504694000022
が含まれる。例えば、そのようなリガンドは、dsRNA分子の鎖の5'および/または3'端に取り付けられうる。いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖の5'または3'端に取り付けられうる。いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖の5'端に取り付けられうる。いくつかの態様において、リガンドはセンス鎖の3'端に取り付けられうる。dsRNA分子への取付けは、空の原子価を有する、上に図解した酸素原子への結合、またはピロリジンの4-ヒドロキシル基を使って形成される結合によって行いうる。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに取り付けてもよい。担体は、（i）少なくとも1つの「バックボーン取付け点」、好ましくは2つの「バックボーン取付け点」と、（ii）少なくとも1つの「テザリング取付け点」とを含む。本明細書にいう「バックボーン取付け点」とは、リボ核酸のバックボーン、例えばホスフェートバックボーン、または修飾ホスフェート、例えば含硫バックボーンへの担体の組み入れに利用することができ、それに適している、官能基、例えばヒドロキシル基、または広く結合を指す。「テザリング取付け点」（TAP）とは、いくつかの態様において、選択された部分を接続する、環状担体の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（バックボーン取付け点を提供する原子とは異なるもの）を指す。前記部分は、例えば炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であることができる。任意で、選択された部分は、介在テザーによって環状担体に接続される。したがって環状担体は、多くの場合、構成環への別の化学実体、例えばリガンドの組み入れまたは繋留に適した官能基、例えばアミノ基を含むか、または広く、そのような結合を提供することになる。
一態様において、本発明のdsRNA分子は担体を介してリガンドにコンジュゲートされ、担体は環状基または非環状基であることができ、好ましくは環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［1,3］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され、好ましくは、非環状基は、セリノールバックボーンまたはジエタノールアミンバックボーンから選択される。
リガンドは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖に、3'端、5'端または両端において取り付けることができる。例えばリガンドは、センス鎖に、特にセンス鎖の3'端に、コンジュゲートすることができる。
リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖に、切断可能基を含むリンカーを介してコンジュゲートすることができる。切断可能連結基とは、細胞外では十分に安定であるが、標的細胞内に進入すると切断されて、そのリンカーが一つにつないでいる2つの部分を放出する連結基である。本発明のdsRNA分子の好ましい一態様において、切断可能連結基は、標的細胞内または第1基準条件下（これは例えば細胞内条件を模倣しまたは表現するように選択することができる）では、対象の血中、または第2基準条件下（これは例えば血中または血清中に見いだされる条件を模倣しまたは表現するように選択することができる）よりも、少なくとも10倍以上、好ましくは少なくとも100倍速く、切断される。
切断可能連結基は、切断作用因、例えばpH、酸化還元電位または分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断作用因は、血清中または血液中よりも細胞内部の方が、優勢であるか、より高いレベルまたは活性で見いだされる。そのような分解性作用因の例には、特定の基質用に選択される酸化還元剤または基質特異性を有しない酸化還元剤、例えば酸化酵素もしくは還元酵素、または酸化還元切断可能連結基を還元によって分解することができる細胞中に存在するメルカプタンなどの還元剤;エステラーゼ;エンドソームまたは酸性環境を作り出すことができる剤、例えば5以下のpHをもたらすもの;酸切断可能連結基を、一般酸として作用することによって加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であることができる）およびホスファターゼがある。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、pHに対して感受性であることができる。ヒト血清のpHが7.4であるのに対し、平均的な細胞内pHはそれよりわずかに低く、約7.1～7.3の範囲にある。エンドソームは、pHの範囲が5.5～6.0と、さらに酸性であり、リソソームは、5.0前後と、より一層酸性のpHを有する。いくつかのリンカーは、好ましいpHで切断されることにより、細胞内で、または細胞の所望の区画に、カチオン性脂質をリガンドから放出する、切断可能連結基を有するだろう。
リンカーは、特定酵素によって切断可能な切断可能連結基を含むことができる。リンカーに組み入れられる切断可能連結基のタイプは、標的とする細胞に依存しうる。例えば肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結することができる。肝臓細胞はエステラーゼに富むので、肝臓細胞ではエステラーゼが豊富でない細胞タイプよりも効率よくリンカーが切断されるだろう。エステラーゼに富む他の細胞タイプとしては、肺、腎皮質および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、ペプチダーゼに富む細胞タイプ、例えば肝臓細胞および滑膜細胞を標的とする場合に使用することができる。
一般に、候補切断可能連結基の適性は、候補連結基を切断する分解性作用因（または条件）の能力を試験することによって評価することができる。また、血中で、または他の非標的組織と接触させた場合に、切断に抵抗する能力についても、候補切断可能連結基を試験することが、同様に望ましいだろう。こうして、標的細胞における切断を示すように選択された第1条件と、他の組織または生体液、例えば血液もしくは血清における切断を示すように選択された第2条件との間で、切断に対する相対的感受性を決定することができる。評価は、無細胞系で、細胞中で、細胞培養中で、器官もしくは組織中で、またはまるごとの動物で、実行することができる。最初の評価を無細胞条件下または細胞培養条件下で行い、まるごとの動物でのさらなる評価によって確認することは、有用であるだろう。好ましい態様において、有用な候補化合物は、血液もしくは血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）では、少なくとも2倍、4倍、10倍または100倍速く切断される。
切断可能連結基のクラスの一つは酸化還元切断可能連結基であり、還元時または酸化時に切断される本発明のdsRNA分子では、これを使用しうる。還元的に切断可能な連結基の一例はジスルフィド連結基（-S-S-）である。候補切断可能連結基が適切な「還元的に切断可能な連結基」であるかどうか、または例えば特定のiRNA部分および特定の標的化剤と共に使用するのに適しているかどうかを決定するには、本明細書記載の方法に頼ることができる。例えば、細胞、例えば標的細胞内で観察されるであろう切断速度を模倣するジチオスレイトール（DTT）または当技術分野において公知の試薬を使った他の還元剤と共にインキュベートすることによって、候補を評価することができる。候補は、血液条件または血清条件を模倣するように選択された条件下でも評価することができる。好ましい一態様において、候補化合物は、血中ではせいぜい10％しか切断されない。好ましい態様において、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）では、少なくとも2倍、4倍、10倍または100倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、標準的な酵素速度論アッセイを使って、細胞内媒質を模倣するように選択された条件下で決定し、細胞外媒質を模倣するように選択された条件と比較することができる。
本発明のdsRNA分子に使用しうるホスフェートベースの切断可能連結基は、ホスフェート基を分解または加水分解する剤によって切断される。細胞内でホスフェート基を切断する剤の例は、細胞中のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェートベースの連結基の例は、-O-P（O）（ORk）-O-、-O-P（S）（ORk）-O-、-O-P（S）（SRk）-O-、-S-P（O）（ORk）-O-、-O-P（O）（ORk）-S-、-S-P（O）（ORk）-S-、-O-P（S）（ORk）-S-、-S-P（S）（ORk）-O-、-O-P（O）（Rk）-O-、-O-P（S）（Rk）-O-、-S-P（O）（Rk）-O-、-S-P（S）（Rk）-O-、-S-P（O）（Rk）-S-、-O-P（S）（Rk）-S-であり、ここで、Rkは、出現ごとに独立して、水素、C1～C20アルキル、C1～C20ハロアルキル、C6～C10アリール、C7～C12アラルキルであることができる。好ましい態様は、-O-P（O）（OH）-O-、-O-P（S）（OH）-O-、-O-P（S）（SH）-O-、-S-P（O）（OH）-O-、-O-P（O）（OH）-S-、-S-P（O）（OH）-S-、-O-P（S）（OH）-S-、-S-P（S）（OH）-O-、-O-P（O）（H）-O-、-O-P（S）（H）-O-、-S-P（O）（H）-O-、-S-P（S）（H）-O-、-S-P（O）（H）-S-、-O-P（S）（H）-S-である。好ましい一態様は-O-P（O）（OH）-O-である。これらの候補は上述の方法と類似する方法を使って評価することができる。
本発明のdsRNA分子において使用しうる酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい態様において、酸切断可能連結基は、pHが約6.5以下（例えば約6.0、5.5、5.0またはそれ以下）の酸性環境において、または一般酸として作用することができる酵素などの剤によって、切断される。細胞では、エンドソームやリソソームなどといった特定の低pH細胞小器官が、酸切断可能連結基のための切断環境を提供することができる。酸切断可能連結基の例としてヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。酸切断可能基は、一般式-C＝NN-、C（O）Oまたは-OC（O）を有することができる。好ましい一態様は、エステルの酸素に取り付けられた炭素（アルコキシ基）がアリール基、置換アルキル基または第三級アルキル基、例えばジメチルペンチルもしくはt-ブチルである場合である。これらの候補は上述の方法と類似する方法を使って評価することができる。
本発明のdsRNA分子に使用しうるエステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼやアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例として、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。エステル切断可能連結基は一般式-C（O）O-または-OC（O）-を有する。これらの候補は上述の方法と類似する方法を使って評価することができる。
本発明のdsRNA分子に使用しうるペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内でペプチダーゼやプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基はアミド基（-C（O）NH-）を含まない。アミド基は任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン間に形成されうる。ペプチド結合は、アミノ酸間に形成されてペプチドおよびタンパク質を与える特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は一般に、アミノ酸間に形成されてペプチドおよびタンパク質を与えるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体が含まれるわけではない。ペプチドベースの切断可能連結基は一般式-NHCHRAC（O）NHCHRBC（O）-を有し、式中、RAおよびRBは2つの隣接アミノ酸のR基である。これらの候補は上述の方法と類似する方法を使って評価することができる。本明細書にいう「炭水化物」とは、少なくとも6つの炭素原子（線状、分岐または環状でありうる）と各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子とを有する1つまたは複数の単糖単位で構成された炭水化物そのものであるか、または少なくとも6つの炭素原子（線状、分岐または環状でありうる）と各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子とを有する1つまたは複数の単糖単位で構成された炭水化物部分をその一部として有する化合物である、化合物を指す。代表的な炭化水素として、糖（単糖、二糖、三糖および約4～9個の単糖単位を含有するオリゴ糖）および多糖、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムが挙げられる。具体的な単糖にはC5以上（好ましくはC5～C8）の糖が含まれ、二糖および三糖には2つまたは3つの単糖単位（好ましくはC5～C8）を有する糖が含まれる。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、鎖の3'端もしくは5'端または両端に、1つまたは複数の、dsRNA分子のオーバーハング領域および/またはキャッピング基を含む。オーバーハングは1～10ヌクレオチド長であることができる。例えばオーバーハングは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチド長であることができる。いくつかの態様において、オーバーハングは1～6ヌクレオチド長、例えば2～6ヌクレオチド長、1～5ヌクレオチド長、2～5ヌクレオチド長、1～4ヌクレオチド長、2～4ヌクレオチド長、1～3ヌクレオチド長、2～3ヌクレオチド長、または1～2ヌクレオチド長である。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖より長い結果であるか、同じ長さの2本の鎖が互いにずれている結果であることができる。オーバーハングは、標的配列とミスマッチを形成するか、標的となる遺伝子配列に相補的であるか、または他の配列であることができる。第1鎖と第2鎖は、例えば追加の塩基で接合してヘアピンを形成させるか、または他の非塩基リンカーで接合することもできる。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子のオーバーハング領域中のヌクレオチドは、それぞれ独立して、修飾ヌクレオチドまたは無修飾ヌクレオチド、例えば限定するわけではないが、2'-糖修飾、例えば2'-フルオロ、2'-O-メチル、チミジン（T）、2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン、2'-O-メトキシエチルアデノシン、2'-O-メトキシエチル-5-メチルシチジン、GNA、SNA、hGNA、hhGNA、mGNA、TNA、h'GNA、およびそれらの任意の組合せであることができる。例えばdTdTは、どちらかの鎖のどちらかの端のオーバーハング配列であることができる。オーバーハングは、標的mRNAとミスマッチを形成するか、標的となる遺伝子配列に相補的であるか、または他の配列であることができる。
本発明のdsRNA分子のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の5'-オーバーハングまたは3'-オーバーハングをリン酸化しうる。いくつかの態様において、オーバーハング領域は、2つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを有する2つのヌクレオチドを含有し、それら2つのヌクレオチドは同じである場合も異なる場合もある。いくつかの態様において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の3'端に存在する。いくつかの態様において、この3'-オーバーハングはアンチセンス鎖に存在する。いくつかの態様において、この3'-オーバーハングはセンス鎖に存在する。
本発明のdsRNA分子はオーバーハングを一つだけ含んでもよく、これは、dsRNAの全体的安定性に影響を及ぼすことなく、その干渉活性を強化することができる。例えば一本鎖オーバーハングは、センス鎖の3'末端に位置するか、あるいはアンチセンス鎖の3'末端に位置することができる。dsRNAは、アンチセンス鎖の5'端（またはセンス鎖の3'端）に位置するかまたはその逆である平滑端を有することもできる。
一般にdsRNAのアンチセンス鎖は3'端にヌクレオチドオーバーハングを有し、5'端は平滑である。理論に拘泥するわけではないが、非対称なアンチセンス鎖の5'端の平滑端とアンチセンス鎖の3'端オーバーハングは、RISCへのガイド鎖の積み込みプロセスにとって有利である。例えば、単一のオーバーハングは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖の3'端に2ヌクレオチドのオーバーハングを有し、アンチセンス鎖の5'端に平滑端を有する。
本発明のdsRNAは1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えば、dsRNA分子のセンス鎖中およびアンチセンス鎖中のすべてのヌクレオチドを修飾することができる。各ヌクレオチドは同じ修飾または異なる修飾で修飾することができ、これらの修飾には、非連結ホスフェート酸素のうちの一方もしくは両方および/または連結ホスフェート酸素のうちの1つもしくは複数の1つまたは複数の改変;リボース糖の構成成分の改変;リボース糖の置き換え;「デホスホ（dephospho）」リンカーによるホスフェート部分の全面的置換;天然塩基の修飾または置換;およびリボース-ホスフェートバックボーンの置換または修飾を含めることができる。
核酸はサブユニットのポリマーであるから、修飾の多くは、例えば塩基、またはホスフェート部分、もしくはホスフェート部分の非連結Oの修飾など、核酸内で繰り返される位置に存在する。場合により、修飾は核酸中の対象位置のすべてに存在することになるが、多くの場合は、そうはならないだろう。例えば、修飾は3'末端位置または5'末端位置にのみ存在するか、または中央領域にのみ存在するか、または非末端領域にのみ存在するか、または末端領域中、例えば末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の2、3、4、5もしくは10ヌクレオチド中にのみ存在しうる。修飾は、二本鎖領域中、一本鎖領域中、またはその両方に存在しうる。修飾は、RNAの二本鎖領域中にのみ存在するか、またはRNAの一本鎖領域中にのみ存在しうる。例えば非連結O位置のホスホロチオエート修飾は、一端または両端にのみ存在するか、または末端領域中の、例えば末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の2、3、4、5もしくは10ヌクレオチド中にのみ存在するか、または二本鎖領域および一本鎖領域、特に末端に存在しうる。1つまたは複数の5'端をリン酸化することができる。
例えば、安定性を強化すること、オーバーハングに特定の塩基を含めること、または修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を一本鎖オーバーハング、例えば5'オーバーハングもしくは3'オーバーハング、またはその両方に含めることが可能でありうる。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合がありうる。いくつかの態様では、3'オーバーハングまたは5'オーバーハング中の塩基の全部または一部を、例えば本明細書に記載の修飾で、修飾しうる。修飾には、例えば、当技術分野において公知の修飾によるリボース糖の2'位における修飾の使用、例えば核酸塩基のリボース糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロ（2'-F）または2'-O-メチル修飾物の使用、およびホスフェート基中の修飾、例えばホスホロチオエート修飾を含めることができる。オーバーハングが標的配列と相同である必要はない。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は交互パターンの修飾を、特にB1、B2、B3、B1'、B2'、B3'、B4'領域に含む。本明細書において使用される「交互モチーフ」または「交互パターン」という用語は、1つまたは複数の修飾を有し、それぞれの修飾が一本の鎖の交互ヌクレオチド上に存在するモチーフを指す。交互ヌクレオチドとは、一つ置きのヌクレオチドもしくは二つ置きのヌクレオチドなどといったパターンを指しうる。例えばA、BおよびCがそれぞれヌクレオチドに対する修飾の一タイプを表すとすると、交互モチーフとは「ABABABABABAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AABAABAABAAB…」、「AAABAAABAAAB…」、「AAABBBAAABBB…」または「ABCABCABCABC…」などであることができる。
交互モチーフに含まれる修飾のタイプは同じであっても異なってもよい。例えば、A、B、C、Dがそれぞれヌクレオチド上の修飾の一タイプを表すとすると、交互パターン、すなわちヌクレオチド一つ置きの修飾は同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖のそれぞれは、例えば「ABABAB…」、「ACACAC…」「BDBDBD…」または「CDCDCD…」など、交互モチーフ内でいくつか考えられる修飾から選択することができる。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、アンチセンス鎖上の交互モチーフに関する修飾パターンに対してシフトした、センス鎖上の交互モチーフに関する修飾パターンを含む。シフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾を受けた基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾を受けた基に対応するようなシフト、またはその逆でありうる。例えばセンス鎖がdsRNA二重鎖中でアンチセンス鎖と対合している場合に、二重鎖領域内で、センス鎖中の交互モチーフは鎖の5'から3'に向かって「ABABAB」で始まり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは鎖の3'から5'に向かって「BABABA」で始まりうる。もう一つの例として、センス鎖とアンチセンス鎖の間で修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトが生じるように、二重鎖領域内で、センス鎖中の交互モチーフは鎖の5'から3'に向かって「AABBAABB」で始まり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは鎖の3'から5'に向かって「BBAABBAA」で始まりうる。
5'-修飾
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は5'リン酸化されているか、または5'末端にホスホリル類似体またはホスフェートミミックを含むことができる。5'-ホスフェート修飾として、RISCが媒介する遺伝子サイレンシングと適合するものが挙げられる。適切な修飾として、5'-モノホスフェート（（HO）2（O）P-O-5'）;5'-ジホスフェート（（HO）2（O）P-O-P（HO）（O）-O-5'）;5'-トリホスフェート（（HO）2（O）P-O-（HO）（O）P-O-P（HO）（O）-O-5'）;5'-グアノシンキャップ（7-メチル化または非メチル化）（7m-G-O-5'-（HO）（O）P-O-（HO）（O）P-O-P（HO）（O）-O-5'）;5'-アデノシンキャップ（Appp）および任意の修飾ヌクレオチドキャップ構造または無修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5'-（HO）（O）P-O-（HO）（O）P-O-P（HO）（O）-O-5'）;5'-モノチオホスフェート（ホスホロチオエート;（HO）2（S）P-O-5'）;5'-モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート;（HO）（HS）（S）P-O-5'）、5'-ホスホロチオレート（（HO）2（O）P-S-5'）;酸素/硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスフェート（例えば5'-アルファ-チオトリホスフェート、5'-ガンマ-チオトリホスフェートなど）の任意のさらなる組合せ、5'-ホスホラミデート（（HO）2（O）P-NH-5'、（HO）（NH2）（O）P-O-5'）、5'-アルキルホスホネート（例えばRP（OH）（O）-O-5'-、R＝アルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）、5'-アルケニルホスホネート（すなわちビニル、置換ビニル）、（OH）2（O）P-5'-CH2-）、シクロプロピルホスホネート、5'-アルキルエーテルホスホネート（R＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（MeOCH2-）、エトキシメチルなど、例えばRP（OH）（O）-O-5'-）が挙げられる。一例として、修飾はdsRNA分子のアンチセンス鎖に置くことができる。
上記局面のいずれか一つのいくつかの態様において、アンチセンス鎖は、5'末端にホスホリル類似体またはホスフェートミミックを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、5'末端にアルケニルホスホネート、すなわちビニルホスホネートを含む。例えばアンチセンス鎖は5'-E-ビニルホスホネートを含む。例示的態様において、5'末端の5'ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドは、以下の構造を有しうる:
Figure 2024504694000023
式中、XはOまたはSであり、Rは水素、ヒドロキシ、フルオロ、またはC1～20アルコキシ（例えばメトキシ）であり、R5'は＝C（H）-P（O）（OH）2であり、C5'炭素とR5'の間の二重結合はE配向またはZ配向（例えばE配向）であり、Bは核酸塩基または修飾核酸塩基であり、任意で、Bは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、5'末端にシクロプロピルホスホネートを含む。例えばアンチセンスは、5'末端に
Figure 2024504694000024
を含む（これは、例えば、直前の構造における4'基を置き換えうる。
本発明のdsRNA剤は、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害するために、アンチセンス鎖のシード領域中（すなわちアンチセンス鎖の5'端から位置2～9）に熱不安定化修飾を含むことができる。理論に拘泥するつもりはないが、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の9ヌクレオチド位置内に二重鎖の熱不安定化修飾を少なくとも1つは含むアンチセンス鎖を持つdsRNAは、低減したオフターゲット遺伝子サイレンシング活性を有する。したがっていくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'領域の最初の9個のヌクレオチド位置内に、二重鎖の熱不安定化修飾を少なくとも1つ（例えば1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上）含む。いくつかの態様において、二重鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5'端から、位置2～9、または好ましくは位置4～8に位置する。いくつかのさらなる態様において、二重鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5'端から、位置5、6、7または8に位置する。
いくつかのさらなる態様において、二重鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5'端から、位置7に位置する。
「熱不安定化修飾」という用語は、全体の融解温度（Tm）が低下したdsRNA（好ましくはそのような修飾を有しないdsRNAのTmよりも1、2、3または4度低いTmをもたらすであろう修飾を包含する。いくつかの態様において、二重鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5'端から位置2、3、4、5、6、7、8または9に位置する。
熱不安定化修飾は、脱塩基修飾;相対する鎖中の相対するヌクレオチドとのミスマッチ;および2'-デオキシ修飾または非環式ヌクレオチド、例えばアンロックド核酸（UNA）またはグリコール核酸（GNA）、または5'-2'連結ヌクレオチド（例えば3'-OMe、3'-F、3'-Hまたは3'-OH、本明細書にいう「3'-RNA」を有するもの）などの糖修飾を含むことができるが、それらに限定されるわけではない。例えば熱不安定化修飾としては、以下のmUNAおよびGNAビルディングブロックを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない:
Figure 2024504694000025
Figure 2024504694000026
。
いくつかの態様において、不安定化修飾は5'-2'結合ヌクレオチド（例えば3'-OMe、3'-F、3'-Hまたは3'-OHを有するものである。いくつかの態様において、不安定化修飾は、3'-OMe、3'-F、3'-Hまたは3'-OHを有する5'-2'結合ヌクレオチドである。いくつかの態様において、不安定化修飾は、3'-OMeを有する5'-2'結合ヌクレオチドである。いくつかの態様において、不安定化修飾は、3'-Fを有する5'-2'結合ヌクレオチドである。いくつかの態様において、不安定化修飾は、3'-Hを有する5'-2'結合ヌクレオチドである。いくつかの態様において、不安定化修飾は、例えば以下の式を有する、3'-OHを有する5'-2'結合ヌクレオチドである:
Figure 2024504694000027
式中、Bはヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基類似体であり、任意で、Bはアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。
いくつかの態様において、不安定化修飾は、GNA-isoC、GNA-isoG、5'-mUNA、4'-mUNA、3'-mUNAおよび2'-mUNAからなる群より選択される。
いくつかの態様において、不安定化修飾mUNAは、
Figure 2024504694000028
R＝H、OH;OMe;Cl、F;OH;O-（CH2）2OMe;SMe、NMe2;NH2;Me;CCH（アルキン）、O-nPr;O-アルキル;O-アルキルアミノ;
R'＝H、Me;
B＝A;C;5-Me-C;G;I;U;T;Y;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;フェノキサジン;G-クランプ（G-clamp）;非標準単環式、二環式および三環式複素環;シュードウラシル;isoC;isoG;2,6-ジアミノプリン;シュードシトシン;2-アミノプリン;キサントシン;N6-アルキル-A;O6-アルキル-G;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;7-デアザプリン、フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環
からなる群より選択され、立体化学は、指定されていないキラル中心については、RまたはSならびにRおよびSの組合せである。
いくつかの態様において、不安定化修飾mUNAは、
Figure 2024504694000029
R＝H、OH;OMe;Cl、F;OH;O-（CH2）2OMe;SMe、NMe2;NH2;Me;CCH（アルキン）、O-nPr;O-アルキル;O-アルキルアミノ;
R'＝H、Me;
B＝A;C;5-Me-C;G;I;U;T;Y;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環;シュードウラシル;isoC;isoG;2,6-ジアミノプリン;シュードシトシン;2-アミノプリン;キサントシン;N6-アルキル-A;O6-アルキル-G;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;7-デアザプリン、フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環
からなる群より選択され、立体化学は、指定されていないキラル中心については、RまたはSならびにRおよびSの組合せである。
いくつかの態様において、不安定化修飾mUNAは、
Figure 2024504694000030
R＝H、OMe;F;OH;O-（CH2）2OMe;SMe、NMe2;NH2;Me;O-nPr;O-アルキル;O-アルキルアミノ;
R'＝H、Me;
B＝A;C;5-Me-C;G;I;U;T;Y;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環;シュードウラシル;isoC;isoG;2,6-ジアミノプリン;シュードシトシン;2-アミノプリン;キサントシン;N6-アルキル-A;O6-アルキル-G;7-デアザプリン
からなる群より選択され、立体化学は、指定されていないキラル中心については、RまたはSならびにRおよびSの組合せである。
いくつかの態様において、不安定化修飾mUNAは、
Figure 2024504694000031
R＝H、OH;OMe;Cl、F;OH;O-（CH2）2OMe;SMe、NMe2;NH2;Me;CCH（アルキン）、O-nPr;O-アルキル;O-アルキルアミノ;
R'＝H、Me;
B＝A;C;5-Me-C;G;I;U;T;Y;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環;シュードウラシル;isoC;isoG;2,6-ジアミノプリン;シュードシトシン;2-アミノプリン;キサントシン;N6-アルキル-A;O6-アルキル-G;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;7-デアザプリン、フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環
からなる群より選択され、
立体化学は、指定されていないキラル中心については、RまたはSならびにRおよびSの組合せである。
いくつかの態様において、不安定化修飾mUNAは、
Figure 2024504694000032
R＝H、OH;OMe;Cl、F;OH;O-（CH2）2OMe;SMe、NMe2;NH2;Me;CCH（アルキン）、O-nPr;O-アルキル;O-アルキルアミノ;
R'＝H、Me;
B＝A;C;5-Me-C;G;I;U;T;Y;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環;シュードウラシル;isoC;isoG;2,6-ジアミノプリン;シュードシトシン;2-アミノプリン;キサントシン;N6-アルキル-A;O6-アルキル-G;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;7-デアザプリン、フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環
からなる群より選択され、立体化学は、指定されていないキラル中心については、RまたはSならびにRおよびSの組合せである。
いくつかの態様において、修飾mUNAは、
Figure 2024504694000033
R＝H、OMe;F;OH;O-（CH2）2OMe;SMe、NMe2;NH2;Me;O-nPr;O-アルキル;O-アルキルアミノ;
R'＝H、Me;
B＝A;C;5-Me-C;G;I;U;T;Y;2-チオウリジン;4-チオウリジン;C5-修飾ピリミジン;C2-修飾プリン;N8-修飾プリン;フェノキサジン;G-クランプ;非標準単環式、二環式および三環式複素環;シュードウラシル;isoC;isoG;2,6-ジアミノプリン;シュードシトシン;2-アミノプリン;キサントシン;N6-アルキル-A;O6-アルキル-G;7-デアザプリン
からなる群より選択され、立体化学は、指定されていないキラル中心については、RまたはSならびにRおよびSの組合せである。
例示的な脱塩基修飾として、以下の修飾が挙げられるが、それらに限定されるわけではない:
Figure 2024504694000034
式中、R＝H、Me、EtまたはOMe、R'＝H、Me、EtまたはOMe、R”＝H、Me、EtまたはOMe
Figure 2024504694000035
式中、Bは修飾または無修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクはR、Sまたはラセミのいずれかを表す。
例示される糖修飾として、以下の修飾が挙げられるが、それらに限定されるわけではない:
Figure 2024504694000036
式中、Bは修飾または無修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクはR、Sまたはラセミのいずれかを表す。
いくつかの態様において、二重鎖の熱不安定化修飾は、本明細書の実施例1～3に記載のmUNAおよびGNAビルディングブロックから選択される。いくつかの態様において、不安定化修飾は、GNA-isoC、GNA-isoG、5'-mUNA、4'-mUNA、3'-mUNAおよび2'-mUNAからなる群より選択される。これのいくつかのさらなる態様において、dsRNA分子は、GNA、2'-OMe、3'-OMe、5'-Me、Hyp-スペーサー、SNA、hGNA、hhGNA、mGNA、TNAおよびh'GNA（Mod A～Mod K）からなる群より選択される少なくとも1つの熱不安定化修飾を、さらに含む。
「非環式ヌクレオチド」という用語は、非環式リボース糖を有する任意のヌクレオチド、例えばリボース炭素間の結合のいずれか（例えばC1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'またはC1'-O4'）が存在せず、および/またはリボース炭素またはリボース酸素のうちの少なくとも1つ（例えばC1'、C2'、C3'、C4'またはO4'）が独立してまたは組み合わされてヌクレオチドから欠失しているものを指す。いくつかの態様において、非環式ヌクレオチドは、
Figure 2024504694000037
であり、式中、Bは修飾または無修飾核酸塩基であり、R1およびR2は、独立して、H、ハロゲン、OR3、またはアルキルであり、R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖である）。「UNA」という用語は、糖の結合のいずれかが除去されてアンロックド「糖」残基を形成しているアンロックド非環式核酸を指す。一例において、UNAは、C1'-C4'間の結合（すなわちC1'炭素とC4'炭素の間の炭素-酸素-炭素共有結合）が除去されているモノマーも包含する。もう一つの例では、糖のC2'-C3'結合（すなわちC2'炭素とC3'炭素の間の炭素-炭素共有結合）が除去される（Mikhailov et.al.,Tetrahedron Letters,26（17）:2059（1985）およびFluiter et al.,Mol.Biosyst.,10:1039（2009）参照。これらの文献は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる）。非環式誘導体は、ワトソン-クリック対合に影響を及ぼすことなく、バックボーンのフレキシビリティを増大させる。非環式ヌクレオチドは2'-5'連結部または3'-5'連結部によって連結されうる。
「GNA」という用語は、DNAまたはRNAに似たポリマーであるが、その「バックボーン」の組成が、ホスホジエステル結合によって連結された繰り返しグリセロール単位で構成される点で異なるポリマーである、グリコール核酸:
Figure 2024504694000038
を指す。
二重鎖の熱不安定化修飾は、dsRNA二重鎖内の熱不安定化ヌクレオチドと逆鎖中の相対するヌクレオチドとの間のミスマッチ（すなわち非相補的な塩基対）であることができる。例示的なミスマッチ塩基対として、G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T、またはそれらの組合せが挙げられる。当技術分野において公知の他のミスマッチ塩基対合も本発明に適用できる。ミスマッチは、天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの間で起こりうる。すなわちミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾とは無関係に、各ヌクレオチドの核酸塩基間で起こりうる。一定の態様において、dsRNA分子は、ミスマッチ対合中に、2'-デオキシ核酸塩基である核酸塩基を少なくとも1つは含有し、例えばその2'-デオキシ核酸塩基はセンス鎖中にある。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖のシード領域における二重鎖の熱不安定化修飾は、標的mRNA上の相補塩基へのW-C H結合が損なわれているヌクレオチド、例えば、
Figure 2024504694000039
を含む。
脱塩基ヌクレオチド修飾、非環式ヌクレオチド修飾（UNAおよびGNAを含む）およびミスマッチ修飾のさらなる例は、WO 2011/133876に詳述されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
熱不安定化修飾には、相対する塩基と水素結合する能力が低減または消失しているユニバーサル塩基、およびホスフェート修飾も含めうる。
いくつかの態様において、二重鎖の熱不安定化修飾には、非標準塩基を持つヌクレオチド、例えば限定するわけではないが逆鎖中の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれているか完全に消失している核酸塩基修飾が含まれる。これらの核酸塩基修飾は、WO 2010/0011895に記載されているように、dsRNA二重鎖の中央領域の不安定化について評価されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。例示的な核酸塩基修飾は、
Figure 2024504694000040
である。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖のシード領域における二重鎖の熱不安定化修飾は、標的mRNA上の塩基に相補的な1つまたは複数のα-ヌクレオチド、例えば、
Figure 2024504694000041
を含み、式中、Rは、H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2またはO-アルキルである。
天然のホスホジエステル連結部と比べてdsRNA二重鎖の熱安定性を減少させることが公知である例示的ホスフェート修飾は、
Figure 2024504694000042
である。
R基としてのアルキルはC1～C6アルキルであることができる。R基としての具体的アルキルには、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
熱不安定化修飾はアンチセンス鎖中の2'-デオキシヌクレオチドを置き換えうることに注意されたい。例えば、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12、14および/または16の2'-デオキシヌクレオチドを、本明細書記載の熱不安定化修飾で置き換えることができる。したがって、いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7、12、14および/または16のうちの1、2、3、4、5および/または6つに、熱不安定化修飾を含む。例えばアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に熱不安定化修飾を含む。
熱不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、dsRNAは、1つまたは複数の安定化修飾も含むことができる。例えばdsRNAは、少なくとも2つ（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上）の安定化修飾を含むことができる。限定されるわけではないが、安定化修飾はすべてが1本の鎖中に存在することができる。いくつかの態様において、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が少なくとも2つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に存在することができる。例えば安定化修飾はセンス鎖上および/またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチドに存在することができ、または各安定化修飾はセンス鎖上もしくはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在することができ、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は両方の安定化修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであっても異なってもよく、センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンに対してシフトしていてもよい。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、少なくとも2つ（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定されるわけではないが、アンチセンス鎖中の安定化修飾は任意の位置に存在することができる。いくつかの態様において、アンチセンスは、5'端から位置2、6、8、9、14および16に安定化修飾を含む。いくつかの別の態様において、アンチセンスは、5'端から位置2、6、14および16に安定化修飾を含む。いくつかのさらに別の態様において、アンチセンスは、5'端から位置2、14および16に安定化修飾を含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接して少なくとも1つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の5'端または3'端にあるヌクレオチド、すなわち不安定化修飾の位置から-1または＋1の位置にあるヌクレオチドであることができる。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の5'端と3'端のそれぞれに、すなわち不安定化修飾の位置から-1の位置と＋1の位置に、安定化修飾を含む。
いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の3'端に少なくとも2つの安定化修飾を、すなわち少なくとも不安定化修飾の位置から＋1の位置と＋2の位置に2つの安定化修飾を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、少なくとも2つ（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定されるわけではないが、センス鎖中の安定化修飾は任意の位置に存在することができる。いくつかの態様において、センス鎖は、5'端から位置7、10および11に安定化修飾を含む。いくつかの別の態様において、センス鎖は、5'端から位置7、9、10および11に安定化修飾を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置11、12および15に相対するまたは相補的な位置に、安定化修飾を含む。いくつかの別の態様において、センス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置11、12、13および15に相対するまたは相補的な位置に、安定化修飾を含む。いくつかの態様において、センス鎖は、2つ、3つまたは4つの安定化修飾のブロックを含む。
いくつかの態様において、センス鎖は、アンチセンス鎖中の二重鎖の熱不安定化修飾に相対するまたは相補的な位置には、安定化修飾を含まない。
例示的な熱安定化修飾として、2'-フルオロ修飾が挙げられるが、それに限定されるわけではない。他の熱安定化修飾として、LNAが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
熱安定化修飾はセンス鎖および/またはアンチセンス鎖中の2'-フルオロヌクレオチドを置き換えうることに注意されたい。例えば、センス鎖の5'端から数えて位置8、9、10、11および/または12の2'-フルオロヌクレオチドを、熱安定化修飾で置き換えることができる。同様に、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14の2'-フルオロヌクレオチドを、熱安定化修飾で置き換えることができる。
dsRNA分子がインビボでより有効であるためには、アンチセンス鎖が、ある程度は代謝安定性でなければならない。言い換えると、dsRNA分子がインビボでより有効であるためには、投与後、ある期間後に、ある程度の量のアンチセンス鎖がインビボに存在する必要がありうる。したがっていくつかの態様では、インビボ投与後5日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後6日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後7日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後8日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後9日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後10日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後11日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後12日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後13日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後14日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。いくつかの態様では、インビボ投与後15日目に、dsRNAのアンチセンス鎖の少なくとも40％、例えば少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％または少なくとも80％が、インビボに、例えばマウス肝臓中に存在する。
dsRNAの使用
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書において定義されるdsRNA分子の使用に関する。いくつかの態様において、本発明はさらに、インビトロで標的遺伝子の発現を阻害するための、dsRNA分子の使用に関する。
本発明はさらに、対象における標的遺伝子の発現を阻害するのに使用するための、本明細書において定義されるdsRNA分子に関する。対象は、任意の動物、例えば哺乳動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、またはヒトでありうる。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は緩衝液に入れて投与される。
いくつかの態様において、本明細書記載のsiRNA化合物は、対象への投与のために製剤化されうる。製剤化されたsiRNA組成物はさまざまな状態をとることができる。いくつかの例において、組成物は少なくとも部分的に結晶性であり、一様に結晶性であり、および/または無水（例えば80、50、30、20または10％未満の水分）である。別の一例において、siRNAは水相にあり、例えば水を含む溶液中にある。
水相または結晶性組成物は、例えば送達媒体、例えばリポソーム（特に水相用）または粒子（例えば結晶性組成物にとって適当でありうるような微粒子）に組み入れることができる。一般に、siRNA組成物は、本明細書に記載するように、意図する投与方法に適合する方法で、製剤化される。例えば、特定の態様において、組成物は、以下の方法のうちの少なくとも1つによって調製される:噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、エバポレーション、流動床乾燥、もしくはこれらの技法の組合せ;、または脂質と共に超音波処理、フリーズドライ、凝縮および他の自己集合。
dsRNA調製物は、別の剤、例えば別の治療剤と、またはdsRNAを安定化する剤、例えばdsRNAと複合体化してiRNPを形成するタンパク質と、組み合わせて製剤化することができる。さらなる他の剤として、キレート剤、例えばEDTA（例えばMg2＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、RNAse阻害剤（例えばRNAsinなどの広域特異性RNAse阻害剤）などが挙げられる。
いくつかの態様において、dsRNA調製物は、別のdsRNA化合物、例えば第2の遺伝子に関してまたは同じ遺伝子に関してRNAiを媒介することができる第2のdsRNAを含む。さらに別の調製物は、少なくとも3、5、10、20、50もしくは100種、またはそれ以上の異なるsiRNA種を含むことができる。そのようなdsRNAは、同様の数の異なる遺伝子に関してRNAiを媒介することができる。
いくつかの態様において、dsRNA調製物は、少なくとも第2の治療剤（例えばRNAまたはDNA以外の剤）を含む。例えば、ウイルス疾患、例えばHIVを処置するためのdsRNA組成物は、公知の抗ウイルス剤（例えばプロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）を含むかもしれない。別の一例において、がんを処置するためのdsRNA組成物は化学療法剤をさらに含むかもしれない。
本発明のdsRNA分子を投与するために使用することができる例示的な製剤を以下に論じる。
リポソーム。dsRNA調製物は、送達のために、膜分子アセンブリ、例えばリポソームまたはミセルに、製剤化することができる。本明細書において使用される「リポソーム」という用語は、少なくとも1つの二重層、例えば1つの二重層または複数の二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームには、親油性材料から形成される膜と水性内部とを有するユニラメラ小胞およびマルチラメラ小胞が含まれる。水性部分はsiRNA組成物を含有する。親油性材料は水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は典型的にはsiRNA組成物を含まないが、いくつかの例では、siRNA組成物を含みうる。リポソームは、作用部位への活性成分の移入および送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用すると、リポソームの二重層が細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の合体が進行するにつれて、dsRNAを含む内側の水性内容物は細胞中に送達され、そこではdsRNAが標的RNAに特異的に結合してRNAiを媒介することができる。場合により、例えばdsRNAを特定細胞タイプに向かわせるために、リポソームも特異的に標的化される。
dsRNAを含有するリポソームは、さまざまな方法によって調製することができる。ある例では、リポソームの脂質構成要素を、脂質構成要素でミセルが形成されるように、デタージェント中に溶解する。例えば、脂質構成要素は両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであることができる。デタージェントは高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性でありうる。例示的なデタージェントとして、コール酸、CHAPS、オクチルグルコシド、デオキシコール酸およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次に、脂質構成要素を含むミセルに、dsRNA調製物を加える。脂質上のカチオン基はsiRNAと相互作用し、dsRNAの周りに凝縮することでリポソームを形成する。凝縮後に、デタージェントを透析などによって取り除くことで、dsRNAのリポソーム調製物を得る。
必要であれば、凝縮を助ける担体化合物を、凝縮反応中に、制御された添加などによって加えることができる。例えば、担体化合物は核酸以外のポリマー（例えばスペルミンまたはスペルミジン）であることができる。凝縮に有利になるようにpHを調節することもできる。
ポリヌクレオチド/カチオン性脂質複合体を送達媒体の構成要素として組み入れた安定なポリヌクレオチド送達媒体を生産するための方法のさらなる説明は、例えばWO96/37194に記載されている。リポソーム形成は、Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8:7413-7417,1987、米国特許第4,897,355号、米国特許第5,171,678号、Bangham,et al.M.Mol.Biol.23:238,1965、Olson,et al.Biochim.Biophys.Acta 557:9,1979、Szoka,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.75:4194,1978、Mayhew,et al.Biochim.Biophys.Acta 775:169,1984、Kim,et al.Biochim.Biophys.Acta 728:339,1983およびFukunaga,et al.Endocrinol.115:757,1984に記載の例示的な方法の1つまたは複数の局面も含むことができ、これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。送達媒体としての使用に適したサイズの脂質凝集体を調製するためによく使用される技法として、超音波処理および凍結融解と押出しが挙げられる（例えばMayer,et al.Biochim.Biophys.Acta 858:161,1986参照。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。一貫して小さく（50～200nm）比較的一様な凝集体が望ましい場合は、マイクロ流体技術を使用することができる（Mayhew,et al.Biochim.Biophys.Acta 775:169,1984、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。これらの方法はリポソームへのsiRNA調製物のパッケージングに容易に適合させることができる。
pH感受性のまたは負に帯電したリポソームは、核酸分子との複合体を形成するのではなく、むしろ核酸を封入する。核酸分子と脂質はどちらも同じように帯電しているので、複合体の形成よりもむしろ反発が起こる。それでも一部の核酸分子はこれらのリポソームの水性内部内に封入される。pH感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養細胞単層に送達するために使用されている。標的細胞において外因性遺伝子の発現が検出された（Zhou et al.,Journal of Controlled Release,19,（1992）269-274、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
リポソーム組成物の主要タイプの一つは、天然由来ホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）から形成されうる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性膜融合性リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）から形成される。もう一つのタイプのリポソーム組成物はホスファチジルコリン（PC）、例えば大豆PCおよび卵PCなどから形成される。もう一つのタイプはリン脂質および/またはホスファチジルコリンおよび/またはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロで細胞にリポソームを導入するための他の方法の例として、米国特許第5,283,185号、米国特許第5,171,678号、WO94/00569、WO93/24640、WO 91/16024、Felgner,J.Biol.Chem.269:2550,1994、Nabel,Proc.Natl.Acad.Sci.90:11307,1993、Nabel,Human Gene Ther.3:649,1992、Gershon,Biochem.32:7143,1993およびStrauss EMBO J.11:417,1992が挙げられる。
いくつかの態様では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームには、細胞膜に融合できるという利点がある。非カチオン性リポソームは、形質膜と効率よく融合することはできないものの、インビボではマクロファージによって取り込まれ、siRNAをマクロファージに送達するために使用することができる。
リポソームのさらなる利点として、天然リン脂質から得られたリポソームは生体適合性かつ生分解性であること、リポソームには広範囲にわたる水溶性および脂溶性の薬物を組み入れることができること、リポソームはその内側区画に封入されたsiRNAを代謝および分解から保護できることが挙げられる（Rosoff,「Pharmaceutical Dosage Forms」,Lieberman,Rieger and Banker（Eds.）,1988,volume 1,p.245）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質表面電荷、小胞サイズおよびリポソームの水体積である。
正荷電合成カチオン性脂質N-［1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）を使って、核酸と自発的に相互作用して脂質-核酸複合体を形成する小さなリポソームを形成させることができ、このリポソームは、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合することで、結果として、siRNAを送達する能力を有する（DOTMAおよびDNAとのその使用については、例えばFelgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8:7413-7417、1987および米国特許第4,897,355号を参照されたい、これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
DOTMA類似体1,2-ビス（オレオイルオキシ）-3-（トリメチルアンモニア）プロパン（DOTAP）をリン脂質と組み合わせて使用することにより、DNA複合体化小胞を形成させることができる。Lipofectin（商標）（Bethesda Research Laboratories、メリーランド州ゲイサーズバーグ）は、高度にアニオン性である核酸を生きている組織培養細胞中に送達するための効果的な薬剤であり、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する正に帯電したDOTMAリポソームを含む。十分な正に帯電したリポソームを使用すると、結果として生じる複合体の正味の電荷はやはり正になる。この方法で調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着し、形質膜と融合して、例えば組織培養細胞中に、機能的核酸を効率よく送達する。市販されているもう一つのカチオン性脂質、1,2-ビス（オレオイルオキシ）-3,3-（トリメチルアンモニア）プロパン（「DOTAP」）（Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス）は、オレオイル部分がエーテル連結部ではなくエステルによって連結されている点で、DOTMAとは異なる。
報告されている他のカチオン性脂質化合物には、さまざまな部分にコンジュゲートされたもの、例えば2タイプの脂質のうち1つにコンジュゲートされたカルボキシスペルミンであって、5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレイルアミド（「DOGS」）（Transfectam（商標）、Promega、ウィスコンシン州マディソン）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン5-カルボキシスペルミルアミド（「DPPES」）などの化合物を含むものがある（例えば米国特許第5,171,678号を参照されたい）。
もう一つのカチオン性脂質コンジュゲートには、DOPEと組み合わせてリポソームに製剤化された、コレステロールによる脂質の誘導体化（「DC-Chol」）が含まれる（例えばGao,X.and Huang,L.,Biochim.Biophys.Res.Commun.179:280,1991参照）。DOPEにポリリジンをコンジュゲートすることによって作製されるリポポリリジンは、血清存在下でのトランスフェクションに有効であると報告されている（Zhou,X.et al.,Biochim.Biophys.Acta 1065:8,1991、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。一定の細胞株については、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、DOTMA含有組成物よりも低い毒性を呈し、効率のよいトランスフェクションをもたらすと言われている。他の市販のカチオン性脂質製品には、DMRIEおよびDMRIE-HP（Vical、カリフォルニア州ラホーヤ）およびLipofectamine（DOSPA）（Life Technology,Inc.、メリーランド州ゲイサーズバーグ）がある。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質はWO98/39359およびWO96/37194に記載されている。
リポソーム製剤は外用投与には特に適している。リポソームには他の製剤と比較していくつかの利点がある。それらの利点には、投与された薬物の高い全身性吸収に関係する副作用の低減、投与された薬物の所望の標的における蓄積の増加、および皮膚にsiRNAを投与できることが含まれる。いくつかの実施形態では、表皮細胞にsiRNAを送達するために、そして真皮組織への、例えば皮膚への、siRNAの浸透を強化するために、リポソームが使用される。例えばリポソームは外用的に適用することができる。リポソームとして製剤化された薬物の外用送達は詳述されている（例えばWeiner et al.,Journal of Drug Targeting,1992,vol.2,405-410およびdu Plessis et al.,Antiviral Research,18,1992,259-265、Mannino,R.J.and Fould-Fogerite,S.,Biotechniques 6:682-690,1988、Itani,T.et al.Gene 56:267-276.1987、Nicolau,C.et al.Meth.Enz.149:157-176,1987、Straubinger,R.M.and Papahadjopoulos,D.Meth.Enz.101:512-527,1983、Wang,C.Y.and Huang,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851-7855,1987を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールとを含む系も、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を決定するために検討されている。Novasome I（グリセリルジラウレート/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）およびNovasome II（グリセリルジステアレート/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮に薬物を送達するために使用された。本明細書記載のdsRNAを含むそのような製剤は皮膚障害を処置するのに有用である。
本明細書記載のdsRNAを含むリポソームは高度に変形可能であるようにすることができる。そのような変形可能性は、リポソームが、リポソームの平均半径よりも小さな小孔を通って浸透することを可能にしうる。例えばトランスファーソームは変形可能なリポソームの一タイプである。トランスファーソームは、標準的なリポソーム組成物に表面エッジ活性化因子（surface edge activator）、通常は界面活性剤を添加することによって作製することができる。本明細書記載のdsRNAを含むトランスファーソームは、皮膚のケラチノサイトにdsRNAを送達するために、例えば皮下にインフェクション（infection）によって送達することができる。哺乳動物の無傷の皮膚を横切るために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれが直径50nm未満である一連の細孔を通過しなければならない。加えて、脂質の特性ゆえに、これらのトランスファーソームは、自己最適化性（小孔、例えば皮膚の小孔の形状に対して適応性がある）、自己修復性であることができ、多くの場合、断片化せずにそれぞれの標的に到達することができ、多くの場合、自己装填性（self-loading）であることができる。
本発明に適する他の製剤は、2008年1月2日に出願された米国仮出願第61/018,616号、2008年1月2日に出願された同第61/018,611号、2008年3月26日に出願された同第61/039,748号、2008年4月22日に出願された同第61/047,087号および2008年5月8日に出願された同第61/051,528号に記載されている。2007年10月3日に出願されたPCT出願番号PCT/US2007/080331にも、本発明に適した製剤が記載されている。
界面活性剤。dsRNA組成物は界面活性剤を含むことができる。いくつかの態様において、dsRNAは界面活性剤を含むエマルションとして製剤化される。天然界面活性剤でも合成界面活性剤でも数多くの異なるタイプの界面活性剤の性質を分類しランク付する最も一般的な方法は、親水性/親油性バランス（HLB）を使用する方法である。親水性基の性質は、製剤に使用されるさまざまな界面活性剤をカテゴリー化するための最も有用な手段になる（Rieger,「Pharmaceutical Dosage Forms」,Marcel Dekker,Inc.,ニューヨーク、NY,1988,p.285）。
界面活性剤分子がイオン化されないのであれば、それは非イオン性界面活性剤と分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品に広く応用され、広範囲にわたるpH値で使用することができる。一般に、それらのHLB値は、それぞれの構造に依存して2～約18の範囲にある。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシ化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。非イオン性のアルカノールアミドおよびアルカノールエーテル、例えば脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシ化/プロポキシ化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。
水に溶解または分散させた時に界面活性剤分子が負電荷を持つのであれば、その界面活性剤はアニオン性と分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸などのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えばアルキルサルフェートおよびエトキシ化アルキルサルフェート、スルホネート、例えばアルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、ならびにホスフェートが含まれる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーはアルキルサルフェートおよび石鹸である。
水に溶解または分散させた時に界面活性剤分子が正電荷を持つのであれば、その界面活性剤はカチオン性と分類される。カチオン性界面活性剤には4級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。4級アンモニウム塩はこのクラスでは最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が正電荷または負電荷をどちらでも持つことができる場合、その界面活性剤は両性と分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタインおよびホスファチドが含まれる。
薬物製品、製剤およびエマルションにおける界面活性剤の使用については総説がある（Rieger,「Pharmaceutical Dosage Forms」,Marcel Dekker,Inc.,ニューヨーク、NY,1988,p.285）。
ミセルおよび他の膜製剤。説明を簡単にするために、この項でのミセルならびに他の製剤、組成物および方法は、おおむね、無修飾siRNA化合物について論じる。しかし、これらのミセルおよび他の製剤、組成物および方法は、他のsiRNA化合物、例えば修飾siRNA化合物でも実施することができ、そのような実施は本発明内であると理解されうる。siRNA化合物、例えば二本鎖siRNA化合物、またはssiRNA化合物（例えば前駆体、例えばssiRNA化合物にプロセシングされうる、より大きなsiRNA化合物、またはsiRNA化合物、例えば二本鎖siRNA化合物、またはssiRNA化合物、またはその前駆体をコードするDNA））、組成物は、ミセル製剤として提供することができる。「ミセル」とは、本明細書では、両親媒性分子の疎水性部分がすべて内側を向き、親水性部分は周囲の水相と接触した状態を保つように、両親媒性分子が球状構造に配置されている分子集合体の一特定タイプと定義される。環境が疎水性であるなら、逆の配置が存在する。
経皮メンブレン（transdermal membranes）による送達に適した混合ミセル製剤は、dsRNA組成物の水溶液、アルカリ金属C8～C22アルキルサルフェートおよびミセル形成化合物を混合することによって調製されうる。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレート、モノラウレート、ボリジオイル、月見草オイル、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよび薬学的に許容されるその塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物はアルカリ金属アルキルサルフェートの添加と同時にまたはアルカリ金属アルキルサルフェートの添加後に添加しうる。混合ミセルは、実質上あらゆる種類の成分の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを得るには激しく混合する。
ある方法では、dsRNA組成物と少なくともアルカリ金属アルキルサルフェートとを含有する第1ミセル組成物が調製される。次にその第1ミセル組成物を少なくとも3種のミセル形成化合物と混合することで、混合ミセル組成物を形成させる。別の一方法では、dsRNA組成物とアルカリ金属アルキルサルフェートとミセル形成化合物のうちの少なくとも1つとを混合することによってミセル組成物を調製し、次に残りのミセル形成化合物を加えて激しく撹拌する。
製剤を安定化し細菌の増殖から保護するために、フェノールおよび/またはm-クレゾールを混合ミセル組成物に加えてもよい。あるいは、フェノールおよび/またはm-クレゾールをミセル形成成分と共に加えてもよい。混合ミセル組成物の形成後にグリセリンなどの等張化剤も加えうる。
ミセル製剤をスプレーとして送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーには噴射剤が充填される。加圧下の噴射剤はディスペンサー中で液状である。成分の比は、水相と噴射剤相とが1つになるように、すなわち存在する相が1つであるように、調節される。2つの相が存在する場合は、内容物の一部を例えば計量弁を通して投薬する前に、ディスペンサーを振とうする必要がある。薬学的剤の投薬量は、計量弁から微細な霧として噴射される。
噴射剤は、含水素クロロフルオロカーボン、含水素フルオロカーボン、ジメチルエーテルおよびジエチルエーテルを含みうる。一定の態様では、HFA134a（1,1,1,2テトラフルオロエタン）を使用しうる。
必須成分の具体的濃度は比較的単純な実験によって決定することができる。口腔からの吸収には、注射による場合または消化管経由の投与による場合の投薬量を、例えば少なくとも2倍または3倍に増加させることが望ましいことが多い。
粒子。いくつかの態様において、dsRNA調製物は粒子、例えば微粒子に組み入れることができる。微粒子は噴霧乾燥によって生産することができるが、凍結乾燥、エバポレーション、流動床乾燥、真空乾燥またはそれらの技法の組合せなどといった他の方法によっても生産されうる。
薬学的組成物
本発明のdsRNA剤は、薬学的使用のために製剤化することができる。本発明はさらに、本明細書において定義されるdsRNA分子を含む薬学的組成物に関する。薬学的に許容される組成物は、単独で投薬されるか、または1つもしくは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）、賦形剤および/もしくは希釈剤と一緒に製剤化された、治療有効量の1種または複数種の前記態様のいずれかのdsRNA分子を含む。
薬学的組成物は、次に挙げる投与に適合するものを含めて、固形物または液状物として投与するために、特別に製剤化されうる。（1）経口投与、例えば飲薬（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、例えば口腔粘膜、舌下および全身性吸収を目的とするもの、ボーラス、粉末剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト剤、（2）非経口投与、例えば滅菌溶液もしくは滅菌懸濁液または徐放性製剤としての皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射によるもの、（3）外用適用、例えばクリーム剤、軟膏もしくは放出制御性貼付剤、または皮膚に適用される噴霧剤、（4）例えばペッサリー、クリーム剤またはフォーム剤としての、腟内または直腸内投与、（5）舌下投与、（6）眼投与、（7）経皮投与、または（8）鼻腔投与。皮下法または静脈内法を使った送達は特に有利である。
本明細書において使用される「治療有効量」という語句は、本発明の化合物を含む化合物、材料または組成物の量であって、動物中の細胞の少なくとも部分集団において、任意の医学的処置に適用可能な合理的ベネフィット/リスク比で、何らかの所望の治療効果を生じるのに有効な量を意味する。
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット/リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適する、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すために使用される。
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、身体のある器官または部分から身体の別の器官または部分へと本化合物を運搬または輸送するのに必要な、薬学的に許容される材料、組成物または媒体、例えば液状または固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸（steric acid））、または溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者にとって有害でないという意味で、「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料の例を以下にいくつか挙げる:（1）糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース、（2）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン、（3）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース、（4）トラガント粉末、（5）麦芽、（6）ゼラチン、（7）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム（magnesium state）、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク、（8）賦形剤、例えばカカオ脂および坐剤用ワックス、（9）油、例えばラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油、（10）グリコール、例えばプロピレングリコール、（11）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール、（12）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（13）寒天、（14）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、（15）アルギン酸、（16）パイロジェンフリー水、（17）等張食塩水、（18）リンゲル液、（19）エチルアルコール、（20）pH緩衝溶液、（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物、（22）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸、（23）血清構成要素、例えば血清アルブミン、HDLおよびLDL、ならびに（22）薬学的製剤に使用される他の非毒性適合物質が挙げられる。
製剤は、単位剤形で都合よく提示することができ、薬学分野において周知の任意の方法によって調製しうる。単一の剤形を生産するために担体材料と合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主、特定投与様式に依存して変動するだろう。単一の剤形を生産するために担体材料と合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる化合物の量であるだろう。一般に、この量は、100パーセントのうち、活性成分約0.1パーセントから約99パーセントまで、好ましくは約5パーセントから約70パーセントまで、最も好ましくは約10パーセントから約30パーセントまでの範囲に及ぶだろう。
一定の態様において、本発明の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば胆汁酸、ならびにポリマー担体、例えばポリエステルおよびポリ無水物からなる群より選択される賦形剤と、本発明の化合物とを含む。一定の態様において、前述の製剤は、本発明の化合物を経口バイオアベイラブルにする。
dsRNA剤調製物は、別の剤、例えば別の治療剤と、またはdsRNAを安定化する剤、例えばdsRNAと複合体化してiRNPを形成するタンパク質と、組み合わせて製剤化することができる。さらなる他の剤として、キレート剤、例えばEDTA（例えばMg2＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、RNAse阻害剤（例えばRNAsinなどの広域特異性RNAse阻害剤）などが挙げられる。
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体および任意で1つまたは複数の補助成分と混合する工程を含む。一般に製剤は本発明の化合物を液状担体もしくは粉砕された固形担体またはその両方と一様かつ密接に混合し、次に必要であれば製品を成形することによって調製される。
場合によっては、薬物の効果を長引かせるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅くすることが望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶性材料または無定形材料の懸濁液の使用によって達成しうる。その場合、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、そして溶解速度は結晶サイズおよび結晶形に依存しうる。あるいは、非経口的に投与された剤形の遅延吸収は、薬物を油性媒体に溶解するか懸濁することによって達成される。
本発明の化合物は、他の医薬品との類推により、医学または獣医学における使用のために任意の好都合な方法での投与用に製剤化されうる。
「処置」（treatment）という用語は、セラピー（therapy）およびキュア（cure）を包含するものとする。この処置を受ける患者は、その必要がある任意の動物、例えば霊長類、特にヒト、および他の哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ブタおよびヒツジ、ならびに家禽およびペット全般である。
二本鎖RNA剤は、インビボで細胞において、例えば細胞中に送達された外因性DNAテンプレートから、生産される。例えばDNAテンプレートをベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）によって、または定位注射（例えばChen et al.（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057参照、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）によって、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むか、または遺伝子送達媒体が埋め込まれている遅放性マトリックスを含むことができる。DNAテンプレートは、例えば、dsRNA分子のトップ鎖を含む転写産物を生産する1つの転写単位と、dsRNA分子のボトム鎖を含む転写産物を生産する1つの転写産物との、2つの転写単位を含むことができる。それらのテンプレートが転写されると、dsRNA分子が生成して、遺伝子サイレンシングを媒介するsiRNA剤フラグメントにプロセシングされる。
本明細書において定義されるdsRNA分子または本明細書において定義されるdsRNA分子を含む薬学的組成物は、さまざまな送達経路を使って対象に投与することができる。本明細書記載のdsRNAを含む組成物は、さまざまな経路によって対象に到達することができる。例示的な経路として、静脈内、皮下、外用、直腸、肛門、膣、鼻腔、肺、眼が挙げられる。
本発明のdsRNA分子は、投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的には、1種または複数種のdsRNAと薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」という言葉は、薬学的投与と適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含するものとする。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および剤の使用は当技術分野において周知である。従来の媒質または剤は、それが活性化合物と不適合でない限り、いずれも、本組成物におけるその使用が考えられる。本組成物には補助的な活性化合物も組み入れることができる。
本発明の組成物は、局所的処置を望むか全身性処置を望むかに依存して、また処置されるべき領域に依存して、いくつかの方法で投与しうる。投与は外用（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口または非経口でありうる。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、または髄腔内もしくは室内投与が含まれる。
投与経路および投与部位は、標的化が強化されるように選ばれうる。例えば筋細胞を標的とするには、関心対象の筋肉への筋肉内注射が論理的な選択になるだろう。dsRNAをエアロゾルの形態で投与することにより、肺細胞が標的になりうる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをdsRNAでコーティングし、dsRNAを機械的に導入することによって標的となりうる。
一局面において、本発明は、dsRNA分子、例えば本明細書記載のdsRNA剤を、対象（例えばヒト対象）に投与する方法を特徴とする。別の一局面において、本発明は、対象における標的遺伝子の発現を阻害するのに使用するための、本明細書において定義されるdsRNA分子に関する。本方法または医学的使用は、dsRNA分子、例えば本明細書記載のdsRNA剤の単位用量を投与することを含む。いくつかの態様において、単位用量は、体重1kgあたり10mg未満、または体重1kgあたり10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005もしくは0.00001mg未満、および体重1kgあたりRNA剤200nmole（例えば約4.4×1016コピー）未満、または体重1kgあたりRNA剤1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmole未満である。
規定の量は、疾患または障害、例えば標的遺伝子と関連する疾患または障害を処置または防止するのに有効な量でありうる。単位用量は、例えば、注射（例えば静脈内、皮下または筋肉内）、吸入投与、または外用によって投与することができる。いくつかの態様において、投薬量は10、5、2、1または0.1mg/kg体重未満でありうる。
いくつかの態様において、単位用量は、1日1回未満、例えば2、4、8または30日ごとに1回未満の頻度で投与される。別の一態様において、単位用量は、ある頻度では（例えば定期的頻度では）投与されない。例えば単位用量は1回だけ投与されうる。
いくつかの態様では、有効用量が、従来の他の治療モダリティと共に投与される。いくつかの態様において、対象はウイルス感染を有し、前記モダリティはdsRNA分子以外の、例えばsiRNA剤以外の、抗ウイルス剤である。別の一態様において、対象はアテローム性動脈硬化を有し、dsRNA分子の、例えばsiRNA剤の、有効量は、例えば外科的介入と組み合わせて、例えば血管形成術と組み合わせて、その後に投与される。
いくつかの態様において、対象には、dsRNA分子の、例えばsiRNA剤（例えば前駆体、例えばsiRNA剤にプロセシングされうる、より大きなdsRNA分子、またはdsRNA分子、例えばsiRNA剤、またはその前駆体をコードするDNA）の、初回用量と、1回または複数回の維持量とが、投与される。1回または複数回の維持量は、初回量と同じである場合も、初回量より少ない場合、例えば初回量の半分である場合もある。維持レジメンは、1日あたり0.01μg～15mg/kg体重の範囲の用量、例えば1日あたり体重1kgあたり10、1、0.1、0.01、0.001または0.00001mgの用量で、対象を1回または複数回処置することを含みうる。維持量は例えば2、5、10または30日ごとに1回以下の頻度で投与される。さらに、処置レジメンはある期間にわたって続けられ、その期間は、その特定疾患の性質、その重症度および患者の全体的状態に依存して変動することになる。一定の態様において、投薬量は、1日1回以下、例えば24、36もしくは48時間またはそれ以上に1回以下、例えば5日ごとまたは8日ごとに1回以下の頻度で送達されうる。処置後に、患者を、その状態の変化について、および疾患状態の症状の改善について、監視することができる。現在の投薬量レベルに患者が有意に反応しない場合には化合物の投薬量を増加させることができ、または疾患状態の症状の改善が観察されるか、疾患状態が消失しているか、もしくは望ましくない副作用が観察された場合には、用量を減少させることができる。
有効用量は、所望に応じてまたはその具体的状況下で適宜考慮して、単回投与で投与するか、2回以上の投与で投与することができる。反復注入または頻回注入が望まれる場合は、送達デバイス、例えばポンプ、半永久ステント（例えば静脈内、腹腔内、槽内または嚢内）、またはリザーバーの埋植が得策になりうる。
いくつかの態様において、組成物は複数のdsRNA分子種を含む。別の一態様において、dsRNA分子種は、天然の標的配列に関して、別の種とはオーバーラップも隣接もしていない配列を有する。別の一態様において、複数のdsRNA分子種は、異なる天然標的遺伝子に特異的である。別の一態様において、dsRNA分子はアレル特異的である。
本明細書記載の本発明のdsRNA分子は、哺乳動物、特に大型の哺乳動物、例えば非ヒト霊長類またはヒトに、いくつかの方法で投与することができる。
いくつかの態様では、dsRNA分子、例えばsiRNA剤、組成物の投与が、非経口投与、例えば静脈内（例えばボーラスとしてまたは拡散可能な注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔粘膜、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、外用、肺、鼻腔内、尿道または眼投与である。投与は、対象が行うか、別の人物、例えば医療提供者が行うことができる。投薬は、計量された用量で、または計量された用量を送達するディスペンサーで行われうる。選ばれた送達モードを以下に詳述する。
本発明は、本明細書記載のdsRNA分子を直腸投与または直腸送達するための方法、組成物およびキットを提供する。
特定態様において、本発明は、上記の方法において使用するための本発明のdsRNA分子に関する。
標的遺伝子の発現を阻害する方法
本発明の態様は、標的遺伝子の発現を阻害するための方法にも関係する。本方法は、前記態様のいずれかのdsRNA分子を、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で投与する工程を含む。本発明はさらに、標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書において定義されるdsRNA分子の使用に関する。好ましい一態様において、本発明は、インビトロで標的細胞中の標的遺伝子の発現を阻害するためのdsRNA分子の使用に、さらに関係する。
別の一局面において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を調整する方法であって、該細胞に本発明のdsRNA分子を与える工程を含む方法に関する。いくつかの態様において、標的遺伝子は、第VII因子、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFベータ遺伝子、Erb-B遺伝子、Src遺伝子、CRK遺伝子、GRB2遺伝子、RAS遺伝子、MEKK遺伝子、JNK遺伝子、RAF遺伝子、Erk1/2遺伝子、PCNA（p21）遺伝子、MYB遺伝子、JUN遺伝子、FOS遺伝子、BCL-2遺伝子、ヘプシジン、活性化プロテインC、サイクリンD遺伝子、VEGF遺伝子、EGFR遺伝子、サイクリンA遺伝子、サイクリンE遺伝子、WNT-1遺伝子、ベータ-カテニン遺伝子、c-MET遺伝子、PKC遺伝子、NFKB遺伝子、STAT3遺伝子、サバイビン遺伝子、Her2/Neu遺伝子、トポイソメラーゼI遺伝子、トポイソメラーゼIIアルファ遺伝子、p73遺伝子中の変異、p21（WAF1/CIP1）遺伝子中の変異、p27（KIP1）遺伝子中の変異、PPM1D遺伝子中の変異、RAS遺伝子中の変異、カベオリンI遺伝子中の変異、MIB I遺伝子中の変異、MTAI遺伝子中の変異、M68遺伝子中の変異、腫瘍抑制遺伝子中の変異、およびp53腫瘍抑制遺伝子中の変異からなる群より選択される。
特定態様において、本発明は、上記の方法において使用するための本発明のdsRNA分子に関する。
さまざまな局面の例示的態様は、文字を割り当てた以下の態様によって記載することができる。
態様A:センス鎖とアンチセンスとを含むdsRNA剤であって、各鎖は独立して15～35ヌクレオチドの長さを有し、センス鎖はセンス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む、dsRNA剤。
態様B:センス鎖がセンス鎖の5'端から数えて位置11に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、態様A記載のdsRNA剤。
態様C:センス鎖がセンス鎖の5'端から数えて位置9に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、態様AまたはB記載のdsRNA剤。
態様D:センス鎖がセンス鎖の5端から数えて位置9および11に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、態様A～Cのいずれか一項記載のdsRNA。
態様E:センス鎖がセンス鎖の5端から数えて位置8および9に2'-フルオロヌクレオチドを含む、態様A～Dのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様F:センス鎖がセンス鎖の5端から数えて位置11および12に2'-フルオロヌクレオチドを含む、態様A～Eのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様G:センス鎖が少なくとも1つの2'-OMeヌクレオチドを含む、態様A～Fのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様H:アンチセンス鎖がアンチセンス鎖の5'端から数えて位置2に2'-デオキシヌクレオチドを含む、態様A～Gのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様I:アンチセンス鎖がアンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む、態様A～Hのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様J:アンチセンス鎖が少なくとも1つの2'-フルオロヌクレオチドを含む、態様A～Iのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様K:アンチセンス鎖がアンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含む、態様A～Jのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様L:dsRNA剤がリガンドを含む、態様A～Kのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様M:センス鎖がリガンドを含む、態様A～Lのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様N:リガンドがASGPRリガンドである、態様LまたはM記載のdsRNA剤。
態様O:少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、態様A～Nのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様P:センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、態様A～Oのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様Q:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含み、かつアンチセンス鎖の3'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、態様A～Pのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様R:dsRNAが、18～約25塩基対の二重鎖領域を有する、態様A～Qのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様S:センス鎖が、18～23ヌクレオチド長である、態様A～Rのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様T:アンチセンス鎖が、18～25ヌクレオチド長である、態様A～Sのいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様U:センス鎖とアンチセンス鎖とを含むdsRNA剤であって、センス鎖は、18～23ヌクレオチド長であり、センス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、センス鎖の5'端から数えて位置9または11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、18～25ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む、前記dsRNA剤。
態様V:センス鎖とアンチセンス鎖とを含むdsRNA剤であって、センス鎖は、18～23ヌクレオチド長であり、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつアンチセンスは、18～25ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置5および7に2'-デオキシヌクレオチドを含む、前記dsRNA剤。
さらなる例示的態様は、以下の番号付き態様のうちの1つまたは複数によって記載することができる。
態様1:センス鎖とアンチセンスとを含むdsRNA剤であって、各鎖は独立して15～35ヌクレオチドの長さを有し、各ヌクレオチドは独立して修飾または無修飾であり、
センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、
アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、
（i）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、または
（ii）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14または16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、
前記dsRNA剤。
態様2:センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置11に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、態様1記載のdsRNA剤。
態様3:センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置9に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、態様1または2記載のdsRNA剤。
態様4:センス鎖が、センス鎖の5端から数えて位置9および11に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、態様1～3のいずれか一項記載のdsRNA。
態様5:センス鎖が、センス鎖の5端から数えて位置8および9に2'-フルオロヌクレオチドを含む、態様1～4のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様6:センス鎖が、センス鎖の5端から数えて位置11および12に2'-フルオロヌクレオチドを含む、態様1～5のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様7:センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、態様1～6のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様8:センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、態様1～7のいずれか一項記載のdsRNA。
態様9:センス鎖が、少なくとも1つの2'-OMeヌクレオチドを含む、態様1～8のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様10:センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、態様1～9のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様11:センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、態様1～10のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様12:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、態様1～11のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様13:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて、位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、態様1～12のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様14:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置16に2'-OMeヌクレオチドを含む、態様1～13のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様15:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-OMeヌクレオチドを含む、態様1～14のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様16:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、態様1～11のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様17:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、態様1～11または16のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様18:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12および14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、態様1～11または16～17のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様19:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、態様1～18のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様20:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、態様1～19のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様21:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、態様1～20のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様22:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12、14および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、態様1～11または16～21のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様23:アンチセンス鎖が、位置2、5、7、12、14および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、態様1～11または16～22のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様24:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、態様1～15または19～20のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様25:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、態様1～15、19～20または24のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様26:リガンドを含む、態様1～25のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様27:センス鎖がリガンドを含む、態様1～26のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様28:リガンドが、センス鎖の3'端にある、態様27記載のdsRNA剤。
態様29:リガンドが、センス鎖の5'端にある、態様27記載のdsRNA剤。
態様30:リガンドがASGPRリガンドを含む、態様26～29のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様31:リガンドが親油性基である、態様26～29のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様32:リガンドがC10～30脂肪族基である、態様31記載のdsRNA剤。
態様33:C10～30脂肪族基がC10～30アルキル基である、態様32記載のdsRNA剤。
態様34:C10～30アルキル基が、直鎖または分岐テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシルまたはテトラコシル基である、態様33記載のdsRNA剤。
態様35:リガンドが、センス鎖の非末端ヌクレオチドにコンジュゲートされている、態様27記載のdsRNA剤。
態様36:リガンドが、センス鎖の非末端ヌクレオチドの2'位にコンジュゲートされ、任意で、5'端から数えてセンス鎖の位置5、6、7または8のうちの1つにコンジュゲートされている、態様35記載のdsRNA剤。
態様37:リガンドが脱塩基ヌクレオチドを含み、任意で、脱塩基ヌクレオチドが、反転ヌクレオチドであって、dsRNA剤の鎖に5'→5'連結部または3'→3'連結部を介して連結されている、態様26～36のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様38:リガンドが、センス鎖の3'端に取り付けられている、態様26～37のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様39:リガンドが、センス鎖の3'端に3'→3'連結部を介して取り付けられている、態様38記載のdsRNA剤。
態様40:dsRNAが2つのリガンドを含む、態様1～39のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様41:センス鎖が、センス鎖の3'端に取り付けられた第1リガンドと、センス鎖の5'端に取り付けられた第2リガンドとを含む、態様40記載のdsRNA。
態様42:第1リガンドが脱塩基ヌクレオチドを含み、第2リガンドがASGPRリガンドを含み、任意で、脱塩基ヌクレオチドが、反転ヌクレオチドであって、センス鎖に3'→3'連結部を介して連結されている、態様41記載のdsRNA。
態様43:少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、態様1～42のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様44:センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、態様1～43のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様45:アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含み、かつアンチセンス鎖の3'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、態様1～44のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様46:dsRNAが、18～約25塩基対の二重鎖領域を有する、態様1～45のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様47:センス鎖が、18～23ヌクレオチド長である、態様1～46のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様48:アンチセンス鎖が、18～25ヌクレオチド長である、態様1～47のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様49:センス鎖とアンチセンス鎖とを含むdsRNA剤であって、センス鎖は、18～23ヌクレオチド長であり、センス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、センス鎖の5'端から数えて位置9または11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、18～25ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、
（i）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、または
（ii）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14または16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、
前記dsRNA剤。
態様50:センス鎖とアンチセンス鎖とを含むdsRNA剤であって、センス鎖は、18～23ヌクレオチド長であり、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつアンチセンスは、18～25ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、
（i）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、または
（ii）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14または16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、
前記dsRNA剤。
態様51:アンチセンス鎖の5'端にホスフェートミミックを含む、態様1～50のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様52:ホスフェートミミックが5'-E-ビニルホスホネートである、態様51記載のdsRNA剤。
態様53:ホスフェートミミックが、構造:
Figure 2024504694000043
を有する5'-シクロプロピルホスホネートであり、式中、＊は5'末端にあるヌクレオチドのC5位への結合である、態様52記載のdsRNA剤。
態様54:センス鎖中の残りのヌクレオチド（すなわち別で規定されていない位置にあるヌクレオチド）が、無修飾ヌクレオチドであるか、または修飾ヌクレオチド、任意で、2'-OMe、2'-F、2'-Hおよび2'-O-C10～30脂肪族基からなる群より選択される修飾ヌクレオチドであり、ただし、2'-O-C10～30脂肪族基である修飾ヌクレオチドが1つ以下である、態様1～53のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様55:センス鎖中の残りのヌクレオチド（すなわち別で規定されていない位置にあるヌクレオチド）が、2'-OMe、2'-F、2'-Hおよび2'-O-C10～30脂肪族基からなる群より選択される修飾ヌクレオチドであり、ただし、2'-O-C10～30脂肪族基である修飾ヌクレオチドが1つ以下である、態様1～54のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様56:アンチセンス鎖中の残りのヌクレオチド（すなわち別で規定されていない位置にあるヌクレオチド）が、無修飾ヌクレオチドであるか、または修飾ヌクレオチド、任意で、2'-OMe、2'-F、2'-H、GNAおよび3'-RNAからなる群より選択される修飾ヌクレオチドであり、3'-RNAは任意で3'-OHであり、ただし、GNAまたは3'-RNAである修飾ヌクレオチドが1つ以下である、態様1～55のいずれか一項記載のdsRNA剤。
態様57:アンチセンス鎖中の残りのヌクレオチド（すなわち別で規定されていない位置にあるヌクレオチド）が、2'-OMe、2'-F、2'-H、GNAおよび3'-RNAからなる群より選択される修飾ヌクレオチドであり、3'-RNAは任意で3'-OHであり、ただし、GNAまたは3'-RNAである修飾ヌクレオチドが1つ以下である、態様1～56のいずれか一項記載のdsRNA剤。
定義の抜粋
本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される一定の用語を、便宜上、ここに集めておく。別段の言明がある場合または文脈上言うまでもない場合を除き、以下の用語および語句は以下に掲載する意味を包含する。明示的に別段の言明がある場合または文脈から明らかな場合を除き、以下の用語および語句は、その用語または語句が関連技術分野において獲得している意味を排除するものではない。これらの定義は、特定態様の説明を助けるために掲載するのであって、請求項に係る発明を限定しようとするものではない。本発明の範囲は請求項によってのみ限定されるからである。さらに、文脈上別段の必要がある場合を除き、単数形は複数を包含するものとし、複数形は単数を包含するものとする。
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。公知の方法、デバイスおよび材料はいずれも本発明の実施または試験に使用しうるが、これに関して、それらの方法、デバイスおよび材料を本明細書に記載する。
さらに、本発明の実施には、別段の表示がある場合を除き、当技術分野の技能の範囲内にある分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用することができる。そのような技法は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」,second edition（Sambrook et al.,1989）、「Oligonucleotide Synthesis」（M.J.Gait,ed.,1984）、「Animal Cell Culture」（R.I.Freshney,ed.,1987）、「Methods in Enzymology」（Academic Press,Inc.）、「Current Protocols in Molecular Biology」（F.M.Ausubel et al.,eds.,1987および定期更新版）、「PCR:The Polymerase Chain Reaction」,（Mullis et al.,ed.,1994）、「A Practical Guide to Molecular Cloning」（Perbal Bernard V.,1988）、「Phage Display:A Laboratory Manual」（Barbas et al.,2001）などの文献に詳述されている。
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間に介在する各値（文脈上そうでないことが明らかな場合を除きその単位の10分の1まで）と、明記されたその範囲内の他の任意の明記された値または介在する値は、本発明内に包含されると理解される。これら小範囲の上限および下限は、当該小範囲に独立して含まれてもよく、明記された範囲内で特に除外される任意の限界点を除いて、同様に本発明に包含される。明記された範囲が限界点の一方または両方を含む場合、それら含まれた限界点のどちらか一方または両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。
本明細書では、一定の範囲が、「約」という用語を前置した数値で提示される。本明細書において、「約」という用語は、それが前置されている数字そのものと、この用語が前置されている数字に近いまたはそれを近似する数字とを、字義上サポートするために使用される。数字が具体的に具陳された数字に近いまたはそれを近似する数字であるかどうかの決定において、その近いまたは近似する、具陳されていない数字は、それが提示される文脈において、具体的に具陳された数字の実質的均等物となる数字でありうる。
本明細書において使用される用語「comprising」または「comprises」（を含む）は、本発明にとって不可欠な組成物、方法およびそれらの各構成要素に関連して使用されるが、不可欠であるか否かを問わず、指定されていない要素の包含も許容される。
単数の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。同様に、「または（or）」という単語は、文脈上明らかにそうではない場合を除き、「および（and）」を包含するものとする。さらに、随意である要素はいずれも除外されるように請求項が起草されうることに注意されたい。したがって、この言明は、請求項の要素の具陳に関連して、「だけ」「のみ」などの排他的表現の使用または「消極的」限定の使用にとって、前提となる根拠として役立つものとする。
本明細書において使用される場合、「dsRNA」、「siRNA」および「iRNA剤」という用語は、標的RNA、例えばmRNA、例えばタンパク質をコードする遺伝子の転写産物のサイレンシングを媒介することができる剤を指すために、相互可換的に使用される。そのようなmRNAを、便宜上、本明細書では、サイレンシングされるmRNAともいう。そのような遺伝子は標的遺伝子とも呼ばれる。一般に、サイレンシングされるRNAは内在性遺伝子、外因性遺伝子または病原遺伝子である。加えて、mRNA以外のRNA、例えばtRNAおよびウイルスRNAも、標的になりうる。
本明細書において使用される「RNAiを媒介する」という語句は、標的遺伝子、例えばmRNAを、配列特異的にサイレンシングする能力を指す。理論に束縛されることは望まないが、サイレンシングにはRNAi機構またはRNAiプロセスとガイドRNA、例えばdsRNAのアンチセンス鎖とが使用されると考えられ、ここで、アンチセンス鎖は21～23ヌクレオチド長である。
本明細書において使用される「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」とは、安定した特異的結合が本発明と標的RNA分子との間で起こるような十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合は、特異的結合が望まれる条件下、すなわちアッセイもしくは治療的処置の場合は生理的条件下での、またはインビトロアッセイの場合はアッセイが行われる条件下での、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を避けるために、十分な程度の特異性を必要とする。非標的配列は典型的には少なくとも5ヌクレオチドが異なる。
いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は、標的RNA、例えば標的mRNAに対して、標的mRNAがコードするタンパク質の生産をdsRNA分子がサイレンシングするように、「十分に相補的」である。別の一態様において、本発明のdsRNA分子は標的RNAに対して「厳密に相補的」であり、例えば標的RNAとdsRNA二重鎖剤とがアニールすることで、例えば厳密に相補的な領域中でもっぱらワトソン-クリック塩基対でできたハイブリッドを形成する。「十分に相補的」な標的RNAは、標的RNAに厳密に相補的な内部領域（例えば少なくとも10ヌクレオチドの領域）を含むことができる。その上、いくつかの態様において、本発明のdsRNA分子は単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この場合、dsRNA分子は、単一ヌクレオチドが相違する領域（例えばその7ヌクレオチド以内）に厳密な相補性が領域に見いだされる場合にのみ、RNAiを媒介する。
「BNA」という用語は架橋型核酸を指し、拘束された（constrained）RNAまたはアクセス不能な（inaccessible）RNAと呼ばれることも多い。BNAは、「固定された」C3'-エンド型糖パッカリングを持つ5員、6員、さらには7員橋かけ構造を含有することができる。架橋は典型的にはリボースの2',4'位に組み入れられて、2',4'-BNAヌクレオチド（例えばLNAまたはENA）を与える。BNAヌクレオチドの例には以下のヌクレオシドが含まれる:
Figure 2024504694000044
。
「LNA」という用語はロックト核酸を指し、拘束されたRNAまたはアクセス不能なRNAと呼ばれることも多い。LNAは修飾RNAヌクレオチドである。LNAヌクレオチドのリボース部分は、2'ヒドロキシルを同じリボース糖の4'炭素につなぐ追加の架橋（例えばメチレン架橋またはエチレン架橋）で修飾されている。例えば、架橋はリボースを3'-エンドNorth）型立体配座:
Figure 2024504694000045
に「ロック」することができる。
「ENA」という用語はエチレン架橋型核酸（エチレン-架橋型核酸）を指し、拘束されたRNAまたはアクセス不能なRNAと呼ばれることも多い。
本明細書にいう「切断部位」とは、iRNA剤を利用することにより、RISC機構によって切断される、標的遺伝子またはセンス鎖中のバックボーン連結部を意味する。また、標的切断部位領域は、切断部位の両側に少なくとも1つまたは少なくとも2つのヌクレオチドを含む。センス鎖の場合、センス鎖自体がRNAi機序によって切断される標的であるなら、切断部位は、センス鎖中の切断されるバックボーン連結部である。切断部位は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるSoutschek et al.,Nature（2004）432,173-178に記載の5'-RACEアッセイなど、当技術分野において公知の方法を使って決定することができる。当技術分野ではよく理解されているとおり、2本の21ヌクレオチド長鎖を含むコニカル（conical）二本鎖RNAi剤（ここでは鎖が、3'端に2ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する19連続塩基対の二本鎖領域を形成する）の場合、切断部位領域はセンス鎖の5'端から位置9～12に相当する。
「減少する」、「低減する」、「低減」または「阻害する」という用語は、いずれも本明細書では、統計的に有意な量の減少を表すために使用される。いくつかの態様において、「低減する」、「低減」または「減少する」または「阻害する」は、典型的には、基準レベル（例えば所与の処置の非存在下）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％またはそれ以上の減少を含みうる。本明細書において使用される「低減」または「阻害」は、基準レベルと比較して完全な阻害または完全な低減を包含しない。「完全な阻害」とはリファレンスレベルと比較して100％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を持たない個体にとって正常範囲内として許容されるレベルまで下がりうる。
本明細書にいう鎖の「中央領域」とは、鎖の5'端から数えて位置5～17、例えば位置6～16、位置6～15、位置6～14、位置6～13、位置6～12、位置7～15、位置7～14、位置7～13、位置7～12、位置8～16、位置8～15、位置8～14、位置8～13、位置8～12、位置9～16、位置9～15、位置9～14、位置9～13、位置9～12、位置10～16、位置10～15、位置10～14、位置10～13または位置10～12を指す。例えば、鎖の中央領域とは、鎖の位置5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16または17を意味する。センス鎖の好ましい中央領域は、センス鎖の5'端から数えて位置6、7、8、9、10、11、12、13および14である。センス鎖の、より好ましい中央領域は、センス鎖の5'端から数えて位置7、8、9、10、11、12および13である。アンチセンス鎖の好ましい中央領域は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置9、10、11、12、13、14、15 16および17である。アンチセンス鎖の、より好ましい中央領域は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置10、11、12、13、14、15および16である。
この開示を読んだ当業者には明らかであるだろうが、本明細書に記載し例示した個々の局面のそれぞれが、別々の構成要素および特徴を有すること、そしてそれらは、本発明の範囲または要旨から逸脱することなく、他のいくつかの局面のいずれかの特徴から分離することまたはそれらの特徴と組み合わせることがすぐにできる。具陳した方法はいずれも、具陳した順序で実行することも、論理的に可能な他の任意の順序で実行することもできる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに例示するが、これらの実施例をさらなる限定と解釈してはならない。本願の全体を通して引用されるすべての参考文献、継続中の特許出願および公開された特許の内容は、参照により、ここに明確に、本明細書に組み入れられる。
オリゴヌクレオチドの合成と精製
オリゴヌクレオチドはすべて、MerMade 192シンセサイザーにより、ユニバーサル担体またはカスタム担体を使って、1μmoleスケールで調製した。ホスホラミダイトはすべて、100％アセトニトリル中、または9:1アセトニトリル:DMF中、濃度100mMにおいて、2-シアノエチルホスホラミダイトのための標準プロトコールで、ただしカップリング時間を400秒に延ばして、使用した。新しく形成された連結部の酸化は、ホスフェート連結部の作出には9:1アセトニトリル:水中の50mM I2の溶液を、またホスホロチオエート連結部の作出には9:1ピリジン:アセトニトリル中の100mM DDTTの溶液を使って達成した。トリチル-オフ合成後に、カラムを150μLの40％メチルアミン水溶液と共に45分間インキュベートし、溶液を減圧によって96ウェルプレート中に排出させた。新しいメチルアミン水溶液を使ったインキュベーションと排液を繰り返した後、粗オリゴヌクレオチド溶液を含有するプレートを密封し、すべての保護基を完全に除去するために、さらに60分間、室温で振とうした。粗オリゴヌクレオチドの沈殿は、1.2mLの9:1アセトニトリル:EtOHを各ウェルに加え、続いて-20℃で一晩インキュベートすることによって達成した。次にプレートを3000RPMで45分間遠心分離し、上清を各ウェルから取り除き、ペレットを950μLの20mM NaOAc水溶液に再懸濁した。最後に、各粗溶液をGE Hi-Trap脱塩カラム（Sephadex G25スーパーファイン）で脱塩し、水を使って最終オリゴヌクレオチド産物を溶出させた。すべての実体と純度をそれぞれESI-MSおよびIEX HPLCで確認した。
細胞培養およびトランスフェクション
初代マウスまたはカニクイザル肝細胞（Thermo Fisher Scientific/Gibco）のトランスフェクションは、384ウェルプレートにおいて、各ウェル4.9μLのOpti-MEM＋0.1μLのLipofectamine RNAiMax（Invitrogen、カタログ番号13778-150）を、各ウェル5μLのsiRNA二重鎖に加えることによって行い、室温で15分間インキュベートした。次に、約5×103細胞を含有する40μLのダルベッコ変法イーグル培地（PCH）またはウィリアム培地（PMH）を、siRNA混合物に加えた。細胞を37℃で24時間インキュベートしてから、RNA精製用に処理した。実験は、10nM、1nMおよび0.1nMのsiRNA用量で行った。
親dsRNA分子を表1～3に示す。配列中に使用される略号を表4に要約する。
（表１）親dsRNA分子の配列
Figure 2024504694000046
（表２）親dsRNA分子のさらなる例示的配列
Figure 2024504694000047
Figure 2024504694000048
Figure 2024504694000049
Figure 2024504694000050
Figure 2024504694000051
（表３）親dsRNA分子のさらなる例示的配列
Figure 2024504694000052
Figure 2024504694000053
Figure 2024504694000054
Figure 2024504694000055
Figure 2024504694000056
Figure 2024504694000057
Figure 2024504694000058
Figure 2024504694000059
Figure 2024504694000060
（表４）核酸配列の説明において使用されるヌクレオチドモノマーの略号＊
Figure 2024504694000061
Figure 2024504694000062
＊オリゴヌクレオチド中に存在する場合、これらのモノマーは5'-3'ホスホジエステル結合によって互いに連結されていることは理解されるだろう。また、ヌクレオチドが2'フルオロ修飾を含有する場合、そのフルオロは親ヌクレオチドのその位置にあるヒドロキシを置き換える（すなわち2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチドである）と理解される。
本開示の態様によるいくつかの例示的dsRNA分子デザインを図5Aおよび図5Bに模式的に示す。本開示のいくつかの態様による例示的dsRNA分子を表5および表6に列挙する。
（表５）本開示のいくつかの実施形態による例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000063
Figure 2024504694000064
Figure 2024504694000065
Figure 2024504694000066
（表６）本開示のいくつかの態様によるさらなる例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000067
Figure 2024504694000068
Figure 2024504694000069
Figure 2024504694000070
Figure 2024504694000071
Figure 2024504694000072
Figure 2024504694000073
Figure 2024504694000074
Figure 2024504694000075
いくつかの態様において、dsRNA分子は表7に列挙するdsRNA分子ではない。
（表７）さらなるdsRNA分子
Figure 2024504694000076
DYNABEADS mRNA単離キット（Invitrogen（商標）、パーツ番号610-12）を使った全RNAの単離
細胞を、各ウェル3uLのビーズを含有する75μLの溶解/結合緩衝液中で溶解し、静電シェーカー（electrostatic shaker）上で10分間混合した。洗浄工程は、磁気プレートサポートを使って、Biotek EL406で自動化した。ビーズを、間に吸引工程を挟んで、緩衝液A中で1回、緩衝液B中で1回、そして緩衝液E中で2回、洗浄した（90μL中）。最後の吸引に続いて、以下に述べるように、完全10μLRT混合物（complete 10μL RT mixture）を各ウェルに加えた。
ABI High capacity cDNA逆転写キット（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ、カタログ番号4368813）を使ったcDNA合成
1反応につき1uL 10×緩衝液、0.4μL 25×dNTP、1μLランダムプライマー、0.5μL逆転写酵素、0.5μL RNase阻害剤および6.6μL H2Oのマスターミックスを、各ウェルに加えた。プレートを密封し、静電シェーカーで10分間撹拌してから、37℃で2時間インキュベートした。それに続いて、プレートを80℃で8分間撹拌した。
リアルタイムPCR
384ウェルプレートの1ウェルにつき0.5μLのヒトGAPDH TaqManプローブ（4326317E）、0.5μLヒトAGT（Hs00174854m1）、2μLヌクレアーゼフリー水および5μL Lightcycler 480プローブマスターミックス（Rocheカタログ番号04887301001）を含有するマスターミックスに、2μLのcDNAを加えた（Rocheカタログ番号04887301001）。リアルタイムPCRはLightCycler480リアルタイムPCRシステム（Roche）で行った。
相対倍率変化を計算するために、ΔΔCt法を使ってデータを解析し、10nM AD-1955をトランスフェクトした細胞またはモックトランスフェクト細胞で行ったアッセイに対して正規化した。
結果を図1A～1Bおよび図3A～4Cに示し、表8～14に要約する。これらの結果は、いくつかの例示的デザインにおける、ならびに例示的配列、標的および細胞株の大きなセットにおける、親デザインと比較して一貫して改良されたインビトロ活性を示している。
（表８）初代マウス肝細胞におけるさまざまなデザインのインビトロ活性
Figure 2024504694000077
Figure 2024504694000078
（表９）初代マウス肝細胞におけるさまざまなデザインのインビトロ活性
Figure 2024504694000079
Figure 2024504694000080
（表１０）初代マウス肝細胞におけるさまざまなデザインのインビトロ活性
Figure 2024504694000081
（表１１）初代マウス肝細胞におけるさまざまなデザインのインビトロ活性
Figure 2024504694000082
（表１２）初代カニクイザル肝細胞におけるさまざまなデザインのインビトロ活性
Figure 2024504694000083
（表１３）Hep3Bにおけるさまざまなデザインのインビトロ活性
Figure 2024504694000084
Figure 2024504694000085
Figure 2024504694000086
Figure 2024504694000087
Figure 2024504694000088
Figure 2024504694000089
（表１４）Hep3BにおけるAgtを標的とするさまざまなデザインのインビトロ活性
Figure 2024504694000090
Figure 2024504694000091
Figure 2024504694000092
Figure 2024504694000093
Figure 2024504694000094
Figure 2024504694000095
Figure 2024504694000096
Figure 2024504694000097
マウスおよびカニクイザルでのインビボ試験
試験はすべて、適宜、Alnylam Pharmaceuticalsの施設内動物実験委員会（IACUCs）によって承認された、地域、州および連邦の規制と合致するプロトコールを使って行われた。
マウス薬力学試験では、雌C57BL/6マウス（Charles River Laboratories）に、媒体対照（1×PBSまたは0.9％塩化ナトリウム）またはsiRNAの単回用量を、上背部に皮下投与した。後眼窩採血によって血液を収集した。室温において10分間、13000rpmで、血清を分離した。マウスの肝臓を収集し、直ちに液体窒素中で急速凍結し、mRNA分析およびsiRNA分析のために、-80℃で保存した。
図2A～2Dおよび図10A～10Dに示すように、これらの結果は、マウスにおける改良されたまたは類似する標的ノックダウンと、カニクイザルにおける改良されたまたは類似する標的ノックダウンおよびサイレンシングの持続時間を実証している。
血清タンパク質定量
TTRタンパク質は、全血から単離された血清から、ELISAによって定量した。ELISAは、血清試料の3025倍希釈後に、製造者のプロトコール（ALPCO、41-PALMS-E01）に従って実施した。データを前採血（pre-bleed）TTRレベルに正規化した。すべての試料を二重にアッセイした。各データ点は、各コホート（n＝3）内のすべてのマウスの平均である。
いくつかの態様において、dsRNA分子は、表15～25のいずれか1つに列挙するdsRNA分子ではない。
（表１５）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000098
（表１６）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000099
Figure 2024504694000100
Figure 2024504694000101
Figure 2024504694000102
Figure 2024504694000103
（表１７）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000104
Figure 2024504694000105
Figure 2024504694000106
Figure 2024504694000107
（表１８）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000108
（表１９）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000109
Figure 2024504694000110
Figure 2024504694000111
（表２０）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000112
（表２１）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000113
Figure 2024504694000114
（表２２）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000115
Figure 2024504694000116
Figure 2024504694000117
Figure 2024504694000118
（表２３）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000119
（表２４）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000120
（表２５）例示的dsRNA分子
Figure 2024504694000121
本明細書において言及される米国特許、米国特許出願公開、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物はすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。態様の諸局面は、必要に応じてさまざまな特許、出願および刊行物の思想を利用するように変更することで、さらなる態様を得ることができる。
これらの変更および他の変更は、上記の詳細な説明に照らして、本態様に加えることができる。一般に、添付の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示された具体的態様に限定するように解釈されるのではなく、それら特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲に沿って、考えうるすべての態様を包含するように解釈されるべきである。したがって請求項が本開示によって限定されることはない。

Claims (57)

  1. センス鎖とアンチセンスとを含むdsRNA剤であって、各鎖は独立して15～35ヌクレオチドの長さを有し、各ヌクレオチドは独立して修飾または無修飾であり、
    センス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、
    アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、
    （i）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、または
    （ii）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14または16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、
    前記dsRNA剤。
  2. センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置11に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、請求項1記載のdsRNA剤。
  3. センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置9に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、請求項1または2記載のdsRNA剤。
  4. センス鎖が、センス鎖の5端から数えて位置9および11に2'-フルオロヌクレオチドをさらに含む、請求項1～3のいずれか一項記載のdsRNA。
  5. センス鎖が、センス鎖の5端から数えて位置8および9に2'-フルオロヌクレオチドを含む、請求項1～4のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  6. センス鎖が、センス鎖の5端から数えて位置11および12に2'-フルオロヌクレオチドを含む、請求項1～5のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  7. センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、請求項1～6のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  8. センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、請求項1～7のいずれか一項記載のdsRNA。
  9. センス鎖が、少なくとも1つの2'-OMeヌクレオチドを含む、請求項1～8のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  10. センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、請求項1～9のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  11. センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、請求項1～10のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  12. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、請求項1～11のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  13. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて、位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、請求項1～12のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  14. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置16に2'-OMeヌクレオチドを含む、請求項1～13のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  15. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-OMeヌクレオチドを含む、請求項1～14のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  16. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、請求項1～11のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  17. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、請求項1～11または16のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  18. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12および14に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、請求項1～11または16～17のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  19. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、請求項1～18のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  20. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、請求項1～19のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  21. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、請求項1～20のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  22. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12、14および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、請求項1～11または16～21のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  23. アンチセンス鎖が、位置2、5、7、12、14および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、請求項1～11または16～22のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  24. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロ以外のヌクレオチドを含む、請求項1～15または19～20のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  25. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えてアンチセンス鎖の位置2、5、7、12および16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、位置14に2'-フルオロを含み、かつセンス鎖が、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-OMeヌクレオチドを含む、請求項1～15、19～20または24のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  26. リガンドを含む、請求項1～25のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  27. センス鎖がリガンドを含む、請求項1～26のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  28. リガンドが、センス鎖の3'端にある、請求項27記載のdsRNA剤。
  29. リガンドが、センス鎖の5'端にある、請求項27記載のdsRNA剤。
  30. リガンドがASGPRリガンドを含む、請求項26～29のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  31. リガンドが親油性基である、請求項26～29のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  32. リガンドがC10～30脂肪族基である、請求項31記載のdsRNA剤。
  33. C10～30脂肪族基がC10～30アルキル基である、請求項32記載のdsRNA剤。
  34. C10～30アルキル基が、直鎖または分岐テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシルまたはテトラコシル基である、請求項33記載のdsRNA剤。
  35. リガンドが、センス鎖の非末端ヌクレオチドにコンジュゲートされている、請求項27記載のdsRNA剤。
  36. リガンドが、センス鎖の非末端ヌクレオチドの2'位にコンジュゲートされ、任意で、5'端から数えてセンス鎖の位置5、6、7または8のうちの1つにコンジュゲートされている、請求項35記載のdsRNA剤。
  37. リガンドが脱塩基ヌクレオチドを含み、任意で、脱塩基ヌクレオチドが、反転ヌクレオチドであって、dsRNA剤の鎖に5'→5'連結部または3'→3'連結部を介して連結されている、請求項26～36のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  38. リガンドが、センス鎖の3'端に取り付けられている、請求項26～37のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  39. リガンドが、センス鎖の3'端に3'→3'連結部を介して取り付けられている、請求項38記載のdsRNA剤。
  40. dsRNAが2つのリガンドを含む、請求項1～39のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  41. センス鎖が、センス鎖の3'端に取り付けられた第1リガンドと、センス鎖の5'端に取り付けられた第2リガンドとを含む、請求項40記載のdsRNA。
  42. 第1リガンドが脱塩基ヌクレオチドを含み、第2リガンドがASGPRリガンドを含み、任意で、脱塩基ヌクレオチドが、反転ヌクレオチドであって、センス鎖に3'→3'連結部を介して連結されている、請求項41記載のdsRNA。
  43. 少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、請求項1～42のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  44. センス鎖が、センス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、請求項1～43のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  45. アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖の5'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含み、かつアンチセンス鎖の3'端から数えて最初の5ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結部を含む、請求項1～44のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  46. dsRNAが、18～約25塩基対の二重鎖領域を有する、請求項1～45のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  47. センス鎖が、18～23ヌクレオチド長である、請求項1～46のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  48. アンチセンス鎖が、18～25ヌクレオチド長である、請求項1～47のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  49. センス鎖とアンチセンス鎖とを含むdsRNA剤であって、センス鎖は、18～23ヌクレオチド長であり、センス鎖の5'端から数えて位置10に2'-フルオロヌクレオチドを含み、センス鎖の5'端から数えて位置9または11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、18～25ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、
    （i）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、または
    （ii）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14または16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、
    前記dsRNA剤。
  50. センス鎖とアンチセンス鎖とを含むdsRNA剤であって、センス鎖は、18～23ヌクレオチド長であり、センス鎖の5'端から数えて位置9、10および11に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつアンチセンスは、18～25ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置2、5、7および12に2'-デオキシヌクレオチドを含み、
    （i）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14に2'-フルオロヌクレオチドを含み、かつ位置16に2'-デオキシまたは2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、または
    （ii）アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'端から数えて位置14または16に2'-デオキシヌクレオチドを含み、かつセンス鎖は、センス鎖の5'端から数えて位置7に2'-フルオロヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、
    前記dsRNA剤。
  51. アンチセンス鎖の5'端にホスフェートミミックを含む、請求項1～50のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  52. ホスフェートミミックが5'-E-ビニルホスホネートである、請求項51記載のdsRNA剤。
  53. ホスフェートミミックが、構造:
    Figure 2024504694000122
    を有する5'-シクロプロピルホスホネートであり、式中、＊は5'末端にあるヌクレオチドのC5位への結合である、請求項52記載のdsRNA剤。
  54. センス鎖中の残りのヌクレオチド（すなわち別で規定されていない位置にあるヌクレオチド）が、無修飾ヌクレオチドであるか、または修飾ヌクレオチド、任意で、2'-OMe、2'-F、2'-Hおよび2'-O-C10～30脂肪族基からなる群より選択される修飾ヌクレオチドであり、ただし、2'-O-C10～30脂肪族基である修飾ヌクレオチドが1つ以下である、請求項1～53のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  55. センス鎖中の残りのヌクレオチド（すなわち別で規定されていない位置にあるヌクレオチド）が、2'-OMe、2'-F、2'-Hおよび2'-O-C10～30脂肪族基からなる群より選択される修飾ヌクレオチドであり、ただし、2'-O-C10～30脂肪族基である修飾ヌクレオチドが1つ以下である、請求項1～54のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  56. アンチセンス鎖中の残りのヌクレオチド（すなわち別で規定されていない位置にあるヌクレオチド）が、無修飾ヌクレオチドであるか、または修飾ヌクレオチド、任意で、2'-OMe、2'-F、2'-H、GNAおよび3'-RNAからなる群より選択される修飾ヌクレオチドであり、3'-RNAは任意で3'-OHであり、ただし、GNAまたは3'-RNAである修飾ヌクレオチドが1つ以下である、請求項1～55のいずれか一項記載のdsRNA剤。
  57. アンチセンス鎖中の残りのヌクレオチド（すなわち別で規定されていない位置にあるヌクレオチド）が、2'-OMe、2'-F、2'-H、GNAおよび3'-RNAからなる群より選択される修飾ヌクレオチドであり、3'-RNAは任意で3'-OHであり、ただし、GNAまたは3'-RNAである修飾ヌクレオチドが1つ以下である、請求項1～56のいずれか一項記載のdsRNA剤。
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