JP7065786B2 - 肝病態を治療又は予防する方法 - Google Patents

Description

関連出願データ
本願は、２０１６年４月２１日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｌｉｖｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」という名称のオーストラリア国特許出願公開第２０１６９０１４９４号明細書及び２０１６年４月２１日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｌｉｖｅｒ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」という名称のオーストラリア国特許出願公開第２０１６９０１４８３号明細書からの優先権を主張する。これらの内容全体が参照により本明細書に援用される。

配列表
本願は、電子形式の配列表と共に提出される。配列表の内容全体が参照により本明細書に援用される。

本願は、肝病態を治療又は予防する方法に関する。

工業先進国の成人及び小児では、主に不健康な食習慣及び肥満を原因として、肝臓への脂肪蓄積を特徴とする疾患が一層蔓延しつつある。慢性的な過度のアルコール摂取により生じるアルコール性脂肪性肝疾患（ＡＦＬＤ）は、基本的には、脂肪症、脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、炎症、肝硬変及び場合により肝細胞癌を伴う病理学的経過をたどる。最も一般的な肝疾患と考えられる非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、肝脂肪症（肝臓への脂肪蓄積）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変から肝細胞癌まで及ぶ様々な重症度の、ＡＦＬＤと類似した一連の肝臓病変を包含する用語である。

推定で米国人の３０％がＮＡＦＬＤを発症している。この有病率は、肥満患者及び２型糖尿病罹患者で６０％超まで増加する。ＮＡＦＬＤは、肝脂肪症からＮＡＳＨへと徐々に悪化し、ＮＡＳＨは、肝細胞傷害、炎症細胞浸潤及び／又は線維化から明らかなとおりの肝傷害の発生によって特徴付けられる。ＮＡＳＨは、次に肝硬変へと進行することもあり、肝硬変は、肝細胞の瘢痕組織への置換、及び病期が進むと肝細胞癌と関連付けられる。ＮＡＦＬＤは、肝硬変及び肝不全に共通する重要な原因であると認識されている。ＮＡＦＬＤは、心血管疾患リスクの増加とも関連付けられる。ＮＡＦＬＤは、メタボリックシンドロームの一部と見なされる。メタボリックシンドロームの患者と同様に、ＮＡＦＬＤ患者の８０％超が過体重であり、約３０％が肥満である。更に、ＮＡＦＬＤ患者は、多くの場合に高脂血症、２型真性糖尿病（Ｔ２ＤＭ）も併発し、高血圧である。

現在、ＮＡＦＬＤに対する有効な治療はなく、多くの治療は、肥満、真性糖尿病及び高脂血症などの関連病態の管理に依存する。他のＮＡＦＬＤ療法は、運動及び食事など、生活習慣を主な標的とする。体重減少及びインスリン抵抗性を標的とすることを目的とした薬理学的介入は有効性が限られている。例えば、メトホルミン及びスタチン類の研究は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨ患者の肝組織学的な改善に効果がないことを示している。

本発明を作り出す上で、本発明者らは、一般に認められているＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨモデルにおいてＶＥＧＦ－Ｂの阻害効果を研究した。本発明者らは、高脂肪食を与えるか、又はコリン欠乏高脂肪食を与えたノックアウトマウスにおいてＶＥＧＦ－Ｂの発現の阻害効果を研究し、従ってこのタンパク質を阻害することの予防効果を実証した。本発明者らはまた、高脂肪食又はコリン欠乏高脂肪食のいずれかを与えたマウスにアンタゴニスト抗体を投与して、このタンパク質を阻害することの治療効果を研究した。いずれの場合にも、ＶＥＧＦ－Ｂの阻害は、肝脂質蓄積を低減するか又は防ぎ、全ての手法が脂質レベルを対照動物と同程度まで低減するか又は維持した。従って、ＶＥＧＦ－Ｂの阻害は、脂質蓄積を潜在的に有害となるほど低いレベルまで低減するのではなく、むしろ正常又は健常レベルに低減する。ＶＥＧＦ－Ｂの阻害は、肝炎症、並びにＮＡＳＨの主要病変の１つである肝細胞風船化、マロリー・デンク体（ＭＤＢ）の形成、炎症性病巣及び衛星病変を含めたＮＡＳＨの幾つかの特徴も低減又は予防した。従って、本発明者らは、ＮＡＦＬＤを予防又は治療し得ると共に、ＮＡＳＨの発症を予防するか又はそれを治療し得ることを示している。明らかに、かかる方法は、肝硬変、肝線維化及び／又は肝細胞癌の予防に更なる有益性を有する。

本発明者らによる知見は、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害することによって対象のＮＡＦＬＤ又はその合併症を治療又は予防する方法の基礎を提供する。例えば、本開示は、対象のＮＡＦＬＤ又はその合併症を治療又は予防する方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。

一例において、ＮＡＦＬＤは、肝脂肪症、例えば単独肝脂肪症である。

一例において、ＮＡＦＬＤは、ＮＡＳＨである。

一例において、ＮＡＦＬＤは、肝硬変である。

一例において、ＮＡＦＬＤは、ＮＡＳＨ由来肝硬変である。

別の例において、ＮＡＦＬＤは、ＮＡＳＨ関連肝硬変である。

別の例において、ＮＡＦＬＤは、ＮＡＳＨ関連肝線維化である。

一例において、本開示は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象の肝硬変の発病を予防するか又は遅延させる方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。

例えば、対象は、ＮＡＳＨに罹患しており、及び本方法は、肝硬変の発病を予防するか又は遅延させる。

一例において、本開示は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象の肝硬変の進行を遅延させる方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。

一例において、本開示は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象のＮＡＦＬＤから肝硬変への進行を遅延させる方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。

一例において、ＮＡＦＬＤの合併症は、肝細胞癌である。

一例において、肝細胞癌は、ＮＡＳＨ由来肝細胞癌である。

別の例において、肝細胞癌は、ＮＡＳＨ関連肝細胞癌である。

一例において、本開示は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象の肝細胞癌の発病を予防するか又は遅延させる方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。

例えば、対象は、ＮＡＳＨに罹患しており、及び本方法は、肝細胞癌の発病を予防するか又は遅延させる。

一例において、本開示は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象の肝細胞癌の進行を遅延させる方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。

一例において、本開示は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象のＮＡＦＬＤから肝細胞癌への進行を遅延させる方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。

一例において、対象は、ＮＡＦＬＤに罹患しており、及び本方法は、前記疾患を治療する。例えば、対象は、肝脂肪症に罹患している。例えば、対象は、ＮＡＳＨに罹患している。

一例において、ＮＡＦＬＤに罹患している対象は、更に過体重若しくは肥満であり、及び／又は糖尿病、例えば２型糖尿病に罹患しており、及び／又はメタボリックシンドロームに罹患している。

一例において、本開示は、過体重又は肥満の対象のＮＡＦＬＤ又はその合併症を治療又は予防する方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。

一例において、化合物を投与することは、対象の体重を投与前の対象の体重と比較して実質的に又は有意に低減しない。

一例において、対象は、ＮＡＦＬＤ（例えば、上記に記載したとおりの）に罹患しており、及び本方法は、その疾患を予防するか又は遅延させる。例えば、対象は、脂肪症に罹患しており、及び本方法は、ＮＡＳＨへの進行を遅延させるか又は予防する。別の例において、対象は、ＮＡＳＨに罹患しており、及び本方法は、肝硬変への進行を遅延させるか又は予防する。

一例において、対象は、ＮＡＦＬＤ（例えば、上記に記載したとおりの）に罹患しており、及び本方法は、ＮＡＦＬＤの合併症の発症リスクを予防又は低減する。例えば、対象は、ＮＡＦＬＤに罹患しており、及び本方法は、肝細胞癌の発症を予防するか又はそのリスクを低減する。

一例において、ＮＡＦＬＤに罹患している対象は、肝酵素、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）の血清値の上昇、肝臓超音波検査又は肝生検の１つ以上に基づいて診断される。

一例において、対象は、ＮＡＦＬＤを発症するリスクがあり、例えばＮＡＦＬＤの共存症に罹患している。例えば、対象は、肥満であり、及び／又は糖尿病、例えば２型糖尿病に罹患しており、及び／又はメタボリックシンドロームに罹患している。

一例において、化合物は、以下の効果：
・例えば、肝生検で評価されるとおりの、対象の肝臓への脂質、例えば中性脂質の蓄積を低減又は予防すること、
・例えば、対象の肝臓内の免疫細胞数を低減することにより、対象の肝臓における炎症を低減又は予防すること、
・対象の肝臓におけるマロリー・デンク体、又は肝細胞風船化、又は炎症性病巣、又は衛星病変などのＮＡＦＬＤの病理学的変化の発生を低減又は予防すること、
・肝線維化及び／又は肝硬変の発症を低減又は予防すること、
・肝細胞癌の発症を低減又は予防すること
の１つ以上を有するのに有効な量で投与される。

一例において、本開示は、ＮＡＦＬＤに罹患している（例えば、ＮＡＳＨに罹患している）対象の肝臓における脂質、例えば中性脂質レベルを低減する方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。一例において、脂質レベルは、化合物の投与前の対象におけるレベルと比較して、又はＮＡＦＬＤに罹患している対象集団で観察されるレベルと比較して低減される。別の例において、脂質レベルは、ＮＡＦＬＤに罹患していない対象又はＮＡＦＬＤに罹患していない対象集団と同程度（例えば、その１０％）又は同じレベルまで低減される。

本開示は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象の肝臓における炎症を低減する方法であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む方法も提供する。

一例において、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を特異的に阻害する。これは、本開示の方法が複数のＶＥＧＦタンパク質のシグナル伝達の阻害を包含しないことを意味するわけではなく、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物（又はその一部）がＶＥＧＦ－Ｂに特異的であり、例えばＶＥＧＦタンパク質の全般的阻害薬ではないことを意味するに過ぎない。この用語は、例えば、１つ（以上）の結合ドメインによってＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を特異的に阻害することができ、且つ別の結合ドメインによって別のタンパク質のシグナル伝達を特異的に阻害することができる二重特異性抗体又はその結合ドメインを含むタンパク質も除外しない。

一例において、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、ＶＥＧＦ－Ｂに結合する。例えば、化合物は、ＶＥＧＦ－Ｂに結合又は特異的に結合し、且つＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を中和する抗体可変領域を含むタンパク質である。

一例において、化合物は、抗体模倣体である。例えば、化合物は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含むタンパク質、例えばＩｇＮＡＲ、ラクダ科動物抗体又はＴ細胞受容体である。

一例において、化合物は、ドメイン抗体（例えば、ＶＥＧＦ－Ｂに結合する重鎖可変領域のみ若しくは軽鎖可変領域のみを含む）又は重鎖単独抗体（例えば、ラクダ科動物抗体若しくはＩｇＮＡＲ）或いはその可変領域である。

一例において、化合物は、Ｆｖを含むタンパク質である。例えば、タンパク質は、
（ｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ－ｓｃＦｖ）、又は
（ｉｖ）ダイアボディ、
（ｖ）トリアボディ、
（ｖｉ）テトラボディ、
（ｖｉｉ）Ｆａｂ、
（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）₂、
（ｉｘ）Ｆｖ、或いは
（ｘ）抗体の定常領域、Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（Ｃ_H）２及び／若しくはＣ_H３に連結された（ｉ）～（ｉｘ）の１つ
からなる群から選択される。

別の例において、化合物は、抗体である。例示的抗体は、完全長及び／又はネイキッド抗体である。

一例において、化合物は、組換え、キメラ、ＣＤＲグラフト、ヒト化、シンヒューマナイズド（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、霊長類化、脱免疫化又はヒトであるタンパク質である。

一例において、化合物は、抗体２Ｈ１０のＶＥＧＦ－Ｂへの結合を競合的に阻害する抗体可変領域を含むタンパク質である。一例において、タンパク質は、配列番号３に示される配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_H）及び配列番号４に示される配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む。

一例において、化合物は、抗体２Ｈ１０のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、タンパク質は、抗体２Ｈ１０のＶ_H及び／又はＶ_Lの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む。例えば、このタンパク質は、
（ｉ）Ｖ_Hであって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸２５～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸４９～６５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号３のアミノ酸９８～１０８に示される配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_H、及び／又は
（ｉｉ）Ｖ_Lであって、
（ａ）配列番号４のアミノ酸２３～３３に示される配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸４９～５５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号４のアミノ酸８８～９６に示される配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_L
を含む。

一例において、化合物は、Ｖ_H及びＶ_Lを含むタンパク質であり、Ｖ_H及びＶ_Lは、抗体２Ｈ１０のヒト化可変領域である。例えば、このタンパク質は、
（ｉ）Ｖ_Hであって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸２５～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸４９～６５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号３のアミノ酸９８～１０８に示される配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_H、及び
（ｉｉ）Ｖ_Lであって、
（ａ）配列番号４のアミノ酸２３～３３に示される配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸４９～５５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号４のアミノ酸８８～９６に示される配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_L
を含む。

一例において、前述の任意の段落における可変領域又はＶ_Hは、配列番号５に示される配列を含む。

一例において、前述の任意の段落における可変領域又はＶ_Lは、配列番号６に示される配列を含む。

一例において、化合物は、抗体である。

一例において、化合物は、配列番号５に示される配列を含むＶ_Hと、配列番号６に示される配列を含むＶ_Lとを含む抗体である。

一例において、タンパク質又は抗体は、前述のタンパク質又は抗体のいずれかをコードする核酸によってコードされる任意の形態のタンパク質又は抗体である。

一例において、タンパク質又は抗体は、
（ｉ）Ｖ_Hであって、
（ａ）配列番号１１を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１２を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号１３を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_H、及び／又は
（ｉｉ）Ｖ_Lであって、
（ａ）配列番号１４を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１５を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号１６を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_L
を含む。

一例において、タンパク質又は抗体は、
（ｉ）Ｖ_Hであって、
（ａ）配列番号２３を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号２５を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_H、及び／又は
（ｉｉ）Ｖ_Lであって、
（ａ）配列番号２６を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２７を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号２８を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_L
を含む。

一例において、タンパク質又は抗体は、
（ｉ）Ｖ_Hであって、
（ａ）配列番号３５を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３６を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号３７を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_H、及び／又は
（ｉｉ）Ｖ_Lであって、
（ａ）配列番号３８を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３９を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号４０を含む核酸によってコードされる配列を含む又は配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_L
を含む。

一例において、化合物は、組成物中にある。例えば、組成物は、抗体可変領域又はＶ_H若しくはＶ_Lを含むタンパク質、或いは本明細書に記載されるとおりの抗体を含む。一例において、組成物は、タンパク質又は抗体の１つ以上の変異体を更に含む。例えば、それは、コードされたＣ末端リジン残基が欠損している変異体、脱アミド化変異体、及び／又はグリコシル化変異体、及び／又はピログルタミン酸を例えばタンパク質のＮ末端に含む変異体、及び／又は抗体若しくはＶ領域においてＮ末端残基、例えばＮ末端グルタミンを欠く変異体、及び／又は分泌シグナルの全て若しくは一部を含む変異体を含む。コードされたアスパラギン残基の脱アミド化変異体は、イソアスパラギン酸及びアスパラギン酸アイソフォームが生成されることになり、又は更に隣接アミノ酸残基を含むスクシンアミドも生じ得る。コードされたグルタミン残基の脱アミド化変異体は、グルタミン酸を生じ得る。特定のアミノ酸配列が参照されるとき、かかる配列及び変異体の不均一混合物を含む組成物が包含されることが意図される。

一例において、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、ＶＥＧＦ－Ｂの発現を阻害又は防止する。例えば、化合物は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム及びＤＮＡザイムの群から選択される。

一例において、ＶＥＧＦ－Ｂは、哺乳類ＶＥＧＦ－Ｂ、例えばヒトＶＥＧＦ－Ｂである。

一例において、対象は、哺乳類、例えばヒトなどの霊長類である。

本明細書に記載される治療方法は、更なる化合物を投与してＮＡＦＬＤを治療又は予防することを更に含み得る。

本明細書に記載されるＮＡＦＬＤの治療方法は、更なる化合物を投与して肥満を治療又は予防すること（又はその進行を遅延させること）を更に含み得る。例示的化合物は、本明細書に記載される。

本開示は、ＮＡＦＬＤ又はその合併症の治療又は予防に用いられる、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物も提供する。

本開示は、ＮＡＦＬＤ又はその合併症の治療又は予防のための医薬の製造における、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物の使用も提供する。

本開示は、ＮＡＦＬＤ又はその合併症の治療又は予防における使用説明書が添付されている、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を含むキットも提供する。

例示的ＮＡＦＬＤ及びその合併症並びに化合物が本明細書に記載され、前出の３段落に示される本開示の例に適宜修正して適用されるものと解釈されなければならない。

固形飼料給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスにおけるＡ．血糖値、Ｂ．体重及びＣ．血清アラニンアミノトランスフェラーゼ値を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較。＊Ｐ＜０．０５、ＨＦＤ給餌ＷＴマウスとの比較。ｎ＝３～８／群（Ａ）、ｎ＝３～８／群（Ｂ）、ｎ＝６～１０／群（Ｃ）。 固形飼料給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスにおけるＡ．肝切片のオイルレッドＯ染色及びＢ．脂肪酸シンターゼ（ｆａｓｎ）の相対肝ｍＲＮＡ発現の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較。＊Ｐ＜０．０５、ＨＦＤ給餌ＷＴマウスとの比較。ｎ＝６～１１／群（Ａ）、ｎ＝３～６／群（Ｂ）。 固形飼料給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスにおけるＡ．肝切片のアディポフィリン、Ｂ．マンノース－６－リン酸受容体結合タンパク質１（ｔｉｐ４７）及びＣ．アディポフィリン（ｐｌｉｎ２ａ）の相対肝ｍＲＮＡ発現の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ ＨＦＤ給餌ＷＴマウスとの比較。ｎ＝４～１１／群（Ａ）、ｎ＝５～８／群（Ｂ）、ｎ＝３～６／群（Ｃ）。 固形飼料給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスにおけるＡ．肝切片のタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｃ（ＣＤ４５）、Ｂ．ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様１（Ｆ４／８０）及びＣ．単球走化性タンパク質－１（ｍｃｐ１）の相対肝ｍＲＮＡ発現の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ ＨＦＤ給餌ＷＴマウスとの比較。ｎ＝４～６／群（Ａ）、ｎ＝４～８／群（Ｂ）、ｎ＝４～５／群（Ｃ）。 固形飼料給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスの肝切片において同定された全ての風船化肝細胞、マロリー・デンク体、炎症性病巣及び衛星病変の総数の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ ＨＦＤ給餌ＷＴマウスとの比較。ｎ＝５～９／群。 固形飼料給餌ＷＴ及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＨＦＤ給餌マウスにおけるＡ．血糖値、Ｂ．体重、Ｃ．肝重量、Ｄ．肝重量の対体重比及びＥ．血清アラニンアミノトランスフェラーゼ値を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較。ｎ＝６～１０／群。 固形飼料給餌ＷＴ及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＨＦＤ給餌マウスにおけるＡ．肝切片のオイルレッドＯ染色及びＢ．脂肪酸シンターゼ（ｆａｓｎ）の相対肝ｍＲＮＡ発現の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較。＊＊Ｐ＜０．０１、対照処置ＨＦＤ給餌マウスとの比較。ｎ＝６～１１（Ａ）、ｎ＝３～６（Ｂ）。 固形飼料給餌ＷＴ及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＨＦＤ給餌マウスにおけるＡ．肝切片のアディポフィリン、Ｂ．マンノース－６－リン酸受容体結合タンパク質１（ｔｉｐ４７）及びＣ．アディポフィリン（ｐｌｉｎ２ａ）の相対肝ｍＲＮＡ発現の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ 対照処置ＨＦＤ給餌マウスとの比較。ｎ＝５～１１／群（Ａ）、ｎ＝６～８／群（Ｂ）、ｎ＝３～５／群（Ｃ）。 固形飼料給餌ＷＴ及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＨＦＤ給餌マウスにおけるＡ．肝切片のタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｃ（ＣＤ４５）、Ｂ．ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様１（Ｆ４／８０）及びＣ．単球走化性タンパク質－１（ｍｃｐ１）の相対肝ｍＲＮＡ発現の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ 対照処置ＨＦＤ給餌マウスとの比較。ｎ＝４～７／群（Ａ）、ｎ＝４～８／群（Ｂ）、ｎ＝４～７／群（Ｃ）。 固形飼料給餌ＷＴ及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＨＦＤ給餌マウスの肝切片において同定された全ての風船化肝細胞、マロリー・デンク体、炎症性病巣及び衛星病変の総数の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１ 固形飼料給餌ＷＴとの比較及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ 対照処置ＨＦＤ給餌マウスとの比較。ｎ＝５～９／群。 短期ＣＤ食（５ヵ月間ＣＤ食；ＣＤ５）におけるＷＴ、Ｖｅｇｆｂ^+/-及びＶｅｇｆｂ^-/-マウスでのＡ．体重及び血糖値、Ｂ 腹腔内グルコース及びＣ．腹腔内インスリン負荷試験（ＩＰＧＴＴ及びＩＰＩＴＴ）をＡＵＣ分析として示される定量化と共に示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５、ＣＤ食におけるＷＴとの比較。ｎ＝４～１３／群。 ＣＤ５食におけるＷＴ、Ｖｅｇｆｂ^+/-及びＶｅｇｆｂ^-/-マウスでのＡ．肝重量及び肝重量の対体重比及びＢ．血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）値の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１ ＣＤ食におけるＷＴマウスとの比較。ｎ＝４～１３／群。 ＣＤ５食におけるＷＴ、Ｖｅｇｆｂ^+/-及びＶｅｇｆｂ^-/-マウスでのＡ．肝切片のオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色の定量化及びＢ．トリグリセリド類（ＴＧ）、ケトン類（ＫＢ）及び非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の血漿レベルの定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ ＣＤ食におけるＷＴマウスとの比較。ｎ＝４～１３／群。 ＣＤ５食におけるＷＴ、Ｖｅｇｆｂ^+/-及びＶｅｇｆｂ^-/-マウスからの肝切片のＡ．タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｃ（ＣＤ４５）及びＢ．ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様１（Ｆ４／８０）の免疫標識の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ ＣＤ食におけるＷＴとの比較。ｎ＝４～１３／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＣＤ５食におけるＷＴマウスでのＡ．体重及び血糖値、Ｂ．腹腔内グルコース（ＩＰＧＴＴ）及びＣ．腹腔内インスリン負荷試験（ＩＰＩＴＴ）を曲線下面積分析として示される定量化と共に示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃Ｐ＜０．０５、固形飼料給餌ＷＴとの比較。ｎ＝８～１０／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＣＤ５食におけるＷＴマウスでのＡ．肝重量及び肝重量の対体重比及びＢ．血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）値の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴマウスとの比較。＊＊Ｐ＜０．０１、ＣＤ食における対照処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスとの比較。ｎ＝８～１０／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＣＤ５食におけるＷＴマウスでのＡ．ＯＲＯ染色の定量化及びＢ．トリグリセリド類（ＴＧ）、ケトン類（ＫＢ）及び非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の血漿レベルの定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴマウスとの比較。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＣＤ食における対照処置マウスとの比較。ｎ＝８～１０／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＣＤ５食におけるＷＴマウスの肝切片でのＡ．アディポフィリン発現の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１ 固形飼料給餌ＷＴ動物との比較。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ ＣＤ食における対照処置マウスとの比較。ｎ＝８～１０／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＣＤ５食におけるＷＴマウスの肝切片でのＡ．タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｃ（ＣＤ４５）及びＢ．ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様１（Ｆ４／８０）の免疫標識の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴマウスとの比較。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ ＣＤ食における対照処置マウスとの比較。ｎ＝８～１０／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＣＤ５食におけるＷＴマウスからの肝切片のマッソントリクローム染色を用いた肝線維化の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴマウスとの比較。＊＊＊Ｐ＜０．００１ ＣＤ食における対照処置マウスとの比較。ｎ＝８～１０／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置したＣＤ５食におけるＷＴマウスのＨ＆Ｅ染色肝切片での総合肝臓ＮＡＳＨスコアリングを示す図表である。値は平均値ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１ 固形飼料給餌動物との比較及び＊＊＊Ｐ＜０．００１ ＣＤ食におけるＣ５７ＢＬ／６マウス対照処置ＷＴマウスとの比較。ｎ＝５～１０／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ抗体（２Ｈ１０）又は対照抗体で処置した長期ＣＤ食（１２ヵ月間ＣＤ食；ＣＤ１２）におけるＷＴマウスでのＡ．体重及び血糖値、Ｂ．腹腔内グルコース及びＣ．腹腔内インスリン負荷試験（ＩＰＧＴＴ及びＩＰＩＴＴ）をＡＵＣ分析として示される定量化と共に示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴマウスとの比較。ｎ＝８／群。 ＷＴ固形飼料給餌マウス及び抗ＶＥＧＦ抗体又は対照抗体で処置したＣＤ１２食におけるＷＴマウスの一連の図表であり、Ａ．肝重量及び肝重量の対体重比、Ｂ．血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）値の定量化、Ｃ．ガドリニウム増強ＭＲＩスキャンの代表的画像である。腫瘍負荷は矢印によって示す。Ｄ．長期ＣＤ食における腫瘍なし及び腫瘍ありの２Ｈ１０又は対照抗体で処置したマウスをまとめたグラフである。記号は個々のマウスを示す。Ｅ．肝臓の肉眼的観察の代表的画像、Ｆ．ＣＤ１２食における対照抗体で処置したマウスの肝腫瘍部位を示す。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴマウスとの比較。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＣＤ食におけるＣ５７ＢＬ／６マウス対照処置マウスとの比較。ｎ＝８／群（Ａ～Ｅ）；ｎ＝４（Ｆ） 固形飼料給餌ＷＴ及び抗ＶＥＧＦ抗体又は腫瘍あり若しくは腫瘍なしの対照抗体で処置したＣＤ１２食におけるＷＴマウスの肝臓でのＯＲＯ染色の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃Ｐ＜０．０１、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴマウスとの比較。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、腫瘍なしのＣＤ食における対照処置マウスとの比較。ｎ＝４～８／群。 固形飼料給餌ＷＴマウス及び抗ＶＥＧＦ（２Ｈ１０）抗体で処置したＣＤ１２食におけるＷＴマウス又は腫瘍あり若しくは腫瘍なしの対照抗体処置マウスの肝切片でのＡ．タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｃ（ＣＤ４５）及びＢ．ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様１（Ｆ４／８０）の免疫標識の定量化を示す図表である。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ 固形飼料給餌ＷＴマウスとの比較。＊Ｐ＜０．０１、腫瘍なしのＣＤ食における対照処置マウスとの比較。＾＾＾Ｐ＜０．００１ 腫瘍ありのＣＤ食における対照処置マウスとの比較。ｎ＝４～８／群。

配列表の説明
配列番号１は、２１アミノ酸Ｎ末端シグナル配列を含むヒトＶＥＧＦ－Ｂ₁₈₆アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号２は、２１アミノ酸Ｎ末端シグナル配列を含むヒトＶＥＧＦ－Ｂ₁₆₇アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号３は、抗体２Ｈ１０のＶ_Hからのアミノ酸配列である。
配列番号４は、抗体２Ｈ１０のＶ_Lからのアミノ酸配列である。
配列番号５は、ヒト化形態の抗体２Ｈ１０のＶ_Hからのアミノ酸配列である。
配列番号６は、ヒト化形態の抗体２Ｈ１０のＶ_Lのアミノ酸配列である。
配列番号７は、抗体４Ｅ１２のＶ_Hからのアミノ酸配列である。
配列番号８は、抗体４Ｅ１２のＶ_Lのアミノ酸配列である。
配列番号９は、抗体２Ｆ５のＶ_Hからのアミノ酸配列である。
配列番号１０は、抗体２Ｆ５のＶ_Lのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ１からのヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ２からのヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ３からのヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ１からのヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ２からのヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ３からのヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ１からのアミノ酸配列である。
配列番号１８は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ２からのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ３からのアミノ酸配列である。
配列番号２０は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ１からのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ２からのアミノ酸配列である。
配列番号２２は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ３からのアミノ酸配列である。
配列番号２３は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ１からのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ２からのヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ３からのヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ１からのヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ２からのヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ３からのヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ１からのアミノ酸配列である。
配列番号３０は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ２からのアミノ酸配列である。
配列番号３１は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ３からのアミノ酸配列である。
配列番号３２は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ１からのアミノ酸配列である。
配列番号３３は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ２からのアミノ酸配列である。
配列番号３４は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ３からのアミノ酸配列である。
配列番号３５は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ１からのヌクレオチド配列である。
配列番号３６は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ２からのヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ３からのヌクレオチド配列である。
配列番号３８は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ１からのヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ２からのヌクレオチド配列である。
配列番号４０は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ３からのヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ１からのアミノ酸配列である。
配列番号４２は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ２からのアミノ酸配列である。
配列番号４３は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ３からのアミノ酸配列である。
配列番号４４は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ１からのアミノ酸配列である。
配列番号４５は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ２からのアミノ酸配列である。
配列番号４６は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ３からのアミノ酸配列である。

概要
本明細書全体を通じて、特に具体的に明記されない限り、又は文脈上特に必要でない限り、単一のステップ、組成物、ステップ群又は組成物群への言及は、それらのステップ、組成物、ステップ群又は組成物群の１つ及び複数（即ち１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。

当業者は、本開示が具体的に記載されるもの以外にも変形形態及び改良形態を受け入れる余地があることを理解するであろう。本開示は、かかる変形形態及び改良形態を全て包含することが理解されるべきである。本開示は、本明細書において言及又は指摘される全てのステップ、特徴、組成物及び化合物を個別に又はまとめて包含し、及び前記ステップ又は特徴の一部及び全部の組み合わせ又は任意の２つ以上も包含する。

本開示は、本明細書に記載される具体的な例によって範囲が限定されることはなく、例示を目的とするに過ぎないことが意図される。機能的に均等な製品、組成物及び方法は、明確に本開示の範囲内にある。

本明細書における開示の任意の例は、特に具体的に明記されない限り、本開示の任意の他の例に適宜修正して適用されると解釈されるものとする。

ＮＡＦＬＤの治療又は予防に関する本開示の任意の例は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象の自然免疫応答（例えば、消化器系における自然免疫応答及び／又は全身性自然免疫応答）の阻害又は防止に適宜修正して適用されると解釈されるものとする。

特に具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、当該技術分野における（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における）当業者が一般に理解するのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。

特に指示されない限り、本開示において利用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学の技法は、当業者に周知の標準的手順である。かかる技法については、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての改訂を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改訂を含む）などの引用元の文献全体にわたって記載及び説明されている。

本明細書における可変領域及びその一部、免疫グロブリン、抗体及びその断片の説明及び定義は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１、Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９－３２０，１９９４、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７－８８３，１９８９及び／又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３，９２７－９４８，１９９７にある考察によって更に明確となり得る。

本明細書におけるタンパク質又は抗体に関するいかなる考察も、製造及び／又は保管中に生じるタンパク質又は抗体の任意の変異体を含むことが理解されるであろう。例えば、製造又は保管中、抗体は、脱アミド化し（例えば、アスパラギン若しくはグルタミン残基で）、及び／又は改変されたグリコシル化を有し、及び／又はピログルタミンに変換されたグルタミン残基を有し、及び／又はＮ末端若しくはＣ末端残基が除去又は「クリップ」され、及び／又はシグナル配列の一部若しくは全部が不完全にプロセシングされて、結果として抗体の末端に残ることもある。特定のアミノ酸配列を含む組成物は、明示されるか若しくはコードされる配列及び／又はその明示されるか若しくはコードされる配列の変異体の不均一混合物であり得ることが理解される。

用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するように理解されるものとし、且つ両方の意味又はいずれか一方の意味に対する明示的なサポートを提供すると解釈されるものとする。

本明細書全体を通じて、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる」などは、明示される要素、完全体若しくはステップ、又は要素、完全体若しくはステップの群の包含を含意し、しかし、任意の他の要素、完全体若しくはステップ、又は要素、完全体若しくはステップの群の除外を含意しないことが理解されるであろう。

本明細書で使用されるとき、用語「由来する」は、特定の供給源から指定の完全体が得られ得る（但し、必ずしもその供給源から直接とは限らない）ことを包含すると解釈されるものとする。

特定の定義
ＶＥＧＦ－Ｂは、ＶＥＧＦ－Ｂ₁₈₆及びＶＥＧＦ－Ｂ₁₆₇と称される２つの主要なアイソフォームで存在することが知られる。限定でなく、あくまでも命名を目的として、ヒトＶＥＧＦ－Ｂ₁₈₆の例示的配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３３６８．１、ＮＣＢＩタンパク質受託番号ＮＰ＿００３３６８、Ｐ４９７６５及びＡＡＬ７９００１並びに配列番号１に示される。本開示に関連して、ＶＥＧＦ－Ｂ₁₈₆の配列は、２１アミノ酸Ｎ末端シグナル配列（例えば、配列番号１のアミノ酸１～２１に示されるとおり）を欠いていることができる。限定でなく、あくまでも命名を目的として、ヒトＶＥＧＦ－Ｂ₁₆₇の例示的配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２３０６６２．１、ＮＣＢＩタンパク質受託番号ＡＡＬ７９０００及びＡＡＢ０６２７４並びに配列番号２に示される。本開示に関連して、ＶＥＧＦ－Ｂ₁₆₇の配列は、２１アミノ酸Ｎ末端シグナル配列（例えば、配列番号２のアミノ酸１～２１に示されるとおり）を欠いていることができる。ＶＥＧＦ－Ｂの更なる配列は、本明細書及び／又は公的に利用可能なデータベースに提供される配列を用いて決定することができ、及び／又は標準的な技法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての改訂を含む）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されるとおり）を用いて決定することができる。ヒトＶＥＧＦ－Ｂへの言及は、ｈＶＥＧＦ－Ｂと省略されることもある。一例において、本明細書におけるＶＥＧＦ－Ｂへの言及は、ＶＥＧＦ－Ｂ₁₆₇アイソフォームへの言及である。

本明細書におけるＶＥＧＦ－Ｂへの言及は、国際公開第２００６／０１２６８８号パンフレットに記載されるとおりのＶＥＧＦ－Ｂ_10-108ペプチドも包含する。

本明細書で使用されるとき、「非アルコール性脂肪性肝疾患」又は「ＮＡＦＬＤ」は、炎症及び線維化（即ち肝線維化）を伴うことも又は伴わないこともある、過剰なアルコール摂取なしに肝臓に脂肪が沈着する病態（肝脂肪症）を指す。この用語には、脂肪症、ＮＡＳＨ及び肝硬変が包含される。

本明細書で使用されるとき、「ＮＡＦＬＤを有する対象」は、ＮＡＦＬＤと診断された対象を指す。一部の例において、ＮＡＦＬＤは、ルーチンの検査、メタボリックシンドローム及び肥満のモニタリング、又は薬物（例えば、コレステロール降下剤又はステロイド）の副作用の可能性に関するモニタリング中に疑われる。一部の例において、ＡＳＡＴ及びＡＬＡＴなどの肝酵素が高い。一部の例において、対象は、腹部又は胸部イメージング、肝臓超音波検査、又は磁気共鳴画像法に従って診断される。一部の例において、過剰なアルコール消費、Ｃ型肝炎及びウィルソン病などの他の病態は、ＮＡＦＬＤ診断前に除外されている。一部の例において、対象は、肝生検に従って診断されている。

本明細書で使用されるとき、「脂肪症」及び「非アルコール性脂肪症」は、同義的に使用され、炎症又は線維化を伴わない、過剰なアルコール摂取のない軽度、中等度及び重度脂肪症を含む。

ここで使用されるとき、用語「肝臓（ｈｅｐａｔｉｃ）」及び「肝臓（ｌｉｖｅｒ）」は、同義的に使用される。

本明細書で使用されるとき、「脂肪症を有する対象」及び「非アルコール性脂肪症を有する対象」は、同義的に使用され、脂肪症と診断された対象を指す。一部の例において、脂肪症は、本明細書に一般にＮＡＦＬＤに関して記載される方法によって診断される。

本明細書で使用されるとき、「非アルコール性脂肪性肝炎」又は「ＮＡＳＨ」は、肝臓に炎症及び／又は線維化（即ち肝線維化）があるＮＡＦＬＤを指す。ＮＡＳＨのステージを決定する例示的方法については、例えば、Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１（６）：１３１３－１３２１、及びＢｒｕｎｔ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌ，２０：Ｓ４０－Ｓ４８に記載されている。

本明細書で使用されるとき、「ＮＡＳＨを有する対象」は、ＮＡＳＨと診断された対象を指す。一部の例において、ＮＡＳＨは、上記にＮＡＦＬＤに関して概括的に記載される方法によって診断される。一部の例において、進行した線維化は、ＮＡＦＬＤを有する患者において、例えばＧａｍｂｉｎｏ Ｒ，ｅｔ．ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；４３（８）：６１７－４９に従って診断される。

本明細書で使用されるとき、用語「ＮＡＳＨ由来肝硬変」又は「ＮＡＳＨ由来肝硬変を有する対象」は、ＮＡＳＨによって引き起こされる肝硬変を有する対象を指し、即ち、このＮＡＳＨは、肝硬変に進行している。

本明細書で使用されるとき、用語「ＮＡＳＨ関連肝硬変」、又は「ＮＡＳＨに伴う肝硬変」、又は「ＮＡＳＨ関連肝硬変を有する対象」は、肝硬変及びＮＡＳＨと診断される対象を指すが、しかしながら、この肝硬変は、必ずしもＮＡＳＨによって引き起こされるわけではない。

本明細書で使用されるとき、用語「ＮＡＳＨ関連肝線維化」、又は「ＮＡＳＨに伴う肝線維化」、又は「ＮＡＳＨ関連肝線維化を有する対象」は、肝線維化及びＮＡＳＨと診断される対象を指すが、しかしながら、この肝線維化は、必ずしもＮＡＳＨによって引き起こされるわけではない。

本明細書で使用されるとき、用語「ＮＡＳＨ由来肝細胞癌」又は「ＮＡＳＨ由来肝細胞癌を有する対象」は、ＮＡＳＨによって引き起こされた肝細胞癌を有する対象を指し、即ち、このＮＡＳＨは、肝細胞癌に進行している。

本明細書で使用されるとき、用語「ＮＡＳＨ関連肝細胞癌」、又は「ＮＡＳＨに伴う肝細胞癌」、又は「ＮＡＳＨ関連肝細胞癌を有する対象」は、肝細胞癌及びＮＡＳＨと診断される対象を指すが、しかしながら、この肝細胞癌は、必ずしもＮＡＳＨによって引き起こされるわけではない。

本明細書で使用されるとき、対象に関して「過体重」とは、ＢＭＩが２５～＜３０である対象を指す。

本明細書で使用されるとき、対象に関して「肥満」とは、ＢＭＩが３０以上である対象を指す。

本明細書で使用されるとき、「ＮＡＦＬＤを発症するリスクがある対象」は、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患及び糖尿病など、１つ以上のＮＡＦＬＤ共存症を有する対象を指す。

本明細書で使用されるとき、「脂肪症を発症するリスクがある対象」は、脂肪症であると診断されていないが、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患及び糖尿病など、１つ以上のＮＡＦＬＤ共存症を有する対象を指す。

本明細書で使用されるとき、「ＮＡＳＨを発症するリスクがある対象」は、肥満、腹部肥満、メタボリックシンドローム、心血管疾患及び糖尿病など、１つ以上のＮＡＦＬＤ共存症を継続的に有している脂肪症の対象を指す。

用語「組換え」は、人為的な遺伝子組換えの産物を意味すると理解されるものとする。従って、抗体可変領域を含む組換えタンパク質に関連して、この用語は、Ｂ細胞成熟中に起こる自然の組換えの産物である対象の体内に天然に存在する抗体を包含しない。しかしながら、かかる抗体を単離した場合、それは、抗体可変領域を含む単離タンパク質と見なされる。同様に、タンパク質をコードする核酸を単離し、組換え手段を用いて発現させた場合、得られるタンパク質は、抗体可変領域を含む組換えタンパク質である。組換えタンパク質には、タンパク質が、例えばそれが発現するところである細胞、組織又は対象内にあるとき、人為的な組換え手段によって発現するタンパク質も包含される。

用語「タンパク質」は、単一のポリペプチド鎖、即ちペプチド結合によって連結された一連の連続アミノ酸又は互いに共有結合的若しくは非共有結合的に連結された一連のポリペプチド鎖（即ちポリペプチド複合体）を含むと解釈されるものとする。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学物質又はジスルフィド結合を用いて共有結合的に連結され得る。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用が挙げられる。

用語「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」は、前述の段落から、ペプチド結合によって連結された一連の連続アミノ酸を意味すると理解されるであろう。

当業者は、「抗体」が、概して、複数のポリペプチド鎖、例えば軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含むポリペプチド及び重鎖可変領域（Ｖ_H）を含むポリペプチドで構成される可変領域を含むタンパク質と見なされることを認識するであろう。抗体は、概して、定常ドメインも含み、その一部は、重鎖の場合に定常断片又は結晶化可能断片（Ｆｃ）が含まれる定常領域に配置され得る。Ｖ_HとＶ_Lとは、相互作用して、１つ又は数個の近縁関係にある抗原への特異的結合能を有する抗原結合領域を含むＦｖを形成する。概して、哺乳類の軽鎖は、κ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかであり、哺乳類の重鎖は、α、δ、ε、γ、又はμである。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＡ₁及びＩｇＡ₂）又はサブクラスであり得る。用語「抗体」は、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、シンヒューマナイズド抗体及びキメラ抗体も包含する。

用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」又は「全抗体」は、抗体の抗原結合断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指して同義的に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、野生型配列定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。

本明細書で使用されるとき、「可変領域」は、抗原への特異的結合能を有し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）、即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む本明細書に定義するとおりの抗体の軽鎖及び／又は重鎖の一部分を指す。例示的可変領域は、３又は４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意選択でＦＲ４）を３つのＣＤＲと共に含む。ＩｇＮＡＲに由来するタンパク質の場合、タンパク質は、ＣＤＲ２を欠いていることもある。Ｖ_Hは、重鎖の可変領域を指す。Ｖ_Lは、軽鎖の可変領域を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「相補性決定領域」（同義語ＣＤＲ、即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、抗原結合にその存在が必要な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲ領域を有する。ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１又は本開示の実施における他の付番方式、例えばＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，１９８７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７－８８３，１９８９、及び／又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８，１９９７のカノニカルな付番方式、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ．Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５－７７，２００３のＩＭＧＴ付番方式、又はＨｏｎｎｅｇｈｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｅｋｔｈｕｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７－６７０，２００１のＡＨＯ付番方式に従って定義することができる。

「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｖ」は、複数のポリペプチドを含むか、又は単一のポリペプチドを含むかに関わらず、Ｖ_LとＶ_Hとが会合して、抗原結合部位を有する、即ち抗原への特異的結合能を有する複合体を形成する任意のタンパク質を意味すると解釈されるものとする。抗原結合部位を形成するＶ_H及びＶ_Lは、単一のポリペプチド鎖にあり得るか、又は異なるポリペプチド鎖にあり得る。更に、本開示のＦｖ（及び本開示の任意のタンパク質）は、同じ抗原に結合することも又はそうでないこともある複数の抗原結合部位を有し得る。この用語は、抗体に直接由来する断片及び組換え手段を用いて作製されたかかる断片に対応するタンパク質を包含すると理解されるものとする。一部の例において、Ｖ_Hは、重鎖定常ドメイン（Ｃ_H）１に連結されず、及び／又はＶ_Lは、軽鎖定常ドメイン（Ｃ_L）に連結されない。例示的Ｆｖ含有ポリペプチド又はタンパク質としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ若しくはより高次の複合体、又はその定常領域若しくはドメイン、例えばＣ_H２若しくはＣ_H３ドメインに連結された前述のいずれか、例えばミニボディが挙げられる。「Ｆａｂ断片」は、抗体の一価抗原結合断片からなり、全抗体を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる断片を生じさせることにより作製することができ、又は組換え手段を用いて作製することができる。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、全抗体をペプシンで処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖と、Ｖ_H及び単一の定常ドメインを含む重鎖の一部分とからなる分子を生じさせることによって得ることができる。このように処理した抗体１つにつき２つのＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、組換え手段によっても作製することができる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合によって一体に保持された２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、全抗体分子を酵素ペプシンで処理し、続く還元を行わないことにより得られる。「Ｆａｂ₂」断片は、例えば、ロイシンジッパー又はＣ_H３ドメインを用いて連結された２つのＦａｂ断片を含む組換え断片である。「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とが好適な可動性ポリペプチドリンカーによって共有結合的に連結されている抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含む組換え分子である。

本明細書で使用されるとき、タンパク質又はその抗原結合部位と抗原との相互作用に関して用語「結合する」とは、その相互作用が抗原上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、全般的にタンパク質というよりむしろ特異的タンパク質構造を認識してそれに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、標識された「Ａ」とタンパク質とを含む反応物中にエピトープ「Ａ」を含有する分子（又は遊離した非標識の「Ａ」）が存在すると、抗体に結合する標識された「Ａ」の量が減少することになる。

本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」又は「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、本開示のタンパク質が、特定の抗原又はそれを発現する細胞と、別の抗原又は細胞と比べてより高頻度で、より速く、より長い持続時間で且つ／又はより高い親和性で反応又は会合することを意味すると解釈されるものとする。例えば、タンパク質は、他の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ）に対するよりも、又は多反応性天然抗体によって（即ちヒトに天然に見られる種々の抗原に結合することが知られる天然に存在する抗体によって）共通して認識される抗原に対するよりも実質的に高い親和性（例えば、２０倍、又は４０倍、又は６０倍、又は８０倍～１００倍、又は１５０倍、又は２００倍）でＶＥＧＦ－Ｂに結合する。概して、必ずしもというわけではないが、結合への言及は、特異的結合を意味し、及び各用語が他の用語の明示的なサポートを提供すると理解されるものとする。

本明細書で使用されるとき、用語「中和する」は、ＶＥＧＦ－Ｒ１を介した細胞のＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を遮断、低減又は防止する能力がタンパク質にあることを意味すると解釈されるものとする。中和の決定方法は、当該技術分野において公知であり、及び／又は本明細書に記載される。

本明細書で使用されるとき、用語「ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を特異的に阻害する」は、化合物がＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害し、１つ以上の他のＶＥＧＦタンパク質、例えばＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ及び／又はＰＩＧＦによるシグナル伝達を有意に又は検出可能なほどに阻害しないことを意味するものと理解されるであろう。

本明細書で使用されるとき、用語「有意に阻害しない」は、本明細書に記載される化合物の存在下におけるＶＥＧＦ－Ｂ以外のＶＥＧＦタンパク質によるシグナル伝達（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ及び／又はＰＩＧＦによるシグナル伝達）の阻害レベルが、本明細書に記載される化合物の非存在下（例えば、アイソタイプ対照抗体の存在下で行われ得る対照アッセイ）と比べて統計的に有意に低くないことを意味すると理解されるものとする。

本明細書で使用されるとき、用語「検出可能なほどに阻害しない」は、本明細書に記載されるとおりの化合物が、ＶＥＧＦ－Ｂ以外のＶＥＧＦタンパク質のシグナル伝達（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ及び／又はＰＩＧＦによるシグナル伝達）を、本明細書に記載される化合物の非存在下で（例えば、アイソタイプ対照抗体の存在下で行われ得る対照アッセイで）検出されるシグナル伝達レベルの１０％、又は８％、又は６％、又は５％、又は４％、又は３％、又は２％、又は１％以下のみ阻害することを意味すると理解されるものとする。

本明細書で使用されるとき、用語「予防している」、「予防する」又は「予防」は、本開示の化合物を投与して、それにより病態の少なくとも１つの症状の発症を止めるか又は妨げることを含む。

本明細書で使用されるとき、用語「治療している」、「治療する」又は「治療」は、本明細書に記載されるタンパク質を投与して、それにより指定の疾患若しくは病態の少なくとも１つの症状を低減するか若しくは消失させること、又は疾患若しくは病態の進行を遅延させることを含む。

本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、ヒト、例えば哺乳類を含めた任意の動物を意味すると解釈されるものとする。例示的対象としては、限定はされないが、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられる。例えば、対象は、ヒトである。

ＮＡＦＬＤ治療
本開示は、対象のＮＡＦＬＤを治療又は予防する方法を提供し、この方法は、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達の阻害薬を対象に投与することを含む。

一部の例において、本方法は、対象がＮＡＦＬＤを有するかどうかを決定すること、及びその対象が実際にＮＡＦＬＤを有する場合にその対象を選択し、次に本明細書に記載されるとおりのＶＥＧＦ－Ｂを阻害する化合物を投与することを含む。対象がＮＡＦＬＤを有するかどうかを決定することには、その病歴を精査すること、又は診断の確立に必要なとおりの検査を注文又は実施することが含まれ得る。多くのＮＡＦＬＤ患者が無症候である。病態は、通常、異常肝機能検査又は例えば無関係の医学的状態に認められた肝腫大の結果として偶発的に発見される。肝生化学検査値の上昇は、単純脂肪症患者の５０％に見られる（例えば、Ｓｌｅｉｓｅｎｇｅｒ，Ｓｌｅｉｓｅｎｇｅｒ ａｎｄ Ｆｏｒｄｔｒａｎ’ｓ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（２００６）を参照されたい）。一般に、診断は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）などのルーチンの血液検査パネルに含まれる肝検査値の上昇の存在から始まる。中程度であっても、肝脂肪蓄積の無症候性の増加は、メタボリックシンドロームの進行性の発病における初期成分であることが示されている（例えば、Ａｌｍｅｄａ－Ｖａｌｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｐａｔｏｌ．８ Ｓｕｐｐｌ １：５１８－２４（２００９）；Ｐｏｌｙｚｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．９（３）：２９９－３１４（２００９）；Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ）．１１６（７）：５３９－６４（２００９）を参照されたい）。

評価過程において、多くの場合に画像解析が入手される。超音波検査では、エコー輝度の増加に伴い「輝く」肝臓が明らかになる。従って、医用画像は、ＮＡＦＬＤの診断を促進し得る。コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）では、脂肪肝は、脾臓よりも密度が低く、及びＴ１強調磁気共鳴画像（ＭＲＩ）において脂肪が輝いて見える。

非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の鑑別診断の確立は、単純脂肪肝とは対照的に、肝生検を用いて行われる。肝生検について、針を皮膚から挿入することにより肝臓の小片が摘出される。顕微鏡で組織を調べて炎症及び肝細胞の損傷を伴う脂肪が示されると、ＮＡＳＨが診断される。組織が炎症及び損傷のない脂肪を示す場合、単純ＮＡＦＬＤが診断される。従って、重症度の評価が指示される場合、肝生検による組織学的診断が求められる。

一例において、対象は、脂肪症に罹患している。

一例において、対象は、ＮＡＳＨに罹患している。

一例において、対象は、肝硬変に罹患している。一例において、肝硬変は、ＮＡＳＨ由来肝硬変である。別の例において、肝硬変は、ＮＡＳＨ関連肝硬変である。

一例において、本開示の方法は、ＮＡＦＬＤの進行、例えば脂肪症からＮＡＳＨへの又はＮＡＳＨから肝硬変への進行を予防するか又は遅延させる。

一例において、対象は、肥満である。例えば、対象は、ＢＭＩが３０以上である。従って、本開示は、肥満の対象におけるＮＡＦＬＤを治療する方法を提供し、この方法は、ＶＥＧＦ－Ｂを阻害する化合物を対象に投与することを含む。

一例において、対象は、メタボリックシンドロームに罹患している。例えば、対象は、真性糖尿病、耐糖能異常、空腹時血糖異常又はインスリン抵抗性、及び以下のうちの２つを有する：
・血圧：≧１４０／９０ｍｍＨｇ、
・脂質異常症：トリグリセリド類（ＴＧ）：≧１．６９５ｍｍｏｌ／Ｌ及び高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）≦０．９ｍｍｏｌ／Ｌ（男性）、≦１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性）、
・中心性肥満：ウエスト・ヒップ比＞０．９０（男性）、＞０．８５（女性）、又はボディ・マス・インデックス＞３０ｋｇ／ｍ²、
・微量アルブミン尿：尿中アルブミン排泄率≧２０μｇ／分又はアルブミン：クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇ。

一例において、対象は、糖尿病に罹患している。例えば、糖尿病に罹患している対象は、以下のような臨床的に認められている糖尿病マーカーを有する：
・７ｍｍｏｌ／Ｌ又は１２６ｍｇ／ｄｌ以上の空腹時血漿グルコース、
・糖尿病の症状を伴う１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ又は２００ｍｇ／ｄｌ以上の随時血漿グルコース（１日のうちの任意の時点でとったもの）。
・２時間の間隔を置いて計測して１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ又は２００ｍｇ／ｄｌ以上の経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）値。ＯＧＴＴは、２又は３時間のタイムスパンで与えられる。

一例において、対象は、２型糖尿病に罹患している。

ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達阻害薬
抗体可変領域を含むタンパク質
例示的ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達阻害薬は、抗体可変領域を含み、例えばＶＥＧＦ－Ｂに結合してＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を中和する抗体又は抗体断片である。

一例において、抗体可変領域は、ＶＥＧＦ－Ｂに特異的に結合する。

好適な抗体及びその可変領域を含むタンパク質は、当該技術分野において公知である。

例えば、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体及びその断片について、国際公開第２００６／０１２６８８号パンフレットに記載されている。

一例において、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体又はその断片は、２Ｈ１０のＶＥＧＦ－Ｂ又はその抗原結合断片への結合を競合的に阻害する抗体である。一例において、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体又はその断片は、抗体２Ｈ１０若しくはそのキメラ、ＣＤＲグラフト若しくはヒト化バージョン又はその抗原結合断片である。この点に関して、抗体２Ｈ１０は、配列番号３に示される配列を含むＶ_Hと、配列番号４に示される配列を含むＶ_Lとを含む。この抗体の例示的キメラ及びヒト化バージョンについて、国際公開第２００６／０１２６８８号パンフレットに記載されている。

一例において、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体又はその断片は、配列番号５に示される配列を含むＶ_Hと、配列番号６に示される配列を含むＶ_Lとを含む。

一例において、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体又はその断片は、４Ｅ１２のＶＥＧＦ－Ｂ又はその抗原結合断片への結合を競合的に阻害する抗体である。一例において、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体又はその断片は、抗体４Ｅ１２若しくはそのキメラ、ＣＤＲグラフト若しくはヒト化バージョン又はその抗原結合断片である。この点に関して、抗体４Ｅ１２は、配列番号７に示される配列を含むＶ_Hと、配列番号８に示される配列を含むＶ_Lとを含む。

一例において、本化合物は、抗体４Ｅ１２のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、タンパク質は、抗体４Ｅ１２のＶ_H及び／又はＶ_Lの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む。例えば、タンパク質は、
（ｉ）Ｖ_Hであって、
（ａ）配列番号７のアミノ酸２５～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸４９～６５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号７のアミノ酸９８～１０５に示される配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_H、及び／又は
（ｉｉ）Ｖ_Lであって、
（ａ）配列番号８のアミノ酸２４～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸５０～５６に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号８のアミノ酸８９～９７に示される配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_L
を含む。

一例において、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体又はその断片は、２Ｆ５のＶＥＧＦ－Ｂ又はその抗原結合断片への結合を競合的に阻害する抗体である。一例において、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体又はその断片は、抗体２Ｆ５若しくはそのキメラ、ＣＤＲグラフト若しくはヒト化バージョン又はその抗原結合断片である。この点に関して、抗体２Ｅ５は、配列番号９に示される配列を含むＶ_Hと、配列番号１０に示される配列を含むＶ_Lとを含む。

一例において、化合物は、抗体２Ｆ５のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、タンパク質は、抗体２Ｆ５のＶ_H及び／又はＶ_Lの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む。例えば、タンパク質は、
（ｉ）Ｖ_Hであって、
（ａ）配列番号９のアミノ酸２５～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸４９～６５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号９のアミノ酸９８～１０７に示される配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_H、及び／又は
（ｉｉ）Ｖ_Lであって、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸２４～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸５０～５６に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸８９～９６に示される配列を含むＣＤＲ３
を含むＶ_L
を含む。

別の例において、抗体又はその可変領域を含むタンパク質は、例えば、当該技術分野において公知であるか又は本明細書に簡単に記載されるとおりの標準方法を用いて作製される。

免疫化に基づく方法
抗体生成のため、任意選択で任意の好適な又は所望のアジュバント及び／又は薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された、ＶＥＧＦ－Ｂ又はそのエピトープ担持断片若しくは部分、或いはその修飾形態又はそれをコードする核酸（「免疫原」）が注射用組成物の形態で対象（例えば、マウス、ラット、ニワトリ等の非ヒト動物対象）に投与される。例示的非ヒト動物は、ネズミ科動物（例えば、ラット又はマウス）などの哺乳類である。注射は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内又は他の公知の経路によるものであり得る。任意選択で、免疫原は、多くの回数にわたって投与される。抗体を調製して特徴付ける手段は、当該技術分野において公知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。マウスにおいて抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体を作製する方法は、国際公開第２００６／０１２６８８号パンフレットに記載されている。

ポリクローナル抗体の産生は、免疫化後の様々な時点で免疫動物の血液を採取することによりモニタし得る。所望の抗体力価を実現するのに必要であれば、２回目のブースター注射が行われ得る。ブースティング及び力価測定のプロセスは、好適な力価が実現するまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性に達すると、免疫動物が採血されて、血清が分離及び保存され、及び／又は動物がモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成に使用される。

モノクローナル抗体は、本開示によって企図される例示的抗体である。概して、モノクローナル抗体の作製は、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で対象（例えば、げっ歯類、例えばマウス又はラット）を免疫原で免疫することを伴う。一部の例では、ヒト抗体を発現してマウス抗体タンパク質を発現しないように遺伝子操作されたマウスを免疫することにより抗体が作製される（例えば、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００７／００８２３１号明細書及び／又はＬｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８（１９９４）：８５６－８５９に記載されるとおり）。免疫後、抗体を産生する体細胞（例えば、Ｂリンパ球）が不死細胞、例えば不死骨髄腫細胞と融合される。かかる融合細胞（ハイブリドーマ）の様々な作製方法が当該技術分野において公知であり、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５－４９７，１９７５に記載されている。次に、ハイブリドーマ細胞を抗体産生に十分な条件下で培養することができる。

本開示は、他の抗体作製方法、例えばＡＢＬ－ＭＹＣ技術（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６，９１－９６．１９９０に記載されるとおり）を企図する。

ライブラリに基づく方法
本開示は、抗体又はその抗原結合ドメインを含む（例えば、その可変領域を含む）タンパク質のライブラリをスクリーニングして、ＶＥＧＦ－Ｂ結合抗体又はその可変領域を含むタンパク質を同定することも包含する。

本開示によって企図されるライブラリの例としては、ナイーブライブラリ（無感作の対象由来）、免疫ライブラリ（抗原で免疫された対象由来）又は合成ライブラリが挙げられる。抗体又はその領域（例えば、可変領域）をコードする核酸が従来技術によってクローニングされ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ，ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に開示されるとおり）、当該技術分野において公知の方法を用いたタンパク質のコーディング及びディスプレイに使用される。タンパク質のライブラリを作製する他の技法について、例えば米国特許第６３０００６４号明細書（例えば、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧのＨｕＣＡＬライブラリ）、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第６２０４０２３号明細書、米国特許第６２９１１５８号明細書又は米国特許第６２４８５１６号明細書に記載されている。

本開示に係るタンパク質は、可溶性分泌タンパク質であり得、又は細胞若しくは粒子（例えば、ファージ又は他のウイルス、リボソーム若しくは胞子）の表面上の融合タンパク質として存在し得る。様々なディスプレイライブラリフォーマットが当該技術分野において公知である。例えば、ライブラリは、インビトロディスプレイライブラリ（例えば、例として米国特許第７２７０９６９号明細書に記載されるとおりのリボソームディスプレイライブラリ、共有結合ディスプレイライブラリ又はｍＲＮＡディスプレイライブラリ）である。更に別の例において、ディスプレイライブラリは、例えば、米国特許第６３０００６４号明細書、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第６２０４０２３号明細書、米国特許第６２９１１５８号明細書又は米国特許第６２４８５１６号明細書に記載されるとおりの、抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質がファージ上に発現するファージディスプレイライブラリである。他のファージディスプレイ方法が当該技術分野において公知であり、本開示によって企図される。同様に、細胞ディスプレイ方法、例えば、例として米国特許第５５１６６３７号明細書に記載されるとおりの細菌ディスプレイライブラリ、例えば米国特許第６４２３５３８号明細書に記載されるとおりの酵母ディスプレイライブラリ又は哺乳類ディスプレイライブラリが本開示によって企図される。

スクリーニングディスプレイライブラリ方法は、当該技術分野において公知である。一例において、本開示のディスプレイライブラリは、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されるとおりのアフィニティー精製を用いてスクリーニングされる。アフィニティー精製方法は、典型的には、ライブラリによって提示される抗原結合ドメインを含むタンパク質を標的抗原（例えば、ＶＥＧＦ－Ｂ）と接触させて、洗浄後、抗原に結合したままのドメインを溶出させることを伴う。

スクリーニングによって同定された任意の可変領域又はｓｃＦｖは、必要に応じて完全抗体に容易に修飾される。可変領域又はｓｃＦｖを完全抗体となるように修飾し、又は再フォーマット化する例示的方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３５４：８５－９０，２０１０、又はＪｏｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９：６５－８０，２００４に記載されている。代わりに又は加えて、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８，１９８７）及び／又は（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１）に記載されるとおり、標準的なクローニング方法が用いられる。

脱免疫化、キメラ、ヒト化、シンヒューマナイズド、霊長類化及びヒトタンパク質
本開示のタンパク質は、ヒト化タンパク質であり得る。

用語「ヒト化タンパク質」は、ヒト抗体由来のＦＲにグラフト又は挿入された非ヒト種（例えば、マウス若しくはラット又は非ヒト霊長類）由来の抗体のＣＤＲを含むヒト様可変領域を含むタンパク質を指すと理解されるものとする（この種の抗体は、「ＣＤＲグラフト抗体」とも称される）。ヒト化タンパク質には、ヒトタンパク質の１つ以上の残基が１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されており、及び／又はヒトタンパク質の１つ以上のＦＲ残基が対応する非ヒト残基に置き換えられているタンパク質も含まれる。ヒト化タンパク質は、ヒト抗体又は非ヒト抗体のいずれにも見られない残基も含み得る。タンパク質の任意の追加的な領域（例えば、Ｆｃ領域）は、概して、ヒトである。ヒト化は、当該技術分野、例えば米国特許第５２２５５３９号明細書、米国特許第６０５４２９７号明細書、米国特許第７５６６７７１号明細書又は米国特許第５５８５０８９号明細書において公知の方法を用いて実施することができる。用語「ヒト化タンパク質」は、例えば、米国特許第７７３２５７８号明細書に記載されるとおりの超ヒト化タンパク質も包含する。

本開示のタンパク質は、ヒトタンパク質であり得る。用語「ヒトタンパク質」は、本明細書で使用されるとき、ヒト、例えばヒト生殖細胞系列又は体細胞に見られる可変、及び任意選択で定常抗体領域を有するか、又はかかる領域を使用して作製されるライブラリからのタンパク質を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、例えばインビトロでランダム又は部位特異的突然変異によって導入される突然変異（詳細には、保存的置換を伴う突然変異又はタンパク質の残基の少数、例えばタンパク質の残基の１、２、３、４又は５個における突然変異）を含むことができる。これらの「ヒト抗体」は、必ずしもヒトの免疫応答の結果として生成される必要はなく、むしろヒト抗体は、組換え手段（例えば、ファージディスプレイライブラリのスクリーニング）を用いて、且つ／又はヒト抗体定常及び／若しくは可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）により、及び／又はガイド下の選択を用いて（例えば又は米国特許第５５６５３３２号明細書に記載されるとおり）生成され得る。この用語は、かかる抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示の目的上、ヒトタンパク質は、例えば、米国特許第６３０００６４号明細書及び／又は米国特許第６２４８５１６号明細書に記載されるとおり、ヒト抗体からのＦＲ又はヒトＦＲのコンセンサス配列からの配列を含むＦＲを含み、且つＣＤＲの１つ以上がランダム又はセミランダムであるタンパク質を含むと見なされることにもなる。

本開示のタンパク質は、シンヒューマナイズドタンパク質であり得る。用語「シンヒューマナイズドタンパク質」は、国際公開第２００７／０１９６２０号パンフレットに記載される方法によって調製されるタンパク質を指す。シンヒューマナイズドタンパク質は、抗体の可変領域を含み、ここで、可変領域は、新世界霊長類抗体可変領域由来のＦＲと、非新世界霊長類抗体可変領域由来のＣＤＲとを含む。例えば、シンヒューマナイズドタンパク質は、抗体の可変領域を含み、ここで、可変領域は、新世界霊長類抗体可変領域由来のＦＲと、マウス又はラット抗体由来のＣＤＲとを含む。

本開示のタンパク質は、霊長類化タンパク質であり得る。「霊長類化タンパク質」は、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）の免疫後に生成された抗体の１つ又は複数の可変領域を含む。任意選択で、非ヒト霊長類抗体の可変領域がヒト定常領域に連結されて霊長類化抗体が作製される。霊長類化抗体を作製する例示的な方法は、米国特許第６１１３８９８号明細書に記載されている。

一例において、本開示のタンパク質は、キメラタンパク質である。用語「キメラタンパク質」は、抗原結合ドメインが特定の種（例えば、マウス又はラットなどのマウス科動物）のものであるか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する一方、タンパク質の残りが別の種に由来するタンパク質（例えば、ヒト又は非ヒト霊長類など）のものであるか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属するタンパク質を指す。一例において、キメラタンパク質は、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）のＶ_H及び／又はＶ_Lを含むキメラ抗体であり、抗体の残りの領域がヒト抗体のものである。かかるキメラタンパク質の作製は、当該技術分野において公知であり、標準的な手段によって実現し得る（例えば、米国特許第６３３１４１５号明細書、米国特許第５８０７７１５号明細書、米国特許第４８１６５６７号明細書及び米国特許第４８１６３９７号明細書に記載されるとおり）。

本開示は、例えば、国際公開第２０００／３４３１７号パンフレット及び国際公開第２００４／１０８１５８号パンフレットに記載されるとおりの脱免疫化タンパク質も企図する。脱免疫化抗体及びタンパク質は、１つ以上のエピトープ、例えばＢ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープが除去（即ち突然変異）されており、それにより対象がその抗体又はタンパク質に対して免疫応答を生じる可能性を低減する。

抗体可変領域を含む他のタンパク質
本開示は、
（ｉ）抗体のＶ_H又はＶ_Lの全て又は一部分を含む単一のポリペプチド鎖である単一ドメイン抗体（例えば、米国特許第６２４８５１６号明細書を参照されたい）、
（ｉｉ）例えば、米国特許第５８４４０９４号明細書及び／又は米国特許出願公開第２００８１５２５８６号明細書に記載されるとおりのダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ、
（ｉｉｉ）例えば、米国特許第５２６０２０３号明細書に記載されるとおりのｓｃＦｖ、
（ｉｖ）例えば、米国特許第５８３７８２１号明細書に記載されるとおりのミニボディ、
（ｖ）米国特許第５７３１１６８号明細書に記載されるとおりの「鍵及び鍵穴」型二重特異性タンパク質、
（ｖｉ）例えば、米国特許第４６７６９８０号明細書に記載されるとおりのヘテロコンジュゲートタンパク質、
（ｖｉｉ）例えば、米国特許第４６７６９８０号明細書に記載されるとおりの、化学的架橋剤を使用して作製されるヘテロコンジュゲートタンパク質、
（ｖｉｉｉ）例えば、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７－２２５，１９９２に記載されるとおりのＦａｂ’－ＳＨ断片、又は
（ｉｘ）Ｆａｂ₃（例えば、欧州特許第１９９３０３０２８９４号明細書に記載されるとおり）
など、抗体の可変領域又は抗原結合ドメインを含む他のタンパク質も企図する。

定常ドメイン融合物
本開示は、抗体の可変領域と、定常領域又はＦｃ又はそのドメイン、例えばＣ_H２及び／又はＣ_H３ドメインとを含むタンパク質を包含する。好適な定常領域及び／又はドメインは、当業者に明らかであり、及び／又はかかるポリペプチドの配列は、公的に利用可能なデータベースから容易に入手し得る。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌも一部の好適な定常領域／ドメインについて説明を提供している。

定常領域及び／又はそのドメインは、二量化、例えばＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）への結合による血清半減期の延長、抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、抗原依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）など、生物学的活性を提供するのに有用である。

本開示は、例えば、米国特許第７２１７７９７号明細書、米国特許第７２１７７９８号明細書、又は米国特許出願公開第２００９００４１７７０号明細書（半減期を増加させる）、又は米国特許出願公開第２００５０３７０００号明細書（ＡＤＣＣの増加）に記載されるとおりの突然変異定常領域又はドメインを含むタンパク質も企図する。

安定化タンパク質
本開示の中和タンパク質は、ＩｇＧ４定常領域又は安定化ＩｇＧ４定常領域を含み得る。用語「安定化ＩｇＧ４定常領域」は、Ｆａｂアーム交換若しくはＦａｂアーム交換を起こす傾向又は半抗体の形成若しくは半抗体を形成する傾向を低減するように修飾されたＩｇＧ４定常領域を意味するものと理解されるであろう。「Ｆａｂアーム交換」は、ヒトＩｇＧ４のタンパク質修飾の一種を指し、ここで、ＩｇＧ４重鎖及び付加軽鎖（半分子）は、別のＩｇＧ４分子の重鎖－軽鎖対にスワップされる。従って、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを獲得し得る（二重特異性分子になる）。Ｆａｂアーム交換は、インビボで自然に起こり、及びインビトロでは精製血球細胞又は還元型グルタチオンなどの還元剤によって誘導することができる。ＩｇＧ４抗体が解離して、単一の重鎖と単一の軽鎖とをそれぞれ含有する２つの分子が形成されると、「半抗体」が形成される。

一例において、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔ方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７ ａｎｄ／ｏｒ １９９１）によるヒンジ領域の２４１位にプロリンを含む。この位置は、ＥＵ付番方式（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，２００１及びＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５，１９６９）によるヒンジ領域の２２８位に対応する。ヒトＩｇＧ４では、この残基は、概して、セリンである。セリンからプロリンへの置換後、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣを含む。この点に関して、当業者は、「ヒンジ領域」が、Ｆｃ及びＦａｂ領域を連結して抗体の２つのＦａｂアームに可動性を付与する抗体重鎖定常領域のプロリンリッチな部分であることを認識しているであろう。ヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。それは、概して、Ｋａｂａｔ付番方式によるヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６～Ｐｒｏ２４３にわたる一続きとして定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによりＩｇＧ１配列とアライメントし得る（例えば、国際公開第２０１０／０８０５３８号パンフレットを参照されたい）。

更なるタンパク質ベースのＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達阻害薬
ＶＥＧＦ－Ｂのその受容体との増殖性相互作用を妨害し得る他のタンパク質としては、突然変異ＶＥＧＦ－Ｂタンパク質が挙げられる。

一例において、阻害薬は、ＶＥＧＦ－Ｂに結合する（且つ例えば実質的にＶＥＧＦ－Ａに結合しない）ＶＥＧＦ－Ｒ１の１つ以上のドメインを含む可溶性タンパク質である。一例において、可溶性タンパク質は、ＩｇＧ１抗体などの抗体の定常領域を更に含む。例えば、可溶性タンパク質は、抗体、例えばＩｇＧ１抗体のＦｃ領域、及び任意選択でヒンジ領域を更に含む。

一例において、タンパク質阻害薬は、抗体模倣体、例えば抗体と同じように標的タンパク質に結合する可変領域を含むタンパク質足場である。以下では、例示的な抗体模倣体について説明する。

免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片
本開示の化合物の一例は、Ｔ細胞受容体又は重鎖免疫グロブリン（例えば、ＩｇＮＡＲ、ラクダ科動物抗体）など、免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質である。

重鎖免疫グロブリン
重鎖免疫グロブリンは、それが重鎖を含むが軽鎖を含まない限りにおいて、他の多くの形態の免疫グロブリン（例えば、抗体）と構造的に異なる。従って、これらの免疫グロブリンは、「重鎖単独抗体」とも称される。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも称される）に見られる。

天然に存在する重鎖免疫グロブリン内にある可変領域は、概して、ラクダ科動物Ｉｇでは「Ｖ_HHドメイン」及びＩｇＮＡＲではＶ－ＮＡＲと称され、従来の４本鎖抗体内にある重鎖可変領域（「Ｖ_Hドメイン」と称される）及び従来の４本鎖抗体内にある軽鎖可変領域（「Ｖ_Lドメイン」と称される）と区別されている。

重鎖免疫グロブリンは、軽鎖が存在しなくても高親和性及び高特異性で関連抗原に結合する。これは、発現が容易であり且つ概して安定していて可溶性であるシングルドメイン結合断片が重鎖免疫グロブリンに由来し得ることを意味する。

ラクダ科動物の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域並びにその作製、及び／又は単離、及び／又は使用方法の概要については、特に以下の文献、国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９７／４９８０５号パンフレット及び国際公開第９７／４９８０５号パンフレットが参照される。

軟骨魚類の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域並びにその作製、及び／又は単離、及び／又は使用方法の概要については、特に国際公開第２００５／１１８６２９号パンフレットが参照される。

Ｖ様タンパク質
本開示の化合物の一例は、Ｔ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体は、抗体のＦｖモジュールと同様の構造に組み合わさる２つのＶドメインを有する。Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：８６４６－８６５０，１９９１は、Ｔ細胞受容体の２つのＶドメイン（α及びβと称される）をどのように融合して一本鎖ポリペプチドとして発現させることができるか、更に抗体ｓｃＦｖと同様に疎水性を直接低減するために表面残基をどのように変え得るかについて説明している。一本鎖Ｔ細胞受容体又は２つのＶ－α及びＶ－βドメインを含む多量体Ｔ細胞受容体の作製について説明する他の刊行物としては、国際公開第１９９９／０４５１１０号パンフレット又は国際公開第２０１１／１０７５９５号パンフレットが挙げられる。

抗原結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質としては、概して単量体である、Ｖ様ドメインを有するタンパク質が挙げられる。かかるＶ様ドメインを含むタンパク質の例としては、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８及びＩＣＯＳが挙げられる。かかるＶ様ドメインを含むタンパク質の更なる開示は、国際公開第１９９９／０４５１１０号パンフレットに含まれる。

アドネクチン
一例において、本開示の化合物は、アドネクチンである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンの第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（¹⁰Ｆｎ３）ドメインをベースとし、抗原結合を付与するようにループ領域が改変される。例えば、アドネクチンが抗原を特異的に認識可能となるように¹⁰Ｆｎ３ドメインのβ－サンドイッチの一端で３つのループを操作することができる。更なる詳細については、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号明細書又は国際公開第２００５／０５６７６４号パンフレットを参照されたい。

アンチカリン
更なる例において、本開示の化合物は、アンチカリンである。アンチカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小型の疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、円錐構造の開口端において、抗原に結合するように操作し得る複数のループを有する可動性のないβシート二次構造を有する。かかる操作されたリポカリンは、アンチカリンとして知られる。アンチカリンの更なる詳細については、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号明細書又は米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号明細書を参照されたい。

アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）
更なる例において、本開示の化合物は、アフィボディである。アフィボディは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡのＺドメイン（抗原結合ドメイン）に由来する足場であり、抗原に結合するように操作することができる。Ｚドメインは、約５８アミノ酸の３本ヘリックス束からなる。表面残基のランダム化によりライブラリが作成されている。更なる詳細については、欧州特許第１６４１８１８号明細書を参照されたい。

アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）
更なる例において、本開示の化合物は、アビマーである。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、ジスルフィド結合した規定の構造をとる。Ａドメインファミリーが呈する天然変異のシャッフリングにより多様性が生じる。更なる詳細については、国際公開第２００２０８８１７１号パンフレットを参照されたい。

ＤＡＲＰｉｎ
更なる例において、本開示の化合物は、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）である。ＤＡＲＰｉｎは、膜内在性タンパク質の細胞骨格への付着に介在するタンパク質ファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックスとβターンとからなる３３残基のモチーフである。これらは、各リピートの第１のαヘリックス及びβターンにある残基をランダム化することにより、種々の標的抗原に結合するように操作することができる。モジュールの数を増加させることにより、その結合面を増加させることができる（親和性成熟法）。更なる詳細については、米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号明細書を参照されたい。

タンパク質の作製方法
組換え発現
組換えタンパク質の場合、それをコードする核酸が発現ベクターにクローニングされ得、次に、それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又は骨髄腫細胞など、本来抗体を産生しない宿主細胞にトランスフェクトされる。本開示のタンパク質の発現に使用される例示的細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞又はＨＥＫ細胞である。こうした目標を実現するための分子クローニング技術は、当該技術分野において公知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての改訂を含む）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。組換え核酸の構築には、多様なクローニング及びインビトロ増幅方法が好適である。組換え抗体の作製方法も当該技術分野において公知である。米国特許第４８１６５６７号明細書又は米国特許第５５３０１０１号明細書を参照されたい。

単離後、核酸は、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、又は無細胞系若しくは細胞における発現のため、発現コンストラクト又は発現ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結されて挿入される。

本明細書で使用されるとき、用語「プロモーター」は、その最も広義の文脈で解釈されるべきであり、核酸の発現を例えば発生刺激及び／又は外部刺激に応答して改変するか又は組織特異的に改変する追加的な調節エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）を伴うことも又は伴わないこともある、ＴＡＴＡボックス又はイニシエーターエレメントを含めた、正確な転写開始に必要なゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。これに関連して、用語「プロモーター」は、それが作動可能に連結されている核酸の発現を付与し、活性化し、又は亢進させる組換え、合成若しくは融合核酸、又は誘導体を記載するためにも使用される。例示的プロモーターは、更に発現を亢進させ、且つ／又は前記核酸の空間的発現及び／若しくは時間的発現を改変する１つ以上の特異的調節エレメントの更なるコピーを含有し得る。

本明細書で使用されるとき、用語「作動可能に連結された」は、核酸の発現がプロモーターによって制御されるようにプロモーターが核酸に対して配置されることを意味する。

細胞での発現のために多くのベクターが利用可能である。概して、ベクター成分としては、限定はされないが、以下：シグナル配列、抗体をコードする配列（例えば、本明細書に提供される情報から得られる）、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列の１つ以上が挙げられる。当業者は、抗体の発現に好適な配列を認識しているであろう。例示的シグナル配列としては、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ又は耐熱性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー又は酸性ホスファターゼリーダー）又は哺乳類分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。

哺乳類細胞において活性な例示的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ）、ヒト伸長因子１－αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α－ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー／β－アクチンプロモーターを含むハイブリッド調節エレメント若しくは免疫グロブリンプロモーター又はこれらの活性断片が挙げられる。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児腎臓株（２９３細胞又は浮遊培養で成長するようにサブクローニングされた２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。

例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含む群から選択される酵母細胞など、酵母細胞での発現に好適な典型的なプロモーターとしては、限定はされないが、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター又はＴＥＦ１プロモーターが挙げられる。

単離核酸又はそれを含む発現コンストラクトを発現のために細胞に導入する手段は、当業者に公知である。所与の細胞に用いられる技法は、公知の成功している技法に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入する手段としては、数ある中でも特に、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストランによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）及び／又はセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）の使用によるなど、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧ媒介ＤＮＡ取込み、ＤＮＡコートしたタングステン又は金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．、ＷＩ、ＵＳＡ）の使用によるなど、電気穿孔及び微粒子ボンバードメントが挙げられる。

抗体の作製に使用される宿主細胞は、使用する細胞型に応じて種々の培地で培養し得る。哺乳類細胞の培養には、Ｈａｍ’ｓ Ｆｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が好適である。本明細書で考察される他の細胞型の培養用培地は、当該技術分野において公知である。

タンパク質精製
作製／発現後、本開示のタンパク質は、当該技術分野において公知の方法を用いて精製される。かかる精製により、本開示のタンパク質は、非特異的タンパク質、酸、脂質、炭水化物などを実質的に含まないものとなる。一例において、タンパク質は、製剤中にあり得、ここで、製剤中のタンパク質の約９０％超（例えば、９５％、９８％又は９９％）は、本開示のタンパク質である。

本開示の単離タンパク質を得るには、限定はされないが、様々な高圧（又は高性能）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び非ＨＰＬＣポリペプチド単離プロトコル、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、相分離法、電気泳動分離、沈殿法、塩溶／塩析法、イムノクロマトグラフィー及び／又は他の方法を含めた標準的なペプチド精製方法が利用される。

一例において、標識を含む融合タンパク質の単離には、アフィニティー精製が有用である。アフィニティークロマトグラフィーを用いたタンパク質の単離方法は、当該技術分野において公知であり、例えばＳｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されている。例えば、標識に結合する抗体又は化合物（ポリヒスチジンタグの場合、これは、例えば、ニッケル－ＮＴＡであり得る）を固体支持体に固定化する。次に、結合が起こるのに十分な時間及び条件下において、タンパク質を含む試料を固定化された抗体又は化合物に接触させる。任意の未結合の又は非特異的に結合したタンパク質を洗浄によって除去した後、タンパク質を溶出させる。

抗体のＦｃ領域を含むタンパク質の場合、アフィニティー精製にプロテインＡ若しくはプロテインＧ又はこれらの修飾形態を使用することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖Ｆｃ領域を含む精製タンパク質の単離に有用である。プロテインＧは、全てのマウスＦｃアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される。

核酸ベースのＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達阻害薬
本開示の一例において、本開示の任意の例に係る本明細書に記載されるとおりの治療及び／又は予防方法は、ＶＥＧＦ－Ｂの発現を低減することを含む。例えば、かかる方法は、核酸の転写及び／又は翻訳を低減する化合物を投与することを含む。一例において、化合物は、核酸、例えばアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＰＮＡ、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡである。

アンチセンス核酸
用語「アンチセンス核酸」は、本明細書において本開示の任意の例に記載されるとおりのポリペプチドをコードする特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的であり、且つｍＲＮＡ翻訳などの転写後イベントに干渉する能力を有するＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はその誘導体（例えば、ＬＮＡ又はＰＮＡ）或いはこれらの組み合わせを意味すると解釈されるものとする。アンチセンス方法の使用は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｅｎｄｒｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９）を参照されたい）。

本開示のアンチセンス核酸は、生理条件下で標的核酸にハイブリダイズすることになる。アンチセンス核酸は、構造遺伝子若しくはコード領域に対応するか、又は遺伝子発現若しくはスプライシングの制御をもたらす配列に対応する配列を含む。例えば、アンチセンス核酸は、ＶＥＧＦ－Ｂをコードする核酸の標的コード領域、又は５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）若しくは３’－ＵＴＲ、或いはこれらの組み合わせに対応し得る。これは、部分的にイントロン配列（転写中又は転写後にスプライスアウトされ得る）に相補的であり得、例えば標的遺伝子のエクソン配列のみに相補的であり得る。アンチセンス配列の長さは、ＶＥＧＦ－Ｂをコードする核酸の少なくとも１９連続ヌクレオチド、例えば少なくとも５０ヌクレオチド、例えば少なくとも１００、２００、５００又は１０００ヌクレオチドでなければならない。遺伝子転写物全体に相補的な完全長配列が使用され得る。その長さは、１００～２０００ヌクレオチドであり得る。アンチセンス配列と標的転写物との同一性の程度は、少なくとも９０％、例えば９５～１００％でなければならない。

ＶＥＧＦ－Ｂに対する例示的アンチセンス核酸については、例えば、国際公開第２００３／１０５７５４号パンフレットに記載されている。

触媒核酸
用語「触媒核酸」は、個別的な基質を特異的に認識して、その基質の化学修飾を触媒するＤＮＡ分子若しくはＤＮＡ含有分子（当該技術分野において「デオキシリボザイム」若しくは「ＤＮＡザイム」としても知られる）又はＲＮＡ若しくはＲＮＡ含有分子（「リボザイム」若しくは「ＲＮＡザイム」としても知られる）を指す。触媒核酸中の核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（及びＲＮＡについてＵ）であり得る。

典型的には、触媒核酸は、標的核酸を特異的に認識するためのアンチセンス配列及び核酸切断酵素活性（本明細書では「触媒ドメイン」とも称される）を含む。本開示において有用なリボザイムの種類は、ハンマーヘッド型リボザイム及びヘアピン型リボザイムである。

ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するのに有用である。理論によって制限されることなしに、この技術は、目的の遺伝子のｍＲＮＡ又はその一部、この場合にはＶＥＧＦ－ＢをコードするｍＲＮＡと本質的に同一の配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在に依存する。好都合には、ｄｓＲＮＡは、組換えベクター宿主細胞において単一のプロモーターから作製することができ、ここで、センス及びアンチセンス配列には無関係の配列が隣接しているため、センス及びアンチセンス配列がハイブリダイズすると、無関係の配列がループ構造を形成したｄｓＲＮＡ分子を形成することが可能である。本開示に好適なｄｓＲＮＡ分子の設計及び作製は、特に国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、国際公開第９９／５３０５０号パンフレット、国際公開第９９／４９０２９号パンフレット及び国際公開第０１／３４８１５号パンフレットを考慮して十分に当業者の能力の範囲内にある。

ハイブリダイズするセンス及びアンチセンス配列の長さは、それぞれ少なくとも１９連続ヌクレオチド、例えば少なくとも３０又は５０ヌクレオチド、例えば少なくとも１００、２００、５００又は１０００ヌクレオチドでなければならない。遺伝子転写物全体に対応する完全長配列が使用され得る。長さは、１００～２０００ヌクレオチドであり得る。センス及びアンチセンス配列と標的転写物との同一性の程度は、少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば９５～１００％でなければならない。

例示的な低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９～２１連続ヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。例えば、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡから始まり、約３０～７０％（例えば、３０～６０％、例えば４０～６０％、例えば約４５％～５５％）のＧＣ含量を含み、例えば標準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定するとき、それを導入しようとする哺乳類のゲノム中にある標的以外のいかなるヌクレオチド配列とも高いパーセンテージ同一性を有しない。ＶＥＧＦ－Ｂの発現を低減する例示的ｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ又はＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから市販されている。

ＶＥＧＦ－Ｂの発現を低減する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も当該技術分野において公知であり、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている。

スクリーニングアッセイ
ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、例えば、以下に記載するとおりの、当該技術分野において公知の技法を用いて同定することができる。同様に、本明細書に記載される方法における使用に好適なＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達阻害薬の量も、例えば以下に記載するとおりの、当該技術分野において公知の技法を用いて決定又は推定することができる。

中和アッセイ
ＶＥＧＦ－Ｂに結合してシグナル伝達を阻害する化合物について、中和アッセイを用いることができる。

一例において、中和アッセイは、検出可能に標識された可溶性ＶＥＧＦ－Ｒ１の存在下又は非存在下でＶＥＧＦ－Ｂを化合物に接触させること、又はＶＥＧＦ－Ｒ１を発現する細胞又は可溶性ＶＥＧＦ－Ｒ１の存在下又は非存在下で検出可能に標識されたＶＥＧＦ－Ｂを化合物に接触させることを含む。次に、ＶＥＧＦ－Ｒ１に結合したＶＥＧＦ－Ｂのレベルを評価する。化合物の非存在下と比較した化合物の存在下における結合したＶＥＧＦ－Ｂのレベルの低減は、その化合物がＶＥＧＦ－Ｒ１へのＶＥＧＦ－Ｂ結合及び結果としてＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害することを示す。

別の中和アッセイが国際公開第２００６／０１２６８８号パンフレットに記載され、これは、固体支持体に固定化した第２のＩｇ様ドメインを含むＶＥＧＦ－Ｒ１の断片を、化合物とプレインキュベートした準飽和濃度の組換えＶＥＧＦ－Ｂと接触させることを含む。洗浄して未結合のタンパク質を除去した後、固定化したタンパク質を抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体に接触させて、結合した抗体の量（固定化したＶＥＧＦ－Ｂの指標となる）を決定する。化合物の非存在下におけるレベルと比較して結合抗体のレベルを低減する化合物は、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達の阻害薬と見なされる。

別の例において、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、増殖がＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達に依存する細胞、例えばヒトエリスロポエチン受容体の細胞内ドメインとＶＥＧＦ－Ｒ１の細胞外ドメインとを取り込むキメラ受容体を発現するように国際公開第２００６／０１２６８８号パンフレットに記載されるとおり修飾されたＢａＦ３細胞を用いて同定される。細胞は、ＶＥＧＦ－Ｂの存在下及び化合物の存在下又は非存在下で培養される。次に、細胞増殖は、標準方法、例えばコロニー形成アッセイ、チミジン取込み又は別の好適な細胞増殖マーカーの取込み（例えば、ＭＴＳ色素還元アッセイ）を用いて評価される。ＶＥＧＦ－Ｂの存在下で増殖レベルを低減する化合物は、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達の阻害薬と見なされる。

化合物は、ＶＥＧＦ－Ｂに結合するその能力に関して標準方法を用いて評価することもできる。タンパク質への結合の評価方法は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されるとおり、当該技術分野において公知である。かかる方法は、概して、化合物を標識すること及び固定化したＶＥＧＦ－Ｂにそれを接触させることを含む。洗浄によって非特異的に結合した化合物を除去した後、標識の量及び結果として結合した化合物の量を検出する。当然ながら、化合物が固定化され、及びＶＥＧＦ－Ｂが標識され得る。パニング型のアッセイも用い得る。代わりに又は加えて、表面プラズモン共鳴アッセイを用いることもできる。

発現アッセイ
ＶＥＧＦ－Ｂの発現を低減又は防止する化合物は、細胞を化合物に接触させて、ＶＥＧＦ－Ｂの発現レベルを決定することにより同定される。遺伝子発現を核酸レベルで決定するのに好適な方法は、当該技術分野において公知であり、例えば定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はマイクロアレイアッセイが挙げられる。発現をタンパク質レベルで決定するのに好適な方法も当該技術分野において公知であり、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、免疫蛍光法又はウエスタンブロッティングが挙げられる。

インビボアッセイ
本明細書に記載される化合物は、ＮＡＦＬＤの動物モデルで試験することができる。

例えば、高脂肪食を与えたマウス（例えば、Ｃ５７／ＢＬ６マウス）は、肥満、耐糖能異常、インスリン抵抗性、脂質異常症並びに脂質生成調節因子及び炎症誘発性サイトカインの発現の増加を伴うヒトＮＡＳＨに見られるのと同様の代謝的特徴を示す。

別の例において、コリン欠乏高脂肪食を与えたマウス（例えば、Ｃ５７／ＢＬ６マウス）は、肥満、耐糖能異常、インスリン抵抗性、免疫細胞浸潤及び衛星病変を含め、ヒトＮＡＳＨと同様の特徴を示す。これらのマウスはまた、続けて線維化及び肝硬変を発症し、長期的には肝細胞癌になる。

別の好適なマウスモデルは、高脂肪及び高フルクトースレベルを含む「西洋食」をマウスに与えることにより誘発される。これらのマウスは、肥満、インスリン抵抗性、脂質異常症、高血糖症及びＮＡＦＬＤを呈する。

他の好適な食事に基づくモデルには、低メチオニン食を与えたマウスが含まれる。

また、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）－１ｃ－トランスジェニックマウス及び１０番染色体上で欠失したホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）ヌルマウスなど、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの遺伝モデルも多数ある。これらのモデルでは、初めに肝脂肪症が起こり、続いて脂肪性肝炎が発症する。

医薬組成物及び治療方法
ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物（同義語、活性成分）は、非経口、局所、経口又は局所投与、エアロゾル投与又は経皮投与、予防的又は治療的処置に有用である。一例において、化合物は、非経口的に、例えば皮下又は静脈内に投与される。

投与する化合物の製剤は、投与経路及び選択の製剤（例えば、溶液、エマルション、カプセル）に従って異なることになる。投与する化合物を含む適切な医薬組成物は、生理学的に許容可能な担体中に調製することができる。溶液又はエマルションについて、好適な担体としては、例えば、水性又はアルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液、例えば生理食塩水及び緩衝媒体が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は固定油を挙げることができる。種々の適切な水性担体が、水、緩衝用水、緩衝生理食塩水、ポリオール類（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液及びグリシンを含め、当業者に公知である。静脈内媒体としては、様々な添加剤、保存剤又は体液、栄養素若しくは電解質補充液を挙げることができる（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照されたい）。組成物は、任意選択で、ｐＨ調整剤及び緩衝剤及び毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムなど、生理条件を近似するため必要に応じて薬学的に許容可能な補助物質を含有し得る。化合物は、当該技術分野において公知の凍結乾燥及び再構成技法に従って貯蔵のため凍結乾燥して、使用前に好適な担体で再構成し得る。

選択の媒体中における活性成分の最適濃度は、当業者に公知の手順に従って実験的に決定することができ、所望の最終的な医薬製剤に依存することになる。

本開示の化合物の投与に関する投薬量範囲は、所望の効果を生じさせるのに十分に大きいものである。例えば、組成物は、治療又は予防有効量の化合物を含む。

本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、対象のＶＥＧＦ－Ｂのシグナル伝達を阻害／低減／防止するのに十分な分量の化合物を意味すると解釈されるものとする。当業者は、かかる量が、例えば、化合物、及び／又は特定の対象、及び／又は治療下のＮＡＦＬＤのタイプ、及び／又は重症度に応じて異なり得ることを認識するであろう。従って、この用語は、本開示を具体的な分量、例えば化合物の重量又は個数に限定するものと解釈されてはならない。

本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、ＮＡＦＬＤ又はその合併症の１つ以上の症状を低減又は阻害するのに十分な分量の化合物を意味すると解釈されるものとする。

本明細書で使用されるとき、用語「予防有効量」は、ＮＡＦＬＤ又はその合併症の１つ以上の検出可能な症状の発生を予防するか、又は阻害するか、又は遅延させるのに十分な分量の化合物を意味すると解釈されるものとする。

一例において、化合物は、以下の効果：
・例えば、肝生検で評価されるとおりの、対象の肝臓への脂質蓄積、例えば中性脂質を低減又は予防すること、
・例えば、対象の肝臓内の免疫細胞数を低減することにより、対象の肝臓における炎症を低減又は予防すること、
・対象の肝臓におけるマロリー・デンク体、又は肝細胞風船化、又は炎症性病巣、又は衛星病変などのＮＡＦＬＤの病理学的変化の発生を低減又は予防すること、
・肝線維化及び／又は肝硬変を低減又は予防すること、
・肝細胞癌の形成を低減又は予防すること
の１つ以上を有するのに有効な量で投与される。

一例において、化合物は、ＮＡＦＬＤに罹患していない対象集団で見られるレベルまで対象の肝臓における脂質蓄積レベルを低減するのに十分な量で投与される。

投薬量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などの有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。概して、投薬量は患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度によって異なることになり、当業者が決定し得る。任意の合併症が生じた場合、個々の医師が投薬量を調整し得る。

投薬量は、１日間又は数日間にわたる１日１回以上の用量投与で約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇまで様々であり得る。

一部の例において、化合物は、後続（維持量）よりも高い初期（又は負荷）量で投与される。例えば、化合物は、約１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの初期量で投与される。次に、化合物は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの維持量で投与される。維持量は、７～３５日毎、例えば１４又は２１又は２８日毎に投与され得る。

一部の例において、用量漸増療法が用いられ、ここで、化合物は、初めに後続の用量よりも低い用量で投与される。この投薬療法は、当初有害事象を被っている対象の場合に有用である。

治療に十分に応答していない対象の場合、週に複数回の用量が投与され得る。代わりに又は加えて、より高い用量が投与され得る。

対象は、化合物への少なくとも約２回の曝露、例えば約２～６０回の曝露、及びより詳細には約２～４０回の曝露、最も詳細には約２～２０回の曝露など、２回以上の曝露又は投与セットを行うことにより、化合物で再治療され得る。

一例において、疾患の徴候又は症状が戻った場合、例えば微量アルブミン尿が進行した場合、任意の再治療が行われ得る。

別の例において、任意の再治療が所定の間隔で行われ得る。例えば、後続の曝露が様々な間隔、例えば約２４～２８週間、又は４８～５６週間、又はそれより長い間隔で投与され得る。例えば、かかる曝露は、それぞれ約２４～２６週間、又は約３８～４２週間、又は約５０～５４週間の間隔で投与される。

本開示の方法は、糖尿病及び／又は肥満の予防又は治療のための別の治療上有効な薬剤の投与と併せた本開示に係る少なくとも１つの化合物の共投与も含み得る。

一例において、本開示の１つ又は複数の化合物は、糖尿病の予防又は治療に現在使用されているか又は開発中である少なくとも１つの追加的な公知の化合物と組み合わせて使用される。かかる公知の化合物の例としては、限定はされないが、一般的な抗糖尿病薬、例えばスルホニル尿素（例えば、グリクラジド、グリピジド）、メトホルミン、グリタゾン（例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン）、ナトリウム－グルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害薬（例えば、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン）、食事性グルコース遊離剤（例えば、レパグリニド、ナテグリニド）、アカルボース及びインスリン（全ての天然に存在する、合成の及び修飾形態のインスリン、例えばヒト、ウシ又はブタ由来のインスリン、例えばイソフェン又は亜鉛中に懸濁されたインスリン及び誘導体、例えばインスリングルリジン、インスリンリスプロ、インスリンリスプロプロタミン、インスリングラルギン、インスリンデテミル又はインスリンアスパルトを含む）が挙げられる。

加えて、本開示の方法は、ＮＡＦＬＤに直接又は間接的に関係する別の疾患の治療のための少なくとも１つの他の治療剤の共投与も含み得る。本発明に係る１つ又は複数の化合物と共投与し得る薬剤の更なる例は、コレステロール及びトリグリセリド類を低減する化合物（例えば、フィブラート系薬（例えば、Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ（商標））及びＨＭＧ－ＣｏＡ阻害薬、例えばＬｏｖａｓｔａｔｉｎ（商標）、Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ（商標）、Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ（商標）、Ｌｅｓｃｏｌ（商標））、Ｌｉｐｉｔｏｒ（商標）、Ｍｅｖａｃｏｒ（商標））、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（商標）、Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ（商標）、Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ（商標）、Ｚｏｃｏｒ（商標）、Ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ（商標））等）、脂質の腸管吸収を阻害する化合物（例えば、エゼチミブ）、ニコチン酸、ファルネソイドＸ受容体作動薬（例えば、オベチコール酸、６α－エチルケノデオキシコール酸（６－ＥＣＤＣＡ））及びビタミンＤである。

前述から明らかなとおり、本開示は、有効量の第１の化合物及び第２の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の併用療法治療方法を提供し、ここで、前記化合物は、本開示の化合物（即ちＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達の阻害薬）であり、及び第２の化合物は、糖尿病又は肥満の予防又は治療用である。

本明細書で使用されるとき、語句「併用療法治療」にあるような用語「併用」は、第１の化合物を第２の化合物の存在下で投与することを含む。併用療法治療方法には、第１、第２、第３又は追加の化合物が共投与される方法が含まれる。併用療法治療方法には、第１又は追加の化合物が第２又は追加の化合物の存在下で投与される方法も含まれ、ここで、第２又は追加の化合物は、例えば、予め投与され得る。併用療法治療方法は、異なる行為者によって段階的に実行され得る。例えば、１人の行為者が対象に第１の化合物を投与し得、且つ第２の行為者がその対象に第２の化合物を投与し得、これらの投与ステップは、第１の化合物（及び／又は追加の化合物）が第２の化合物（及び／又は追加の化合物）の存在下における投与後である限り、同じ時点で、又はほぼ同じ時点で、又は隔たった時点で実行され得る。行為者及び対象は、同じ実体（例えば、ヒト）であり得る。

一例において、本開示は、対象のＮＡＦＬＤを治療又は予防する方法も提供し、この方法は、本開示の少なくとも１つの化合物を含む第１の医薬組成物及び１つ以上の追加の化合物を含む第２の医薬組成物を対象に投与することを含む。

一例において、本開示の方法は、ＮＡＦＬＤに罹患しており、且つ別の治療（例えば、糖尿病に対する治療）を受けている対象にＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達の阻害薬を投与することを含む。

キット
本開示の別の例は、上記に記載したとおりのＮＡＦＬＤの治療に有用な化合物を含むキットを提供する。

一例において、キットは、（ａ）任意選択で薬学的に許容可能な担体又は希釈剤中にある、本明細書に記載されるとおりのＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を含む容器、及び（ｂ）対象のＮＡＦＬＤ又はその合併症の治療に関する説明を含む添付文書を含む。

本開示のこの例において、添付文書は、容器上にあるか、又は容器に付属している。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなど、種々の材料で形成され得る。容器は、ＮＡＦＬＤの治療に有効な組成物を保持又は収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針で穿通可能な栓を有する静注バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物である。ラベル又は添付文書は、提供されている化合物及び任意の他の医薬の投与量及び投与間隔に関する具体的な手引きと共に、その組成物が治療に適格な対象、例えばＮＡＦＬＤを有するか又はそれに罹り易い対象の治療に使用されることを指示する。キットは、薬学的に許容可能な希釈緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及び／又はデキストロース溶液が入った追加の容器を更に含み得る。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含め、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得る。

キットは、第２の医薬を含む容器を任意選択で更に含み得、ここで、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、第１の医薬であり、及びこの物品は、第２の医薬による有効量での対象の治療に関する添付文書上の説明を更に含む。第２の医薬は、上記に示したもののいずれでもあり得る。

本開示は、以下の非限定的な例を含む。

実施例１：ＶＥＧＦ－Ｂ欠損マウスは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症に抵抗性である
ＶＥＧＦ－Ｂ欠損糖尿病マウスは、肝損傷から保護される
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＣ５７ＢＬ／６－Ｖｅｇｆｂ－／－マウスに高脂肪食（脂肪由来カロリー６０％）を３０週間与えた。年齢及び性別対応Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスに低脂肪対照食（通常の固形飼料、脂肪由来カロリー１０％）を３０週間与えた。隔週で１日のうちの同じ時点において、血糖値を安定化させる手段として２時間絶食させた後、血中グルコースを計測した。尾の先端を切断して、グルコースメーターで一滴の血液を計測した。終了時点で血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）値を計測した。

図１Ａ及び図１Ｂは、高脂肪食（ＨＦＤ）給餌マウスが年齢対応固形飼料給餌マウスと比較して血糖値及び体重の上昇を呈したことを示す（それぞれ図１Ａ及び図１Ｂ）。

図１Ｃは、ＨＦＤ給餌マウスでは血清ＡＬＡＴ値が１５倍増加したが、年齢対応ＨＦＤ給餌ＷＴマウスと比較して、ＨＦＤ給餌ＶＥＧＦ－Ｂ欠損マウスでは血清ＡＬＡＴ値が減少したことを示す。

これらのデータは、ＨＦＤ給餌マウスにおいてＶｅｇｆｂを除去すると、高血糖症が標的となることなく肝損傷が減少することを実証している。

Ｖｅｇｆｂの欠失は、ＨＦＤ給餌マウスの肝脂質蓄積を低減する
ＨＦＤ給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-及び固形飼料給餌ＷＴマウスから摘出した肝臓に対してオイルレッドＯ（ＯＲＯ）分析を実施した。簡潔に言えば、肝臓を解剖してドライアイスで急速凍結し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。低温切片（１２μｍ）をＯＲＯワーキング溶液（２．５ｇオイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４００ｍｌ ９９％イソプロパノール中に溶解し、更にＨ₂Ｏで６：１０希釈し、２２μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でろ過した）に５分間浸漬し、ヘマトキシリン溶液中に３秒間沈め、続いてＬｉＣＯ₃中に短時間沈め、水道水の流水下で１０分間リンスした後、それらをマウントした。各切片内におけるＯＲＯ及びヘマトキシリン染色した、１動物につき少なくとも１０フレームを明視野顕微鏡法（Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓ＯＲＯ染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いて脂肪滴量を定量化した。

摘出した肝臓において脂肪酸シンターゼ（Ｆａｓｎ）の発現レベルを検出した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して肝臓から全ＲＮＡを抽出して精製した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して０．５～１μｇ全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ）リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーにおいてＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキットマスターミックス（２×）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の指示に従って使用してリアルタイム定量ＰＣＲを実施した。発現レベルは、Ｌ１９及びβ２ミクログロブリンの発現に対して正規化した。

ＶＥＧＦ－Ｂの発現が低減したＨＦＤ給餌マウスでは肝脂肪滴蓄積及び構造が改善した。詳細には、Ｖｅｇｆｂ欠損ＨＦＤ給餌マウスの肝切片では、ＷＴ ＨＦＤ給餌マウスと比較して脂肪滴の数及びサイズが減少した。

図２は、ＨＦＤ給餌マウスにおいてＶＥＧＦ－Ｂレベルが低減すると、肝中性脂質含量が減少することを示している。

ＨＦＤ給餌マウスにおけるＶｅｇｆｂの欠失は、肝脂肪症の発症を予防する
分析にＨＦＤ給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-及び固形飼料給餌ＷＴマウスを使用した。肝臓を解剖し、４％ＰＦＡで２４時間固定し、続いて標準的手順を用いてパラフィン包埋処理を行い、６μｍ切片を調製した。簡潔に言えば、抗原回復溶液ｐＨ６（Ｄａｋｏ ＃Ｓ２３６７）を使用して抗原回復を実施し、９８℃で１０分間加熱した。切片を一次抗体：モルモット抗アディポフィリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）又はモルモット抗ｔｉｐ４７（Ｐｒｏｇｅｎ）抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）を加える前に、試料をビオチン化ロバ抗モルモット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と共に室温で１時間インキュベートした。各切片内におけるアディポフィリン又はｔｉｐ４７染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓のｉ）アディポフィリン染色（ピクセル²／μｍ²）又はｉｉ）ｔｉｐ４７染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いてそれぞれの染色量を定量化した。

固形飼料給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスにおけるアディポフィリン（ｐｌｉｎ２ａ）の発現も上記に記載される方法を用いて決定した。

図３は、ＰＡＴタンパク質、アディポフィリン（Ａ、Ｃ）及びマンノース－６－リン酸受容体結合タンパク質１（ｔｉｐ４７；Ｂ）の発現によって計測したとき、ＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスの肝脂質含量がＨＦＤ給餌ＷＴマウスと比較して５～１０倍低減することを示す。ＶＥＧＦ－Ｂ発現が減少すると肝臓の形態が維持され、ＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスではＨＦＤ給餌ＷＴマウスと比較して脂肪滴が小さくなる。これらのデータは、ＨＦＤ給餌マウスにおいてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減すると肝脂肪症の発症が予防されること、及びＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達経路が非アルコール性脂肪性肝疾患の治療の好適な標的であることを示している。

ＨＦＤ給餌マウスにおけるＶｅｇｆｂの欠失は、肝炎症の発症を予防する
分析にＨＦＤ給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-及び通常の固形飼料給餌ＷＴマウスを使用した。肝臓を摘出し、ドライアイスで急速凍結した。肝生検をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。包埋後、１２μｍ切片を調製し、氷冷４％ＰＦＡで後固定し、その後、ＣＤ４５又はＦ４／８０に関して免疫染色した。簡潔に言えば、切片を一次ラット抗ＣＤ４５（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びラット抗Ｆ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体と共に４℃で１２時間インキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）を加え、切片を室温で１時間更にインキュベートした後、それらを顕微鏡法のために調製した。各切片内におけるＣＤ４５又はＦ４／８０染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓のｉ）ＣＤ４５染色（ピクセル²／μｍ²）又はｉｉ）Ｆ４／８０染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いて各染色量を定量化した。

固形飼料給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスにおける単球走化性タンパク質１（ｍｃｐ１）の発現も上記に記載される方法を用いて決定した。

図４に示すとおり、脂肪肝における炎症細胞集団は、ＨＦＤ給餌によって２～３倍増加した（図４Ａ及び図４Ｂ）。ＨＦＤ給餌マウスでは、肝炎症の増加がｍｃｐ１の上方制御によって確認された（図４Ｃ）。ＶＥＧＦ－Ｂの発現が低減したＨＦＤ給餌マウスでは肝脂肪症及び炎症細胞数の両方が減少した（図４Ａ～図４Ｃ）。

ＨＦＤ給餌マウスにおけるＶｅｇｆｂの欠失は、ＮＡＳＨ及びＮＡＳＨ関連病変を低減する
分析にＨＦＤ給餌ＷＴ、ＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-及び固形飼料給餌ＷＴマウスを使用した。肝臓を解剖し、４％ＰＦＡで２４時間後固定し、続いて標準的手順を用いてパラフィン包埋処理を行った。包埋後、６μｍ切片を調製し、製造者の指示に従ってヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）（Ｓｉｇｍａ）で染色した。各切片内におけるＨ＆Ｅ染色した１動物当たり少なくとも２０フレームを明視野顕微鏡法（Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により４０倍の倍率で撮影し、Ｈ＆Ｅ染色切片の風船化肝細胞、ＭＤＢ形成、炎症性病巣及び衛星病変の存在に関して分析した。スコアリングは、Ｈ＆Ｅ染色切片の各フレームにおける風船細胞、ＭＤＢ形成／炎症性病巣又は衛星病変の数に基づいた。各動物について、Ｈ＆Ｅ染色肝切片に同定された全ての風船化肝細胞、ＭＤＢ、炎症性病巣及び衛星病変の平均を計算した。ＮＡＳＨ総合スコアを各群内平均の合計として計算した。

表１に示されるとおり、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓は、風船化肝細胞及びＭＤＢ形成、並びに程度は少ないが免疫細胞浸潤及び衛星病変を呈した。ＨＦＤ給餌マウスにおけるＶＥＧＦ－Ｂレベルの低減により、これらのヒトＮＡＳＨ関連病変の出現が減少した。

図５は、ＨＦＤ給餌マウスにおいてＶＥＧＦ－Ｂレベルが低減すると、総合ＮＡＳＨスコアがＨＦＤ給餌マウスと比較して５０％超低減することを示す。

実施例２：中和抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の進行を治療又は予防する
抗体媒介性ＶＥＧＦ－Ｂ阻害は、ＨＦＤ給餌マウスの肝機能に中程度の影響を与える
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）に高脂肪食（脂肪由来カロリー６０％）を３０週間与えた。年齢及び性別対応Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスに低脂肪対照食（通常の固形飼料、脂肪由来カロリー１０％）を３０週間与えた。１１週目に抗体処置を開始し、マウスに４００μｇ ２Ｈ１０（中和抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体）又はアイソタイプ対応対照抗体を週２回、２０週間にわたって腹腔内注射した。隔週でマウスの食後血糖値を２時間の絶食後にモニタした。尾静脈から採取した血液でＢａｙｅｒ Ｃｏｎｔｏｕｒグルコースメーターを使用してグルコース測定を実施した。終了時点の血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）値を測定した。

図６Ａ及び図６Ｂは、抗体２Ｈ１０で治療的に処置したＨＦＤ給餌マウスの血糖値及び体重を示す。

図６Ｃ及び図６Ｄは、抗体２Ｈ１０で治療的に処置したＨＦＤ給餌マウスの肝重量及び肝重量の対体重比を示す。

図６Ｄは、抗体２Ｈ１０で治療的に処置したＨＦＤ給餌マウスのＡＬＡＴ値の血清分析を示す。

これらのデータは、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体処置（２Ｈ１０）を用いてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減することにより、ＨＦＤ給餌に起因する肝機能の低減を予防し得ることを示唆している。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、ＨＦＤ給餌マウスの肝脂質蓄積を低減する
２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体で２０週間処置した３０週齢の固形飼料給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌マウスから摘出した肝臓に対してオイルレッドＯ（ＯＲＯ）分析を実施した。肝臓を採取し、ドライアイスで急速凍結し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。低温切片（１２μｍ）をＯＲＯワーキング溶液（２．５ｇ ＯＲＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４００ｍｌ ９９％イソプロパノール中に溶解し、更にＨ２Ｏで６：１０希釈し、２２μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でろ過した）に５分間浸漬した。その後、切片をヘマトキシリン溶液中に３秒間沈め、続いてＬｉＣＯ₃中に沈め、水道水の流水下で１０分間リンスした後、それらをマウントした。染色切片を明視野顕微鏡法で調べた。各切片内におけるＯＲＯ及びヘマトキシリン染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓ＯＲＯ染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いて脂肪滴量を定量化した。

脂肪酸シンターゼ（ｆａｓｎ）の発現も上記に記載される方法を用いて決定した。

図７に示すとおり、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体処置を受けたＨＦＤ給餌マウスにおいて、ＯＲＯ染色量が低減した。これらのデータ及び染色切片の分析は、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体で処置したＨＦＤ給餌マウスにおいて脂肪滴の数及びサイズの両方が減少したこと、及びＨＦＤ給餌マウスにおける２Ｈ１０の投与が肝中性脂質蓄積から保護することを示している。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、肝脂肪症の発症を予防する
２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体で２０週間処置した３０週齢のＨＦＤ給餌マウスから肝臓を採取し、４％ＰＦＡで２４時間固定し、包埋して、免疫染色のために６μｍ切片を調製した。手短に言えば、抗原回復溶液ｐＨ６（Ｄａｋｏ ＃Ｓ２３６７）を使用して抗原回復を実施し、９８℃で１０分間加熱した。切片を一次抗体：モルモット抗アディポフィリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）又はモルモット抗ｔｉｐ４７（Ｐｒｏｇｅｎ）抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）を加える前に、試料をビオチン化ロバ抗モルモット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と共に室温で１時間インキュベートした。各切片内におけるアディポフィリン又はｔｉｐ４７染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓のｉ）アディポフィリン染色（ピクセル²／μｍ²）又はｉｉ）ｔｉｐ４７染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いてそれぞれの染色量を定量化した。

アディポフィリン（ｐｌｉｎ２ａ）の発現も上記に記載される方法を用いて決定した。

図８は、ＨＦＤ給餌マウスにおける２Ｈ１０を用いた抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体処置が脂肪肝におけるＰＡＴタンパク質の発現を低減したことを示す。抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体処置では、肝脂質含量は、固形飼料給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスで達成されるのと同様のレベルまで低減した。肝臓の発現解析により、ＨＦＤ給餌マウスにおける２Ｈ１０処置によってｐｌｉｎ２のｍＲＮＡ転写物レベルが減少したとおり、肝脂肪症の発症に対する影響が確認された。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、ＨＦＤ給餌マウスにおける肝炎症の発症を予防する
２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体で２０週間処置した３０週齢のＨＦＤ給餌マウスから肝臓を採取し、ドライアイスで急速凍結し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。包埋後、１２μｍ切片を調製し、氷冷４％ＰＦＡで１０分間後固定し、その後、ＣＤ４５又はＦ４／８０に関して免疫染色した。簡潔に言えば、切片を一次ラット抗ＣＤ４５（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びラット抗Ｆ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体と共に４℃で１２時間インキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）を加え、切片を室温で１時間更にインキュベートした後、それらを顕微鏡法のために調製した。各切片内におけるＣＤ４５又はＦ４／８０染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓のｉ）ＣＤ４５染色（ピクセル²／μｍ²）又はｉｉ）Ｆ４／８０染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いてそれぞれの染色量を定量化した。

単球走化性タンパク質１（ｍｃｐ１）の発現も上記に記載される方法を用いて決定した。

図９は、抗ＶＥＧＦ抗体で治療的に処置したＨＦＤ給餌マウスの肝臓においてＣＤ４５（Ａ）のレベル及びＦ４／８０（Ｂ）レベルが低減したことを示す。ＨＦＤ給餌マウスを抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体２Ｈ１０で処置すると、肝炎症細胞数は、固形飼料給餌ＷＴ及びＨＦＤ給餌Ｖｅｇｆｂ^-/-マウスと同様のレベルまで低減した。ｍｃｐ１の発現レベルも抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体処置によって低減した。従って、これらのデータは、抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体による治療処置がＮＡＳＨの主要病変の発症を予防することを示している。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、ＮＡＳＨ及びＮＡＳＨ関連病変を低減する
２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体で２０週間処置した３０週齢のＨＦＤ給餌マウスから肝臓を採取し、４％ＰＦＡで２４時間固定し、包埋して６μｍ切片を調製し、製造者の指示に従ってヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）（Ｓｉｇｍａ）で染色した。各切片内におけるＨ＆Ｅ染色した１動物当たり少なくとも２０フレームを明視野顕微鏡法（Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により４０倍の倍率で撮影した。各動物について、Ｈ＆Ｅ染色肝切片に同定された全ての風船化肝細胞、ＭＤＢ、炎症性病巣及び衛星病変の平均を計算した。ＮＡＳＨ総合スコアを各群内平均の合計として計算した。

表２に示されるとおり、ＨＦＤ給餌マウスの肝臓は、風船化肝細胞、ＭＤＢ形成、並びに程度は少ないが免疫細胞浸潤及び衛星病変を呈した。抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体による治療的処置により、これらのヒトＮＡＳＨ関連病変の出現が減少した。

図１０は、ＨＦＤ給餌マウスにおいて２Ｈ１０抗体処置を用いてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減すると、総合ＮＡＳＨスコアが５０％超低減したことを示す。

実施例３：短期コリン欠乏高脂肪（ＣＤ）食におけるＶＥＧＦ－Ｂ欠損マウスは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症に抵抗性である
Ｖｅｇｆｂの欠失は、グルコース及びインスリン感受性を増加させる
５週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス及び年齢対応Ｖｅｇｆｂ^+/-及びＶｅｇｆｂ^-/-マウスにコリン欠乏高脂肪（ＣＤ）食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ；Ｄ０５０１０４０２）を５ヵ月間与えた（ＣＤ５）。本試験中、体重（ＢＷ）及び血中グルコース（ＢＧ）値を記録した。ＢＧの記録前２時間にわたって絶食させた。尾静脈から採取した血液でＢａｙｅｒ Ｃｏｎｔｏｕｒグルコースメーターを使用してグルコース測定を実施した。ＣＤ食において１７週間後、非飢餓マウス又は実験前に２時間絶食させたマウスに対して腹腔内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）及び腹腔内インスリン負荷試験（ＩＰＩＴＴ）を実施した。負荷試験について、動物に１ｍｇグルコース／ｇ ＢＷ（ＩＰＧＴＴ）及び０．７５ｍＵインスリン／ｇ ＢＷ（ＩＰＩＴＴ）を腹腔内注射した。

短期ＣＤは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて体重増加、血糖値、グルコース不耐性及びインスリン抵抗性の増加につながる。ＣＤ食におけるＣ５７ＢＬ／６マウスでＶｅｇｆｂを除去しても、体重又は高血糖症の発症は変わらなかった。しかしながら、ＣＤ食におけるＣ５７ＢＬ／６マウスで遺伝的手段によってＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減すると、耐糖能及びインスリン感受性に幾らかの効果があったが、しかし、高血糖は標的とならなかった。

図１１は、短期コリン欠乏高脂肪（ＣＤ）食におけるマウスでＶｅｇｆｂを欠失させても、体重（Ａ）又は食後血糖値（Ａ）に影響はなかったが、グルコース及びインスリン感受性（Ｂ及びＣ）が増加したことを示す。

Ｖｅｇｆｂの欠失は、肝損傷から保護する
分析にＣ５７ＢＬ／６、Ｖｅｇｆｂ^-/-及びＶｅｇｆｂ^+/-ＣＤ給餌マウスを使用した。肝臓を解剖して秤量し、心穿刺により全血を採取した。血液を１４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、血清を分離して、－８０℃でアリコートに分けて凍結した。スウェーデン国ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）のスウェーデン農業科学大学（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）でアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）血清値が分析された。

短期ＣＤは、肝傷害を誘発し、Ｖｅｇｆｂ^+/-及びＶｅｇｆｂ^-/-マウスと比較したとき、ＷＴマウスにおいて血清ＡＬＡＴ値が増加した。

図１２Ａは、短期ＣＤ食におけるマウスでＶｅｇｆｂを欠失させても、肝重量又は肝重量／体重比に何ら効果がなかったことを示す。

図１２Ｂは、ＣＤ給餌ＷＴマウスで血清ＡＬＡＴ値が増加したが、一方、ＣＤ給餌ＶＥＧＦ－Ｂ欠損マウスでは年齢対応ＣＤ給餌ＷＴマウスと比較して血清ＡＬＡＴ値が低減したことを示す。

これらのデータは、ＣＤ給餌マウスにおいてＶｅｇｆｂを除去すると肝損傷が低減し、高血糖症が標的とならないことを実証している。

Ｖｅｇｆｂの欠失は、肝脂質蓄積を減少させる
分析にＣ５７ＢＬ／６、Ｖｅｇｆｂ^-/-及びＶｅｇｆｂ^+/-ＣＤ給餌マウスを使用した。肝臓を解剖し、急速凍結して、心穿刺により全血を採取した。血液を１４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、血清を分離し、－８０℃でアリコートに分けて凍結した。

摘出した肝臓に対してオイルレッドＯ（ＯＲＯ）分析を実施した。手短に言えば、肝生検をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。低温切片（１２μｍ）をオイルレッドＯワーキング溶液（２．５ｇオイルレッドＯ（ＯＲＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４００ｍｌ ９９％イソプロパノール中に溶解し、更にＨ₂Ｏで６：１０希釈し、２２μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でろ過したものに５分間浸漬した。その後、切片をヘマトキシリン溶液中に３秒間沈め、続いてＬｉＣＯ₃中に短時間沈め、水道水の流水下で１０分間リンスした後、それらをマウントした。染色切片を明視野顕微鏡法で調べた。各切片内におけるＯＲＯ及びヘマトキシリン染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓ＯＲＯ染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いて脂肪滴量を定量化した。

市販のキットを使用して非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ；Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、β－ヒドロキシブチレート（Ｓｔａｎｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びトリグリセリド類（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を酵素測定した。

短期ＣＤは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の発症につながった。ＣＤ食は、ＯＲＯ分析によって検出されるとおり、肝中性脂質含量の劇的な増加及び付随する肝機能の低減を誘発した（図１２）。ＣＤ食におけるＣ５７ＢＬ／６マウスでＶｅｇｆｂを遺伝子除去すると、肝脂質蓄積が減少した。脂肪滴は、数及びサイズの両方が低減した。短期ＣＤは、脂質異常症につながり、ＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減すると、ケトン体（ＫＢ）、ＮＥＦＡ及びトリグリセリド類（ＴＧ）の血漿レベルが減少した。

図１３は、Ｖｅｇｆｂの欠失が、短期ＣＤ食におけるマウスで肝脂質蓄積を低減し、肝脂肪症が標的となったことを示す。

Ｖｅｇｆｂの欠失は、肝炎症の発症を予防する
分析にＣ５７ＢＬ／６、Ｖｅｇｆｂ^-/-及びＶｅｇｆｂ^+/-ＣＤ給餌マウスを使用した。肝生検をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。包埋後、１２μｍ切片を調製し、氷冷４％ＰＦＡで後固定し、その後、ＣＤ４５又はＦ４／８０に関して免疫染色した。簡潔に言えば、切片を一次ラット抗ＣＤ４５（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びラット抗Ｆ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体と共に４℃で１２時間インキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）を加え、切片を室温で１時間更にインキュベートした後、それらを顕微鏡法のために調製した。各切片内におけるＣＤ４５又はＦ４／８０染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓のｉ）ＣＤ４５染色（ピクセル²／μｍ²）又はｉｉ）Ｆ４／８０染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いてそれぞれの染色量を定量化した。

短期ＣＤを用いると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて全面的な非アルコール性脂肪性肝炎疾患（ＮＡＳＨ）、即ち異常な肝脂質蓄積及び炎症を誘発することができる。ＣＤ食における、Ｖｅｇｆｂをホモ接合性又はヘテロ接合性に除去したマウスでは、肝脂肪症（図１３及び図１４）及び炎症細胞数の両方が減少した。これらのデータは、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達の減少を用いてＮＡＳＨの主要病変の発症を予防し得ることを示唆している。

図１４は、短期ＣＤ食におけるマウスでのＶｅｇｆｂの欠失が、ＣＤ４５及びＦ４／８０発現の低減によって示されるとおり、肝炎症の発症を予防したことを示す。

実施例４：中和抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体は、短期コリン欠乏高脂肪（ＣＤ）食におけるマウスで非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の進行を治療又は予防する
治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、体重、血糖値、耐糖能又はインスリン感受性に影響を与えない
５週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＤ食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ；Ｄ０５０１０４０２）を５ヵ月間与えた。１２週目に抗体処置を開始し、マウスを２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体で１０週間処置した。動物に８０μｇ用量の抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体を週２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。本試験には、年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴマウスも含めた。本試験中、ＢＷ及びＢＧレベルを記録した。ＢＧの記録前２時間にわたって絶食させた。尾静脈から採取した血液でＢａｙｅｒ Ｃｏｎｔｏｕｒグルコースメーターを使用してグルコース測定を実施した。ＣＤ食において１７週間後、非飢餓マウス又は実験前に２時間絶食させたマウスに対してＩＰＧＴＴ及びＩＰＩＴＴを実施した。負荷試験について、動物に１ｍｇグルコース／ｇ ＢＷ（ＩＰＧＴＴ）及び０．７５ｍＵインスリン／ｇ ＢＷ（ＩＰＩＴＴ）を腹腔内注射した。

抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置は、短期ＣＤにおける体重又はグルコース及びインスリン感受性に影響を与えなかった。これらのデータは、Ｖｅｇｆｂ^-/-マウス及びＷＴマウスと比較したとき、ＣＤ食給餌Ｖｅｇｆｂ^+/-で観察される耐糖能及びインスリン感受性の改善がＶｅｇｆｂ^-/-マウスモデルに関連する発症効果に結び付けられ得ることを示している。

図１５は、短期ＣＤ食におけるマウスでの（２Ｈ１０を用いる）抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置が（Ａ）体重、血糖値、（Ｂ）耐糖能又は（Ｃ）インスリン感受性に影響を与えなかったことを示す。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、肝機能を改善する
５週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＤ食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ；Ｄ０５０１０４０２）を５ヵ月間与えた。１２週目に抗体処置を開始し、マウスを２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体で１０週間処置した。動物に８０μｇ用量の抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体を週２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。本試験には、年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴも含めた。動物をイソフルラン麻酔薬で犠牲にし、肝臓を解剖して秤量し、心穿刺により全血を採取した。血液を１４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、血清を分離して、－８０℃でアリコートに分けて凍結した。スウェーデン国ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）のスウェーデン農業科学大学（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）でＡＬＡＴ血清値が分析された。

抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置した短期ＣＤ食におけるＣ５７ＢＬ／６マウスでは、血清ＡＬＡＴ値の低減によって計測されるとおり、２Ｈ１０療法が肝損傷を予防した。

図１６は、肝重量及び肝重量の対体重比（Ａ）及びＡＬＡＴ値の血清分析（Ｂ）によって示されるとおり、短期ＣＤ食におけるマウスでの（２Ｈ１０を用いる）抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置が肝機能を改善したことを示す。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、肝脂質蓄積を低減させる
分析にＣＤ給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス並びに年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴを使用した。動物は、上記に記載したとおり、２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体処置を受けた。

先述のとおり摘出した肝臓に対してオイルレッドＯ（ＯＲＯ）分析を実施した。短期ＣＤにおけるＣ５７ＢＬ／６マウスで２Ｈ１０を用いてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減することにより、肝脂肪症が減少し、脂肪滴が数及びサイズの両方について低減された。

分離血清に関して市販のキットを使用して非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ；Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、β－ヒドロキシブチレート（Ｓｔａｎｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びトリグリセリド類（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を酵素測定した。抗ＶＥＧＦ－Ｂ療法は、ＣＤ食におけるマウスでのケトン類（ＫＢ）、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）及びトリグリセリド類（ＴＧ）の血漿レベルを正常化した。

図１７は、短期ＣＤ食におけるＣ５７ＢＬ／６マウスでの抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）により肝脂質蓄積が低減したことを示す。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、肝脂肪症の発症を予防する
分析にＣＤ給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス並びに年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴを使用した。動物は、上記に記載したとおり、２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体処置を受けた。

摘出した肝臓に対して免疫染色を実施した。簡潔に言えば、動物をイソフルラン麻酔薬で犠牲にして肝臓を解剖し、４％ＰＦＡで２４時間固定し、続いて標準的手順を用いてパラフィン包埋処理を行い、６μｍ切片を調製した。抗原回復溶液Ｐｈ６（Ｄａｋｏ ＃Ｓ２３６７）を使用して抗原回復を実施し、９８℃で１０分間加熱した。切片をモルモット抗アディポフィリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）と共に４℃で一晩インキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）を加える前に、試料をビオチン化ロバ抗モルモット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）と共に室温で１時間インキュベートした。各切片内におけるアディポフィリン又はｔｉｐ４７染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓アディポフィリン染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いてそれぞれの染色量を定量化した。

短期ＣＤにおけるＣ５７ＢＬ／６マウスで２Ｈ１０を用いてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減することにより、肝脂肪症及びＮＡＳＨの発症が予防された。抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体処置により、ＣＤ食における対照処置マウスと比較したとき、肝脂質含量が５０％超低減した。

図１８は、短期ＣＤ食におけるＣ５７ＢＬ／６マウスでの（２Ｈ１０を用いる）抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置が、肝臓のアディポフィリン発現の低減によって示されるとおり、肝脂肪症の発症を予防したことを示す。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、肝炎症の発症を予防する
分析にＣＤ給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス並びに年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴを使用した。動物は、上記に記載したとおり、２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体処置を受けた。

摘出した肝臓に対して免疫染色を実施した。簡潔に言えば、動物をイソフルラン麻酔薬で犠牲にし、肝臓を解剖してドライアイスで急速凍結した。肝生検をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。包埋後、１２μｍ切片を調製し、氷冷４％ＰＦＡで１０分間後固定し、その後、ＣＤ４５又はＦ４／８０に関して免疫染色した。簡潔に言えば、切片を一次ラット抗ＣＤ４５（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びラット抗Ｆ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体と共に４℃で１２時間インキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）を加え、切片を室温で１時間更にインキュベートした後、それらを顕微鏡法のために調製した。各切片内におけるＣＤ４５又はＦ４／８０染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓のｉ）ＣＤ４５染色（ピクセル²／μｍ²）又はｉｉ）Ｆ４／８０染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いてそれぞれの染色量を定量化した。

ＣＤ食におけるマウスで抗ＶＥＧＦ－Ｂ療法として２Ｈ１０を用いると、肝炎症細胞量が固形飼料給餌マウスと同様のレベルまで減少した。これらのデータは、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達の（２Ｈ１０処置を用いた）減少を用いてＮＡＳＨの発症における炎症期を標的にし得ることを示している。

図１９は、短期ＣＤ食におけるマウスでの（２Ｈ１０を用いる）抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置が、（Ａ）ＣＤ４５及び（Ｂ）Ｆ４／８０発現の低減によって示されるとおり、肝炎症の発症を予防することを示す。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、軽度肝線維化の発症を予防する
分析にＣＤ給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス並びに年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴを使用した。動物は、上記に記載したとおり、２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体処置を受けた。

摘出した肝臓に対してマッソントリクローム染色を実施した。簡潔に言えば、動物をイソフルラン麻酔薬で犠牲にした。肝臓を解剖し、４％ＰＦＡで２４時間後固定し、続いて標準的手順を用いてパラフィン包埋処理を行った。包埋後、６μｍ切片を調製し、マッソントリクローム（ＭＴ）（Ｓｉｇｍａ）で製造者の指示に従って染色した。各切片内におけるＭＴ染色した１動物当たり少なくとも２０フレームを明視野顕微鏡法（Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓のｉ）ＭＴ＋染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いて線維化量を定量化した。

短期ＣＤを用いて線維化ＮＡＳＨを誘発することができる。線維化ＮＡＳＨは、ＮＡＳＨのより進行した状態と考えられ、肝硬変及び肝臓関連死の主因である。ＣＤ食は、実質に検出される、ある場合には肝小葉全体にわたって「橋状」のパターンでも存在する線維化と併せて、正常な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）沈着の指標である血管壁に明らかとなる軽度肝線維化を誘発する。ＣＤ食におけるマウスで２Ｈ１０を用いてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減すると、線維化の発症が減少したことから、線維化ＮＡＳＨの治療に抗ＶＥＧＦ－Ｂ療法を用い得ることが示唆される。

図２０は、肝切片のマッソントリクローム染色を用いて、短期ＣＤ食におけるマウスでの（２Ｈ１０を用いる）抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置が線維化の発症を予防することを示す。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、ＮＡＳＨ及びＮＡＳＨ関連病変を低減する
分析にＣＤ給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス並びに年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴを使用した。動物は、上記に記載したとおり、２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体処置を受けた。

肝臓を解剖し、４％ＰＦＡで２４時間後固定し、続いて標準的手順を用いてパラフィン包埋処理を行った。包埋後、６μｍ切片を調製し、製造者の指示に従ってヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）（Ｓｉｇｍａ）で染色した。各切片内におけるＨ＆Ｅ染色した１動物当たり少なくとも２０フレームを明視野顕微鏡法（Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影し、肝細胞の変性、ＭＤＢ形成の形成、炎症性病巣及び衛星病変の存在に関して分析した。総合スコアは、Ｈ＆Ｅ染色肝切片における同定された全ての風船肝細胞、ＭＢＤ、炎症性病巣及び衛星病変の量である。

表３に示されるとおり、ＣＤ給餌マウスの肝臓は、肝細胞の風船化、マロリー・デンク体の形成、炎症性病巣及び衛星病変など、ヒトＮＡＳＨの特徴の幾つかを示した。抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体による治療的処置により、これらのヒトＮＡＳＨ関連病変の出現が減少した。

図２１は、ＣＤ給餌マウスにおいて２Ｈ１０抗体処置を用いてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減すると、総合ＮＡＳＨスコアが５０％超減少したことを示す。

実施例５：中和抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体は、長期ＣＤ食におけるマウスでの非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の進行を治療又は予防する
治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、体重、食後血糖値、耐糖能又はインスリン感受性に影響を与えない
５週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＤ食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ；Ｄ０５０１０４０２）を１２ヵ月間与えた（ＣＤ１２）。３２週齢で抗体処置を開始し、マウスを２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体で２０週間処置した。動物に８０μｇ用量の抗ＶＥＧＦ－Ｂ抗体を週２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。本試験には、年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴも含めた。本試験中、ＢＷ及びＢＧレベルを記録した。ＢＧの記録前２時間にわたって絶食させた。尾静脈から採取した血液でＢａｙｅｒ Ｃｏｎｔｏｕｒグルコースメーターを使用してグルコース測定を実施した。ＣＤ食において１７週間後、非飢餓マウス又は実験前に２時間絶食させたマウスに対してＩＰＧＴＴ及びＩＰＩＴＴを実施した。負荷試験について、動物に１ｍｇグルコース／ｇ ＢＷ（ＩＰＧＴＴ）及び０．７５ｍＵインスリン／ｇ ＢＷ（ＩＰＩＴＴ）を腹腔内注射した。

図２２に示すとおり、抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける長期ＣＤ食による体重（Ａ）又はグルコース及びインスリン感受性（Ｂ及びＣ）に影響を与えなかった。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、肝機能を改善し、肝細胞癌の発症を緩和する
分析に１２ヵ月ＣＤ給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス並びに年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴを使用した。動物は、上記に記載したとおり、２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体処置を受けた。

４０ｍｍの内径のミリピード（ｍｉｌｌｉｐｅｄｅ）送受信体積コイル（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｙａｒｎｔｏｎ、ＵＫ）を備えた水平穴型９．４Ｔスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｙａｒｎｔｏｎ、ＵＫ）を使用して磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）データを取得した。ＭＲＩ解析のため、動物に造影剤プリモビスト（Ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ）を注入した。２５０ｍＭのプリモビスト（Ｐｒｉｍｏｖｉｓｔ）溶液（Ｂａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を生理食塩水（９ｍｇ／ｍｌ）で１２．５ｍＭに希釈した。アイソセンターに位置付けながら、穴の近傍に位置決めした輸液ポンプに接続された２ｍのポリエチレン（ＰＥ－２０）ホースで接続した尾静脈カテーテルから体重１グラム当たり２ｕｌのボーラスをマウスに送達した。ＭＲＩスキャンについて、脂肪－飽和（高速スピンエコーデータｅｔｌ４、ｋｚｅｒｏ＝１ マトリックス２５６×１９２、有効エコー時間＝７．０１ｍｓ、１ｍｍ厚さの３０連続スライス、視野３５．２×２６．４ｍｍ２のＴ１加重画像。各呼息期間に１５スライスを連続的に励起し、回復時間は、呼吸期間の２倍となった。呼吸期間は、７５０～９５０ｍｓであり、イソフルランレベル（１．６～２．５％）によって制御した。各三次元データセットを取得するのに約１．５分かかった。ボーラス前に１つのデータセットを取得し、続いてボーラス後に５連続データセットを取得した。健常な肝臓の強度は造影剤によって３分以内に増加したが、腫瘍の強度は造影剤によって増強されず、造影剤後にも腫瘍は低信号に見えた。

ＭＲＩ解析後、動物をイソフルラン麻酔薬で犠牲にし、肝臓を解剖して秤量し、心穿刺により全血を採取した。

長期ＣＤは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて肝肥大、肝機能の低下及び肝細胞癌の発症につながった。ガドリニウム増強造影スキャンと組み合わせたＭＲＩを用いて肝腫瘍を視覚化することができる。肝内で腫瘍発育が最も豊富な部位は、尾状突起及び右側葉であった。ＣＤ食において１２ヵ月後、対照Ｉｇ処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスの５０％が肝細胞癌を発症し、２Ｈ１０処置マウスで腫瘍は検出されなかった。更に、抗ＶＥＧＦ－Ｂ療法が肥大を予防し、肝機能を改善したことから、肝細胞癌発症の予防に抗ＶＥＧＦ－Ｂ療法を用い得ることが示唆される。

図２３は、抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置が肝機能を改善し、肝細胞癌の発症を緩和したことを示す。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、肝脂質蓄積を低減する
分析に１２ヵ月ＣＤ給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス並びに年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴを使用した。動物は、上記に記載したとおり、２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体処置を受けた。

摘出した肝臓に関してオイルレッドＯ（ＯＲＯ）分析を実施した。簡潔に言えば、肝臓を解剖してドライアイスで急速凍結し、肝生検をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。低温切片（１２μｍ）をオイルレッドＯワーキング溶液（２．５ｇオイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４００ｍｌ ９９％イソプロパノール中に溶解し、更にＨ２Ｏで６：１０希釈し、２２μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でろ過した）に５分間浸漬した。その後、切片をヘマトキシリン溶液中に３秒間沈め、続いてＬｉＣＯ３中に沈め、水道水の流水下で１０分間リンスした後、それらをマウントした。染色切片を明視野顕微鏡法で調べた。各切片内におけるＯＲＯ及びヘマトキシリン染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓ＯＲＯ染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いて脂肪滴量を定量化した。

長期ＣＤ食におけるマウスで２Ｈ１０を用いてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減することにより、肝脂肪症が減少し得、脂肪滴が数及びサイズの両方について低減された。ＣＤ食におけるマウスでのマウスの肝脂質含量は、２Ｈ１０療法によって５０％超低減した。

図２４は、ＯＲＯ染色によって測定されるとおりの肝脂質蓄積が、長期ＣＤ食におけるマウスで抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）後に低減したことを示す。

治療的抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置（２Ｈ１０を用いる）は、肝炎症の発症を予防する
分析に１２ヵ月ＣＤ給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウス並びに年齢及び性別対応固形飼料給餌ＷＴを使用した。動物は、上記に記載したとおり、２Ｈ１０又はアイソタイプ対応対照抗体処置を受けた。

摘出した肝臓に対してＣＤ４５及びＦ４／８０免疫染色を実施した。簡潔に言えば、肝臓を解剖してドライアイスで急速凍結した。肝生検をＴｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）（Ｓａｋｕｒａ）でクライオスタットのモールド上に直接包埋した。包埋後、１２μｍ切片を調製し、氷冷４％ＰＦＡで１０分間後固定し、その後、ＣＤ４５又はＦ４／８０に関して免疫染色した。簡潔に言えば、切片を一次ラット抗ＣＤ４５（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びラット抗Ｆ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体と共に４℃で１２時間インキュベートした。適切な蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ）を加え、切片を室温で１時間更にインキュベートした後、それらを顕微鏡法のために調製した。各切片内におけるＣＤ４５又はＦ４／８０染色した１動物につき少なくとも１０フレームをＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）により２０倍の倍率で撮影した。肝臓のｉ）ＣＤ４５染色（ピクセル²／μｍ²）又はｉｉ）Ｆ４／８０染色（ピクセル²／μｍ²）に関して、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｕｎウィザードプログラムを用いてそれぞれの染色量を定量化した。

長期ＣＤは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて肝炎症の増加につながった。ＣＤ食における対照処置マウスでは、腫瘍を伴う場合及び伴わない場合の両方において、固形飼料給餌マウスと比較したとき、炎症反応がそれぞれ約２倍及び５倍増加した。ＣＤ食におけるマウスで２Ｈ１０を用いてＶＥＧＦ－Ｂレベルを低減すると、肝炎症細胞量が正常化した。従って、このデータは、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を（２Ｈ１０処置を用いて）減少させると、ＮＡＳＨ／肝細胞癌の発症における炎症期が効率的に標的化されることを示唆している。

図２５は、長期ＣＤ食におけるマウスでの抗ＶＥＧＦ－Ｂ処置が、ＣＤ４５及びＦ４／８０発現の低減によって示されるとおり、肝炎症の発症を予防することを示す。

Claims (11)

1. 肝脂肪症若しくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）若しくは肝硬変若しくは肝線維症の治療のための若しくは進行の予防のための、又は肝脂肪症若しくはＮＡＳＨ若しくは肝硬変若しくは肝線維症に罹患している対象において、その合併症が発症することを予防するための若しくはその合併症の発症のリスクを低下させるための医薬組成物であって、前記組成物がＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を含み、
   前記化合物が、ＶＥＧＦ－Ｂに結合するかまたは特異的に結合し、ＶＥＧＦ－Ｂのシグナル伝達を中和する抗体可変領域を含むタンパク質であり、
   前記タンパク質が、
   （ｉ）
   （ａ）配列番号３のアミノ酸２５～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号３のアミノ酸４９～６５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸９８～１０８に示される配列を含むＣＤＲ３
   を含む重鎖可変領域（Ｖ_H）、及び
   （ｉｉ）
   （ａ）配列番号４のアミノ酸２３～３３に示される配列を含むＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号４のアミノ酸４９～５５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
   （ｃ）配列番号４のアミノ酸８８～９６に示される配列を含むＣＤＲ３
   を含む軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含み、前記合併症が、肝細胞癌である、
   医薬組成物。
2. 前記肝脂肪症若しくはＮＡＳＨ若しくは肝硬変若しくは肝線維症に罹患している前記対象は、更に過体重若しくは肥満であり、及び／又は糖尿病に罹患しており、及び／又はメタボリックシンドロームに罹患している、請求項１に記載の組成物。
3. 前記対象が、さらに肝脂肪症又はＮＡＳＨ又は肝硬変又は肝線維症の共存症に罹患している、請求項１に記載の組成物。
4. 前記化合物は、以下の効果：
   ・対象の肝臓への脂質、例えば中性脂質の蓄積を低減又は予防すること、
   ・前記対象の肝臓における炎症を低減又は予防すること、
   ・対象の肝臓における肝脂肪症又はＮＡＳＨ又は肝硬変又は肝線維症の病理学的変化の発生を低減又は予防すること、
   ・肝線維症及び／又は肝硬変を低減又は予防すること、
   ・肝細胞癌の形成を低減又は予防すること
   の１つ以上を有するのに有効な量で投与されるために製剤化される、請求項１に記載の組成物。
5. 肝脂肪症又はＮＡＳＨ又は肝硬変又は肝線維症に罹患している対象の肝臓における脂質レベルを低減するための医薬組成物であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を含み、
   前記化合物が、ＶＥＧＦ－Ｂに結合するかまたは特異的に結合し、ＶＥＧＦ－Ｂのシグナル伝達を中和する抗体可変領域を含むタンパク質であり、
   前記タンパク質が、
   （ｉ）
   （ａ）配列番号３のアミノ酸２５～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号３のアミノ酸４９～６５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸９８～１０８に示される配列を含むＣＤＲ３
   を含む重鎖可変領域（Ｖ_H）、及び
   （ｉｉ）
   （ａ）配列番号４のアミノ酸２３～３３に示される配列を含むＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号４のアミノ酸４９～５５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
   （ｃ）配列番号４のアミノ酸８８～９６に示される配列を含むＣＤＲ３
   を含む軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、
   医薬組成物。
6. 肝脂肪症又はＮＡＳＨ又は肝硬変又は肝線維症に罹患している対象における炎症レベルを低減する医薬組成物であって、ＶＥＧＦ－Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を含み、
   前記化合物が、ＶＥＧＦ－Ｂに結合するかまたは特異的に結合し、ＶＥＧＦ－Ｂのシグナル伝達を中和する抗体可変領域を含むタンパク質であり、
   前記タンパク質が、
   （ｉ）
   （ａ）配列番号３のアミノ酸２５～３４に示される配列を含むＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号３のアミノ酸４９～６５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸９８～１０８に示される配列を含むＣＤＲ３
   を含む重鎖可変領域（Ｖ_H）、及び
   （ｉｉ）
   （ａ）配列番号４のアミノ酸２３～３３に示される配列を含むＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号４のアミノ酸４９～５５に示される配列を含むＣＤＲ２、及び
   （ｃ）配列番号４のアミノ酸８８～９６に示される配列を含むＣＤＲ３
   を含む軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、
   医薬組成物。
7. 前記化合物は、Ｆｖを含むタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
8. 前記タンパク質は、
   （ｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、
   （ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ－ｓｃＦｖ）、
   （ｉｉｉ）ダイアボディ、
   （ｉｖ）トリアボディ、
   （ｖ）テトラボディ、
   （ｖｉ）Ｆａｂ、
   （ｖｉｉ）Ｆ（ａｂ’）₂、
   （ｖｉｉｉ）Ｆｖ、
   （ｉｘ）抗体の定常領域、Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（Ｃ_H）２及び／若しくはＣ_H３に連結された（ｉ）～（ｖｉｉｉ）の１つ、および
   （ｘ）抗体
   からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
9. 前記化合物は、ＶＥＧＦ－Ｂへの抗体２Ｈ１０の結合を競合的に阻害し、抗体２Ｈ１０が配列番号３に示される配列を含むＶ_H及び配列番号４に示される配列を含むＶ_Lを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記化合物は、抗体２Ｈ１０のヒト化可変領域を含むタンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記タンパク質は、配列番号５に示される配列を含むＶ_Hと、配列番号６に示される配列を含むＶ_Lとを含む抗体である、請求項１に記載の組成物。

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