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JP6882160B2 - 植物脂質から工業製品を製造する工程 - Google Patents

植物脂質から工業製品を製造する工程 Download PDF

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Description

本発明は、植物脂質、特に植物の生育部分から工業製品を製造する方法に関する。特に、本発明は、バイオディーゼル及び合成ディーゼルなどの油製品、ならびにこれらを製造する工程に加え、トリアシルグリセロールなどの１つ以上の非極性脂質レベルが増加した植物、及び非極性脂質の総含有量が増加した植物を提供する。特定の一実施形態では、本発明は、植物またはその任意の部分において、１つ以上の非極性脂質のレベル及び／または非極性脂質の総含有量及び／または一価不飽和脂肪酸含有量を増加させる、２つ以上の脂質処理酵素、油体タンパク質、低脂質分解酵素及び／または脂質生合成を調節する転写因子の改変の組み合わせに関する。一実施形態では、本発明は脂質の抽出工程に関する。別の実施形態では、採取された植物生育部分において、脂質を１つ以上の炭化水素生成物へと転換し、再生可能バイオディーゼル燃料としての用途に適した脂肪酸のアルキルエステルを製造する。
世界のエネルギー、特に輸送に関するエネルギーの大部分は、有限の石油から得られる燃料により供給されている。例えば、生物から生成される油等の、再生可能な代替原料が必要とされている。
トリアシルグリセロール生合成
トリアシルグリセロール類（ＴＡＧ）は、種子中の脂質の主形態を構成し、エステル化されグリセロール主鎖となる３つのアシル鎖から構成される。脂肪酸は、アシル−アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）中間体として、最初の不飽和化触媒を受け得る色素体中で合成される。この反応は、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（不飽和化酵素）により触媒され、オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）を生成する。次いで、アシル鎖は、アシル−コエンザイム（ＣｏＡ）チオエステルとして細胞質ゾル及び小胞体（ＥＲ）へと移送される。主要なＴＡＧ生合成経路（ケネディ経路またはグリセロール３リン酸（Ｇ３Ｐ）経路としても知られる）に入る前に、アシル鎖は、通常、ＥＲ膜のリン脂質へと組み込まれ、更なる不飽和化を受けることができる。多価不飽和脂肪酸の産生における２つの重要な酵素は、膜結合ＦＡＤ２及びＦＡＤ３デサチュラーゼであり、それらは、それぞれ、リノール酸（Ｃ１８：２Δ９、１２）及びαリノレン酸（Ｃ１８：３Δ９、１２、１５）を産生する。
ケネディ経路を介したＴＡＧ生合成は、引き続く一連のアシル化（各々、アシル供与体として、アシル−ＣｏＡエステルを用いる）から構成される。最初のアシル化ステップは通常、Ｇ３Ｐ主鎖のｓｎ１−位で発生し、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（ｓｎ１−ＧＰＡＴ）により触媒される。産物である、ｓｎ１−リゾホスファチジン酸（ｓｎ１−ＬＰＡ）は、第２のアシル鎖をｓｎ２−位で連結させ、ホスファチジン酸を形成するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）の基質として機能する。ＰＡは更に、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）によりジアシルグリセロール（ＤＡＧ）へと脱リン酸化され、それによって、最終アシル化ステップの基質がもたらされる。最後に、第３のアシル鎖が、ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）により触媒される反応においてＤＡＧのｓｎ３−位でエステル化され、油体に蓄積されるＴＡＧを形成する。第２の酵素反応である、ホスファチジルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）によっても、ＤＡＧからＴＡＧへの転換がもたらされる。この反応は、ＤＧＡＴとは関連がなく、アシル供与体として、リン脂質を使用する。
脂質の商用製造量を最大化するために、トランスジェニック生物またはそれらの一部（例えば、植物、種子、葉、藻類及び菌類）において、脂質、特に、例えばＤＡＧ及びＴＡＧ等の非極性脂質のレベルを増加させる手段が更に求められている。植物での中性脂質の収率を上げる試みは、主に、脂肪酸生合成またはＴＡＧアセンブリに関連する個々の重要な酵素ステップに焦点が置かれてきた。しかしこれらの戦略は、種子の油体または葉の油体において、ほどほどの増加をもたらしたのみであった。油性酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに関する近年の代謝工学研究により、グリセロール３リン酸産生の増加と、β酸化を介したＴＡＧ分解の阻害を組み合わせたアプローチにより、脂質の総含有量の累積的増加がもたらされたことが示された（Ｄｕｌｅｒｍｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
種子油のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等の植物油は、例えば料理用途（ショートニング、テクスチャ、フレーバー）、工業用途（石鹸、蝋燭、香料、化粧品、適切な乾燥剤、絶縁体、潤滑剤）等の多くの用途があり、そして栄養的な価値がある。また、植物油を使用したバイオ燃料の製造に注目が集まっている。
脂質の生物からの商用製造を最大化するために、トランスジェニック生物またはその一部（例えば、植物、種子、葉、藻及び菌類等）において、脂質、特に非極性脂質（例えば、ＤＡＧ及びＴＡＧ等）のレベルを増加させるための更なる手段が必要とされている。
Ｄｕｌｅｒｍｏ ａｎｄ Ｎｉｃａｕｄ（２０１１）Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇ． １３：４８２−４９１．
本発明者らは、生育植物部分から油製品を製造する工程を特定した。
第１の態様では、本発明は油製品の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
（ｉ）反応器内で、
（ａ）乾重量が少なくとも２ｇであり、非極性脂質の総含有量を乾重量基準で少なくとも５重量％有する生育植物部分と、
（ｂ）水、アルコールまたは両方を含む溶媒と、
（ｃ）場合により触媒と、を含む組成物を処理するステップであって、
該処理が、酸化、還元または不活性環境にて組成物を温度約５０℃〜約４５０℃、圧力５〜３５０ｂａｒで１〜１２０分間加熱することを含むステップ、
（ｉｉ）生育植物部分の乾重量に対して、少なくとも３５重量％の収率で反応器から油製品を回収すること、
それによって油製品を製造するステップ。
一実施形態では、生育植物部分は、少なくとも１ｋｇの乾重量を有する。
一実施形態では、生育植物部分は、乾重量基準で少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、約２５％、約３０％、約３５％、１０％〜７５％、２０％〜７５％、または好ましくは３０％〜７５％の非極性脂質の総含有量を有する。
一実施形態では、組成物は、５％〜９０％、好ましくは１５％〜５０％（乾重量／重量）の固体濃度を有する。
任意の好適な触媒を用いることができる。一実施形態では、触媒はアルカリ、酸または貴金属触媒である。例えば、一実施形態では、触媒はＮａＯＨまたはＫＯＨまたは両方を好ましくは０．１Ｍ〜２Ｍの濃度で含む。
一実施形態では、処理時間は１〜６０分、好ましくは１０〜６０分、より好ましくは１５〜３０分間である。圧力が５０ｂａｒ未満である一実施形態では、反応時間は最長２４時間あるいは最長７日でも良い。好ましい実施形態では、温度は２７５℃〜３６０℃であり、圧力は１００〜２００ｂａｒであり、反応は１０〜６０分生じる。
一実施形態では、溶媒が水である場合、この工程により、生育植物部分の乾重量に対して、最小３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％または４０重量％から、最大５５％または好ましくは６０重量％までの収率の油製品が製造される。本実施形態では、油製品は、脂肪酸アシルエステルより少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍の炭化水素化合物を含む。油製品は、３５％、より好ましくは４０％のＣ１３〜Ｃ２２炭化水素化合物を含むことが好ましい。
別の実施形態では、溶媒がアルコール、好ましくはメタノールを含む場合、この工程により、生育植物部分の乾重量に対して、最小３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％または４０重量％から、最大６５％または好ましくは７０重量％までの収率の油製品が生じる。本実施形態では、油製品は、炭化水素化合物よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍の脂肪アシルエステルを含む。油製品は、４０％、より好ましくは５０％の脂肪酸メチルエステルを含むことが好ましい。
更に別の実施形態では、溶媒が約８０％の水を含む場合、油製品は約３０％のＣ１３〜Ｃ２２炭化水素化合物、好ましくは約３５％、より好ましくは約４０％のＣ１３〜Ｃ２２炭化水素化合物を含む。
別の実施形態では、溶媒が約５０％のメタノールを含む場合、油製品は約５０％の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を含む。
更に別の実施形態では、回収された油製品は、約１５重量％未満、好ましくは５重量％未満の含水量を有する。
また別の実施形態では、油製品の収率は、非極性脂質の含有量が乾重量基準で２％未満である、相当する生育植物部分を用いた相当する工程と比較して、少なくとも２重量％、好ましくは少なくとも４重量％多い。
一実施形態では、ステップ（ｉ）（ａ）において、生育植物部分は、乾燥、切断、破砕、粉砕、回転、加圧、圧縮または摩砕のうち１つ以上によって物理的に処理された。代替的一実施形態では、組成物の調製前に含水量１０％未満まで生育植物部分を乾燥させないようにした。例えば、生育植物部分は少なくとも２０％または少なくとも３０％の含水量を有するか、または生育植物部分が採取されたときに有した含水量の少なくとも５０％を保持する。
一実施形態では、この工程は以下の１つ以上を更に含む：
（ｉ）回収された油製品の水素化脱酸素、
（ｉｉ）回収した油製品の水素処理により、油製品のケトンまたは糖のレベルを低減すること、
（ｉｉｉ）回収した油製品からの合成ガスの製造、及び
（ｉｖ）回収した油製品を分画し、１種以上の燃料油、ディーゼル油、灯油またはガソリンを製造すること。例えば、分画ステップは、分別蒸留によってなされる。
一実施形態では、生育植物部分は、植物の葉、茎または両方を含む。
一実施形態では、生育植物部分は、本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変の組み合わせを含む。
本発明者らは、脂肪酸生合成、脂質アセンブリ及び脂質パッケージング経路の操作によって、ならびに脂質異化作用の抑制によって、生物、特に植物の生育部分及び種子の脂質含有量が有意に増加することも実証した。遺伝子の各種の組合せ及び遺伝子発現の抑制を用いて、含油率の大幅な増加を達成した。これは、バイオ燃料及び油由来の他の工業製品の製造に極めて重要である。
第２の態様では、本発明は以下を含む組み換え真核細胞を提供する：
ａ）細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、ならびに次の１つまたは２つまたは３つすべて：
ｃ）遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、
ｄ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｅ）細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第２の転写因子ポリペプチドをコードする、第４の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
一実施形態では、細胞は、ａ）、ｂ）及びｃ）、ならびに場合により、ｄ）またはｅ）を含む。
一実施形態では、細胞は、ａ）、ｂ）及びｄ）、ならびに場合により、ｃ）またはｅ）を含む。
一実施形態では、細胞は、ａ）、ｂ）及びｅ）、ならびに場合により、ｃ）またはｄ）を含む。
一実施形態では、細胞は以下の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ａ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくは脂肪滴会合タンパク質（ＬＤＡＰ）をコードする第５の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、ならびに
ｃ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
一実施形態では、組み換え真核細胞は、以下を含む：
ａ）細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、
ｃ）遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、場合により細胞は次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｄ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、
ｅ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｆ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｇ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
一実施形態では、細胞は植物の生育部分からの、またはその内部の植物細胞であり、この生育部分では、植物の種子と比較して、プロモーターの１つ以上またはそのすべてを高レベルで発現する。
好ましい実施形態では、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドと共に、ｃ）、ｄ）またはｅ）がある場合、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含むが、ｃ）、ｄ）、ｅ）のそれぞれを欠く、相当する細胞と比較して、細胞、好ましくは葉または茎等の生育植物部分内の細胞での非極性脂質の総含有量を増加させる。増加は相乗作用的である方がより好ましい。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
一実施形態では、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、細胞内でのＴＡＧの異化に関与するポリペプチドはＳＤＰ１リパーゼである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、細胞内でのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドはＳＤＰ１リパーゼである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、及び細胞内でのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドはＳＤＰ１リパーゼである。
一実施形態では、存在する場合に、２つの転写因子は、ＷＲＩ１及びＬＥＣ２またはＷＲＩ１及びＬＥＣ１である。
上記実施形態では、細胞は、土壌で生長している植物、または土壌で生長した後に、その植物部分を採取した植物の生育部分にあり、かつ、該細胞が重量基準（乾重量％）で少なくとも８％、例えば８％〜７５％、または８％〜３０％等のＴＡＧを含むことが好ましい。より好ましくは、ＴＡＧの含有量は、少なくとも１０％、例えば１０％〜７５％、または１０％〜３０％である。これらのＴＡＧレベルが、植物の開花前若しくは開花時、または植物成長の結実段階前に生育部分に存在していることが好ましい。これらの実施形態では、植物の葉内のＴＡＧ含有量と、茎内のＴＡＧ含有量との比率が１：１〜１０：１であり、及び／またはこの比率が、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含み、第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、増加していることが好ましい。
上記実施形態では、細胞は、好ましくはＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド及び内因性ＳＤＰ１リパーゼの産生を下方調節する遺伝子改変を含む。より好ましくは、細胞はＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び／またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（ニコチアナ・ベンサミアナ）細胞以外の細胞であり、及び／またはＷＲＩ１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ）ＷＲＩ１（配列番号２１または２２）以外のＷＲＩ１である。最も好ましくは、細胞の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または開花開始後または老化中に、上方調節されるプロモーター等から発現する。
第３の態様では、本発明は以下を含む組み換え真核細胞を提供する：
ａ）細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｃ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくは脂肪滴会合ポリペプチド（ＬＤＡＰ）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、かつ、該組み換え真核細胞では、ヌクレオチド配列が配列番号１７６に示された配列の補体である第３の外因性ポリヌクレオチドを含む、相当する細胞と比較して、１つ以上の非極性脂質のレベル及び／またはＯＢＣポリペプチド量が増加している。
一実施形態では、上記態様の細胞は、次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｄ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、
ｅ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｆ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｇ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
一実施形態では、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂肪の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、細胞は、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、２種類の転写因子ポリペプチド、例えばＷＲＩ１とＬＥＣ２、またはＷＲＩ１とＬＥＣ１等をコードする２つの外因性ポリヌクレオチドを含む。
好ましい実施形態では、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドと共に、ＯＢＣポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第３の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、植物細胞、好ましくは葉または茎等の生育植物部分内の細胞での非極性脂質の総含有量を増加させる。増加は相乗作用的である方がより好ましい。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
第４の態様では、本発明は、色素体、及び細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、ならびに次の１つ以上またはそのすべてを含む組み換え真核細胞を提供する；
ａ）第２の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、及び
ｃ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
一実施形態では、植物細胞は、好ましくはａ）及び場合により、ｂ）またはｃ）を含む。
一実施形態では、上記態様の細胞は、次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｄ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、
ｅ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変、及び
ｆ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド。
好ましい実施形態では、細胞、好ましくは植物細胞は、第１、第２及び第３の外因性ポリヌクレオチド、ならびに場合により、第３の遺伝子改変または第４の外因性ポリヌクレオチドを含む。
好ましい実施形態では、第１及び、存在する場合、第３の外因性ポリヌクレオチドと共に、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチド、好ましくはＦＡＴＡポリペプチド等の脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第１及び、存在する場合、第３の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第２の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物細胞と比較して、植物細胞、好ましくは葉または茎等の生育植物部分内の細胞での非極性脂質の総含有量を増加させる。より好ましくは、第２の外因性ポリヌクレオチドにより提供される増加は、相乗作用的である。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドは、ＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチド、好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１（配列番号２１または２２）以外の転写因子であり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチド、より好ましくはＦＡＴＡポリペプチド、または中鎖脂肪酸チオエステラーゼ以外の脂肪酸チオエステラーゼである。中鎖チオエステラーゼ以外のチオエステラーゼの存在は、チオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、ほぼ同等である細胞の総脂肪酸含有量におけるＣ１２：０及び／またはＣ１４：０脂肪酸の比率によって示される。好ましくは、細胞はＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド及び内因性ＳＤＰ１リパーゼの産生を下方調節する遺伝子改変を更に含む。一実施形態では、ＳＤＰ１リパーゼ産生の低下は、転写因子及び脂肪酸チオエステラーゼと相乗作用し、細胞の非極性脂質の総含有量を増加させる。より好ましくは、細胞はＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び／またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞以外の細胞である。最も好ましくは、細胞の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または老化中に上方調節されるプロモーター等から発現する。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはＴＧＤポリペプチドである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドは色素体ＧＰＡＴである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチドであり、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはＴＧＤポリペプチドである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチドであり、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドは色素体ＧＰＡＴである。
一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、細胞の色素体への脂肪酸の移入を増加させるポリペプチドは、ＴＧＤポリペプチドであり、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドは色素体ＧＰＡＴである。
一実施形態では、細胞は、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、２種類の転写因子ポリペプチド、例えばＷＲＩ１とＬＥＣ２、またはＷＲＩ１とＬＥＣ１等をコードする２つの外因性ポリヌクレオチドを含む。
第２、第３及び第４の態様の実施形態では、細胞が、脂肪酸チオエステラーゼ、例えばＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチド等をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む場合、チオエステラーゼは好ましくは、ＦＡＴＡポリペプチド、または中鎖脂肪酸チオエステラーゼ以外の脂肪酸チオエステラーゼである。
第５の態様では、本発明は以下を含む組み換え真核細胞を提供する：
ａ）細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチド、好ましくはＷＲＩ転写因子をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）中鎖長（Ｃ８〜Ｃ１４）を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるＬＰＡＡＴである、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｃ）第３の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からのＣ８〜Ｃ１４脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
一実施形態では、第３の外因性ポリヌクレオチドは、チオエステラーゼ、好ましくは中鎖長（Ｃ８〜Ｃ１４）を有する脂肪酸に対して優先的活性を有するＦＡＴＢチオエステラーゼをコードする。
好ましい実施形態では、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドと共に、細胞の色素体からのＣ８〜Ｃ１４脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第３の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、細胞（好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分内の細胞）でのＭＣＦＡの総含有量を増加させる。より好ましくは、第３の外因性ポリヌクレオチドにより提供される増加は、相乗作用的である。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
一実施形態では、中鎖長（Ｃ８〜Ｃ１４）を有する脂肪酸に対して優先的活性を有するＦＡＴＢチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドは、その配列が配列番号１９３〜１９９のいずれかに示されたアミノ酸、またはそのいずれか１つのアミノ酸の生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号１９３〜１９９のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドを含む。より好ましくは、中鎖長（Ｃ８〜Ｃ１４）を有する脂肪酸に対して優先的活性を有するＦＡＴＢチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドは、その配列が配列番号１９３〜１９９に示されたアミノ酸、またはそのいずれか１つのアミノ酸の生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号１９３〜１９９のいずれか１つまたは両方と少なくとも３０％同一であるポリペプチドを含む。
第５の態様の一実施形態では、転写因子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１（配列番号２１または２２）ではない。
第５の態様の一実施形態では、ＬＰＡＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２００に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも３０％同一であるポリペプチドを含む。
第５の態様の一実施形態では、細胞は次の１つ以上またはそのすべてを更に含む；
ｄ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与する更に別のポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｅ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、
ｆ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第５の外因性ポリヌクレオチド、
ｇ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｈ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
第５の態様の一実施形態では、細胞は植物の生育部分からの、またはその内部の植物細胞であり、この生育部分では、植物の種子と比較して、プロモーターの１つ以上またはそのすべてを高レベルで発現する。
第５の態様の実施形態では、中鎖長を有する脂肪酸は、少なくともミリスチン酸である。好ましい実施形態では、細胞は、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、８％〜２５％、８％〜２０％、１０％〜２５％、１１％〜２５％、約１５％〜２５％、約２０％〜２５％（ｗ／ｗ乾重量）のミリスチン酸成分を含む。
第３、第４及び第５の態様の実施形態では、細胞は、土壌で生長している植物、または土壌で生長した後、その植物部分を採取した植物の生育部分にあり、かつ、該細胞が重量基準（乾重量％）で少なくとも８％、例えば８％〜７５％、または８％〜３０％等のＴＡＧを含むことが好ましい。より好ましくは、ＴＡＧの含有量は、少なくとも１０％、例えば１０％〜７５％、または１０％〜３０％である。これらのＴＡＧレベルが、植物の開花前若しくは開花時、または植物成長の結実段階前に生育部分に存在していることが好ましい。これらの実施形態では、植物の葉内のＴＡＧ含有量と、茎内のＴＡＧ含有量との比率が１：１〜１０：１であり、及び／またはこの比率が、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含み、第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、増加していることが好ましい。
第２、第３、第４及び第５の態様の実施形態では、細胞は、好ましくはＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド及び内因性ＳＤＰ１リパーゼの産生を下方調節する遺伝子改変を含む。好ましい実施形態では、細胞はＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び／またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞以外の細胞であり、及び／またはＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（セイヨウアブラナ）細胞以外の細胞である。最も好ましくは、細胞の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または老化中に上方調節されるプロモーター等から発現する。
一実施形態では、本発明（第２、第３、第４及び第５の態様を含む）の細胞は、以下の１つ以上またはそのすべての特徴を有する（該当する場合）；
ｉ）細胞は、第１の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸の合成が増加しているか、または第１の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸の異化が減少しているか、またはその両方であり、それによって第１の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸のレベルが増加している、
ｉｉ）細胞は、第１の外因性ポリヌクレオチドを有し、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、ＴＡＧ、ＤＡＧまたはＭＡＧ、好ましくはＴＡＧの合成を触媒する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ（ｆａｔｔｙ ａｃｙｌ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現及び／または活性が増加している、
ｉｉｉ）細胞は、第１の外因性ポリヌクレオチドを有し、細胞内の色素体でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、色素体中のアシル−ＡＣＰ及びＧ３Ｐからのリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の産生が減少している、
ｉｖ）細胞は、外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸含有量及び／またはガラクト脂質の含有量のうち、Ｃ１８：３脂肪酸に対するＣ１６：３の比率が変化している、好ましくは比率が減少している、
ｖ）細胞は植物の生育部分にあり、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を含む、
ｖｉ）細胞は植物の生育部分にあり、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）のＴＡＧ含有量を含む、
ｖｉｉ）転写因子ポリペプチド（複数を含む）が、Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １（ＷＲＩ１）、Ｌｅａｆｙ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ １（ＬＥＣ１）、ＬＥＣ１様、Ｌｅａｆｙ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ２（ＬＥＣ２）、ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ（ＢＢＭ）、ＦＵＳ３、ＡＢＩ３、ＡＢＩ４、ＡＢＩ５、Ｄｏｆ４、およびＤｏｆ１１からなる群、またはＭＹＢ７３、ｂＺＩＰ５３、ＡＧＬ１５、ＭＹＢ１１５、ＭＹＢ１１８、ＴＡＮＭＥＩ、ＷＵＳ、ＧＦＲ２ａ１、ＧＦＲ２ａ２及びＰＨＲ１からなる群から選択される、
ｖｉｉｉ）オレイン酸は、細胞中、総脂肪酸含有量の少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは約６５％（ｍｏｌ％）または２０％〜約６５％を占める、
ｉｘ）細胞内の非極性脂質に含まれる脂肪酸は、水酸基、エポキシ基、シクロプロパン基、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、共役二重結合、分枝鎖（例えばメチル化若しくはヒドロキシル化された分枝鎖、またはそれらの２つ以上の組み合わせ）、または上述の基、結合若しくは分枝鎖のうち任意の２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含む、
ｘ）細胞の非極性脂質は、エイコサジエン酸（ＥＤＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１種以上の多価不飽和脂肪酸を含む、
ｘｉ）細胞は、植物またはその一部、好ましくは生育植物部分にあり、または細胞は、珪藻植物（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）、金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、ハプト藻、茶藻類または不等毛藻類等の藻細胞であり、または細胞は、真菌等の発酵に適した微生物であるか、またはそれらに由来する、
ｘｉｉ）１つ以上またはすべてのプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーター、好ましくは組織特異的プロモーター（例えば葉及び／または茎に特異的なプロモーター）、老化特異的プロモーター等の発生的調節プロモーター（例えば、ＳＡＧ１２プロモーター）、誘導性プロモーター、または概日リズム調節プロモーターから選択され、好ましくは転写因子ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターが構成的プロモーター以外である、
ｘｉｉｉ）細胞は、中鎖脂肪酸、好ましくはＣ１２：０、Ｃ１４：０または両方を総脂肪酸含有量のうち少なくとも５％のレベルで含む、総脂肪酸含有量を含み、更に場合により、中鎖長（Ｃ８〜Ｃ１４）、好ましくはＣ１２：０またはＣ１４：０を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるＬＰＡＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、
ｘｉｖ）細胞に含まれる総脂肪酸含有量のうち、オレイン酸レベル及び／またはパルミチン酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する細胞と比較して、少なくとも２％増加している、及び／またはαリノレン酸（ＡＬＡ）レベル及び／またはリノール酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する細胞と比較して、少なくとも２％低下している、
ｘｖ）細胞内の非極性脂質に含まれる、ステロール、好ましくは遊離（非エステル型）ステロール、ステロイルエステル（ｓｔｅｒｏｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ステロイルグリコシド（ｓｔｅｒｏｙｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）の総量のレベルが外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する細胞の非極性脂質と比較して変化している、
ｘｖｉ）細胞の非極性脂質は、ワックス及び／またはワックスエステルを含む、
ｘｖｉｉ）細胞は、少なくとも約１０００のこのような細胞、好ましくは生育植物部分または種子の集団またはコレクションの１つのメンバーである、
ｘｖｉｉｉ）細胞がサイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、該外因性ポリヌクレオチドが細胞内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結されている、
ｘｉｘ）細胞の１つ以上の非極性脂質のレベル及び／または非極性脂質の総含有量が、Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１（配列番号２１）及びＡｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１（配列番号１）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む相当する細胞中よりも、重量基準で少なくとも２％多い、
ｘｘ）外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する細胞の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の総含有量と比較して、ＰＵＦＡの総含有量が減少している。
以降の実施形態は、本発明（第２、第３、第４および第５の態様を含む）の細胞、ならびに細胞の産生方法及び細胞の使用方法にも当てはまる。これらの実施形態では、細胞が植物の生育部分にある場合、植物は土壌で生長しているか、または土壌で生長したものであることが好ましい。
一実施形態では、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドは、細胞内のＴＡＧ、ＤＡＧまたはモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、好ましくは細胞内のＴＡＧの生合成に関与する、例えばＤＧＡＴ、ＰＤＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＧＰＡＴまたはＭＧＡＴ等の脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ、好ましくはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴである。
一実施形態では、細胞のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドは、ＳＤＰ１リパーゼ、Ｃｇｉ５８ポリペプチド、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（例えばＡＣＸ１またはＡＣＸ２）、またはＰＸＡ１ペルオキシソームＡＴＰ結合カセットトランスポーター等の細胞内での脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドであり、好ましくはＳＤＰ１リパーゼである。
一実施形態では、油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチドは、ポリオレオシン若しくはカレオシン等のオレオシン、または好ましくは脂肪滴会合タンパク質（ＬＤＡＰ）である。
一実施形態では、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、ＦＡＴＡポリペプチドまたはＦＡＴＢポリペプチド等のＣ１６またはＣ１８脂肪酸チオエステラーゼ、ＡＢＣＡ９ポリペプチド等の脂肪酸トランスポーター、または長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＬＡＣＳ）である。
一実施形態では、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドは、脂肪酸トランスポーターまたはそのサブユニット、好ましくはＴＧＤポリペプチド、例えばＴＧＤ１ポリペプチド、ＴＧＤ２ポリペプチド、ＴＧＤ３ポリペプチドまたはＴＧＤ４ポリペプチド等である。
一実施形態では、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）産生に関与するポリペプチドは、色素体ＧＰＡＴ、色素体ＬＰＡＡＴまたは色素体ＰＡＰである。
一実施形態では、細胞は、１６：３植物由来であるか、または１６：３植物内、またはその生育部分若しくは種子内のものであり、以下の１つ以上または以下のすべてを含む；
ａ）外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、及び
ｃ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変。ここでの外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
代替的実施形態では、細胞は、１８：３植物由来であるか、または１８：３植物内、またはその生育部分若しくは種子内のものである。
一実施形態では、細胞は植物開花前の植物の葉、茎または根由来であるか、またはそれら内にあり、該細胞は、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、８％〜１５％または９％〜１２％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を含む。一実施形態では、細胞の非極性脂質の総含有量は、第２、第３、第４及び第５の態様で本明細書に記載した、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴをコードしているが、他の外因性ポリヌクレオチド及び遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された相当する細胞での非極性脂質の総含有量よりも、少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％より多い。植物の茎若しくは根の細胞内に、その程度の増加が見られることがより好ましい。
一実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子改変、好ましくは、ＯＢＣ若しくは脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、または細胞内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変、より好ましくは、ＦＡＴＡチオエステラーゼ若しくはＬＤＡＰをコードする、または細胞のＳＤＰ１ ＴＡＧリパーゼ等の内因性ＴＡＧリパーゼの発現を減少させる外因性ポリヌクレオチドを加えた結果、特に植物開花前の、更により詳細には植物の茎及び／または根の導入遺伝子ＷＲＩ１及びＤＧＡＴの対に追加されたとき、細胞の非極性脂質の総含有量が相乗作用的に増加する。例えば、実施例８、１１および１５を参照されたい。好ましい実施形態では、植物の茎または根の細胞のＴＡＧ含有量の増加は、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１をコードしているが、ＦＡＴＡチオエステラーゼ、ＬＤＡＰ、及び細胞のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された、相当する細胞と比較して、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍である。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
遺伝子改変は、自然発生的な細胞に対して何らかの変化をもたらし、望ましい効果を与えることができる。細胞の遺伝子改変方法は当技術分野において周知である。一実施形態では、１つ以上またはすべての遺伝子改変は各々、遺伝子を部分的に、または完全に不活性化する内因性遺伝子の変異であり、好ましくはポイントミューテーション、挿入または欠失（または、その１つ以上の組み合わせ）等の誘導型変異である。ポイントミューテーションは、遺伝子またはコードされたポリペプチドの活性を抑制する未成熟終止コドン、スプライス部位変異、フレームシフト変異またはアミノ酸置換変異であり得る。欠失は、遺伝子の転写されたエキソンまたはプロモーター内の１つ以上のヌクレオチドにあっても、複数のエキソンに跨がってもまたは渡ってもよく、遺伝子全体に欠失が及んでいてもよい。好ましくは、欠失は、ＺＦ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ技術を使用して誘導される。一実施形態では、１つ以上またはすべての遺伝子改変は、内因性遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドであり、ここでの外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。内因性遺伝子の発現を抑制する外因性ポリヌクレオチドの例は、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、内因性酵素を結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子、及びそれから誘導される操作されたＲＮＡ分子からなる群から選択される。一実施形態では、細胞は、内因性遺伝子の誘導された変異である遺伝子改変、及び別の内因性遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、ＷＲＩ１をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号２１〜７５または２０５〜２１０のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号２１〜７５または２０５〜２１０のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下でｉ）及び／またはｉｉ）にハイブリダイズするヌクレオチド。ＷＲＩ１ポリペプチドは、好ましくは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１（配列番号２１または２２）以外のＷＲＩ１ポリペプチドである。より好ましくは、ＷＲＩ１ポリペプチドは、配列番号２０８に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも３０％同一であるポリペプチドを含む。
第２、第３、第４または第５の態様の一実施形態では、組み換え細胞は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）塊茎の細胞、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の根または葉の細胞、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．）若しくはサトウモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）の茎または葉の細胞、単子葉植物の内胚乳細胞であり、該細胞は、相当する野生型内胚乳細胞、例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）穀物、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓｐ．）穀物またはトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）穀粒等の細胞、高い総脂肪酸含有量を有するＢｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．種子、例えば、カノーラ種子等の細胞、または高い総脂肪酸含有量を有するマメ科種子、例えば、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）種子等の細胞と比較して、総脂肪酸含有量が増加している。
第６の態様では、本発明は、本発明の１種以上の細胞を含む、またはそれからなる非ヒト生物またはその一部を提供する。
一実施形態では、非ヒト生物の一部は、植物の種子、果物または生育部分、例えば葉または茎等の植物地上部または緑色部分である。
別の実施形態では、非ヒト生物は、例えば植物若しくは藻類等の光合成生物、または例えば真菌類等の発酵に適した微生物である。
第７の態様では、本発明は、以下を含むトランスジェニック植物またはその一部、好ましくは生育植物部分を提供する：
ａ）植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、ならびに次の１つまたは２つまたは３つすべて：
ｃ）遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変、
ｄ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、植物細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｅ）植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第２の転写因子ポリペプチドをコードする、第４の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
一実施形態では、植物は、ａ）、ｂ）及びｃ）、ならびに場合により、ｄ）またはｅ）を含む。
一実施形態では、植物またはその一部は、ａ）、ｂ）及びｄ）、ならびに場合により、ｃ）またはｅ）を含む。
一実施形態では、植物またはその一部は、ａ）、ｂ）及びｅ）、ならびに場合により、ｃ）またはｄ）を含む。
好ましい実施形態では、ａ）及びｂ）と共に、ｃ）、ｄ）またはｅ）がある場合、ａ）およびｂ）を含むが、ｃ）、ｄ）及びｅ）の各々を欠く、相当する細胞と比較して、植物またはその一部（好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分）での非極性脂質の総含有量を増加させる。増加は相乗作用的である方が好ましい。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
一実施形態では、植物またはその一部は、以下の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ａ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第５の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｃ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
一実施形態では、トランスジェニック植物またはその一部は、以下を含む：
ａ）植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、好ましくは構成的プロモーター以外のプロモーターから発現されるポリヌクレオチド、
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｃ）遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、場合により植物は次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｄ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、
ｅ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｆ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｇ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
一実施形態では、部分は生育部分であり、プロモーターのうちの１つ以上またはすべては植物の種子と比較して、生育部分において高レベルで発現する。
一実施形態では、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、植物内でのＴＡＧの異化に関与するポリペプチドはＳＤＰ１リパーゼである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、植物内でのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドはＳＤＰ１リパーゼである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、及び植物内でのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドはＳＤＰ１リパーゼである。
一実施形態では、存在する場合に、２つの転写因子は、ＷＲＩ１及びＬＥＣ２またはＷＲＩ１及びＬＥＣ１である。
上記実施形態では、植物は土壌で生長しているか、または土壌で生長した後に、その一部が採取されたものであることが好ましい。植物の生育部分は、重量基準（乾重量％）で少なくとも８％、例えば８％〜７５％、または８％〜３０％等のＴＡＧを含むことが好ましい。より好ましくは、ＴＡＧの含有量は、少なくとも１０％、例えば１０％〜７５％、または１０％〜３０％である。これらのＴＡＧレベルが、植物の開花前若しくは開花時、または植物成長の結実段階前に生育部分に存在していることが好ましい。これらの実施形態では、植物の葉内のＴＡＧ含有量と、茎内のＴＡＧ含有量との比率が１：１〜１０：１であり、及び／またはこの比率が、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含み、第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、増加していることが好ましい。
上記実施形態では、植物またはその一部の非極性脂質の総含有量は、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴをコードしているが、本明細書に記載の他の外因性ポリヌクレオチド及び遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された相当する植物またはその一部での非極性脂質の総含有量よりも、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％多い。植物の茎若しくは根の組織内に、その程度の増加が見られることがより好ましい。
上記の実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子改変、好ましくは、ＯＢＣ若しくは脂肪酸チオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、または細胞内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変、より好ましくは、ＬＤＡＰ若しくはＦＡＴＡチオエステラーゼをコードする、または細胞のＳＤＰ１ ＴＡＧリパーゼ等の内因性ＴＡＧリパーゼの発現を減少させる外因性ポリヌクレオチドを加えた結果、特に植物開花前の、更により詳細には植物の茎及び／または根の組織の導入遺伝子ＷＲＩ１及びＤＧＡＴの対に追加されたとき、植物またはその一部の非極性脂質の総含有量が相乗作用的に増加する。例えば、実施例８、１１及び１５を参照されたい。好ましい実施形態では、植物の葉、茎若しくは根の組織またはその３つすべてのＴＡＧ含有量の増加は、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１をコードしているが、ＯＢＣまたは脂肪酸チオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、及び細胞のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された相当する部分と比較して、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍である。
上記実施形態では、植物またはその一部は、好ましくはＤＧＡＴをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド及び内因性ＳＤＰ１リパーゼの産生を下方調節する第１の遺伝子改変を含む。より好ましくは、植物またはその一部はＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び／またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及び／またはＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ以外の植物またはその一部であり、及び／またはＷＲＩ１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１以外のＷＲＩ１である（配列番号２１または２２）。一実施形態では、植物はサトウキビ以外である。最も好ましくは、植物の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または開花開始後または老化中に、上方調節されるプロモーター等から発現する。好ましくは、少なくとも第１の外因性ポリヌクレオチド（転写因子をコードする）は、このようなプロモーターから発現する。
第８の態様では、本発明は、以下を含むトランスジェニック植物またはその一部、好ましくは生育植物部分を提供する：
ａ）植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｃ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、かつ、該植物では、ヌクレオチド配列が配列番号１７６に示された配列の補体である第３の外因性ポリヌクレオチドを含む、相当する植物と比較して、１つ以上の非極性脂質のレベル及び／またはＯＢＣポリペプチド量が増加している。
好ましい実施形態では、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドと共に、ＯＢＣポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第３の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物部分と比較して、植物またはその一部（好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分）での非極性脂質の総含有量を増加させる。増加は相乗作用的である方が好ましい。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
第８の態様の一実施形態では、植物またはその一部は次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｄ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、
ｅ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｆ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｇ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
一実施形態では、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂肪の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、細胞は、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、２種類の転写因子ポリペプチド、例えばＷＲＩ１とＬＥＣ２、またはＷＲＩ１とＬＥＣ１等をコードする２つの外因性ポリヌクレオチドを含む。
第９の態様では、本発明は、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、及び次の１つ以上またはそのすべてを含む、トランスジェニック植物またはその一部、好ましくは生育植物部分を提供する；
ａ）第２の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、及び
ｃ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
一実施形態では、植物細胞またはその一部、好ましくは、生育植物部分は、ａ）及び場合により、ｂ）またはｃ）を含む。
第９の態様の一実施形態では、植物またはその一部は次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｄ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、
ｅ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変、及び
ｆ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド。
好ましい実施形態では、植物またはその一部、好ましくは生育植物部分は、第１、第２及び第３の外因性ポリヌクレオチド、ならびに場合により、第３の遺伝子改変または第４の外因性ポリヌクレオチドを含む。
好ましい実施形態では、第１及び、存在する場合、第３の外因性ポリヌクレオチドと共に、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチド、好ましくはＦＡＴＡポリペプチド等の脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする第２の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第１及び、存在する場合、第３の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第２の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物部分と比較して、植物部分（好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分）での非極性脂質の総含有量を増加させる。より好ましくは、第２の外因性ポリヌクレオチドにより提供される増加は、相乗作用的である。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはＴＧＤポリペプチドである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドは色素体ＧＰＡＴである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチドであり、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはＴＧＤポリペプチドである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチドであり、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドは色素体ＧＰＡＴである。
一実施形態では、植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、植物の色素体への脂肪酸の移入を増加させるポリペプチドは、ＴＧＤポリペプチドであり、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドは色素体ＧＰＡＴである。
一実施形態では、植物は、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、２種類の転写因子ポリペプチド、例えばＷＲＩ１とＬＥＣ２、またはＷＲＩ１とＬＥＣ１等をコードする２つの外因性ポリヌクレオチドを含む。
第７、第８及び第９の態様の実施形態では、植物が、脂肪酸チオエステラーゼ、例えばＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチド等をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む場合、チオエステラーゼは好ましくは、ＦＡＴＡポリペプチド、または中鎖脂肪酸チオエステラーゼ以外の脂肪酸チオエステラーゼである。
第１０の態様では、本発明は、以下を含むトランスジェニック植物またはその一部、好ましくは生育植物部分を提供する：
ａ）植物内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチド、好ましくはＷＲＩ転写因子をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）中鎖長（Ｃ８〜Ｃ１４）を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるＬＰＡＡＴである、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｃ）第３の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からのＣ８〜Ｃ１４脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
好ましい実施形態では、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドと共に、植物の色素体からのＣ８〜Ｃ１４脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第３の外因性ポリヌクレオチドがある場合、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含むが、第３の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較して、植物部分（好ましくは葉、根または茎等の生育植物部分）でのＭＣＦＡの総含有量を増加させる。より好ましくは、第３の外因性ポリヌクレオチドにより提供される増加は、相乗作用的である。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
第１０の態様の一実施形態では、トランスジェニック植物またはその一部は、次の１つ以上またはそのすべてを更に含む；
ｄ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与する更に別のポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｅ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、
ｆ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第５の外因性ポリヌクレオチド、
ｇ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｈ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
第１０の態様の一実施形態では、転写因子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１（配列番号２１または２２）ではなく、及び／または植物はＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａではない。
第１０の態様の一実施形態では、ＬＰＡＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号２００に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも３０％同一であるＬＰＡＡＴポリペプチドを含む。
第１０の態様の一実施形態では、好ましくは、少なくとも第１の外因性ポリヌクレオチドを発現するプロモーターを含めた、プロモーターのうちの１つ以上またはすべてが、植物の種子と比較して、生育部分において高レベルで発現する。
第１０の態様の実施形態では、中鎖長を有する脂肪酸は、少なくともミリスチン酸（Ｃ１４：０）である。好ましい実施形態では、植物、好ましくは生育植物部分が、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、８％〜２５％、８％〜２０％、１０％〜２５％、１１％〜２５％、約１５％〜２５％、約２０％〜２５％（ｗ／ｗ乾重量）のミリスチン酸成分を含む。
第６、第７、第８、第９及び第１０の態様の実施形態では、植物は土壌で生長している、または土壌で生長した後、その植物部分、好ましくは生育植物部分を採取されたものであり、かつ、該植物部分が重量基準（乾重量％）で少なくとも８％、例えば８％〜７５％、または８％〜３０％等のＴＡＧを含むことが好ましい。より好ましくは、ＴＡＧの含有量は、少なくとも１０％、例えば１０％〜７５％、または１０％〜３０％である。これらのＴＡＧレベルが、植物の開花前若しくは開花時、または植物成長の結実段階前に生育部分に存在していることが好ましい。これらの実施形態では、植物の葉内のＴＡＧ含有量と、茎内のＴＡＧ含有量との比率が１：１〜１０：１であり、及び／またはこの比率が、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドを含み、第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、増加していることが好ましい。
第６、第７、第８、第９及び第１０の態様の実施形態では、植物またはその一部は、好ましくはＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド及び内因性ＳＤＰ１リパーゼの産生を下方調節する遺伝子改変を含む。好ましい実施形態では、植物またはその一部はＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まず、及び／またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物以外の植物である。最も好ましくは、植物またはその一部の外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つが、構成的プロモーターでないプロモーター、例えば、植物の緑色組織または茎で優先的に発現するプロモーター、または老化中に上方調節されるプロモーター等から発現する。
第１１の態様では、本発明は、生育部分を含む植物またはその生育部分を提供し、該生育部分は、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、約１８％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を含み、該非極性脂質は少なくとも９０％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む。
好ましい実施形態では、生育植物部分は、第７、第８、第９および第１０の態様に記載した特性を特徴とする。植物は好ましくは１８：３植物である。
上記態様の一実施形態では、植物細胞または植物部分は、もう繁殖できないように、または生きた植物を発生させないように処理されており、すなわち死滅している。例えば、植物細胞または植物部分は、乾燥及び／または粉砕されている。
第１２の態様では、本発明は、生育部分を含む植物またはその生育部分を提供し、該生育部分は、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、約１８％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）のＴＡＧ含有量を有し、該非極性脂質は少なくとも９０％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む。植物は好ましくは１８：３植物である。
第１３の態様では、本発明は、生育部分を含む植物またはその生育部分を提供し、該生育部分は、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を含み、該非極性脂質は少なくとも９０％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、該植物は１６：３植物またはその生育植物部分である。
第１４の態様では、本発明は、生育部分を含む植物またはその生育部分を提供し、該生育部分は、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）のＴＡＧ含有量を有し、該非極性脂質は少なくとも９０％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、該植物は１６：３植物またはその生育植物部分である。
一実施形態では、本発明（第２、第３、第４及び第５の態様を含む）の細胞は、以下の種または属の細胞であり、または本発明（第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３および第１４の態様を含む）の植物またはその一部は、Ａｃｒｏｃｏｍｉａ ａｃｕｌｅａｔａ（モモヤシ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）、Ａｒａｃｉｎｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｍｕｒｕｍｕｒｕ（ムルムル）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（ツクマ）、Ａｔｔａｌｅａ ｇｅｒａｅｎｓｉｓ（Ｉｎｄａｉａ−ｒａｔｅｉｒｏ）、Ａｔｔａｌｅａ ｈｕｍｉｌｉｓ（アメリカアブラヤシ）、Ａｔｔａｌｅａ ｏｌｅｉｆｅｒａ（ａｎｄａｉａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｐｈａｌｅｒａｔａ（ｕｒｉｃｕｒｉ）、Ａｔｔａｌｅａ ｓｐｅｃｉｏｓａ（ババス）、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（オーツ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（カノーラ））、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（アマナズナ）、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ（タイマ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｃａｒｙｏｃａｒ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（ペキー）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ（ココナッツ）、Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（アビシニアケール）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アフリカヤシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ワタ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（例えばＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ））、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（フィジックナッツ）、Ｊｏａｎｎｅｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ（ａｒａｒａ ｎｕｔ−ｔｒｅｅ）、Ｌｅｍｎａ ｓｐ．（ウキクサ）（例えばＬｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｌｅｍｎａ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ（イボウキクサ）、Ｌｅｍｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｕｔａ、Ｌｅｍｎａ ｏｂｓｃｕｒａ、Ｌｅｍｎａ ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ、Ｌｅｍｎａ ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ、Ｌｅｍｎａ ｔｅｎｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｔｒｉｓｕｌｃａ、Ｌｅｍｎａ ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｖａｌｄｉｖｉａｎａ、Ｌｅｍｎａ ｙｕｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｌｉｃａｎｉａ ｒｉｇｉｄａ（オイチシカ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（ルピナス）、Ｍａｕｒｉｔｉａ ｆｌｅｘｕｏｓａ（ミリチーヤシ）、Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎａ ｍａｒｉｐａ（イナジャヤシ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ及びＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐ．（タバコ）（例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｃａｂａ（ｂａｃａｂａ−ｄｏ−ａｚｅｉｔｅ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｔａｕａ（ｐａｔａｕａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ（ｂａｃａｂａ−ｄｅ−ｌｅｑｕｅ）、Ｏｒｙｚａ ｓｐ．（イネ）（例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ及びＯｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｐａｒａｑｕｅｉｂａ ｐａｒａｅｎｓｉｓ（ｍａｒｉ）、Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｎｃａｎａ（アボカド）、Ｐｏｎｇａｍｉａ ｐｉｎｎａｔａ（Ｉｎｄｉａｎ ｂｅｅｃｈ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（サトウキビ）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ（ゴマ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｏｒｕｍ（クプアス）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｔｒｉｔｈｒｉｎａｘ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｎｅｅｄｌｅ ｐａｌｍ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ．（コムギ）（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）及びＺｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）である。
第１５の態様では、本発明は、少なくとも２ｃｍの直径を有し、乾重量基準で少なくとも０．５％のＴＡＧ含有量及び／または少なくとも１％、好ましくは少なくとも１．５％または少なくとも２．０％の総脂肪酸含有量を有するジャガイモ植物またはその一部、好ましくは塊茎を提供する。ジャガイモ塊茎は、総脂肪酸含有量と総脂肪酸含有量のうちのＴＡＧ分画の両方において、遺伝子改変及び／または外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を欠く、相当するジャガイモ塊茎と比較して、モノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）レベルの増加及び／または多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）レベルの減少、例えばオレイン酸レベルの増加及びＡＬＡレベルの減少を有する。好ましくは、遺伝子改変及び／または外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を欠く、相当するジャガイモ塊茎と比較して、塊茎の総脂肪酸含有量中のＡＬＡレベルが１０％未満に減少する、及び／または総脂肪酸含有量中のオレイン酸レベルが少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％またはより好ましくは少なくとも１５％に増加する。更にまた、一実施形態では、遺伝子改変及び／または外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を欠く、相当するジャガイモ塊茎と比較して、塊茎の総脂肪酸含有量中のパルミチン酸レベルが増加する、及び／または、塊茎の総脂肪酸含有量中のステアリン酸（１８：０）レベルが減少する。一実施形態では、同一条件下で生育された野生型塊茎と比較して、塊茎のデンプン含有量は重量基準で約９０％〜１００％である。
一実施形態では、本発明のジャガイモ植物またはその一部、好ましくは、塊茎は以下を含む：
ａ）塊茎内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、生長期のジャガイモ植物の塊茎内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
好ましい実施形態では、ジャガイモ塊茎は、次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｃ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、
ｄ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変であって、該ポリペプチドがＳＤＰ１である遺伝子改変、
ｅ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｆ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｇ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
更なる実施形態では、塊茎の付加的な遺伝子改変は、本発明の細胞または植物に関連して定義された通りである。
第１６の態様では、本発明は、乾重量基準で少なくとも６％または少なくとも８％の総脂肪酸含有量を有し、及び／または乾重量基準で少なくとも２％または少なくとも３％の茎中のＴＡＧ含有量を有し、及び／または重量基準でＴＡＧ含有量が茎中で少なくとも５０倍及び／または葉中で少なくとも１００倍に増加している、モロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部、好ましくは茎または葉を提供する。各実施形態において、モロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部、好ましくは茎または葉は、本発明の細胞または植物またはそれらの一部に関連して定義された通りの特徴を有する。
第１７の態様では、本発明は、以下を含むモロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部、好ましくは茎または葉を提供する：
ａ）植物またはその一部での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、生長期の植物またはその一部でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
好ましくは、少なくとも第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、イネユビキチンプロモーター（Ｒｕｂｉ３）以外のプロモーターである。より好ましくは、プロモーターは、ユビキチンプロモーターでもなく、他のいかなる構成的プロモーターでもない。好ましくは、第１および第２の外因性ポリヌクレオチドならびにそれぞれのプロモーターは、植物ゲノムに組み込まれる１つの遺伝子構築物に連結される。
一実施形態では、同一条件下で生育された野生型塊サトウキビ茎と比較して、サトウキビの糖含有量は重量基準で約７０％〜１００％である。あるいは、糖含有量は５０％〜７０％である。
一実施形態では、本発明のモロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部、好ましくは茎または葉は、以下を含む：
ａ）植物の茎（複数を含む）内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド。ここでの外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも第１の外因性ポリヌクレオチドは、植物生育期の葉よりも、茎（複数を含む）内で優先的に発現するプロモーターと作動可能に連結される。
一実施形態では、本発明のモロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部は、次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｃ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、
ｄ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、
ｅ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｆ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｇ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
本発明のモロコシ若しくはサトウキビ植物またはそれらの一部は、好ましくは、総脂肪酸含有量と総脂肪酸含有量のうちのＴＡＧ分画の両方において、遺伝子改変及び／または外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、モノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）レベルの増加及び／または多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）レベルの減少、例えばオレイン酸レベルの増加及びＡＬＡレベルの減少を有する。
好ましくは、遺伝子改変及び／または外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、総脂肪酸含有量中のＡＬＡレベルが１０％未満であり、及び／または総脂肪酸含有量中のオレイン酸レベルが少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％またはより好ましくは少なくとも１５％である。
更なる実施形態では、モロコシまたはサトウキビ植物またはそれらの一部の付加的な遺伝子改変は、本発明の細胞または植物に関連して定義された通りである。
第１８の態様では、本発明は、相当する非トランスジェニック単子葉植物またはその一部と比較して、総脂肪酸含有量またはＴＡＧ含有量が重量基準で少なくとも５倍に増加する、トランスジェニック単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、穀物、茎、根または内胚乳を提供する。あるいは、内胚乳のＴＡＧ含有量が重量基準で少なくとも２．０％、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも４％または少なくとも５％であるトランスジェニック単子葉植物、または植物の一部、好ましくは葉、茎、根、穀物または内胚乳を提供する。一実施形態では、内胚乳は少なくとも２％のＴＡＧ含有量を有し、これは相当する非トランスジェニック内胚乳と比較して、少なくとも５倍に増加している。好ましくは、植物は完全稔性の雌雄であり、その花粉は本質的に１００％生存可能であり、その穀物は相当する野生型穀粒に対して７０％〜１００％の発芽率を有する。一実施形態では、トランスジェニック植物は、最初のトランスジェニック小麦植物に由来する少なくとも２世代目の子孫植物であり、好ましくは導入遺伝子に対してホモ接合性である。各実施形態において、単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、茎、穀物または内胚乳は、本発明の細胞または植物に関連して定義された通りの１つ以上の特徴を更に有する。
第１９の態様では、本発明は、以下を含む単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、穀物、茎または内胚乳を提供する：
ａ）植物またはその一部での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物生長期の植物またはその一部のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
好ましくは、少なくとも第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
一実施形態では、同一条件下で生育された植物から取得された野生型穀物と比較して、本発明の単子葉植物の穀物のデンプン含有量は重量基準で約７０％〜１００％である。上記２つの態様の好適な単子葉植物は、コムギ、イネ、モロコシ及びトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）である。
一実施形態では、本発明の単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、穀物または内胚乳は、以下を含む：
ａ）植物の内胚乳内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｂ）１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド。ここでの外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも第１の外因性ポリヌクレオチドは、植物生育期の葉よりも、内胚乳内に高レベルで発現するプロモーターと作動可能に連結される。
好ましい実施形態では、単子葉植物またはその一部は、次の１つ以上またはそのすべてを更に含む：
ｃ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチド、好ましくはＬＤＡＰをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、
ｄ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、
ｅ）第４の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、
ｆ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、及び
ｇ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。
一実施形態では、単子葉植物は、ａ）、ｂ）、ｄ）及びｅ）の一方または両方、ならびに場合によりにｃ）、ｆ）及びｇ）いずれかの特徴を含む。
本発明の単子葉植物またはその一部、好ましくは葉、穀物、茎または内胚乳は、総脂肪酸含有量と総脂肪酸含有量のうちのＴＡＧ分画の両方において、遺伝子改変及び／または外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、モノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）レベルの増加及び／または多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）レベルの減少、例えばオレイン酸レベルの増加及びＬＡ（１８：２）レベルの減少等を有する。
好ましくは、遺伝子改変及び／または外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、相当する野生型植物またはその一部に対して、穀物または内胚乳の総脂肪酸含有量中のリノール酸（ＬＡ、１８：２）レベルが、少なくとも５％減少し、及び／または総脂肪酸含有量中のオレイン酸レベルが少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％またはより好ましくは少なくとも１５％増加している。
以降の各実施形態は、第１５、第１６、第１７、第１８及び第１９態様それぞれの植物及びその一部にも当てはまる。
一実施形態では、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、植物またはその一部内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴである。
一実施形態では、植物またはその一部内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、植物またはその一部内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂肪の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、ＯＢＣポリペプチドはオレオシンである。あるいは、ＯＢＣポリペプチドはＬＤＡＰである。
一実施形態では、植物またはその一部は、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、２種類の転写因子ポリペプチド、例えばＷＲＩ１とＬＥＣ２、またはＷＲＩ１とＬＥＣ１等をコードする２つの外因性ポリヌクレオチドを含む。
本発明（第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８及び第１９の態様を含む）の細胞、植物及びその一部の各実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、及び細胞内でのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドはＳＤＰ１リパーゼである。
本発明（第２、第３、第５、第６、第７、第８、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８及び第１９の態様を含むが、第５及び第１０の態様を除く）の細胞、植物及びその一部の各実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド、ＬＥＣ２ポリペプチド、ＬＥＣ１ポリペプチドまたはＬＥＣ１様ポリペプチドであり、１つ以上の非極性脂肪の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴであり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ、好ましくはＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチド、より好ましくはＦＡＴＡポリペプチド、または中鎖脂肪酸チオエステラーゼ以外の脂肪酸チオエステラーゼである。
本発明（第２、第３、第４，第５、第６、第７、第８、第９，第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８及び第１９の態様を含む）の細胞、植物及びその一部の上記各実施形態では、植物またはその一部内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドは、少なくとも２種のポリペプチドの組み合わせ、好ましくはＷＲＩ１ポリペプチド及びＬＥＣ２ポリペプチドである。より好ましくは、前記少なくとも２種の転写因子ポリペプチドは、異なるプロモーターから発現する。最も好ましくは、前記少なくとも２種のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドは、細胞または植物ゲノムに組み込まれる単一の遺伝子構築物に連結される。
上記各実施形態において、植物が双子葉植物であるとき、前記転写因子が単子葉植物転写因子であってもよい。反対に、植物が単子葉植物であるとき、前記転写因子が双子葉植物転写因子であってもよい。前記転写因子は、好ましくはＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１（配列番号２１または２２）以外の転写因子である。
上記各実施形態では、植物が、最初のトランスジェニックコムギ植物に由来する少なくとも２世代目の子孫植物であり、好ましくは導入遺伝子に対してホモ接合性であることが好ましい。
更なる実施形態では、植物またはその一部の付加的な遺伝子改変は、本発明の細胞に関連して定義された通りである。
一実施形態では、本発明（第６、第７、第８、第９，第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８及び第１９の態様を含む）の植物またはその一部は、以下の特徴の１つ以上またはそのすべてを有する（該当する場合）、
ｉ）植物は、第１の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する部分と比較して、総脂肪酸の合成が増加しているか、または第１の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する部分と比較して、総脂肪酸の異化が減少しているか、またはその両方であり、それによって第１の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する部分と比較して、総脂肪酸のレベルが増加している部分、好ましくは生育部分を含む、
ｉｉ）植物は、第１の外因性ポリヌクレオチドを有し、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する部分と比較して、ＴＡＧ、ＤＡＧまたはＭＡＧ、好ましくはＴＡＧの合成を触媒する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼの発現及び／または活性が増加している、部分、好ましくは生育部分を含む、
ｉｉｉ）植物は、第１の外因性ポリヌクレオチドを有し、植物部分内の色素体でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く、相当する部分と比較して、色素体中のアシル−ＡＣＰ及びＧ３Ｐからのリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の産生が減少している、部分、好ましくは生育部分を含む、
ｉｖ）植物は、外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する部分と比較して、総脂肪酸含有量及び／またはガラクト脂質の含有量のうち、Ｃ１８：３脂肪酸に対するＣ１６：３の比率が変化している、好ましくは比率が減少している部分、好ましくは生育部分を含む、
ｖ）植物の生育部分は、好ましくは開花前に、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を含む、
ｖｉ）植物の生育部分は、好ましくは開花前に、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）のＴＡＧ含有量を含む、
ｖｉｉ）転写因子ポリペプチド（複数を含む）が、ＷＲＩ１、ＬＥＣ１、ＬＥＣ１様、ＬＥＣ２、ＢＢＭ、ＦＵＳ３、ＡＢＩ３、ＡＢＩ４、ＡＢＩ５、Ｄｏｆ４、およびＤｏｆ１１、好ましくはＷＲＩ１、ＬＥＣ１またはＬＥＣ２からなる群、あるいはＭＹＢ７３、ｂＺＩＰ５３、ＡＧＬ１５、ＭＹＢ１１５、ＭＹＢ１１８、ＴＡＮＭＥＩ、ＷＵＳ、ＧＦＲ２ａ１、ＧＦＲ２ａ２及びＰＨＲ１からなる群から選択される、
ｖｉｉｉ）オレイン酸は、植物またはその一部中、総脂肪酸含有量の少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは約６５％（ｍｏｌ％）または２０％〜約６５％を占める、
ｉｘ）植物またはその一部、好ましくは生育部分内の非極性脂質では、水酸基、エポキシ基、シクロプロパン基、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、共役二重結合、分枝鎖（例えばメチル化若しくはヒドロキシル化された分枝鎖、またはそれらの２つ以上の組み合わせ）、または上述の基、結合若しくは分枝鎖のうち任意の２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含む、１種以上の脂肪酸レベルが増加している、
ｘ）植物またはその一部、好ましくは生育部分の非極性脂質は、エイコサジエン酸（ＥＤＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１種以上の多価不飽和脂肪酸を含む、
ｘｉ）部分が、生育植物部分、例えば葉または茎、またはその一部である、
ｘｉｉ）１つ以上またはすべてのプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーター、好ましくは組織特異的プロモーター（例えば葉及び／または茎に特異的なプロモーター）、老化特異的プロモーター等の発生的調節プロモーター（例えば、ＳＡＧ１２プロモーター）、誘導性プロモーター、または概日リズム調節プロモーターから選択され、好ましくは転写因子ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターが構成的プロモーター以外である、
ｘｉｉｉ）植物またはその一部、好ましくは生育部分は、中鎖脂肪酸、好ましくはＣ１２：０、Ｃ１４：０または両方を総脂肪酸含有量のうち少なくとも５％のレベルで含む、総脂肪酸含有量を含み、及び場合により、中鎖長（Ｃ８〜Ｃ１４）、好ましくはＣ１２：０またはＣ１４：０を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるＬＰＡＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、
ｘｉｖ）植物またはその一部、好ましくは生育部分は、オレイン酸レベル及び／またはパルミチン酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、少なくとも２％増加している、及び／またはαリノレン酸（ＡＬＡ）レベル及び／またはリノール酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する植物またはその一部と比較して、少なくとも２％低下している、総脂肪酸含有量を含む、
ｘｖ）植物またはその一部、好ましくは生育部分内の非極性脂質に含まれる、ステロール、好ましくは遊離（非エステル型）ステロール、ステロイルエステル、ステロイルグリコシドの総量のレベルが外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する植物またはその一部の非極性脂質と比較して変化している、
ｘｖｉ）植物またはその一部の非極性脂質は、ワックス及び／またはワックスエステルを含む、
ｘｖｉｉ）植物またはその一部、好ましくは、生育部分が少なくとも約１０００のこのような植物またはその一部の集団またはコレクションの１つのメンバーである、
ｘｖｉｉｉ）植物がサイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、該外因性ポリヌクレオチドが植物内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結されている、
ｘｉｘ）植物またはその一部、好ましくは生育植物部分の１つ以上の非極性脂質のレベル及び／または非極性脂質の総含有量が、それぞれＡｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１（配列番号２１）及びＡｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１（配列番号１）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む相当する植物またはその一部中よりも、重量基準で少なくとも２％多い、
ｘｘ）外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く、相当する植物の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）総含有量と比較して、ＰＵＦＡの総含有量が減少している、
ｘｘｉ）植物部分は、例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）穀物またはトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）穀粒、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ．の葉、または例えばＢｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．種子若しくはダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）種子等の高い総脂肪酸含有量を有するマメ科種子のように、内胚乳に高い総脂肪酸含有量を有する、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）塊茎、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の根、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．）またはサトウモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）の茎、単子葉植物の種子である、
ｘｘｉｉ）植物部分が種子である場合、相当する野生型種子と実質的に同等の速度で種子が生長する、あるいは土壌に植え付けされて実る植物の場合、その種子が相当する野生型種子と実質的に同等の速度で生長する、
ｘｘｉｉｉ）植物は、珪藻植物（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）、金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、ハプト藻、茶藻類または不等毛藻類等の藻植物である。
上記実施形態では、好適な植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉部分または少なくとも１ｃｍの長さを有する茎部分である。
上記態様の一実施形態では、植物または植物部分は、もう繁殖できないように、または生きた植物を発生させないように処理されており、すなわち死滅している。例えば、植物または植物部分は、乾燥及び／または粉砕されている。
上記実施形態では、植物部分の非極性脂質の総含有量は、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴをコードしているが、上記の各態様で本明細書に記載されている他の外因性ポリヌクレオチド及び遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された相当する植物部分での非極性脂質の総含有量よりも、少なくとも３％多く、より好ましくは少なくとも５％多いことが好ましい。植物の茎または根に、その程度の増加が見られることがより好ましい。
一実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子改変、好ましくは、ＯＢＣ若しくは脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、または植物内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変、より好ましくは、ＦＡＴＡチオエステラーゼ若しくはＬＤＡＰをコードする、または植物のＳＤＰ１ ＴＡＧリパーゼ等の内因性ＴＡＧリパーゼの発現を減少させる外因性ポリヌクレオチドを加えた結果、特に植物開花前の、更により詳細には植物の茎及び／または根の導入遺伝子ＷＲＩ１及びＤＧＡＴの対に追加されたとき、植物部分の非極性脂質の総含有量が相乗作用的に増加する。例えば、実施例８、１１および１５を参照されたい。好ましい実施形態では、植物の茎または根のＴＡＧ含有量の増加は、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１をコードしているが、ＦＡＴＡチオエステラーゼ、ＬＤＡＰ、及び植物のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く遺伝子で形質転換された、相当する部分と比較して、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍である。最も好ましくは、少なくとも、第１の外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
第６、第７、第８、第９，第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１６、第１８及び第１９の態様の各実施形態では、植物またはその一部は、改変されていない植物またはその一部と比較して、生長及び生殖の能力が大幅に減少しないという点で、表現型的に正常であることが好ましい。好ましくは、バイオマス、生長速度、発芽率、貯蔵器官サイズ、種子サイズ及び／または実った種子の生存可能数が、同一条件下で生長した相当する野生型植物のそれの少なくとも９０％を下回らない。一実施形態では、植物は相当する野生型植物と同程度に稔性の雌雄であり、及びその花粉（発生する場合）は野生型植物の花粉と同程度に生存可能、好ましくは約１００％生存可能である。一実施形態では、植物は、相当する野生型植物の種子の発芽率と比較して、少なくとも９０％の発芽率を有する種子を実らせる。一実施形態では、本発明の植物は、同一条件下で生長した相当する野生型植物の高さと比較して、少なくとも９０％である植物の高さを有する。これらの各特徴の組み合わせが想定される。代替的実施形態では、本発明の植物は、同一条件下で生長した相当する野生型植物の高さと比較して、少なくとも６０％〜９０％である植物の高さを有する。一実施形態では、本発明の植物またはその一部、好ましくは植物の葉は、壊死の増加を呈さない。すなわち、壊死（生じる場合）の程度が、同一条件下で生長した及び植物成長の同段階にある、相当する野生型植物またはその一部によって生じるものと同様である。この特徴は特に、ＦＡＴＢチオエステラーゼ等の脂肪酸チオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む植物またはその一部に当てはまる。
以降の各実施形態は、本発明（第６、第７、第８、第９，第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１６、第１８及び第１９の態様を含む）の植物またはその一部、ならびに植物またはその一部の産生方法またはその使用方法に当てはまる。一実施形態では、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドは、植物またはその一部のＴＡＧ、ＤＡＧまたはモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、好ましくは植物またはその一部でのＴＡＧの生合成に関与する、例えばＤＧＡＴ、ＰＤＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＧＰＡＴまたはＭＧＡＴ等の脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ、好ましくはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴである。
別の実施形態では、植物またはその一部のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドは、ＳＤＰ１リパーゼ、Ｃｇｉ５８ポリペプチド、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（例えばＡＣＸ１またはＡＣＸ２）、またはＰＸＡ１ペルオキシソームＡＴＰ結合カセットトランスポーター等の植物内での脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドであり、好ましくはＳＤＰ１リパーゼである。
一実施形態では、油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチドは、ポリオレオシン若しくはカレオシン等のオレオシン、または好ましくは脂肪滴会合タンパク質（ＬＤＡＰ）である。
一実施形態では、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、ＦＡＴＡポリペプチドまたはＦＡＴＢポリペプチド等のＣ１６またはＣ１８脂肪酸チオエステラーゼ、ＡＢＣＡ９ポリペプチド等の脂肪酸トランスポーター、または長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＬＡＣＳ）である。
一実施形態では、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドは、脂肪酸トランスポーターまたはそのサブユニット、好ましくはＴＧＤポリペプチド、例えばＴＧＤ１ポリペプチド、ＴＧＤ２ポリペプチド、ＴＧＤ３ポリペプチドまたはＴＧＤ４ポリペプチド等である。
一実施形態では、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）産生に関与するポリペプチドは、色素体ＧＰＡＴ、色素体ＬＰＡＡＴまたは色素体ＰＡＰである。
一実施形態では、本発明の植物またはその一部は、１６：３植物またはその一部であり、次の１つ以上またはそのすべてを含む：
ａ）外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較して、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、及び
ｃ）第２の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変。ここでの外因性ポリヌクレオチドは、植物またはその一部内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
代替的実施形態では、本発明の植物またはその一部は、１８：３植物またはその一部である。
一実施形態では、植物の生育部分は、植物開花前に少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、８％〜１５％または９％〜１２％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を含む。
一実施形態では、１つ以上またはすべての遺伝子改変は、遺伝子を部分的に、または完全に不活性化する内因性遺伝子の変異、例えばポイントミューテーション、挿入または欠失（または、その１つ以上の組み合わせ）等であり、好ましくは誘導型変異である。ポイントミューテーションは、遺伝子またはコードされたポリペプチドの活性を抑制する未成熟終止コドン、スプライス部位変異、フレームシフト変異またはアミノ酸置換変異であり得る。欠失は、遺伝子の転写されたエキソンまたはプロモーター内の１つ以上のヌクレオチドにあっても、複数のエキソンに跨がってもまたは渡ってもよく、遺伝子全体に欠失が及んでいてもよい。好ましくは、欠失は、ＺＦ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ技術を使用して誘導される。代替的実施形態において、１つ以上またはすべての遺伝子改変は、内因性遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドであり、ここでの外因性ポリヌクレオチドは、植物またはその一部内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
一実施形態では、ＷＲＩ１をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号２１〜７５または２０５〜２１０のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号２１〜７５または２０５〜２１０のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下でｉ）及び／またはｉｉ）にハイブリダイズするヌクレオチド。好ましくは、ＷＲＩ１ポリペプチドは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１（配列番号２１または２２）以外のＷＲＩ１ポリペプチドである。より好ましくは、ＷＲＩ１ポリペプチドは、配列番号２０８に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも３０％同一であるポリペプチドを含む。
一実施形態では、非極性脂質の総含有量または１つ以上の非極性脂質、及び／または植物若しくはその一部のオレイン酸若しくはＰＵＦＡのレベルは、植物またはその生育部分から得た脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを用いた分析によって決定可能である。
更なる実施形態において、植物部分が葉である場合、葉の非極性脂質の総含有量は、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を用いた分析によって決定可能である。
一実施形態では、植物またはその一部は、少なくとも約１０００のこのような植物または部分の集団またはコレクションのメンバーである。
更なる態様では、本発明は、各々が本発明の植物であり、耕地で生長する、少なくとも約１０００の植物の集団を提供する。
別の態様では、本発明は、各々が本発明の生育植物部分であり、該生育植物部分が耕地で生長した植物から採取された、少なくとも約１０００の生育植物部分のコレクションを提供する。
本発明の細胞、非ヒト生物、植物またはその一部の一実施形態では、細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドはＷＲＩ１ポリペプチド転写因子であり、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドはＤＧＡＴ（例えばＤＧＡＴ１またはＤＧＡＴ２）またはＰＤＡＴであり、及び細胞内でのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドはＳＤＰ１リパーゼである。好ましい実施形態では、油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチドはオレオシンであり、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドは、脂肪酸チオエステラーゼ（例えば、ＦＡＴＡまたはＦＡＴＢチオエステラーゼ）であり、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドはＴＧＤポリペプチド、好ましくはＴＧＤ１ポリペプチドであり、色素体内のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）産生に関与するポリペプチドは、色素体ＧＰＡＴである。より好ましい実施形態では、細胞は生育植物部分にあり、植物の開花前の生育植物部分のＴＡＧ含有量は少なくとも８％（％乾重量）である。
一実施形態では、植物、生育植物部分、非ヒト生物またはその一部、種子またはジャガイモ塊茎は、ＷＲＩ１をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴまたはＰＤＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、ＳＤＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡをコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、及びオレオシンをコードする第４の外因性ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、生育植物部分、非ヒト生物またはその一部、種子またはジャガイモ塊茎は、以下の１つ以上またはそのすべての特徴を有する：
ｉ）脂質総含有量が少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％または少なくとも１５．５％（重量％）、
ｉｉ）外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物の脂質総含有量が少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、または少なくとも１０倍である、
ｉｉｉ）ＴＡＧの総含有量が少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％または少なくとも７％（乾重量または種子重量の重量％）、
ｉｖ）外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧの総含有量が、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１２０倍である、
ｖ）ＴＡＧ中の脂肪酸のうち、オレイン酸が少なくとも１５％、少なくとも１９％または少なくとも２２％（乾重量または種子重量の重量％）を占める、
ｖｉ）外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のオレイン酸レベルが、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも１７倍である、
ｖｉｉ）ＴＡＧ中の脂肪酸のうち、パルミチン酸が少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３３％（重量％）を占める、
ｖｉｉｉ）外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のパルミチン酸レベルが、少なくとも１．５倍である、
ｉｘ）ＴＡＧ中の脂肪酸のうち、リノール酸が少なくとも２２％、少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３４％（重量％）を占める、
ｘ）ＴＡＧ中の脂肪酸のうち、αリノレン酸が２０％未満、１５％未満、１１％未満または８％未満（重量％）を占める、
ｘｉ）外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のαリノレン酸レベルが、少なくとも１／５、または少なくとも１／８である、
ｘｉｉ）ジャガイモ塊茎の場合、ＴＡＧ含有量が乾重量基準で少なくとも０．５％、及び／または総脂肪酸含有量が乾重量基準で少なくとも１％、好ましくは少なくとも１．５％または少なくとも２．０％である。
本発明の植物の種子、または植物から得た種子もまた提供される。
別の態様では、本発明は、ＴＡＧ含有量が重量基準（乾重量）で少なくとも５％、好ましくは少なくとも６％、より好ましくは少なくとも７％である、少なくとも１ｇの乾重量のトランスジェニック植物の茎、または茎の一部を提供する。一実施形態では、トランスジェニック植物の茎または茎の一部は、双子葉植物のものであるか、または好ましくは双子葉植物から採取される。あるいは、トランスジェニック植物の茎または茎の一部は、単子葉植物のものであるか、または好ましくは単子葉植物から採取される。一実施形態では、植物の茎または茎の一部は、サトウキビ以外の植物のものであるか、またはそれ以外からのものである。各実施形態において、植物の茎または茎の一部は、本発明の細胞または植物に関連して定義された通りの１つ以上の特徴を更に有する。
別の態様では、本発明は、以下を含む植物細胞を提供する：
ａ）ＰＤＡＴをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、
ｂ）第１の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチド、好ましくはＴＧＤポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第１の遺伝子改変、及び次の１つ以上：
ｃ）遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチド、好ましくはＳＤＰ１ポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第２の遺伝子改変、
ｄ）第２の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチド、好ましくは脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、及び
ｅ）第３の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する第３の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。好ましい実施形態では、細胞内の第１、第２または第３の遺伝子改変または第２の外因性ポリヌクレオチドの存在により、ＰＤＡＴを有するが、付加的な遺伝子改変または外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の非極性脂質の総含有量が相乗作用的に増加する。より好ましくは、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター以外のプロモーターから発現する。
別の態様では、本発明は、本発明の組み換え真核細胞を得るための工程を提供し、該方法は以下のステップを含む：
ｉ）本明細書で定義される少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド及び／または少なくとも１つの遺伝子改変を真核細胞に導入し、本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変のセットを含む真核細胞を産生すること、
ｉｉ）細胞またはその子孫細胞の外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を発現させること、
ｉｉｉ）細胞または子孫細胞の脂質含有量を分析すること、及び
ｉｖ）本発明の細胞を選択すること。
一実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、細胞または子孫細胞のゲノムに安定して組み込まれる。
一実施形態では、工程は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む細胞または子孫細胞からトランスジェニック植物を再生するステップを更に含む。
更に別の実施形態では、トランスジェニック植物の再生ステップは、細胞またはその子孫細胞の１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップの前、及び／または細胞または子孫細胞の脂質含有量を分析するステップの前、及び／または１つ以上の非極性脂質のレベルが増加している細胞または子孫細胞を選択するステップの前に実施される。
一実施形態では、工程は、トランスジェニック植物から種子または子孫植物を取得するステップを含み、該種子または子孫植物が１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを更に含む。
更にまた別の実施形態では、それから選択された細胞若しくは再生植物または再生植物の生育植物部分若しくは種子は、本明細書で定義される１つ以上の特徴を有する。
更なる態様では、本発明は、本明細書で定義される１組の外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変をゲノムに組み込んだ植物の産生方法を提供し、該方法は以下のステップを含む：
ｉ）一方の植物が本明細書で定義される少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド及び／または少なくとも１つの遺伝子改変を含み、他方の植物が本明細書で定義される少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド及び／または少なくとも１つの遺伝子改変を含み、かつ両者間で２つの親植物が本明細書で定義される１組の外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変を含む、２つの親植物を交配すること、
ｉｉ）本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変のセットが存在するまたは存在しない交配種から１つ以上の子孫植物を選別すること、
ｉｉｉ）本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子組み替えのセットを含む子孫植物を選択し、
それによって植物を産生すること。
本発明の工程を用いて得られたトランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物、またはその一部もまた提供され、それから得られたものは本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子組み替えの組を含む。
外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変の組を欠く、相当する細胞、非ヒト生物若しくはその一部、または種子と比較して、１つ以上の非極性脂質の生成能力が増強された、トランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部を産生するための、本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変のセットの使用もまた提供され、ここでの各外因性ポリヌクレオチドはトランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部または種子での外因性ポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
好ましくは、転写因子ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドに作動可能に連結される、少なくとも１つのプロモーターは、構成的プロモーター以外のプロモーターである。
一実施形態では、トランスジェニック細胞、非ヒト生物若しくはその一部、または種子は、本明細書で定義される１つ以上の特徴を含む。
更に別の態様では、本発明は工業製品の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部を得ること、
ｉｉ）加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを非ヒト生物またはその一部の脂質にｉｎ ｓｉｔｕで適用することにより、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品に転換すること、及び
ｉｉｉ）工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
更に別の態様では、本発明は工業製品の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部を得ること、
ｉｉ）ステップｉ）の細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部または種子を物理的に処理すること、
ｉｉｉ）加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、処理された細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の脂質に適用することにより、処理された細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を同時にまたは後に工業製品へと転換すること、及び
ｉｖ）工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
上記の２つの態様の一実施形態において、植物部分は、生育植物部分である。
更に別の態様では、本発明は工業製品の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、約１８％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ること、
ｉｉ）加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを生育植物部分の脂質にｉｎ ｓｉｔｕで適用することにより、生育植物部分の少なくとも一部の脂質を工業製品に転換すること、及び
ｉｉｉ）工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
別の態様では、本発明は工業製品の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、約１８％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ること、
ｉｉ）ステップｉ）の生育植物部分を物理的に処理すること、
ｉｉｉ）加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、処理された生育植物部分の脂質に適用することにより、処理された生育植物部分の少なくとも一部の脂質を同時にまたは後に工業製品へと転換すること、及び
ｉｖ）工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
更にまた別の態様では、本発明は工業製品の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ることであって、該植物が１６：３植物またはその生育部分であるステップ、
ｉｉ）加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを生育植物部分の脂質にｉｎ ｓｉｔｕで適用することにより、生育植物部分の少なくとも一部の脂質を工業製品へと転換すること、及び
ｉｉｉ）工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
別の態様では、本発明は工業製品の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ることであって、該植物が１６：３植物またはその生育部分であるステップ、
ｉｉ）ステップｉ）の生育植物部分を物理的に処理すること、
ｉｉｉ）加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、処理された生育植物部分の脂質に適用することにより、処理された生育植物部分の少なくとも一部の脂質を同時にまたは後に工業製品へと転換すること、及び
ｉｖ）工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
一実施形態では、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子を物理的に処理するステップは、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子を回転、加圧、圧縮または摩砕のうち１つ以上を含む。
一実施形態では、工程は以下のステップを含む：
（ａ）細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の非極性脂質含有量の少なくとも一部を非極性脂質として抽出すること、
（ｂ）抽出された非極性脂質を回収すること。ここでのステップ（ａ）及び（ｂ）は、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品へと転換するステップの前に実施される。
一実施形態では、抽出された非極性脂質はトリアシルグリセロールを含み、該トリアシルグリセロールは抽出された脂質のうち少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％を含む。
一実施形態では、工業製品は、炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル及び／または脂肪酸エチルエステル、アルカン（例えば、メタン、エタンまたは長鎖アルカン）、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素及び／または水素ガス、バイオアルコール（例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール）、バイオ炭、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の混合物等である。好ましい実施形態では、生育植物部分の総脂肪酸含有量は、少なくとも５％のＣ１２：０、Ｃ１４：０を含み、あるいはＣ１２：０とＣ１４：０との合計が総脂肪酸含有量の少なくとも５％であり、及び生育植物部分の脂質から製造される工業製品は航空燃料の成分である。
更に別の態様では、本発明は抽出された脂質の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部を得ること、
ｉｉ）細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部または種子から脂質を抽出すること、及び
ｉｉｉ）抽出された脂質を回収すること、
それによって抽出された脂質を製造すること。
更に別の態様では、本発明は抽出された脂質の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、約１８％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ること、
ｉｉ）生育植物部分から脂質を抽出すること、及び
ｉｉｉ）抽出された脂質を回収すること、
それによって抽出された脂質を製造すること。
更に別の態様では、本発明は抽出された脂質の製造工程を提供し、該工程は以下のステップを含む：
ｉ）少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ることであって、該植物が１６：３植物またはその生育部分であるステップ、
ｉｉ）生育植物部分から脂質を抽出すること、及び
ｉｉｉ）抽出された脂質を回収すること、
それによって抽出された脂質を製造すること。
一実施形態では、抽出の工程は、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の乾燥、回転、加圧、圧縮または摩砕のうち１つ以上、及び／または抽出した脂質または種子油の精製を含む。
一実施形態では、工程は、抽出工程に有機溶媒を使用して油を抽出する。
更に別の実施形態では、工程には、抽出された脂質または油を容器内に収集すること及び／または抽出された脂質または油を脱ガム、脱臭、脱色、乾燥、分画の１つ以上によって回収すること、抽出された脂質または油から少なくとも一部のワックス及び／若しくはワックスエステルを除去すること、あるいは抽出された脂質または油からの脂肪酸成分を分析することを含む。
一実施形態では、抽出された脂質または油の体積は、少なくとも１リットルである。
更に別の実施形態では、以下の１つ以上またはそのすべての特徴が該当する：
（ｉ）抽出された脂質または油はトリアシルグリセロールを含み、該トリアシルグリセロールは抽出された脂質または油のうち少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９６％を占める、
（ｉｉ）抽出された脂質または油は、遊離ステロール、ステロイルエステル、ステロイルグリコシド、ワックス若しくはワックスエステル、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
（ｉｉｉ）抽出された脂質または油のステロール総含有量及び／または成分は、相当する細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子から得た、抽出された脂質または油のステロール含有量及び／または成分と有意差がある。
一実施形態では、工程は、抽出された脂質または油を工業製品に転換することを更に含む。
一実施形態では、工業製品は、炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル及び／または脂肪酸エチルエステル、アルカン（例えば、メタン、エタンまたは長鎖アルカン）、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素及び／または水素ガス、バイオアルコール（例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール）、バイオ炭、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の混合物等である。好ましい実施形態では、生育植物部分の総脂肪酸含有量は、少なくとも５％のＣ１２：０、Ｃ１４：０を含み、あるいはＣ１２：０とＣ１４：０との合計が総脂肪酸含有量の少なくとも５％であり、及び生育植物部分の脂質から製造される工業製品は航空燃料の成分である。
更に別の実施形態では、植物部分は、植物地上部または縁色植物部分、好ましくは生育植物部分、例えば植物の葉または茎である。代替的実施形態では、植物部分は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）塊茎またはテンサイ等の塊茎または食用根である。
更にまた別の実施形態では、工程は、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部（例えば、塊茎若しくは食用根等）、または種子を、好ましくは機械式収穫機を用いて、あるいは藻類または菌類生物の濾過、遠心、沈殿、浮遊または凝集を含む工程により、採取するステップを更に含む。
別の実施形態では、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子中の脂質レベル及び／または抽出された脂質または油中の脂質レベルは、抽出された脂質または油から調製された脂肪酸メチルエステルに関するガスクロマトグラフィーを用いた分析によって決定可能である。
更にまた別の実施形態では、工程は、植物から部分を採取することを更に含む。
一実施形態では、植物部分は、非極性脂質の総含有量が、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、約１８％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）を占める生育植物部分である。
更に別の実施形態では、植物部分は、ＴＡＧの総含有量が、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、約１８％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）を占める生育植物部分である。
別の実施形態では、植物部分は、非極性脂質の総含有量が、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）を占める生育植物部分であり、該生育植物部分は１６：３植物からのものである。
更に別の実施形態では、植物部分は、ＴＡＧの総含有量が、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、８％〜７５％、１０％〜７５％、１１％〜７５％、約１５％〜７５％、約２０％〜７５％、約３０％〜７５％、約４０％〜７５％、約５０％〜７５％、約６０％〜７５％、または約２５％〜５０％（ｗ／ｗ乾重量）を占める生育植物部分であり、該生育植物部分は１６：３植物からのものである。
種子を実らせるための工程もまた提供され、該工程は以下を含む：
ｉ）本発明の植物を生長させること、及び
ｉｉ）その植物から種子を採取すること。
一実施形態では、上記工程は、各々が本発明の植物である少なくとも約１０００の植物の集団を生長させること、及び植物の集団から種子を採取することを含む。
更にまた別の態様では、本発明は以下のステップを含む発酵工程を提供する：
ｉ）本発明の組み換え真核細胞、または本発明のトランスジェニック非ヒト生物であって、発酵に好適である該細胞または該非ヒト生物、及び発酵及び脂肪酸生合成に必要な成分を含む液体組成物を収容する容器を提供すること、ならびに
ｉｉ）前記容器内に収容された液体組成物の発酵を促す条件を与えること。
本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部、または本発明の工程によって得られるものから得られる回収または抽出された脂質もまた提供する。
更なる態様では、本発明は、本発明の工程によって製造される工業製品を提供し、これは炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル及び／または脂肪酸エチルエステル、アルカン（例えば、メタン、エタンまたは長鎖アルカン）、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素及び／または水素ガス、バイオアルコール（例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール）、バイオ炭、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の混合物等である。
本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部の使用、または工業製品を製造するための本発明の回収または抽出された脂質の使用もまた提供する。
本発明の工業製品の例としては、炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル及び／または脂肪酸エチルエステル、アルカン（例えば、メタン、エタンまたは長鎖アルカン）、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素及び／または水素ガス、バイオアルコール（例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール）、バイオ炭、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。
更なる態様では、本発明は燃料の製造工程を提供し、該工程は以下を含む：
ｉ）本発明の脂質を、場合により触媒の存在下で、アルコールと反応させ、アルキルエステルを得ること、及び
ｉｉ）場合により、該アルキルエステルと石油系燃料を混合すること。
上記工程の一実施形態では、アルキルエステルはメチルエステルである。
更にまた別の態様では、本発明は合成ディーゼル燃料の製造工程を提供し、該工程は以下を含む：
ｉ）本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部中の脂質を、熱分解または熱水処理を含む工程によりバイオ油に転換すること、または気化により合成ガスに転換すること、
ｉｉ）分画、好ましくは約１５０℃〜約２００℃または約２００℃〜約３００℃で凝縮する炭化水素化合物の選別を含む工程により、バイオ油を合成ディーゼル燃料に転換すること、または金属触媒または微生物触媒を使用して合成ガスをバイオ燃料に転換すること。
別の態様では、本発明はバイオ燃料の製造工程を提供し、該工程は、本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部中の脂質を、熱分解によりバイオ油に、発酵によりバイオアルコールに、または気化若しくは嫌気性消化によりバイオガスに転換することを含む。
上記工程の一実施形態では、部分は生育植物部分である。
飼料を製造する工程もまた提供され、該工程は、本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部、または本発明の工程によって得られるもの、または抽出物またはその部分を少なくとも１つの他の食品原料成分と混合することを含む。
更なる態様では、本発明は、本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部、または本発明の工程によって得られるもの、または抽出物若しくはその部分を含む飼料、化粧品または化学薬品を提供する。
別の態様では、本発明は動物に給餌する工程を提供し、該工程は、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、または本発明の回収若しくは抽出された脂質を動物に与えることを含む。
特段の記載のない限り、本明細書のいかなる実施形態も、他のいかなる実施形態に準用するものと解釈すべきである。
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、例示目的のみを意図している。機能的に等価な生成物、組成物及び方法は、明らかに本明細書に記載される本発明の範囲内である。
本明細書を通じて、特段の記載のない限り、または文脈上必要とされない限り、単一のステップ、物質の組成、ステップの群または物質の組成の群への言及は、これらのステップ、物質の組成、ステップの群または物質の組成の群の１つ及び複数（すなわち１以上）を包含すると解釈すべきである。
本発明は、以下の非限定的な実施例により、及び添付の図を参照することにより、以下に記載される。
真核細胞での脂質合成を表す図である。色素体で合成された一部の脂肪酸の、色素体結合型膜（ＰＬＡＭ）を介した小胞体（ＥＲ）への移出、及び真核型ガラクト脂質合成のための、ＥＲから色素体への一部の脂肪酸の移入を示す。略語は以下の通りである：アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡ：アセチル−コエンザイムＡ及びマロニル−コエンザイムＡ；ＡＣＣａｓｅ：アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；ＦＡＳ：脂肪酸シンターゼ複合体；１６：０−ＡＣＰ、１８：０−ＡＣＰ及び１８：１−ＡＣＰ：Ｃ１６：０−アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）、Ｃ１８：０−アシル担体タンパク質、Ｃ１８：１−アシル担体タンパク質；ＫＡＳＩＩ：ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＥＣ２．３．１．４１）；ＰＬＰＡＡＴ：色素体ＬＰＡＡＴ；ＰＧＰＡＴ：色素体ＧＰＡＴ；ＰＡＰ：ＰＡホスホリラーゼ（ＥＣ３．１．３．４）；Ｇ３Ｐ：グリセロール−３−リン酸；ＬＰＡ：リゾホスファチジン酸；ＰＡ：ホスファチジン酸；ＤＡＧ：ジアシルグリセロール；ＴＡＧ：トリアシルグリセロール；アシル−ＣｏＡ及びアシル−ＰＣ：アシル−コエンザイムＡ及びアシル−ホスファチジルコリン；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ＧＰＡＴ：グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ；ＬＰＡＡＴ：リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５１）；ＬＰＣＡＴ：アシル−ＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ；または同義語、１−アシルグリセロホスホコリンＯ−アシルトランスフェラーゼ；アシル−ＣｏＡ：１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２３）；ＣＰＴ：ＣＤＰ−コリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ；または同義語、１−アルキル−２−アセチルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ；アルキルアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ；コリンホスホトランスフェラーゼ；ホスホリルコリン−グリセリドトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．８．２）；ＰＤＣＴ：ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ；ＰＬＣ：ホスホリパーゼＣ（ＥＣ３．１．４．３）；ＰＬＤ：ホスホリパーゼＤ；コリンホスファターゼ；レシチナーゼＤ；リポホスホジエステラーゼＩＩ（ＥＣ３．１．４．４）；ＰＤＡＴ：リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ；または同義語、リン脂質：１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）；ＦＡＤ２：脂肪酸Δ１２−デサチュラーゼ；ＦＡＤ３、脂肪酸Δ１５−デサチュラーゼ；ＵＤＰ−Ｇａｌ：ウリジン二リン酸ガラクトース；ＭＧＤＳ：モノガラクトシルジアシルグリセロールシンターゼ；ＭＧＤＧ：モノガラクトシルジアシルグリセロール；ＤＧＤＧ：ジガラクトシルジアシルグリセロール；ＦＡＤ６、７、８：それぞれ色素体脂肪酸Δ１２−デサチュラーゼ、色素体ω３−デサチュラーゼ、低温誘導性の色素体ω３−デサチュラーゼ。 双子葉植物の種子油含有量を増加させる構築物の模式的な遺伝子地図。略語：ＰＲＯ Ｐｉｓｓａ−ビシリン、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍのビシリンプロモーター及び５´ＵＴＲ；ＴＭＶリーダー、タバコモザイクウイルスの５´ＵＴＲ；Ａｒａｔｈ−ＤＧＡＴ１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ１をコードするタンパク質コード領域；ＴＥＲ Ｇｌｙｍａ−レクチン、Ｇ．ｍａｘレクチン遺伝子の３´末端／ポリアデニル化領域；ＰＲＯ Ｐｈａｖｕ−ファゼオリン、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓのファゼオリンタンパク質遺伝子からのプロモーター；Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１をコードするタンパク質コード領域；ＴＥＲ Ａｇｒｔｕ−ＮＯＳ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｎｏｓ遺伝子の３´末端／ポリアデニル化領域；ＰＲＯ Ｐｈａｖｕ−ＰＨＡ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓのファゼオリン遺伝子のプロモーター；Ｓｅｓｉｎ−オレオシン、Ｓｅｓａｍｅ ｉｎｄｉｃｕｍのオレオシン遺伝子をコードするタンパク質コード領域；ＴＥＲ Ｐｈａｖｕ−ＰＨＡ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓのファゼオリン遺伝子の３´末端／ポリアデニル化領域。 ベクターｐＯＩＬ１２２の概略図。略語：ＴＥＲ Ａｇｒｔｕ−Ｎｏｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼターミネーター；ＮＰＴＩＩ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質コード領域；ＰＲＯ ＣａＭＶ３５Ｓ−Ｅｘ２、二重エンハンサー領域を有するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；Ａｒａｔｈ−ＤＧＡＴ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼタンパク質コード領域；ＰＲＯ Ａｒａｔｈ−Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーター；Ａｒａｔｈ−ＦＡＴＡ２、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＦＡＴＡ２チオエステラーゼタンパク質コード領域；Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１転写因子タンパク質コード領域；ＴＥＲ Ｇｌｙｍａ−レクチン、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのレクチンターミネーター；ｅｎＴＣＵＰ２プロモーター、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの潜在的構成的プロモーター；ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２、ゲートウエイ組み換え部位；ＮＢ ＳＤＰ１断片、ｈｐＲＮＡｉサイレンシングの標的となるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＳＤＰ１領域；ＯＣＳターミネーター、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトピンシンターゼターミネーター。Ｔ−ＤＮＡ領域の外側の主鎖特徴はｐＯＲＥ０４に由来する（Ｃｏｕｔｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。 Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉（ｎ＝４）におけるＭＣＦＡ産生に、ＷＲＩ１＋ＤＧＡＴ１媒介性の高い油分環境の効果を示す、総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）のプロファイル（重量パーセント）。Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１の添加後に、最も高いＭＣＦＡ産生が観察された。 ＭＣＦＡの蓄積に対するＷＲＩ１の効果を明らかにした、葉の総ＦＡＭＥプロファイル（重量パーセント）（ｎ＝４）。Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１の添加により、以前のＣｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴのみの添加と比較して、関連する脂肪酸（Ｃ１２：０、Ｃ１４：０またはＣ１６：０）の産生が大幅に増加した。 ＦＡＴＢ、ＬＰＡＡＴ及びＷＲＩ１と組み合わせた３種のアブラヤシＤＧＡＴの発現後の植物細胞における、ＴＦＡレベル（％重量）、ＴＡＧレベル、ＴＦＡ中のＭＣＦＡレベル（総脂肪酸に占めるＣ１６：０及びＣ１４：０の％比率）及びＴＡＧ中のＭＣＦＡ（ＴＡＧ中の総脂肪酸含有％）。数字１〜１０は、本文（実施例９）に記載された通りである。 ＤＧＡＴ１を共発現させた（右側のバー）、または共発現させない（左側のバー）異なるＷＲＩ１ポリペプチドをコードする遺伝子とともに浸潤した、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中のＴＡＧレベル（％葉乾重量）（ｎ＝３）。サンプルはすべて、Ｐ１９構築物にも浸潤した。 Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＳＤＰ１ヘアピン構築物の概略図。示された遺伝子セグメントについては、実施例１１で説明する。略語は図３に従う。ａｔｔＢ部位はｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ１２ベクターからの組み換え部位を表す。 開花前に採取された、ｐＯＩＬ５１、系統＃６１及び＃６９からのＴ−ＤＮＡで形質転換したタバコ植物の緑葉サンプル中のＴＡＧ含有量。対照（親）は、ｐＪＰ３５０２からのＴ−ＤＮＡで形質転換された植物由来である。 ｐＪＰ３５０２からのＴ−ＤＮＡ単独、またはそれに加えてｐＯＩＬ０５１からのＴ−ＤＮＡを含有する、野生型（ｗｔ）及びトランスジェニックＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の根及び茎組織のＴＡＧレベル（％乾重量）。 ｐＪＰ３５０２からのＴ−ＤＮＡ単独、またはそれに加えてｐＯＩＬ０４９からのＴ−ＤＮＡを含有する、野生型（ｗｔ）及びトランスジェニックＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の根及び茎組織のＴＡＧレベル（％乾重量）。 生長期の結実段階で形質転換されたタバコ植物あり、ｐＯＩＬ０４９、系統＃２３ｃ及び＃３２ｂからのＴ−ＤＮＡで形質転換されたタバコ植物の葉サンプル中のＴＡＧ含有量。対照（親）サンプルは、ｐＪＰ３５０２からのＴ−ＤＮＡで形質転換された植物由来である。上側の線はＴＡＧ中の１８：２のパーセンテージを示し、下側の線は脂肪酸含有量中の１８：３（ＡＬＡ）のパーセンテージを示す。 Ａ．ｐＪＰ３５０２（ＨＯ対照）からのＴ−ＤＮＡ、またはｐＪＰ３５０２とｐＯＩＬ０５１の両方（ｐＯＩＬ５１．６１及びｐＯＩＬ５１．６９）、若しくはｐＪＰ３５０２とｐＯＩＬ０４９の両方（ｐＯＩＬ４９．３２ｂ）からのＴ−ＤＮＡを含有する、野生型植物（ＷＴ）及びトランスジェニック植物由来の葉組織中のデンプン含有量。データは、少なくとも３個体の植物から得た結果の総計を示す。Ｂ．ｐＪＰ３５０２（ＨＯ対照）からのＴ−ＤＮＡ、またはｐＪＰ３５０２とｐＯＩＬ０５１の両方（ｐＯＩＬ５１．６１及びｐＯＩＬ５１．６９）、若しくはｐＪＰ３５０２とｐＯＩＬ０４９の両方（ｐＯＩＬ４９．３２ｂ）からのＴ−ＤＮＡを含有する、野生型植物（ＷＴ）及びトランスジェニック植物の葉組織中のデンプンとＴＡＧ含有量との相関関係。データは、少なくとも３個体の植物から得た結果の総計を示す。 ｐＴＶ５５バイナリーベクターの概略図。略語：ＰＲＯ、プロモーター；ＴＥＲ、３´末端／ポリアデニル化領域；Ａｒａｔｈ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ；Ｌｉｎｕｓ、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ；Ｎｉｃｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ；Ｇｌｙｍａ、Ｇ．ｍａｘ；Ｃｎｌ１、アマ由来のコンリニン１；Ｃｎｌ２、アマ由来のコンリニン２；ＭＡＲ Ｎｉｃａｔ−ＲＢ７、図３と同様のタバコＲＢ７由来のマトリックス付着領域。遺伝子略号ＭＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１、ＧＰＡＴ４、ＷＲＩ１については本文を参照。 ＮＭＲによって決定される、ｐＴＶ５５、ｐＴＶ５６及びｐＴＶ５７で形質転換したＣ．ｓａｔｉｖａ Ｔ２種子の含油率（％）。各データポイントは、各トランスジェニック系統あたり５０ｍｇの種子からなる３つの独立バッチの平均含油量を表す。陰性対照の種子は、温室内の同一条件の下で生長した、野生型（未形質変換）Ｃ．ｓａｔｉｖａ種子であった。Ｎは、構築物ごとの独立したトランスジェニック事象の数を示す。 ＬＤＡＰポリペプチドの系統樹（実施例１５）。 左右の境界間にＴ−ＤＮＡ領域を含む、遺伝子構築物ｐＪＰ３５０６の概略図。略語は、図３に従い、Ｓｅｓｉｎ−オレオシンはＳｅｓａｍｅ ｉｎｄｉｃｕｍオレオシンタンパク質コード領域である。 野生型及びトランスジェニックの高い油量のタバコ生育植物材料を原料とした、ＨＴＰによるバイオ油製造での収率及び発熱量の変化。
配列リストの説明
配列番号１：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＣＡＢ４４７７４．１）
配列番号２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿５６６９５２．１）
配列番号３：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＹ１６３２４．１）
配列番号４：Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＢＣ９４４７４．１）
配列番号５：Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７９．１）
配列番号６：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ９６ＰＤ７．２）
配列番号７：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ５８ＨＴ５．１）
配列番号８：Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ７０ＶＺ８．１）
配列番号９：Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７５．１）
配列番号１０：ＹＦＰトリペプチド−ＤＧＡＴ２及び／またはＭＧＡＴ１／２の保存配列モチーフ
配列番号１１：ＨＰＨＧテトラペプチド−ＤＧＡＴ２及び／またはＭＧＡＴ１／２の保存配列モチーフ
配列番号１２：ＥＰＨＳテトラペプチド−植物ＤＧＡＴ２の保存配列モチーフ
配列番号１３：ＲＸＧＦＸ（Ｋ／Ｒ）ＸＡＸＸＸＧＸＸＸ（Ｌ／Ｖ）ＶＰＸＸＸＦＧ（Ｅ／Ｑ）−推定グリセロールリン脂質ドメインの一部であるＤＧＡＴ２の長い保存配列モチーフ
配列番号１４：ＦＬＸＬＸＸＸＮ−推定中性脂質結合ドメインであるマウスＤＧＡＴ２及びＭＧＡＴ１／２の保存配列モチーフ
配列番号１５：ＧＰＡＴのｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメイン（ＰＦ０１５５３）
配列番号１６：ＧＰＡＴのＨＡＤ様ヒドロラーゼ（ＰＦ１２７１０）スーパーファミリードメイン
配列番号１７：ホスホセリンホスファターゼドメイン（ＰＦ００７０２）。ＧＰＡＴ４〜８は、このドメインに相同のＮ末端領域を含む。
配列番号１８：保存ＧＰＡＴアミノ酸配列ＧＤＬＶＩＣＰＥＧＴＴＣＲＥＰ
配列番号１９：保存ＧＰＡＴ／ホスファターゼアミノ酸配列（モチーフＩ）
配列番号２０：保存ＧＰＡＴ／ホスファターゼアミノ酸配列（モチーフＩＩＩ）
配列番号２１：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１ポリペプチド（Ａ８ＭＳ５７）
配列番号２２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１ポリペプチド（Ｑ６Ｘ５Ｙ６）
配列番号２３：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｌｙｒａｔａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２８７６２５１．１）
配列番号２４：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＷＲＩ１ポリペぺチド（ｐｏｌｙｐｅｐｅｔｉｄｅ）（ＡＢＤ１６２８２．１）
配列番号２５：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＷＲＩ１ポリペチド（ｐｏｌｙｐｐｅｔｉｄｅ）（ＡＤＯ１６３４６．１）
配列番号２６：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５３０３７０．１）
配列番号２７：Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓのＷＲＩ１ポリペプチド（ＡＥＯ２２１３１．１）
配列番号２８：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２５２５３０５．１）
配列番号２９：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２３１６４５９．１）
配列番号３０：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＣＢＩ２９１４７．３）
配列番号３１：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５７８９９７．１）
配列番号３２：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅのＷＲＩ１ポリペプチド（ＢＡＪ８６６２７．１）
配列番号３３：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＥＡＹ７９７９２．１）
配列番号３４：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２４５０１９４．１）
配列番号３５：Ｚｅａ ｍａｙｓのＷＲＩ１ポリペプチド（ＡＣＧ３２３６７．１）
配列番号３６：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５６１１８９．１）
配列番号３７：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍのＷＲＩ１ポリペプチド（ＡＢＬ８５０６１．１）
配列番号３８：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＢＡＤ６８４１７．１）
配列番号３９：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２４３７８１９．１）
配列番号４０：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２４４１４４４．１）
配列番号４１：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５３０６８６．１）
配列番号４２：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５５３２０３．１）
配列番号４３：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２３１５７９４．１）
配列番号４４：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２２７０１４９．１）
配列番号４５：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５３３５４８．１）
配列番号４６：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５５１７２３．１）
配列番号４７：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３６２１１１７．１）
配列番号４８：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２３２３８３６．１）
配列番号４９：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２５１７４７４．１）
配列番号５０：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＣＡＮ７９９２５．１）
配列番号５１：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５７２２３６．１）
配列番号５２：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＢＡＤ１００３０．１）
配列番号５３：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２４４４４２９．１）
配列番号５４：Ｚｅａ ｍａｙｓのＷＲＩ１ポリペプチド（ＮＰ＿００１１７０３５９．１）
配列番号５５：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｌｙｒａｔａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２８８９２６５．１）
配列番号５６：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＡＡＦ６８１２１．１）
配列番号５７：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＮＰ＿１７８０８８．２）
配列番号５８：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｌｙｒａｔａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２８９０１４５．１）
配列番号５９：Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｈａｌｏｐｈｉｌａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＢＡＪ３３８７２．１）
配列番号６０：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＮＰ＿５６３９９０．１）
配列番号６１：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５３０３５０．１）
配列番号６２：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５７８１４２．１）
配列番号６３：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＥＡＺ０９１４７．１）
配列番号６４：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２４６０２３６．１）
配列番号６５：Ｚｅａ ｍａｙｓのＷＲＩ１ポリペプチド（ＮＰ＿００１１４６３３８．１）
配列番号６６：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５１９１６７．１）
配列番号６７：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５５０６７６．１）
配列番号６８：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３６１０２６１．１）
配列番号６９：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５２４０３０．１）
配列番号７０：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００３５２５９４９．１）
配列番号７１：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２３２５１１１．１）
配列番号７２：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＣＢＩ３６５８６．３）
配列番号７３：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２２７３０４６．２）
配列番号７４：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２３０３８６６．１）
配列番号７５：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａのＷＲＩ１ポリペプチド（ＣＢＩ２５２６１．３）
配列番号７６：Ｓｏｒｂｉ−ＷＲＬ１
配列番号７７：Ｌｕｐａｎ−ＷＲＬ１
配列番号７８：Ｒｉｃｃｃｏ−ＷＲＬ１
配列番号７９：Ｌｕｐｉｎ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓのＷＲＩ１ポリペプチド
配列番号８０：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿７５５１７２．１）
配列番号８１：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＡＲ１１４７９．１）
配列番号８２：Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＢＣ９４４７２．１）
配列番号８３：Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＢＶ２１９４５．１）
配列番号８４：Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＢＶ２１９４６．１）
配列番号８５：Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌａｔｕｓのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＡＶ３１０８３．１）
配列番号８６：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＡＦ８２４１０．１）
配列番号８７：Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿４４５８８９．１）
配列番号８８：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿０３６２１１．２）
配列番号８９：ＷＲＩ１モチーフ（Ｒ Ｇ Ｖ Ｔ／Ｓ Ｒ Ｈ Ｒ Ｗ Ｔ Ｇ Ｒ）
配列番号９０：ＷＲＩ１モチーフ（Ｆ／Ｙ Ｅ Ａ Ｈ Ｌ Ｗ Ｄ Ｋ）
配列番号９１：ＷＲＩ１モチーフ（Ｄ Ｌ Ａ Ａ Ｌ Ｋ Ｙ Ｗ Ｇ）
配列番号９２：ＷＲＩ１モチーフ（Ｓ Ｘ Ｇ Ｆ Ｓ／Ａ Ｒ Ｇ Ｘ）
配列番号９３：ＷＲＩ１モチーフ（Ｈ Ｈ Ｈ／Ｑ Ｎ Ｇ Ｒ／Ｋ Ｗ Ｅ Ａ Ｒ Ｉ Ｇ Ｒ／Ｋ Ｖ）
配列番号９４：ＷＲＩ１モチーフ（Ｑ Ｅ Ｅ Ａ Ａ Ａ Ｘ Ｙ Ｄ）
配列番号９５：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのオレオシンポリペプチド（ＣＡＡ５７５４５．１）
配列番号９６：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのオレオシンＳ１−１ポリペプチド（ＡＣＧ６９５０４．１）
配列番号９７：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのオレオシンＳ２−１ポリペプチド（ＡＣＧ６９５０３．１）
配列番号９８：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのオレオシンＳ３−１ポリペプチド（ＡＣＧ６９５１３．１）
配列番号９９：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのオレオシンＳ４−１ポリペプチド（ＡＣＧ６９５０７．１）
配列番号１００：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのオレオシンＳ５−１ポリペプチド（ＡＣＧ６９５１１．１）
配列番号１０１：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａのオレオシン１ポリペプチド（ＡＡＺ２０２７６．１）
配列番号１０２：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａのオレオシン２ポリペプチド（ＡＡＵ２１５００．１）
配列番号１０３：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａのオレオシン３ポリペプチド（ＡＡＵ２１５０１．１）
配列番号１０４：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａのオレオシン５ポリペプチド（ＡＢＣ９６７６３．１）
配列番号１０５：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓのオレオシン１ポリペプチド（ＥＥＦ４０９４８．１）
配列番号１０６：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓのオレオシン２ポリペプチド（ＥＥＦ５１６１６．１）
配列番号１０７：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのオレオシンアイソフォームａポリペプチド（Ｐ２９５３０．２）
配列番号１０８：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのオレオシンアイソフォームｂポリペプチド（Ｐ２９５３１．１）
配列番号１０９：Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍのオレオシン低分子量アイソフォームポリペプチド（ＡＢＢ０１６２２．１）
配列番号１１０：Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍのオレオシン高分子量アイソフォームポリペプチドのアミノ酸配列（ＡＢＢ０１６２４．１）
配列番号１１１：Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓのオレオシンポリペプチド（ＣＡＡ４４２２４．１）
配列番号１１２：Ｚｅａ ｍａｙｓのオレオシンポリペプチド（ＮＰ＿００１１０５３３８．１）
配列番号１１３：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのステロレオシンポリペプチド（ＡＢＭ３０１７８．１）
配列番号１１４：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのステロレオシンＳＬＯ１−１ポリペプチド（ＡＣＧ６９５２２．１）
配列番号１１５：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのステロレオシンＳＬＯ２−１ポリペプチド（ＡＣＧ６９５２５．１）
配列番号１１６：Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍのステロレオシンポリペプチド（ＡＡＬ１３３１５．１）
配列番号１１７：Ｚｅａ ｍａｙｓのステロレオシンポリペプチド（ＮＰ＿００１１５２６１４．１）
配列番号１１８：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのカレオシンＣＬＯ−１ポリペプチド（ＡＣＧ６９５２９．１）
配列番号１１９：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのカレオシンＣＬＯ−３ポリペプチド（ＡＣＧ６９５２７．１）
配列番号１２０：Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍのカレオシンポリペプチド（ＡＡＦ１３７４３．１）
配列番号１２１：Ｚｅａ ｍａｙｓのカレオシンポリペプチド（ＮＰ＿００１１５１９０６．１）
配列番号１２２：（ゲノムに挿入された）ｐＪＰ３５０２ ＴＤＮＡ配列
配列番号１２３：ｐＪＰ３５０７ベクター配列
配列番号１２４：リンカー配列
配列番号１２５：ｈｐＲＮＡｉサイレンシングのために選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＣＧＩ−５８部分配列（ｐＴＶ４６）
配列番号１２６：ｈｐＲＮＡｉサイレンシングのために選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍのＡＧＰａｓｅ部分配列（ｐＴＶ３５）
配列番号１２７：ＧＸＳＸＧリパーゼモチーフ
配列番号１２８：ＨＸ（４）Ｄアシルトランスフェラーゼモチーフ
配列番号１２９：ＶＸ（３）ＨＧＦ推定脂質結合モチーフ
配列番号１３０：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＣＧｉ５８ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１１８５４８．１）
配列番号１３１：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎのＣＧｉ５８ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００３５７８４０２．１）
配列番号１３２：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＣＧｉ５８ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００３５２３５９０．１）
配列番号１３３：Ｚｅａ ｍａｙｓのＣＧｉ５８ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１５５５４１．１）
配列番号１３４：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＣＧｉ５８ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４６０４９３．１）
配列番号１３５：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓのＣＧｉ５８ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５１０４３９．１）
配列番号１３６：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＣＧｉ５８ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００３６０３６８５．１）
配列番号１３７：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＬＥＣ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１０２５９５．２）
配列番号１３８：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＬＥＣ２ポリヌケロチド（ｐｏｌｙｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）（Ｘ６０３８７．１）
配列番号１３９：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＬＥＣ２ポリヌケロチド（ｐｏｌｙｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）（ＨＭ３７０５３９．１）
配列番号１４０：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＢＢＭポリヌクレオチド（ＮＭ＿１２１７４９．２）
配列番号１４１：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＢＢＭポリヌクレオチド（ＡＹ８９９９０９．１）
配列番号１４２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＬＥＣ２ポリペプチド（ＮＰ＿５６４３０４．１）
配列番号１４３：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＬＥＣ２ポリペプチド（ＣＡＡ４２９３８．１）
配列番号１４４：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＬＥＣ２ポリペプチド（ＡＤＯ１６３４３．１）
配列番号１４５：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＢＢＭポリペプチド（ＮＰ＿１９７２４５．２）
配列番号１４６：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＢＢＭポリペプチド（ＡＡＷ８２３３４．１）
配列番号１４７：Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｎｉｇｅｒの誘導性ａｌｃＡプロモーター
配列番号１４８：エタノールの存在下でＡｌｃＡプロモーターを活性化する、ＡｌｃＲインデューサー
配列番号１４９：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＬＥＣ１；（ＡＡＣ３９４８８）
配列番号１５０：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａのＬＥＣ１（ＸＰ＿００２８６２６５７）
配列番号１５１：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＬＥＣ１（ＡＤＦ８１０４５）
配列番号１５２：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓのＬＥＣ１（ＸＰ＿００２５２２７４０）
配列番号１５３：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＬＥＣ１（ＸＰ＿００６５８２８２３）
配列番号１５４：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＬＥＣ１（ＡＦＫ４９６５３）
配列番号１５５：Ｚｅａ ｍａｙｓのＬＥＣ１（ＡＡＫ９５５６２）
配列番号１５６：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａのＬＥＣ１（ＡＤＣ３３２１３）
配列番号１５７：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＬＥＣ１様（ＡＡＮ１５９２４）
配列番号１５８：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＬＥＣ１様（ＡＨＩ９４９２２）
配列番号１５９：Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓのＬＥＣ１様（ＡＡＮ０１１４８）
配列番号１６０：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＦＵＳ３（ＡＡＣ３５２４７）
配列番号１６１：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＦＵＳ３
配列番号１６２：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＦＵＳ３
配列番号１６３：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ配列、アクセッション番号ＮＭ＿１２０４８６、３２７５ｎｔ
配列番号１６４：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ；アクセッション番号ＧＮ０７８２９０
配列番号１６５：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ、２６７０ｎｔ
配列番号１６６：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ、３８８４ｎｔ
配列番号１６７：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ；ＸＭ＿００３５９１３７７；２４９０ｎｔ
配列番号１６８：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ ＸＭ＿００３５２１１０３；２７８３ｎｔ
配列番号１６９：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ ＸＭ＿００２４５８４８６；２７２４ｎｔ
配列番号１７０：Ｚｅａ ｍａｙｓのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ、ＮＭ＿００１１７５２０６；２９８５ｎｔ
配列番号１７１：Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ、ＸＭ＿００１７５８１１７；１９９８ｎｔ
配列番号１７２：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ、ＡＫ３７２０９２；３４３９ｎｔ
配列番号１７３：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ、Ｎｂｖ５ｔｒ６４０４２０１
配列番号１７４：ｈｐＲＮＡｉサイレンシングの標的とされるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＳＤＰ１ ｃＤＮＡ領域
配列番号１７５：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＳＤＰ１遺伝子のプロモーター、１．５ｋｂ
配列番号１７６：ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡ内のｐＳＳＵ−オレオシン遺伝子の相補体であるヌクレオチド配列。順に（相補配列）：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチンターミネーター３４８ｎｔ、３´エキソン２５５ｎｔ、ＵＢＱ１０イントロン３０４ｎｔ、５´エキソン２１３ｎｔ、ＳＳＵプロモーター１７５１ｎｔ
配列番号１７７：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＮＭ＿１７９４０７
配列番号１７８：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＧＰＡＴポリペプチド、ＮＭ＿１７９４０７
配列番号１７９：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＸＰ＿００６３６８３５１
配列番号１８０：Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＡＣＲ６１６３８
配列番号１８１：Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＸＰ＿００２５１８９９３
配列番号１８２：Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＡＤＶ１６３８２
配列番号１８３：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＸＰ＿００３６１２８０１
配列番号１８４：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＸＰ＿００３５１６９５８
配列番号１８５：Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＣＡＨＧ３ＰＡＣＴＲ
配列番号１８６：Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＸＰ＿００６３５２８９８
配列番号１８７：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ，Ｊａｐｏｎｉｃａの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＮＭ＿００１０７２０２７
配列番号１８８：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＸＭ＿００２４６７３８１
配列番号１８９：Ｚｅａ ｍａｙｓの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＮＭ＿００１１５８６３７
配列番号１９０：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＡＫ３７１４１９
配列番号１９１：Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＸＭ＿００１７７１２４７
配列番号１９２：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの色素体ＧＰＡＴ ｃＤＮＡ、ＸＭ＿００１６９４９２５
配列番号１９３：Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒａ １４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｃｉｎｃａ−ＴＥ）、葉緑体、３８２ａａ、（アクセッション番号Ｑ３９４７３．１）
配列番号１９４：Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦａｔＢ１（Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ１；４１７ａａ、アクセッション番号ＡＥＭ７２５１９．１
配列番号１９５：Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦａｔＢ２（Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ２；４２３ａａ、アクセッション番号ＡＥＭ７２５２０．１）
配列番号１９６：Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦａｔＢ３（Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ３；４１４ａａ、アクセッション番号ＡＥＭ７２５２１．１）
配列番号１９７：Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａのアシル−（ＡＣＰ）チオエステラーゼＢ型（Ｃｕｐｌａ−ＴＥ、４１９ａａ、アクセッション番号ＣＡＢ６０８３０．１）
配列番号１９８：Ｃｕｐｈｅａ ｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａのＦａｔＢ１（Ｃｕｐｖｉ−ＴＥ；４１９ａａ、アクセッション番号ＡＥＭ７２５２２．１）
配列番号１９９：Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（ラウロイル−アシル担体タンパク質チオエステラーゼ）（Ｕｍｂｃａ−ＴＥ、３８２ａａ；アクセッション番号Ｑ４１６３５．１）
配列番号２００：Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのＬＰＡＡＴ（Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴ、３０８ａａ、アクセッション番号Ｑ４２６７０．１）
配列番号２０１：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＬＰＡＡＴ１（Ａｒａｔｈ−ＰＬＰＡＡＴ；３５６ａａ、アクセッション番号ＡＥＥ８５７８３．１）
配列番号２０２：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＴＡ１
配列番号２０３：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＴＡ２
配列番号２０４：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＴＢ
配列番号２０５：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ３
配列番号２０６：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ４
配列番号２０７：Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａのＷＲＩ１
配列番号２０８：Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのＷＲＩ１
配列番号２０９：Ｚｅａ ｍａｙｓのＷＲＩ１
配列番号２１０：Ｔｒｉａｄｉｃａ ｓｅｂｉｆｅｒａのＷＲＩ１
配列番号２１１：Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ＰａｔａｔｉｎのＢ３３プロモーター配列
配列番号２１２〜２１５及び２４５〜２５４：オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１６：Ｚ．ｍａｙｓのＳＥＥ１プロモーター領域（アクセッション番号ＡＪ４９４９８２の１９７０ｎｔ）
配列番号２１７：Ａ．ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓのＡｌＳＡＰプロモーター配列、アクセッション番号ＤＱ８８５２１９
配列番号２１８：Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＡｒＲｏｌＣプロモーター配列、アクセッション番号ＤＱ１６０１８７
配列番号２１９：Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの色素体ＧＰＡＴの７３２ｂｐ断片を含むｈｐＲＮＡｉ構築物
配列番号２２０：Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アブラヤシ）のＤＧＡＴ１
配列番号２２１：Ｇ．ｍａｘのＭＹＢ７３、アクセッション番号ＡＢＨ０２８６８
配列番号２２２：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｂＺＩＰ５３、アクセッション番号ＡＡＭ１４３６０
配列番号２２３：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＡＧＬ１５、アクセッション番号ＮＰ＿１９６８８３
配列番号２２４：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＭＹＢ１１８、アクセッション番号ＡＡＳ５８５１７
配列番号２２５：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＭＹＢ１１５、アクセッション番号ＡＡＳ１０１０３
配列番号２２６：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＴＡＮＭＥＩ、継承番号ＢＡＥ４４４７５
配列番号２２７：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＵＳ、アクセッション番号ＮＰ＿５６５４２９
配列番号２２８：Ｂ．ｎａｐｕｓのＧＦＲ２ａ１、アクセッション番号ＡＦＢ７４０９０
配列番号２２９：Ｂ．ｎａｐｕｓのＧＦＲ２ａ２、アクセッション番号ＡＦＢ７４０８９
配列番号２３０：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＰＨＲ１、アクセッション番号ＡＡＮ７２１９８
配列番号２３１：Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＴＧＤ１断片
配列番号２３２：ジャガイモのＳＤＰ１アミノ酸
配列番号２３３：ジャガイモのＳＤＰ１ヌクレオチド配列
配列番号２３４：ジャガイモのＡＧＰａｓｅ小サブユニット
配列番号２３５：ジャガイモのＡＧＰａｓｅ小サブユニットヌクレオチド配列：
配列番号２３６：Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍのＬＤＡＰ−１ヌクレオチド配列
配列番号２３７：Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍのＬＤＡＰ−１アミノ酸配列
配列番号２３８：Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍのＬＤＡＰ−２ヌクレオチド配列
配列番号２３９：Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍのＬＤＡＰ−２アミノ酸配列
配列番号：２４０：Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍのＬＤＡＰ−３ヌクレオチド配列
配列番号２４１：Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍのＬＤＡＰ−３アミノ酸配列
配列番号２４２：Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒのＳＤＰ１（アクセッション番号ＸＭ＿００２４６３６２０）
配列番号２４３：Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍのＳＤＰ１ヌクレオチド配列（アクセッション番号ＡＫ３３４５４７）
配列番号２４４：Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒのＳＤＰ１ ｈｐＲＮＡｉ断片
一般的な手法
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、植物生物学、細胞生物学、タンパク質化学、脂質及び脂肪酸化学、バイオ燃料製造、ならびに生化学において）当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有するものと解釈されるものとする。
別途指示されていない限り、本発明で利用される組み換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的手法は、標準的な手順であり、当業者に周知である。そのような手法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１巻及び第２巻，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ及びＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１−４巻，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までのすべての最新版を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までのすべての最新版を含む）等の出展の文献全体を通して記載及び説明されている。
選択された定義
「トランスジェニック非ヒト生物」という用語は、例えば、１つ以上の外因性ポリヌクレオチド（導入遺伝子）またはポリペプチドを含む、植物、藻類、非ヒト動物、または酵母若しくは真菌等の発酵に好適な生物全体を指す。ある実施形態では、トランスジェニック非ヒト生物は、動物またはその一部ではない。一実施形態では、トランスジェニック非ヒト生物は、日光からエネルギーを得て、栄養のための有機化合物を合成することができる、光合成生物（例えば、植物または藻類）である。
「外因性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと関連して、その自然な状態ではポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有しない細胞に存在するときの、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。このような細胞は、本明細書において「組み換え細胞」または「トランスジェニック細胞」と称される。ある実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む細胞とは異なる属に由来する。別の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異なる種に由来する。一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、宿主植物または植物細胞で発現し、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異なる種または属に由来する。外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、非自然発生的、例えば、組み換えＤＮＡ技術により産生される合成ＤＮＡ分子等であっても良い。ＤＮＡ分子は、多くの場合、好ましくは、細胞での発現に最適化されたコドンであるタンパク質コード領域を含んでも良く、それにより、タンパク質コード領域のヌクレオチド配列は非自然発生的であるが、自然発生的ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが産生される。外因性ポリヌクレオチドは以下をコードしても良く、または外因性ポリペプチドは以下であっても良く、ＤＧＡＴ１若しくはＤＧＡＴ２等のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １（ＷＲＩ１）転写因子、オレオシン若しくは好ましくはＬＤＡＰ等のＯＢＣ、ＦＡＴＡまたはＦＡＴＢポリペプチド等の脂肪酸チオエステラーゼ、またはサイレンシングサプレッサーポリペプチドである。
本明細書で使用される場合、「抽出脂質」という用語は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）の脂質を含む、トランスジェニック生物またはその一部から抽出される組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「非極性脂質」という用語は、有機溶媒には溶解するが、水には溶解しない、脂肪酸及びその誘導体を指す。脂肪酸は、遊離脂肪酸及び／またはエステル化形態であって良い。エステル化形態の例としては、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。非極性脂質としては、ステロール、ステロールエステル、及びワックスエステルも挙げられる。非極性脂質は、「中性脂質」としても知られている。非極性脂質は、典型的に、室温で液体である。好ましくは、非極性脂質は、主に（５０％超の）、少なくとも１６個の炭素長である、脂肪酸を含む。より好ましくは、非極性脂質中の総脂肪酸の少なくとも５０％は、Ｃ１８脂肪酸、例えばオレイン酸である。好ましくは、非極性脂質の全脂肪酸の少なくとも５％は、Ｃ１２若しくはＣ１４脂肪酸またはその両方である。一実施形態では、本発明の非極性脂質中の脂肪酸の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％を、ＴＡＧとして見出すことができる。非極性脂質は、例えば、強塩基で加水分解して遊離脂肪酸を放出させることによって、または分画、蒸留等によって、更に精製または処理しても良い。非極性脂質は、例えば種子、葉、塊茎、食用根若しくは果実等の植物部分に存在していても、それから得ても良く、あるいは組み換え細胞、または酵母等の非ヒト生物から得ても良い。本発明の非極性脂質は、種子から得られた場合に、「種子油」の一部を形成し得る。
遊離ステロール及びエステル化ステロール（例えば、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、Δ５−アベナステロール（ａｖｅｎａｓｔｅｒｏｌ）、シトスタノール、カンペスタノール、及びコレステロール等）の抽出脂質中の濃度は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）に記載されているものであって良い。植物油中のステロールは、遊離アルコール、脂肪酸とのエステル（エステル化ステロール）、ステロールのグリコシド及びアシル化グリコシドとして存在する。自然発生的な植物油（種子油）中のステロール濃度は、最大で約１１００ｍｇ／１００ｇまでの範囲である。水素化ヤシ油は、最も低い自然発生的な植物油の濃度（約６０ｍｇ／１００ｇ）を有するものの一つである。本発明の回収種子油または抽出種子油は、好ましくは、約１００〜約１０００ｍｇ総ステロール／１００ｇ油である。食物または飼料としての使用のためには、ステロールはグリコシル化形態ではなく、遊離形態またはエステル化形態として主に存在するほうが好ましい。本発明の種子油では、当該油中のステロールのうち、好ましくは少なくとも５０％が、エステル化ステロールとして存在する（約２５％のエステル化ステロールを有するダイズ種子油を除く）。本発明のカノーラ種子油及び菜種油は、好ましくは、約５００〜約８００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールであり、カンペステロールが次に最も多いステロールである。本発明のトウモロコシ種子油は、好ましくは、約６００〜約８００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のダイズ種子油は、好ましくは、約１５０〜約３５０ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールであり、スチグマステロールが次に最も多いステロールであり、エステル化ステロールよりも遊離ステロールのほうが多い。本発明の綿実油は、好ましくは、約２００〜約３５０ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のココナッツ油及びヤシ油は、好ましくは、約５０〜約１００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のサフラワー種子油は、好ましくは、約１５０〜約２５０ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のピーナッツ種子油は、好ましくは、約１００〜約２００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のゴマ種子油は、好ましくは、約４００〜約６００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のヒマワリ種子油は、好ましくは、約２００〜４００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明の生育植物部分から得られる油は、好ましくは、２００ｍｇ総ステロール／１００ｇ未満であり、より好ましくは１００ｍｇ総ステロール／１００ｇ未満であり、及び最も好ましくは、５０ｍｇ総ステロール／１００ｇ未満であり、ステロールのほとんどが遊離ステロールである。
本明細書で使用される場合、「種子油」という用語は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）の脂質を含む植物の種子／穀物から得られる組成物、または種子／穀物中に種子油が更に存在する場合に、種子／穀物から得ることが可能な組成物を指す。すなわち、本発明の種子油は、種子／穀物またはその一部分に存在する種子油、ならびに種子／穀物から抽出した種子油を含む。種子油は、好ましくは、抽出した種子油である。種子油は、典型的に、室温で液体である。好ましくは、種子油における総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量は、主に（５０％超が）、少なくとも１６個の炭素長である、脂肪酸を含む。より好ましくは、種子油中の総脂肪酸の少なくとも５０％は、Ｃ１８脂肪酸、例えばオレイン酸である。脂肪酸は、典型的に、例えば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、アシル−ＣｏＡ、またはリン脂質等の、エステル化形態である。脂肪酸は、遊離脂肪酸及び／またはエステル化形態であって良い。一実施形態では、本発明の種子油中の脂肪酸の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％を、ＴＡＧとして見出すことができる。一実施形態では、本発明の種子油は、１つ以上の他の脂質、核酸、ポリペプチド、または種子若しくは粗抽出物に伴う他の汚染分子から分離された、「実質的に精製した」または「精製した」油である。実質的に精製した種子油は、種子若しくは抽出物に伴う他の成分を、少なくとも６０％含まない、より好ましくは少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まないことが好ましい。本発明の種子油は、ステロール等が挙げられるが、これに限定されない、非脂肪酸分子を更に含んでも良い。一実施形態では、種子油は、カノーラ油（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）カラシ油（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、他のＢｒａｓｓｉｃａ油（例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｅｌｉｎａ）、ヒマワリ油（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．例えば、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、アマニ油（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ダイズ油（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、サフラワー油（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、トウモロコシ油（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、タバコ油（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐ．例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ピーナッツ油（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ヤシ油（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、綿実油（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ココナッツ油（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、アボカド油（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、オリーブ油（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、カシュー油（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア油（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド油（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、オートムギ種子油（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、コメ油（Ｏｒｙｚａ ｓｐ．例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ及びＯｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子油（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、または、Ａｃｒｏｃｏｍｉａ ａｃｕｌｅａｔａ（ｍａｃａｕｂａ ｐａｌｍ）、Ａｒａｃｉｎｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｍｕｒｕｍｕｒｕ（ｍｕｒｕｍｕｒｕ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（ｔｕｃｕｍａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｇｅｒａｅｎｓｉｓ（Ｉｎｄａｉａ−ｒａｔｅｉｒｏ）、Ａｔｔａｌｅａ ｈｕｍｉｌｉｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｏｉｌ ｐａｌｍ）、Ａｔｔａｌｅａ ｏｌｅｉｆｅｒａ（ａｎｄａｉａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｐｈａｌｅｒａｔａ（ｕｒｉｃｕｒｉ）、Ａｔｔａｌｅａ ｓｐｅｃｉｏｓａ（ｂａｂａｓｓｕ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（アマナズナ）、Ｃａｒｙｏｃａｒ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（ｐｅｑｕｉ）、Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（Ａｂｙｓｓｉｎｉａｎ ｋａｌｅ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（大麦）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（フィジックナッツ）、Ｊｏａｎｎｅｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ（ａｒａｒａ ｎｕｔ−ｔｒｅｅ）、Ｌｉｃａｎｉａ ｒｉｇｉｄａ（オイチシカ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（ルピナス）、Ｍａｕｒｉｔｉａ ｆｌｅｘｕｏｓａ（ｂｕｒｉｔｉ ｐａｌｍ）、Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎａ ｍａｒｉｐａ（ｉｎａｊａ ｐａｌｍ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ及びＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｃａｂａ（ｂａｃａｂａ−ｄｏ−ａｚｅｉｔｅ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｔａｕａ（ｐａｔａｕａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ（ｂａｃａｂａ−ｄｅ−ｌｅｑｕｅ）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｐａｒａｑｕｅｉｂａ ｐａｒａｅｎｓｉｓ（ｍａｒｉ）、Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｎｃａｎａ（アボカド）、Ｐｏｎｇａｍｉａ ｐｉｎｎａｔａ（Ｉｎｄｉａｎ ｂｅｅｃｈ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（サトウキビ）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ（ゴマ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｏｒｕｍ（クプアス）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｔｒｉｔｈｒｉｎａｘ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｎｅｅｄｌｅ ｐａｌｍ）及びＴｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ．（コムギ）（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の種子から得られる油である。種子油は、当技術分野で既知の任意の方法によって、種子／穀物から抽出されても良い。これは、典型的に、ジエチルエーテル、石油エーテル、クロロホルム／メタノール、またはブタノール混合物等の非極性溶媒による抽出を伴い、一般に、最初に種子を粉砕することを含む。穀物のデンプンに伴う脂質は、水飽和したブタノールで抽出され得る。種子油は、当技術分野で既知の方法によって「脱ガム」して多糖類を除去しても良く、あるいは汚染物質を除去するため、または純度、安定性、若しくは色を改善するための他の方法で処理しても良い。種子油中のＴＡＧ及び他のエステルは、遊離脂肪酸を放出するように加水分解しても良く、または種子油を当技術分野で既知である水素化、化学的若しくは酵素的処理しても良い。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、少なくとも８個の炭素原子長の飽和または不飽和の脂肪族末端を伴う、カルボン酸を指す。好適な脂肪酸は、少なくとも１２個の炭素長の炭素−炭素結合鎖を有する。大部分の自然発生的な脂肪酸は、その生合成に２個の炭素原子を有するアセテートが関与するため、偶数個の炭素原子を有する。脂肪酸は、遊離状態（非エステル化）であっても良く、またはＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、アシル−ＣｏＡ（チオエステル）結合、アシル−ＡＣＰ結合の一部、若しくはその他の共有結合形態等のエステル化形態であっても良い。本明細書では、エステル化形態で共有結合したときの脂肪酸を「アシル」基と称する。脂肪酸は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール等のリン脂質としてエステル化されても良い。飽和脂肪酸は、鎖に沿っていかなる二重結合または他の官能基も含まない。「飽和」という用語は、すべての炭素（カルボン酸（−ＣＯＯＨ）基は除く）が取り得る数の水素を含むことであり、その点では水素を指す。換言すれば、オメガ（ω）末端は、３つの水素（ＣＨ３−）を含み、鎖内部の各炭素は、２つの水素（−ＣＨ２−）を含む。不飽和脂肪酸は、飽和脂肪酸に類似した形態のものであるが、１つ以上のアルケン官能基が鎖に沿って存在している点が異なり、かつ各アルケンは、鎖の単結合「−ＣＨ２−ＣＨ２−」部が、二重結合「−ＣＨ＝ＣＨ−」部分（すなわち、別の炭素と二重結合した炭素）に置換されている。二重結合の各側に結合した、鎖中の２個の隣り合う炭素原子には、シスまたはトランス配置が起こり得る。
本明細書で使用される場合、「一価不飽和脂肪酸」または「ＭＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖中に少なくとも１２個の炭素原子、及びアルケン基（炭素−炭素二重結合）を１個のみ含み、エステル形態でも非エステル（遊離）形態でもあり得る、脂肪酸を指す。本明細書で使用される場合、「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖中に少なくとも１２個の炭素原子、及び少なくとも２個のアルケン基（炭素−炭素二重結合）を含み、エステル形態でも非エステル形態でもあり得る、脂肪酸を指す。
本明細書で使用される場合、「中鎖長」を有する脂肪酸（別称：「ＭＣＦＡ」）は、８〜１４個の炭素からなるアシル鎖を含む。アシル鎖は、修飾されていても（例えば、１つ以上の二重結合、ヒドロキシ基、エクポキシ（ｅｘｐｏｘｙ）基等を含み得る）、または非修飾（飽和）であっても良い。本用語は、少なくとも、カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、及びミリスチン酸（Ｃ１４：０）の１つ以上またはそのすべてを含む。
「モノアシルグリセリド」または「ＭＡＧ」は、グリセロールが１つの脂肪酸でエステル化されたグリセリドである。本明細書で使用される場合、ＭＡＧは、ｓｎ−１／３位にヒドロキシ基を含み（本明細書では、ｓｎ−１ＭＡＧ、１−ＭＡＧ、または１／３−ＭＡＧとも称される）、またはｓｎ−２位にヒドロキシ基を含み（本明細書では、２−ＭＡＧとも称される）、それゆえＭＡＧはＰＡまたはＰＣ等のリン酸化分子を含まない。したがって、ＭＡＧは細胞中の中性脂質の成分である。
「ジアシルグリセリド」または「ＤＡＧ」は、グリセロールが２つの脂肪酸（同一または好ましくは異なるものであって良い）でエステル化されたグリセリドである。本明細書で使用される場合、ＤＡＧは、ｓｎ−１，３位またはｓｎ−２位にヒドロキシ基を含み、それゆえＤＡＧはＰＡまたはＰＣ等のリン酸化分子を含まない。したがって、ＤＡＧは細胞中の中性脂質の成分である。ＤＡＧ合成のケネディ経路（図１）では、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）によって触媒され、ｓｎ−１位にＬｙｓｏＰＡを形成する第１の反応、続いてリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）によって触媒され、ｓｎ−２位にホスファチジン酸（ＰＡ）を形成する第２のアシル化において、前駆体ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）が、それぞれが脂肪酸コエンザイムＡエステルから得られる２つのアシル基にエステル化される。次いで、この中間体はＰＡＰにより脱リン酸化されて、ＤＡＧを形成する。ＤＡＧはまた、リパーゼによるアシル基の除去によってＴＡＧから形成してもよく、または本質的に、酵素ＰＤＣＴ、ＰＬＣまたはＰＬＤのいずれかによるコリン頭部基の除去によってＰＣから形成しても良い（図１）。
「トリアシルグリセリド」または「ＴＡＧ」は、グリセロールが３個の脂肪酸でエステル化されたグリセリドであり、各脂肪酸は（例えば、トリオレインの場合のように）同一であっても、より一般的には異なっていても良い。ＴＡＧ合成のケネディ経路では、ＤＡＧが前述のように形成され、次いで、第３のアシル基がＤＧＡＴの活性によってグリセロール主鎖とエステル化される。ＴＡＧ形成のための代替経路は、本明細書に記載する酵素ＰＤＡＴ（図１）及びＭＧＡＴ経路によって触媒されるものを含む。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語またはその変形は、本発明に従って遺伝子改変されていない、例えば外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を含んでいない、生育植物部分、細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部、例えば塊茎または食用根を指す。
「相当する」という用語は、本明細書で記載されるように改変されていないが（例えば、外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）及び／または遺伝子改変（複数を含む）を欠く生育植物部分、細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部）、本発明の生育植物部分、細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部と同一または同様の遺伝的背景を有する生育植物部分、細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部（例えば塊茎または食用根）を指す。好ましい実施形態では、相当する生育植物部分、真核細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部は、本発明の生育植物部分、真核細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部と同じ成長段階にある。例えば、非ヒト生物が開花期の植物である場合、好ましくは、相当する植物もまた開花期である。相当する生育植物部分、真核細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部を対照として使用し、核酸またはタンパク質発現のレベル、または形質改変の程度若しくは性質、例えば非極性脂質産物及び／または含有量を、本明細書で記載されるように改変された本発明の生育植物部分、真核細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部と比較することができる。当業者であれば、このような比較に適した「相当する」生育植物部分、真核細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部、組織、器官または生物を容易に決定することができる。
本明細書で使用される場合、「〜と比較する」または「〜と比較して」は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは外因性ポリペプチドを発現している生育植物部分、真核細胞、種子、非ヒト生物またはその一部（例えば、塊茎または食用根）の非極性脂質のレベル、総非極性脂質含有量、脂肪酸含有量またはその他のパラメーターを、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを欠く、生育植物部分、真核細胞、種子、非ヒト生物またはその一部と比較することを指す。
本明細書で使用される場合、「非極性脂質の生成能力の増強」は、相当する生育植物部分、真核細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部と比較して、本発明の生育植物部分、真核細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部（例えば、塊茎または食用根）によって生成される非極性脂質の総量が増加することを指す、相対的な用語である。一実施形態では、非極性脂質の総脂肪酸含有量中のＴＡＧ及び／または多価不飽和脂肪酸の含有量またはオレイン酸含有量が増加するか、あるいは非極性脂質の総脂肪酸含有量中のリノレン酸含有量が、例えば絶対条件で少なくとも２％減少する。
本明細書で使用される場合、「相乗作用」、「相乗的」、「相乗的に作用」及び関連する用語は各々、本発明の細胞、植物またはその一部に存在する要素の組み合わせ、例えば要素Ａ及びＢの組み合わせの効果が、相当する細胞、植物またはその一部の別々の要素、例えば要素Ａと要素Ｂの効果の合計よりも大きいことを意味する相対的な用語である。３つ以上の要素が細胞、植物またはその一部、例えば要素Ａ、Ｂ及びＣに存在する場合、要素のすべてを組み合わせた効果が要素の個々の効果の合計よりも大きいことを意味する。好ましい実施形態では、要素Ａ、Ｂ及びＣを組み合わせた効果が、要素Ａ及びＢを組み合わせた効果と要素Ｃの効果との合計よりも大きいことを意味する。このような場合、要素Ｃが要素Ａ及びＢと相乗的に作用すると言うことができる。理解されるように、効果は、例えば同一条件下で生長した、生物学的成長の同一段階にある、相当する細胞、植物またはその一部で測定される。
本明細書で使用される場合、「相当する野生型植物の場合と実質的に同じ比率で発芽する」とは、定義された外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）を欠く、野生型植物の種子と比較したとき、相対的に発芽能力のある本発明の植物の種子を指す。発芽は、耕地での発生と同様に、組織培地上または土壌中でｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。一実施形態では、例えば植物種にとって最適な温室条件下で成長した場合に、発芽する種子の数が、相当する野生型の種子と比較して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％である。一実施形態では、例えば植物種にとって最適な温室条件下で成長した場合に、発芽し、苗木になる種子の率が、相当する野生型の植物と比較して、平均で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％である。これを「苗の活力（ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｖｉｇｏｕｒ）」と呼ぶ。一実施形態では、本発明の根の初期生長率及び苗の新芽生長率は、本質的に、同一条件下で生長した相当する野生型苗と比較して同一である。一実施形態では、本発明の植物の葉バイオマス（乾重量）は、同一条件下、好ましくは耕地で生長した相当する野生型植物と比較して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の葉バイオマスである。一実施形態では、本発明の植物の高さは、同一条件下で、好ましくは耕地で生長し、好ましくは成熟した相当する野生型植物と比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の植物の高さである。
本明細書で使用される場合、「内因性ポリペプチドの産生及び／または活性を下方調節する外因性ポリヌクレオチド」という用語またはその変形は、内因性ポリペプチド、例えば、ＳＤＰ１ ＴＡＧリパーゼ、色素体ＧＰＡＴ、色素体ＬＰＡＡＴ、ＴＧＤポリペプチド、ＡＧＰａｓｅまたはデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２）、またはその２つ以上の組み合わせの産生及び／または活性を下方調節するＲＮＡ分子をコードする（例えば、ａｍｉＲＮＡまたはｈｐＲＮＡｉをコードする）ポリヌクレオチド、及び／またはその産生及び／または活性をそれ自体が下方調節する（例えば細胞に直接送達することができるａｍｉＲＮＡまたはｈｐＲＮＡである）ポリヌクレオチドを指す。典型的には、ＲＮＡ分子は、ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を抑制する。
本明細書で使用される場合、「重量基準で」という用語は、物質を含む組成物（例えば、種子、葉）の重量パーセント比としての物質（例えば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、脂肪酸）の重量を指す。例えば、トランスジェニック種子が１２０μｇの種子重量あたり２５μｇの総脂肪酸を有する場合、総脂肪酸パーセント比は、重量基準で２０．８％である。
本明細書で使用される場合、「相対基準で」という用語は、例えば、物質を含む組成物中の物質量を、対応する組成物のパラメーターと比較したときのパーセント比としてのパラメーターを指す。例えば、３単位から２単位への減少は、相対基準で３３％の減少である。
本明細書で使用される場合、「色素体」は、糖、デンプン及び脂肪酸を含む、炭素系化合物を光合成から製造する部位である、藻類を含めた植物のオルガネラである。色素体は、クロロフィルを含有し、光合成を実施する葉緑体、葉緑体の前駆体であるエチオプラスト、ならびに色素の合成及び貯蔵のための有色色素体であるクロモプラスト、老化過程での光合成機構の解体を制御するゲロントプラスト、デンプンの合成及び貯蔵のためのアミロプラスト、脂質貯蔵のためのエライオプラスト、及びタンパク質を貯蔵して修飾するためのプロテノプラスト（ｐｒｏｔｅｉｎｏｐｌａｓｔ）等の分化した色素体を含む。
本明細書で使用される場合、「バイオ燃料」という用語は、典型的には、例えば自動車、航空機、ボート、トラックまたは石油で動くエンジン等の機械に動力を与えるために用いられる燃料の任意の型を指し、そのエネルギーは、生物学的炭素固定から得られる。バイオ燃料としては、バイオマス転換、ならびに固形バイオマス、液体燃料及びバイオガスから得られる燃料が含まれる。バイオ燃料の例としては、バイオアルコール、バイオディーゼル、合成ディーゼル、植物油、バイオエーテル、バイオガス、合成ガス、固形バイオ燃料、藻類由来燃料、バイオ水素、バイオメタノール、２，５−ジメチルフラン（ＤＭＦ）、バイオジメチルエーテル（ｂｉｏＤＭＥ）、Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｔｒｏｐｓｃｈディーゼル、バイオ水素ディーゼル、混合アルコール及び木材ディーゼル（ｗｏｏｄ ｄｉｅｓｅｌ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「バイオアルコール」という用語は、生物学的に製造されたアルコール、例えば、エタノール、プロパノール及びブタノールを指す。バイオアルコールは、糖、ヘミセルロースまたはセルロースの発酵を介して、微生物及び／または酵素の作用により製造される。
本明細書で使用される場合、「バイオディーゼル」という用語は、脂質のエステル交換により得られる、脂肪酸メチルエステルまたは脂肪酸エチルエステルを含む組成物を指し、該脂質が化石燃料ではなく生細胞由来である。
本明細書で使用される場合、「合成ディーゼル」という用語は、ほとんどのディーゼル燃料で使用されている化石原料ではなく、再生可能な原料から得られるディーゼル燃料の形態を指す。
本明細書で使用される場合、「植物油」という用語は、生育植物部分中または種子中のいずれかに生成される油を含めた、純粋な植物油（すなわちストレート植物油）または廃棄植物油（他の工業製品の副産物）を含む。
本明細書で使用される場合、「バイオガス」という用語は、嫌気性生物による有機物質の嫌気性消化により生成されるメタン、またはメタンとその他のガスの可燃性混合物を指す。
本明細書で使用される場合、「合成ガス」という用語は、バイオマスの部分燃焼により生成される、様々な量の一酸化炭素及び水素、ならびに場合により他の炭化水素を含有するガス混合物を指す。合成ガスは、触媒（通常は銅系）の存在下でメタノールに転換でき、更にそれに続いて別の触媒（例えば、シリカアルミナ）の存在下でメタノール脱水することができる。
本明細書で使用される場合、「フィッシャー・トロプシュ」という用語は、一酸化炭素と水素の混合物を液体炭化水素へと転換する一連の化学反応を指す。最初に合成ガスを、例えば水−ガスシフトを用いて調整し、必要とするＨ２／ＣＯ比を得ることができる。転換は、触媒（通常は、鉄またはコバルト）の存在下で行われる。温度、圧力及び触媒に応じて、軽油または重油いずれの合成原油が製造されるかが決定される。例えば、３３０℃では主にガソリン及びオレフィンが製造され、一方、１８０℃〜２５０℃では主にディーゼルとワックスが製造される。様々な炭化水素分画を含む合成ガスから製造される液体は、非常に清浄な（硫黄を含まない）直鎖炭化水素である。
本明細書で使用される場合、「バイオ炭」という用語は、例えばバイオマスの熱分解により、バイオマスから作製される炭を指す。
本明細書で使用される場合、「原料」という用語は、製品、例えばバイオディーゼルまたは合成ディーゼル等のバイオ燃料の製造に用いられる場合、例えばバイオマスまたはその転換産物（例えば、合成ガス）等の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「工業製品」という用語は、例えば、脂肪酸メチル及び／若しくはエチルエステル、またはアルカン類（例えば、メタン）、長鎖アルカン類（大気温度では通常、液体である）の混合物、バイオ燃料、一酸化炭素及び／若しくは水素、またはバイオアルコール（例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール）、またはバイオ炭等の、主に炭素及び水素から作られる炭化水素製品を指す。「工業製品」という用語は、他の工業製品に転換させることができる中間産物を含むことが意図され、例えば、合成ガスはそれ自身、工業製品であるとみなされ、また炭化水素製品を合成するために用いることができる工業製品であるともみなされる。本明細書で使用される場合、工業製品という用語は、上記化合物の純粋な形態、またはより一般的には様々な化合物と成分の混合物形態の両方を含み、例えば、炭化水素製品は、当技術分野で周知の範囲の炭素鎖長を含んでも良い。
本明細書で使用される場合、「子孫」は、親から産生された直近及びそれ以降すべての世代の子孫、例えば２世代目、３世代目、またはそれ以降の世代の子孫を意味する。
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語または例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記述される要素、完全体若しくはステップ、または要素、完全体若しくはステップの群を包含するが、任意の他の要素、完全体若しくはステップ、または要素、完全体若しくはステップの群を排除しないことを意味することを理解されたい。
「及び／または」という用語、例えば「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するものと理解されるべきであり、かつ両方の意味またはいずれかの意味に対して明示的な支持をもたらすと解釈されなければならない。
本明細書で使用される場合、反対の記載がない限り、約という用語は、指定された値の＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％、より好ましくは＋／−２％、より好ましくは＋／−１％、さらにより好ましくは＋／−０．５％を指す。
非極性脂質及びトリアシルグリセロールの製造
本発明は、本明細書で指定する以下から選択される改変の組み合わせにより、組み換え真核細胞の非極性脂質含有量を増加させることができるという知見に基づいている：（Ａ）プッシュ型、（Ｂ）プル型、（Ｃ）防御的、（Ｄ）パッケージ、（Ｅ）色素体移出、（Ｆ）色素体移入及び（Ｇ）原核型経路。本明細書に記載するように、色素体のない細胞は、Ａ〜Ｄの種々の組み合わせを含み、対して色素体のある細胞、例えば植物及び藻類の細胞はＡ〜Ｇの種々の組み合せを含み得る。
したがって、本発明の組み換え細胞、トランスジェニック非ヒト動物またはその一部及びトランスジェニック植物またはその一部は、各々がいずれかの改変をもたらす外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変の多数の組み合わせを有する。これらの外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変として、以下が挙げられる：
（Ａ）細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドであり、「プッシュ型」改変をもたらすもの、
（Ｂ）細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部内で１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドであり、「プル型」改変をもたらすもの、
（Ｃ）遺伝子改変を欠く、相当する細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部と比較したとき、細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変であり、「防御的」改変をもたらすもの、
（Ｄ）油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドであり、「パッケージ」改変をもたらすもの、
（Ｅ）外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部と比較したとき、細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドであり、「色素体移出」改変をもたらすもの、
（Ｆ）遺伝子改変を欠く、相当する細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部と比較したとき、細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変であり、「色素体移入」改変をもたらすもの、及び
（Ｇ）遺伝子改変を欠く、相当する細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部と比較したとき、細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部の色素体でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する遺伝子改変であり、「原核型経路」改変をもたらすもの。
本発明の外因性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子改変の好適な組み合わせ（本明細書でセットとも称する）は、以下の通りである；
１）Ａ、Ｂ及び場合によりＣ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのうちのいずれか；
２）Ａ、Ｃ及び場合によりＤ、Ｅ、ＦまたはＧのうちのいずれか；
３）Ａ、Ｄ及び場合によりＥ、ＦまたはＧのうちのいずれか；
４）Ａ、Ｅ及び場合によりＦまたはＧ；
５）Ａ、Ｆ及び場合によりＧ；
６）Ａ及びＧ；
７）Ａ、Ｂ、Ｃ及び場合によりＤ、Ｅ、ＦまたはＧのうちのいずれか；
８）Ａ、Ｂ、Ｄ及び場合によりＥ、ＦまたはＧのうちのいずれか；
９）Ａ、Ｂ、Ｅ及び場合によりＦまたはＧ；
１０）Ａ、Ｂ、Ｆ及び場合によりＧ；
１１）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及び場合によりＥ、ＦまたはＧのうちのいずれか；
１２）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ及び場合によりＦまたはＧ；
１３）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ及び場合によりＧ；
１４）Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ及び場合によりＦまたはＧ；
１５）Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及び場合によりＧ；
１６）Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ及び場合によりＧ；
１７）Ａ、Ｃ、Ｄ及び場合によりＥ、ＦまたはＧのうちのいずれか；
１８）Ａ、Ｃ、Ｅ及び場合によりＦまたはＧ；
１９）Ａ、Ｃ、Ｆ及び場合によりＧ；
２０）Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び場合によりＦまたはＧ；
２１）Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ及び場合によりＧ；
２２）Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ及び場合により第５の改変Ｇ；
２３）Ａ、Ｄ、Ｅ及び場合によりＦまたはＧ；
２４）Ａ、Ｄ、Ｆ及び場合によりＧ；
２５）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び場合によりＧ；
２６）Ａ、Ｅ、Ｆ及び場合によりＧ；
２７）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのうちのいずれかを除外した、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧのうちの６つ、ならびに
２８）細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、２つ以上の異なる転写因子ポリペプチドをコードする２つ以上の外因性ポリヌクレオチド、例えば、ＷＲＩ１をコードする、ある外因性ポリヌクレオチドと、ＬＥＣ２をコードする別の外因性ポリヌクレオチドとが存在している、上記１〜２６のうちの任意のいずれか。
上記の好適な組み合わせ各々に、細胞、トランスジェニック非ヒト動物若しくはその一部、またはトランスジェニック植物若しくはその一部内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、少なくとも２種類の転写因子ポリペプチドをコードする少なくとも２種類の外因性ポリヌクレオチドが存在し得る。
各改変について以下に説明する。
Ａ．「プッシュ型」改変は、真核細胞の色素体で総脂肪酸の合成を増加させる特徴がある。一実施形態では、これは色素体での脂肪酸合成を調節する転写因子の発現及び／または活性の増加によって発生する。一実施形態では、これは細胞内での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドをトランスジェニック細胞内に発現させることにより成し得る。一実施形態では、脂肪酸合成の増加の原因は、脂肪酸による活性阻害が細胞内の内因性ＡＣＣａｓｅよりも少なく、細胞へのＡＣＣａｓｅの供給が変化したことによるものではない。一実施形態では、細胞は、転写因子を、好ましくは構成的プロモーター以外のプロモーターの制御下でコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。転写因子は、ＷＲＩ１、ＬＥＣ１、ＬＥＣ１様、ＬＥＣ２、ＢＢＭ、ＦＵＳ３、ＡＢＩ３、ＡＢＩ４、ＡＢＩ５、Ｄｏｆ４、Ｄｏｆ１１からなる群、またはＭＹＢ７３、ｂＺＩＰ５３、ＡＧＬ１５、ＭＹＢ１１５、ＭＹＢ１１８、ＴＡＮＭＥＩ、ＷＵＳ、ＧＦＲ２ａ１、ＧＦＲ２ａ２及びＰＨＲ１からなる群から選択して良く、好ましくはＷＲＩ１、ＬＥＣ１またはＬＥＣ２である。更に別の実施形態では、総脂肪酸合成の増加は、相当する野生型細胞と相関する。一実施形態では、２つ以上の異なる転写因子ポリペプチドをコードする２つ以上の外因性ポリヌクレオチドが存在する。
Ｂ．「プル型」改変は、細胞内のＴＡＧ、ＤＡＧまたはＭＡＧ、例えばＤＧＡＴ、ＰＤＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＧＰＡＴまたはＭＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴまたはＰＤＡＴ等の合成を触媒する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼの細胞内での発現及び／または活性を増加させる特徴がある。一実施形態では、これは、１つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドをトランスジェニック細胞内に発現させることにより成し得る。一実施形態では、アシルトランスフェラーゼは、ＤＧＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＧＰＡＴまたはＭＧＡＴの場合は、アシル−ＣｏＡ基質をアシル供与体として使用し、またはＰＤＡＴの場合は、ＰＣからのアシル基をアシル供与体として使用する膜結合型アシルトランスフェラーゼである。プル型改変は、相当する野生型細胞と相関するか、または好ましくは、プッシュ型改変を有する相当する細胞と相関し得る。一実施形態では、細胞は、脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
Ｃ．「防御的」改変は、細胞のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化を抑制する特徴がある。一実施形態では、これは、遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する、細胞内の遺伝子改変によって成し得る。一実施形態では、細胞は、細胞の内因性ＴＡＧリパーゼ、好ましくはＳＤＰ１リパーゼ、Ｃｇｉ５８ポリペプチド、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（例えばＡＣＸ１またはＡＣＸ２）、またはＰＸＡ１ペルオキシソームＡＴＰ結合カセットトランスポーター等の細胞内での脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドの発現及び／または活性が抑制されている。これは、例えば、ＳＤＰ１リパーゼ等のＴＡＧリパーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、または細胞内での脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドの細胞内での発現によって、あるいは、例えば、ＴＡＧリパーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、または脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドをコードする内因性遺伝子の変異により発生し得る。一実施形態では、抑制される発現及び／または活性は、相当する野生型細胞と相関するか、またはプッシュ型改変を有する相当する細胞と相関する。
Ｄ．「パッケージ」改変は、油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチドの発現及び／または蓄積を増加させる特徴がある。一実施形態では、これは、油体被覆（ＯＢＣ）ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドをトランスジェニック細胞内に発現させることにより成し得る。ＯＢＣポリペプチドはオレオシン、例えばポリオレオシン、カオレオシン（ｃａｏｌｅｏｓｉｎ）またはステロレオシン等、好ましくはＬＤＡＰであって良い。一実施形態では、真核細胞に蓄積されるオレオシンのレベルが、ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡ由来のオレオシン遺伝子を含む相当する細胞と比較して、少なくとも２倍である。一実施形態では、ＯＢＣポリペプチドの発現または蓄積の増加の原因は、プッシュ型改変のみによるものではない。一実施形態では、発現及び／または蓄積は、相当する野生型細胞と相関するか、または好ましくはプッシュ型改変を有する相当する細胞と相関する。
Ｅ．「色素体移出」改変は、真核細胞の色素体からの総脂肪酸の移出率を増加させる特徴がある。一実施形態では、これは、外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドをトランスジェニック細胞内に発現させることにより成し得る。一実施形態では、これは、脂肪酸チオエステラーゼ（ＴＥ）、脂肪酸トランスポーターポリペプチド（例えばＡＢＣＡ９ポリペプチド）、または長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＬＡＣＳ）の発現及び／または活性の増加によって発生する。一実施形態では、細胞は、ＴＥ、脂肪酸トランスポーターポリペプチド、またはＬＡＣＳをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。ＴＥは、ＦＡＴＢポリペプチドまたは好ましくはＦＡＴＡポリペプチドでも良い。一実施形態では、ＴＥは、好ましくはＭＣＦＡに対する特異性をもつＴＥである。一実施形態では、色素体の移出改変は、相当する野生型細胞と相関するか、または好ましくはプッシュ型改変を有する相当する細胞と相関する。
Ｆ．「色素体移入」改変は、色素体の外側から細胞の色素体への脂肪酸の移入率を減少させる特徴がある。一実施形態では、これは、遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する、細胞内の遺伝子改変によって成し得る。これは、例えば、ＴＧＤポリペプチド等、例えば、ＴＧＤ１、ＴＧＤ２、ＴＧＤ３またはＴＧＤ４ポリペプチド等のトランスポーターポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドの細胞内での発現によって、あるいは、ＴＧＤポリペプチドをコードする内因性遺伝子の変異により発生し得る。一実施形態では、移入率の減少は、相当する野生型細胞と相関するか、またはプッシュ型改変を有する相当する細胞と相関する。
Ｇ．「原核型経路」改変は、細胞の色素体内のＤＡＧの量またはＤＡＧの産生率を減少させる特徴がある。一実施形態では、これは、遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節する、細胞内の遺伝子改変によって成し得る。一実施形態では、ＤＡＧの量または産生率の減少は、色素体内のアシル−ＡＣＰ及びＧ３ＰからのＬＰＡの産生が減少することにより発生する。ＤＡＧの量または産生率の減少は、色素体ＧＰＡＴ、色素体ＬＰＡＡＴまたは色素体ＰＡＰ、好ましくは色素体ＧＰＡＴをコードする内因性遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドの細胞内での発現によって、あるいは、色素体ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の変異により発生し得る。一実施形態では、ＤＡＧの量または産生率の減少は、相当する野生型細胞と相関するか、または好ましくはプッシュ型改変を有する相当する細胞と相関する。
プッシュ型改変は本発明に必須であり、更にプル型改変を有することが好ましい。防御型改変及びパッケージ改変は相補的であって良く、すなわち２つのうちのいずれかで十分である。細胞は、色素体移出、色素体移入及び原核型経路の改変のうち１つ、２つ、または３つすべてを含んで良い。一実施形態では、細胞の外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも、色素体での脂肪酸合成を調節する転写因子をコードする外因性ポリヌクレオチドは、（Ｈ）構成的プロモーター以外のプロモーター、例えば、発生に関連したプロモーター、光合成細胞で優先的に作用するプロモーター、組織特異的プロモーター、相当する天然プロモーターと比較して、その発現レベルを抑制することにより改変されたプロモーター、または好ましくは、老化特異的プロモーター等の制御下で発現する。より好ましくは、少なくとも、色素体での脂肪酸合成を調節する転写因子をコードする外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター以外のプロモーターであり、トリアシルグリセロールの異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び／または活性を下方調節するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター以外のプロモーターの制御下でも発現し、この各プロモーターは同一であっても異なっていても良い。
植物は、いわゆる原核型経路（図１）によって、色素体内のＭＧＤＧ等の膜脂質のすべてではないが、一部を産生する。植物にはガラクト脂質及びグリセロ脂質を合成するための真核型経路も存在し、この場合、まず色素体でＦＡが合成され、次にＥＲ内でＦＡがグリセロ脂質にアセンブリされる。真核型経路によって合成されるＭＧＤＧは、ＭＧＤＧのｓｎ−２位でエステル化されるＣ１８：３（ＡＬＡ）脂肪酸を含有する。この経路によって、ＭＧＤＧ合成のためのＡＬＡを含むＤＡＧ主鎖がＥＲ内でアセンブリされ、次に色素体へと移送される。対照的に、原核型経路によって合成されるＭＧＤＧは、ＭＧＤＧのｓｎ−２位でエステル化されるＣ１６：３脂肪酸を含有する。ＭＧＤＧ（１６：３）対ＭＧＤＧ（１８：３）の産生に関わる、真核型経路に対する原核型経路の関与比は、異なる植物種の特徴及び示差的特徴である（Ｍｏｎｇｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９８）。ＭＧＤＧのこの特徴的な脂肪酸組成によって、すべての高等植物（被子植物）を、いわゆる１６：３植物または１８：３植物のいずれかに分類することができる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及びＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓを例とする１６：３種は、一般に、ＭＧＤＧ合成操作の原核型経路及び真核型経路の両方を有し、一方のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ及びＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘを例とする１８：３種は、一般にＭＧＤＧ合成の真核型経路のみ（または、ほとんど）を有し、生育組織にＣ１６：３脂肪酸をほとんどまたはまったく蓄積しない。本明細書で使用される場合、「１６：３植物」または「１６：３種」は、その光合成的組織の総脂肪酸含有量のうち、２％超のＣ１６：３脂肪酸を有するものである。本明細書で使用される場合、「１８：３植物」または「１８：３種」は、その光合成的組織の総脂肪酸含有量のうち、２％未満のＣ１６：３脂肪酸を有するものである。本明細書で記載される植物は、好適な遺伝子改変によって、１６：３植物から１８：３植物へと転換することができる。原核型経路と真核型経路とのフラックス比は、異なる植物種または組織をまたがって保存されない。１６：３種では、葉のフラックスのうち最大４０％が原核型経路経由で生じ（Ｂｒｏｗｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、その一方でエンドウ及びダイズ等の１８：３種では、色素体で合成されるＦＡの約９０％が、色素体からＥＲに移出され、元になるＦＡを真核型経路に供給する（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ ａｎｄ Ｂｒｏｗｓｅ，１９９５；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ.，２０００）。
したがって、異なる植物種の糖脂質中に見出される１８：３及び１６：３の脂肪酸の量は異なっている。これを利用して、３つの二重結合を有する脂肪酸がほぼ完全にＣ１８脂肪酸である１８：３植物と、３つの二重結合を有するＣ１６及びＣ１８脂肪酸の両方を含む１６：３植物とを区別する。１８：３植物の葉緑体では、ホスファチジン酸のジアシルグリセロールへの転換、及びジアシルグリセロールのモノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤ）への転換を触媒する酵素的活性は、１６：３の葉緑体内よりも有意に低い活性度である。１８：３植物の葉では、葉緑体がストロマ内でステアロイル−ＡＣＰ２を合成し、第１の二重結合を飽和炭化水素鎖に導入し、次いでチオエステラーゼによりチオエステルを加水分解する（図１）。放出されたオレイン酸は、葉緑体エンベロープを越えて細胞の真核部分の膜、おそらくは小胞体へと移出され、そこでＰＣに組み込まれる。この膜でＰＣと結合したオレオイル基は不飽和化された後、葉緑体に戻る。ＭＧＤと結合したアシル基は、第３の二重結合を導入して、２つのリノレノイル（ｌｉｎｏｌｅｎｏｙｌ）残基を有するＭＧＤを得るための基質である。このガラクト脂質は、例えばＡｓｔｅｒａｃｅａｅ及びＦａｂａｃｅａｅ等の１８：３植物に特徴的である。例えば、Ａｐｉａｃｅａｅ及びＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅのメンバーに代表される１６：３植物の光合成的活性細胞では、２つの経路が平行して作動し、チラコイドにＭＧＤを提供する。
一実施形態では、本発明の生育植物部分、真核細胞、種子またはトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部（例えば、塊茎または食用根）は、遺伝子改変または外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する生育植物部分、真核細胞、種子または非ヒト生物若しくはその一部よりも多くのＴＡＧ等の非極性脂質のレベル及び総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量、好ましくはその両方を生成する。一実施例では、本発明の植物は、相当する種子、葉、表面積の少なくとも１ｃｍ２の葉部分、茎または塊茎と比較して、非極性脂質含有量、例えばＴＡＧまたはＴＦＡ含有量、好ましくはその両方が増加している、種子、葉を実らせ、または表面積の少なくとも１ｃｍ２の葉部分、茎及び／または塊茎を有する。
別の実施形態では、生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部（例えば、塊茎または食用根）、好ましくは植物、塊茎、食用根または種子は、１種以上の特定の脂肪酸が豊富であるＴＡＧを産生する。飽和及び不飽和脂肪酸、ならびに短鎖及び長鎖脂肪酸を含め、広範な脂肪酸がＴＡＧに組み込まれ得る。ＴＡＧに組み込まれ得る、かつレベルが増加され得る脂肪酸のいくつかの非限定的例としては、カプリン脂肪酸（１０：０）、ラウリン脂肪酸（１２：０）、ミリスチン脂肪酸（１４：０）、パルミチン脂肪酸（１６：０）、パルミトレイン脂肪酸（１６：１）、ステアリン脂肪酸（１８：０）、オレイン脂肪酸（１８：１）、バクセン脂肪酸（１８：１）、リノール脂肪酸（１８：２）、エレオステアリン脂肪酸（１８：３）、γリノレン脂肪酸（１８：３）、αリノレン脂肪酸（１８：３ω３）、ステアリドン脂肪酸（１８：４ω３）、アラキジン脂肪酸（２０：０）、エイコサジエン脂肪酸（２０：２）、ジホモ−γリノール脂肪酸（２０：３）、エイコサトリエン脂肪酸（２０：３）、アラキドン脂肪酸（２０：４）、エイコサテトラエン脂肪酸（２０：４）、エイコサペンタエン脂肪酸（２０：５ω３）、ベヘン脂肪酸（２２：０）、ドコサペンタエン脂肪酸（２２：５ω）、ドコサヘキサエン脂肪酸（２２：６ω３）、リグノセリン脂肪酸（２４：０）、ネルボン脂肪酸（２４：１）、セロチン脂肪酸（２６：０）、及びモンタン脂肪酸（２８：０）が挙げられる。本発明の一実施形態では、生育植物部分、真核細胞、種子またはトランスジェニック生物若しくはその一部（例えば、塊茎または食用根）は、オレイン酸を含むＴＡＧが豊富であり、及び／またはリノレン酸（ＡＬＡ）が、好ましくは絶対基準で少なくとも２％または少なくとも５％減少している。
好ましくは、本発明の生育植物部分、真核細胞、種子またはトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部は、１つ以上のキメラＤＮＡ（外因性ポリヌクレオチド）によって形質転換される。複数のキメラＤＮＡの場合、これらは、好ましくは１つのＤＮＡ分子、例えば単一のＴ−ＤＮＡ分子等に共有結合され、及び好ましくは宿主細胞ゲノムに単一座で統合される。あるいは、キメラＤＮＡは、宿主ゲノムに連鎖できない２つ以上のＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子（複数を含む）が一過性発現実験で生じるのと同様に、宿主ゲノムに統合されない、２つ以上のＤＮＡ分子上にある。植物、生育植物部分、真核細胞、種子またはトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部は、好ましくはそのゲノムに挿入される１つのＤＮＡ分子に対してホモ接合性である。
転写因子
真核細胞では、脂肪酸の合成及び脂肪酸（例えばＴＡＧ）を組み込んでいる脂質の合成に、種々の転写因子が関与しているため、これを操作してプッシュ型改変を行うことができる。好適な転写因子は、ＷＲＩ１である。本明細書で使用される場合、「Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １」または「ＷＲＩ１」または「ＷＲＬ１」という用語は、解糖系及びｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸生合成に関与する数種の酵素の発現を調節するＡＰ２／ＥＲ ＷＥＢＰクラスの転写因子を指す。ＷＲＩ１は、２つの植物特異的（ＡＰ２／ＥＲＥＢ）ＤＮＡ結合ドメインを有する。少なくともＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＷＲＩ１は、解糖系を介してスクロースの解体も調節し、それにより脂肪酸生合成のための前駆体の供給を調節する。言い換えると、光合成産物から貯蔵脂質への炭素の流れを制御する。少なくともＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｗｒｉ１変異体は、ＴＡＧへのスクロース及びグルコースの組み込みに欠損があるため、しわのある種子の表現型を有する。
ＷＲＩ１により転写される遺伝子の例としては、限定されないが、ピルビン酸キナーゼ（Ａｔ５ｇ５２９２０、Ａｔ３ｇ２２９６０）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）Ｅ１アルファサブユニット（Ａｔ１ｇ０１０９０）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ＢＣＣＰ２サブユニット（Ａｔ５ｇ１５５３０）、エノイル−ＡＣＰリダクターゼ（Ａｔ２ｇ０５９９０；ＥＡＲ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（Ａｔ１ｇ２２１７０）、細胞質フルクトキナーゼ及び細胞質ホスホグリセリン酸ムターゼ、スクロースシンターゼ（ＳｕＳｙ）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ；Ｂａｕｄ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒｕｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００２を参照）をコードする遺伝子のうちの１つ以上、好ましくはすべてが挙げられる。
ＷＲＬ１は、保存ドメインＡＰ２（ｃｄ０００１８）を含有する。ＡＰ２は、例えば、ＡＰＥＴＡＬＡ２及びＥＲＥＢＰ（エチレン応答性エレメント結合タンパク質）等の植物における転写レギュレーター中に見られるＤＮＡ結合ドメインである。ＥＲＥＢＰの場合、当該ドメインは、エチレン応答性エレメント（ＥＲＥ）（エチレン応答性にとって必須のプロモーターエレメント）の１１ｂｐのＧＣＣ ｂｏｘに特異的に結合する。ＥＲＥＢＰ及びＣ−リピート結合因子ＣＢＦ１（ストレス応答に関与する）は、１コピーのＡＰ２ドメインを含む。ＡＰＥＴＡＬＡ２様タンパク質（植物成長期において役割を果たす）は２つのコピーを含む。
ＷＲＩ１中に見出すことのできる他の配列モチーフ及びその機能的ホモログとしては以下が挙げられる：
１．Ｒ Ｇ Ｖ Ｔ／Ｓ Ｒ Ｈ Ｒ Ｗ Ｔ Ｇ Ｒ（配列番号８９）。
２．Ｆ／Ｙ Ｅ Ａ Ｈ Ｌ Ｗ Ｄ Ｋ（配列番号９０）。
３．Ｄ Ｌ Ａ Ａ Ｌ Ｋ Ｙ Ｗ Ｇ（配列番号９１）。
４．Ｓ Ｘ Ｇ Ｆ Ｓ／Ａ Ｒ Ｇ Ｘ（配列番号９２）。
５．Ｈ Ｈ Ｈ／Ｑ Ｎ Ｇ Ｒ／Ｋ Ｗ Ｅ Ａ Ｒ Ｉ Ｇ Ｒ／Ｋ Ｖ（配列番号９３）。
６．Ｑ Ｅ Ｅ Ａ Ａ Ａ Ｘ Ｙ Ｄ（配列番号９４）。
本明細書で使用される場合、「Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １」または「ＷＲＩ１」という用語は、「Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １様」または「ＷＲＩ１様」タンパク質もまた含む。ＷＲＩ１タンパク質の例としては、アクセッション番号Ｑ６Ｘ５Ｙ６（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号２２）、ＸＰ＿００２８７６２５１．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ．Ｌｙｒａｔａ；配列番号２３）、ＡＢＤ１６２８２．１（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；配列番号２４）、ＡＤＯ１６３４６．１（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；配列番号２５）、ＸＰ＿００３５３０３７０．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号２６）、ＡＥＯ２２１３１．１（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ；配列番号２７）、ＸＰ＿００２５２５３０５．１（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ；配列番号２８）、ＸＰ＿００２３１６４５９．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号２９）、ＣＢＩ２９１４７．３（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号３０）、ＸＰ＿００３５７８９９７．１（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；配列番号３１）、ＢＡＪ８６６２７．１（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ；配列番号３２）、ＥＡＹ７９７９２．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号３３）、ＸＰ＿００２４５０１９４．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号３４）、ＡＣＧ３２３６７．１（Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号３５）、ＸＰ＿００３５６１１８９．１（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；配列番号３６）、ＡＢＬ８５０６１．１（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ；配列番号３７）、ＢＡＤ６８４１７．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号３８）、ＸＰ＿００２４３７８１９．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号３９）、ＸＰ＿００２４４１４４４．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号４０）、ＸＰ＿００３５３０６８６．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号４１）、ＸＰ＿００３５５３２０３．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号４２）、ＸＰ＿００２３１５７９４．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号４３）、ＸＰ＿００２２７０１４９．１（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号４４）、ＸＰ＿００３５３３５４８．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号４５）、ＸＰ＿００３５５１７２３．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号４６）、ＸＰ＿００３６２１１１７．１（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ；配列番号４７）、ＸＰ＿００２３２３８３６．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号４８）、ＸＰ＿００２５１７４７４．１（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ；配列番号４９）、ＣＡＮ７９９２５．１（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号５０）、ＸＰ＿００３５７２２３６．１（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；配列番号５１）、ＢＡＤ１００３０．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号５２）、ＸＰ＿００２４４４４２９．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号５３）、ＮＰ＿００１１７０３５９．１（Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号５４）、ＸＰ＿００２８８９２６５．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｌｙｒａｔａ；配列番号５５）、ＡＡＦ６８１２１．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号５６）、ＮＰ＿１７８０８８．２（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号５７）、ＸＰ＿００２８９０１４５．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｌｙｒａｔａ；配列番号５８）、ＢＡＪ３３８７２．１（Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ；配列番号５９）、ＮＰ＿５６３９９０．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号６０）、ＸＰ＿００３５３０３５０．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号６１）、ＸＰ＿００３５７８１４２．１（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；配列番号６２）、ＥＡＺ０９１４７．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号６３）、ＸＰ＿００２４６０２３６．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号６４）、ＮＰ＿００１１４６３３８．１（Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号６５）、ＸＰ＿００３５１９１６７．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号６６）、ＸＰ＿００３５５０６７６．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号６７）、ＸＰ＿００３６１０２６１．１（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ；配列番号６８）、ＸＰ＿００３５２４０３０．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号６９）、ＸＰ＿００３５２５９４９．１（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号７０）、ＸＰ＿００２３２５１１１．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号７１）、ＣＢＩ３６５８６．３（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号７２）、ＸＰ＿００２２７３０４６．２（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号７３）、ＸＰ＿００２３０３８６６．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号７４）、及びＣＢＩ２５２６１．３（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号７５）が挙げられる。更なる例としては、Ｓｏｒｂｉ−ＷＲＬ１（配列番号７６）、Ｌｕｐａｎ−ＷＲＬ１（配列番号７７）、Ｒｉｃｃｏ−ＷＲＬ１（配列番号７８）及びＬｕｐｉｎ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ ＷＲＩ１（配列番号７９）が挙げられる。好適なＷＲＩ１は、トウモロコシのＷＲＩ１またはモロコシのＷＲＩ１である。
近年、ＷＲＩ１様の転写因子のサブセットが、ＷＲＩ２、ＷＲＩ３またはＷＲＩ４転写因子として再分類された。これらは成長期の種子内よりもむしろ植物の茎及び／または根に優先的に発現する特徴がある（Ｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。再分類されたが、これらは本明細書での「ＷＲＩ１」の定義に包含される。好適なＷＲＩ１様の転写因子は、植物のｗｒｉ１変異の機能、具体的にはＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ｗｒｉ１変異体等の植物の成長期の種子の機能を補完できるものである。ＷＲＩ１様ポリペプチドの機能は、本明細書に記載するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの一過性アッセイで分析することもできる。
本明細書で使用される場合、「ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ」または「ＬＥＣ」ポリペプチドは、種子の成熟及び脂肪酸合成に対して広範な制御を呈する、ＬＥＣ１、ＬＥＣ１様、ＬＥＣ２、ＡＢＩ３またはＦＵＳ３転写因子である転写因子を意味する。ＬＥＣ２、ＦＵＳ３及びＡＢＩ３は、植物タンパク質にのみ見出される１２０のアミノ酸のＢ３ ＤＮＡ結合ドメインを各々が含む関連するポリペプチドである（Ｙａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらは、次のアクセッション番号を有するＡ．ｔｈａｌｉａｎａポリペプチドのメンバーとのアミノ酸配列の関連性を決定する系統発生的解析によって特徴づけることができる：ＬＥＣ２、アクセッション番号ＡＡＬ１２００４．１；ＦＵＳ３（ＦＵＳＣＡ３として知られる）、アクセッション番号ＡＡＣ３５２４７。ＬＥＣ１は、ポリペプチドの異なるクラスに帰属し、ＣＢＦ結合因子クラスのＨＡＰ３ポリペプチドに対して相同的である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＬＥＣ１、ＬＥＣ２及びＦＵＳ３遺伝子は、初期胚形成期において、胚性細胞の運命の維持及び子葉同一性の指定に必要とされ、後期において、胚の成熟の開始及び持続に必要とされる（Ｓａｎｔｏｓ−Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。このポリペプチドはまた、プロモーターに存在するＲＹモチーフに結合することにより、種子の貯蔵タンパク質をコードする遺伝子、及びオレオシン遺伝子の発現も誘導する。各ポリペプチドは、種子成長期における発現パターンによって、またはＡ．ｔｈａｌｉａｎａの対応する変異を補完する能力によって区別することができる。
本明細書で使用される場合、「Ｌｅａｆｙ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ １」または「ＬＥＣ１」という用語は、接合体の成長及び体細胞胚形成に関与するＮＦ−ＹＢ型転写因子を指す。内因性遺伝子は、特に種子内の胚及び内胚乳の両方に発現する。ＬＥＣ１は、ＷＲＩ１をコードする遺伝子、ならびに大分類の脂肪酸合成遺伝子を活性化させる。ＬＥＣ２の異所性発現によっても、オーキシン応答性遺伝子の急速な活性化が生じて、体細胞胚の形成が生じ得る。ＬＥＣ１ポリペプチドの例として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＣ３９４８８、配列番号１４９）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（ＡＦＫ４９６５３、配列番号１５４）及びＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＡＤＦ８１０４５、配列番号１５１）、Ａ．ｌｙｒａｔａ（ＸＰ＿００２８６２６５７、配列番号１５０）、Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＸＰ＿００２５２２７４０、配列番号１５２）、Ｇ．ｍａｘ（ＸＰ＿００６５８２８２３、配列番号１５３）、Ａ．ｈｙｐｏｇａｅａ（ＡＤＣ３３２１３、配列番号１５６）、Ｚ． ｍａｙｓ（ＡＡＫ９５５６２、配列番号１５５）が挙げられる。
ＬＥＣ１様（Ｌ１Ｌ）はＬＥＣ１と密接に関連しているが、異なる遺伝子発現パターンを有し、胚形成期以前に発現する（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＬＥＣ１様ポリペプチドの例として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＮ１５９２４、配列番号１５７）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＡＨＩ９４９２２、配列番号１５８）及びＰｈａｓｅｏｌｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓのＬＥＣ１様（ＡＡＮ０１１４８、配列番号１５９）からのタンパク質が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「Ｌｅａｆｙ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ２」または「ＬＥＣ２」という用語は、接合体の成長及び体細胞胚形成に関与し、ＷＲＩ１をコードする遺伝子の発現を活性化するＢ３ドメイン転写因子を指す。その異所性発現は、生育植物組織からの胚形成を促進する（Ａｌｅｍａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＬＥＣ２ポリペプチドの例として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号ＮＰ＿５６４３０４．１、配列番号１４２）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（アクセッション番号ＣＡＡ４２９３８．１、配列番号１４３）及びＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（アクセッション番号ＡＤＯ１６３４３．１、配列番号１４４）からのタンパク質が挙げられる。
一実施形態では、ＬＥＣ２をコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号１４２〜１４４のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号１４２〜１４４のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本明細書で使用される場合、「ＦＵＳ３」という用語は、接合体の成長及び体細胞胚形成に関与し、胚の前表皮組織に主に検出されるＢ３ドメイン転写因子を指す（Ｇａｚｚａｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＦＵＳ３ポリペプチドの例として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＣ３５２４７、配列番号１６０）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＸＰ＿００６２９３０６６．１、配列番号１６１）及びＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（ＸＰ＿００３６２４４７０、配列番号１６２）からのタンパク質が挙げられる。外因性ポリヌクレオチド由来のＬＥＣ１、Ｌ１Ｌ、ＬＥＣ２、ＦＵＳ３及びＡＢＩ３いずれかの過剰発現を、これらの転写因子の過剰発現と一般に関連する植物成長期の異常を回避するために、特に、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ及びＢ．ｎａｐｕｓ ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒ以外の植物において、発生的調節プロモーター、例えば老化特異的プロモーター、または誘導性プロモーターまたは天然プロモーターと比較して抑制された発現レベルをもたらすために遺伝子操作されたプロモーターによって制御することが好ましい（Ｍｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
本明細書で使用される場合、「ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ」または「ＢＢＭ」という用語は、野生型植物では通常再生を助けない培養条件下で再生を誘発するＡＰ２／ＥＲＦ転写因子を指す。Ｂ．ｎａｐｕｓ及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内のＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＢＢＭ（ＢｎＢＢＭ）遺伝子の異所性発現は、ホルモン非添加の基本培地で生長した苗からの自発的な体細胞胚形成及び器官形成を誘発する（Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。タバコの場合、異所性ＢＢＭ発現により、基本培地上での不定芽及び根再生が十分に誘発されるが、体細胞不定胚（ＳＥ）形成には外因性サイトカイニンが必要である（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＢＢＭポリペプチドの例として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号ＮＰ＿１９７２４５．２、配列番号１４５）、ｍａｉｚｅ（ＵＳ ７５７９５２９）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（アクセッション番号ＸＰ＿００２４５８９２７）及びＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（アクセッション番号ＡＡＷ８２３３４．１、配列番号１４６）からのタンパク質が挙げられる。
一実施形態では、ＢＢＭをコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、別段の指定のない限り、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号１４５または１４６のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号１４５または１４６の一方または両方と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
ＡＢＩ３ポリペプチド（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、アクセッション番号ＮＰ＿１８９１０８）は、トウモロコシのＶＰ１タンパク質と関連性があり、生育組織に低レベルで発現し、色素体の生長に影響を及ぼす。ＡＢＩ４ポリペプチド（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、アクセッション番号ＮＰ＿１８１５５１）は、植物特異的なＡＰ２ドメインを含む転写因子ファミリーに帰属し（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ＡＢＩ３の下流で作用する。ＡＢＩ５（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、アクセッション番号ＮＰ＿５６５８４０）は、ＡＢＡ感受性に影響を及ぼし、種子の一部のＬＥＡ遺伝子の発現を制御するｂＺＩＰファミリーの転写因子である。これはＡＢＡ応答エレメントと結合する。
以下の転写因子は各々、植物の胚形成で機能したという根拠により選択された。アクセッション番号を表１０に示す。他の多くの植物種において、各々のホモログを容易に同定でき、実施例１０に記載するように試験することができる。
ＭＹＢ７３は、ストレス応答に関与する、ダイズで同定された転写因子である。
ｂＺＩＰ５３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓで同定された、ｂＺＩＰタンパク質ファミリーの転写因子である。
ＡＧＬ１５（Ａｇａｍｏｕｓ様１５）は、胚形成期に自然に発現するＭＡＤＳ ｂｏｘ転写因子である。ＡＧＬ１５は、葉起源、茎頂分裂組織及び若い花芽でも自然に発現する。これは、ＡＧＬ１５が発芽後の成長期にも機能を有することを示唆している。ＡＧＬ１５は、胚形成及びジベレリン酸の異化を担う。ＡＧＬ１５の標的は、胚形成のキー調節因子であるＢ３ドメイン転写因子である。
ＭＹＢ１１５及びＭＹＢ１１８は、胚形成に関与する、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに由来するＭＹＢファミリーの転写因子である。
ＥＭＢ２７５７としても知られるＴＡＮＭＥＩは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの胚成長に必要とされるＷＤ反復タンパク質をコードする。
Ｗｕｓｃｈｅｌとしても知られるＷＵＳは、胚の幹細胞プールを制御するホメオボックス遺伝子である。ＷＵＳは、分裂組織の幹細胞形成中心に発現し、幹細胞を未分化状態に維持するために必要とされる。この転写因子は、ＴＡＡＴエレメントのコアモチーフと結合する。
ＧＦＲ２ａ１及びＧＦＲ２ａ２は、少なくともダイズからの転写因子である。
脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ
本明細書で使用される場合、「脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ」という用語は、アシル−ＣｏＡ、ＰＣまたはアシル−ＡＣＰ、好ましくはアシル−ＣｏＡまたはＰＣからアシル基を基質上に転移させ、ＴＡＧ、ＤＡＧまたはＭＡＧを形成できるタンパク質を指す。このようなアシルトランスフェラーゼとして、ＤＧＡＴ、ＰＤＡＴ、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ及びＬＰＡＡＴが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）」という用語は、アシル−ＣｏＡからＤＡＧ基質へ脂肪族アシル基を転移させ、ＴＡＧを産生するタンパク質を意味する。したがって、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、アシル−ＣｏＡからＤＡＧへアシル基を転移させ、ＴＡＧを産生することを指す。ＤＧＡＴはまた、ＭＧＡＴ機能も有し得るが、主にＤＧＡＴとして機能する。すなわち、酵素活性をｎｍｏｌｅ産物／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質を単位として表すとき、ＤＧＡＴはＭＧＡＴとしてよりもＤＧＡＴとして高い触媒活性を有する（例えば、Ｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５を参照）。種子のＴＡＧ合成では、ＤＧＡＴの活性が律速となり得る（Ｉｃｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。ＤＧＡＴはアシル−ＣｏＡ基質をアシル供与体として使用し、アシル基をＤＡＧのｓｎ−３位へと転移させ、ＴＡＧを形成する。酵素は、細胞の小胞体（ＥＲ）内で、酵素の自然状態で機能する。
それぞれＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２及びＤＧＡＴ３と称する、３種類のＤＧＡＴが既知である。ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、典型的に１０個の膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であり、ＤＧＡＴ２ポリペプチドもまた膜タンパク質であるが、典型的に２個の膜貫通ドメインを有する。これに対して、ＤＧＡＴ３ポリペプチドは、典型的にいずれも有しておらず、細胞質に溶解するが、膜には組み込まれないと考えられている。植物ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、典型的に約５１０〜５５０のアミノ酸残基を有し、一方のＤＧＡＴ２ポリペプチドは、典型的に約３１０〜３３０の残基を有する。ＤＧＡＴ１は、大部分の成長期の植物種子でのＤＡＧからのＴＡＧ産生を担う主酵素であるが、多量の異常な脂肪酸を産生するアブラギリ（Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ）及びヒマの実（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）等の植物種からのＤＧＡＴ２は、ＴＡＧ中の異常な脂肪酸の蓄積に重要な役割を有すると思われる。タバコの葉でのＡｔＤＧＡＴ１の過剰発現の結果、ＴＡＧ含有量が６〜７倍に増加した（Ｂｏｕｖｉｅｒ−Ｎａｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（ＸＰ＿７５５１７２．１；配列番号８０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＣＡＢ４４７７４．１；配列番号１）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＡＡＲ１１４７９．１；配列番号８１）、Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ （ＡＢＣ９４４７２．１；配列番号８２）、Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓ（ＡＢＶ２１９４５．１及びＡＢＶ２１９４６．１；それぞれ、配列番号８３及び配列番号８４）、Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌａｔｕｓ（ＡＡＶ３１０８３．１；配列番号８５）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（ＡＡＦ８２４１０．１；配列番号８６）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ＮＰ＿４４５８８９．１；配列番号８７）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ＮＰ＿０３６２１１．２；配列番号８８）、ならびにこれらの変異体及び／または突然変異体由来のＤＧＡＴ１タンパク質が挙げられる。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿５６６９５２．１；配列番号２）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＡＡＹ１６３２４．１；配列番号３）、Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ（ＡＢＣ９４４７４．１；配列番号４）、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａ（ＡＡＫ８４１７９．１；配列番号５）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（Ｑ９６ＰＤ７．２；配列番号６）（Ｑ５８ＨＴ５．１；配列番号７）、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（Ｑ７０ＶＺ８．１；配列番号８）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＡＡＫ８４１７５．１；配列番号９）、ならびにこれらの変異体及び／または突然変異体由来のＤＧＡＴ２遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＧＡＴ１及びＤＧＡＴ２アミノ酸配列は、ほとんど相同性を示さない。葉での外因性ＤＧＡＴ２の発現は、ＤＧＡＴ１の２倍、油含有量（ＴＡＧ）の増加に有効であった。更に、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ２は、ＤＧＡＴ１と比較して、アシル供与体としてオレオイル−ＣｏＡよりもリノレオイル−ＣｏＡ及びリノレノイル−ＣｏＡに対して高い選択性を有した。この基質選択性を利用して、２つのＤＧＡＴクラスをそのアミノ酸配列以外で区別することができる。
ＤＧＡＴ３ポリペプチドの例としては、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．，２００６）ならびにこれらの変異体及び／または突然変異体由来のＤＧＡＴ３遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＧＡＴは、検出可能なＭＧＡＴ活性をほとんどまたは全く有さず、例えば、３００ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは２００ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質未満、より好ましくは１００ｐｍｏｌ／ｍｉｎ分／ｍｇタンパク質未満である。
一実施形態では、ＤＧＡＴ１をコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号１または８０〜８８のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号１または８０〜８８のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
一実施形態では、ＤＧＡＴ２をコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号２〜９のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号２〜９のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本明細書で使用される場合、用語「リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＰＤＡＴ；ＥＣ２．３．１．１５８）または、その同義語「リン脂質：１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ」は、リン脂質、典型的にはＰＣからＤＡＧのｓｎ−３位へアシル基を転移させ、ＴＡＧを形成するアシルトランスフェラーゼを意味する。この反応はＤＧＡＴとは無関連であり、リン脂質をアシル供与体として使用する。植物細胞には、ＰＤＡＴ１、ＰＤＡＴ２またはＰＤＡＴ３を含め、いくつかの形態のＰＤＡＴがある（Ｇｈｏｓａｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
本明細書で使用される場合、「モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」または「ＭＧＡＴ」という用語は、アシル−ＣｏＡからＭＡＧ基質、例えばｓｎ−２ＭＡＧへ脂肪族アシル基を転移させ、ＤＡＧを産生するタンパク質を指す。したがって、「モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、少なくとも、アシル−ＣｏＡからＭＡＧへアシル基を転移させ、ＤＡＧを産生することを指す。本明細書で使用される場合、「ＭＧＡＴ」という用語は、ｓｎ−１／３ＭＡＧ及び／またはｓｎ−２ＭＡＧ基質に作用して、それぞれｓｎ−１，３ＤＡＧ及び／またはｓｎ−１，２／２，３−ＤＡＧを形成する酵素を含む。好ましい実施形態では、ＭＧＡＴは、ｓｎ−１ＭＡＧと比較してｓｎ−２ＭＡＧ基質に対する選択性を有するか、または実質的にｓｎ−２ＭＡＧのみを基質として使用する。本明細書で使用される場合、ＭＧＡＴは、ＭＡＧと比較して、アシル基を優先的にＬｙｓｏＰＡへ転移させる酵素（この種の酵素は、ＬＰＡＡＴとして知られる）を含まない。すなわち、ＭＧＡＴは、非リン酸化モノアシル基質がＬｙｓｏＰＡに対して低い触媒活性を有する場合であっても、優先的に非リン酸化モノアシル基質を使用する。好適なＭＧＡＴは、ＬｙｓｏＰＡのアシル化に関して、検出可能な活性を有しない。ＭＧＡＴはまた、ＤＧＡＴ機能も有し得るが、主にＭＧＡＴとして機能する。すなわち、酵素活性をｎｍｏｌｅ産物／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質を単位として表すとき、ＤＧＡＴとしてよりもＭＧＡＴとして高い触媒活性を有する（Ｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２も参照）。ＭＧＡＴには、それぞれＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２、及びＭＧＡＴ３と称される、３つの既知のクラスがある。ＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２及びＭＧＡＴ３ポリペプチドの例は、ＷＯ２０１３／０９６９９３に記載されている。
本明細書で使用される場合、「ＭＧＡＴ経路」は、ＴＡＧ形成のためのケネディ経路とは異なる同化経路を指し、その経路で、ＭＧＡＴによって触媒されるｓｎ−１ＭＡＧ、または好ましくはｓｎ−２ＭＡＧのいずれかのアシル化によってＤＡＧが形成される。ＤＡＧは、その後、ＴＡＧまたは他の脂質を形成するために使用され得る。ＷＯ２０１２／００００２６は、第１に、植物の葉組織がＧ−３−ＰからＭＡＧを合成し、それにより葉組織で発現した外因性ＭＧＡＴにＭＡＧがアクセス可能となること、第２に、種々の供給源からのＭＧＡＴが植物組織で機能でき、それには脂質合成に関与する他の植物因子との正常な相互作用が必要であること、第３に、外因性ＭＧＡＴ活性によって産生されるＤＡＧが、植物のＤＧＡＴまたは外因性ＤＧＡＴにアクセス可能となり、ＴＡＧを産生できることを実証している。酵素（または、候補酵素）をコードする構築物をサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）系統Ｈ１２４６に導入し、ＴＡＧの蓄積を実証することによって、ＭＧＡＴ及びＤＧＡＴの活性を分析することができる。
一部のＤＧＡＴ２の触媒活性にとって重要であることが示されたモチーフのいくつかは、ＭＧＡＴアシルトランスフェラーゼにも保存される。特に対象とするのは、コンセンサス配列ＦＬＸＬＸＸＸＮ（配列番号１４）を伴う推定中性脂肪結合ドメインであり、この配列中、各Ｘは独立して、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｎは、Ｎ末端膜貫通領域内に位置する任意の非極性アミノ酸であり、その後に推定グリセロール／リン脂質アシルトランスフェラーゼドメインが続く。ＦＬＸＬＸＸＸＮモチーフ（配列番号１４）は、マウスＤＧＡＴ２（アミノ酸８１〜８８）及びＭＧＡＴ１／２で見られるが、酵母または植物ＤＧＡＴ２では見られない。これは、マウスＤＧＡＴ２の活性に重要である。他のＤＧＡＴ２及び／またはＭＧＡＴ１／２配列のモチーフは、以下を含む：
１．ＹＦＰトリペプチド（配列番号１０）。大部分のＤＧＡＴ２ポリペプチド、及びＭＧＡＴ１及びＭＧＡＴ２にも高度に保存され、例えば、マウスＤＧＡＴ２にアミノ酸１３９〜１４１として存在する。このモチーフを酵母ＤＧＡＴ２内で非保存的置換体と共に変異させ、酵素を非機能的にした。
２．ＨＰＨＧテトラペプチド（配列番号１１）。ＭＧＡＴ、ならびに動物及び菌類由来のＤＧＡＴ２配列に高度に保存され、例えばマウスＤＧＡＴ２においてアミノ酸１６１〜１６４として存在し、少なくとも酵母及びマウスＤＧＡＴ２の触媒活性に重要である。植物ＤＧＡＴ２アシルトランスフェラーゼは、代わりにＥＰＨＳ（配列番号１２）保存性配列を有するので、第１及び第４のアミノ酸に対する保存的変化を許容することができる。
３．推定グリセロールリン脂質ドメインの一部である、より長い保存モチーフ。このモチーフの例は、ＲＸＧＦＸ（Ｋ／Ｒ）ＸＡＸＸＸＧＸＸＸ（Ｌ／Ｖ）ＶＰＸＸＸＦＧ（Ｅ／Ｑ）（配列番号１３）であり、これはマウスＤＧＡＴ２においてアミノ酸３０４〜３２７として存在する。このモチーフは、その長さから予想されるように、他の配列よりもアミノ酸配列に保存されないが、相同体をモチーフ検索によって認識することができる。保存性の高いアミノ酸間の間隔は様々であり得る。すなわち、上記の配列と比較して、モチーフ内にＸアミノ酸がより多い場合、またはＸアミノ酸が少ない場合がある。
ＡＣＰまたはＣｏＡにエステル化された脂肪酸からのグリセロ脂質合成の重要な成分の１つは、酵素ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）であり、これは非極性脂質の生合成に関与する別のポリペプチドである。この酵素は、異なる代謝経路及び生理機能に関与する。この酵素は以下の反応を触媒する：Ｇ３Ｐ＋脂肪酸アシル−ＡＣＰまたは脂肪酸アシル−ＣｏＡ→ＬＰＡ＋遊離ＡＣＰまたは遊離ＣｏＡ。ＧＰＡＴ触媒反応は、色素体、小胞体（ＥＲ）及びミトコンドリアの３つの異なる植物細胞内区画で起こる。これらの反応は、色素体ストロマに位置し、アシル−ＡＣＰをその天然アシル基質として使用する可溶性形態（図１のＰＧＰＡＴ）、及びＥＲ及びミトコンドリア内に位置し、天然アシル供与体としてそれぞれアシル−ＣｏＡ及びアシル−ＡＣＰを使用する、２つの膜結合形態である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、３種類のＧＰＡＴ酵素により触媒される。
本明細書で使用される場合、用語「グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ＧＰＡＴ；ＥＣ２．３．１．１５）またはその同義語「グリセロール−３−リン酸Ｏ−アシルトランスフェラーゼ」は、グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）をアシル化してＬｙｓｏＰＡ及び／またはＭＡＧを形成するタンパク質を指し、後者の産物は、ＧＰＡＴがＬｙｓｏＰＡに対してホスファターゼ活性も有する場合に形成される。転移されるアシル基は、ＧＰＡＴがＥＲ型ＧＰＡＴ（「ミクロソームＧＰＡＴ」とも称される「アシル−ＣｏＡ：ｓｎ−グリセロール−３−リン酸１−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ」）である場合、アシル−ＣｏＡからのものであり、またはＧＰＡＴが色素体型ＧＰＡＴ（ＰＧＰＡＴ）である場合は、アシル−ＡＣＰからのものである。したがって、「グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、Ｇ−３−Ｐをアシル化してＬｙｓｏＰＡ及び／またはＭＡＧを形成することを指す。「ＧＰＡＴ」という用語は、Ｇ−３−Ｐをアシル化して、ｓｎ−１−ＬＰＡ及び／またはｓｎ−２−ＬＰＡ、好ましくは、ｓｎ−２−ＬＰＡを形成する酵素を包含する。好ましくは、プル型改変で過剰発現し得るＧＰＡＴは、細胞のＥＲ内で機能する膜結合ＧＰＡＴ、より好ましくはＧＰＡＴ９であり、原核型経路改変で下方調節される色素体のＧＰＡＴは、可溶性ＧＰＡＴ（「色素体ＧＰＡＴ」）である。好ましい実施形態では、ＧＰＡＴはホスファターゼ活性を有する。最も好ましい実施形態では、ＧＰＡＴは、ｓｎ−２−ＭＡＧを産生するｓｎ−２−ＧＰＡＴを有する、ホスファターゼ活性である。
本明細書で使用される場合、「ｓｎ−１グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ｓｎ−１−ＧＰＡＴ）という用語は、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）をアシル化して優先的に１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−１−ＬＰＡ）を形成するタンパク質を指す。したがって、「ｓｎ−１グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸をアシル化して１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−１−ＬＰＡ）を形成することを指す。
本明細書で使用される場合、「ｓｎ−２グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ｓｎ−２−ＧＰＡＴ）という用語は、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）をアシル化して優先的に２−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−２−ＬＰＡ）を形成するタンパク質を指す。したがって、「ｓｎ−２グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸をアシル化して２−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−２−ＬＰＡ）を形成することを指す。
ＧＰＡＴファミリーは広範にわたっており、既知のメンバーはすべて、２つの保存性ドメイン、すなわち、ｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメイン（ＰＦ０１５５３、配列番号１５）及びＨＡＤ様ヒドロラーゼ（ＰＦ１２７１０、配列番号１６）スーパーファミリードメイン、ならびにその変異体を含む。これに加えて、少なくともＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａでは、サブクラスＧＰＡＴ４〜ＧＰＡＴ８のＧＰＡＴはすべて、ホスホセリンホスファターゼドメイン（ＰＦ００７０２、配列番号１７）に相同的なＮ末端領域を含んでおり、ＭＡＧを産物として産生するＧＰＡＴはこのような相同的領域の存在により同定することができる。葉組織に内因的に発現する一部のＧＰＡＴは、保存性アミノ酸配列ＧＤＬＶＩＣＰＥＧＴＴＣＲＥＰ（配列番号１８）を構成する。ＧＰＡＴ４及びＧＰＡＴ６は、いずれもホスファターゼ活性に不可欠であることが知られている保存性残基、特に、Ｎ末端に位置するモチーフＩ（ＤＸＤＸ［Ｔ／Ｖ］［Ｌ／Ｖ］、配列番号１９）及びモチーフＩＩＩ（Ｋ−［Ｇ／Ｓ］［Ｄ／Ｓ］ＸＸＸ［Ｄ／Ｎ］、配列番号２０）の保存性アミノ酸を含む（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＧＰＡＴ４（アクセッション番号ＮＰ＿１７１６６７．１）及びＧＰＡＴ６（ＮＰ＿１８１３４６．１）のホモログとしては、ＡＡＦ０２７８４．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ＡＡＬ３２５４４．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ＡＡＰ０３４１３．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＡＢＫ２５３８１．１（Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、ＡＣＮ３４５４６．１（Ｚｅａ Ｍａｙｓ）、ＢＡＦ００７６２．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ＢＡＨ００９３３．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＥＡＹ８４１８９．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＥＡＹ９８２４５．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＥＡＺ２１４８４．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＥＥＣ７１８２６．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＥＥＣ７６１３７．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＥＥＥ５９８８２．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＥＦＪ０８９６３．１（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ）、ＥＦＪ１１２００．１（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ）、ＮＰ＿００１０４４８３９．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＮＰ＿００１０４５６６８．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＮＰ＿００１１４７４４２．１（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ＮＰ＿００１１４９３０７．１（Ｚｅａ ｍａｙｓ；）、ＮＰ＿００１１６８３５１．１（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ＡＦＨ０２７２４．１（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ） ＮＰ＿１９１９５０．２（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ＸＰ＿００１７６５００１．１（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）、ＸＰ＿００１７６９６７１．１（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）、（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ＸＰ＿００２２７５３４８．１（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ＸＰ＿００２２７６０３２．１（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ＸＰ＿００２２７９０９１．１（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ＸＰ＿００２３０９１２４．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ＸＰ＿００２３０９２７６．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ＸＰ＿００２３２２７５２．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ＸＰ＿００２３２３５６３．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ＸＰ＿００２４３９８８７．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ＸＰ＿００２４５８７８６．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ＸＰ＿００２４６３９１６．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ＸＰ＿００２４６４６３０．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ＸＰ＿００２５１１８７３．１（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ＸＰ＿００２５１７４３８．１（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ＸＰ＿００２５２０１７１．１（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ＡＣＴ３２０３２．１（Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ）、ＮＰ＿００１０５１１８９．１（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ＡＦＨ０２７２５．１（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ＸＰ＿００２３２０１３８．１（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ＸＰ＿００２４５１３７７．１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ＸＰ＿００２５３１３５０．１（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）及びＸＰ＿００２８８９３６１．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ）が挙げられる。
可溶性色素体ＧＰＡＴ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＡＴＳ１として知られるＰＧＰＡＴ）を精製し、それらをコードする遺伝子を、いくつかの植物種、例えばエンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ、アクセッション番号Ｐ３０７０６．１）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ、アクセッション番号Ｑ４３８６９．１）、カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔｅ、アクセッション番号Ｐ１０３４９．１）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ、アクセッション番号Ｑ３９６３９．１）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号Ｑ４３３０７．２）等からクローン作成した。可溶性色素体ＧＰＡＴは、グリセロ脂質合成の原核型経路として既知である工程において最初のステップを担い、色素体でのみ作用する（図１）。いわゆる原核型経路は、植物色素体に限って特定されており、グリセリン主鎖のｓｎ−２位でエステル化されたＣ１６：３脂肪酸を含むガラクト脂質（ＭＧＤＧ及びＤＧＭＧ）合成のためのＤＡＧをアセンブリする。
保存性モチーフ及び／または残基は、配列に基づく特性としてＧＰＡＴ酵素の同定に利用することができる。あるいは、よりストリンジェントな機能に基づくアッセイを利用することもできる。このようなアッセイには、例えば、標識されたグリセロール−３−リン酸を細胞またはミクロソームに供給して、標識された産物のレベルを薄層クロマトグラフィーまたは類似の技術によって定量化することを伴う。ＧＰＡＴ活性の結果、標識されたＬＰＡが産生し、一方でＧＰＡＴ／ホスファターゼ活性の結果、標識されたＭＡＧが産生する。
本明細書で使用される場合、用語「リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ」（ＬＰＡＡＴ；ＥＣ２．３．１．５１）ならびにその同義語「１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」、「アシル−ＣｏＡ：１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸２−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ」及び「１−アシルグリセロール−３−リン酸Ｏ−アシルトランスフェラーゼ」は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）をアシル化してホスファチジン酸（ＰＡ）を形成するタンパク質を指す。転移されるアシル基は、ＬＰＡＡＴがＥＲ型ＬＰＡＡＴである場合は、アシル−ＣｏＡ由来であり、またはＬＰＡＡＴが色素体型のＬＰＡＡＴ（ＰＬＰＡＡＴ）である場合は、アシル−ＡＣＰ由来である。したがって、「リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ＬＰＡをアシル化してＰＡを形成することを指す。
油体被覆ポリペプチド
植物の種子及び花粉は、一般に直径０．５〜２．５ｍの範囲である油体と呼ばれる細胞下構造にＴＡＧを蓄積する。本明細書で使用される場合、「脂肪滴」（「油体」とも称する）は、主にＴＡＧを含めた中性脂質の貯蔵または交換のための脂質豊富な細胞オルガネラである。脂肪滴の大きさは、約２０ｎｍ〜１００μｍまでと、非常に様々である。これらのオルガネラは、いくつかの組み込みタンパク質を含有するリン脂質単層に囲まれたＴＡＧコアを有し、このタンパク質は脂質代謝及び貯蔵ならびに他の膜への脂質輸送に関与し、油体が植物の種子または花組織由来である場合、オレオシンを含む（Ｊｏｌｉｖｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらは一般に０．５〜３．５％をタンパク質が占め、対する残りが脂質である。大部分の細胞で最も密度が低いオルガネラであり、したがって浮遊遠心法により容易に分離することができる。オレオシンは、種子由来の油体の膜内にある最も豊富なタンパク質である（少なくとも８０％）。
本明細書で使用される場合、「オレオシン」という用語は、種子の貯蔵組織（例えば、Ｈｕａｎｇ，１９９６；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｃａｐｕａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｓｈｉｍａｄａ ａｎｄ Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，２０１０を参照）及び人工的に産生された変異体（例えば、ＷＯ２０１１／０５３１６９及びＷＯ２０１１／１２７１１８を参照）中の油体膜に存在する両親媒性タンパク質を指す。
オレオシンは、約１４０〜２３０アミノ酸残基に相当する低いＭｒ（１５〜２６，０００）であり、油体表面に密に充填される。各種子種内には通常、Ｍｒの異なる２種以上のオレオシンが存在する。各オレオシン分子は、比較的親水性の可変Ｎ末端ドメイン（例えば、約４８アミノ酸残基）、脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン及びバリン等が特に豊富である、中心部の全体的に疎水性のドメイン（例えば、約７０〜８０アミノ酸残基のもの）、及びＣ末端またはＣ末端近傍にある約３０〜４０アミノ酸残基の両親媒性αヘリカルドメインを含む。中心部の疎水性ドメインは典型的に、その中心に約１２残基のプロリンノットモチーフを含む。一般に、疎水性残基の中心の連続配列が脂質コアの中に挿入され、両親媒性のＮ末端及び／または両親媒性のＣ末端は、油体表面に位置し、正荷電残基はリン脂質単層に包埋され、負荷電残基は外部に露出される。
本明細書で使用される場合、「オレオシン」という用語は、たとえば２ｘ、４ｘまたは６ｘオレオシンペプチド等の、単一のポリペプチドとして頭−尾結合形態で共に融合された複数のオレオシンポリペプチドを有するポリオレオシン（ＷＯ２００７／０４５０１９）、及びカルシウムを結合し、種子の油体を被覆するタンパク質の微小タンパク質成分であるカレオシン（Ｆｒｏｉｓｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００９）、及びステロールを結合するステロレオシン（ＷＯ２０１１／０５３１６９）を包含する。しかしながら、油体のオレオシンの大部分（少なくとも８０％）は、一般にカレオシン及び／またはステロレオシンではない。「オレオシン」という用語はまた、人工的に改変されたオレオシンポリペプチドも包含し、このようなオレオシンは、ＷＯ２０１１／０５３１６９に記載するように、天然オレオシンの１つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基と人工的に置換されている。典型的には、４〜８残基、好ましくは６残基が人工的に置換されるが、２〜１４残基の間の数を置換することができる。好ましくは、両親媒性のＮ末端及びＣ末端ドメインの両方がシステイン置換を含む。改変は、オレオシンの架橋能力を増加させ、熱安定性及び／またはプロテアーゼによる分解に対するタンパク質の安定性を増加させる。
相当数のオレオシンタンパク質配列及びそれをコードするヌクレオチド配列が、多数の異なる植物種で知られている。例としては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ）、カノーラ、トウモロコシ、イネ、ピーナッツ、トウゴマ、ダイズ、アマ、ブドウ、キャベツ、ワタ、ヒマワリ、モロコシ及びオオムギからのオレオシンが挙げられるが、これらに限定されない。オレオシンの例（アクセッション番号付き）としては、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓオレオシン（ＣＡＡ５７５４５．１；配列番号９５）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓオレオシンＳ１−１（ＡＣＧ６９５０４．１；配列番号９６）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓオレオシンＳ２−１（ＡＣＧ６９５０３．１；配列番号９７）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓオレオシンＳ３−１（ＡＣＧ６９５１３．１；配列番号９８）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓオレオシンＳ４−１（ＡＣＧ６９５０７．１；配列番号９９）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓオレオシンＳ５−１（ＡＣＧ６９５１１．１；配列番号１００）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａオレオシン１（ＡＡＺ２０２７６．１；配列番号１０１）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａオレオシン２（ＡＡＵ２１５００．１；配列番号１０２）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａオレオシン３（ＡＡＵ２１５０１．１；配列番号１０３）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン５（ＡＢＣ９６７６３．１；配列番号１０４）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓオレオシン１（ＥＥＦ４０９４８．１；配列番号１０５）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓオレオシン２（ＥＥＦ５１６１６．１；配列番号１０６）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘオレオシンアイソフォームａ（Ｐ２９５３０．２；配列番号１０７）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘオレオシンアイソフォームｂ（Ｐ２９５３１．１；配列番号１０８）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍオレオシン低分子量アイソフォーム（ＡＢＢ０１６２２．１；配列番号１０９）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍオレオシン高分子量アイソフォーム（ＡＢＢ０１６２４．１；配列番号１１０）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓオレオシン（ＣＡＡ４４２２４．１；配列番号１１１）、Ｚｅａ ｍａｙｓオレオシン（ＮＰ＿００１１０５３３８．１；配列番号１１２）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓステロレオシン（ＡＢＭ３０１７８．１；配列番号１１３）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓステロレオシンＳＬＯ１−１（ＡＣＧ６９５２２．１；配列番号１１４）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓステロレオシンＳＬＯ２−１（ＡＣＧ６９５２５．１；配列番号１１５）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍステロレオシン（ＡＡＬ１３３１５．１；配列番号１１６）、Ｚｅａ ｍａｙｓステロレオシン（ＮＰ＿００１１５２６１４．１；配列番号１１７）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓカレオシンＣＬＯ−１（ＡＣＧ６９５２９．１；配列番号１１８）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓカレオシンＣＬＯ−３（ＡＣＧ６９５２７．１；配列番号１１９）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍカレオシン（ＡＡＦ１３７４３．１；配列番号１２０）、Ｚｅａ ｍａｙｓカレオシン（ＮＰ＿００１１５１９０６．１；配列番号１２１）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘカレオシン（ＡＡＢ７１２２７）が挙げられる。機能的に等価である他の脂質封入ポリペプチドは、プラストグロブリン及びＭＬＤＰポリペプチド（ＷＯ２０１１／１２７１１８）である。
一実施形態では、オレオシンをコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、特段の指定がない限り、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号９５〜１１２のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号９５〜１１２のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
一実施形態では、ステロレオシンをコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、特段の指定のない限り、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号１１３〜１１７のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号１１３〜１１７のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本明細書で使用される場合、「脂肪滴会合タンパク質」または「ＬＤＡＰ」は、植物の種子、葯及び花粉以外の組織または器官（例えば果皮及び中果皮を含む果物組織）内の脂肪滴と会合するポリペプチドを意味する。ＬＤＡＰは、種子、葯または花粉内、ならびに種子、葯及び花粉以外の組織または器官内の油体と会合している場合もある。ＬＤＡＰは種子組織、葯及び花粉内の脂肪滴表面と会合するポリペプチドであるオレオシンとは異なっている。本明細書で使用される場合、ＬＤＡＰは、植物組織内に自然に産生されるＬＤＡＰポリペプチド、ならびに人工的に産生されるアミノ酸配列変異体を含む。このような変異体の機能は、実施例１５に例示されるように試験することができる。
Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、アボカド果皮に発現する２つのＬＤＡＰ遺伝子を同定した。コードされたアボカドＬＤＡＰ１及びＬＤＡＰ２ポリペプチドは、アミノ酸配列が６２％同一であり、シロイヌナズナのＡｔ３ｇ０５５００及びゴムの木のＳＲＰＰ様タンパク質によってコードされるポリペプチドと相同性を有した。Ｇｉｄｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）の穀粒ではなく中果皮に発現した３つのＬＤＡＰ遺伝子を同定し、ＬＤＡＰ遺伝子が植物特異的であり、すべての植物種間で保存されると結論付けた。ＬＤＡＰポリペプチドは、追加のドメインを含有する場合もある（Ｇｉｄｄａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）。ＬＤＡＰをコードする遺伝子は、一般に豊富な脂質を有する非種子組織では上方調節され、それにより同定することができるが、一過性貯蔵のために含まれる油を生成するすべての非種子細胞に発現すると考えられる。Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、植物内のＳＲＰＰ様のタンパク質の系統樹を明らかにしている。例示的なＬＤＡＰポリペプチドを本明細書の実施例１５に記載する。他の植物種のＬＤＡＰのホモログは当業者によって容易に同定することができる。
一実施形態では、ＬＤＡＰをコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、特段の指定のない限り、以下の１つ以上を含む：
ｉ）配列番号２３７、２３９または２４１のいずれか１つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号２３７、２３９または２４１のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本明細書で使用される場合、「デンプン生合成に関与するポリペプチド」という用語は、細胞中の正常レベル（野生型）を下回る下方調節によりデンプン合成のレベル減少をもたらし、デンプンのレベルを減少させる、いずれかのポリペプチドを指す。このようなポリペプチドの例として、ＡＧＰａｓｅがある。
本明細書で使用される場合、「ＡＤＰ−グルコースホスホリラーゼ」または「ＡＧＰａｓｅ」という用語は、デンプン生合成を調節し、グルコース−１−リン酸及びＡＴＰのＡＤＰ−グルコース（デンプンポリマーに対する構成要素として供される）への転換を触媒する酵素を指す。ＡＧＰａｓｅ酵素の活性型は、２つの大きなサブユニットと、２つの小さなサブユニットからなる。
植物におけるＡＤＰａｓｅ酵素は、主に、２つの大きなサブユニットと２つの小さなサブユニットからなる四量体として存在している。これらのサブユニットは、種によって、その触媒及び調節の働きが異なるが（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、植物において小サブユニットは通常、触媒活性を示す。小サブユニットの分子量は、約５０〜５５ｋＤａである。大きい大サブユニットの分子量は、約５５〜６０ｋＤａである。植物酵素は、二酸化炭素固定の産物である３−ホスホグリセリン酸（ＰＧＡ）により強く活性化され、ＰＧＡの非存在下では、酵素はその活性を約３％しか示さない。植物のＡＧＰａｓｅはまた、無機リン酸（Ｐｉ）により強く阻害される。対照的に、細菌のＡＧＰａｓｅ及び藻類のＡＧＰａｓｅは、５０ｋＤａのホモ四量体として存在する。藻類の酵素は、その植物の対応物と類似して、ＰＧＡにより活性化され、Ｐｉにより阻害される一方、細菌の酵素は、フルクトース−１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）により活性化され、ＡＭＰ及びＰｉにより阻害される。
ＴＡＧリパーゼ及びβ酸化
本明細書で使用される場合、「脂質分解に関与するポリペプチド及び／または脂質含有量を減少させるポリペプチド」という用語は、細胞中の正常レベル（野生型）を下回る下方調節により細胞中の、好ましくは植物の生育部分、塊茎、食用根または種子の細胞中の油（例えば、脂肪酸及び／またはＴＡＧ）のレベルの増加をもたらす、脂質を異化するいずれかのポリペプチドを指す。このようなポリペプチドの例として、リパーゼ、または例えばＣＧｉ５８（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ−５８様）ポリペプチド、ＳＵＧＡＲ−ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１（ＳＤＰ１）トリアシルグリセロールリパーゼ（例えば、Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２を参照）及びＷＯ２００９／０２７３３５に記載のリパーゼ等のリパーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ＴＡＧリパーゼ」（ＥＣ．３．１．１．３）という用語は、１つ以上の脂肪酸、及びＤＡＧ、ＭＡＧまたはグリセロールのいずれか１つにＴＡＧを加水分解するタンパク質を指す。したがって、「ＴＡＧリパーゼ活性」という用語は、ＴＡＧをグリセロールと脂肪酸に加水分解することを指す。
本明細書で使用される場合、「ＣＧｉ５８」という用語は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ及び他の植物のホモログではＡｔ４ｇ２４１６０遺伝子、及び酵母とそのホモログでは「Ｉｃｔ１ｐ」によりコードされる、可溶性のアシル−ＣｏＡ依存性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼを指す。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子座Ａｔ４ｇ２４１６０由来の植物の遺伝子は、以下の２つの選択的転写産物として発現する：長い全長アイソフォーム（Ａｔ４ｇ２４１６０．１）及び３′末端部分が失われた短いアイソフォーム（Ａｔ４ｇ２４１６０．２）（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００９；ＵＳ２０１０００２２１４００を参照）。いずれのｍＲＮＡも、ヒトＣＧＩ−５８タンパク質とホモログであり、このα／β加水分解酵素ファミリー（ＡＢＨＤ）のオルソロガスな他のメンバーのタンパク質をコードする。一実施形態では、ＣＧＩ５８（Ａｔ４ｇ２４１６０）タンパク質は、植物種にわたって保存される３つのモチーフ：ＧＸＳＸＧリパーゼモチーフ（配列番号１２７）、ＨＸ（４）Ｄアシルトランスフェラーゼモチーフ（配列番号１２８）、及びＶＸ（３）ＨＧＦ、推定脂質結合モチーフ（配列番号１２９）を含有する。ヒトＣＧＩ−５８タンパク質は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）活性を有するが、リパーゼ活性はない。対照的に、植物及び酵母タンパク質は、脊椎動物（ヒト、マウス及びゼブラフィッシュ）タンパク質には存在していない、カノニカルなリパーゼ配列モチーフＧＸＳＸＧ（配列番号１２７）を有する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００９）。植物及び酵母のＣＧＩ５８タンパク質は、ＬＰＡＡＴ活性に加え、検出可能な量のＴＡＧリパーゼ及びホスホリパーゼＡ活性を有していると思われるが、ヒトのタンパク質にはない。
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ中の相同なＣＧＩ−５８遺伝子を撹乱することにより、成熟した葉の中で、中性脂質滴の蓄積がもたらされる。ｃｇｉ−５８の機能を失った突然変異体由来の単離脂質滴の質量分析により、一般的な葉特異的脂肪酸と共にトリアシルグリセロールを含有していることが示された。成熟したｃｇｉ−５８植物の葉は、トリアシルグリセロールの絶対レベルに、野生型植物の１０倍を超える著しい増加を呈する。ｃｇｉ−５８の機能が失われている植物の油貯蔵種子中の脂質レベルは変化せず、β酸化の突然変異体と異なり、ｃｇｉ−５８種子は正常に発芽及び生長し、スクロースのレスキューを必要としなかった（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
ＣＧｉ５８ポリペプチドをコードするヌクレオチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿１９４１４７．２をコードするＮＭ＿１１８５４８．１；配列番号：１３０）、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（ＸＰ＿００３５７８４５０．１；配列番号：１３１）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ＸＰ＿００３５２３６３８．１をコードするＸＭ＿００３５２３５９０．１；配列番号：１３２）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（ＮＰ＿００１１４９０１３．１をコードするＮＭ＿００１１５５５４１．１；配列番号：１３３）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（ＸＰ＿００２４６０５３８．１をコードするＸＭ＿００２４６０４９３．１；配列番号：１３４）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＸＰ＿００２５１０４８５．１をコードするＸＭ＿００２５１０４３９．１；配列番号：１３５）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（ＸＰ＿００３６０３７３３．１をコードするＸＭ＿００３６０３６８５．１；配列番号：１３６）、及びＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（ＥＡＺ０９７８２．１をコードする）由来のものが挙げられる。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変は、ＣＧｉ５８の内因性の産生を下方調節し、ここでのＣＧｉ５８は以下の１つ以上によりコードされる：
ｉ）配列番号１３０〜１３６のいずれか１つに示された配列を含むヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号１３０〜１３６のいずれか１つ以上と少なくとも３０％同一である配列を含むヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
ＴＡＧに対するリパーゼ活性を有する他のリパーゼとして、植物種ならびに酵母（ＴＧＬ４ポリペプチド）及び動物細胞に見られるＳＵＧＡＲ−ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１トリアシルグリセロールリパーゼ（ＳＤＰ１、例えばＥａｓｔｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１を参照）及びＳＤＰ１様ポリペプチドが挙げられ、これらは貯蔵ＴＡＧの分解に関与する。ＳＤＰ１及びＳＤＰ１様ポリペプチドは、発芽後の種子でＴＡＧ分解を開始する役割を担っていると思われる（Ｅａｓｔｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＳＤＰ１の突然変異体である植物は、外因性ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１の非存在下で、そのＴＡＧ中でＰＵＦＡレベルの増加を呈する。本明細書で使用される場合、「ＳＤＰ１ポリペプチド」は、植物種のＳＤＰ１ポリペプチド、ＳＤＰ１様ポリペプチド及びそのホモログを含む。植物のＳＤＰ１及びＳＤＰ１様ポリペプチドは、長さ８００〜９１０のアミノ酸残基であり、油体表面と会合し、ＤＡＧまたはＭＡＧに優先してＴＡＧを加水分解できるパタチン様のアシルヒドロラーゼドメインを有する。ＳＤＰ１は、ＴＡＧのｓｎ−２位でアシル基を加水分解する選択性を有すると考えられる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、ＳＤＰ１リパーゼ、すなわちＳＤＰ１（アクセッション番号ＮＰ＿１９６０２４、ヌクレオチド配列の配列番号１６３及び他種のホモログ）、ＳＤＰ１Ｌ（アクセッション番号ＮＭ＿２０２７２０及び他種のホモログ、Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）及びＡＴＧＬＬ（Ａｔ１ｇ３３２７０）（Ｅａｓｔｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００６）をコードする少なくとも３つの遺伝子を含む。遺伝子活性の抑制に特に関与するのは、植物の生育組織（例えば葉、茎及び根）に発現するＳＤＰ１遺伝子である。したがって、植物部分のＳＤＰ１ポリペプチドの活性を抑制することによって、例えばＳＤＰ１ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の変異、または内因性ＳＤＰ１遺伝子の発現を抑制するサイレンシングＲＮＡ分子をコードする外因性遺伝子の導入のいずれかによって、生育植物部分の非極性脂質のレベルを増加させることができる。このような抑制は、テンサイ及びジャガイモ等の塊茎作物、及びサトウキビ及びテンサイ等の「高スクロース」植物に特に有益である。
選択した植物種のＳＤＰ１ホモログ（ＳＤＰ１様のホモログを含む）をコードする遺伝子は、既知のＳＤＰ１遺伝子配列に対する相同性により容易に同定することができる。既知のＳＤＰ１ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は以下のアクセッション番号を含む：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、ＧＮ０７８２９０（配列番号１６４）、ＧＮ０７８２８１、ＧＮ０７８２８３；Ｃａｐｓｅｌｌａ ｒｕｂｅｌｌａ、ＸＰ＿００６２８７０７２；Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ、ＸＰ＿００７０２８５７４．１；Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、ＸＰ＿００２３０８９０９（配列番号１６６）；Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ、ＸＰ＿００７２０３３１２；Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ、ＸＰ＿００８２４０７３７；Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、ＸＰ＿００８３７３０３４；Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、ＸＰ＿００２５３００８１；Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ、ＸＰ＿００３５９１４２５（配列番号１６７）；Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、ＸＰ＿００４２４９２０８；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、ＸＰ＿００７１６２１３３；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、ＸＰ＿００３５５４１４１（配列番号１６８）；Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ＸＰ＿００６３５１２８４；Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、ＸＰ＿００３５２１１５１；Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ、ＸＰ＿００４４９３４３１；Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ、ＸＰ＿００４１４２７０９；Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ、ＸＰ＿００８４５７５８６；Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ、ＫＤＰ２６２１７；Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ、ＣＢＩ３００７４；Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群ＢＡＢ６１２２３；Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｉｎｄｉｃａ Ｇｒｏｕｐ ＥＡＹ７５９１２；Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群ＮＰ＿００１０４４３２５；Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、ＸＰ＿００２４５８５３１（配列番号１６９）；Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ、ＸＰ＿００３５６７１３９（配列番号１６５）；Ｚｅａ ｍａｙｓ、ＡＦＷ８５００９；Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、ＢＡＫ０３２９０（配列番号１７２）；Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ、ＥＭＴ３２８０２；Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、ＸＰ＿００２４６３６６５；Ｚｅａ ｍａｙｓ、ＮＰ＿００１１６８６７７（配列番号１７０）；Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、ＢＡＫ０１１５５；Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ、ＥＭＴ０２６２３；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｕｒａｒｔｕ、ＥＭＳ６７２５７；Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、ＸＰ＿００１７５８１６９（配列番号１７１）。内因性遺伝子の発現を阻害する遺伝子構築物に用いられる好適なＳＤＰ１配列は、改変されているかどうかを問わず、細胞、生育植物部分または種子において最も高度に発現する遺伝子に対応するｃＤＮＡ由来である。ある植物種の遺伝子ファミリーの全メンバーの活性を抑制することが望ましい場合、その植物種のＳＤＰ１遺伝子のすべてに対応するｃＤＮＡ間で高度に保存されるヌクレオチド配列が好ましい。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変は、ＳＤＰ１の内因性の産生を下方調節し、ここでのＳＤＰ１は以下の１つ以上によりコードされる：
ｉ）配列番号１６３〜１７４のいずれか１つに示された配列を含むヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号１６３〜１７４に示された配列のいずれか１つ以上と少なくとも３０％、配列が同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）またはｉｉ）の一方または両方とハイブリダイズするヌクレオチドの配列。
実施例に示すように、植物の葉におけるＳＤＰ１のＴＡＧリパーゼの発現及び／または活性の抑制は、転写因子ＷＲＩ１と脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼの共発現に関連して、蓄積したＴＡＧの量及び植物成長期初期の蓄積タイミングの両方の点で、ＴＡＧ含有量を大幅に増加させた。特に、開花前の植物に増加が観察され、老化開始期での増加は重量基準で最大約７０％（％乾重量）であった。増加は、ＷＲＩ１及び脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼをコードするが、ＳＤＰ１発現及び／または活性が抑制された改変を欠く、外因性ポリヌクレオチドで形質転換された、相当する植物の葉に観察されたＴＡＧレベルと相関していた。
植物部分の他のＴＡＧ異化遺伝子、例えばＡｃｘ１（Ａｔ４ｇ１６７６０及びその他の植物種のホモログ）またはＡｃｘ２（Ａｔ５ｇ６５１１０及びその他の植物種のホモログ）遺伝子等のアシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードするＡＣＸ遺伝子の発現を抑制することでも、ＴＡＧ含有量を増加させることができる。脂質異化に関与する別のポリペプチドは、β酸化のための脂肪酸取り込みに必要とされる、ペルオキシソームＡＴＰ結合カセットトランスポーターであるＰＸＡ１である（Ｚｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
色素体からの脂肪酸の移出
本明細書で使用される場合、「細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチド」という用語は、色素体内（植物の生育部分、塊茎、食用根または種子の細胞等の、色素体を有する細胞内）から、色素体外部（例えば小胞体（ＥＲ）等の細胞の他のいずれかの部分であっても良い）への脂肪酸の移送を補助する、いずれかのポリペプチドを指す。このようなポリペプチドの例としては、Ｃ１６またはＣ１８脂肪酸チオエステラーゼ（例えばＦＡＴＡポリペプチドまたはＦＡＴＢポリペプチド）、Ｃ８〜Ｃ１４脂肪酸チオエステラーゼ（ＦＡＴＢポリペプチドでもある）、ＡＢＣＡ９ポリペプチド等の脂肪酸トランスポーター、または長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＬＡＣＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸チオエステラーゼ」または「ＦＡＴ」という用語は、アシル−ＡＣＰ内のアシル部分とアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）間のチオエステル結合の加水分解及び遊離脂肪酸の放出を触媒する酵素を指す。このような酵素は典型的に、新たに脂肪酸を合成している生物の色素体内で機能する。本明細書で使用される場合、「Ｃ１６またはＣ１８脂肪酸チオエステラーゼ」という用語は、アシル−ＡＣＰ内のＣ１６及び／またはＣ１８のアシル部分とＡＣＰ間のチオエステル結合の加水分解及び色素体の遊離Ｃ１６またはＣ１８脂肪酸の放出を触媒する酵素を指す。更に遊離脂肪酸は、色素体のエンベロープ内でＣｏＡに再エステル化されて、色素体から移出される。色素体の脂肪酸チオエステラーゼ（ＦＡＴ）酵素の基質特異性は、鎖長の範囲及び色素体から移出される脂肪酸の飽和度の決定に関与する。ＦＡＴ酵素は、その基質特異性及びヌクレオチド配列に基づいて、ＦＡＴＡ及びＦＡＴＢ（ＥＣ３．１．２．１４）という２つのクラスに分類することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＦＡＴＡポリペプチドは基質としてオレオイル−ＡＣＰを選択し、対するＦＡＴＢポリペプチドは遊離パルミチン酸を生成するパルミトイル−ＡＣＰへの作用等の異なる鎖長の飽和アシル−ＡＣＰに対して高い活性を示す。本発明に有用なＦＡＴＡポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿１８９１４７）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ＧＵ３２４４４６）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ＡＡＬ７９３６１）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ＡＡＡ３３０２０）、Ｍｏｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ（ＸＰ＿０１０１０４１７８．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＣＤＸ７７３６９．１）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＸＰ＿００２５３２７４４．１）、及びＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（ＡＦＱ６０９４６．１）由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に有用なＦＡＴＢポリペプチドの例としては、Ｚｅａ ｍａｙｓ（ＡＩＬ２８７６６）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＡＢＨ１１７１０）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ＡＡＸ１９３８７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＥＥ２８３００）、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（ＡＡＣ４９００１）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ＡＦＲ５４５００）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＥＥＦ４７０１３）、及びＢｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ（ＡＢＬ８５０５２．１）由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。
ＦＡＴＢポリペプチドのサブクラスは、チオエステル結合によってＡＣＰと結合されるＣ８〜Ｃ１４飽和アシル部分に対して加水分解活性を有する脂肪酸チオエステラーゼである。このような酵素は、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）チオエステラーゼまたはＭＣ−ＦＡＴ酵素とも称される。このような酵素は、Ｃ１６−ＡＣＰに対するチオエステラーゼ活性を有することができ、実際、ＭＣＦＡ−ＡＣＰ基質に対してよりもＣ１６アシル−ＡＣＰ基質に対して高いチオエステラーゼ活性を有し得るが、本明細書では、植物細胞で外因的に発現するとき、総脂肪酸含有量の少なくとも０．５％のＭＣＦＡを産生する場合、この酵素をＭＣＦＡチオエステラーゼであると見なす。ＭＣＦＡチオエステラーゼの例を、本明細書の実施例９に示す。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸トランスポーター」という用語は、色素体から色素体外部への脂肪酸の動的な移送に関与する色素体膜に存在するポリペプチドを言う。本発明に有用なＡＢＣＡ９（ＡＢＣトランスポーターＡのファミリーメンバー９）ポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｑ９ＦＬＴ５）、Ｃａｐｓｅｌｌａ ｒｕｂｅｌｌａ（ＸＰ＿００６２７９９６２．１）、Ａｒａｂｉｓ ａｌｐｉｎｅ（ＫＦＫ２７９２３．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４５７６５２．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＣＤＹ２３０４０．１）、及びＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１３６５１２．１）由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アシル−ＣｏＡシンテターゼ」または「ＡＣＳ」（ＥＣ６．２．１．３）という用語は、２段階の工程による脂肪酸アシル−ＣｏＡの生成を触媒するリガーゼファミリのメンバーであるポリペプチドを意味する。この工程は、アデニル化中間体を経て進行し、非エステル化脂肪酸、ＣｏＡ及びＡＴＰを基質として使用し、アシル−ＣｏＡエステル、ＡＭＰ及びピロリン酸を産物として生成する。本明細書で使用される場合、「長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ」（ＬＡＣＳ）という用語は、少なくともＣ１８遊離脂肪酸基質に対する活性を有するＡＣＳであるが、Ｃ１４〜Ｃ２０遊離脂肪酸のいずれに対しても広い活性を有することができる。内因性色素体のＬＡＣＳ酵素は色素体外膜に位置しており、脂肪酸チオエステラーゼと共に機能し、色素体から脂肪酸を移出させる（Ｓｃｈｎｕｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの場合、少なくとも９つの同定されたＬＡＣＳ遺伝子が存在する（Ｓｈｏｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００２）。好適なＬＡＣＳポリペプチドは、ＬＡＣＳ９サブクラスに属し、これはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの主要色素体ＬＡＣＳである。本発明に有用なＬＡＣＳポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｑ９ＣＡＰ８）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４１６７１０．１）、Ｃａｐｓｅｌｌａ ｒｕｂｅｌｌａ（ＸＰ＿００６３０１０５９．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＣＤＸ７９２１２．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１０４６１８．１）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｒａｉｍｏｎｄｉｉ（ＸＰ＿０１２４５０５３８．１）、及びＶｉｔｉｓ Ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＸＰ＿００２２８５８５３．１）由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。上述したポリペプチドの他種のホモログは、当業者によって容易に同定することができる。
色素体中のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）産生に関与するポリペプチド
植物部分の色素体内でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチドの活性を抑制することによって、例えば、このようなポリペプチドをコードする内因性遺伝子の変異、または色素体内でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与する標的遺伝子の発現を抑制するサイレンシングＲＮＡ分子をコードする外因性遺伝子の導入のいずれかによって、例えば、生育植物部分の非極性脂質のレベルも増加させることができる。
本明細書で使用される場合、「色素体内でのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生に関与するポリペプチド」という用語は、ジアシルグリセロールの合成に直接関与する色素体内（植物の生育部分、塊茎、食用根、または種子の細胞等の色素体を有する細胞内）のいずれかのポリペプチドを指す。このようなポリペプチドの例としては、色素体ＧＰＡＴ、色素体ＬＰＡＡＴまたは色素体ＰＡＰが挙げられるが、これらに限定されない。
ＧＰＡＴについては、本文書の別の箇所に記載する。本発明の下方調節の標的となり得る色素体ＧＰＡＴポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＢＡＡ００５７５）、Ｃａｐｓｅｌｌａ ｒｕｂｅｌｌａ（ＸＰ＿００６３０６５４４．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（０１０４９９７６６．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＣＤＹ４３０１０．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１４５１９８．１）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ＡＤＶ１６３８２．１）、及びＣｉｔｒｕｓ ｕｎｓｈｉｕ（ＢＡＢ７９５２９．１）由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。他種のホモログは、当業者によって容易に同定することができる。
ＬＰＡＡＴについては、本文書の別の箇所に記載する。当業者であれば理解できるように、色素体のＤＡＧ合成を抑制するための下方調節の標的となる色素体ＬＰＡＡＴは、例えば本明細書に記載する中鎖脂肪酸を含むＴＡＧの産生に有用となるように色素体外部で機能する、ＥＲ内のもの等の内因性ＬＰＡＡＴではない。本発明の下方調節の標的となり得る色素体ＬＰＡＡＴポリペプチドの例としては、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＡＢＱ４２８６２）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１３７９３９．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿１９４７８７．２）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４３２９６９．１）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ＸＰ＿００６５９２６３８．１）、及びＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＸＰ＿００６３４３６５１．１）由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。上述したポリペプチドの他種のホモログは、当業者によって容易に同定することができる。
本明細書で使用される場合、「ホスファチジン酸ホスファターゼ」（ＰＡＰ）（ＥＣ３．１．３．４）という用語は、３−ｓｎ−ホスファチジン酸上のリン酸基を加水分解して、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール（ＤＡＧ）とリン酸を生成するタンパク質を指す。本発明の下方調節の標的となり得る色素体ＰＡＰポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｑ６ＮＬＡ５）、Ｃａｐｓｅｌｌａ ｒｕｂｅｌｌａ（ＸＰ＿００６２８８６０５．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４５２１７０．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＣＤＹ１０４０５．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１２２７３３．１）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ＸＰ＿００３５４２５０４．１）及びＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＸＰ＿００６３６１７９２．１）由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。上述したポリペプチドの他種のホモログは、当業者によって容易に同定することができる。
色素体への脂肪酸の移入
植物部分のＴＧＤポリペプチドの活性を抑制すること、例えばＴＧＤポリペプチドをコードする内因性遺伝子の変異、または内因性ＴＧＤ遺伝子の発現を抑制するサイレンシングＲＮＡ分子をコードする外因性遺伝子の導入のいずれかによっても、生育植物部分の非極性脂質のレベルを増加させることができる。本明細書で使用される場合、「トリガラクトシルジアシルグリセロール（ＴＧＤ）ポリペプチド」は、ＥＲ内での葉緑体の脂質輸送（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に関与するもの、及び脂質に対するパーミアーゼ機能を有するタンパク質複合体の形成に関与するものである。ＴＧＤパーミアーゼを形成する、またはそれと会合するこのようなポリペプチドとして、ＴＧＤ−１（アクセッション番号Ａｔ１ｇ１９８００及び他種のホモログ）、ＴＧＤ−２（アクセッション番号Ａｔ２ｇ２０３２０及び他種のホモログ）、ＴＧＤ−３（アクセッション番号ＮＭ−１０５２１５及び他種のホモログ）及びＴＧＤ−４（Ａｔ３ｇ０６９６０及び他種のホモログ）（ＵＳ２０１２０２３７９４９）の４つが既知である。ＴＧＤ−１、ＴＧＤ−２及びＴＧＤ−３のポリペプチドは、葉緑体の内側エンベロープ膜に会合するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターの成分であると考えられている。ＴＧＤ−２及びＴＧＤ−４ポリペプチドはホスファチジン酸と結合するが、ＴＧＤ−３ポリペチド（ＴＧＤ−３ ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）は葉緑体ストロマのＡＴＰａｓｅとして機能する。本明細書で使用される場合、「内因性ＴＧＤ遺伝子」は、植物のＴＧＤポリペプチドをコードする遺伝子である。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＴＧＤ−１遺伝子変異によって、トリアシルグリセロール、オリゴガラクト脂質及びホスファチジン酸（ＰＡ）の蓄積が生じた（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＴＧＤ遺伝子またはＳＤＰ１遺伝子の変異、すなわち実際には所望するいずれの植物遺伝子の変異も、当技術分野において既知である、人工ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥＮ）またはＣＲＩＳＰＲ技術（Ｃａｓ９型ヌクレアーゼを使用）によって部位特異的な方式で導入することができる。サイレンシングＲＮＡをコードする好適な外因性遺伝子は、二重鎖ＲＮＡ分子、例えばヘアピンＲＮＡまたは人工マイクロＲＮＡ前駆体をコードするものである。
脂肪酸修飾酵素
本明細書で使用される場合、「ＦＡＤ２」という用語は、オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）を不飽和化してリノール酸（Ｃ１８：２Δ９，１２）を生成する膜結合デルタ１２脂肪酸デスチュレーゼ（ｄｅｓｔｕｒａｚｅ）を指す。
本明細書で使用される場合、「エポキシゲナーゼ」または「脂肪酸エポキシゲナーゼ」という用語は、エポキシ基を脂肪酸に導入し、エポキシ脂肪酸の産生をもたらす酵素を指す。好ましい実施形態では、エポキシ基は脂肪酸鎖の１２番目の炭素に導入され、その場合のエポキシゲナーゼは、特にＣ１６またはＣ１８脂肪酸鎖のΔ１２−エポキシゲナーゼである。エポキシゲナーゼは、Δ９−エポキシゲナーゼ、Δ１５−エポキシゲナーゼであっても良く、または当技術分野において既知のアシル鎖の異なる位置で作用しても良い。エポキシゲナーゼは、Ｐ４５０クラスのものであっても良い。好ましいエポキシゲナーゼは、ＷＯ９８／４６７６２に記載のモノ−オキシゲナーゼである。多くのエポキシゲナーゼまたは推定エポキシゲナーゼがクローニングされており、当技術分野において既知である。エポキシゲナーゼの更なる例としては、ＷＯ２００９／１２９５８２の配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｃｒｅｐｉｓ ｐａｌｅａｓｔｉｎａ（ＣＡＡ７６１５６，Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、Ｓｔｏｋｅｓｉａ ｌａｅｖｉｓ（ＡＡＲ２３８１５）（モノオキシゲナーゼ型）、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌａｇａｓｃａｅ（ＡＡＬ６２０６３）（Ｐ４５０型）、ヒトＣＹＰ２Ｊ２（アラキドン酸エポキシゲナーゼ、Ｕ３７１４３）；ヒトＣＹＰＩＡ１（アラキドン酸エポキシゲナーゼ、Ｋ０３１９１）由来の遺伝子にコードされるポリペプチド、ならびにそれらの変異体及び／または突然変異体が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシラーゼ」または「脂肪酸ヒドロキシラーゼ」という用語は、ヒドロキシ基を脂肪酸に導入し、ヒドロキシル化脂肪酸の産生をもたらす酵素を指す。好ましい実施形態では、ヒドロキシ基は、Ｃ１８脂肪酸鎖の２、１２及び／または１７番目の炭素に導入される。好ましくは、ヒドロキシ基は、１２番目の炭素に導入され、その場合のヒドロキシラーゼは、Δ１２−ヒドロキシラーゼである。他の好ましい実施形態では、ヒドロキシ基は、Ｃ１６脂肪酸鎖の１５番目の炭素に導入される。ヒドロキシラーゼはまた、脂肪酸デサチュラーゼとしての酵素活性を有していても良い。Δ１２−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の例としては、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＡＡＣ９０１０、ｖａｎ ｄｅ Ｌｏｏ １９９５）；Ｐｈｙｓａｒｉａ ｌｉｎｄｈｅｉｍｅｒｉ、（ＡＢＱ０１４５８、Ｄａｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）；Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ ｆｅｎｄｌｅｒｉ、（ＡＡＣ３２７５５、Ｂｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ、（ＡＡＫ３０２０６）由来のもの；例えば、Ａ，ｔｈａｌｉａｎａ ＣＹＰ８６Ａ１（Ｐ４８４２２、脂肪酸ω−ヒドロキシラーゼ）；Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ ＣＹＰ９４Ａ１（Ｐ９８１８８、脂肪酸ω−ヒドロキシラーゼ）；マウスＣＹＰ２Ｅ１（Ｘ６２５９５、ラウリン酸ω−１ヒドロキシラーゼ）；ラットＣＹＰ４Ａ１（Ｍ５７７１８、脂肪酸ω−ヒドロキシラーゼ）等の脂肪酸の末端をヒドロキシル化する脂肪酸ヒドロキシラーゼ、ならびにそれらの変異体及び／または突然変異体が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「コンジュガーゼ」または「脂肪酸コンジュガーゼ」という用語は、脂肪酸のアシル鎖に共役結合を形成することができる酵素を指す。コンジュガーゼの例としては、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（ＡＦ３４３０６４、Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）；Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ（ＡＡＮ８７５７４、Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）；Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ（ＡＹ１７８４４６、Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）及びＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ（ＡＹ１７８４４４、Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）由来の遺伝子によりコードされるもの、ならびにそれらの変異体及び／または突然変異体が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アセチレナーゼ」または「脂肪酸アセチレナーゼ」という用語は、三重結合を脂肪酸に導入し、アセチレン脂肪酸の産生をもたらす酵素を指す。好ましい実施形態では、三重結合はＣ１８脂肪酸鎖の２、６、１２及び／または１７番目の炭素に導入される。アセチレナーゼの例としては、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ＡＡ０３８０３２、ＡＢＣ５９６８４）由来のもの、ならびにその変異体及び／または突然変異体が挙げられる。
このような脂肪酸修飾遺伝子の例としては、以下のアクセッション番号に従う、推定機能によりグループ化されたタンパク質、及び他種由来のホモログが挙げられる：Δ１２アセチレナーゼＡＢＣ００７６９、ＣＡＡ７６１５８、ＡＡＯ３８０３６、ＡＡＯ３８０３２；Δ１２コンジュガーゼＡＡＧ４２２５９、ＡＡＧ４２２６０、ＡＡＮ８７５７４；Δ１２デサチュラーゼＰ４６３１３、ＡＢＳ１８７１６、ＡＡＳ５７５７７、ＡＡＬ６１８２５、ＡＡＦ０４０９３、ＡＡＦ０４０９４；Δ１２エポキシゲナーゼＸＰ＿００１８４０１２７、ＣＡＡ７６１５６、ＡＡＲ２３８１５；Δ１２ヒドロキシラーゼＡＣＦ３７０７０、ＡＡＣ３２７５５、ＡＢＱ０１４５８、ＡＡＣ４９０１０；及び、Δ１２Ｐ４５０酵素（例えば、ＡＦ４０６７３２）。
サイレンシングサプレッサー
一実施形態では、本発明の組み換え／トランスジェニック細胞は、サイレンシングサプレッサーを含んで良い。
本明細書で使用される場合、「サイレンシングサプレッサー」は、本発明の細胞の導入遺伝子発現を増強する。例えば、サイレンシングサプレッサーの存在により、サイレンシングサプレッサーを欠く、相当する細胞と比較したとき、高レベルのポリペプチド（複数を含む）を産生する本発明の細胞内の外因性ポリヌクレオチド（複数を含む）をもたらす。一実施形態では、サイレンシングサプレッサーは、長さが２１塩基対であるｄｓＲＮＡ分子に、違う長さのｄｓＲＮＡ分子よりも優先的に結合する。これは、少なくともｐ１９型のサイレンシングサプレッサー、すなわちｐ１９及びその機能的なオルソログがもつ特徴である。別の実施形態では、サイレンシングサプレッサーは、平滑末端を有する対応する二重鎖ＲＮＡ分子よりも、突出５´末端を有する二重鎖ＲＮＡ分子と優先的に結合する。これは、Ｖ２型のサイレンシングサプレッサー、すなわちＶ２及びその機能的なオルソログがもつ特徴である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子またはそのプロセッシングされたＲＮＡ産物は、少なくとも１９の連続的ヌクレオチドを含み、好ましくは、二本鎖ヘアピンＲＮＡ分子またはプロセッシングされたＲＮＡ産物の場合に、その長さが１９〜２４の連続対を有する１９〜２４のヌクレオチドであり、より好ましくは、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチドからなる長さであり、また好ましくは標的ＲＮＡ領域の相補体と少なくとも９５％同一であるメチル化ヌクレオチドを含み、かつ該標的ＲＮＡの領域が、ｉ）標的ＲＮＡの５′未翻訳領域内、ｉｉ）標的ＲＮＡの５′ハーフ内、ｉｉｉ）標的ＲＮＡのタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム内、ｉｖ）標的ＲＮＡの３′ハーフ内、またはｖ）標的ＲＮＡの３′未翻訳領域内である。
サイレンシングサプレッサーに関する詳細は、当技術分野において周知であり、ＷＯ２０１３／０９６９９２及びＷＯ２０１３／０９６９９３に記載されている。
ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は同じ意味で使用される。各用語は、長さを問わないポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの両方、またはそのアナログを指す。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成若しくは合成起源、２本鎖若しくは１本鎖のものであっても良く、また、その起源または操作によって、（１）自然界で伴うポリヌクレオチドの全部または一部を伴わない、（２）自然界で連結されるもの以外のポリヌクレオチドに連結する、または（３）自然界で生じない。ポリヌクレオチドの非限定的例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード若しくは非コード領域、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、色素体、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、任意の配列のキメラＤＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用するため、ポリヌクレオチドを標識化成分とのコンジュゲート等によって修飾しても良い。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」とは、その自然状態において会合または連結されたポリヌクレオチド配列から分離されたポリヌクレオチド、または非自然発生的ポリヌクレオチドを意味する。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、その最も広義に解釈すべきであり、構造遺伝子の転写された領域、及び翻訳された場合は、タンパク質コード領域を含み、かつ、５’及び３’のいずれの末端においても少なくとも約２ｋｂの距離にわたって両末端上のコード領域に隣接して位置し、遺伝子の発現に関与する配列を含む、デオキシリボヌクレオチド配列を含む。この点に関して、遺伝子は、所与の遺伝子と自然に関連するプロモーター、エンハンサー、終結及び／またはポリアデニル化シグナル等の制御シグナル、または異種制御シグナルを含み、その場合、遺伝子は「キメラ遺伝子」と称される。タンパク質コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。タンパク質コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡ形態及びゲノム形態双方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と称される非コード配列で中断され得るコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｎＲＮＡ）の中に転写される、遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサー等の調節要素を含んでも良い。イントロンは、核転写物または一次転写物から除去または「スプライス除去」される。したがってイントロンは、ｍＲＮＡ転写物中には存在しない。少なくとも１つのイントロンを含む遺伝子は、可変的スプライシングを施される場合があり、単一の転写遺伝子から選択的ｍＲＮＡが生じ、その結果ポリペプチド変異体をもたらす。その自然状態の遺伝子またはキメラ遺伝子は、イントロンを欠く場合がある。ｍＲＮＡは、翻訳中に機能し、新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を指定する。「遺伝子」という用語は、本明細書に記載する本発明のタンパク質のすべてまたは一部をコードする合成分子または融合分子、及び上記のいずれか１つに対する相補的なヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用される場合、「キメラＤＮＡ」は、自然界では自然に見出されないあらゆるＤＮＡ分子を指し、本明細書では「ＤＮＡ構築物」または「遺伝子構築物」とも称される。典型的には、キメラＤＮＡは、自然界では一緒に自然に見出されない調節配列及び転写配列またはタンパク質コード配列を含む。したがって、キメラＤＮＡは、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然界で見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含むことができる。オープンリーディングフレームは、その自然の上流及び下流の調節要素に連結されても良く、または連結されなくても良い。オープンリーディングフレームは、例えば、植物ゲノムの中、非自然的な場所、または細菌プラスミド若しくはウイルスベクター等の自然に見出されないレプリコン若しくはベクターに組み込まれ得る。「キメラＤＮＡ」という用語は、宿主内に複製可能であるＤＮＡ分子に限定されず、例えば特異的アダプター配列によってレプリコンの中に連結することができるＤＮＡを含む。
「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノムの中に導入された遺伝子である。本用語には、それらの先祖細胞のゲノム内に導入された、子孫細胞、植物、種子、非ヒト生物若しくはその一部中の遺伝子が含まれる。そのような子孫細胞等は、初代形質転換細胞の先祖細胞から、または先祖トランスジェニック植物（本明細書でＴ０植物と称する）から、少なくとも３世代または４世代後の子孫細胞であって良い。子孫細胞は、有性生殖または植物生育（例えば、ジャガイモの塊茎またはサトウキビの新芽等）により産生されても良い。「遺伝的に改変された」、「遺伝子改変」という用語、及びその変化形は、形質転換または形質導入によって遺伝子を細胞の中に導入することと、細胞中の遺伝子を変異させることと、細胞中の遺伝子、若しくは上記のように改変される任意の細胞の子孫細胞の調節を遺伝子的に変化または調整することとを含む、広義の用語である。
本明細書で使用される場合、「ゲノム領域」は、導入遺伝子または導入遺伝子群（本明細書では、クラスターとも称する）が細胞またはその先代に挿入されたゲノム内の位置を指す。このような領域は、本明細書に記載する方法等により、人の介入によって組み込まれたヌクレオチドのみを含む。
本発明の「組み換えポリヌクレオチド」は、人工組み換え方法によって構成または改変された、核酸分子を指す。組み換えポリヌクレオチドは、その自然状態と比較して、（例えば、ｍＲＮＡの場合）変化した量で細胞中に存在し得るか、または変化した速度で発現し得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、自然にはそのポリヌクレオチドを含まない細胞の中に導入される。典型的に、外因性ＤＮＡがｍＲＮＡの転写のためのテンプレートとして使用され、次いで、形質転換される細胞内に本発明のポリペプチドをコードするアミノ酸残基の連続配列に翻訳される。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性であり、その発現は、組み換え手段によって変化させられる。例えば、外因性制御配列を、目的とする内因性遺伝子の上流に導入し、形質転換された細胞が、遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現できるようにする、あるいはＺＦＮ、ＴａｌｅｎまたはＣＲＩＳＰＲ方法によって目的遺伝子に欠失を形成させる。
本発明の組み換えポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが存在している、細胞に基づくまたは細胞を含まない発現系の他の成分から分離されていないポリヌクレオチド、及び前記細胞に基づく、または細胞を含まない発現系に生成され、その後に少なくとも一部の他成分を除去して精製されたポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、隣接する一続きのヌクレオチドとすることができ、または単一のポリヌクレオチドを形成するように接合した異なる源（自然発生的及び／または合成的なもの）に由来する２つ以上の隣接する一続きのヌクレオチドを含むことができる。典型的に、このようなキメラポリヌクレオチドは、目的とする細胞中のオープンリーディングフレームの転写を駆動するのに好適なプロモーターに作動可能に連結される本発明のポリペプチドをコードする、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む。
定義されたポリヌクレオチドに関して、上記に示されたものよりも高い同一性％の値が、好ましい実施形態に包含されることが理解されるであろう。したがって、該当する場合、最小の同一性％の値に照らして、ポリヌクレオチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましく少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指定された配列番号と同一である、ポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドまたは本発明に有用なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、本明細書で定義されるポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズさせても良い。本明細書で使用される場合、ストリンジェントな条件とは、（１）ハイブリダイズ時に、ホルムアミド等の変性剤を用いること、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドに、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、７５０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを添加し４２℃で用いること、または（２）０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、４２℃で、５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａｃｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト溶液、超音波振動処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍＬ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストランを用いること、及び／または（３）洗浄のために低イオン強度で高温を用いること、例えば、５０℃で０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のＳＤＳを用いること、である。
本発明のポリヌクレオチドは、自然発生的な分子と比較したとき、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換である、１つ以上の変異を保有し得る。参照配列に対して変異を有するポリヌクレオチドは、自然発生的なもの（すなわち、天然源から単離したもの）、または（例えば、上述のように、部位特異的変異誘発またはＤＮＡシャッフリングを行うことによって）合成したものとすることができる。
遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチド
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子の発現を特異的に抑制するのに特に有用であり、遺伝子がタンパク質をコードする場合は、特定のタンパク質の産生を抑制する。理論に束縛されるものではないが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）により、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を用いてタンパク質産生を抑制できる機構モデルが提唱されている。この技術は、目的遺伝子またはその一部のｍＲＮＡと本質的に同一である配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在を利用する。好都合にも、ｄｓＲＮＡは、組み換えベクターまたは宿主細胞中で単一プロモーターから産生することができ、センス配列とアンチセンス配列の間に関連のない配列が隣接することにより、センス配列とアンチセンス配列をハイブリダイズさせ、ループ構造を形成する非関連配列を有するｄｓＲＮＡ分子を形成することができる。好適なｄｓＲＮＡ分子の設計及び製造は、具体的には、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２０００）、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９及びＷＯ０１／３４８１５を考慮して、当業者が十分達成し得る範囲である。
１つの例として、非活性化する標的遺伝子、例えば、ＳＤＰ１、ＴＧＤ、色素体ＧＰＡＴ、色素体ＬＰＡＡＴ、色素体ＰＡＰ、ＡＧＰａｓｅ遺伝子等に対して相同性を有する、少なくとも部分的に二重鎖のＲＮＡ産物（複数を含む）の合成を誘導するＤＮＡが導入される。したがって、このＤＮＡは、ＲＮＡに転写される際、ハイブリダイズされて二重鎖ＲＮＡ領域を形成することができるセンス配列とアンチセンス配列の両方を含む。本発明の一実施形態では、センス配列とアンチセンス配列は、ＲＮＡに転写された際に、スプライス除去されるイントロンを含むスペーサー領域により分離されている。この配置によって、より高効率で遺伝子サイレンシングが起こることが示されている（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。二重鎖領域は、１つのＤＮＡ領域または２つのＤＮＡ領域のいずれかから転写される、１つまたは２つのＲＮＡ分子を含有し得る。二重鎖分子の存在によって、二重鎖ＲＮＡ及び、標的遺伝子からの相同ＲＮＡ転写物の両方を破壊する内因性システムからの応答が引き起こされ、標的遺伝子の活性が効率的に抑制または除去されると考えられている。
ハイブリダイズするセンス配列及びアンチセンス配列の長さは、各々少なくとも１９の連続的ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０の連続的ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００または少なくとも２００の連続的ヌクレオチドでなければならない。一般的に、標的遺伝子ｍＲＮＡの領域に対応する１００〜１０００ヌクレオチドの配列が使用される。遺伝子転写物全体に対応する全長配列を使用しても良い。標的転写物に対するセンス配列の同一性（したがって、標的転写物の相補体に対するアンチセンス配列の同一性も同様）の程度は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または９５〜１００％でなければならない。ＲＮＡ分子は、もちろん、分子の安定化のために機能し得る非関連配列を含有してもよい。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で、発現されても良い。後者の例としては、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡプロモーターが挙げられる。
好ましい低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２５の連続的ヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡから始まり、ＧＣ含有量が約３０〜７０％（好ましくは、３０〜６０％、より好ましくは４０〜６０％、及びより好ましくは約４５〜５５％）であり、また、導入される生物のゲノム中の標的以外のいずれかのヌクレオチド配列と高い同一性パーセンテージ（例えば標準的なＢＬＡＳＴ検索により決定される）を有しない。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（略語ｍｉＲＮＡ）は一般に、不完全なステムループ構造を形成する大きな前駆体から誘導される、１９〜２５ヌクレオチド（通常、植物においては約２０〜２４ヌクレオチド）の非コーディングＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補的な配列に結合し、通常、翻訳の抑制または標的の分解及び遺伝子サイレンシングをもたらす。人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、当技術分野において周知のように、天然ｍｉＲＮＡに基づいて設計し、目的とする任意の遺伝子の発現を抑制することができる。
植物細胞において、ｍｉＲＮＡ前駆体分子は、核内で大部分がプロセッシングされると考えられている。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（１つ以上の局所的な二重鎖または「ヘアピン」領域、ならびに通常のｍＲＮＡの５´「キャップ」及びポリアデニル化テールを含有）は、プロセッシングされて、ステムループ構造または折り畳み構造をまた含有する、より短いｍｉＲＮＡ前駆体分子となり、これは「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」と称される。植物において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、独特なＤＩＣＥＲ様（ＤＣＬ）酵素により開裂され、ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖を産生する。核から外に輸送される前に、これらの二本鎖はメチル化される。
細胞質において、ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ二本鎖由来のｍｉＲＮＡ鎖は、標的認識のために、選択的に、活性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと組み込まれる。ＲＩＳＣ複合体は、配列特異的遺伝子抑制を行うＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の特定のサブセットを含む（例えば、Ｍｉｌｌａｒ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，２００５；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｌｍｅｉｄａ ａｎｄ Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００５を参照）。
共抑制
遺伝子は、関連内因性遺伝子及び／またはゲノム中に既に存在している導入遺伝子の発現を抑制することができ、その現象は、相同性依存遺伝子サイレンシングと称される。
相同性依存遺伝子サイレンシングの事例のほとんどは、２つに分類され、１つは導入遺伝子の転写レベルで機能するものであり、もう１つは転写後に作動するものである。
転写後の相同性依存遺伝子サイレンシング（すなわち、共抑制）により、トランスジェニック植物における、導入遺伝子及び関連内因性遺伝子またはウイルス性遺伝子の発現の消失が説明される。共抑制は多くの場合（常ではない）、導入遺伝子の転写物が豊富にある場合に発生し、一般にｍＲＮＡプロセッシングのレベル、局在及び／または分解で引き起こされると考えられている。どのように共抑制が機能するかを説明するモデルがいくつか存在する（Ｔａｙｌｏｒ，１９９７を参照）。
共抑制は、その発現用プロモーターに対してセンス方向での、過剰な遺伝子のコピーまたはそれらの断片の植物内への導入に関与する。センス断片のサイズ、標的遺伝子領域との相関性、及び標的遺伝子に対する配列同一性の程度は、当業者によって決定することができる。一部の例では、遺伝子配列の付加的なコピーは、標的植物遺伝子の発現を妨げる。共抑制法を実施する方法に関しては、ＷＯ９７／２０９３６及びＥＰ０４６５５７２を参照されたい。
アンチセンスポリヌクレオチド
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、内因性ポリペプチドをコードする特定のｍＲＮＡと少なくとも一部に対して相補的であり、ｍＲＮＡ翻訳等の転写後事象を阻害することができるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味すると理解すべきである。アンチセンス法の使用は、当技術分野において周知である（例えば、Ｇ．Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｅｎｄｒｅｓ，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９）を参照）。植物におけるアンチセンス技法の使用は、Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５）及びＳｅｎｉｏｒ（１９９８）により概説されている。Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５）は、植物系での遺伝子不活化の方法としてアンチセンス配列をいかに利用するかについて、数多くの例を挙げている。Ｂｏｕｒｑｕｅはまた、部分阻害は、ほぼ確実に系内に測定可能な変化をもたらすため、必ずしもいずれかの酵素活性の阻害を１００％達成する必要はない場合があると述べている。Ｓｅｎｉｏｒ（１９９８）は、アンチセンス法は、現時点で非常によく確立された、遺伝子発現操作のための技術であることを述べている。
一実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドは、生理学的条件下でハイブリダイズする、すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド（完全一本鎖または部分一本鎖である）は、少なくとも、細胞中の通常の条件下で内因性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（例えば、ＳＤＰ１、ＴＧＤ、色素体ＧＰＡＴ、色素体ＬＰＡＡＴ、色素体ＰＡＰまたはＡＧＰａｓｅのｍＲＮＡ）と二重鎖ポリヌクレオチドを形成することができる。
アンチセンス分子は、構造遺伝子に対応する配列、または遺伝子発現若しくはスプライシング事象に対する制御を有効にする配列を含んでいても良い。例えば、アンチセンス配列は、内因性遺伝子の標的コード領域、すなわち５´非翻訳領域（ＵＴＲ）若しくは３´−ＵＴＲまたはこれらの組み合わせに対応し得る。アンチセンス配列は、転写中、または転写後にスプライス除去され得るイントロン配列に対して、部分的に相補的であっても良く、好ましくは標的遺伝子のエキソン配列にのみ相補的であって良い。一般にＵＴＲの多様性が高いことを考慮すると、この領域を標的とすることにより、遺伝子阻害の特異性が高められる。
アンチセンス配列の長さは、少なくとも１９の連続的ヌクレオチドでなければならず、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドである。遺伝子転写物全体に対して相補的な全長配列を用いても良い。長さは、最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％でなければならず、より好ましくは９５〜１００％である。アンチセンスＲＮＡ分子は、もちろん、分子の安定化のために機能し得る非関連配列を含有しても良い。
組み換えベクター
本発明の一実施形態は、組み換えベクターを含み、該組み換えベクターは、本明細書で定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる。組み換えベクターとしては、発現ベクターが挙げられる。組み換えベクターは、非相同のポリヌクレオチド配列、すなわち、自然には見出されず、本明細書で定義されるポリヌクレオチドに隣接し、好ましくは、異なる種に由来するポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、典型的にはウイルスに由来するウイルスベクター、またはプラスミドであるプラスミドベクターとしては、典型的に、原核生物細胞での発現カセットの容易な選択、増幅及び形質転換を提供する付加的な核酸配列、例えばｐＵＣ由来のベクター、ｐＧＥＭ由来のベクターまたは１つ以上のＴ−ＤＮＡ領域を含むバイナリーベクターが挙げられる。付加的な核酸配列は、ベクターの自律複製を提供する複製起点、選択マーカー遺伝子（好ましくは、抗生物質耐性または除草剤耐性をコードする遺伝子）、核酸構築物中のコードされた核酸配列または遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する固有の多重クローニング部位、ならびに原核細胞及び真核細胞（特に植物）の形質転換を増強する配列を含む。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」とは、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、転写配列に対する転写調節要素（プロモーター）の機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、適切な細胞においてコード配列の転写を刺激または調節する場合に、本明細書で定義されるポリヌクレオチドのコード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されるプロモーター転写調節要素は、転写配列に物理的に隣接する。すなわち、それらは、シス作用性である。しかしながら、エンハンサー等のいくつかの転写調節要素は、その転写を増強するコード配列に物理的に隣接する、または極めて近接して位置する必要がない。
複数のプロモーターが存在するとき、各プロモーターは独立して同一であってもまたは異なっていても良い。
組み換えベクターはまた、本明細書で定義する発現されるポリペプチドを細胞内の小胞体（ＥＲ）に保持できるようにする、または色素体へと移送する１つ以上のシグナルペプチド配列を含み、及び／または融合タンパク質としての核酸分子の発現を誘導する融合配列を含む。好適なシグナルセグメントの例としては、本明細書で定義されるポリペプチドの分泌または局在化を指令することができる、任意のシグナルセグメントが挙げられる。
形質転換体の特定を容易にするために、組み換えベクターは、望ましくは、選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。「マーカー遺伝子」とは、そのマーカー遺伝子を発現する細胞に特異な表現型を与え、それにより該マーカーを有しない細胞と、このような形質転換細胞とを区別することを可能にする遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子は、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質）に対する耐性に基づいて「選択」できる形質を与える。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通して、すなわち「スクリーニング」によって特定することができる形質（例えば、非形質転換細胞中に存在しない、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、または他の酵素活性）を与える。植物の形質転換体を選択するための例示的な選択マーカーとしては、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；カナマイシン、パロモマイシンに対する耐性を与える、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子；例えばＥＰ２５６２２３に記載されているような、グルタチオン由来の除草剤に対する耐性を与える、ラット肝臓由来のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子；例えばＷＯ８７／０５３２７に記載されているような、過剰発現に応じてホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤に対する耐性を与える、グルタミンシンテターゼ遺伝子；例えばＥＰ２７５９５７に記載されているような、選択剤ホスフィノトリシンに対する耐性を与える、ストレプトマイセス・ヴィリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子；例えばＨｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）により記載されているようなＮ−ホスホノメチルグリシンに対する耐性を与える、５−エノルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子；例えばＷＯ９１／０２０７１に記載されているような、ビアラホスに対する耐性を与えるｂａｒ遺伝子；ブロモキシニルに対する耐性を与える、クレブシーラ・オザエナエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ）由来のｂｘｎ等（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）のニトリラーゼ遺伝子；メトトレキサートに対する耐性を与える、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）；イミダゾリノン、スルホニル尿素、またはその他のＡＬＳ阻害化学薬品に対する耐性を与える、変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（ＥＰ１５４，２０４）；５−メチルトリプトファンに対する耐性を与える、変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子；または除草剤に対する耐性を与える、ダラポンデハロゲナーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、組み換えベクターは、植物細胞等の細胞のゲノムの中に安定的に組み込まれる。したがって、組み換えベクターは、ベクターをゲノムに組み込むこと、または細胞の染色体に組み込むことを可能にする、適切な要素を含んでも良い。
発現ベクター
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換すること、及び１個以上の特定のポリヌクレオチドの発現を生じさせることができる、ＤＮＡベクターである。本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点等の調節配列、及び宿主細胞と適合性があり、かつ本発明のポリヌクレオチドの発現を制御する他の調節配列を含む。特に、本発明の発現ベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列等の、転写開始を制御するものである。使用する調節配列の選択は、目的とする植物及び／または標的器官若しくは組織等の標的生物に応じて異なる。このような調節配列は、植物若しくは植物ウイルス等の任意の真核生物から得ても良く、または化学的に合成しても良い。植物細胞の安定したトランスフェクションまたはトランスジェニック植物の確立に好適な数多くのベクターが、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５，ｓｕｐｐ．１９８７、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、及びＧｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９０に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’及び３’調節配列の転写制御下の１つ以上のクローン化した植物遺伝子、ならびに優性選択マーカーを含む。ポリアデニル化このような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘発性若しくは構成的、環境的若しくは発生的調節、または細胞若しくは組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、転写終結部位、及び／またはポリアデニル化シグナルも含むことができる。
植物細胞において活性である、多くの構成的プロモーターが記載されている。植物での構成的発現に好適なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、リブロース−１，５−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）由来の光誘発性プロモーター、イネサイトゾル型トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼ及びオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、ならびにクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、植物に発現させるＤＮＡベクターを作成するために使用されている（例えば、ＷＯ８４／０２９１３を参照）。これらのプロモーターはすべて、種々の型の植物発現可能な組み換えＤＮＡベクターを作成するために使用されている。
植物の源組織（例えば、葉、種子、根または茎）での発現を目的として、本発明で利用されるプロモーターは、これらの特異的組織において比較的高い発現を有することが好ましい。この目的のために、遺伝子に応じて数多くのプロモーターから選択し、組織若しくは細胞に特異的な発現、または組織若しくは細胞で増強された発現を得ることができる。文献で報告されているこのようなプロモーターの例としては、エンドウ由来の葉緑体グルタミンシンテターゼＧＳ２プロモーター、コムギ由来の葉緑体フルクトース−１，６−ビスホスファターゼプロモーター、ジャガイモ由来の核光合成ＳＴ−ＬＳ１プロモーター、セリン／スレオニンキナーゼプロモーター、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のグルコアミラーゼ（ＣＨＳ）プロモーターが挙げられる。また、アメリカカラマツ（Ｌａｒｉｘ ｌａｒｉｃｉｎａ）由来のリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーター、マツ由来のＣａｂ遺伝子（Ｃａｂ６）に対するプロモーター、コムギ由来のＣａｂ−１遺伝子に対するプロモーター、ホウレンソウ由来のＣａｂ−１遺伝子に対するプロモーター、イネ由来のＣａｂ１Ｒ遺伝子に対するプロモーター、Ｚｅａ ｍａｙｓ由来のピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、タバコＬｈｃｂ１＊２遺伝子に対するプロモーター、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＳｕｃ２スクロース−Ｈ３０共輸送体プロモーター、及びホウレンソウ由来のチラコイド膜タンパク質遺伝子（ＰｓａＤ、ＰｓａＦ、ＰｓａＥ、ＰＣ、ＦＮＲ、ＡｔｐＣ、ＡｔｐＤ、Ｃａｂ、ＲｂｃＳ）に対するプロモーターも、光合成活性組織において活性であることが報告されている。また、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ）由来のＬｈｃＢ遺伝子及びＰｓｂＰ遺伝子に対するプロモーター等の、クロロフィルα／β結合タンパク質に対する他のプロモーターを、本発明で利用してもよい。
植物細胞におけるＲＮＡ結合タンパク質遺伝子の発現には、（１）熱、（２）光（例えば、エンドウのＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、トウモロコシのＲｂｃＳプロモーター）、（３）ホルモン（アブシジン酸等）、（４）損傷（例えば、ＷｕｎＩ）、または（５）化学薬品（ジャスモン酸メチル、サリチル酸、ステロイドホルモン、アルコール、Ｓａｆｅｎｅｒｓ（ＷＯ９７／０６２６９）によって調節されるプロモーターを含めた、環境、ホルモン、化学、及び／または成長シグナルに応答して調節される、種々の植物遺伝子プロモーターも使用することができ、または（６）器官特異的プロモーターを使用することも有益であり得る。
本明細書で使用される場合、「植物貯蔵器官特異的プロモーター」という用語は、他の植物組織と比較したときに、植物の貯蔵器官における遺伝子転写を選択的に指令するプロモーターを指す。ジャガイモ植物の塊茎、トマトの実、またはダイズ、カノーラ、ワタ、Ｚｅａ ｍａｙｓ、コムギ、イネ及びオオムギの種子等の植物のシンク組織での発現を目的として、本発明で利用されるプロモーターは、これらの特異的組織において比較的高い発現を有することが好ましい。β−コングリシニンに対するプロモーター、またはナピン、ゼイン、リニン、及びファゼオリンプロモーター等の他の種子特異的プロモーターを使用することができる。根特異的プロモーターを使用しても良い。このようなプロモーターの一例は、酸キチナーゼ遺伝子に対するプロモーターである。根組織における発現は、特定されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの根特異的サブドメインを利用することによって達成することも可能である。
特に好ましい実施形態において、プロモーターは、脂質生合成が行われる組織及び器官における発現を指令する。このようなプロモーターは、種子内の脂質組成物を改変するのに好適な種子成長期の時点で作用させても良い。種子特異的発現に好適なプロモーターとしては、１）デサチュラーゼ及びエロンガーゼ等の、種子での脂質生合成及び蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーター、２）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに３）種子での炭水化物生合成及び蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。好適である種子特異的プロモーターは、セイヨウアブラナのナピン遺伝子プロモーター（ＵＳ５，６０８，１５２）、ソラマメのＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、シロイヌナズナのオレオシンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、インゲンマメのファゼオリンプロモーター（ＵＳ５，５０４，２００）、アブラナ属のＢｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）、またはレグミンＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、及びトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネ等の単子葉植物において種子特異的発現を誘導するプロモーターである。好適である注目すべきプロモーターは、オオムギｌｐｔ２若しくはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（ＷＯ９５／１５３８９及びＷＯ９５／２３２３０）またはＷＯ９９／１６８９０に記載のプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、モロコシカジリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝子に由来するプロモーター）である。他のプロモーターとして、Ｂｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，（２００４）、ＵＳ２００７０１９２９０２及びＵＳ２００３０１５９１７３に記載のものが挙げられる。一実施形態では、種子特異的プロモーターは、子葉（複数を含む）または内胚乳等の種子の所定の部分で選択的に発現する。子葉特異的プロモーターの例として、ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、エンドウレグミンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、及びマメフィトヘマグルトニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｎｉｎ）プロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。内胚乳特異的プロモーターの例として、トウモロコシゼイン−１プロモーター（Ｃｈｉｋｗａｍｂａ ｅｔ ａｌ．，２００３）、イネグルテリン−１プロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）、オオムギＤ−ホルデインプロモーター（Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）、及びコムギＨＭＷグルテニンプロモーター（Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。更なる実施形態では、種子特異的プロモーターは、胚芽内及び／または種子の発芽後に発現しないか、または低レベルでしか発現しない。
別の実施形態では、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、果実特異的プロモーターである。例としては、トマトポリガラクツロナーゼ、Ｅ８及びＰｄｓプロモーター、ならびにリンゴＡＣＣオキシダーゼプロモーター（概要については、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，２００４を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、プロモーターは、果実の表皮または果実内の種子と比較して、果実の可食部、例えば果実の中果皮での発現を選択的に指令する。
一実施形態では、誘導性プロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのａｌｃ系である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのａｌｃ系の代わりに用いることができる誘導性発現系の例は、Ｐａｄｉｄａｍ（２００３）ならびにＣｏｒｒａｄｏ ａｎｄ びＫａｒａｌｉ（２００９）によるレビューに記載されている。別の実施形態では、誘導性プロモーターは、例えば、トウモロコシのｌｎ２−１またはｌｎ２−２プロモーター（Ｈｅｒｓｈｅｙ及びＳｔｏｎｅｒ，１９９１）等の解毒剤誘導性プロモーターがあり、該解毒剤誘導性プロモーターは、トウモロコシのＧＳＴ−２７プロモーター（Ｊｅｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）またはダイズのＧＨ２／４プロモーター（Ｕｌｍａｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９５）である。
別の実施形態では、誘導性プロモーターは、老化誘導性プロモーター、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の老化誘導性プロモーターＳＡＧ（老化関連遺伝子）１２及びＳＡＧ１３（Ｇａｎ，１９９５；Ｇａｎ ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ，１９９５）、ならびにＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のＬＳＣ５４（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，１９９４）等である。このようなプロモーターは、植物組織（特に葉）の老化開始に関して発現の増加を示す。
生育組織での発現のために、葉特異的プロモーター（例えば、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター等）を用いることができる。例えば、トマトのＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２及びＲＢＣＳ３Ａ遺伝子は、葉及び光生長苗（Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）で発現される。Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）により記載された、葉身及び葉鞘の葉肉細胞中で、ほぼ独占的に高レベルで発現されるリブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターを用いることができる。他の葉特異的プロモーターは、集光性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター（Ｓｈｉｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７を参照）である。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．
（１９９６）により記載されているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）は、葉に特異的である。Ａｔｍｙｂ５プロモーターは、若いロゼット及び茎葉の縁上にある成長期の葉トリコーム、托葉及び外皮細胞で、ならびに未成熟な種子で発現する。Ｂｕｓｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）により、トウモロコシで同定された葉プロモーターもまた使用することができる。
いくつかの例において、例えば、ＬＥＣ２またはＢＢＭが組み換え発現される場合に、導入遺伝子が高レベルで発現されないことが望ましい場合がある。このような状況で使用できるプロモーターの例は、種子特異的発現パターンは保持しているが、発現レベルは減少している、トランケート型ナピン（ｎａｐｉｎ）Ａプロモーターである（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
５’非翻訳リーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドの異種遺伝子配列を発現するように選択されるプロモーターから誘導することができ、または産生すべき酵素のコード領域に対して非相同であっても良く、及び所望であれば、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるように特異的に改変することができる。導入遺伝子発現の最適化に関する概説については、Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照されたい。また、５’非翻訳領域は、植物ウイルスＲＮＡ（とりわけ、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、好適な真核細胞遺伝子、植物遺伝子（コムギ及びトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列から得ることもできる。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列を伴う５′非翻訳配列に由来する構築物に限定されない。リーダー配列はまた、無関係なプロモーターまたはコード配列にも由来し得る。本発明に関連して有用なリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０リーダー（ＵＳ５，３６２，８６５及びＵＳ５，８５９，３４７）及びＴＭＶオメガエレメントを含む。
転写の終結は、発現ベクターにおいて目的ポリヌクレオチドと作動可能に連結される３′非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組み換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、アデニル化ヌクレオチドをＲＮＡの３’末端に付加させるように植物中で機能する、ポリアデニル化シグナルを含む。３’非翻訳領域は、植物細胞で発現する種々の遺伝子から得ることができる。一般に、ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウ小サブユニットのＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子由来の３’非翻訳領域、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子由来の３’非翻訳領域をこの機能に使用することができる。また、アグロバクテリウム腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む、３’転写非翻訳領域も好適である。
組み換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、得られた転写物を宿主細胞種に応じたコドン最適化により翻訳する効率、または転写物を不安定化する配列の欠失、及び翻訳後修飾の効率を操作することにより、形質転換ポリヌクレオチドの発現を改善することができる。
転移核酸
転移核酸は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用することができ、１つ、好ましくは２つの境界配列と、１つ以上の目的ポリヌクレオチドとを含む。転移核酸は、選択マーカーをコードしても良く、またはコードしなくても良い。好ましくは、転移核酸は、細菌中でバイナリーベクターの一部を形成し、該バイナリーベクターは、細菌中でのベクターの複製を可能にするか、またはバイナリーベクターを含む細菌細胞の選択若しくは持続を可能にする要素を更に含む。真核細胞へ転移すると、バイナリーベクターの転移核酸成分は、真核細胞へのゲノムの組み込み、あるいは一過性発現実験では、細胞内での発現のみが可能である。
本明細書で使用される場合、「染色体外転移核酸」という用語は、アグロバクテリウム種等の細菌から植物の葉細胞等の真核細胞に転移させることができる核酸分子を指す。染色体外転移核酸は、転移された後に、その境界内に含まれるヌクレオチド配列をレシピエント細胞のゲノムに統合することが可能な要素として周知されている遺伝的要素である。この点で、転移核酸は、典型的に２つの「境界」配列と両端を接するが、場合によっては単一の境界を一方の末端で使用することができ、転移させた核酸の第２の末端は転移過程でランダムに生成される。目的ポリヌクレオチドは、典型的に転移核酸の左境界様配列と右境界様配列との間に位置する。転移核酸内に含まれるポリヌクレオチドは、その発現、すなわち、ポリヌクレオチドの転写及び／または翻訳を容易にする様々な異なるプロモーター及びターミネーター調節要素に作動可能に連結されても良い。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ等のアグロバクテリウム種に由来する転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）及びその人工の変異体／突然変異体は、おそらく転移核酸の特徴を最も有している例である。別の例は、植物に由来するＴ−ＤＮＡ境界様配列を含む、Ｐ−ＤＮＡ（「植物ＤＮＡ」）である。
本明細書で使用される場合、「Ｔ−ＤＮＡ」は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ若しくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡ、または植物細胞へのＤＮＡの転移の際に機能するその変異体を指す。Ｔ−ＤＮＡは、右境界配列及び左境界配列の両方を含むＴ−ＤＮＡ全体を含み得るが、転移のためには、シスに必要とされる最小の配列、すなわち、Ｔ−ＤＮＡ右境界配列のみを含んでいれば良い。本発明のＴ−ＤＮＡは、（存在する場合）右境界配列及び左境界配列の間のどこかで、目的ポリヌクレオチドをそれらに挿入している。ｖｉｒ遺伝子等のＴ−ＤＮＡを植物細胞中に転移させるために、トランスに必要とされる因子をコードする配列は、Ｔ−ＤＮＡ中に挿入されても良く、またはＴ−ＤＮＡと同じレプリコン上に存在しても良く、または好ましくはアグロバクテリウム宿主の適合性レプリコン上のトランスに存在する。このような「バイナリーベクター系」は、当技術分野において周知である。本明細書で使用される場合、「Ｐ−ＤＮＡ」は、植物ゲノムから単離された転移核酸またはその人工の変異体／突然変異体を指し、及び各末端に、または一方の末端のみにＴ−ＤＮＡ境界様配列を含む。
本明細書で使用される場合、転移核酸の「境界」配列は、植物若しくは細菌等の選択した生物から単離することができ、またはその人工の変異体／突然変異体であり得る。境界配列は、それが連結するポリヌクレオチドの転写を増強して促進し、レシピエント細胞ゲノム内へのその組込みを容易にし得る。一実施形態では、境界配列は１０〜８０ｂｐの長さである。アグロバクテリウム種由来のＴ−ＤＮＡからの境界配列は当技術分野において周知であり、Ｌａｃｒｏｉｘ ｅｔ ａｌ．（２００８）に記載されているものを含む。
従来、遺伝子を植物細胞に転移させるためにアグロバクテリウム種のみが使用されてきたが、現在、アグロバクテリウム種と類似の方法で作用する数多くの系が特定／開発されている。近年、いくつかの非アグロバクテリウム種が、遺伝子転移に対してコンピテントになるように遺伝的に改変されている（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。このような種として、リゾビウム種ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）及びメゾリゾビウム・ロティ（Ｍｅｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）が挙げられる。
細菌から真核生物宿主への真核型発現プラスミドの直接転移は、哺乳類細胞とプラスミド担持大腸菌のプロトプラストとの融合によって、数十年前に初めて達成された（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，１９８０）。それ以後、４つのグループ（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｄａｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）によって個々に発見され、遺伝子を哺乳類細胞中に送達できる細菌の数は、着実に増加している（Ｗｅｉｓｓ，２００３）。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」、「形質転換」という用語及びそれらの変形は一般に、同じ意味で使用される。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」細胞は、目的ポリヌクレオチド（複数を含む）を導入するように操作されていても良く、またはそれに由来する子孫細胞であっても良い。
組み換え細胞
本発明はまた、本明細書で定義される１つ以上のポリヌクレオチド若しくはベクター、またはその組み合わせを用いて形質転換される宿主細胞である、組み換え細胞、例えば、組み換え植物細胞または真菌細胞も提供する。本発明の好適な細胞としては、本明細書に記載するＲＮＡ、ポリペプチドまたは酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドまたは組み換えベクターで形質転換することができる、あらゆる細胞が挙げられる。細胞は、それによって脂質の産生に使用できる細胞である。組み換え細胞は、培養物中の細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞、または例えば植物等の生物中の細胞、または例えば種子若しくは葉等の器官中の細胞であっても良い。好ましくは、細胞は植物中にあり、より好ましくは植物の種子中にある。一実施形態では、組み換え細胞は非ヒト細胞である。
ポリヌクレオチド（複数を含む）が導入される宿主細胞は、非形質転換細胞か、または少なくとも１個の核酸で既に形質転換された細胞のいずれかであり得る。このような核酸は、脂質合成に関連していても良く、または関連していなくても良い。本発明の宿主細胞は、本明細書で定義されるポリペプチド（複数を含む）を内因的に（すなわち、自然に）産生でき得る（この場合、それに由来する組み換え細胞は、ポリペプチド（複数を含む）を産生する増強された能力を有する）か、または本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換された後にのみ、前記ポリペプチド（複数を含む）を産生することが可能であり得る。一実施形態では、本発明の組み換え細胞は、ＴＡＧ等の非極性脂質を産生する増強された能力を有する。
本発明の宿主細胞は、本明細書に記載する少なくとも１つのタンパク質を産生できるあらゆる細胞とすることができ、真菌（酵母を含む）、寄生体等の動物、藻類等の植物細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、植物細胞は種子細胞であり、具体的には種子の子葉または内胚乳における細胞である。宿主細胞は、例えばＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたは他の酵母等の、発酵過程に好適な生物であっても良い。一実施形態では、細胞は動物細胞である。動物細胞は、例えば、非ヒト動物細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳類細胞、または魚類若しくは甲殻類等の水生動物、無脊椎動物、昆虫等の細胞等の、あらゆる種類の動物のものであって良い。本発明の宿主細胞として有用な藻細胞の例としては、例えば、クラミドモナス種（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ドナリエラ種、ヘマトコッカス種、クロレラ種、スラウストキトリウム種、シゾキトリウム種、及びボルボックス種が挙げられる。
トランスジェニック植物
本発明はまた、本発明の１つ以上の外因性ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド及び１つ以上の遺伝子改変、本発明の細胞、本発明のベクター、またはこれらの組み合わせを含む植物も提供する。「植物」という用語は、名詞として使用される場合、植物全体を指すが、「その一部」という用語は、植物器官（例えば、葉、茎、根、花、果実）、単一の細胞（例えば、花粉）、種子、種子の部分（例えば、胚、内胚乳、胚盤または種皮等）、脈管組織等の植物組織、植物細胞及びその子孫を指す。本明細書で使用される場合、植物部分は植物細胞を含む。
本明細書で使用される場合、植物に対する改変に関連する、「植物に」及び「その植物に」という用語は、改変が植物全体にわたって生じる場合を含め、改変が少なくとも植物の一部に生じることを意味し、改変が植物の１箇所以上のみで生じるが、全部では生じない場合を除外しない。例えば、それが植物のある一部においてのみ発現し得る場合であっても、組織特異的プロモーターを「植物に」発現させると述べる。これと類似して、「植物での１つ以上の解糖系遺伝子及び／または脂肪酸生合成支配遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチド」は、発現の増加が少なくとも植物の一部に生じることを意味する。
本明細書で使用される場合、「植物」という用語は最も広義に使用され、植物界のあらゆる生物を含む。これには、緑藻のみならず、紅藻及び茶藻も含まれる。これには、開花植物、草、作物若しくは穀物（例えば、油糧種子、トウモロコシ、ダイズ）、飼料若しくは馬草、果実若しくは野菜植物、ハーブ植物、木本植物または樹木のあらゆる種が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、植物を任意の特定の構造に限定することを意味するものではない。また、単細胞植物（例えば、微細藻類）も指す。植物を参照した「その一部」という用語は、植物細胞及びその子孫、複数の植物細胞、植物の成長の任意の段階で存在する構造体、または植物組織を指す。このような構造としては、葉、茎、花、果実、木の実、根、種子、種皮、胚が挙げられるが、これらに限定されない。「植物組織」という用語は、葉、茎、花、果実、木の実、根、種子に存在する、例えば、胚組織、内胚乳、真皮組織（例えば、表皮、周皮）、脈管組織（例えば、木質部、篩部）、または基本組織（柔組織、厚角組織、及び／または厚膜組織細胞を含む）、ならびに培養物中の細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、カルス、胚等）といった、分化した及び分化していない植物の組織を含む。植物組織は、植物体、器官培養物、組織培養物、または細胞培養物中にあっても良い。
本明細書で使用される場合、「生育組織」または「生育植物部分」という用語は、植物の有性生殖のための器官以外のいずれかの植物組織、器官または一部である。植物の有性生殖のための器官とは、具体的に、種子をもつ器官、花、花粉、果物及び種子である。生育組織及び部分は、少なくとも植物の葉、茎（頭部を除く、束及び若芽を含む）、塊茎及び根を含むが、花、花粉、種皮を含む種子、胚及び内胚乳、中果皮組織を含む果実、種子をもつ莢、ならびに種子をもつ頭部を除く。一実施形態では、植物の生育部分は、植物地上部である。別のまたは更なる実施形態では、生育植物部分は、葉または茎等の緑色部分である。
「トランスジェニック植物」またはその変形は、同一種、変種または栽培変種の野生型植物には見られない導入遺伝子を含む植物を指す。本発明に関連して定義されるトランスジェニック植物としては、所望の植物またはその一部において本明細書で定義される少なくとも１つのポリペプチドを産生させるように組み換え技術を使用して遺伝子改変された植物及びその子孫が挙げられる。トランスジェニック植物部分は、類似の意味を有する。
本明細書において、「種子」及び「穀物」という用語は、同じ意味で使用される。「穀物」は、成熟した穀物、例えば、収穫した穀物または依然として植物上にあるが収穫され得る状態にある穀物を指すが、文脈に応じて、吸水または発芽後の穀物を指すこともあり得る。成熟した穀物は、一般的に約１８％未満の含水率を有する。好ましい実施形態では、穀物の含水率は、貯蔵に安全であると一般的に見なされるレベルであり、好ましくは５％〜１５％、６％〜８％、８％〜１０％、または１０％〜１５％である。本明細書で使用される場合、「成長中の種子」は、典型的に、受精または開花後の植物の生殖構造に見られる成熟前の種子を指すが、植物から単離された成熟期前のこのような種子を指すこともあり得る。成熟種子は一般に、約１２％未満の含水率を有する。
本明細書で使用される場合、「植物貯蔵器官」という用語は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質の形態でエネルギーを貯蔵するように特化された植物の一部を指す。植物貯蔵器官の例は、種子、果実、塊状根、及び塊茎である。本発明の好ましい植物貯蔵器官は、種子である。
本明細書で使用される場合、「表現型的に正常」という用語は、未改変の植物またはその一部と比較したときに、生長して繁殖する能力が大幅に低下しない、遺伝子改変された植物またはその一部、例えば、トランスジェニック植物、または本発明の種子、塊茎若しくは果実等の貯蔵器官を指す。好ましくは、バイオマス、生長速度、発芽率、貯蔵器官のサイズ、種子のサイズ、及び／または生成された生存可能な種子の数は、同一条件下で生長させたときに、前記遺伝子改変及び外因性ポリヌクレオチドを欠く植物のバイオマス、生長速度、発芽率、貯蔵器官のサイズ、種子のサイズ、及び／または生成された生存可能な種子の数の９０％を下回ることがない。野生型植物と異なり得るが、例えば芽生え葉のバレリーナ表現型（ｂａｌｌｅｒｉｎａ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）等の、商用目的としての植物の有用性をもたらさない植物の特徴は、この用語に包含しない。一実施形態では、表現型的に正常な遺伝子改変された植物またはその一部は、植物貯蔵器官特異的プロモーターに作動可能に連結されるサイレンシングサプレッサーをコードする組み換えポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドを含まない相当する植物またはその一部と本質的に同等の生長能力または繁殖能力を有する。
植物に関して本明細書で使用される場合、「開花の始まり（ｃｏｍｍｅｎｃｅｍｅｎｔ）」または「開花の開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）」は、植物上で最初の花が開くとき、または開花の開始時を指す。
種子をもつ植物に関して本明細書で使用される場合、「結実」という用語は、植物の最初の種子が成熟に達するときを指す。これは通常、当技術分野で周知である、種子の色
またはその含水量によって観察可能である。
植物全体に関して本明細書で使用される場合、「老化」という用語は、生長が完了した後の植物成長の最終段階、通常は植物が最大の地上部バイオマスまたは高さに達した後を指す。老化は、植物の地上部バイオマスがその最大に達し、量が低下し始めたときに始まり、一般には大部分の植物組織の死によって終わる。この段階中、植物は、生長期間に他の部分に蓄積された細胞成分を、葉及び他の部分から動員して再利用し、その生殖成長を完了する。老化は、一部の遺伝子の新たな、または増加した遺伝子発現を伴う複雑な調節過程である。多くの場合、一部の植物部分が老化している間も、同じ植物の他の部分は生長し続ける。したがって、植物の葉または他の緑色器官に関して、本明細書で使用される場合、「老化」という用語は、葉または器官の葉緑素の量が減少し始めるときを指す。老化には通常、主に老化の最終段階で葉または器官の乾燥を伴う。老化は通常、葉の色が緑色から黄色になり、完全に乾燥したときは最終的に茶色に変化することにより観察可能である。細胞老化が植物及び器官の老化を引き起こすと考えられている。
本発明の実施によって提供される植物、または使用が企図される植物は、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含む。好ましい実施形態では、本発明の植物は、作物植物（例えば、穀類及び豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、イネ、モロコシ、キビ、キャッサバ、オオムギ）またはダイズ、インゲンマメ若しくはエンドウマメ等のマメ科類である。植物は生長して、食用の根、塊茎、葉、茎、花または果実を産生することができる。植物は、生育部分が食物として使用される野菜植物であっても良い。本発明の植物は、以下であっても良い：Ａｃｒｏｃｏｍｉａ ａｃｕｌｅａｔａ（ｍａｃａｕｂａ ｐａｌｍ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｒａｃｉｎｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｍｕｒｕｍｕｒｕ（ｍｕｒｕｍｕｒｕ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（ｔｕｃｕｍａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｇｅｒａｅｎｓｉｓ（Ｉｎｄａｉａ−ｒａｔｅｉｒｏ）、Ａｔｔａｌｅａ ｈｕｍｉｌｉｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｏｉｌ ｐａｌｍ）、Ａｔｔａｌｅａ ｏｌｅｉｆｅｒａ（ａｎｄａｉａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｐｈａｌｅｒａｔａ（ｕｒｉｃｕｒｉ）、Ａｔｔａｌｅａ ｓｐｅｃｉｏｓａ ｂａｂａｓｓｕ）、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（オーツ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．（例えばＢｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（カノーラ）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ（ｆａｌｓｅ ｆｌａｘ）、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ（タイマ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｃａｒｙｏｃａｒ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（ペキー）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ（ココナッツ）、Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ（アビシニアケール）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アフリカヤシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ワタ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ））、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（フィジックナッツ）、Ｊｏａｎｎｅｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ（ａｒａｒａ ｎｕｔ−ｔｒｅｅ）、Ｌｅｍｎａ ｓｐ．（ウキクサ）（例えば、Ｌｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｌｅｍｎａ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ（イボウキクサ）、Ｌｅｍｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｕｔａ、Ｌｅｍｎａ ｏｂｓｃｕｒａ、Ｌｅｍｎａ ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ、Ｌｅｍｎａ ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ、Ｌｅｍｎａ ｔｅｎｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｔｒｉｓｕｌｃａ、Ｌｅｍｎａ ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｖａｌｄｉｖｉａｎａ、Ｌｅｍｎａ ｙｕｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｌｉｃａｎｉａ ｒｉｇｉｄａ（オイチシカ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（ルピナス）、Ｍａｕｒｉｔｉａ ｆｌｅｘｕｏｓａ（ｂｕｒｉｔｉ ｐａｌｍ）、Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎａ ｍａｒｉｐａ（ｉｎａｊａ ｐａｌｍ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ及びＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐ．（タバコ）（例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｃａｂａ（ｂａｃａｂａ−ｄｏ−ａｚｅｉｔｅ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｔａｕａ（ｐａｔａｕａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ（ｂａｃａｂａ−ｄｅ−ｌｅｑｕｅ）、Ｏｒｙｚａ ｓｐ．（イネ）（例えば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ及びＯｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｐａｒａｑｕｅｉｂａ ｐａｒａｅｎｓｉｓ（ｍａｒｉ）、Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｎｃａｎａ（アボカド）、Ｐｏｎｇａｍｉａ ｐｉｎｎａｔａ（Ｉｎｄｉａｎ ｂｅｅｃｈ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（サトウキビ）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ（ゴマ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｏｒｕｍ（クプアス）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｔｒｉｔｈｒｉｎａｘ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｎｅｅｄｌｅ ｐａｌｍ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ．（コムギ）（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒａｌｅ）、サツマイモ（Ｌｏｐｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ ｓｐｐ．）、パイナップル（Ａｎａｎａ ｃｏｍｏｓｕｓ）、ｃｉｔｒｉｓ ｔｒｅｅ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｅｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）及びアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）。
他の好ましい植物としては、上述に加えて、例えば、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉ、Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ、Ｂ．ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｂｕｃｈｌｏｅ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ、Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ ｎｕｔａｎｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ｃｒｙｐｔａｎｄｒｕｓ等のＣ４草；Ｅｌｙｍｕｓ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、マメ科植物のＬｅｓｐｅｄｅｚａ ｃａｐｉｔａｔａ及びＰｅｔａｌｏｓｔｅｍｕｍ ｖｉｌｌｏｓｕｍ、広葉草本のＡｓｔｅｒ ａｚｕｒｅｕｓ等のＣ３草；Ｑｕｅｒｃｕｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌｉｓ及びＱ．ｍａｃｒｏｃａｒｐａ等の木本植物が挙げられる。他の好ましい植物としては、Ｃ３草が挙げられる。
好ましい実施形態では、植物は被子植物である。
一実施形態では、植物は、油糧種子植物、好ましくは油糧種子作物植物である。本明細書で使用される場合、「油糧種子植物」とは、植物の種子からの脂質の商用製造に使用される植物種である。油糧種子植物は、例えば、アブラナ（例えば、カノーラ）、トウモロコシ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、モロコシ、アマ（アマニ）、またはサトウダイコンであっても良い。更に、油糧種子植物は、他のアブラナ属、ワタ、ピーナッツ、ケシ、ルタバガ、マスタード、トウゴマ、ゴマ、ベニバナ、ナンヨウアブラギリまたは堅果産生植物であっても良い。この植物は、その果実（例えば、オリーブ、アブラヤシ、またはココナッツ）に高レベルの脂質を産生し得る。本発明が適用され得る園芸植物は、レタス、エンダイブ、またはキャベツ、ブロッコリ若しくはカリフラワーを含むアブラナ属の野菜である。本発明をタバコ、ウリ科、ニンジン、イチゴ、トマトまたはコショウに適用しても良い。
好ましい実施形態では、トランスジェニック植物は、所望の表現型を分離しないように子孫が導入された、すべての遺伝子（導入遺伝子）に対してホモ接合性である。トランスジェニック植物はまた、例えばハイブリッド種子から生長したＦ１子孫等に導入された導入遺伝子（複数を含む）に対してヘテロ接合性、好ましくは導入遺伝子に対して一様にヘテロ接合性であっても良い。このような植物は、当技術分野において周知の雑種強勢等の利点を提供し得る。
植物の形質転換
トランスジェニック植物は、一般に、Ｓｌａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３）、及びＣｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｋｌｅｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（２００４）に記載されているもの等の、当技術分野で既知の技術を使用して産生することができる。
本明細書で使用される場合、「安定的に形質転換する」、「安定的に形質転換された」という用語、及びそれらの変形は、ポリヌクレオチドが、その存在を積極的に選択されることを必要とせずに、細胞分裂中に、子孫細胞に転移されるように、ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに統合されることを指す。安定した形質転換体またはその子孫は、染色体ＤＮＡに対するサザンブロットまたはゲノムＤＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の、当技術分野において既知のあらゆる手段によって同定でき、それにより選択が可能となる。
一過性発現のために、または植物細胞ゲノムでのＤＮＡの安定的な組み込みのために、植物組織全体の細胞、植物器官の細胞、または組織培養物中の外植体にＤＮＡを導入することができるので、アグロバクテリウム媒介性転移は、遺伝子を植物細胞の中に導入するための広く適用可能な系である。例えば、（植物界では）フローラルディップ法を使用することができる。植物細胞へのＤＮＡ導入に、アグロバクテリウム媒介性植物組み込みベクターを使用することは、当技術分野において周知である。転移されるＤＮＡの領域は、境界配列によって定義され、介在ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は通常、植物ゲノムの中に挿入される。容易かつ確定された性質の遺伝子転移であるため、これは最適な方法である。
使用され得る加速法としては、例えば、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント法等が挙げられる。形質転換核酸分子を植物細胞に送達するための方法の１つの例は、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント法である。この方法は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）によって概説されている。非生物学的粒子（マイクロプロジェクタイル）を核酸で被覆して、推進力によって細胞の中、例えば未成熟胚に送達しても良い。例となる粒子としては、タングステン、金、白金等から成るものが挙げられる。
別の方法で、色素体を安定的に形質転換させることができる。高等植物における色素体形質転換について開示されている方法としては、選択マーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガンによる送達、及び相同組み換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡの標的化が挙げられる（ＵＳ５，４５１，５１３、ＵＳ５，５４５，８１８、ＵＳ５，８７７，４０２、ＵＳ５，９３２，４７９及びＷＯ９９／０５２６５）。細胞形質転換の他の方法を使用することもでき、そのような方法としては、花粉への直接のＤＮＡ転移によって、植物の生殖器官中へのＤＮＡの直接注入によって、または未成熟胚の細胞へのＤＮＡの直接注入と、その後の乾燥した胚の再水和によって、植物の中にＤＮＡを導入することが挙げられるが、これらに限定されない。
単一植物プロトプラストの形質転換体からの、または種々の形質転換された外植体からの、植物の再生、成長及び栽培は、当技術分野において周知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８８））。この再生及び生長過程は、典型的に、形質転換細胞を選択するステップ、この個別化した細胞を通常の胚の発達段階を経て発根した苗木段階まで培養するステップを含む。トランスジェニック胚及び種子が、同様に再生される。その後に、結果として生じたトランスジェニック発根芽を、土壌等の適切な植物生長培地に植え付ける。
外来の外因性遺伝子を含む植物の成長または再生は、当技術分野において周知である。好ましくは、再生植物を自家授粉させて、ホモ接合性トランスジェニック植物を提供する。それ以外の場合、再生植物から得られた花粉を、農学的に重要な系列の種子から生長させた植物と交配する。逆に、これらの重要な系列の植物からの花粉を使用して、再生植物に授粉する。所望のポリヌクレオチドを含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を使用して栽培される。
トランスジェニック細胞及びトランスジェニック植物における導入遺伝子の存在を確認するために、当業者に既知の方法を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を行うことができる。導入遺伝子の発現産物は、その産物の性質に応じて、種々の方法のいずれかで検出することができ、そのような方法としては、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット法及び酵素アッセイが挙げられる。トランスジェニック植物を得た後に、これを生長させて、所望の表現型を有する植物組織または一部を産生しても良い。植物組織または植物部分を採取しても良く、及び／または種子を採集しても良い。この種子は、所望の特性を有する組織または一部を伴う付加的な植物を生長させるための源としての役割を果たし得る。好ましくは、生育植物部分は、非極性脂質の産生量が最大になった時点で採取される。一実施形態では、生育植物部分は開花期の頃、または開花の開始後に採取される。好ましくは、植物部分は、通常は葉の黄変及び乾燥によって示される、老化が開始する頃に採取される。
アグロバクテリウムまたは他の形質転換方法を使用して形成されたトランスジェニック植物は、典型的には、１つの染色体上に単一の遺伝子座を含む。このようなトランスジェニック植物は、付加遺伝子（複数を含む）に対してヘミ接合性であると称することができる。付加遺伝子（複数を含む）に対してホモ接合性であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの付加遺伝子（染色体対の各染色体上の同一遺伝子座に１つの遺伝子）を含むトランスジェニック植物が、より好ましい。ホモ接合性トランスジェニック植物は、ヘミ接合性トランスジェニック植物を自家受精させ、産生した種子の一部を発芽させて、得られた植物を目的遺伝子について分析することによって得ることができる。
独立して隔離された２つの外因性遺伝子または遺伝子座を含む２種類のトランスジェニック植物を交配させて（掛け合わせて）、両組の遺伝子または遺伝子座を含む子孫を産生できることも理解されたい。適切なＦ１子孫の自殖により、双方の外因性遺伝子または遺伝子座に対してホモ接合性である植物を産生することができる。生育繁殖と同様に、親植物への戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配も企図される。同様に、同定された導入遺伝子と遺伝子改変の両方を含む突然変異遺伝子及び子孫等の、遺伝子改変を含む第２の植物と、トランスジェニック植物を交配することができる。異なる形質及び作物に一般的に使用される他の繁殖方法の説明は、ＦｅｈｒのＢｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．（１９８７）に見出すことができる。
ＴＩＬＬＩＮＧ法
一実施形態では、ＴＩＬＬＩＮＧ法（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）は、内因性遺伝子、例えば、ＳＤＰ１若しくはＴＧＤポリペプチド、色素体ＧＰＡＴ、色素体ＬＰＡＡＴ、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、またはその２つ以上の組み合わせをコードする遺伝子に突然変異が含まれる植物を産生するために使用することができる。第１のステップでは、化学的変異原で種子（または花粉）を処理することによって新しい一塩基対変化等の誘導型変異を植物の集団に誘発させ、その後、変異が安定的に継承される世代まで植物を成長させる。ＤＮＡを抽出し、集団の全メンバーからの種子を貯蔵して、経時的に繰り返して利用できる供給源を作成する。ＴＩＬＬＩＮＧアッセイのために、特異的エンドヌクレアーゼを用いるヘテロデュプレックス法を使用して、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することができる。あるいは、突然変異誘発性植物プールからの次世代ＤＮＡシーケンシングを使用して、最適な遺伝子の突然変異体を同定することができる。典型的には、突然変異誘発性集団において１０００植物当たり１つの突然変異体の変異頻度が達成される。この手法を使用することで、何千もの植物をスクリーニングし、ゲノムの任意の遺伝子または特定の領域における一塩基変化、ならびに小挿入若しくは欠失（１〜３０ｂｐ）を伴うあらゆる個体を同定することができる。ＴＩＬＬＩＮＧについては、Ｓｌａｄｅ ａｎｄ Ｋｎａｕｆ（２００５）、ならびにＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２００４）に更に詳細に記載されている。
変異の効率的な検出を可能にすることに加えて、高スループットのＴＩＬＬＩＮＧ技術は、自然多型性の検出に理想的である。したがって、既知の配列に対するヘテロ２本鎖を形成することによって未知の相同的ＤＮＡを確認することで、多型性部位の数及び位置が明らかになる。少なくともいくつかの反復回数多型を含めた、ヌクレオチドの変化、ならびに小挿入及び欠失の双方が特定される。これはＥｃｏｔｉｌｌｉｎｇと呼ばれている（Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
部位特異的ヌクレアーゼを使用したゲノム編集
ゲノム編集は、非特異的ＤＮＡ切断モジュールと融合された配列特異的ＤＮＡ結合ドメインで構成される、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ等の人工ヌクレアーゼを使用する。この人工ヌクレアーゼにより、標的ＤＮＡ二本鎖の切断を誘発させ、細胞の内因性細胞ＤＮＡ修復機構を刺激して、誘発された切断を修復することにより、効率的かつ正確な遺伝子改変を可能にする。このような機構として、例えば、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と、相同組み換え修復（ＨＤＲ）が挙げられる。
伸長された相同アームを有する供与体プラスミドの存在下では、ＨＤＲが、単一または複数の導入遺伝子の導入を誘導し、既存の遺伝子を修正または置換することができる。供与体プラスミドの不在下では、ＮＨＥＪ媒介性修復により、遺伝子破損の原因となる小挿入または欠失の変異を標的に引き起こす。
本発明の方法に有用な人工ヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ、ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タイプのヌクレアーゼが挙げられる。
通常、ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクターまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡによって細胞に送達される。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）はＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインとを備え、ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つのジンクフィンガーで構成され、ＤＮＡ切断ドメインと作動可能に連結される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインはタンパク質のＮ末端にあり、ＤＮＡ切断ドメインは前記タンパク質のＣ末端に位置する。
ＺＦＮは、少なくとも１つのジンクフィンガーを有していなければならない。好ましい実施形態では、宿主細胞または生物での標的遺伝子組み換えに有用である十分な特異性を有するために、ＺＦＮは少なくとも３つのジンクフィンガーを有している。通常、３つを超えるジンクフィンガーを有するＺＦＮでは、ジンクフィンガーが追加されるごとに特異性は累進的に増加することになる。
ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーのいかなるクラスまたはタイプからも誘導され得る。特定の実施形態では、ジンクフィンガードメインは、例えば、ごく一般にジンクフィンガー転写因子ＴＦＩＩＩＡまたはＳｐ１に代表されるＣｉｓ２Ｈｉｓ２タイプのジンクフィンガーを含む。好ましい実施形態では、ジンクフィンガードメインは、３つのＣｉｓ２Ｈｉｓ２タイプのジンクフィンガーを含む。細胞内ＤＮＡのいずれかの選択部位で標的遺伝子組み換えを達成するために、ＺＦＮのＤＮＡ認識及び／または結合特異性を変更することができる。このような改変は、既知の分子生物学及び／または化学合成技術を使用して達成することができる（Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
ＺＦＮのＤＮＡ切断ドメインは、非特異的ＤＮＡ切断ドメインのクラス、例えばＦｏｋＩ等のＩＩ型制限酵素のＤＮＡ切断ドメインから誘導される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。他の有用なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ及びＡｌｗＩを挙げることができる。
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む。
ＴＡＬエフェクターは、病原体によって植物細胞に導入される植物病原性細菌のタンパク質であり、核に輸送されて転写因子として機能し、特異的植物遺伝子をオンにする。ＴＡＬエフェクターの一次アミノ酸配列は、それが結合するヌクレオチド配列を決定する。したがって、標的部位をＴＡＬエフェクターで予測することができ、特定のヌクレオチド配列との結合を目的として、ＴＡＬエフェクターを遺伝子操作して産生することができる。
ＴＡＬエフェクターをコードする核酸配列に融合される配列は、典型的にはＦｏｋＩ等（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的切断ドメインである、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部分をコードする。他の有用なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ及びＡｌｗＩを挙げることができる。一部のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）が二量体としてのみ機能する事実を利用して、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を増強することができる。例えば、場合によっては、異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に、各ＦｏｋＩモノマーを融合させ、２つの認識部位が隣接している場合のみ、不活性モノマー同士を会合させ、機能的酵素を生成することができる。ヌクレアーゼの活性化にＤＮＡ結合を必要とすることにより、高度に部位特異的な制限酵素を生成することができる。
配列特異的ＴＡＬＥＮは、細胞に存在する事前選択された標的ヌクレオチド配列内の特定の配列を認識することができる。したがって、いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列をスキャンしてヌクレアーゼ認識部位を特定でき、標的配列に基づいて特定のヌクレアーゼを選択することができる。他の場合には、ＴＡＬＥＮを遺伝子操作して、特定の細胞内配列を標的化することができる。
プログラム可能なＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用したゲノム編集
上記の部位特異的なヌクレアーゼとは異なり、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＡＳシステムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断を経て、標的遺伝子の変更を誘発するためのＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの代替法を提供する。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡの配列特異的切断のためにＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化キメラＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を利用する。３種類のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが存在し、ＩＩ型システムでは、Ｃａｓ９が、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ標的認識に応じてＤＮＡを切断するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する。ｔｒａｃｒＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ塩基対は二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、切断する相補ＤＮＡ部位へとＣａｓ９エンドヌクレアーゼを誘導する。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及び必要なｃｒＲＮＡ構成要素を発現するプラスミドの同時送達によって、植物細胞に移植可能であり得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼをニッカーゼに転換して、ＤＮＡ修復機構の追加制御を付与しても良い（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＣＲＩＳＰＲは通常、最大１１ｂｐの内部反復と末端逆方向反復を含む、２４〜４０ｂｐの部分的な短鎖反復回文配列である。単離された要素が検出されているが、一般的にＣＲＩＳＰＲは、２０〜５８ｂｐの固有の介在配列によって間隔を置いた反復単位のクラスター内（ゲノム当たり最大約２０以上）に配置される。ＣＲＩＳＰＲは一般に、その大半が同一である所与のゲノム内で相同性である。しかしながら、例えば古細菌に異質性の例が存在する（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
植物バイオマス
植物バイオマスの総脂質含有量の増加は、エネルギー含有量が大きくなることと同じであり、飼料または馬草として、またはバイオ燃料の産生に使用したとき、より経済的になる。
自然発生的な植物バイオマスの主な構成成分は、炭水化物（約７５％、乾重量）及びリグニン（約２５％）であり、植物の種類によって変化し得る。炭水化物は主に、セルロースまたはヘミセルロース繊維であり、植物の構造に強度を与え、リグニンは繊維同士を結合させる。植物バイオマスは通常、その物理的形状及び含水率の両方の結果、エネルギー濃度が低い。このため、何らかの前処理を行わなければ、貯蔵及び輸送にも不便で非効率である。より便利な形態へと転換するために利用可能な方法が多くあり、それには以下が挙げられる：１）物理的前処理（例えば、研削）または２）熱による転換（例えば、燃焼、ガス化、熱分解）または化学的な転換（例えば、嫌気的消化、発酵、たい肥化、エステル交換）方法。このようにして、バイオマスはバイオマス燃料としての特徴を有し得るものへと転換される。
燃焼
燃焼とは、可燃性の物質を空気または酸素の存在下で発熱を伴い燃えるようにする方法である。基本的な方法は酸化である。燃焼は、バイオマスをエネルギーに使用できるようにする最も単純な方法であり、熱を提供するために用いられる。この熱は、それ自身、多くの方法で用いることができる：１）空内暖房、２）集中暖房若しくは地域暖房またはプロセス加熱用の水（または他の流体）加熱、３）発電または原動力のための蒸気発生。可燃性燃料物質がバイオマスの形態である場合、酸化は主に、セルロース、ヘミセルロース、リグニン及び存在する他の分子中の炭素（Ｃ）及び水素（Ｈ）による二酸化炭素（ＣＯ２）と水（Ｈ２Ｏ）の形成である。本発明の植物は、脂質含有量の増加によって、改善された燃焼用燃料を提供する。
ガス化
ガス化は、部分的な酸化方法であり、これにより、植物バイオマス等の炭素源を一酸化炭素（ＣＯ）と水素（Ｈ２）、加えて二酸化炭素（ＣＯ２）、及び場合によってはメタン（ＣＨ４）等の炭化水素分子へと分解する。ガス化が比較的低温（例えば７００℃〜１０００℃）で行われる場合、生成物ガスは高温ガス化と比較して比較的高い濃度の炭化水素を有する。その結果、蒸気タービンを介した発熱または発電のための燃焼、または適切なガス浄化を伴う、発電のための内燃機関の稼働にこれを直接使用することができる。単純なボイラー用の燃焼チャンバは、ガス化装置に密連結されていても良く、または発生炉ガスは、長鎖炭化水素（タール）が浄化され、輸送され、貯蔵及び遠隔操作で燃焼されるものであっても良い。ガス化システムは、発電用の複合サイクルガスタービンと密に統合されていても良い（ＩＧＣＣ−石炭ガス化複合発電（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇａｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｙｃｌｅ））。高温（１２００℃〜１６００℃）でのガス化により、生成物ガス中の炭化水素がほとんどなくなり、ＣＯ及びＨ２の比率が高くなる。これは、例えばフィッシャー・トロプシュ（ＦＴ）合成等の技術を用いた長鎖炭化水素の合成に使用できるため、合成ガス（合成ガスまたはバイオ合成ガス）として知られている。Ｈ２とＣＯとの比が適切（２：１）である場合、ＦＴ合成を使用して、合成ガスを従来の化石ディーゼル及びディーゼルエンジンとの適合性がある高品質の合成ディーゼルバイオ燃料へと転換することができる。
熱分解
本明細書で使用される場合、「熱分解」という用語は、酸素の非存在下で徐加熱を利用して、バイオマスからガス生成物、油生成物、及び炭化生成物を製造する方法を意味する。熱分解は、脂質系物質、特にトリグリセリド系物質の熱転換または熱化学転換である。熱分解の生成物には、ガス、液体及び固体炭が含まれ、それぞれの比率は当該方法のパラメーターに依存する。蒸気の滞留時間が約１秒またはそれ以下に抑えられるという条件で、低温度（約４００℃）では、より固形の炭が生成される傾向があり（低速熱分解）、一方、ある程度の高温（約５００℃）では、はるかに高比率の液体（バイオ油）が生成される。約２７５℃〜約３７５℃の温度を用いると、長鎖炭化水素を高比率で有する液体バイオ油を製造することができる。熱分解は、脂質の直接熱分解または熱及び接触分解の併用を含む。約４００〜５００℃の温度で分解が発生し、短鎖炭化水素（例えばアルカン類、アルケン類、アルカジエン類、芳香族類、オレフィン類及びカルボン酸類）ならびに一酸化炭素及び二酸化炭素が産生される。
遷移金属触媒、分子ふるい触媒、活性アルミナ及び炭酸ナトリウムを含む、主に４つの触媒型を使用することができる（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＵＳ４１０２９３８に例が記載されている。酸により活性化されたアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）は、効果的な触媒である（ＵＳ５２３３１０９）。分子ふるい触媒は、サイズ選択性を呈する多孔性の高結晶構造であり、あるサイズの分子のみを通すことができる。これには、ＡｌＯ４及びＳｉＯ４を含む結晶性物質であるゼオライト触媒（例えば、ＺＳＭ−５またはＨＺＳＭ−５）ならびに他のシリカ−アルミナ触媒が含まれる。これらの触媒の活性及び選択性は、酸性度、孔径及び細孔形状に依存し、通常は、３００〜５００℃で作用する。遷移金属触媒は、例えばＵＳ４９９２６０５に記載されている。炭酸ナトリウム触媒は、油の熱分解に使用されている（Ｄａｎｄｉｋ ａｎｄ Ａｋｓｏｙ，１９９８）。
本明細書で使用される場合、「熱解重合」とも称される「熱水処理」、「ＨＴＰ」は、他のガス及び固体とともに主にパラフィン系炭化水素からなるバイオ油生成物を製造するために、植物由来物質、特に植物由来物質の炭素含有材料を水素と反応させる熱分解の形態である。ＨＴＰの重要な利点は、転換反応させる組成物を形成する前に、生育植物部材料を乾燥させる必要がないことである。ただし、生育植物材料を事前に乾燥させると、バイオマスの輸送または貯蔵を助けることができる。バイオマスを耕地から採取して直接使用することができる。反応器は、高温及び高圧の使用に耐えることができる、あらゆる容器であり、かつ腐食に対して耐性がある。ＨＴＰに使用する溶媒は水を含むか、または完全に水であり、あるいは油の形態で若干の炭化水素化合物を含んでも良い。一般にＨＴＰの溶媒は、添加アルコールを欠いている。転換反応は、酸化性、還元性または不活性環境で生じ得る。本明細書で使用される場合、「酸化性」は空気の存在下であることを意味し、「還元性」は還元剤、通常は水素ガスまたはメタンの存在下（例えば、１０〜１５％がＨ２で、残りのガスがＮ２）であることを意味し、「不活性」は窒素またはアルゴン等の不活性ガスの存在下であることを意味する。転換反応は好ましくは還元性条件下で実施される。転換される炭素含有材料としては、セルロース、ヘミセルロース、リグニン及びタンパク質ならびに脂質が挙げられる。この方法は、２７０℃〜４００℃の転換温度及び７０〜３５０ｂａｒの圧力、典型的には３００℃〜３５０℃及び１００〜１７０ｂａｒの圧力を使用する。この方法の結果、有機蒸気、熱分解ガス及び炭が生成される。有機蒸気を凝縮すると、バイオ油が生成される。反応器を冷却して、大気圧まで減圧すると、バイオ油（有機）相と水相を形成でき、このバイオ油を反応器から取り出すことによりバイオ油の回収を達成することができる。
回収されたバイオ油の収率は、乾重量基準で投入バイオマス乾重量のパーセンテージとして算出される。これは、式：バイオ油の重量ｘ１００／生育植物部分の乾重量に従って算出される。このバイオ油の重量には、バイオ油混合物中に存在し得るいかなる水または固体の重量も含まない。これらは、濾過または他の既知の方法によって速やかに除去される。
その後、付加的な精製工程の有無にかかわらず、バイオ油を分別蒸留によって留分に分離することができる。通常、以下の温度で凝縮する留分を次のように称する：約３７０℃、燃料油；約３００℃、ディーゼル油；約２００℃、灯油；約１５０℃、ガソリン（石油）。重質留分を、当技術分野において周知の、より軽質の望ましい留分に分解しても良い。ディーゼル燃料は通常、Ｃ１３〜Ｃ２２炭化水素化合物からなる。
本明細書で使用される場合、「石油ディーゼル（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｄｉｅｓｅｌ）」（ｐｅｔｒｏｄｉｅｓｅｌ）は、化石燃料から製造され、米国のＡＳＴＭ Ｄ９７５及び欧州のＥＮ ５９０により定められた仕様に該当するディーゼル燃料を意味する。本明細書で使用される場合、「再生可能ディーゼル」という用語は、ＡＳＴＭ Ｄ９７５規格を満たす、新しい生体バイオマス（化石燃料でない）に由来するディーゼル燃料を意味し、モノアルキルエステルではない。再生可能ディーゼルの典型的な特性は、セタン価７５〜９０、エネルギー密度約４４ＭＪ／ｋｇ、密度約０．７８ｇ／ｍＬ、エネルギー含有量約１２３Ｋ ＢＴＵ／ｇａｌ、硫黄レベル１０ｐｐｍ未満、曇点０℃以下である。
エステル交換
本明細書で使用される場合、「エステル交換」とは、アルカリまたは酸等の触媒の存在下で、メタノールまたはエタノール等の短鎖アルコールと反応させることにより、脂質（主にトリアシルグリセロール）を脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルに転換することである。低コスト及び入手の容易さにより、より一般的にはメタノールが使用されるが、エタノール、プロパノール若しくはブタノールまたはアルコールの混合物を使用しても良い。触媒は、均一触媒、不均一触媒または酵素触媒でも良い。均一触媒としては、硫酸第二鉄、次いでＫＯＨが挙げられる。不均一触媒としては、ＣａＯ、Ｋ３ＰＯ４及びＷＯ３／ＺｒＯ２が挙げられる。酵素触媒には、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａから産生されるＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５が挙げられる。
エステル交換は、抽出油に対して、または好ましくは生育植物材料中でそのまま直接実施することができる。交換反応に備えて組成物の調製に使用する前に、生育植物部分を乾燥させて粉砕しても良いが、必ずしもそうする必要はない。脂肪酸エステル、好ましくはＦＡＭＥへの直接変換の利点は、低温及び低圧力を転換に使用しても、良好な収率で、例えば少なくとも５０重量％のＦＡＭＥを含む生成物を得ることができる点である。エステル転移により回収されたバイオ油の収率は、ＨＴＰ方法の場合と同様に算出される。
非極性脂質の生成
当技術分野で日常的に行われている手法を使用して、本発明の細胞、生物、またはその一部によって産生される、ＴＡＧ等の非極性脂質を抽出、処理、精製及び分析することができる。このような手法は、Ｆｅｒｅｉｄｏｏｎ Ｓｈａｈｉｄｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）Ｄ１．１．１−Ｄ１．１．１１、及びＰｅｒｅｚ−Ｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）等の出展の文献全体を通して記載及び説明されている。
生育植物部分または種子からの油の生成
通常、植物種子は煮沸、圧搾及び／または抽出され、粗種子油を得た後、脱ガム、精製、脱色及び脱臭される。一般に、種子を破砕するための手法は、当技術分野で既知である。例えば、油糧種子は、水を噴霧することによって、例えば８．５％まで含水量を上昇させることによって柔らかくし、滑面ロールを使用して０．２３〜０．２７ｍｍの間隙調整でフレーク状にすることができる。種子の種類によっては、破砕する前に水を加えなくても良い。加熱により、酵素を不活性化し、更なる細胞破壊を促進し、脂肪滴を癒合させ、タンパク質粒子を塊にする。これらはいずれも抽出工程を容易にする。
一実施形態では、大部分の種子油は、スクリュー圧搾機を通過させることによって放出される。次いで、スクリュー圧搾機から排出されたケークを、熱追跡カラム（ｈｅａｔ ｔｒａｃｅｄ ｃｏｌｕｍｎ）を使用して、例えばヘキサンで溶媒抽出する。あるいは、圧搾操作により得た粗種子油を、スロット状ワイヤ排液頂部を伴う沈殿槽に通過させて、圧搾操作中に種子油とともに絞り出される固形物を除去することができる。浄化した種子油は、プレート及びフレームフィルタを通過させて、あらゆる残余の微細な固形粒子を除去することができる。所望であれば、抽出工程から回収した種子油を、浄化した種子油と組み合わせて、混合種子粗油を製造することができる。
粗種子油から溶媒を除去すると、圧搾して抽出された部分を混ぜ合わせて、標準的な脂質処理手順（すなわち、脱ガム、苛性精製、脱色及び脱臭）が施される。
本発明の生育植物部分からの脂質抽出は、種子油抽出の技術分野において既知のものと類似した方法を使用する。１つの方法は物理的な抽出であり、多くの場合、これは溶媒抽出を使用しない。エキスペラーによる圧搾抽出は、スクリュー圧搾法及びラム圧抽出法と並んで、一般的な種類である。機械抽出は通常、有機溶媒（例えば、ヘキサン）を少なくとも植物バイオマスと、好ましくはバイオマスを乾燥させ粉砕した後に混合する、溶媒抽出法よりも効率性が低い。溶媒により、バイオマス中の脂質が溶出され、次に溶液が機械的作用によって（例えば、上記の圧搾工程によって）バイオマスから分離される。この分離ステップは、（例えば、圧搾濾過器または類似の装置を用いた）濾過または遠心分離等によっても行うことができる。その後、有機溶媒を非極性脂質から（例えば、蒸留によって）分離することができる。この第２の分離ステップにより、植物から非極性脂質を生成するとともに、従来の蒸気回収を使用している場合、再利用可能な溶媒を得ることができる。一実施形態では、植物部分または種子の油及び／またはタンパク質含有量は、抽出前に、Ｈｏｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）に記載された近赤外光反射分光法により分析される。
生育植物部分が脂質抽出に直ちに使用されない場合、例えば、生育植物部分を乾燥させることにより、脂質含有量を可能な限り最小限に保つように処理することが好ましい（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ（１９９３）を参照）。
脱ガム
脱ガムは、油精製の初期ステップであり、その主な目的は、油からリン脂質（総抽出脂質の約１〜２％で存在し得る）の大部分を除去することである。典型的には、リン酸を含む約２％の水を７０〜８０℃で原油に添加することにより、微量の金属及び色素とともにリン脂質の大部分が分離される。除去される不溶性物質は主にリン脂質とトリアシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしてもまた知られている。脱ガムは、濃縮したリン酸を粗種子油に添加して非水和性リン脂質を水和可能な形態に変換し、存在する少量の金属をキレート化することによって行うことができる。ガムは、遠心分離によって種子油から分離される。種子油は、十分量の水酸化ナトリウム溶液を添加して、すべての脂肪酸を滴定し、それにより形成された石鹸を除去することによって精製することができる。
アルカリ精製
アルカリ精製は、原油を処理するための精製工程の一つであり、中和とも称される。通常、脱色の前、脱ガムの後に行われる。脱ガムの後、すべての脂肪酸及びリン酸を滴定するために十分な量のアルカリ溶液を添加して、それにより形成される石鹸を除去することにより、種子油を処理することができる。好適なアルカリ性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム及び水酸化アンモニウムが挙げられる。この方法は通常、室温で実施され、遊離脂肪酸分画を除去する。遠心分離または溶媒中への石鹸の抽出により石鹸を除去し、中和された油を水で洗浄する。必要な場合、油中に過剰量のアルカリがあれば、好適な酸（例えば、塩酸または硫酸）で中和しても良い。
脱色
脱色は、漂白土の存在下（０．２〜２．０％）及び酸素の不在下で、窒素または蒸気とともに、または真空中で操作することにより、１０〜３０分、９０〜１２０℃で油を加熱する精製工程の一つである。油処理のこのステップは、不必要な色素（カロチノイド、クロロフィル、ゴシポール等）の除去を目的としており、当該方法により、酸化産物、微量金属、硫黄化合物及び微量の石鹸もまた除去される。
脱臭
脱臭は、高温（２００〜２６０℃）及び低圧（０．１〜１ｍｍＨｇ）での油及び脂質の処理である。これは通常、種子油１００ｍＬあたり約０．１ｍＬ／分の速度で、蒸気を種子油に導入することにより行われる。脱臭は、真空下で種子油を２６０℃に加熱し、種子油１００ｍＬあたり約０．１ｍＬ／分の速度で蒸気を種子油中に緩やかに導入することによって行うことができる。約３０分のスパージ後、種子油を真空下で冷却させる。種子油は通常、ガラス容器に移し、アルゴンでフラッシングした後、冷凍下で貯蔵される。種子油の量が限られている場合、種子油を真空下、例えばＰａｒｒ反応器中に置き、脱臭に要し得る時間と同じ長さで２６０℃まで加熱することができる。この処理は、種子油の色を改善し、大半の揮発性物質、または何らかの残留遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール及び酸化生成物を含む臭気化合物を除去する。
脱ろう
脱ろうは、油及び脂質を、周囲以下の温度での結晶化により、固体（ステアリン）及び液体（オレイン）留分へと分離するために、市販の油製品に時折用いられる工程である。元々は、固形分のない製品を製造するために綿実油に適用されていた。典型的には、油の飽和脂肪酸含有量を減少させるために用いられる。
脂質生成のための藻類
藻類は、陸生植物よりも、年に１０〜１００倍もの質量を産生することができ、開口池（水路型池及び湖等）またはフォトバイオリアクター内で培養することができる。最も一般的な油産生藻類は通常、珪藻植物（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）及び金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）を含み得る。加えて、ハプト藻類（ｈａｐｔｏｐｈｙｔｅｓ）として知られる第五の群を用いても良い。群には、褐藻類及び黄色藻類（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｓ）を含む。非限定的な藻類の具体例としては、以下のクラスが含まれる：緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ、ハプト藻類（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、珪藻類（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）。油を産生することができる珪藻類には、以下の属が含まれる：Ａｍｐｈｉｐｌｅｕｒａ、Ａｍｐｈｏｒａ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｃｙｍｂｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ及びＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ。油を産生することができる緑藻類の非限定的な具体例としては、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ及びＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓが挙げられる。一態様では、緑藻類はＣｈｌｏｒｅｌｌａまたはＤｕｎａｌｉｅｌｌａであり得る。油を産生することができる青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）の非限定的な具体例としては、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ及びＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓが挙げられる。油を産生することができる金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）の具体例としては、Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａが挙げられる。ハプト藻類の非限定的な具体例としては、Ｉｓｏｃｈｙｓｉｓ及びＰｌｅｕｒｏｃｈｙｓｉｓが挙げられる。
本発明に有用な具体的な藻類としては、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｄ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｄ．Ｌａｔｅｒａｌｉｓ．Ｄ．ｍａｒｉｔｉｍａ．Ｄ．ｐａｒｖａ、Ｄ．ｐｏｌｍｏｒｐｈａ、Ｄ．ｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ、Ｄ．ｐｓｅｕｄｏｓａｌｉｎａ、Ｄ．ｑｕａｒｔｏｌｅｃｔａ．Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａまたはＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｖｏｌｖｏｘ ｓｐ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．、６０ｗｔ％を超える脂質を含むことができるＢｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．、Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｓｐ、Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ ｓｐ．、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐ．、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｓｐ．が挙げられる。
本発明の藻類は、マイクロスクリーンを使用して、遠心分離によって、（例えば、キトサン、ミョウバン及び塩化第二鉄を使用した）凝集によって、及びフロス浮選によって採取することができる。二酸化炭素の供給を中断することで、藻類を自然に凝集させることができ、これは「自己凝集」と呼ばれる。フロス浮選では、カルチベーターによって水に通気して泡立たせ、次いで頂部から藻類をすくい取る。超音波及び他の採取方法が、現在開発されている。
脂質は、機械的に破砕することによって藻類から抽出しても良い。藻類集団は乾燥させたとき、その脂質含量を保持しているため、搾油機で「圧搾する」ことができる。浸透圧衝撃を使用して、藻類から脂質等の細胞成分を放出させても良く、また超音波抽出によって抽出工程を加速することができる。藻類からの脂質の抽出には、多くの場合、化学溶媒（例えば、ヘキサン、ベンゼン、石油エーテル）が使用される。藻類から脂質を抽出するために、酵素を使用して細胞壁を分解する酵素抽出を使用しても良い。超臨界ＣＯ２を溶媒として使用することもできる。この方法では、ＣＯ２を加圧下で液化し、超臨界になる（液体及びガス両方の特性を有する）時点まで加熱することで、溶媒として作用することを可能にする。
本明細書で使用される場合、「油性生物」は、その乾重量の少なくとも２０％をトリアシルグリセロールとして蓄積しているものである。本明細書で使用される場合、「酵母」は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。好適な酵母は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたは他の油性酵母及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．系統を含む。
植物脂質の用途
記載される方法によって生成される脂質は、種々の用途を有する。いくつかの実施形態では、脂質は食物油として使用される。他の実施形態では、脂質は精製されて、潤滑剤としてまたはプラスチックの合成等の他の工業的用途に使用される。いくつかの好適な実施形態では、脂質を精製して、バイオディーゼルを製造する。本発明の植物、藻類及び菌類に由来される油から、バイオディーゼルを製造することができる。バイオ燃料を製造するための植物トリアシルグリセロールの使用は、Ｄｕｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．
（２００８）に概説されている。この結果、得られる燃料は、一般にバイオディーゼルと称され、１．９〜６．０ｍｍ２ｓ−１（ＡＳＴＭ Ｄ６７５１）の動的粘度範囲を有する。バイオアルコールは、糖類または脂質抽出後に残留した脂質以外のバイオマスの発酵から製造しても良い。バイオ燃料製造の一般的な方法は、例えば、Ｍａｈｅｒ ａｎｄ Ｂｒｅｓｓｌｅｒ（２００７）、Ｇｒｅｅｎｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０）、Ｋａｒｍａｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）、Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０ａ）、Ｇｏｎｇ ａｎｄ Ｊｉａｎｇ（２０１１）、Ｅｎｄａｌｅｗ ｅｔ ａｌ．（２０１１）及びＳｅｍｗａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）で参照することができる。
本発明は、生育組織内の含油量を増加させるための方法を提供する。本発明の植物は、植物の地上部全体を採取して、バイオ燃料の製造に使用できるように、葉及び／または茎のエネルギー含有量を増加させている。更にまた、オレイン酸のレベルを有意に増加させる一方で、多価不飽和脂肪酸のアルファリノレン酸（ＡＬＡ）を減少させている。本発明の植物、藻類及び菌類は、それによりバイオ燃料の製造コストを削減する。
バイオディーゼル
バイオディーゼル、すなわちアルキルエステルの製造は周知である。脂質からのエステル製造には、次の３つの基本経路がある。すなわち、１）アルコールによる脂質の塩基触媒性エステル交換、２）メタノールによる脂質の直接的な酸触媒性エステル化、及び３）脂質を脂肪酸に変換した後の酸触媒によるアルキルエステルへの変換である。任意の方法を用いて、脂肪酸アルキルエステル及びグリセロールエーテル（グリセロール上の１、２、または３つのヒドロキシ基がエーテル化している）を調製することができる。例えば、脂肪酸は、例えば、ＴＡＧを酸触媒で加水分解または塩基触媒でけん化することにより、または酵素（例えばリパーゼまたはエステラーゼ）を使用することにより調製することができる。脂肪酸アルキルエステルは、酸触媒の存在下でアルコールと脂肪酸を反応させることにより調製することができる。脂肪酸アルキルエステルはまた、酸触媒または塩基触媒の存在下で、ＴＡＧとアルコールを反応させることによっても調製することができる。グリセロールエーテルは、例えば、塩基触媒の存在下で、グリセロールとアルキルハライドを反応させることにより、または酸触媒の存在下で、グリセロールと、オレフィン若しくはアルコールを反応させることにより調製することができる。アルキルエステルは、ディーゼル燃料と直接混合する、または混合前に、水若しくは他の水性溶液で洗浄し、様々な不純物（触媒を含む）を除去することができる。
航空燃料
バイオ燃料の性能を改善するために、バイオ油を石油由来のディーゼル燃料及び他の燃料（例えばジェット燃料）のバイオ由来代替物へと転換できる、熱及び触媒による化学結合の切断（クラッキング）技術が開発されている。
本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部により産生されるような、中鎖脂肪酸源の使用により、ジェット燃料及び低温流動性が要求される他の燃料に必要とされる短鎖分子を得るための高エネルギーの脂肪酸鎖クラッキングの必要性がなくなる。この方法は、グリセリドから１つ以上の中鎖脂肪酸基を切断し、グリセロールと１つ以上の遊離脂肪酸を形成することを含む。加えて、この方法は、１つ以上の中鎖脂肪酸をグリセロールから分離すること、及び１つ以上の中鎖脂肪酸を脱カルボキシル化して、ジェット燃料製造のための１つ以上の炭化水素を形成することを含む。
飼料
本発明は、飼料として使用することができる組成物を含む。本発明の目的とする「飼料」には、組織に栄養分を与える若しくは組織を作り上げる、またはエネルギーを供給する役目をする、及び／または適切な栄養状態若しくは代謝機能を維持、回復若しくは補助する役目をする、ヒトまたは動物の摂取のためのあらゆる食品または調製物が含まれる。本発明の飼料は、乳児及び／または幼児のための栄養組成物を含む。
本発明の飼料は、例えば、本発明の細胞、本発明の植物、本発明の植物部分、本発明の種子、本発明の抽出物、本発明の方法による産物、または適切な担体（複数を含む）を伴う組成物を含む。「担体」という用語は、その最も広義に用いられ、栄養価を有しても、または有しなくても良いあらゆる成分を包含する。当業者が理解するように、担体は、飼料を摂取する生物に対して悪影響を有しないように、該飼料における使用に対して好適なものでなければならない（または十分に低い濃度で使用されなければならない）。
本発明の飼料は、本明細書で開示される方法、細胞、または生物を使用することによって直接的または間接的に生成される脂質を含む。組成物は、固体または液体形態のいずれであっても良い。加えて、組成物は、特定の用途に所望される量で食用の多量栄養素、ビタミン及び／または鉱物を含んでも良い。これらの成分の量は、組成物が、正常な個体による使用を意図しているか、または代謝障害等を罹患している個体等の特別な必要性を有する個体による使用を意図しているかに応じて変動する。
栄養価を有する好適な担体の例としては、食用脂肪、炭水化物及びタンパク質等の多量栄養素が挙げられるが、これらに限定されない。このような食用脂肪の例としては、ヤシ油、ルリヂサ油、真菌油、ブラックカラント油、ダイズ油、ならびにモノグリセリド及びジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。このような炭水化物の例としては、グルコース、食用のラクトース及び加水分解されたデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本発明の栄養組成物に利用され得るタンパク質の例としては、ダイズタンパク質、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、ミルクホエー、またはこれらのタンパク質の加水分解物が挙げられるが、これらに限定されない。
ビタミン及び鉱物に関して、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレニウム、ヨウ素、ならびにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、及びＢ複合体が、本発明の飼料組成物に添加されても良い。また、他のこのようなビタミン及び無機質が添加されても良い。
本発明の飼料組成物はまた、食餌による補充が必須ではない場合でも、食物に添加されても良い。例えば、組成物は、いずれの種類の食物に添加されても良く、該食物としては、マーガリン、バター、チーズ、乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック、サラダ油、調理油、料理用脂肪、肉、魚及び飲料が挙げられるが、これらに限定されない。
加えて、本発明に従って生成される脂質、または対象遺伝子を含み、発現するように形質転換された宿主細胞はまた、動物の組織または乳脂肪酸組成物をヒトまたは動物の摂取に対してより望ましいものに変化させる、動物性食物のサプリメントとしても使用され得る。このような動物の例としては、ヒツジ、ウシ、ウマ等が挙げられる。更に、本発明の飼料を水産養殖に使用して、ヒトまたは動物が摂取する魚の脂肪酸レベルを増加させることができる。
本発明の好ましい飼料は、ヒトまたは他の動物の食物または餌として直接使用され得る、葉、果実及び茎等の植物、種子及び他の植物部分である。例えば、耕地で生長したそのような植物を動物が直接食しても良く、または給餌を制御してより正確に計量された量を動物に給餌しても良い。本発明は、ヒト及び他の動物での多価不飽和脂肪酸レベルを増加させる食料として、このような植物及び植物部分を使用することを含む。
非ヒト動物による摂取の場合、飼料は、例えば限定されないが、耕地で生長するサイレージ、干し草または牧草に好適ないかなる形態あっても良い。一実施形態では、非ヒトの摂取する飼料は、マメ科植物またはその一部であり、これは、例えばアルファルファ、クローバー、エンドウマメ、ルーサン、インゲンマメ、レンズマメ、ルピナス、メスキート、イナゴマメ、ダイズ及びピーナッツ等のＦａｂａｃｅａｅファミリー（またはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）のファミリーメンバーである。
組成物
本発明はまた、本発明の方法を使用して生成される１つ以上の脂質を含む組成物、特に医薬組成物も包含する。
医薬組成物は、リン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤または乳剤（油中水型乳剤等）等の、標準的な周知の無毒な薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルと組み合わせた、１つ以上の脂質を含んでも良い。本組成物は、液体形態または固体形態のいずれであっても良い。例えば、この組成物は、錠剤、カプセル、摂取可能な液体、粉末、局所用軟膏またはクリームの形態であって良い。適切な流動性は、例えば、分散液の場合に必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことが望ましい場合もある。このような不活性希釈剤以外に、本組成物は、湿潤剤等のアジュバント、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、着香剤及び芳香剤を含むこともできる。
特定の脂肪酸の典型的な投与量は、０．１ｍｇ〜２０ｇであり、１日あたり１回〜５回（１日最高１００ｇ）服用され、好ましくは、１日あたり約１０ｍｇ〜約１、２、５または１０ｇの範囲（１回または複数回投与で服用）である。当技術分野で知られているように、最低で約３００ｍｇ／日の脂肪酸（特に、多価不飽和脂肪酸）が望ましい。しかしながら、任意量の脂肪酸が対象にとって有益であることが理解されるであろう。
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては、例えば、経腸及び腸管外が挙げられる。例えば、液体調製物を経口的に投与しても良い。加えて、均質の混合物を水中に完全に分散させ、生理学的に許容される希釈剤、防腐剤、緩衝剤または噴射剤と無菌条件下で混合し、噴霧剤または吸入剤を形成することができる。
対象に投与される組成物の投与量は、当業者によって決定されても良く、例えば対象の体重、年齢、全体的な健康、既往歴、免疫状態等の種々の要因に依存する。
さらに、本発明の組成物は、化粧品の目的で利用されても良い。組成物は、先在の化粧品組成物に添加することにより混合物を形成しても良く、または本発明に従って生成される脂肪酸を化粧品組成物中の唯一の「活性」成分として使用しても良い。
ポリペプチド
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、一般に本明細書で同義に使用される。
ポリペプチドまたはポリペプチド類は、参照アミノ酸配列に対するそのアミノ酸配列の同一性の程度（同一性％）によって、または一方の参照アミノ酸配列に対して他方よりも大きい同一性％を有することによって定義され得る。参照アミノ酸配列に対するポリペプチドの同一性％は、典型的に、ギャップ作成ペナルティ＝５及びギャップ伸長ペナルティ＝０．３のパラメーターで、ＧＡＰ分析（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、ＧＣＧプログラム）によって決定される。問い合わせ配列は、長さが少なくとも１００個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析により、少なくとも１００個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整合させる。更により好ましくは、問い合わせ配列は、長さが少なくとも２５０個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析により、少なくとも２５０個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整合させる。さらにより好ましくは、ＧＡＰ分析により、その全長にわたって２つの配列を整合させる。ポリペプチドまたはポリペプチド類は、参照ポリペプチドと同じ酵素活性若しくは異なる活性を有しても良く、または参照ポリペプチドの活性が欠如していても良い。好ましくは、ポリペプチドは、参照ポリペプチドの活性の少なくとも１０％の酵素活性を有する。
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な断片」は、完全長参照ポリペプチドの定義された活性、例えばＭＧＡＴ活性を維持する、本発明のポリペプチドの一部分である。本明細書で使用される生物学的に活性な断片は、完全長ポリペプチドを除外する。生物学的に活性な断片は、定義された活性を維持する限り、あらゆるサイズの部分とすることができる。好ましくは、生物学的に活性な断片は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％を維持する。
定義されたポリペプチドまたは酵素に関して、本明細書で提供されるものよりも高い同一性％の値が、好ましい実施形態を包含されることが理解されるであろう。したがって、該当する場合、最小の同一性％の値に照らして、ポリペプチド／酵素は、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましく少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、及びさらにより好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指定された配列番号と同一である、アミノ酸配列を含むことが好ましい。
本明細書で定義されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を本明細書で定義される核酸の中に導入することによって、または所望のポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成によって調製することができる。このような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換を含む。最終ポリペプチド産物が所望の特性を保有するならば、欠失、挿入及び置換の組み合せを行って、最終的な構築物に到達させることができる。
変異（改変）ポリペプチドは、当技術分野で既知の手法を使用して、例えば、指向性進化または合理的な設計方策（下記参照のこと）を使用して調製することができる。変異／改変ＤＮＡ由来の産物は、本明細書に記載する手法を使用して容易にスクリーニングして、それらが転写因子活性、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ活性またはＯＢＣ活性を保有するかどうかを判定することができる。
アミノ酸配列変異体を設計する際に、変異部位の場所及び変異の性質は、修飾される特性（複数を含む）に依存する。変異の部位は、例えば、（１）最初に保存的アミノ酸選択物と置換し、次いで達成する結果に応じてより急進的な選択物と置換することによって、（２）標的残基を欠失させることによって、または（３）位置する部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個別にまたは連続的に修飾することができる。
アミノ酸配列の欠失は、一般に、約１個〜１５個の残基、より好ましくは約１〜１０個の残基、及び典型的に、約１〜５個の連続した残基の範囲に及ぶ。
置換変異体は、除去されたポリペプチド分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基と、その場所に挿入された異なる残基とを有する酵素を不活性化する置換変異誘発の最大の目的部位としては、活性部位（複数を含む）として同定されている部位が挙げられる。他の目的部位は、種々の株または種から得られる特定の残基が同一である部位である。これらの位置は、生物活性にとって重要であり得る。これらの部位、特に少なくとも３つの他の同様に保存された部位の配列内に含まれる部位は、好ましくは、相対的に保存的な様式で置換される。このような保存的置換を「例示的置換」という見出しで表１に示す。
表１．例示的置換
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好ましい実施形態では、突然変異体／変異体ポリペプチドは、自然発生型ポリペプチドと比較したときに、１つ、若しくは２つ、若しくは３つ、若しくは４つだけ、またはそれを超えない保存的アミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細を表１に記載する。当業者であれば認識しているように、このようなわずかな変化は、組み換え細胞での発現時に、ポリペプチドの活性を変化させないことを当然予測することができる。望ましい活性を有する変異体は、当技術分野における標準的手順、例えば既知の目的遺伝子上のランダムな突然変異誘発、突然変異誘発の標的化または飽和突然変異誘発を実行することによって、または異なる遺伝子にＤＮＡシャッフリングを施すことにより、遺伝子操作され得る。
実施例１．一般的な材料及び方法
一過性発現系での植物細胞における遺伝子の発現
遺伝子は、基本的に、Ｖｏｉｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）及びＷｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）によって記載されたような一過性発現系を使用して植物細胞に発現させた。重複エンハンサー領域を含む強力なｅ３５Ｓ構成的プロモーターによって発現するコード領域を含むバイナリーベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）系統ＡＧＬ１に導入した。ｐ１９ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現させるためのキメラバイナリーベクター３５Ｓ：ｐ１９を、ＷＯ２０１０／０５７２４６に記載されたようなＡＧＬ１に別々に導入した。Ｖ２ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現させるためのキメラバイナリーベクター３５Ｓ：Ｖ２を、ＡＧＬ１に別々に導入した。組み換え細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び５０ｍｇ／Ｌのリファンピシンを補充したＬＢブロス中で２８℃にて静止期まで成長させた。次いで、室温にて５分間、５０００ｇの遠心分離によって細菌をペレット化した後、１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１００μＭのアセトシリンゴンを含む浸潤緩衝液中に、ＯＤ６００＝１．０になるように再懸濁した。次いで、細胞を、２８℃で３時間振盪しながらインキュベートした後、ＯＤ６００を測定し、最終濃度ＯＤ６００＝０．１２５に達するまで、ウイルスサプレッサー構築物３５Ｓ：ｐ１９または３５Ｓ：Ｖ２を含む必要量の各培養物を新しい管に加えた。最終的な体積は、前述の緩衝液で補った。次いで、培養混合物を葉に浸潤させ、通常は浸潤後、更に３〜５日間植物を生長させた後、精製した細胞溶解物の調製または総脂質の単離のため、葉片を回収した。
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの形質転換
Ｋｅｒｅｓｚｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）によって記載されたように、塩素ガスを使用してＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの種子を殺菌し、組織培地上で発芽させた。Ｂｅｌｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されたように、２〜４ｍｍの茎を有する子葉葉柄を単離し、外植体として使用した。バイナリーベクターを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＡＧＬ１（Ｌａｚｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）培養物を調製し、Ｂｅｌｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって記載されたように、子葉葉柄に培養物を接種した。感染させた子葉葉柄を１ｍｇ／ＬのＴＤＺ＋０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ＋３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのｔｉｍｅｎｔｉｎ及び２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充したＭＳ培地で培養し、更に同一培地に対して隔週で継代培養しながら、１６時間／８時間の明暗光周期にて２４℃で４週間、培養した。緑色カルスを有する外植体をシュート誘導培地（ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌのカイネチン＋３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム＋５０ｍｇ／Ｌのｔｉｍｅｎｔｉｎ＋２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）に移し、更に２〜３週間培養した。小さいシュート（約１ｃｍ）を耐性カルスから単離し、シュート伸長培地（０．１ｍｇ／Ｌのジベレリン酸＋３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム＋２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを有するＭＳ培地）に移し、更に２週間培養した。１または２枚の葉を有する健康なシュートを選択して、発根培地（１ｍｇ／ＬのＮＡＡ＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを有する１／２ＭＳ）に移し、２〜３週間培養した。製造業者のプロトコルに記載されているように、植物ＤＮＡ単離キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、耐性シュートの小さい葉からＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ増幅試験によってＴ−ＤＮＡ配列の存在を確認した。根を有する陽性トランスジェニックシュートを、育苗用混合物（ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｒａｉｓｉｎｇ ｍｉｘ）を含むポットへ移し、温室内にて昼間２４℃／夜間１６℃（標準条件）で生長させた。
葉溶解物の精製−酵素アッセイ
上記のように事前に浸潤させたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉組織を、ガラスホモジナイザーを使用して、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）及び０．３３Ｍのスクロースを含む溶液中ですりつぶした。葉ホモジェネートを、４℃、２０，０００ｇで４５分間遠心分離し、その後、各上清を採集した。各上清中のタンパク質含有量を、Ｗａｌｌａｃ１４２０マルチレベルカウンター及びＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ色素試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ ＵＳＡ）を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）に従って測定した。アシルトランスフェラーゼアッセイでは、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）に従い、一部変更を加え、１００μｇのタンパク質を使用した。反応培地には、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（脂肪酸含まず）、２００ｍＭのスクロース、４０ｍＭの低温オレオイル−ＣｏＡ、１６．４μＭのｓｎ−２−モノオレオイルグリセロール［１４Ｃ］（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ＵＳＡ）または６．０μＭの［１４Ｃ］グリセロール−３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）ジナトリウム塩（１５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を入れた。アッセイは、７．５分、１５分、または３０分にわたって行った。
脂質分析
Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ種子中の含油量の分析
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子等の小さな種子の種子含油量または総脂肪酸組成を計測しようとした場合、種子を破砕せずに、種子中の脂肪酸を直接メチル化した。種子はデシケーター中で２４時間乾燥させ、およそ４ｍｇの種子をテフロン（登録商標）加工のねじ蓋を含む２ｍＬのガラスバイアルに移した。０．１ｍＬのトルエンに溶解した０．０５ｍｇのトリヘプタデカノイン（３つのＣ１７：０脂肪酸を有するＴＡＧ）を内部標準物質としてバイアルに添加した。０．７ｍＬの１ＮメタノールＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を、種子物質を含むバイアルに添加することにより、種子の脂肪酸をメチル化した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子等の小さな種子での完全なメチル化に、種子の破砕は必要なかった。混合物を短時間ボルテックスし、８０℃で２時間インキュベートした。混合物を室温にまで冷却した後、０．３ｍｌの０．９％ ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）及び０．１ｍｌのヘキサンをバイアルに添加し、１０分間、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｖｉｂｒａｍａｘ １１０中で十分に混合した。ＦＡＭＥを０．３ｍＬのガラスインサート中へ回収し、後述のように、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を搭載したＧＣにより分析した。
最初に、市販の標準物質ＧＬＣ−４１１（ＮＵ−ＣＨＥＫ ＰＲＥＰ，ＩＮＣ．、ＵＳＡ）中に存在する既知量の同じＦＡＭＥのピーク面積応答に基づいて、個々のＦＡＭＥのピーク面積を補正した。ＧＬＣ−４１１は、等量の、Ｃ８：０〜Ｃ２２：６に及ぶ３１の脂肪酸（重量％）を含有する。標準物質中に存在しなかった脂肪酸の場合には、最も類似しているＦＡＭＥのピーク面積応答を採用した。例えば、１６：１ｄ９のＦＡＭＥのピーク面積応答を１６：１ｄ７に対して使用し、Ｃ２２：６のＦＡＭＥ応答をＣ２２：５に対して使用した。補正面積を用いて、内部標準物質の質量と比較したサンプル中の各ＦＡＭＥの質量を算出した。油は主にＴＡＧの形態で貯蔵されており、その重量はＦＡＭＥ重量に基づいて算出した。グリセロールの総モルは、各ＦＡＭＥのモルを算出し、ＦＡＭＥの総モルを３で割ることにより決定した。ＴＡＧ含有量は、次の比率式を使用してグリセロール及び脂肪酸アシル部分の総和として算出した：油重量％＝１００ｘ（（４１ｘ総モルＦＡＭＥ／３）＋（総ｇＦＡＭＥ−（１５ｘ総モルＦＡＭＥ）））／ｇ種子（ここで、４１及び１５は、それぞれグリセロール部分及びメチル基の分子量である）。
Ｃａｍｅｌｉｎａ種子及びカノーラ種子中の脂肪酸含有量の分析
カノーラ種子及びＣａｍｅｌｉｎａ種子等の大きな単一種子中の脂肪酸組成を決定するには、種皮を破砕することを除き、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子の場合と同様に、種子中の脂肪酸に直接的なメチル化を実施する。この方法により、脂肪酸組成分析が可能である十分な油を種子から抽出した。種子から抽出された全脂質中の脂肪酸組成を決定するため、種子を破砕し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨを用いて脂質を抽出した。抽出された脂質のアリコートをメチル化して、ＧＣにより分析した。カノーラのプールされた種子全体の脂質含有量（種子油含有量）は、破砕後の既知重量の乾燥種子からＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨを用いて脂質を２回抽出した後、この脂質のアリコートを内部標準物質である１７：０脂肪酸とともにメチル化することにより測定した。Ｃａｍｅｌｉｎａの場合、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの油分析と同様、既知量の種子からの脂質を既知量の１７：０脂肪酸とともにメチル化して、ＦＡＭＥをＧＣにより分析した。ＴＡＧ定量化のため、１７：０のＴＡＧを内部標準物質として使用し、ＴＬＣを用いて抽出された脂質からＴＡＧを分画し、シリカ中で直接メチル化した。この方法を以下で詳細に説明する。
植物が成熟した時点で採取後、Ｃａｍｅｌｉｎａまたはカノーラ種子を、乾燥剤としてシリカゲルを含むデシケーター中に室温で２４時間種子を保存することにより、乾燥させた。種子の含水量は通常、６〜８％であった。Ｒｅｉｃｈｔ組織破砕機（２２回／秒、３分間）及び金属球を用いて、エッペンドルフ管中で、クロロホルムとメタノール（２／１ｖ／ｖ）の混合物を使用して種子を破砕することにより、既知重量の乾燥種子から総脂質を抽出した。１体積の０．１Ｍ ＫＣｌを添加し、混合物を１０分間、振盪させた。混合物を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、非極性の下相を回収した。残りの上相（水性）を２体積のクロロホルムと、１０分間、混合することにより洗浄した。第２の非極性相も回収して、第１のものとともにプールした。窒素フロー下で、抽出物中の脂質から溶媒を蒸発させ、総乾燥脂質を既知量のクロロホルム中に溶解させた。
抽出物中の脂質量を測定するために、既知量の１７：０−ＴＡＧを内部標準物質として添加し、既知量の種子由来の脂質を１ＮメタノールＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）中で、２時間、８０℃でインキュベートした。このようにして得たＦＡＭＥをヘキサン中で抽出し、ＧＣにより分析した。個々のＦＡＭＥを１７：０ＴＡＧ−ＦＡＭＥ量に基づいて定量化した。ＦＡＭＥからエステル化メチル基の重量を差し引いた後の個々のＦＡＭＥ重量を、個々のＦＡＭＥの分子量で割ることにより、モル換算した。すべてのＦＡＭＥの総モルを３で割り、ＴＡＧとのモル、更にその結果からグリセロールのモルを算出した。次いで、ＴＡＧのモルをＴＡＧの重量に換算した。最後に、種子重量基準での油含有比率を、種子重量を用いて算出した。油含有量の算出を目的とする場合、抽出された脂質のすべてがＴＡＧまたはＴＡＧに相当するものであることを前提とした。この方法はＬｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）に基づいた。Ｃａｍｅｌｉｎａまたはカノーラ種子以外の、サイズが類似する種子もまた、この方法で分析することができる。
カノーラ及び他の種子油含有量は、実施例１４に記載のように、パルス波式ＮＭＳ １００ Ｍｉｎｉｓｐｅｃ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｐｔｙ Ｌｔｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による核磁気共鳴法（Ｒｏｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，１９９１）によっても測定した。ＮＭＲ法により、含水量を同時に測定した。種子油含有量は、例えば、ＮＩＲＳｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ５０００モノクロメーター等を使用して、近赤外（ＮＩＲ）分光法によって測定することもできる。含水量はまた、種子のバッチ由来のサンプルで、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）に従って、約１００℃で１８時間、サンプル中の種子を乾燥させることにより測定することもできる。
葉溶解物アッセイからの脂質の分析
溶解物アッセイによる脂質をクロロホルム：メタノール：０．１Ｍ ＫＣｌ（２：１：１）を使用して抽出し、回収した。サンプル中の異なる脂質クラスを、１０％のホウ酸を含浸させたＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（Ｍｅｒｃｋ、Ｄｅｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で分離した。脂質抽出物からＴＡＧを分画するために使用した溶媒系は、クロロホルム／アセトン（９０／１０ｖ／ｖ）であった。個々の脂質クラスを、プレートをヨウ素蒸気に露出することによって視覚化し、同じＴＬＣプレート上で正規標準物質を並列に移動させることによって特定した。プレートを蛍光体撮像スクリーンに一晩露出して、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ＦＬＡ−５０００ホスホイメージャーによって解析した後、液体シンチレーション計数法でＤＰＭを定量化した。
生育組織からの総脂質の単離及び脂質の分画化
葉及び他の生育組織サンプル中の総脂質の脂肪酸組成を、凍結乾燥させたサンプル中での脂肪酸の直接メチル化により決定した。総脂質定量化のために、１７：０のＦＦＡを加えた、既知重量の凍結乾燥させたサンプル中の脂肪酸を直接メチル化した。葉サンプル中の総ＴＡＧレベルを決定するために、抽出された総脂質からＴＬＣによってＴＡＧを分画し、１７：０のＴＡＧ内部標準物質の存在下でメチル化した。これは、葉に相当量の極性脂質が存在するためである。これは以下のように実施した。葉サンプルを含む組織を凍結乾燥させ、計量し（乾重量）、Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ（１９５９）に記載のように、または溶媒としてクロロホルム：メタノール：０．１Ｍ ＫＣｌ（ＣＭＫ；２：１：１）を用いることにより総脂質を抽出した。凍結乾燥後、クロロホルム／メタノール（２／１ｖ／ｖ）混合物を、葉サンプル１ｃｍ直径当たり９００μＬで添加することにより、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉サンプルから総脂質を抽出した。ＴＬＣ−ＦＩＤ分析を実施した場合、葉乾重量０．５ｍｇ当たり０．８μｇのＤＡＧＥを内部標準物質として添加した。サンプルをＩＫＡ ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ組織破砕機を用いてホモジナイズした後、５００μＬの０．１Ｍ ＫＣｌを添加した。サンプルをボルテックスして、５分間遠心分離し、下相を回収した。残りの上相は、６００μＬのクロロホルムを添加し、ボルテックスして５分間遠心分離することにより、２回目の抽出をした。下相を回収し、先の回収物へプールした。脂質を窒素フロー下で乾燥させ、葉乾重量ｍｇ当たり２μＬのクロロホルムで再懸濁した。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍの葉または葉サンプルの総脂質を、一部変更を加えて、上述のように抽出した。４または６枚の葉片（各々の表面積が約１ｃｍ２）を組み合わせた場合、１．６ｍＬのＣＭＫ溶媒を使用し、一方、３枚以下の葉片を組み合わせた場合、１．２ｍＬのＣＭＫを使用した。凍結乾燥させた葉組織を、Ｒｅｉｃｈｔ組織破砕機（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して３分間、２０回／秒で、金属球を含むエッペンドルフ管内でホモジナイズした。
ＴＬＣ及びメチル基転移による中性脂質の分離
既知体積の葉抽出物全体（例えば、３０μＬ）を、ＴＬＣシリカゲル６０プレート（１ｘ２０ｃｍ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に載せた。中性脂質を種類別に分画し、ヘキサン／ＤＥＥ／酢酸（７０／３０／１ｖ／ｖ／ｖ）溶媒系を含む平衡化した展開槽内でＴＬＣにより極性脂質から分離した。プリムリンを噴霧してＴＡＧのバンドを視覚化し、紫外線下でマークして、ＴＬＣプレートから掻き取り、２ｍＬのＧＣバイアルへと移し、Ｎ２で乾燥させた。各サンプルのＴＡＧ量に応じた、既知量の内部標準物質Ｃ１７：０ＴＡＧとともに、７５０μＬの１ＮメタノールＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、ＵＳＡ）を各バイアルに添加した。通常、低ＴＡＧのサンプルには３０μｇの内部標準物質を添加し、対して高ＴＡＧのサンプルの場合は、最大２００μｇの内部標準物質を使用した。
ＧＣによる脂肪酸組成分析のための脂質サンプルを、メタノールＨＣｌの存在下で、２時間、８０℃で混合物をインキュベートすることによりメチル基転移させた。サンプルを室温にまで冷却した後、３５０μＬのＨ２Ｏを添加することにより反応を停止させた。３５０μＬのヘキサンを添加し、ボルテックスし、及び１７００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、混合物から脂肪酸アシルメチルエステル（ＦＡＭＥ）を抽出した。上のヘキサン相を回収し、３００μＬの円錐インサートを有するＧＣバイアルへと移した。蒸発後、サンプルを３０μＬのヘキサン中に再懸濁した。１μＬをＧＣへと注入した。
脂質画分中に存在する個々の脂肪酸及び総脂肪酸（ＴＦＡ）の量を、ＧＣにより各ピーク面積を測定して定量化し、既知量の内部標準物質に対するピーク面積との比較により算出した。葉のＴＡＧ含有量は、次の比率式を使用してＴＡＧ画分中のグリセロール及び脂肪酸アシル部分の総和として算出した：ＴＡＧ重量％＝１００ｘ（（４１ｘ総モルＦＡＭＥ／３）＋（総ｇＦＡＭＥ−（１５ｘ総モルＦＡＭＥ）））／ｇ葉乾重量（ここで、４１及び１５は、それぞれグリセロール部分及びメチル基の分子量である）。
キャピラリーガス−液体クロマトグラフィー（ＧＣ）
ＳＧＥ ＢＰＸ７０（７０％シアノプロピルポリシルフェニレン−シロキサン）カラム（３０ｍｘ０．２５μｍ内径、フィルム厚０．２５μｍ）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレスインジェクター及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ７６９３ Ｓｅｒｉｅｓオートサンプラー兼インジェクターを備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ７８９０Ａ ＧＣ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、ＦＡＭＥをＧＣにより分析した。キャリアガスとしてヘリウムを使用した。サンプルは、スプリットモード（スプリット比５０：１）で、オーブン温度１５０℃で注入した。注入後、オーブンの温度を１分間、１５０℃に維持し、次いで３℃／ｍｉｎ−１で２１０℃まで上げ、最終的に５０℃／ｍｉｎ−１で２４０℃まで上げた。既知量の外部標準物質ＧＬＣ−４１１（Ｎｕｃｈｅｃｋ）及びＣ１７：０−Ｍｅ内部標準物質の応答に基づいて、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ Ｂ．０４．０３（１６）、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）でピークを定量化した。
ＩａｔｒｏｓｃａｎによるＴＡＧの定量
１μＬの脂質抽出物を、ＴＬＣ−ＦＩＤ Ｉａｔｒｏｓｃａｎ（商標）（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｄｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ−Ｊａｐａｎ）用のＣｈｒｏｍａｒｏｄ−ＳＩＩの１本に載せた。次に、Ｃｈｒｏｍａｒｏｄのラックを７０ｍＬのヘキサン／ＣＨＣｌ３／２−プロパノール／ギ酸（８５／１０．７１６／０．５６７／０．０５６７ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）溶媒系を含む平衡化した展開槽へと移した。３０分のインキュベーション後、Ｃｈｒｏｍａｒｏｄラックを１００℃で３分間、乾燥させ、Ｉａｔｒｏｓｃａｎ ＭＫ−６ｓ ＴＬＣ−ＦＩＤ分析器（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｄｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ−Ｊａｐａｎ）上で直ちにスキャンした。ＤＡＧＥ内部標準物質及びＴＡＧのピーク面積を、ＳＩＣ−４８０ＩＩ積分ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ：７．０−Ｅ ＳＩＣ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．，ＬＴＤ−Ｊａｐａｎ）を使用して積分した。
ＴＡＧの定量化を２つのステップで実施した。最初に、全サンプル中のＤＡＧＥをスキャンして抽出収率を補正した後、濃縮ＴＡＧサンプルを選択して希釈した。次に、外部標準物質としてグリセリルトリリノレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた外部キャリブレーションに従って、第２のスキャンで希釈サンプル中のＴＡＧを定量化した。
ＧＣによる葉サンプル中のＴＡＧの定量化
最初に、市販の標準物質ＧＬＣ−４１１（ＮＵ−ＣＨＥＫ ＰＲＥＰ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）中に存在する既知量の同じＦＡＭＥのピーク面積応答に基づいて、個々のＦＡＭＥのピーク面積を補正した。補正した面積を用いて、内部標準物質と比較することにより、サンプル中の各ＦＡＭＥの質量を算出した。油は主にＴＡＧの形態で貯蔵されているため、油の量は各サンプル中のＦＡＭＥの量に基づいて算出した。グリセロールの総モルは、ＦＡＭＥのモル数を算出し、ＦＡＭＥの総モルを３で割ることにより決定した。ＴＡＧ量は、次式を使用してグリセロール及び脂肪酸アシル部分の総和として算出した：油重量％＝１００ｘ（（４１ｘ総モルＦＡＭＥ／３）＋（総ｇＦＡＭＥ−（１５ｘ総モルＦＡＭＥ）））／ｇ葉乾重量（ここで、４１及び１５は、それぞれグリセロール部分及びメチル基の分子量である）。
実施例２．Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの生育部分での脂質含有量の増加
遺伝子構築物ｐＪＰ３５０２を使用して、ＷＯ２０１３／０９６９９３のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍに関する記載のように、アグロバクテリウム媒介性の形質転換プロトコルによって、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの安定的な形質転換植物を産生した。カナマイシン耐性によりトランスジェニック植物を選抜し、温室で成熟するまで生長させた。葉サンプルを結実時に採取し、凍結乾燥した。Ｂｌｉｇｈ及びＤｙｅｒ（１９５９）によるサンプルからの総脂質の抽出に従った総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量（乾質量％）及び組成、ならびにトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）画分の含有量及び組成を決定した。データを表２及び表３に示す。最も油量の多い葉サンプルは、３３重量％のＴＦＡ含有量を有したトランスジェニック植物＃１６由来であった。このサンプルは、２２．５重量％（乾重量）のＴＡＧを含有していた。
脂肪酸組成と、ＴＦＡまたはＴＡＧの含有量の変化に強い相関性が見られた。オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ−９）は、ＴＦＡ及びＴＡＧの含有量の増加とともに増加し、その結果、オレイン酸は高ＴＡＧ含有量を有する葉において優勢な脂肪酸であった。例えば、最も高いＴＡＧ含有量を有する葉においてＴＦＡの６６．８％及びＴＡＧ脂肪酸の６６．９％を占めた。他の脂肪酸に関して、類似の相関が見られた。例えば、最も高いＴＡＧ含有量を有する葉において、ＡＬＡレベルはＴＦＡの４．９％及びＴＡＧの３．９％に減少していた。Ｃ１６：３レベルと、ＴＦＡ及びＴＡＧ両方の含有量との間にも強い相関性が見られ、Ｃ１６：３はＴＦＡ及びＴＡＧの高いサンプルにおいて実質的に減少していた。
高油糧植物のうちの２つ（＃１４及び＃１６）は、葉が黄変を開始した頃の葉の老化段階期間についても分析した（表４及び表５）。最も高いサンプルの総脂肪酸含有量にほとんど変化はなかったが（３２．９％対３３％）、ＴＡＧの量は３２．６％に増加した。これらのサンプルでは、ＴＡＧが葉脂質のほぼすべてを占めた。
表２．構築物ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡによって安定的に形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の葉における総脂肪酸（ＴＦＡ）組成及び量（乾重量％）。サンプルは０．１〜０．３％のＣ１４：０及び０．０〜０．７％のＣ２０：１も含有した
Figure 0006882160
表３．構築物ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡによって安定的に形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の葉におけるＴＡＧの脂肪酸組成及び量（乾重量％）。サンプルは０．１〜０．３％のＣ１４：０及び０．０〜０．７％のＣ２０：１も含有した
Figure 0006882160
表４．構築物ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡによって安定的に形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物由来の葉における葉の黄変段階での総脂肪酸（ＴＦＡ）組成及び量（乾重量％）。サンプルは０．１〜０．３％のＣ１４：０及び０．０〜０．７％のＣ２０：１も含有した
Figure 0006882160
表５．構築物ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡによって安定的に形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の葉における葉の黄変段階でのＴＡＧの脂肪酸組成及び量（乾重量％）。サンプルは０．１〜０．３％のＣ１４：０及び０．０〜０．７％のＣ２０：１も含有した
Figure 0006882160
実施例３：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの生育植物部分での脂質含有量の増加
従来どおり構築物ｐＪＰ３５０２を使用して、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍを形質転換した（ＷＯ２０１３／０９６９９３）。ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡによって形質転換されたホモ接合性Ｔ１植物から得た、高いＴＦＡ及びＴＡＧ含有量を有する種子を採取して播種し、導入遺伝子に対して均一なホモ接合性である新たな世代のＴ２子孫植物を確立した。植物の成熟葉が、野外での生長時に生じるような通常の樹冠構成で重なり合っている（「樹冠（ｃａｎｏｐｙ）」）か、または直射日光に最大限露出されるように（「非樹冠（ｎｏｎ−ｃａｎｏｐｙ）」）、ポットを温室内に配置した。完全に生長した結実段階の葉サンプルを各植物から採集して、凍結乾燥した。Ｂｌｉｇｈ及びＤｙｅｒ（１９５９）によるサンプルからの総脂質の抽出に従って、ＴＡＧ画分の脂肪酸含有量を決定した（表６）。非樹冠の植物からの成熟葉組織のＴＡＧレベルは通常、樹冠植物のものよりも高く、観察された葉のうち最大のＴＡＧ含有量は葉乾重量の２０．６％であった。
表６．野生型（ｗｔ）と比較した、ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡによって形質転換されたＴ２トランスジェニック子孫植物（系統４９）の成熟葉組織におけるＴＡＧ含有量（乾重量％）。
Figure 0006882160
実施例４．単子葉植物の生育部分での含油量の増加
トランスジェニック植物で、ＷＲＩ１、Ｚ．ｍａｙｓ ＬＥＣ１（アクセッション番号ＡＡＫ９５５６２；配列番号１５５）、ＤＧＡＴ及びオレオシンをコードする遺伝子の組み合わせを発現させることにより、単子葉植物（例えばＣ４植物Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ（モロコシ））の含油量を増加させるようにキメラＤＮＡ構築物を設計した。バイオリスティック共形質転換のための数対の構築物を設計し、以下の通り、制限酵素ライゲーションによりクローニングして作製した。
遺伝子構築物ｐＯＩＬ１３６は、３つの単子葉植物発現カセット、すなわち、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードする植物選択のための選択マーカー遺伝子、ＤＧＡＴを発現させるための第２のカセット及びオレオシンを発現させるための第３のカセットを含有するバイナリーベクターであった。ｐＪＰ１３６を作製するため、最初に、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０）からのアクチン遺伝子プロモーターを増幅して、それを平滑化ＣｌａＩ断片としてｐＯＲＥ０４（Ｃｏｕｔｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）に挿入し、ｐＯＩＬ０９４を作製した。次に、単子葉植物の発現にコドンを最適化したＳｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ種のオレオシン遺伝子をｐＯＩＬ０９４のＫｐｎＩ部位に挿入することにより、ｐＯＩＬ０９５を作製した。単子葉植物にコドンを最適化したＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｒａｍａｎｎｉａｎａ種のＤＧＡＴ２ａ遺伝子（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）をＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片として、既にＺｅａ ｍａｙｓのユビキチン遺伝子プロモーターを含んでいるベクターにクローニングすることにより、ｐＯＩＬ０９３を作製した。ＮｏｔＩ ＤＧＡＴ２ａ発現カセットをｐＯＩＬ０９３からｐＯＩＬ０９５のＮｏｔＩ部位にクローニングすることにより、ｐＯＩＬ１３４を作製した。ＰＡＴをコードする選択マーカー遺伝子をＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片として、Ｚ．ｍａｙｓのユビキチンプロモーターを含有するベクターに挿入することにより、ｐＯＩＬ１４１を作製した。最後に、Ｚ．ｍａｙｓユビキチン：：ＰＡＴ発現カセットを平滑化ＡｓｃＩ断片として、ｐＯＩＬ０９６のＺｒａＩ−ＡｓｃＩにクローニングすることにより、ｐＯＩＬ１３６を作製した。したがって、遺伝子構築物ｐＯＩＬ１３６は、次の発現カセットを含有した：プロモーターＯ．ｓａｔｉｖａアクチン：：Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍオレオシン、プロモーターＺ．ｍａｙｓユビキチン：：Ｕ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ ＤＧＡＴ２ａ及びプロモーターＺ．ｍａｙｓユビキチン：：ＰＡＴ。
ＰＡＴの代わりにＮＰＴＩＩを含有している、類似するベクターｐＯＩＬ１９７を、ｐＵＫＮからのＺ．ｍａｙｓユビキチン：：ＮＰＴＩＩカセットをＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ断片としてｐＪＰ３３４３のＡｓｃＩ（平滑化）部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングすることにより構築した。得られたベクターｐＯＩＬ１９６を、次にＨｉｎｄＩＩＩ（平滑化）及びＡｇｅＩで消化した。得られた３３５８ｂｐの断片をｐＯＩＬ１３４のＺｒａＩ−ＡｇｅＩ部位にクローニングして、ｐＯＩＬ１９７を得た。
ｐＯＩＬ１３６と組み合わせたバイオリスティック共形質転換のため、異なるプロモーターの制御下にあるＺ．ｍａｙｓのＷＲＩ１（ＺｍＷＲＩ）またはＬＥＣ１（ＺｍＬＥＣ１）転写因子をコードする遺伝子を含む構築物のセットを設計して作製し、Ｃ４植物（例えばモロコシ）の生育組織に発現したときに、ＷＲＩ１若しくはＬＥＣ１、または組み合わせの場合はその両方の機能に及ぼすプロモーター強度及び細胞特異性の効果を試験した。この個別の構築物セットは、ｐＯＩＬ３３３が選択マーカーとしてＮＰＴＩＩを含有した以外は、選択マーカー遺伝子を含まなかった。試験された種々のプロモーターは以下の通りである。Ｚ．ｍａｙｓユビキチン遺伝子プロモーター（ｐＺｍＵｂｉ）が単子葉植物の強い構成的プロモーターであったのに対して、重複エンハンサー領域を有する増強されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（ｅ３５Ｓ）は、結果的に導入遺伝子の発現レベルを低下させることが報告された（Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ及びＳｗａｔｈｉｓｒｅｅ（２００９）に概説）。Ｚ．ｍａｙｓのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐＺｍＰＥＰＣ）遺伝子プロモーターが、Ｃ４植物種の光合成部位である葉肉細胞（Ｍａｔｓｕｏｋａ ａｎｄ Ｍｉｎａｍｉ、１９８９）で活性であったのに対して、Ｚ．ｍａｙｓのＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニット（ｐＺｍＳＳＵ）遺伝子プロモーターは、Ｃ４植物において炭素固定が行われる細胞である維管束鞘細胞層に対して特異的であった（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｌｅｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
ＳＥＥ１システインプロテアーゼをコードするＺ．ｍａｙｓ遺伝子（アクセッション番号ＡＪ４９４９８２）の発現は、植物成長期間のＡ．ｔｈａｌｉａｎａのＳＡＧ１２老化特異的プロモーターの場合と同様であることが同定された。したがって、ＳＥＥ１遺伝子（配列番号２１６）由来の１９７０ｂｐプロモーターも、Ｚ．ｍａｙｓのＷＲＩ１及びＬＥＣ１転写因子をコードする遺伝子発現を誘導するために選択した。更に、Ａｅｌｕｒｏｐｕｓ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓのジンクフィンガータンパク質ＡｌＳＡＰをコードする遺伝子由来のプロモーター（Ｂｅｎ Ｓａａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１；アクセッション番号ＤＱ８８５２１９；配列番号２１７）と、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓからのスクロース応答性ＡｒＲｏｌＣ遺伝子由来のプロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９４；アクセッション番号ＤＱ１６０１８７；配列番号２１８）も、茎組織のＺｍＷＲＩ１発現を発現させるために選択した。したがって、これらのプロモーターは各々、ＺｍＷＲＩ１またはＺｍＬＥＣ１コード領域の上流に、以下のように個々に連結された。
Ｚ．ｍａｙｓのＷＲＩ１コード配列及び転写ターミネーター／ポリアデニル化領域（ＡｓｃＩ−ＮｃｏＩ部位に隣接する）をバイナリーベクターｐＪＰ３３４３の同じ部位にクローニングすることにより、中間ベクター（ｐＯＩＬ１００）を最初に作製した。ＷＲＩ１発現のための異なる改変型の構築物はこのベクターを基にしており、種々のプロモーターをｐＯＩＬ１００にクローニングすることにより作製された。重複エンハンサー領域を有するｅ３５Ｓプロモーターを含んでいるＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片をｐＯＩＬ１００のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより、ｐＯＩＬ１０１を作製した。Ｚ．ｍａｙｓのユビキチン遺伝子プロモーターを含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｖｒＩＩ断片をｐＯＩＬ１００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位にクローニングすることにより、ｐＯＩＬ１０２を作製した。Ｚ．ｍａｙｓのＰＥＰＣ遺伝子プロモーターを含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩ断片をｐＯＩＬ１００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩ部位にクローニングすることにより、ｐＯＩＬ１０３を作製した。Ｚ．ｍａｙｓのＳＳＵ遺伝子プロモーターを含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｖｒＩＩ断片をｐＯＩＬ１００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｖｒＩＩ部位にクローニングすることにより、ｐＯＩＬ１０４を作製した。
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ固有の部位に隣接するＺ．ｍａｙｓのＳＥＥ１プロモーター領域を含んでいる合成断片を合成した。この断片は、Ｚ．ｍａｙｓのＷＲＩ１タンパク質コード領域の上流に、ｐＯＩＬ１００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位を用いてクローニングされる。得られたベクターをｐＯＩＬ３２９と称する。ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ固有の部位に隣接するＡ．ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓのＡｌＳＡＰプロモーター領域を含んでいる合成断片を合成する。この断片を、Ｚ．ｍａｙｓのＷＲＩ１コード領域の上流に、ｐＯＩＬ１００のＸｂａＩ−ＸｈｏＩ部位を用いてクローニングする。得られたベクターをｐＯＩＬ３３０と称する。ＰｓｐＯＭＩ−ＸｈｏＩ固有の部位に隣接するＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＡｒＲｏｌＣプロモーター領域を含んでいる合成断片を合成する。この断片を、Ｚ．ｍａｙｓのＷＲＩ１コード領域の上流に、ｐＯＩＬ１００のＰｓｐＯＭＩ−ＸｈｏＩ部位を用いてクローニングする。得られたベクターをｐＯＩＬ３３５と称する。最後に、Ｚ．ｍａｙｓのＳＥＥ１：：ＺｍＬＥＣ１発現カセットを含んでいるバイナリーベクター（ｐＯＩＬ３３３）を３段階で得る。最初に、ＡｖｒＩＩ及びＫｐｎＩ部位を含んでいるフランキングプライマーとともにＧＵＳコード領域を増幅することにより、３５Ｓ：：ＧＵＳ発現ベクターを構築する。その後、得られた断片をｐＪＰ３３４３のＳｐｅＩ−ＫｐｎＩ部位にクローニングする。得られたベクターをｐＴＶ１１１と称する。次に、ｐＴＶ１１１の３５Ｓプロモーター領域をＺ．ｍａｙｓのＳＥＥ１プロモーターと置換する。この目的のために、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ固有の部位を含んでいるフランキングプライマーを使用して、Ｚ．ｍａｙｓのＳＥＥ１配列を増幅する。得られた断片は、それぞれの制限酵素で切断され、ｐＴＶ１１１のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングされる。得られたベクターをｐＯＩＬ３３２と称する。次に、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶ部位を含んでいるフランキングプライマーを使用して、ＺｍＬＥＣ１コード配列を増幅する。この得られた断片をｐＯＩＬ３３２の対応する部位にサブクローニングして、ｐＯＩＬ３３３を産生する。
バイオリスティック形質転換のために、ｐＯＩＬ１０１、ｐＯＩＬ１０２、ｐＯＩＬ１０３、ｐＯＩＬ１０４、ｐＯＩＬ１９７、ｐＯＩＬ３２９、ｐＯＩＬ３３０、ｐＯＩＬ３３３及びｐＯＩＬ３３５を制限消化によりベクター主鎖から切断し、次いでゲル単離することにより、ＤＮＡを調製する。次に、ｐＯＩＬ１９７のＤＮＡをｐＯＩＬ１０１、ｐＯＩＬ１０２、ｐＯＩＬ１０３、ｐＯＩＬ１０４、ｐＯＩＬ３２９、ｐＯＩＬ３３０、ｐＯＩＬ３３３またはｐＯＩＬ３３５のＤＮＡのいずれかと混合し、バイオリスティックを媒介してＳ．ｂｉｃｏｌｏｒ外植体へと形質転換する。あるいは、遺伝子の同一組み合わせを発現するための構築物を、アグロバクテリウム媒介性の形質転換により、個別に形質転換または共形質転換する（Ｇｕｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
トランスジェニック植物を再生させ、抗生物質耐性によって選抜する。２つの構築物が同じ事象で共形質転換している場合、含油量の増加は、トランスジェニック植物の種子以外の組織に観察される。
Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）による記載のように、アグロバクテリウム媒介性の形質転換のためのキメラＤＮＡ構築物を使用して、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）を形質転換する。簡潔には、茎頂外植体をトランスジェニックアグロバクテリウムと２日間、共存培養した後、カナマイシン及びカルベニシリンを含んでいるＭＳ塩培地へと移す。数回の継代培養後、形質転換されたシュートと根が自発的に形成され、これを土壌へ移植する。この構築物を同様に使用して、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）及びＡｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（オートムギ）を、それぞれの種で知られている形質転換法を用いて形質転換する。簡潔には、オオムギの場合、アグロバクテリウム培養物を使用して、公開された方法（Ｔｉｎｇａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００８）に、長さ１．５〜２．５ｍｍの胚を未成熟の穎果から単離して、胚軸を除去する改変を一部加えて、オオムギ（栽培変種Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅ）の未成熟胚中の細胞を形質転換する。得られた外植体を、トランスジェニックアグロバクテリウムとともに２〜３日間、共存培養し、次いでｔｉｍｅｎｔｉｎ及びハイグロマイシンを含んでいる培地で暗所にて４〜６週間培養して、胚形成カルスを産生した後、２週間、低光量の条件下の移行培地へ移す。次に、カルスをシュート及び根の再生が可能である再生培地に移し、再生された小植物を土壌に移し替えた。形質転換された植物を得て、温室で成熟するまで生長させる。
実施例５．双子葉植物の含油量の増加
放牧種として一般に使用されるマメ科植物である、双子葉植物種Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｒｅｐｅｎｓ（クローバー）の含油量を、生育部分にＷＲＩ１、ＤＧＡＴ及びオレオシン遺伝子の組み合わせを発現させることにより増加させた。構築物ｐＪＰ３５０２を使用して、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によってＴ．ｒｅｐｅｎｓを形質転換した（Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。簡潔には、遺伝子構築物ｐＪＰ３５０２を、標準的なエレクトロポレーション手順によってＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに導入した。バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡ内に３５Ｓ：ＮｐｔＩＩ選択マーカー遺伝子も含有した。形質転換したアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）及びリファンピシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した固体ＬＢ培地で増殖させ、２８℃で２日間インキュベートした。単一のコロニーを使用して、新しい培養を開始した。４８時間の活発な培養の後、Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）による記載のように、吸水種子から全裂したＴ．ｒｅｐｅｎｓ（栽培変種Ｈａｉｆａ）子葉を、アグロバクテリウム細胞群を使用して処理した。３日間の共存培養の後、外植体を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンに曝露させ、形質転換されたシュートを選抜し、次いで発根培地に移して、根を形成させた後、土壌へ移した。
ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡを含んでいる６つの形質転換植物を得て、温室内の土壌に移した。いくつかの植物の種子以外の組織において含油量の増加が観察された。うち１つの植物は葉のＴＡＧレベルに４倍を超える増加を示した。このような植物は、例えば、牧草地で植物を栽培して、単位重量当たりのエネルギー含有量（エネルギー密度）の増加した飼料を与え、その結果、動物の成長速度を増加させることにより、動物の飼料として有用となる。
構築物ｐＪＰ３５０２は、生育部分のＴＡＧ含有量の増加したトランスジェニック植物を得るために、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）の方法によるアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）及びｂａｒｒｅｌ ｍｅｄｉｃ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）等の他のマメ科植物の形質転換にも使用される。３つの推定トランスジェニックＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ植物を得た。トランスジェニック植物は、放牧種として、または動物（例えばウシ、ヒツジ及びウマ等）のための飼料源としての干し草またはサイレージとして有用であり、飼料中のエネルギー密度の増加をもたらす。
マメ科種子の含油量を増加させるために、２つのキメラ遺伝子、すなわち、（ａ）Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓベータ型ファゼオリン貯蔵タンパク質プロモーター及び５’ＵＴＲから発現させたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１をコードする第１のキメラ遺伝子に加え、（ｂ）Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍビシリンプロモーター及び５’ＵＴＲから発現させたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１をコードする第２のキメラ遺伝子の組み合わせを含んでいるＤＮＡ断片を合成した。オレオシンをコードするキメラ遺伝子を含んでいるバイナリーベクターｐＯＲＥ０４にこのＤＮＡ断片を挿入し、３つのキメラ遺伝子と選択マーカー遺伝子を含むＴ−ＤＮＡ構築物を産生した（図２）。これを、Ｐｉｇｅａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）により記載された方法によってＬｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（別のマメ科植物）の形質転換に使用した。簡潔には、Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓの茎頂外植体をトランスジェニックアグロバクテリウムとともに共存培養した後、カナマイシン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）に完全に湿潤させ、カナマイシン非含有の再生培地に移した。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む培地上の、茎頂から発達している複数の腋芽を切り取り、残存するシュートを５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む新しい培地に移した。その後、健全なシュートを土壌に移した。Ｔ−ＤＮＡ上の遺伝子が、形質転換植物の細胞に発現し、生育組織及び種子の含油量が増加する。Ｌｕｐｉｎｕｓのトランスジェニック種子の含油量を増加させるために、ＷＲＩ１遺伝子を誘導する種子特異的プロモーターも使用する。
この構築物は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）による記載のようにＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘを形質転換し、種子のＴＡＧ含有量を増加させたトランスジェニックダイズ植物を得るためにも使用した。植物のサンプルから得たＤＮＡに対するＰＣＲによって示されているトランスジェニック植物を得た。植物を成熟するまで生長させ、種子を採取した。非破壊ＮＭＲによって測定されたように、種子の含油量が増加することが見込まれる。
３つの遺伝子発現カセットを含むＤＮＡインサートを合成することにより、ルピナス及びダイズの種子油含有量を増加させるための第２の遺伝子構築物を構築した。３つの遺伝子発現カセットとは、すなわちＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｒａｍａｎｎｉａｎａのＤＧＡＴ２Ａを発現するＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのβ−コングリシニンプロモーターを有する第１の遺伝子発現カセット、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１を発現するＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのＫＴｉ３プロモーターを有する第２の遺伝子発現カセット、及びＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓのＭＧＡＴ２を発現するＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘのβ−コングリシニンプロモーターを有する第３の遺伝子発現カセットである。このインサートのＳｂｆＩ−ＰｓｔＩ断片を、バイナリーベクターｐＯＲＥ０４のＰｓｔＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３５６９を得た。より小さいＳｂｆＩ−ＳｗａＩ断片をｐＯＲＥ０４のＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ部位にクローニングすることにより、ＭＧＡＴ２遺伝子のない変形型を作製し、ｐＪＰ３５７０を得た。ＷＲＩ１遺伝子のみ、及びＤＧＡＴ２Ａ遺伝子のみを含んでいる変形型も同様に得た。これらのバイナリーベクターを使用して、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘを形質転換し、トランスジェニック種子を産生した。種子を播種してＴ２種子を産生する前に、主要な形質転換体からの種子の含油量を、非破壊ＮＭＲによって分析する。
ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ２Ａ発現カセットをＰＣＲにより増幅して、ＮｏｔＩ制限部位と適合する単一のアンプリコンにすることにより、ルピナスの形質転換に好適なｐＪＰ３５６９の変形型を作製する。ＮｏｔＩ断片をｐＪＰ３４１６のＰｓｐＯＭＩ部位にクローニングして、バイナリーベクターがＰＡＴ選択マーカー遺伝子を含むｐＪＰ３６７８を得る。
実施例６．カノーラの生育部分での含油量を増加させる実験
種子及び／または生育組織のＴＡＧ蓄積に対する効果を調査するために、２つのバイナリー発現ベクターを使用して、Ｂ．ｎａｐｕｓ（栽培変種Ｏｓｃａｒ）を形質転換した。最初に、コドンを最適化したＡ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１タンパク質コード配列を空の３５Ｓ発現カセットを含んだバイナリーベクター３５Ｓ−ｐＯＲＥ０４に挿入することによって、プラスミドｐＪＰ３４１４を構築した。したがってｐＪＰ３４１４のＴ−ＤＮＡは、３５Ｓ構成的プロモーターの制御下にある、コドンを最適化した変形型のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１転写因子含んでいる。実施例１に記載するように、ｐＪＰ３４１４で形質転換した１１本の個別に形質転換されたＢ．ｎａｐｕｓ Ｔ０苗からの葉組織は各々、空のベクター（ｐＯＲＥ０４）で形質転換された植物と比較して、高いＴＡＧレベルを含有した。しかしながら、いかなる場合でもＴＡＧのレベルは１％を超えなかった。最大レベルを検出したのは系統３１で、乾重量基準で最大０．５８％のＴＡＧを含有した。Ｔ１トランスジェニック種子の含油量は、野生型（Ｏｓｃａｒ）及び空のベクターの対照種子と比較して有意に上昇しなかった。葉組織に最も高いＴＡＧレベルを呈する３つの系統のＴ１種子を、３％のスクロースを含有するＭＳ培地で発芽させた。未形質転換の対照（Ｏｓｃａｒ）と比較したとき、５日後及び８日後の発芽に差は観察されなかった。
Ｂ．ｎａｐｕｓ生育組織のＴＡＧレベルを更に上昇させる試みとして、第２のベクターであるｐＪＰ３５０２（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を使用して、Ｂ．ｎａｐｕｓ（栽培変種Ｏｓｃａｒ）を形質転換した。開花前に採取したトランスジェニック葉において、ＴＡＧレベルを定量化した。しかしながら、ＴＡＧ含有量が更に増加することはなく、脂肪酸組成はこの成長段階にある未形質転換の対照植物と差はなかった。
葉でのＴＡＧ含有量が１％未満であったという、本実施例に記載したＢ．ｎａｐｕｓに関する観察は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種に関して実施例２及び３で報告された、約２０〜３０％のＴＡＧを示すという結果とは著しく対照的であった。発明者らはこれらの観察を網羅的に考察し、種間での相違を解明することにした。種間でいくつかの相違が確認された。発明者らが本質的な相違を生むと見なした１つの相違点は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓがいわゆる１６：３種であるのに対して、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種がいわゆる１８：３種であることであった。これは、色素体脂質合成（図１）のためのいわゆる原核型経路及び真核型経路の相対的寄与、ひいては、発明者らの考察によればＴＡＧ合成に利用可能なＤＡＧ量と関連する。このことから発明者らは、例えば１８：３と比較して１６：３の蓄積を減少させることにより、原核型経路に対する、真核型経路を経た脂肪酸合成の比率を改変すると、植物細胞または光合成微生物の細胞に蓄積するＴＡＧレベルが変化するというモデルを考察した。真核型経路が優勢になるように均衡を傾けた、このような改変が、特にいわゆる１６：３植物のＴＡＧ蓄積レベルにとって有利になると予測した。要約すると、「１６：３」細胞を「１８：３」細胞」に類するものへ転換することである。
発明者らは、１６：３植物内では、原核型経路により色素体内で脂肪酸が合成及び保持されるため、フィードバック阻害によってＡＣＣａｓｅを阻害する色素体中のＣ１８：１−ＡＣＰの存在が強くなり得るという仮説を立てた。対照的に、Ｃ１８：３植物は、真核型経路へ供給される色素体からのＣ１８：１の移出が増加することにより、生育組織でより高レベルのＴＡＧを蓄積できるという仮説を立てた本明細書の実施例２〜４に示すように、このことは、例えば、色素体脂質中に低レベルのＣ１８：３を有するＢ．ｎａｐｕｓ等の種と比較して、高いＣ１８：３／Ｃ１６：３色素体脂質比を有するＮ．ｔａｂａｃｕｍ及びＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ等の種に観察された。このモデルは、発明者らの仮説によれば、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ及びＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ両方への、ベクターｐＪＰ３５０２由来のＷＲＩ＋ＤＧＡＴ＋オレオシン発現遺伝子の安定的な形質転換の結果、高レベルのＴＡＧ蓄積と、脂肪酸組成の広範な変化が生じる理由を説明している。対照的に、同じベクターのＢ．ｎａｐｕｓへの形質転換では、ＴＡＧ蓄積の軽微な増加と、脂肪酸組成のわずかな変化しか生じなかった。このモデルを後述のように検討した。
実施例７．色素体ＧＰＡＴ発現の改変
植物細胞中の色素体ＧＰＡＴの過剰発現
多数の実験を実施し、植物（すなわちいわゆる１６：３植物）に高活性の１６：３原核型経路が存在すると、ｐＪＰ３５０２上への遺伝子組み合わせの導入時に、１８：３植物と比較して、はるかに低レベルのＴＡＧを生育組織中にもたらすという仮説を検証した。以下の実施例でこの実験について説明する。最初に発明者らは、トランスジェニックＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに観察される高レベルのＴＡＧ蓄積が、原核型経路へのフラックスを増加させる色素体ＧＰＡＴの過剰発現によって妨害され得るかどうかを試験した。
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＧＰＡＴを発現するコード領域ＡＴＳ１（Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）をＲＴ−ＰＣＲによってＡ．ｔｈａｌｉａｎａの全ＲＮＡから増幅し、３５Ｓプロモーターの制御下でＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片としてバイナリー発現ベクターｐＪＰ３３４３にクローニングし、構成的発現ベクターｐＯＩＬ０９８を得た。高油量の葉の環境での色素体ＧＰＡＴの過剰発現の効果を、キメラベクターｐＯＩＬ０９８を高油量の葉組織に浸潤させることにより判定した。ＷＲＩ１及びＤＧＡＴのバイナリー発現ベクターの共浸潤（実施例１）によって、またはｐＪＰ３５０２若しくは別の高油量のベクター由来のＴ−ＤＮＡで安定的に形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ植物の葉にｐＯＩＬ０９８を浸潤させることのいずれかによって、高油量の葉組織を産生する。含油量は、ＡＴＳ１をコードする遺伝子を共発現している浸潤した葉斑点で減少すると予測される。これは、ＴＦＡ及びＴＡＧをサンプルの乾質量比として分析することにより求める。これは、浸潤した葉斑点から作製されたミクロソームまたは葉溶解物によって産生される脂肪酸への標識した酢酸の取り込みを観察することによっても決定される。
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＧＰＡＴ突然変異体中の油蓄積
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのａｔｓ１突然変異体は、色素体ＧＰＡＴをコードする遺伝子の分裂変異を有し、これにより色素体ＧＰＡＴ活性が野生型のわずか３．８％のレベルに減少する（Ｋｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの親とａｔｓ１突然変異体の両方において、種子以外、少なくとも葉、茎及び根のＴＡＧ蓄積レベルを試験して比較する。ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ及びオレオシンをコードする遺伝子の組み合わせを過剰発現させるｐＪＰ３５０２構築物のＴ−ＤＮＡを、形質転換によって両方の遺伝子型の植物に導入する。ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡ内の遺伝子組み合わせは、両方の植物環境での脂肪酸合成を増加させる。しかしながら、ａｔｓ１突然変異体でのＴＡＧの蓄積は、色素体ＧＰＡＴ活性の低下及びそれによる色素体原核型経路への脂肪酸のフラックスの減少によって、野生型（親）遺伝子型から誘導されたトランスジェニック植物よりも、平均して有意に高くなると予測される。Ｃ１８：３に対するＣ１６：３の脂肪酸比は、ａｔｓ１突然変異体の葉では、形質転換及び非形質転換いずれの場合でも有意に減少する。
植物細胞での色素体ＧＰＡＴをコードする遺伝子のサイレンシング
色素体ＧＰＡＴをコードする遺伝子に突然変異を導入することにより、植物を遺伝的に改変することに加えて、色素体ＧＰＡＴのサイレンシングによって、１６：３の原核型経路を経由する脂肪酸のフラックスを減少させ、それによって生育部分の含油量を増加させることができる。選択された種由来の色素体ＧＰＡＴをコードする遺伝子の領域に対応するＲＮＡヘアピンを発現する構成的または葉特異的プロモーターを有するトランスジェニックカセットを作製することにより、これを実証する。一例として、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＧＰＡＴのｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿１７９４０７、配列番号１７７）の５８１ｂｐ ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＶ断片を使用して、ＲＮＡｉヘアピン発現カセットを作製する。色素体ＧＰＡＴをコードする遺伝子の領域が、ＮＭ＿１７９４０７のヌクレオチド配列と高度な配列同一性を有していれば、内因性の色素体ＧＰＡＴ遺伝子をサイレンシングするためのヘアピンＲＮＡを発現させる遺伝子の構築にも、この領域を使用することができる。ＳｍａＩ及びＫａｓＩ固有の部位が隣接する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの色素体ＧＰＡＴの７３２ｂｐの断片（配列番号２１９）を含んでいるｈｐＲＮＡｉ構築物を、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍに安定的に形質転換されるように設計した。合成されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの色素体ＧＰＡＴ断片を、ｐＪＰ３３０３のＳｍａＩ−ＫａｓＩ部位にサブクローニングし、ｐＯＩＬ１１３を得た。色素体脂肪酸の保持が減少すると、特に、ＷＲＩ１等の転写因子の過剰発現のような「プッシュ型」要素と組み合わせたとき、またはＤＧＡＴ若しくはＰＤＡＴ等の「プル型」要素によって、ＴＡＧ蓄積の増加及び／またはＳＤＰ１若しくはＴＧＤ活性の減少が生じることが予測される。
色素体ＧＰＡＴをコードする遺伝子または事実上いかなる遺伝子の失活も、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用して達成することができる。例えば、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＧＰＡＴをコードする遺伝子（アクセッション番号ＮＭ＿１７９４０７）の失活を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡを媒介した遺伝子切断及び後続の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復による突然変異誘発によって実施することができる。標的ＤＮＡの切断前に、Ｃａｓ９によりＤＮＡ鎖分離が刺激され、ｓｇＲＮＡによる標的遺伝子内の特定の２０ｎｔ配列とのハイブリダイズが可能となる。これにより、ＰＡＭ（直列グアノシンヌクレオチド）結合部位に対して適切な方向で標的ＤＮＡをＣａｓ９の活性部位へと配置する。この位置決定によって、Ｃａｓ９の個々のヌクレアーゼドメインが、ＰＡＭ部位の３−ｎｔ上流位で標的ＤＮＡ配列の各鎖を個別に切断することができる。次に、二本鎖切断を経て、エラーが発生しやすいＮＨＥＪによるＤＮＡ修復が行われ、この間にいくつかのヌクレオチドの欠失または挿入が生じ、その結果、色素体ＧＰＡＴ遺伝子が失活する。ＣＲＩＳＰＲＰのＷｅｂツール（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を使用して、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＧＰＡＴ遺伝子を標的とするＳｇＲＮＡ配列を同定して選択する。２０ｎｔ標的配列は、ゲノム内の特異的配列である限り、プロモーターまたはイントロン等の遺伝子の非コード領域を含めた、標的遺伝子内のいずれの２０ｎｔ配列でもあり得る。この配列を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現カセット及びカナマイシン植物選択マーカー（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を含んでいるバイナリーベクターに挿入し、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によって植物細胞に形質転換することができる。ＰＣＲ増幅及びＤＮＡシークエンシングによって、トランスジェニックＴ１植物の色素体ＧＰＡＴ遺伝子の突然変異をスクリーニングすることができる。
実施例８．植物細胞中のチオエステラーゼの発現増加
Ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸合成は真核細胞の色素体中で行われ、そこで脂肪酸が合成されると同時に、アシル−ＡＣＰ複合体としてアシル担体タンパク質に結合する。Ｃ１６：０及びＣ１８：０アシル基への鎖伸長、次いでＡＣＰとの連結時のＣ１８：１への不飽和化に続いて、脂肪酸はチオエステラーゼによってＡＣＰから切断され、色素体からの移出を経て真核型経路に入り、ＥＲへと輸送され、そこで膜脂質生合成及び貯蔵脂質生合成に関与する。葉緑体では、移出過程で次の２段階を有する：最初に、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（脂肪酸アシルチオエステラーゼ；ＦＡＴ）の酵素活性によりアシル鎖が遊離脂肪酸として放出される、次に、長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＬＡＣＳ）によって触媒されるＣｏＡとの反応により、アシル−ＣｏＡエステルが形成される。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａは、アシル鎖特異性に基づいて区別できる３つの脂肪酸アシルチオエステラーゼを含む。ＦＡＴＡ１及びＦＡＴＡ２は不飽和アシル−ＡＣＰを優先的に加水分解する一方、飽和アシル−ＡＣＰ鎖は通常、ＦＡＴＢによって切断される。
チオエステラーゼと、ＷＲＩ１及び／またはＤＧＡＴポリペプチドをコードする遺伝子の共発現が総脂肪酸含有量、ＴＡＧ含有量及び脂肪酸組成に及ぼす効果を検討するため、各３つのＡ．ｔｈａｌｉａｎａチオエステラーゼに対するキメラ遺伝子を、ｐＪＰ３３４３バイナリー発現ベクターにコード領域を挿入し、３５ＳプロモーターからＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉細胞で一過性発現させて作製した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＴＡ１（アクセッション番号ＮＰ＿１８９１４７．１、配列番号２０２）及びＦＡＴＡ２（アクセッション番号ＮＰ＿１９３０４１．１、配列番号２０３）チオエステラーゼに対するタンパク質コード領域を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ部位を含んでいるプライマーを使用して、長角果のｃＤＮＡから増幅し、引き続き同じ制限部位を用いてｐＪＰ３３４３にクローニングした。得られた発現ベクターは、それぞれｐＯＩＬ０７９及びｐＯＩＬ０８０と称した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＴＢ遺伝子（アクセッション番号ＮＰ＿１７２３２７．１、配列番号２０４）のタンパク質コード領域を、ＮｏｔＩ及びＳａｃＩフランキング部位を含んでいるプライマーを使用して増幅し、ｐＪＰ３３４３の対応する制限部位にクローニングして、ｐＯＩＬ０８１を得た。構築物ｐＯＩＬ０７９、ｐＯＩＬ０８０及びｐＯＩＬ０８１を個別に、またはＡ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１転写因子（ＡｔＷＲＩ１）（ｐＪＰ３４１４）及び／若しくはＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼ（ＡｔＤＧＡＴ１）（ｐＪＰ３３５２）の遺伝子を含んでいる構築物と組み合わせて、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織に浸潤させる。比較のため、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのＦａｔＢ１（ＣｎＦＡＴＢ１）（ｐＪＰ３６３０）、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａのＦａｔＢ２（ＣｎＦＡＴＢ２）（ｐＪＰ３６２９）をコードするキメラ遺伝子をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓチオエステラーゼと並列的にＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織に導入し、ＭＣＦＡ特異性を有するＦａｔＢポリペプチドの効果と、ＭＣＦＡ特異性を有しないＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓチオエステラーゼの効果とを比較した。浸潤にはすべて、実施例１で説明したように、ｐ１９サイレンシングサプレッサーの発現のためのキメラ遺伝子を含んだ。陰性対照は、ｐ１９のＴ−ＤＮＡにのみ浸潤させた。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉でのＴＡＧレベルに与える、チオエステラーゼ発現とＷＲＩ１及び／またはＤＧＡＴ過剰発現との間の相乗効果を観察した。ＷＲＩ１またはＤＧＡＴ遺伝子のないチオエステラーゼ遺伝子の発現では、陰性対照（ｐ１９単独）の低レベルを上回り、有意にＴＡＧレベルが増加した。例えば、ココナッツのＦＡＴＢ２チオエステラーゼの発現の結果、陰性対照と比較して葉のＴＡＧレベルが８．２倍に増加した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１転写因子と、チオエステラーゼ各々との共発現は、ＡｔＷＲＩ１対照と比較して更にＴＡＧレベルを増加させた。ココナッツのチオエステラーゼＣｎＦＡＴＢ１及びＣｎＦＡＴＢ２各々と、ＷＲＩ１との共発現の結果、３つのＡ．ｔｈａｌｉａｎａチオエステラーゼ各々とＷＲＩ１との共発現よりも高いＴＡＧレベルを得た。興味深いことに、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼをチオエステラーゼ及びＷＲＩ１と組み合わせて共発現させた場合、逆の結果が観察された。 このことは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａチオエステラーゼと、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼのアシル鎖特異性に良好な一致があり、その結果、アシル−ＡＣＰからＴＡＧへのアシル鎖のフラックスが増えたことを示唆している。非ＭＣＦＡチオエステラーゼもまた、葉での総脂肪酸含有量中のオレイン酸の比率を上昇させる上で、かなり有効であった。ＡｔＷＲＩ１、ＡｔＤＧＡＴ１及びＡｔＦＡＴＡ２の共発現は、葉でのＴＡＧレベルが最も大きく、チオエステラーゼなしでＡｔＷＲＩ１及びＡｔＤＧＡＴ１を共発現した場合の１．６倍のレベルを示した。これらの実験から、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ両方を共発現した場合の油合成及び蓄積での相乗的な増加のみならず、この組み合わせにチオエステラーゼを加えることによって得られる更に相乗的な増加を示すことが確認された。
３つの異なるバイナリー発現ベクターを構築して、ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１及びＦＡＴＡをコードする遺伝子の共発現が、安定的に形質転換されたＮ．ｔａｂａｃｕｍ葉のＴＡＧレベル及び脂肪酸組成に与える効果を試験した。ベクターｐＯＩＬ１２１は、ＳＳＵプロモーターからＡｔＷＲＩ１を発現させるためのＳＳＵ：：ＡｔＷＲＩ１遺伝子、３５ＳプロモーターからＡｔＤＧＡＴを発現させるための３５Ｓ：：ＡｔＤＧＡＴ１遺伝子、及び構成的プロモーターであるｅｎＴＣＵＰ２プロモーターからＡｔＦＡＴＡ２を発現させるためのｅｎＴＣＵＰ２：：ＡｔＦＡＴＡ２遺伝子を含んでいた。これらの遺伝子構築物は、最初にＮｏｔＩでＤＮＡを消化して、Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍオレオシンをコードする遺伝子を削除することにより、ｐＯＩＬ３８から誘導された。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＴＡ２遺伝子のタンパク質コード領域を、ｐＯＩＬ８０のＤＮＡをテンプレートとして使用して増幅し、ＮｏｔＩ部位と隣接させた。次に、この断片をｐＯＩＬ３８のＮｏｔＩ部位に挿入した。次に、ｐＯＩＬ１２１を親ベクターとして機能させ、トランスジェニック植物での内因性ＳＤＰ１遺伝子のＲＮＡｉ媒介性サイレンシングのため、付加的なｅｎＴＣＵＰ２：：ＳＤＰ１ヘアピンＲＮＡカセットを含んだｐＯＩＬ１２２を作製した。これを行うために、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＳＤＰ１ヘアピンカセット全体をＳｆｏＩ−ＳｍａＩ断片としてｐＯＩＬ５１（実施例１１）から単離し、ｐＯＩＬ１２１のＳｆｏＩ部位にクローニングして、ｐＯＩＬ１２２（図３）を得た。ＳＳＵ：：ＷＲＩ１及び３５Ｓ：：ＤＧＡＴ１遺伝子ならびにｅｎＴＣＵＰ２：：ＳＤＰ１ヘアピンＲＮＡ遺伝子を含んでいる第３のベクター（ｐＯＩＬ１２３）を類似の方法で、ｅｎＴＣＵＰ２：：ＳＤＰ１ヘアピンＲＮＡカセットをＳｆｏＩ−ＳｍａＩ断片としてｐＯＩＬ３６のＳｆｏＩ部位にクローニングすることによって得た。
まとめると、ベクターは以下の遺伝子組み合わせを含んでいた：
ｐＯＩＬ１２１：ＳＳＵ：：ＡｔＷＲＩ１、３５Ｓ：：ＡｔＤＧＡＴ１、ｅｎＴＣＵＰ２：：ＡｔＦＡＴＡ２。
ｐＯＩＬ１２２：ＳＳＵ：：ＡｔＷＲＩ１、３５Ｓ：：ＡｔＤＧＡＴ１、ｅｎＴＣＵＰ２：：ＡｔＦＡＴＡ２、ｅｎＴＣＵＰ２：：ＳＤＰ１ヘアピン。
ｐＯＩＬ１２３：ＳＳＵ：：ＡｔＷＲＩ１、３５Ｓ：：ＡｔＤＧＡＴ１、ｅｎＴＣＵＰ２：：ＳＤＰ１ヘアピン。
３つの構築物各々を使用して、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によって形質転換されたＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物（栽培変種Ｗｉ３８）を得た。ＡｔＷＲＩ１及びＡｔＤＧＡＴ１の発現と組み合わせた、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＦＡＴＡ２チオエステラーゼの共発現または内因性ＳＤＰ１ ＴＡＧリパーゼのサイレンシングの結果、チオエステラーゼ遺伝子及びＳＤＰ１サイレンシング遺伝子の両方がない場合のＡｔＷＲＩ１及びＡｔＤＧＡＴ１の発現と比較して、それぞれ更に高いＴＡＧレベルが得られた。最大のＴＡＧ収率は、ｐＯＩＬ１２２を使用した、４つすべてのキメラ遺伝子の複合的作用によって得られた。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａが１８：３植物であることに注意する。１６：３植物であるＡ．ｔｈａｌｉａｎａの形質転換には、同様の構築物ｐＯＩＬ０７９、ｐＯＩＬ０８０及びｐＯＩＬ０８１を使用する。
発明者らは、脂肪酸アシルチオエステラーゼ活性の増加等による色素体の脂肪酸移出の増加が、色素体中のアシル−ＡＣＰの蓄積を減少させ、それにより、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）に対するフィードバック阻害が抑制された（Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｍｏｒｅｎｏ−Ｐｅｒｅｚら，２０１２）結果、脂肪酸生合成が増加するというモデルを考察した。チオエステラーゼの過剰発現は、色素体からＥＲへのアシル鎖の移出を増加させ、それにより、いわゆる「プッシュ型」と「プル型」の代謝工学戦略間での効果的な連係を可能にする。
実施例９．生育植物細胞での中鎖脂肪酸の生成
Ｅｃｃｌｅｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）は、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｂａｙ Ｌａｕｒｅｌの１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）をコードする遺伝子を恒常的発現させて形質転換したトランスジェニックＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物の種子及び葉の両方でのＣ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の蓄積について研究した。その研究報告によれば、成熟したＢ．ｎａｐｕｓ種子には相当なレベルのＣ１２：０が蓄積されたが、１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼの発現及び活性が高レベルであったにもかかわらず、葉組織では、極低レベルのＣ１２：０しか観察されなかった。遺伝子がＡ．ｔｈａｌｉａｎａに形質転換された場合にも同様の結果を得た（Ｖｏｅｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。その研究を発展させた、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのＬＰＡＡＴと、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのチオエステラーゼとの共発現の結果、総Ｃ１２：０の蓄積が増加するとともに、Ｂ．ｎａｐｕｓの種子でのトリラウリン画分も増加した（Ｋｎｕｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。したがって、この従来技術は、生育植物細胞中の中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）合成に問題があることを示した。
本明細書に記載する他の遺伝子と組み合わせて、ＭＣＦＡに対する特異性を有するチオエステラーゼを導入する効果を試験するために、いくつかの異なるチオエステラーゼを発現するキメラＤＮＡを合成し、単独でまたは組み合わせて植物細胞に導入した。ＭＣＦＡを生成することが知られている生物由来のチオエステラーゼに対するタンパク質コード領域（Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を合成して、３５Ｓプロモーター発現カセット（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を含んだバイナリーベクターｐＪＰ３３４３にＥｃｏＲＩ断片として挿入した。チオエステラーゼは、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒａの１４：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（別称Ｃｉｎｃａ−ＴＥ）（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；アクセッション番号Ｑ３９４７３．１；配列番号１９３）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦａｔＢ１（Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ１；アクセッション番号ＡＥＭ７２５１９．１；配列番号１９４）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦａｔＢ２（Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ２；アクセッション番号ＡＥＭ７２５２０．１；配列番号１９５）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼＦａｔＢ３（Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ３；アクセッション番号ＡＥＭ７２５２１．１；配列番号１９６）、Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａのアシル−（ＡＣＰ）チオエステラーゼＢ型（Ｃｕｐｌａ−ＴＥ）（Ｔｏｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；アクセッション番号ＣＡＢ６０８３０．１；配列番号１９７）、Ｃｕｐｈｅａ ｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａのＦａｔＢ１（Ｃｕｐｖｉ−ＴＥ；アクセッション番号ＡＥＭ７２５２２．１；配列番号１９８）及びＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼ（Ｕｍｂｃａ−ＴＥ）（Ｖｏｅｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；アクセッション番号Ｑ４１６３５．１；配列番号１９９）であった。これらのチオエステラーゼはすべて、ＦＡＴＢクラスであり、ＭＣＦＡに対する特異性を有した。Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａのＬＰＡＡＴ（Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴ、ＭＣＦＡ型）（Ｋｎｕｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；アクセッション番号Ｑ４２６７０．１；配列番号２００）及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＬＰＡＡＴ１（Ａｒａｔｈ−ＰＬＰＡＡＴ；アクセッション番号ＡＥＥ８５７８３．１；配列番号２０１）に対するタンパク質コード領域もクローニングした。Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴは、種子内でＴＡＧのｓｎ−２位でのＭＣＦＡの取り込みを増加させることが以前に示されているが（Ｋｎｕｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、それに対してＡ．ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＬＰＡＡＴ（Ａｒａｔｈ−ＰＬＰＡＡＴ）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４）を対照ＬＰＡＡＴとして使用し、Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴが有し得る何らかのＭＣＦＡ特異性の効果を決定した。Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴはアシル−ＣｏＡを１つの基質として使用し、その自然状況下においてＥＲ内で作動するのに対して、Ａｒａｔｈ−ＰＬＰＡＡＴはアシル−ＡＣＰを基質として使用し、色素体内で作用する。
実施例１に記載するようにアグロバクテリウム媒介性の浸潤によって、ｐ１９サイレンシングサプレッサーと、Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴまたはＡｒａｔｈ−ＰＬＰＡＡＴいずれかとを共発現させる遺伝子とともに、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉にチオエステラーゼ遺伝子を導入し、ＭＣＦＡをＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織に生成できるかどうかを判定した。アグロバクテリウム混合物に浸潤して５日後に、葉の浸潤帯を採取して凍結乾燥した後、総脂肪酸含有量及び組成を実施例１に記載するようにＧＣによって測定した（表７）。表７に示すデータでは、誤差は３回の浸潤の標準偏差である。対照葉の浸潤帯には、脂肪酸Ｃ１２：０及びＣ１４：０を極微量（＜０．１％）含むかまたは含まなかったのに対して、Ｃ１６：０は葉の総脂質中のＴＦＡのうち１４．９％±０．６を占めた。Ｃ１２：０のレベルは、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ３（１．２％±０．１）及びＵｍｂｃａ−ＴＥ（１．６％±０．１）の発現による有意な増加のみだった。試験した各々のチオエステラーゼの発現の結果、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉でＣ１４：０の蓄積が生じ、Ｃｉｎｃａ−ＴＥが１１．３％±１．０で最も高レベルを示した。同様に、Ｕｍｂｃａ−ＴＥを除く、各々のチオエステラーゼの発現の結果、Ｃ１６：０のレベルが増加した。最も高レベルのＣ１６：０の蓄積（３５．４％±４．７）は、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ１の発現に観察された。ＦＡＴＢ遺伝子が単独で発現されたとき、葉には浸潤帯の相当な壊死が観察され、ＭＣＦＡ生成のレベルとの相関が見られた。発明者らの考察によれば、壊死の原因はおそらく、最適条件を上回る遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベル、更にはＴＡＧ中よりもむしろリン脂質プールでのＭＣＦＡの多量の蓄積によるものである。
表７．各種チオエステラーゼ（ＴＥ）及びＬＰＡＡＴに浸潤したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉での、選抜した脂肪酸の葉の総脂肪酸組成（葉の総脂肪酸％）。共浸潤した遺伝子（単一遺伝子（ｐ１９以外のすべてのサンプルに存在）、Ａｒａｔｈ−ＬＰＡＡＴ＋各種ＴＥ、Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴ＋各種ＴＥ）ごとに、結果を分類した。「対照」は未浸潤であったＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉を意味するのに対して、「ｐ１９のみ」はサイレンシングサプレッサー遺伝子を単独で含んでいる。１６：３は１６：３Δ７，１０，１３であり、１８：３は１８：３Δ９，１２，１５である。遺伝子同一性については本文に定義している。
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Ａｒａｔｈ−ＰＬＰＡＡＴを発現するキメラ遺伝子とチオエステラーゼとの共浸潤は、ＬＰＡＡＴがない場合と比較して、Ｃ１６：０の蓄積をわずかに増加させる一方、Ｃ１２：０及びＣ１４：０両方の蓄積を減少させる傾向があった。対照的に、Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴまたはＵｍｂｃａ−ＴＥを発現する遺伝子の共浸潤は、Ｃ１２：０の蓄積を３．３％±０．５まで増加させた一方、Ｃ１４：０は、Ｃｉｎｃａ−ＴＥ＋Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴサンプルで１４．９％±１．６の蓄積が見られた。最も高レベルのＣ１６：０は、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ１及びＣｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴ（４０．２％±２．８）の共発現後に観察された。各々の接種帯へのＬＰＡＡＴの添加は、葉組織の壊死の程度を減少させた。驚くべきことに、一過性発現研究において、Ｃ８：０及びＣ１０：０脂肪酸の両方も植物細胞に生成された。チオエステラーゼを単独で発現させた場合、Ｃ８：０及びＣ１０：０の蓄積は観察されなかった。しかしながら、チオエステラーゼの発現を、ＣｕｐｈｏＦａｔＢとＣｎＬＰＡＡＴ及びＡｔＷＲＩ１との共浸潤と組み合わせたとき、Ｃ８：０が植物細胞中に総脂肪酸含有量の０．２７±０．０９％の濃度で存在することがわかった。同様に、ＣｕｐｌａＦａｔＢをＣｎＬＰＡＡＴ及びＡｔＷＲＩ１と共発現させたとき、Ｃ１０：０が総脂肪酸含有量のうち０．５４±０．１６％で存在することがわかった。
これらの結果は、以前に報告された種子の発現から観察されるチオエステラーゼのアシル基特異性が、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉において本質的に維持され、この発現系がアシル基特異性の試験に有効な系であることを示した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの色素体ＰＬＰＡＡＴの添加はＭＣＦＡの蓄積を増加させなかったが、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ細胞内のＣ１６：０の蓄積をわずかに増加させた。対照的に、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａのＬＰＡＡＴは、Ｃ．ｎｕｃｉｆｅｒａ油に見出されている脂肪酸である（Ｌａｕｒｅｌｅｓら，２００２）Ｃ１２：０、Ｃ１４：０及びＣ１６：０のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉での蓄積を増加させた。本実験は、自然のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＬＰＡＡＴは葉組織において高度に発現せず、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０及びＣ１６：０基質に対する高い活性も有しないことを示した。
高レベルのＴＡＧを蓄積する生育植物細胞での中鎖脂肪酸の生成
発明者らは以前に、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ１及びＳ．ｉｎｄｉｃｕｍのオレオシンをコードするキメラ遺伝子の協調的発現によって、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉で１５％のＴＡＧ生成を得た（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）ＬＰＡＡＴと組み合わせたチオエステラーゼの発現後に観察されたＭＣＦＡの蓄積が、高レベルのＴＡＧを生成する植物細胞（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）でも発生または増加するかどうかを試験するため、これらの遺伝子を共発現させた。Ｃ１２：０、Ｃ１４：０及びＣ１６：０チオエステラーゼ／ＬＰＡＡＴの最適に機能する組み合わせ（それぞれ、Ｕｍｂｃａ−ＴＥ、Ｃｉｎｃａ−ＴＥ及びＣｏｃｎｕ−ＴＥ２チオエステラーゼを加えたＣｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴ）を、前述のＡｒａｔｈ−ＷＲＩ１＋ＤＧＡＴの組み合わせ（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）とともに、またはそれなしで浸潤した。そのデータを図４に示す。
関連するＭＣＦＡ（Ｕｍｂｃａ−ＴＥではＣ１２：０、Ｃｉｎｃａ−ＴＥではＣ１４：０、及びＣｏｃｎｕ−ＴＥ２ではＣ１６：０）の蓄積は、以下の組み合わせにＡｒａｔｈ−ＷＲＩ１を添加することにより、一貫して実質的に最大限増加した。Ｃ１２：０はＵｍｂｃａ−ＴＥ＋Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴ＋Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１サンプルの葉の総脂肪酸のうち９．５％±０．９を占め、Ｃ１４：０のレベルはＣｉｎｃａ−ＴＥ＋Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴ＋Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１サンプルで１８．５％±２．６、Ｃ１６：０のレベルは、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ２＋Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴ＋Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１サンプルで３８．３％±３．０であった。チオエステラーゼとＡｒａｔｈ−ＷＲＩ１との浸潤は、ＷＲＩ１の非存在下でのチオエステラーゼとＣｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴとの浸潤と比較して、Ｕｍｂｃａ−ＴＥＣの存在下ではＣ１２：０に対して、Ｃｉｎｃａ−ＴＥの存在下ではＣ１４：０に対して、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ２存在下ではＣ１６：０に対して有意に高い効果を有することが見出された（図５）。チオエステラーゼとＡｒａｔｈ−ＷＲＩ１との混合物にＣｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴを添加すると脂肪酸組成に影響を及ぼし、Ｕｍｂｃａ−ＴＥ及びＣｉｎｃａ−ＴＥとのセットではＣ１２：０及びＣ１４：０に比較的小幅な増加が、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ２とのセットではＣ１６：０に小幅な減少が観察された。観察された最大レベルは以下の通りである。Ｕｍｂｃａ−ＴＥ＋Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１＋Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴサンプルでは葉の総脂肪酸中、８．８％±１．１のＣ１２：０、Ｃｉｎｃａ−ＴＥ＋Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１＋Ｃｏｃｎｕ−ＬＰＡＡＴサンプルでは１４．１％±３．５のＣ１４：０、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ２＋Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１サンプルでは４８．６％±３．７のＣ１６：０が観察された。
興味深いことに、Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１で同程度にＭＣＦＡの蓄積が増加しなかった唯一のチオエステラーゼはＣｏｃｎｕ−ＴＥ２であったが、それさえも有意に増加した。この遺伝子を単独で添加すると、Ｃ１６：０の蓄積が１６．０％±０．４から３７．３％±０．６に増加したが、更にＡｒａｔｈ−ＷＲＩ１を添加しても、これを４８．６％±１．７に増加させるに留まった。これは、Ｃ１６：０と比較して、Ｃ１２：０及びＣ１４：０中間体が色素体での脂肪酸合成時に比較的一過性であることに起因し得る。
注意すべき他の効果として挙げられるのは、Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ１存在下でのＣ１６：０及びＣ１８：１Δ9レベルの増加、及びＣ１８：３Δ９，１２，１５レベルの減少であった。Ｃｉｎｃａ−ＴＥ及びＣｏｃｎｕ−ＴＥ２を更に添加しても、Ｃ１８：３Δ９，１２，１５レベルは更に低下した。対照的に、Ｕｍｂｃａ−ＴＥへのＡｒａｔｈ−ＷＲＩ１の添加後に生じた過剰なＣ１２：０は、Ｃ１８：３Δ９，１２，１５の付加よりむしろＣ１６：０の損失に現れた（図５）。
ＭＣＦＡの蓄積に関して詳細な理解を得るため、サンプルのサブセットをＬＣ−ＭＳでも分析した。色素体のガラクト脂質であるモノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）及びジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）は、ｐ１９対照の浸潤と比較して、Ｃ１２：０及びＣ１４：０を極低レベルで含有し、Ｃ１６：０のレベルは減少した。Ｕｍｂｃａ−ＴＥサンプルの主要なＣ１２：０含有ＭＧＤＧ種は３０：３であった。これは、１つのＣ１８：３と１つのＣ１２：０が、同じモノガラクトシル主鎖に位置したことを示す。他の主要なＣ１２：０含有ＭＧＤＧ種は２８：０であった。これは、第２の脂肪酸がＣ１６：０であったことを示す。Ｃｉｎｃａ−ＴＥサンプルの主要なＣ１４：０含有ＭＧＤＧ種は、２８：０及び３０：０であった。これは、ＭＧＤＧ内の有意なＣ１４：０部分がｄｉ−Ｃ１４：０であるか、またはＣ１６：０を有することを示す。Ｃ１２：０含有及びＣ１４：０含有ＭＧＤＧ種は、ｐ１９対照サンプルには検出されなかった。対照的に、Ｃ１６：０含有ＭＧＤＧ種は、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ２サンプルでは減少する傾向があった。野生型サンプルの主要なＭＧＤＧ種（Ｃ１６：３含有３４：６、Ｃ１８：３含有３４：６、及びＣ１８：３含有３６：６）はすべて、導入遺伝子の発現によって減少する傾向があった。この減少は、ＷＲＩ＋ＤＧＡＴの組み合わせ存在下で最大であった。
Ｕｍｂｃａ−ＴＥサンプルには、極微量レベルのＣ１２：０含有ＤＧＤＧ種が観察された。Ｃｉｎｃａ−ＴＥサンプルに観察された主要なＣ１４：０含有種は、いずれも対照に存在しない２８：０及び３０：０であった。これらの種も、Ｃｏｃｎｕ−ＴＥ２サンプルには高レベルで観察されたが、Ｕｍｂｃａ−ＴＥサンプルには微量レベルでしか観察されなかった。野生型サンプルの主要なＤＧＤＧ種（Ｃ１６：０含有３４：３、Ｃ１８：３含有３４：３、及びＣ１８：３含有３６：６）はすべて、導入遺伝子の発現によって減少する傾向があった。この減少は、ＷＲＩの存在下で最大であった。
同様に、従来の記載のように（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）ＷＲＩ＋ＤＧＡＴを含んでいるサンプルすべてにおいて、ＴＡＧ種は総じて、大幅に増加した。Ｃ１２：０種は、高ＴＡＧのＵｍｂｃａ−ＴＥサンプルで、Ｃ１４：０は高ＴＡＧのＣｉｎｃａ−ＴＥサンプルで、Ｃ１６：０は高ＴＡＧのＣｏｃｎｕ−ＴＥ２サンプルで優勢であることが見出された。ＴＡＧ画分のＬＣ−ＭＳ分析から、ＷＲＩ転写因子を含んでいるＵｍｂｃａ−ＴＥサンプルすべてにおいて、Ｃ１２：０含有３６：０が、Ｃ１８：３を含有するＴＡＧ種のレベルの２倍優勢なＴＡＧ種であることが見出された。同様に、Ｃ１４：０含有４２：０は、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ、ＷＲＩまたはＷＲＩ＋ＤＧＡＴのいずれかと共形質転換されたＣｉｎｃａ−ＴＥサンプルで優勢なＴＡＧ種であったが、ＷＲＩを含んでいるサンプルの場合、その応答性は大幅に高くなった。いくつかのＣ１６：０含有ＴＡＧ種は、高ＴＡＧのＣｉｎｃａ−ＴＥ（例えば４４：０及び５０：３）及びＣｏｃｎｕ−ＴＥ２（例えば４６：０、４８：０、５０：２及び５０：３）サンプルの両方で有意に上昇した。ここでも、ＷＲＩの存在下で最大のＣ１６：０の増加が観察された。
生育組織でのＭＣＦＡ生成のための安定的形質転換。
生育組織にＭＣＦＡを生成する遺伝子を組み合わせて、タバコ等の植物を安定的に形質転換するために、バイナリーベクター内に一連の遺伝子構築物を作製し、最適な遺伝子の組み合わせを同定した。これらの構築物は、ＳＳＵプロモーター（実施例８、ｐＯＩＬ１２１を参照）または老化特異的ＳＡＧ１２プロモーターいずれかの制御下でＷＲＩ１を発現する遺伝子、アブラヤシＤＧＡＴをコードする遺伝子（下記）、ｅｎＴＣＵＰプロモーターの制御下にあるココナッツのＬＰＡＡＴをコードする遺伝子（ＣｏｃｎｕＬＰＡＡＴ、上記参照）及び３５ＳプロモーターまたはＳＡＧ１２プロモーターのいずれかから発現される種々の脂肪酸アシルチオエステラーゼ（ＦＡＴＢ）を発現するいくつかの遺伝子を含んだ。これらについて以下に述べる。
Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（アブラヤシ）のＤＧＡＴをコードする遺伝子のクローニング
まず、代表的なＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２及びＤＧＡＴ３酵素を含め、種々のＤＧＡＴ酵素を試験するために、公開されたトランスクリプトーム（Ｄｕｓｓｅｒｔら，２０１３）からアブラヤシのＤＧＡＴ配列候補を特定し、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍでの発現のためコドンを最適化した。次に、タンパク質コード領域を各々、実施例１に記載したようなＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉の一過性アッセイの試験用３５Ｓプロモーターの制御下で、バイナリー発現ベクターに個別にクローニングした。試験した遺伝子の組み合わせは以下の通りである：
１ ｐ１９（陰性対照）
２ Ｐ１９＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＷＲＩ１
３ Ｐ１９＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＡｔＷＲＩ１＋ＡｔＤＧＡＴ１
４ Ｐ１９＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＡｔＷＲＩ１＋ＥｇＤＧＡＴ１
５ Ｐ１９＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＡｔＷＲＩ１＋ＥｇＤＧＡＴ２
６ Ｐ１９＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＡｔＷＲＩ１＋ＥｇＤＧＡＴ３
７ Ｐ１９＋ＣｉｎｃａＦａｔＢ
８ Ｐ１９＋ＣｉｎｃａＦａｔＢ＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＷＲＩ１
９ Ｐ１９＋ＣｉｎｃａＦａｔＢ＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＡｔＷＲＩ１＋ＡｔＤＧＡＴ１
１０ Ｐ１９＋ＣｉｎｃａＦａｔＢ＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＡｔＷＲＩ１＋ＥｇＤＧＡＴ１
１１ Ｐ１９＋ＣｉｎｃａＦａｔＢ＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＡｔＷＲＩ１＋ＥｇＤＧＡＴ２
１２ Ｐ１９＋ＣｉｎｃａＦａｔＢ＋ＣｎＬＰＡＡＴ＋ＡｔＷＲＩ１＋ＥｇＤＧＡＴ３
ＴＦＡ及びＴＡＧのレベル、ならびにＴＦＡまたはＴＡＧ含有量の総ＭＣＦＡレベルの結果を図６に示す。ＡｔＤＧＡＴ１と比較して、ＥｇＤＧＡＴ１の発現は、より多くの総脂肪酸の蓄積と、ＴＡＧレベルの増加をもたらした。総脂肪酸含有量中のＭＣＦＡ総含有量は、ＡｔＤＧＡＴ１と比較してＥｇＤＧＡＴ１の発現によって減少したが、ＴＡＧに存在するＭＣＦＡのレベルはほぼ同じままだった（図６）。
遺伝子構築物の調製
安定的形質転換のための遺伝子構築物（表８）を、適合性を持つ制限酵素部位を用いた遺伝子カセットの順次挿入によりアセンブリした。４遺伝子の構築物（表８）は各々、３５Ｓプロモーターから発現したアブラヤシＤＧＡＴ１（ＥｇＤＧＡＴ１）をコードする遺伝子、ｅｎＴＣＵＰ２構成的プロモーターから発現したＣ．ｎｕｃｉｆｅｒａのＬＰＡＡＴ（ＣｎＬＰＡＡＴ）をコードする遺伝子、及びＳＳＵプロモーターまたはＳＡＧ１２プロモーターいずれかから発現したＡｔＷＲＩ１をコードする遺伝子に加え、ＦＡＴＢ酵素をコードする一連の遺伝子の１つを含んでいた。
５遺伝子の構築物は、アシル活性化酵素（ＡＡＥ）をコードする内因性遺伝子の発現を減少させるためにヘアピンＲＮＡの発現遺伝子も含んでいた。ヘアピンは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ（ＥＦＨ４４５７５．１）から同定されたＡＡＥ１５及びＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａゲノムとの配列類似性に基づいて構築された。ＡＡＥは、ＭＣＦＡの再活性化、及びその後の更なる伸長に関与することを示している。ＡＡＥのサイレンシングがＭＣＦＡ蓄積を増加させ得ると考えられた。ヘアピンカセットをベクターｐＫＡＮＮＩＢＡＬ内に構築し、次いで発現ベクターｐＷＢＶｅｃ２（Ｗａｎｇら，２００４）にサブクローニングし、ヘアピンの発現を３５Ｓプロモーターによって誘導した。
表８．アセンブルした遺伝子構築物の一覧。
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これらの遺伝子構築物を使用して、栽培変種Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３８の形質転換タバコ植物及びｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡで形質転換された高油量の系統を産生した。３５Ｓプロモーターから発現させた単一遺伝子のＦＡＴＢ構築物で形質転換された植物は、ＳＡＧ１２プロモーターからまたは４遺伝子の構築物から発現させた対応するＦＡＴＢ構築物で形質転換されたものよりも有意に小型であることが観察された。植物のサイズが小型である理由は、効率的にＴＡＧに組み込まれなかったＭＣＦＡの増強によるものと考えられた。
考察
本研究から、Ｕｍｂｃａ−ＴＥ単独（表７）の発現後、葉細胞でのＣ１２：０の生成は、総脂肪酸含有量のわずか約１．６％であったことが見出された。Ａｒａｔｈ−ＷＲＩ発現遺伝子の付加は、ココナッツＬＰＡＡＴ（図４及び５）の付加よりも葉組織でのＣ１２：０及びＣ１４：０の蓄積に対してはるかに強い影響を及ぼした。これは、ＷＲＩ１とチオエステラーゼとの組み合わせが、相乗的に作用し、葉細胞のＭＣＦＡ蓄積を大幅に増加させたことを示した。重要なことに、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０及びＣ１６：０の多くが、野生型葉では脂質が実質的なレベルでは蓄積しない、葉中でＴＡＧに蓄積することが見出された。これらの実験は、植物の生育部分の細胞を改変すると、ＭＣＦＡ、特にＣ１２：０及びＣ１４：０をＴＡＧに高レベルで生成できることを示した。Ｃ１６：０のレベルもまた実質的に増加した。
実施例１０．ＴＡＧ蓄積に対する各種の転写因子ポリペプチドの効果
ＷＲＩ１及びＤＧＡＴを用いた従来の報告済み実験（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＡｔＷＲＩ１をコードする合成遺伝子（アクセッション番号ＡＡＰ８０３８２．１）及び同じくＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＡｔＤＧＡＴ１をコードする合成遺伝子（アクセッション番号ＡＡＦ１９２６２；配列番号１）を使用した。ＤＧＡＴとの組み合わせで含油量を増加させる能力を他のＷＲＩポリペプチドとＡｔＷＲＩ１とで比較するために、他のＷＲＩコード配列を同定して、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉で発現させる構築物の産生に使用した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ３（アクセッション番号ＡＡＭ９１８１４．１、配列番号２０５）及びＷＲＩ４（アクセッション番号ＮＰ＿１７８０８８．２、配列番号２０６）転写因子（Ｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）をコードするヌクレオチド配列を合成して、３５Ｓプロモーターの制御下でＥｃｏＲＩ断片としてｐＪＰ３３４３に挿入した。得られたバイナリー発現ベクターは、それぞれｐＯＩＬ０２７及びｐＯＩＬ０２８と称した。オートムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）のＷＲＩ１に対するコード配列を（ＡｓＷＲＩ１、配列番号２０７）、付加的なＥｃｏＲＩ部位を含んでいるフランキングプライマーを使用して、Ｓｔｅｎ Ｓｔｙｍｎｅ教授（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって提供されたベクターからＰＣＲ増幅した。増幅した断片をｐＪＰ３３４３に挿入して、ｐＯＩＬ０５５を得た。Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ（アクセッション番号ＸＰ＿００２４５０１９４．１、配列番号２０８）由来のＷＲＩ１候補配列を、Ｚｅａ ｍａｙｓのＷＲＩ１アミノ酸配列（アクセッション番号ＮＰ＿００１１３７０６４．１、配列番号２０９）をクエリとして使用し、ＮＣＢＩサーバ上でＢＬＡＳＴｐ検索により同定した。Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒのＷＲＩ１遺伝子（ＳｂＷＲＩ１）のタンパク質コード領域を合成して、ＥｃｏＲＩ断片としてｐＪＰ３３４３に挿入し、ｐＯＩＬ０５６を産生した。ＷＲＩ１をコードする遺伝子候補を、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｔａｌｌｏｗ（Ｔｒｉａｄｉｃａ ｓｅｂｉｆｅｒａ；ＴｓＷＲＩ１、配列番号２１０）トランスクリプトーム（Ｕｄａｙ ｅｔ ａｌ．，が提出）から同定した。タンパク質コード領域を合成して、ＥｃｏＲＩ断片としてｐＪＰ３３４３に挿入し、ｐＯＩＬ０７０を得た。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１ポリペプチドを発現するコード配列を含んでいるｐＪＰ３４１４及びｐＪＰ３３５２バイナリーベクターが、Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）によって記載された。
種々のＷＲＩコード配列を含んでいるプラスミドを、実施例１に記載したすべての接種法で、ｐ１９ウイルスサプレッサータンパク質をコードする遺伝子を使用して、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織に導入し、一過性発現させた。ＷＲＩポリペプチドをコードする遺伝子は、単独でまたはＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼ遺伝子と組み合わせて試験され、後者はより大きなＴＡＧの生合成及び蓄積をもたらした。この実験の陽性対照は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１転写因子及びＡｔＤＧＡＴ１をコードする遺伝子の組み合わせであった。すべての浸潤を３つの異なる植物を使用して３回行い、実施例１に記載したようにＴＡＧレベルを分析した。個々のＷＲＩポリペプチドの大部分が外因性の付加的ＤＧＡＴ１の非存在下で発現し、その結果、浸潤した葉斑点でＴＡＧレベルが増加したが、ｐ１９構築物（図７）のみを有した対照との比較では依然として低かった（乾重量基準で０．２３％未満）。例外は、それ自体、有意なＴＡＧレベルの増加が見られなかったＴｓＷＲＩ１であった。加えて、各種のＷＲＩ転写因子単独の発現によって生成されるＴＡＧのレベルの差は大きくなかった。ＡｓＷＲＩ１及びＳｂＷＲＩ１はいずれも、単独でＡｔＷＲＩ１と同様のＴＡＧレベルを得た。ＴＡＧ脂肪酸組成の分析により、浸潤した葉組織（表９）では、ＡｔＷＲＩ３の発現によるＣ１８：１Δ９レベルの増加を除いて変化はごく微量であったことが明らかになった。
表９．ＷＲＩを発現する各種キメラ遺伝子に浸潤したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉サンプルのＴＡＧ脂肪酸組成（ｎ＝３）。
サンプルはすべてＰ１９構築物にも浸潤した。ＴＡＧサンプルは更に、０．１〜０．４％のＣ１４：０、０．５〜１．２％のＣ１６：３及び０．１〜０．７％のＣ１８：１Δ１１も含有していた。
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対照的に、各種ＷＲＩポリペプチドの発現から得たＴＡＧ収率の差は、ＡｔＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼとの共発現時に、より顕著であった。この結果もまた、Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）によって報告されたように、浸潤したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織でのＴＡＧ生合成に対して、ＷＲＩ１とＤＧＡＴの共発現が相乗的に効果を及ぼすことを示した。ＡｔＷＲＩ３、ＡｔＷＲＩ４及びＴｓＷＲＩ１発現ベクターとＤＧＡＴ１との共発現時には、中程度のＴＡＧレベルが観察され、対するＡｓＷＲＩ１及びＡｔＷＲＩ１との共発現時に得られたレベルは、それよりも有意に低かった。事前に予測できなかった結果として、ＤＧＡＴとＳｂＷＲＩ１との共発現によって最も高収率のＴＡＧを得た。ただし、この分析は双子葉植物細胞で実施された。ＴＡＧ脂肪酸組成分析から、ＳｂＷＲＩ１、ＡｓＷＲＩ１及びＡｔＷＲＩ１陽性対照の場合、Ｃ１８：１Δ９レベルの増加及びＣ１８：３Δ9,12,15（ＡＬＡ）レベルの減少が明らかになった（表９）。しかしながら、ＡｔＷＲＩ１とは異なり、ＡｓＷＲＩ１及びＳｂＷＲＩ１の発現はいずれも、ｐ１９陰性対照と比較してＣ１６：０レベルの増加を示した。興味深いことに、ＡｔＷＲＩ３を浸潤させた葉サンプルは、特異なＴＡＧプロファイルを示し、Ｃ１８：１Δ９は豊富であるが、Ｃ１６：０及びＡＬＡには、わずかな影響しか与えなかった。
この実験は、ＤＧＡＴと共発現したとき、Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒのＷＲＩ１転写因子（ＳｂＷＲＩ１）はＡｔＷＲＩ１よりも優位に、生育植物部分のＴＡＧレベルを増加させることを示した。発明者らはまた、単子葉植物由来の転写因子（例えばＷＲＩ１）が双子葉植物細胞において良好に機能でき、それどころか双子葉植物由来の対応する転写因子と比較して優れた活性さえも有し得るという結論を得た。同様に、双子葉植物由来の転写因子は、単子葉植物細胞において良好に機能することができる。
他の転写因子の使用
植物細胞で１４種類の転写因子各々を発現させる遺伝子構築物を調製し、ＴＡＧ生合成及び蓄積に関与する他の遺伝子との組み合わせで、ＴＡＧレベルを増加させるように機能する能力を試験した。これらの転写因子は、ＷＲＩ１の代替候補、または植物細胞、特に生育植物部分に用いるためのＷＲＩ１、ＬＥＣ１及びＬＥＣ２のうち１つ以上の転写因子を含む組み合わせに付加する候補であった。各転写因子は主として、ＬＥＣ２と同様に、報告された胚形成への関与（Ｂａｕｄ ａｎｄ Ｌｅｐｉｎｉｅｃ（２０１０）、及びＩｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００６）に概説）に基づいて選択した。したがって、以下の通り、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ発現系（実施例１）を用いて、その機能を分析する実験を実施した。
以下の転写因子のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列を、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及びＮ．ｔａｂａｃｕｍで発現させるためコドンを最適化して合成し、ｐＪＰ３３４３のそれぞれの部位にＮｏｔＩ−ＳａｃＩ断片としてサブクローニングした：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＦＵＳ３（ｐＯＩＬ１６４）（Ｌｕｅｒｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；アクセッション番号ＡＡＣ３５２４７；配列番号１６０）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＬＥＣ１Ｌ（ｐＯＩＬ１６５）（Ｋｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；アクセッション番号ＡＡＮ１５９２４；配列番号１５７）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＬＥＣ１（ｐＯＩＬ１６６）（Ｌｏｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；アクセッション番号ＡＡＣ３９４８８；配列番号１４９）、Ｇ．ｍａｘ ＭＹＢ７３（ｐＯＩＬ１６７）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４；アクセッション番号ＡＢＨ０２８６８；配列番号２２１）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ｂＺＩＰ５３（ｐＯＩＬ１６８）（Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００９；アクセッション番号ＡＡＭ１４３６０；配列番号２２２）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＧＬ１５（ｐＯＩＬ１６９）（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９；アクセッション番号ＮＰ＿１９６８８３；配列番号２２３）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＭＹＢ１１８（アクセッション番号ＡＡＳ５８５１７；ｐＯＩＬ１７０；配列番号２２４）、ＭＹＢ１１５（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；アクセッション番号ＡＡＳ１０１０３；ｐＯＩＬ１７１；配列番号２２５）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＴＡＮＭＥＩ（ｐＯＩＬ１７２）（Ｙａｍａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；アクセッション番号ＢＡＥ４４４７５；配列番号２２６）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＵＳ（ｐＯＩＬ１７３）（Ｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９６；アクセッション番号ＮＰ＿５６５４２９；配列番号２２７）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＢＢＭ（ｐＯＩＬ１７４）（Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；アクセッション番号ＡＡＭ３３８９３，配列番号１４５）、Ｂ．ｎａｐｕｓ ＧＦＲ２ａ１（アクセッション番号ＡＦＢ７４０９０；ｐＯＩＬ１７７；配列番号２２８）及びＧＦＲ２ａ２（アクセッション番号ＡＦＢ７４０８９；ｐＯＩＬ１７８；配列番号２２９）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１２ｃ））。加えて、強光リン酸飢餓条件への適応に関与するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＰＨＲ１転写因子のコドンを最適化した変形型を、同様に、ｐＪＰ３３４３（ｐＯＩＬ１８９）（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）；アクセッション番号ＡＡＮ７２１９８；配列番号：２３０）にサブクローニングした。各転写因子を表１０にまとめる。
これらの転写因子の機能を判定するためのスクリーニングアッセイとして、実施例１に記載のように、遺伝子構築物を、ＤＧＡＴ１をコードする遺伝子とともに、若しくはそれなしで、またはＷＲＩ１、ＬＥＣ２、ｈｐＳＤＰ１またはＦＡＴＡチオエステラーゼ等をコードする他の遺伝子の組み合わせとともに、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉細胞へ導入し、葉細胞の総脂質含有量及び脂肪酸組成を測定する。総脂質含有量を有意に増加させる転写因子を特定して選択する。
選択的転写因子をコードする遺伝子を使用した、植物の安定的形質転換のために、以下のバイナリー構築物を作製する。転写因子の発現遺伝子は、ＳＳＵプロモーターまたはＳＡＧ１２プロモーターを使用する。胚形成転写因子（例えばＬＥＣ１及びＬＥＣ２）の過剰発現は、体細胞不定胚形成を含めた、本文脈では望ましくない種々の多面的表現型効果を誘発することが示されている（Ｆｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）；Ｓａｎｔｏｓ−Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．（２００５）；Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）；Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０））。植物の成長及びバイオマス収率に与える可能性がある悪影響を最小限にするために、胚形成の主要制御因子の異所性発現を誘導する構成的プロモーターよりも組織または成長段階に特異的なプロモーターが好ましい。
表１０．付加的な転写因子及びそれらを発現する遺伝子構築物
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実施例１１．葉組織にＴＡＧを高度に蓄積する植物でのＴＡＧリパーゼのサイレンシング
Ｓｕｇａｒ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ １（ＳＤＰ１）ＴＡＧリパーゼは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの種子以外の組織ならびに種子発芽期のＴＡＧ代謝回転に関与することが示された（Ｅａｓｔｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＳＤＰ１は成長中の種子に発現し、ＳＤＰ１ポリペプチドは油体を伴う（ただし被覆されない）成熟種子にも存在する。ＳＤＰ１をコードする遺伝子のサイレンシングの結果、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの根及び茎に少量だが有意なＴＡＧレベルの増加（乾重量基準で０．４％未満）が生じた一方、葉組織では更に少ない増加が観察された（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＡｔＷＲＩ１及びＡｔＤＧＡＴ１の共発現と比較して、葉及び茎組織で更にＴＡＧレベルを増加させ得るかどうかを判定するために、ＷＲＩ、ＤＧＡＴ１及びオレオシンポリペプチドをトランスジェニック発現させる遺伝子を有するＴ−ＤＮＡに対してホモ接合性であったＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の内因性ＳＤＰ１遺伝子をサイレンシングするように実験を設計した（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡｔＳＤＰ１ヌクレオチド配列をクエリとして使用した、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａトランスクリプトーム（Ｎａｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２）のＢＬＡＳＴ検索により、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＳＤＰ１遺伝子に対して相同性を有する転写物（Ｎｂｖ５ｔｒ６３８５２００、配列番号１７３）を同定した。ヘアピン媒介性の遺伝子サイレンシングのための７１３ｂｐ領域（配列番号１７４）を選択した。３．９０３ｋｂの合成断片をｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ１２ベクターに基づいて設計した。このベクターには、順にｅｎＴＣＵＰ２構成的プロモーター、ａｔｔＢ１とａｔｔＢ２部位に隣接したセンス方向の７１３ｂｐ Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＳＤＰ１断片、Ｐｄｋイントロン、逆方向のｃａｔイントロン配列、ａｔｔＢ１とａｔｔＢ２部位に隣接した逆（アンチセンス）方向の第２の７１３ｂｐ Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＳＤＰ１断片及びＯＣＳ ３´領域ターミネーター／ポリアデニル化部位から構成された（図８）。挿入物を、ＳｍａＩ及びＫａｓＩ制限部位を利用してｐＪＰ３３０３にサブクローニングし、これにより得られた発現ベクターをｐＯＩＬ０５１と称した。このキメラＤＮＡは、ハイグロマイシン耐性の選択マーカー遺伝子を含んでいる。
ｐＯＩＬ０５１を使用して、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によって形質転換されたＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物を産生した。出発植物細胞は、ｐＪＰ３５０２（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）のＴ−ＤＮＡに対してホモ接合性であったトランスジェニック植物由来であった。ｐＯＩＬ０５１由来のＴ−ＤＮＡを含んでいるトランスジェニック植物をハイグロマイシン耐性によって選抜し、温室内または管理環境下のキャビネット内の土壌に移し、引き続き生長させた。植物成長期である開花前、開花期及び結実段階で、確認済みの二重形質転換体（Ｔ０植物）から葉サンプルを採取し、それぞれのＴＡＧレベルを決定した。極低レベルの葉ＴＡＧまたは対照と同レベルのＴＡＧを含有しているトランスジェニック植物を、葉サンプルからの脂質抽出及びスポットＴＬＣによる分析によって特定し、廃棄した。形質転換体の残余集団のＴＡＧレベルを、実施例１に記載したようにＧＣにより定量化した。開花前、これらの植物の大部分はその葉組織にＴＡＧレベルの大幅な増加（葉乾重量の５％超）を示すと同時に、４つの植物では１０％を上回るＴＡＧレベルを含有した（表１１）。これらの植物の葉で開花前に観察された最大のＴＡＧレベルは、植物５１−１３の１１．３％であった。比較として、ＡｔＷＲＩ１、ＡｔＤＧＡＴ１及びオレオシンを発現する親Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ系統のトランスジェニック植物は、開花前に約２％、及び開花期に約６％のＴＡＧレベルを示した（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。したがって、ＡｔＷＲＩ１とＡｔＤＧＡＴ１を組み合わせたＳＤＰ１阻害構築物の付加は、これらの植物のＴＡＧレベルの増加に対して相乗的であった。驚くべきことに、開花段階で二重形質転換した植物から採取した葉のＴＡＧ含有量は大幅に増加し、乾重量基準で３０．５％を認め（表１２）、ＳＤＰ１をサイレンシングしていない植物に対して５倍の増加を示した。発明者らが大いに驚いたことに、結実段階の老化葉（緑色及び黄色）のサンプルでは、ＴＡＧレベルが驚異的な７０．７％（乾重量％）に達した（表１３）。ＮＭＲを使用して、結実段階のタバコ植物からの全葉の含油量を測定したとき、老化開始期のほぼ緑色の葉でのＴＡＧ含有量は約４３％であり、ほぼ茶色の乾燥した葉では４２％であった。このような葉は２枚の褐色紙フィルター間で押圧したときに、滲出する油が紙に浸み込み、紙が半透明になるが、対照のタバコ葉ではそうならない。これは、高含油量を有する植物を検出するための単純なスクリーニング法となる。
ｐＪＰ３５０２及びｐＯＩＬ５１由来のＴ−ＤＮＡをそれぞれ含んでおり、高レベルのＴＡＧを示す２つの主要な形質転換体（＃６１、＃６９）を、ハイグロマイシン遺伝子特異的プライマー対を利用したデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって分析し、ｐＯＩＬ５１のＴ−ＤＮＡ挿入の数を決定した。＃６１と称する植物は、ｐＯＩＬ５１由来のＴ−ＤＮＡ挿入を１箇所含んでいたのに対して、植物＃６９はｐＯＩＬ５１由来のＴ−ＤＮＡ挿入を３箇所含んでいた。両方の系統のＴ１子孫植物を、再びｄｄＰＣＲでスクリーニングして、ホモ接合性、ヘテロ接合性及びヌル植物を特定した。ｐＯＩＬ５１由来の挿入を含んでいない（ヌル（複数可）；合計７）または２箇所のＴ−ＤＮＡ挿入を含んでいる（すなわち、そのＴ−ＤＮＡに対してホモ接合性；合計１２）植物＃６１の子孫植物を選択して更に分析した。同様に、ｐＯＩＬ５１由来のＴ−ＤＮＡ挿入を含んでいない（ヌル（複数可）；合計２）またはこの種の挿入を２箇所含んでいる（合計１５）または挿入を４若しくは５箇所含んでいる（合計５）系統＃６９の子孫植物を維持して更に分析した。
表１１．野生型（未形質転換）と比較した、ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１及びオレオシン導入遺伝子を発現する、ＳＤＰ１ヘアピン構築物（ｐＯＩＬ０５１）をコードするＴ−ＤＮＡで超形質転換したＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物（Ｔ０世代）由来の葉組織のＴＡＧレベル（葉乾重量％）及びＴＡＧ脂肪酸組成。葉サンプルは、生育段階（開花前）に採取された。脂質サンプルはまた、０．０〜０．２％のＣ１６：３、０．０〜０．４％のＣ２０：１、０．０〜０．１％のＣ２０：２ｎ−６も含有していた。
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表１２．ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１及びオレオシン導入遺伝子を発現する、ＳＤＰ１ヘアピン構築物（ｐＯＩＬ０５１）をコードするＴ−ＤＮＡで超形質転換したＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物（Ｔ０世代）由来の葉組織のＴＡＧレベル（葉乾重量％）及びＴＡＧ組成。葉サンプルは開花期に採取された。
Figure 0006882160
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表１３．ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１及びオレオシン導入遺伝子を発現する、ＳＤＰ１ヘアピン構築物（ｐＯＩＬ０５１）をコードするＴ−ＤＮＡで超形質転換したＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物（Ｔ０世代）由来の葉組織のＴＡＧレベル（葉乾重量％）及びＴＡＧ組成。葉サンプルは結実段階で採取した。Ｙ＝黄色葉、Ｇ＝緑色葉である。
Figure 0006882160
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選抜したＴ１植物を温室内で対照植物と同時に同一条件下で生長させた。開花前のＴ１植物由来の緑色葉組織サンプルを乾燥させ、総脂肪酸（ＴＦＡ）及びＴＡＧ含有量をＧＣ分析により測定した。両方のＴ−ＤＮＡを含んでいる植物のＴＦＡ含有量は、乾重量基準で４．６％〜１６．１％の範囲であり、それに含まれる同じ葉のＴＡＧレベルは乾重量基準で１．２％〜１１．８％であった（図９）。これは、ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡだけを含み、同一条件下で一緒に生長し、同じ生長段階で分析された植物と比較して、はるかに高く、ＴＡＧリパーゼ活性の減少と、ＷＲＩ１とＤＧＡＴとの組み合わせとの間の相乗作用を再度示した。ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡのみを含んでいる植物は、４．２％〜６．８％のＴＦＡを含有し、それに含まれるＴＡＧレベルは乾重量基準で１．４％〜４．１％であった（図９）。野生型植物は、平均して約０．８％のＴＦＡを含有し、それに含まれるＴＡＧは乾重量基準で０．５％未満であった。系統＃６１及び＃６９各々からの葉の総脂肪酸含有量中の脂肪酸組成及びＴＡＧ含有量は、ｐＪＰ３５０２（親）由来のＴ−ＤＮＡのみを含んでいる葉の組成と類似していた。野生型対照葉と比較して、ｐＯＩＬ５１及びｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡの両方を含んでいる植物は、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１及びＣ１８：２脂肪酸レベルの増加を示した。脂肪酸組成のこの有意な変動は主に、総脂肪酸含有量比で約５０〜５５％から約２０〜３０％へと減少したＣ１８：３の喪失分から生じた。
ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡのみを含んでいる植物と、ｐＯＩＬ５１及びｐＪＰ３５０２両方のＴ−ＤＮＡを含んでいる植物との間の、ＴＡＧレベルを含めたＴＦＡレベルの大幅な増加は、植物成長期間全体にわたって維持された。ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡのみを含んでいる対照植物は、開花期で７．７％〜１７．５％のＴＡＧを含有し、対して結実期ではＴＡＧレベルは乾重量基準で１４．１％〜２０．７％の範囲であった。ｐＪＰ３５０２及びｐＯＩＬ５１両方のＴ−ＤＮＡを含んでいる植物からの葉のＴＡＧ含有量は、開花期で６．３％〜２３．３％、結実期で１２．６％〜３３．６％に変化した。生育成長段階に関して前述した通り、いずれの段階でもＴＡＧ画分の脂肪酸組成に類似の変化が検出された。
ＴＡＧレベルはまた、トランスジェニック植物の他の生育組織、例えば根及び茎等でも更に増加することが見出された。ｐＯＩＬ０５１のＴ−ＤＮＡで形質転換されたトランスジェニックＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の一部の根組織に、乾重量基準で４．４％のＴＡＧ、及び一部の茎組織に７．４％のＴＡＧを含有していた（図１０）。ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡのみを含んでいる野生型植物及びＮ．ｔａｂａｃｕｍは、両方の組織ではるかに低いＴＡＧレベルを示した。内因性ＴＡＧリパーゼの発現を減少させるヘアピンＳＤＰ１構築物の付加は、茎及び根でのＴＡＧ含有量を増加させる転写因子及びＴＡＧ生合成（ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ）をコードする遺伝子と明らかに相乗的であった。特筆すべきことに、同じ植物内では根のＴＡＧレベルが茎組織と比較して低かったが、対するｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡのみを含んでいる野生型植物及びＮ．ｔａｂａｃｕｍには逆の傾向が観察された。根及び茎組織のＴＡＧ組成は、トランスジェニック葉組織で先に観察されたように、Ｃ１８：１及びＣ１８：３脂肪酸に類似の変化を示した。ＴＡＧ中のＣ１８：２レベルは、野生型対照と比較したとき、トランスジェニック茎組織で減少したが、対するＣ１６脂肪酸は一般に、トランスジェニック根組織で減少した。
したがって、発明者らは、ＷＲＩ１とＤＧＡＴの組み合わせに、内因性ＳＤＰ１遺伝子をサイレンシングする外因性遺伝子を付加すると、植物生長の全段階で、ＴＡＧ含有量を含めた総脂肪酸含有量を増加させ、特に茎及び根においてＷＲＩ１及びＤＧＡＴと相乗的に作用したという結論を得た。トランスジェニック植物由来のＴ１種子を、室温でｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培地に播種し、発芽の範囲及び時期を試験した。３つの個別に形質転換された系統からのＴ１種子の発芽は、ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡで形質転換されたトランスジェニック植物からの種子と比較して同様であった。更にまた、初期の苗の活力には影響しないように思われた。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ種子の発芽におけるＳＤＰ１の役割と、ＳＤＰ１突然変異体に観察された発芽欠損（Ｅａｓｔｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００６）を考えると、これは驚くべきことであった。このようなことが生じた場合に何らかの発芽欠損を克服するため、第２の構築物を、種子で本質的に発現しないか、または低レベルで発現するプロモーター、例えばＳＳＵ等の光合成遺伝子からのプロモーター等から、ＳＤＰ１阻害性ＲＮＡを発現させるように設計する。発明者らの考察によれば、構成的プロモーターまたは少なくとも種子で発現するプロモーターがＳＤＰ１阻害ＲＮＡの発現を誘導しないようにすることは、種子の発芽または初期の苗の活力に対する有害作用リスクを緩和するために有益である。
最も高レベルのＴＡＧを有するＴ０植物は、制御された環境室（５００マイクロモルの光強度、１６時間の明／２６℃−８時間の暗／１８℃の昼夜周期）の強光条件下で生長し、野生型対照植物よりも外観が小型（ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡで形質転換された植物に対して、高さ約７０％）であったことが確認された。発明者らは、導入遺伝子及び／または「プッシュ型」、「プル型」、「防御的」及び「パッケージ」手法の遺伝子改変の組み合わせが、特に、生育植物部分で高レベルのＴＡＧを達成するために有利であったという結論を得た。本実施例では、ＷＲＩ１は「プッシュ」を提供し、ＤＧＡＴは「プル」を提供し、ＳＤＰ１のサイレンシングは「防御」を提供し、及びオレオシンはＴＡＧの「パッケージ」を提供した。
実施例１２．転写因子の老化特異的発現
ＬＥＣ２等の胚及び種子成長の主要制御因子の異所性発現は、種子以外の組織でＴＡＧレベルを増加させることが報告された（Ｓａｎｔｏｓ−Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｌｏｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ａｎｄｒｉａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。しかしながら、３５Ｓ−ＬＥＣ２遺伝子で形質転換された植物でのＬＥＣ２の構成的過剰発現は、体細胞不定胚形成及び異常な葉構造を含めた、植物成長及びモルホロジーに対する望ましくない多面発現性効果を生じさせた（Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓａｎｔｏｓ−Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。植物成長の葉老化段階、すなわち植物が完全に生長し、十分にバイオマスに達した後に、ＬＥＣ２発現を制限すると、葉の脂質レベルは引き続き増加させるが、望ましくない表現型効果は最小化するかどうかを試験するため、ＳＡＧ１２遺伝子（Ｕ３７３３６；Ｇａｎ ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ １９９５）からのＡ．ｔｈａｌｉａｎａ老化特異的プロモーターの制御下で、ＬＥＣ２を発現するキメラＤＮＡを設計して作製した。
遺伝子構築物を作製するため、順に、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのＳＡＧ１２老化特異的プロモーター、ＬＥＣ２タンパク質コード配列及びＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン遺伝子ターミネーター／ポリアデニル化領域からなる３．６３５ｋｂの合成ＤＮＡ断片を作製した。この断片は、ｐＪＰ３３０３のＳａｃＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位の間に挿入された。この構築物をｐＯＩＬ０４９と称し、ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１及びオレオシンポリペプチドをコードする遺伝子で安定的に形質転換された、ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡを含んでいるＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の葉で試験した。アグロバクテリウム媒介性の形質転換法を用いて、ｐＯＩＬ０４９構築物を使用して、ｐＪＰ３５０２（実施例３）のＴ−ＤＮＡに対してホモ接合性であったＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物細胞を形質転換した。ｐＯＩＬ０４９由来の遺伝子を含むトランスジェニック植物は、ハイグロマイシン耐性によって選抜し、温室で成熟するまで生長させた。サンプルは、葉の老化期を含む、生長の異なる段階でトランスジェニック葉組織から採取し、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍのｐＪＰ３５０２親系統と比較して、増加したＴＡＧレベルを含む。
合計１４９の独立したＴ０植物（すなわち主要な形質転換体）を得た。全植物の上部緑色葉、及び選択した事象の十分に老化した下部茶色葉を植物成長の結実段階でサンプル採取し、ＴＡＧ含有量をＴＬＣ−ＧＣにより定量化した。選抜した植物内のｐＯＩＬ４９ Ｔ−ＤＮＡ挿入数を、ハイグロマイシン遺伝子に特異的なプライマー対を利用してｄｄＰＣＲにより決定した。結実段階で採取した緑色葉組織において、乾重量基準で３０．２％のＴＡＧレベルが観察された。サンプル採取した植物の大部分で、茶色葉のＴＡＧレベルは低かった。しかしながら、３つの植物（＃３２ｂ、＃８ｂ及び＃２３ｃ）は、緑色の伸長した葉においてよりも、茶色の老化葉組織において高いＴＡＧレベルを示した。これらの植物は、１、２または３箇所のｐＯＩＬ４９由来のＴ−ＤＮＡ挿入を含んだ。
植物＃２３ｃ及び＃３２ｂのＴ１子孫をｄｄＰＣＲによりスクリーニングし、ｐＯＩＬ０４９由来のＴ−ＤＮＡに対して、ヌル（複数可）、ヘテロ接合性及びホモ接合性である植物を同定した。ｐＯＩＬ０４９由来のＴ−ＤＮＡ挿入を含んでいない植物＃２３ｃの子孫植物（ヌル（複数可）；合計７）またはｐＯＩＬ０４９由来のＴ−ＤＮＡのＴ−ＤＮＡ挿入を２箇所含んでいる子孫植物（ホモ接合性；合計４）を選択して更に分析した。同様に、挿入を含んでいない植物＃３２ｂの子孫植物（ヌル（複数可）；合計６）または挿入を２箇所含んでいる子孫植物（ホモ接合性；合計９）を保持して更に分析した。緑色の葉組織を開花前にサンプル採取し、ＴＦＡ及びＴＡＧ含有量をＧＣにより測定した。野生型植物及びｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡで形質転換された植物は、前述（実施例１１）と同様であり、同じ温室で一緒に生長させた。ｐＯＩＬ０４９由来のＴ−ＤＮＡを含んでいる形質転換体の葉のＴＦＡレベルは、開花前の乾重量基準で５．２％〜１９．５％の範囲だった（図１２）。同じ組織のＴＡＧレベルは、乾重量基準で０．８％〜１５．４％の範囲だった。これは、ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡのみを含んでいる植物を大幅に上回った。ｐＪＰ３５０２及びｐＯＩＬ０４９由来のＴ−ＤＮＡを含んでいる植物のＴＡＧレベルは、開花期及び結実期では、それぞれ３８．５％及び３４．９％に更に増加した。総脂肪酸含有量の脂肪酸組成をｐＯＩＬ０４９由来のＴ−ＤＮＡに対してホモ接合性の葉で分析すると、Ｃ１８：２レベルの増加及びＣ１８：３レベルの減少が観察された（図１２）が、Ｃ１６：０とＣ１８：１のパーセント比は、ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡのみで形質転換された葉と比較して、ほぼ同じままであった。これらのデータは、発現の発生的調節が可能である非構成的プロモーターの制御下で第２の転写因子遺伝子を付加することにより、植物の生育組織でのＴＡＧレベルを更に増加できることを示した。このデータはまた、老化特異的プロモーターＳＡＧ１２が葉の老化前の緑色組織において多少の発現を有したことも示した。
ＴＡＧレベルは、野生型Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物及びｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡのみを含んでいるトランスジェニック植物の両方と比較して茎組織ではるかに増加した。ｐＯＩＬ０４９由来のＴ−ＤＮＡで形質転換されたトランスジェニックＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の一部の茎組織は、乾重量基準で４．９％のＴＡＧを含有していた（図１１）。他方で、根組織のＴＡＧレベルは、３つのｐＯＩＬ０４９植物間で大きな変動を示し、一部の根組織では３．４％のＴＡＧを含有した。特筆すべきことに、同じ植物内では根のＴＡＧレベルが茎組織と比較して低かったが、対するｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡのみを含んでいる野生型植物及びＮ．ｔａｂａｃｕｍには逆の傾向が観察された。根及び茎組織のＴＡＧ組成は、トランスジェニック葉組織で先に観察されたように、Ｃ１８：１及びＣ１８：３脂肪酸に類似の変化を示した。ＴＡＧ中のＣ１８：２レベルは、野生型対照と比較したとき、トランスジェニック茎組織で減少したが、対するＣ１６脂肪酸は一般に、トランスジェニック根組織で減少した。
ＳＡＧ１２プロモーターの制御下で他の転写因子、すなわち、ＬＥＣ１、ＬＥＣ１様、ＦＵＳ３、ＡＢＩ３、ＡＢＩ４及びＡＢＩ５ならびにその他をコードする、対応する遺伝子構築物を作製した（実施例１０）。例えば、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＳＡＧ１２プロモーターの単子葉植物派生型ホモログ、例えばｍａｉｚｅ ＳＥＥ１プロモーター（Ｒｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）の制御下で、単子葉植物転写因子であるＺｅａ ｍａｙｓ ＬＥＣ１（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）またはＳｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ ＬＥＣ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００２４５２５８２．１）を発現させるため、付加的な構築物を作製した。例えば、開花期に優先的に発現する発生的制御プロモーター（例えば日長感受性プロモーター）、フィトクロムプロモーター、クリプトクロムプロモーター、または二次生長期の植物茎内にある、例えばＣｅｓＡ遺伝子由来のプロモーター下で、転写因子を発現させるため、更なる構築物を作製した。これらの構築物を植物の形質転換に使用し、植物は生育部分で少なくとも８％のＴＡＧを生成するものを選択する。
デンプンと糖のレベル
野生型植物、ならびにｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡ、またはｐＪＰ３５０２及びｐＯＩＬ５１若しくはｐＪＰ３５０２及びｐＯＩＬ０４９由来のＴ−ＤＮＡを含んでいるトランスジェニック植物からサンプル採取した葉組織において、デンプン及び可溶性糖のレベルを測定した。一般に、両方のＴ−ＤＮＡを有する葉では、乾重量基準で葉組織内のＴＡＧレベルとデンプンレベルとの間に逆の相関が見られた（図１３）。対照的に、トランスジェニック植物での葉の可溶性糖レベルは、野生型と比較してほぼ同じであった。これは、糖からＴＡＧへの転換に重大なボトルネックが存在しなかったことを示唆している。野生型植物では、植物の葉の位置による影響が観察され、下部葉から上部葉へとデンプンレベルが増加する傾向があったこのような影響は、トランスジェニック植物には検出されなかった。
実施例１３．転写因子をコードする遺伝子の茎特異的発現
ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ及びオレオシンをコードする導入遺伝子を発現するＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の葉は、成長の結実段階で約１６％のＴＡＧを含有している。しかしながら、ＴＡＧレベルは、植物の茎（１％）及び根（１．４％）ではるかに低かった（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。発明者らは、茎及び根でＴＡＧレベルが低くなる理由が、このトランスジェニック植物でＷＲＩ１をコードする遺伝子の発現に使用されたＲｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵプロモーターのプロモーター活性不足に起因するかどうかを考察した。茎及び根でより強く発現し、その結果、茎及び根にＴＡＧを蓄積させるための因子を制限する可能性がない、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって、ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡ内にＤＧＡＴ導入遺伝子を発現させた。
茎組織のＴＡＧ生合成を増加させる試みとして、ＷＲＩ１をコードする遺伝子がＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＳＤＰ１プロモーターの制御下で配置されるように構築物を設計した。１．５ｋｂのＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＳＤＰ１プロモーター（配列番号１７５）（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、続いてＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１ポリペプチドのためのコード領域及びＧ．ｍａｘレクチンターミネーター／ポリアデニル化領域を含んでいる、３．１５６ｋｂの合成ＤＮＡ断片を合成した。この断片は、ｐＪＰ３３０３のＳａｃＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入された。得られたベクターをｐＯＩＬ０５０と称した。次に、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によって、このベクターを使用して、ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡに対してホモ接合性であるＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の細胞を形質転換した。トランスジェニック植物をハイグロマイシン耐性により選抜し、合計８６の独立したトランスジェニック植物を温室で成熟するまで生長させた。サンプルは、結実段階でトランスジェニック葉及び茎組織から採取した。これは、ｐＪＰ３５０２で形質転換されたＮ．ｔａｂａｃｕｍの親植物と比較して、増加したＴＡＧレベルを含む。
実施例１４．種子中の含油量の増加
ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１をコードする個々の遺伝子の過剰発現時に、トウモロコシ、カノーラまたはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの種子組織でＴＡＧレベルが増加することを複数のグループが報告している（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗｅｓｅｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｊａｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２に概説）。近年では、ｖａｎ Ｅｒｐ ｅｔ ａｌ．（２０１４）が、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａでの種子含油量に対するＷＲＩ１とＤＧＡＴ１との共発現の効果を調査した。ＴＡＧの絶対レベルは、野生型及び空ベクター対照では３８％であったが、トランスジェニック系統では４４％に増加した。ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１の過剰発現にＳＤＰ１ ＴＡＧリパーゼのサイレンシングを組み合わせると、ＴＡＧレベルを４５％まで更に増加させた。特筆すべきことに、平均種子重量は増加することが見出されたが、植物当たりの種子の数は対照植物よりも少なかった。
長さが約１４．３ｋｂであり、ＦＡＥ１、Ｃｏｎｌｉｎｉｎ１及びＣｏｎｌｉｎｉｎ２をコードする遺伝子由来の種子特異的プロモーターの制御下で、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＭＧＡＴ２、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＧＰＡＴ４ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでいる合成ＤＮＡ断片を合成し、ＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片としてｐＪＰ３４１６に挿入した。得られたベクターはｐＴＶ５５とした（図１４）。制限酵素消化に続くセルフライゲーションの各ステップを使用した、個々の発現カセットの連続的除去によって、一連の誘導型ベクターをｐＴＶ５５から構築した。ＧＰＡＴ４カセットをＰａｃＩ消化によって欠失させ、ｐＴＶ５６を得た。それに続くＳｒｆＩでの消化により、ＭＧＡＴ２発現カセットを除去し、ｐＴＶ５７を産生した。隣接するＳｂｆＩ制限部位を使用して、ＷＲＩ１カセットを欠失させ、ｐＴＶ５８を得た。最後に、ｐＴＶ５８のＤＧＡＴ１カセットを、ＳｒｆＩ及びＰａｃＩでの消化、それに続くＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理及びライゲーションによってＷＲＩ１カセットと交換した。ＷＲＩ１カセットを、ＳｂｆＩを用いてｐＴＶ５７から切断し、Ｔ４ポリメラーゼ処理した。平滑末端ＷＲＩカセットをＳｒｆＩ−ＰａｃＩ消化されたｐＴＶ５８主鎖へライゲーションし、ｐＴＶ５９を産生した。各ベクターは、ＢＡＳＴＡに対する耐性をもたらす、ｅ３５Ｓ（二重エンハンサー領域を含む）：：ＰＡＴ遺伝子を選択マーカー遺伝子として含んでいた。
まとめると、構築物は、以下の遺伝子の組み合わせを含んでいた：
ｐＴＶ５５：ＰｒｏＣｎｌ１：：ＭＧＡＴ２＋ＰｒｏＣｎｌ２：：ＤＧＡＴ１＋ＰｒｏＣｎｌ１：：ＧＰＡＴ４＋ＰｒｏＦＡＥ１：：ＷＲＩ１；
ｐＴＶ５６：ＰｒｏＣｎｌ１：：ＭＧＡＴ２＋ＰｒｏＣｎｌ２：：ＤＧＡＴ１＋ＰｒｏＦＡＥ１：：ＷＲＩ１；
ｐＴＶ５７：ＰｒｏＣｎｌ２：：ＤＧＡＴ１＋ＰｒｏＦＡＥ１：：ＷＲＩ１；
ｐＴＶ５８；ＰｒｏＣｎｌ２：：ＤＧＡＴ１；
ｐＴＶ５９：ＰｒｏＦＡＥ１：：ＷＲＩ１。
構築物ｐＴＶ５５〜ｐＴＶ５９をＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１に個別に導入し、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（２０１２）の採用したフローラルディップ法によるＣ．ｓａｔｉｖａ（栽培変種Ｃｅｌｉｎｅ）の形質転換に使用した。簡潔には、新たに開いた花芽をＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ溶液に１５秒間浸漬し、プラスチックフィルムで包み、２４℃で暗所に一晩放置した後、プラスチックを除去した。入手した花の質に応じて、合計３〜４回のフローラルディップを実施した。植物を成熟するまで生長させ、Ｔ１種子を採取した。土壌でＴ１種子を発芽させた後、ＰＡＴ選択マーカー遺伝子を発現している植物を選抜するために、０．１％のＢＡＳＴＡ除草剤（２５０ｇ／Ｌのグルホシネートアンモニウム；Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｔｙ Ｌｔｄ，ＶＩＣ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、樹立したＴ１苗（７〜１０日）に噴霧した。生存苗を分離して、新しい土壌ポットに移し、２２±１℃（昼）及び１８±１℃（夜）で温室内にて成熟するまで生長させた。Ｔ２種子を採取して、各系統の５０ｍｇ種子からなる３つの独立バッチの含油量（ＴＡＧが少なくとも９５％である）をＮＭＲ（ＭＱＣ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。乾燥したキムワイプ紙に既知量のＣ．ｓａｔｉｖａ種子油を含ませ、１０ｍｍ径のＮＭＲ試験管に入れて較正サンプルを調製し、紙及び油の重量に基づいて含油量の範囲を得た。較正サンプルはパラフィルムで密閉し、油を組織に均一に分布できるように、使用前の最低１時間、４０℃の加熱ブロックに保持した。０．５５テスラの磁石及び１０ｍｍ径のプローブを２３．４ＭＨｚのプロトン共鳴周波数で１６秒間作動させ、較正サンプルを３回測定した。磁石温度は４０℃に維持した。種子サンプルは、含水量が必ず５％未満になるように最初に１０５℃のオーブン内で一晩乾燥させた。その後、サンプルを計量し、１０ｍｍ径のガラス管に移し、ＮＭＲ分析の前に１時間、４０℃でインキュベートした。含油量をＮＭＲにより３回測定し、質量重量基準で検量線と対照した。
各形質転換系統に挿入されたＴ−ＤＮＡ（複数可）のコピー数をデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）により測定した。挿入が複数の場合は、Ｔ−ＤＮＡが確実に物理的に分離されるように、最初にゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによって消化した。Ｃ．ｓａｔｉｖａ ＬＥＡＦＹ遺伝子（ｌｆｙ）を参照遺伝子として、及び選択マーカーをマルチプレックスｄＰＣＲ反応の標的遺伝子として選択した。プローブをＨＥＸ（参照遺伝子）またはＦＡＭ（標的遺伝子）のいずれかで標識した。増幅反応条件は以下の通りであった：１０分間９５℃（ランピング速度２．５℃／ｓ）、３０秒間９４℃（ランピング速度２．５℃／ｓ）及び１分間６１℃（ランピング速度２．５℃／ｓ）を３９サイクル、１０分間９８℃。ＰＣＲ増幅後、個々の液滴の蛍光をＱＸ１００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて測定し、コピー数をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（バージョン１．３．２．０、ＢｉｏＲａｄ）を使用して算出した。
Ｃ．ｓａｔｉｖａの形質転換により、未形質変換の野生型対照と比較して、分離したＴ２種子でＴＡＧレベルの増加を呈する複数のトランスジェニック事象を得た（図１５）。興味深いことに、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１をコードする遺伝子を含んでいるｐＴＶ５７で、最も高レベルのＴＡＧを得た。ＭＧＡＴ２（ｐＴＶ５６）及びＭＧＡＴ２＋ＧＰＡＴ４（ｐＴＶ５５）の付加的な挿入は、ｐＴＶ５５と比較してわずかにＴＡＧレベルを減少させる結果となった。コピー数の決定により、ｐＴＶ５７系統に対する１または２箇所のＴ−ＤＮＡ挿入は、それぞれ２番目に高い種子含油量、及び最も高い種子含油量を示していることが明らかとなった（表１４）。
ｐＴＶ０５７由来のＴ−ＤＮＡで形質転換されたホモ接合性のＴ２植物は、種子でのＤＨＡの合成及び蓄積に必要な脂肪酸デサチュラーゼ及びエロンガーゼを発現する遺伝子で形質転換されたＣ．ｓａｔｉｖａ植物（ＷＯ２０１３／１８５１８４）とも交配した。ＮＭＲによって測定したとき、Ｆ１種子は、ＤＨＡ構築物で形質転換され、ｐＴＶ５７のＴ−ＤＮＡを含まないＣ．ｓａｔｉｖａ種子と比較して含油量の増加を示した。Ｃ．ｓａｔｉｖａ ＤＨＡ親植物と比較した、ＴＡＧ画分のＤＨＡレベルを測定することにより、種子のＤＨＡ含有量を決定する。ＤＨＡ構築物のみを含んでいる種子の総ＤＨＡ含有量と比較して、両方のＴ−ＤＮＡを含んでいる種子の総ＤＨＡ含有量（ｍｇＤＨＡ／ｇ種子）は増加している。
表１４．Ｔ２種子の含油量（％）及びＣ．ｓａｔｉｖａ ｐＴＶ５７トランスジェニック事象のコピー数（デジタルＰＣＲによる）。
Figure 0006882160
実施例１５．ＴＡＧの蓄積及び代謝回転に対する油体タンパク質発現の効果
ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡで形質転換され、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１及びＳ．ｉｎｄｉｃｕｍオレオシンをコードする導入遺伝子を発現するＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物は、生育組織のＴＡＧレベルが増加していた。上記の実施例１１に示すように、これらの植物でＳＤＰ１ ＴＡＧリパーゼをコードする内因性遺伝子をサイレンシングすると、葉のＴＡＧレベルが更に増加した。このことは、ＳＤＰ１活性を保持した植物で相当なＴＡＧ代謝回転が発生していたことを発明者らに示した。そこで、植物の導入遺伝子の発現レベルを決定した。ノーザンハイブリダイゼーションブロッティングにより、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１の強い発現及び若干のオレオシンｍＲＮＡ発現を確認した一方、デジタルＰＣＲ及びｑＲＴ−ＰＣＲによる発現分析で、極低レベルのオレオシン転写物のみを検出した。発現分析により、オレオシンをコードする遺伝子がＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１導入遺伝子と比較して十分に発現しなかったことが明らかとなった。これらの実験から、発明者らは、ｐＪＰ３５０２のＴ−ＤＮＡによってコードされるとき、オレオシンタンパク質の不適切な産生のため、葉組織の油体が、ＴＡＧ分解から完全には保護されなかったという結論を得た。植物成長期を通じてＴＡＧの安定的な蓄積を改善するために、オレオシン遺伝子を置換した、いくつかのｐＪＰ３５０２改変型を設計した。これらの改変型構築物は以下の通りである。
１．ｐＪＰ３５０２には、発現が不十分であった、Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍオレオシンをコードする遺伝子（配列番号１７６はその相補体の配列を与える）が含まれている。その遺伝子は、発現レベルを抑制し得るＵＢＱ１０内部イントロンを有する。これを試験するために、Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍオレオシン遺伝子を含み、かつＵＢＱ１０内部イントロンを欠く５０２ｂｐの合成ＤＮＡ断片を合成して、ＮｏｔＩ断片としてｐＪＰ３５０２に挿入し、ｐＪＰ３５０２のイントロンを含んでいるオレオシン遺伝子を置換した。得られたプラスミドをｐＯＩＬ０４０と称した。
２．ｐＪＰ３５０２のオレオシン遺伝子の発現を誘導するＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーターを、ｅｎＴＣＵＰ２構成的プロモーターと置換した。この目的のために、ｅｎＴＣＵＰ２プロモーター、オレオシンタンパク質コード領域、Ｇ．ｍａｘレクチンターミネーター／ポリアデニル化領域、及びｗｒｉ１発現を誘導する下流ＳＳＵプロモーターの先頭６４３ｂｐを含んでいる２３２１ｂｐの断片を合成し、ｐＪＰ３５０２のＡｓｃＩ及びＳｐｅＩ部位にサブクローニングして、ｐＯＩＬ０３８を得た。
３．類似の技法に従って、ｅｎＴＣＵＰ２プロモーター（Ｗｉｎｉｃｈａｙａｋｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）の制御下で導入される６つのシステイン残基（ｏ３−３）を含んでいるＳ．ｉｎｄｉｃｕｍオレオシン遺伝子の遺伝子操作された変形型を発現させた。ｅｎＴＣＵＰ２プロモーター、オレオシンｏ３−３タンパク質コード領域、Ｇ．ｍａｘレクチンターミネーター／ポリアデニル化領域、及びｗｒｉ１発現を誘導する下流ＳＳＵプロモーターの先頭６４３ｂｐを含んでいる２２９８ｂｐの断片を合成し、ｐＪＰ３５０２のＡｓｃＩ及びＳｐｅＩ部位にサブクローニングして、ｐＯＩＬ０３７を得た。
４．ｐＪＰ３５０２のＳ．ｉｎｄｉｃｕｍオレオシン遺伝子に隣接するＮｏｔＩ部位を利用して、タンパク質コード領域をピーナッツのオレオシン３（アクセッション番号ＡＡＵ２１５０１．１）（Ｐａｒｔｈｉｂａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ａ；Ｐａｒｔｈｉｂａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）をコードするものと交換した。ＮｏｔＩ部位に隣接するオレオシン３遺伝子を含んでいる５２８ｂｐの断片を合成して、ｐＪＰ３５０２の対応する部位にサブクローニングした。得られたベクターをｐＯＩＬ０４１と称した。
５．同様に、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのステロレオシン（Ａｒａｂ−１）（アクセッション番号ＡＡＭ１０２１５．１）（Ｊｏｌｉｖｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）をコードする遺伝子を含んでいる１０７７ｂｐのＮｏｔＩ隣接断片を合成して、ｐＪＰ３５０２のＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、ｐＯＩＬ０４３を得た。
６．Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｅａｎｉｃ脂肪滴表面タンパク質（ＬＤＳＰ）（アクセッション番号ＡＦＢ７５４０２．１）（Ｖｉｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を５０４ｂｐのＮｏｔＩ隣接断片として合成して、ｐＪＰ３５０２のＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、ｐＯＩＬ０４４を産生した。
７．最後に、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのカレオシン（ＣＬＯ３）（アクセッション番号Ｏ２２７８８．１）（Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を６１２ｂｐのＮｏｔＩ隣接断片として合成して、ｐＪＰ３５０２にサブクローニングして、ｐＯＩＬ０４２を得た。
これらの構築物を各々、実施例１に記載のように、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉細胞に導入した。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織のｐＪＰ３５０２及びｐＯＩＬ０４０はいずれも一過性発現により、ＴＡＧレベルが上昇し、類似したＴＡＧ脂肪酸プロファイルを示したが、ｐＯＩＬ０４０の方がＴＡＧレベルが増加した（０．９％と比較して１．３％）。構築物ｐＯＩＬ０３７、ｐＯＩＬ０３８、ｐＯＩＬ０４１、ｐＯＩＬ０４２及びｐＯＩＬ０４３をそれぞれ使用して、アグロバクテリウム媒介性の方法によってＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物（栽培変種Ｗ３８）を安定的に形質転換した。カナマイシン耐性に基づいて選抜したトランスジェニック植物を、温室内で成熟するまで生長させる。植物成長期の異なる段階で、トランスジェニック葉組織からサンプルを採取する。これは、野生型Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ及びｐＪＰ３５０２で形質転換されたＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物と比較して、レベルの増加したＴＡＧを含有している。
Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒａからのＬＤＡＰポリペプチドのクローニング及び性質決定
オレオシンは、オリーブ、アブラヤシ及びアボカドの中果皮等の種子以外の油蓄積植物組織で高度に発現しない（Ｍｕｒｐｈｙ，２０１２）。その代わりに、種子組織のオレオシンのものと類似した役割を果たすことができる脂肪滴会合タンパク質（ＬＤＡＰ）が、これらの組織に確認されている（Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。したがって、発明者らは、植物の生育組織で蓄積された油をＴＡＧリパーゼまたは他のサイトゾル酵素の活性から保護するための最適なパッケージングタンパク質に、オレオシンがなり得ない可能性について考察した。そこでＴＡＧ蓄積の増強について、以下の通り、ＬＤＡＰポリペプチドを確認及び評価した。
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｔａｌｌｏｗ ｔｒｅｅ、Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒａ、トウダイグサ科の果実は、種子の外側に油の豊富な組織を含んでいるため、特に発明者らは関心を持った。最近の研究（Ｄｉｖｉｅｔ ａｌが刊行物として提出済み）では、この油性（ｏｌｅｏｇｉｎｏｕｓ）組織（タロー層とも呼ばれる）がその果実の中果皮に由来し得ることが示された。したがって、発明者らはＳ．ｓｅｂｉｆｅｒａのトランスクリプトームをクエリして、ＬＤＡＰ配列を得た。果実の被覆組織及び種子組織の発現遺伝子の比較分析から、タロー層で高度に発現した、従来未確認の３つのＬＤＡＰ遺伝子からなる群が明らかになった。
３つのＬＤＡＰをコードするヌクレオチド配列を、３対のプライマーを使用して、タロー組織に由来するＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲにより得た。プライマー配列は、各３つの遺伝子の全コード領域と隣接するＤＮＡ配列に基づいた。プライマー配列は、ＬＤＡＰ１では、５’−ＴＴＴＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧ−３’（配列番号２４５）及び５’−ＡＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＡＡＧＴＣ−３’（配列番号２４６）ＡＴ−３’；ＬＤＡＰ２では、５’−ＣＴＴＴＴＣＴＣＡＣＡＣＣＧＴＡＴＣＴＣＣＧ−３’（配列番号２４７）及び５’−ＡＧＣＡＴＧＡＴＡＴＡ ＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号２４８）；ＬＤＡＰ３では、５’−ＧＣＧＡＣＡＧＴＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴ−３’（配列番号２４９）及び５’−ＡＴＡＣＡＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣ−３’（配列番号２５０）であった。
Ｓ．ｓｅｂｉｆｅｒａトランスクリプトーム解析により、各遺伝子ファミリー内での配列分散が１０％未満である、８つのＬＤＡＰ１、６つのＬＤＡＰ２及び６つのＬＤＡＰ３遺伝子を含む各ＬＤＡＰ遺伝子に対する、複数のオルソログが明らかになった。推定ペプチド配列をアラインメントし、系統樹をＧｅｎｉｏｕｓソフトウェアを使用して構築した（図１６）。これには、図１６に示した、アボカド（Ｐａｍ）から２つ、アブラヤシから１つ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（Ｐａｒ）から１つ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ａｔｈ）から２つ、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ（Ｔｂｒ）から５つ、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（Ｈｂｒ）から３つを含んだ他の植物種由来のＬＤＡＰホモログも加えた。系統樹から、ＳｓＬＤＡＰ３は、アボカド由来のＬＤＡＰ１及びＬＤＡＰ２ポリペプチド及びアブラヤシ由来のＬＤＡＰと大きいアミノ酸配列同一性を共有したが、対するＳｓＬＤＡＰ１及びＳｓＬＤＡＰ２ポリペプチドはより相違があった。
ＬＤＡＰの過剰発現のための遺伝子構築物
Ｓ．ｓｅｂｉｆｅｒａ由来のＬＤＡＰの機能を試験するために、葉細胞において３５Ｓプロモーターの制御下でこれらのポリペプチドをそれぞれ発現させる、発現ベクターを作製した。全長ＳｓＬＤＡＰ ｃＤＮＡ配列を、組み換え反応によってｐＤＯＮＲ２０７のデスティネーションベクターに挿入し、デスティネーションベクターのＣｃｄＢ及びＣｍ（Ｒ）領域をＳｓＬＤＡＰ ｃＤＮＡ断片に置き換えた。制限消化分析及びＤＮＡシーケンシングによる確認の後、構築物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１に導入し、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉細胞での一過性発現及びＮ．ｔａｂａｃｕｍの安定的形質転換の両方に使用した。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉において、３５Ｓ：：ＡｔＤＧＡＴ１及び３５Ｓ：：ＡｔＷＲＩ１の発現と組み合わせて、３５Ｓプロモーターの転写制御下で３つのＳｓＬＤＡＰ遺伝子をそれぞれ発現させると、ＬＤＡＰ構築物のない３５Ｓ：：ＡｔＤＧＡＴ１及び３５Ｓ：：ＡｔＷＲＩ１遺伝子を浸潤させた細胞と比較して、実質的にレベルの増加したＴＡＧ蓄積を産生した。ＴＡＧレベルは、対照細胞のＴＡＧレベルの約２倍以上に増加した。遺伝子の組み合わせを与えられている細胞では、対照細胞と比較して、α−リノレン酸（ＡＬＡ）レベルの有意な増加及び飽和脂肪酸レベルの減少が観察された。
ＹＦＰ融合ＬＤＡＰポリペプチドと葉細胞の脂肪滴との共局在化
ｉｎ ｖｉｖｏでＳｓＬＤＡＰを性質決定し、それらの動的挙動を観察するために、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）と融合させたＬＤＡＰポリペプチドからなる融合ポリペプチドを発現する、発現構築物を作製した。融合ポリペプチドごとに、ＹＦＰをＳｓＬＤＡＰのＣ末端にインフレームで融合した。その３´末端に終止コドンのない３つのＬＤＡＰ遺伝子それぞれの全オープンリーディングフレームをＹＦＰ配列に融合し、キメラ遺伝子をｐＤＯＮＲ２０７に挿入した。制限消化及びＤＮＡシーケンシングにより、得られた構築物を確認した後、構築物をＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１に導入し、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉細胞での一過性発現及びＮ．ｔａｂａｃｕｍの安定的形質転換の両方に使用した。葉細胞とＬＤＡＰ−ＹＦＰ構築物の浸潤後３日目に、浸潤帯からの葉片を、脂肪滴を陽性染色させるＮｉｌｅ Ｒｅｄで染色して、共焦顕微鏡下で観察し、ＹＦＰポリペプチドから赤い染色（脂肪滴）及び蛍光の両方を検出した。ＬＤＡＰ−ＹＦＰと脂肪滴との共局在化が観察され、ＬＤＡＰが葉細胞の脂肪滴と関連することが示された。
実施例１６．高レベルのＴＡＧを蓄積する葉での種々の脂質プールの脂肪酸修飾
発明者らは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＷＲＩ１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１及びＳ．ｉｎｄｉｃｕｍオレオシン（Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ ｅｔ ａｌ，２０１４）をコードする導入遺伝子の共発現によって、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉でのＴＡＧレベルの増加した産物について記載した。葉中に存在する種々の脂質プールの脂肪酸修飾が、ＷＲＩ１とＤＧＡＴ１遺伝子組み合わせの共発現により可能であったかどうかを調査するために、一過性発現実験を実施し、アシル−ＣｏＡ及びアシル−ＰＣプールの脂肪酸が発生し得るかどうかを調べた。一実験では、Ｃ１８：１−ＣｏＡをＣ２０：１−ＣｏＡへと伸長するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ脂肪酸エロンガーゼ（ＡｔＦａｅ１）をコードする導入遺伝子の発現を、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴをコードする遺伝子と組み合わせて、アシル−ＣｏＡプールの修飾を試験した。第２の実験では、Ｃ１８：１−ＰＣからＣ１８：２−ＰＣへと不飽和化するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ脂肪酸デサチュラーゼ２（ＡｔＦＡＤ２）をコードする導入遺伝子を、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ遺伝子と組み合わせて、ＰＣプールの修飾を試験した。これらの実験は、植物細胞のＥＲにおけるアシル基質の有効性を試験するように設計された。
ＡｔＦＡＥ１をコードする遺伝子を、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターから単独で、または実施例１に記載したようにＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１と組み合わせて、３回発現させた。葉サンプルは、異なる遺伝子組み合わせを含むアグロバクテリウム細胞に浸潤後５日間で採取した。総脂質を葉サンプルから抽出し、ＴＡＧ画分をＴＬＣにより各々から分離した。各ＴＡＧ画分の脂肪酸組成を、既知量のＣ１７：０−ＴＡＧを内部標準物質として使用し、ＧＣにより測定して定量化した。表１５に示すように、ＴＡＧ中のＣ２０：１の比率は、ＡｔＡＦＥ１の発現時に有意に増加した。ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１とＡｔＦＡＥ１との共発現は、対照と比較して、Ｃ２０：１生成物のレベルも増加させた一方、総ＴＡＧ量を０．８から１４．９μｇ／ｍｇ葉に増加させた。ＴＡＧ中のＣ２０：１生成物は、ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１の組み合わせがない場合の１ｍｇ当たり０．０４μｇと比較して、１ｍｇ当たり０．９６μｇまで蓄積された。
表１５．Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉での修飾酵素のトランスジェニック発現後の脂肪酸レベルの変化。
Figure 0006882160
同様に、ＡｔＦＡＤ２を、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉でＣａＭＶ３５Ｓプロモーターから、単独でまたはＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１と組み合わせて共発現させた。ＴＡＧ画分の脂肪酸組成を、上記のように測定して定量化した。ＴＡＧ中のＣ１８：２脂肪酸レベルは、ＡｔＦＡＤ２をＷＲＩ１及びＤＧＡＴ１と共発現させたとき、１０．７％から３７．９％へと有意に増加し、Ｃ１８：１のレベルは１９．５％から７．６％へと減少した。加えて、ＷＲＩ＋ＤＧＡＴ１＋ＡｔＦＡＤ２を葉で共発現させたとき、相当なレベルのＴＡＧ（１３．４μｇ／ｍｇ葉）が観察された。これらの結果は、脂肪酸組成及び脂肪酸量を、少なくともＷＲＩ１及びＤＧＡＴと組み合わせた脂肪酸修飾酵素の付加によって変更することができ、それにより、これを利用して、アシル−ＣｏＡ及びＰＣプールの一方または両方で生成され、最終的に生育植物部分のＴＡＧに貯蔵される修飾された脂肪酸生成物の蓄積を増加させ得ることを明らかに示した。
実施例１７．植物中のＴＧＤ遺伝子のサイレンシング
Ｌｉ−Ｂｅｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉（１６：３植物）では、葉緑体で合成された脂肪酸の約４０％が原核型経路に入り、それに対して６０％は移出して真核型経路に入ると推定した。ＥＲで脂肪酸が不飽和化された後、移出された脂肪酸の約半分は色素体に戻され、チラコイド膜のガラクト脂質合成を補助する。脂肪酸のＤＡＧまたはリン脂質としての色素体への輸送（移入）は、ＴＧＤ１（葉緑体内包膜のパーミアーゼ様タンパク質）と関連する。ＴＧＤ１、２及び３タンパク質を含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＡＢＣ脂質トランスポーターは、Ｂｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８及び２００９）によって、更に最近になりＲｏｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）によって同定された。このタンパク質複合体は、葉緑体内包膜に局在化され、この膜全体へのホスファチジン酸の転送を媒介することが提唱されている。ＴＧＤ２ポリペプチドはホスファチジン酸結合タンパク質であり、ＴＧＤ３はＡＴＰａｓｅである。新規なＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓタンパク質（ＴＧＤ４）が遺伝子手法（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）によって同定され、そのＴＧＤ４遺伝子の失活はまた、ＥＲから色素体への脂質輸送を阻害した。最近の生化学データから、ＴＧＤ４は葉緑体外包膜に存在するホスファチジン酸結合タンパク質であることが示された（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｂｅｎｎｉｎｇ，２０１２）。
Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの漏出性ｔｇｄ１対立遺伝子が、植物生長の減少及び胚発育不全の高頻度の発生をもたらすと記載した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｔｇｄ１突然変異体の葉組織は、サイトゾル油滴と同等の、増加したＴＡＧレベルを含有した。加えて、ＴＡＧレベルの上昇は、ｔｇｄ１突然変異体の根にも見出された。種子油含有量に差は検出されなかった。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｔｇｄ２（Ａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ｔｇｄ３（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）及びｔｇｄ４突然変異体（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）について、葉組織で類似のＴＡＧ蓄積が報告されている。すべてのｔｇｄ突然変異対立遺伝子は、十分に漏出性であるか、または植物成長を極度に損なった。
ＴＧＤ１サイレンシング
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａトランスクリプトームで同定された全長ｍＲＮＡ転写物に基づいて、ＴＧＤ１色素体インポーターに対するサイレンシング構築物を産生した。６８５ｂｐの断片をＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のｃＤＮＡから増幅すると同時に、５´末端にＰｍｌＩ部位を組み込んだ。最初にＴＧＤ１断片をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、続いてＬＲクローニング（Ｇａｔｅｗａｙ）によってｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ１２デスティネーションベクターに挿入した。得られた発現ベクターは、ｐＯＩＬ０２５と称した。これをＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａで一過性発現させ、葉のＴＡＧレベルに対するＴＧＤ１遺伝子サイレンシングの効果を評価する。ＴＧＤ１ヘアピン構築物を、Ａ．ｎｉｇｅｒの誘発性プロモーターａｌｃＡの制御下で、ＰｍｌＩ−ＥｃｏＲＶ断片としてｐＯＩＬ０２０（下記）のＮｈｅＩ（ｋｌｅｎｏｗ）−ＳｆｏＩ部位にサブクローニングすることにより配置する。葉の油レベルを更に増加させるため、得られたベクター（ｐＯＩＬ０２６と称する）を、ホモ接合性Ｎ．ｔａｂａｃｕｍのｐＪＰ３５０２系統に超形質転換する。
ＴＧＤ−２、ＴＧＤ−３及びＴＧＤ−４遺伝子の発現を低減させるヘアピンＲＮＡを発現するために、更に別の構築物を作製する。これらの構築物を使用して、形質転換された植物を産生し、形質転換体の含油量を決定する。形質転換された植物を、ｐＪＰ３５０２または上記の遺伝子の他の組み合わせを用いて産生された形質転換体と交配する。
実施例１８．ジャガイモ塊茎での遺伝子組み合わせの発現
ｐＪＰ３５０６の構築
ジャガイモ塊茎に発現させる３つの遺伝子を含んでいる遺伝子構築物を作製し、ジャガイモの形質転換に使用した。この構築物をｐＪＰ３５０６と称した。これは、既存のベクターｐＪＰ３５０２（ＷＯ２０１３／０９６９９３）を基に、塊茎特異的発現をもたらすプロモーターの置換を有した。ｐＪＰ３５０６は、（ｉ）選択マーカー遺伝子として、重複エンハンサー領域（ｅ３５Ｓ）を有する３５Ｓプロモーターによって誘導されるＮＰＴＩＩカナマイシン耐性遺伝子、ならびに３つの遺伝子発現カセットを含んでおり、このカセットは、（ｉｉ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ１をコードする３５Ｓ：：ＡｔＤＧＡＴ１、（ｉｉｉ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１をコードするＢ３３：：ＡｔＷＲＩ１、及び（ｉｖ）Ｓｅｓａｍｅ ｉｎｄｉｃｕｍ由来のオレオシンをコードする、Ｂ３３：：ゴマオレオシンであった。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ｐＪＰ３５０２と同様であった。パタチンＢ３３プロモーター（Ｂ３３）は、Ｄｒ Ａｌｉｓｄａｉｒ Ｆｅｒｎｉｅ，Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｐｏｔｓｄａｍ，Ｇｅｒｍａｎｙにより提供された、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに由来する塊茎特異的プロモーターであった。ｐＪＰ３５０６の環状プラスミド地図を図１７に示す。
ｐＪＰ３５０６構築物に使用されたＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍのパタチンＢ３３プロモーター配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１４４８３と比較して、５´末端から１８３ヌクレオチドの欠失及び３´末端から２６１のヌクレオチドの欠失を有するトランケート変形型であった。ｐＪＰ３５０６に使用されたようなパタチンＢ３３プロモーターのヌクレオチド配列を、配列番号２１１として示す。
ジャガイモの形質転換
組織培養で無菌的に（ａｓｃｅｐｔｉｃａｌｌｙ）生長させたＡｔｌａｎｔｉｃ栽培品種のジャガイモ苗（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）をＴｏｏｌａｎｇｉ Ｅｌｉｔｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａｎ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｓｅｅｄ Ｐｏｔａｔｏ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＶｉＣＳＰＡ）（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。ｐＪＰ３５０６を含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４の懸濁液下で、茎節間を長さ約１ｃｍ片に切断した。アグロバクテリウム細胞をＯＤ０．２まで増殖させ、等体積のＭＳ培地で希釈した。無菌の濾紙上で茎片を軽く拭き取って過剰なアグロバクテリウム懸濁液を除去し、次にこれをＭＳ培地上に留置して、２日間２４℃に維持した（共存培養）。次に、２００μｇ／ＬのＮＡＡ、２ｍｇ／ＬのＢＡＰ及び２５０ｍｇ／ＬのＣｅｆｅｔａｘｉｍｅを補充した新しいＭＳ培地に、節間を移した。２ｍｇ／ＬのＢＡＰ、５ｍｇ／ＬのＧＡ３、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５０ｍｇ／ＬのＣｅｆｅｔａｘｉｍｅを補充した新しいＭＳ培地に節間を移して、１０日目以降にトランスジェニックカルスの選抜を開始した。カルスから再生されるシュートを切断して、根誘導のための無添加のＭＳ培地上に留置した後、ポッティングミックスを含有した１５ｃｍ径のポットに移植し、温室内で塊茎の生長を含め植物が成熟するまで生長させた。
ＰＣＲによるトランスジェニック植物のＤＮＡ抽出及び分子同定
温室内の植物のジャガイモの葉から直径約１ｃｍの葉片を得た。これらを、深型ウェルマイクロタイタープレート内に配置し、４８時間凍結乾燥した。次に、各ウェルに鋼鉄製ボールベアリングを加えて、Ｒｅｉｃｈｔ組織破砕機（Ｑｉａｇｅｎ）にてマイクロタイタープレートの各側に対して２分ずつ、最大頻度２８回／秒でプレートを振盪することにより、凍結乾燥された葉サンプルを粉砕した。０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０５ＭのＥＤＴＡ及び１．２５％のＳＤＳを含有する３７５μＬの抽出緩衝液を、粉末状の葉組織を入れた各ウェルに添加した。６５℃で１時間インキュベートした後、１８７μＬの６Ｍ酢酸アンモニウムを各ウェルに添加し、この混合物を４℃で３０分間保存した後、３０００ｒｐｍで３０分間、プレートを遠心した。各ウェルから３４０μＬの上清を、２２０μＬのイソプロパノールを入れた新しい深型ウェルマイクロタイタープレートに移し、室温にて５分間保持した後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心した。沈降したＤＮＡペレットを７０％のエタノールで洗浄し、空気乾燥して、サンプル当たり２２５μＬのＨ２Ｏで再懸濁した。
各葉サンプルのＤＮＡ調製物から２μＬずつを、ＨｏｔＳｔａｒ ＰＣＲ系を使用している２０μＬのＰＣＲ反応混合試薬（Ｑｉａｇｅｎ）に添加した。タバコに合わせてコドンを最適化したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＷＲＩ１遺伝子の５´配列及び３´配列を基にした、一対のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応に使用した。各配列は、Ｎｔ−Ｗｒｉ−Ｐ３：５’−ＣＡＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２１２）及び Ｎｔ−Ｗｒｉ−Ｐ１：５’−ＧＡＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号２１３）であった。また、タバコに合わせてコドンを最適化したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＤＧＡＴ１遺伝子を基にした、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、各ＤＮＡサンプルに対して個別にＰＣＲ反応させた。各配列は、Ｎｔ−ＤＧＡＴ−Ｐ２：５’−ＧＧＣＧＡＴＴＴＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号２１４）及びＮｔ−ＤＧＡＴ−Ｐ３：５’−ＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＧＴＡＴＡＣＡＴ−３’（配列番号２１５）であった。最初のサイクルは１５分間９５℃、続く４０サイクルは３０秒間９５℃、３０秒間５７℃、６０秒間７２℃で増幅を実施した。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で電気泳動し、特定の増幅産物を検出した。
ジャガイモ塊茎の脂質分析
確認済みのトランスジェニック植物及び非形質転換対照として再生されたジャガイモ植物から採取した塊茎の薄片を７２時間凍結乾燥して、脂質含有量及び組成を分析した。クロロホルム：メタノール：０．１ＭのＫＣｌ（２：１：１ｖ／ｖ／ｖ）を使用して、以下に従って乾燥塊茎組織から総脂質を抽出した。最初に、凍結乾燥させた塊茎組織を、Ｒｅｉｃｈｔ組織破砕機（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１秒当たり２９回の頻度で３分間、金属球を入れたエッペンドルフ管内のクロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）中でホモジナイズした。各ホモジェネートを、Ｖｉｂｒａｍａｘ １０（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ）を用いて、２，０００ｒｐｍで１５分間混合した後、０．１ＭのＫＣｌ溶液を１／３量ずつ各サンプルに添加し、更に混合した。１０，０００ｇで５分間遠心分離した後、脂質を含む下相を各サンプルから回収し、Ｎ２フローを使用して完全に蒸発させた。各脂質調製物を塊茎乾重量ミリグラム当たり３μＬのＣＨＣｌ３に溶解した。脂質調製物のアリコートを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（２０ｃｍｘ２０ｃｍ、シリカゲル６０、Ｍｅｒｋ）に載せ、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（７０：３０：１、ｖ／ｖ／ｖ）にて展開した。ＴＬＣプレートにＰｒｉｍｕｌｉｎｅを噴霧し、ＵＶ下で視覚化して脂質スポットを示した。適切なバンドのシリカを掻き取ってＴＡＧ及びＰＬを回収し、この材料を１Ｎメタノール性ＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）中で、内部標準物質である既知量のＴｒｉｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｎ（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ ＰＲＥＰ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）とともに、８０℃で２時間、インキュベートすることにより、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換し、脂質を定量化した。従来の記載の通り（Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、３０ｍのＢＰＸ７０カラム（内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５ｍｍ、ＳＧＥ、Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）を備えるＧＣ−ＦＩＤ（７８９０Ａ ＧＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によりＦＡＭＥを分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂ．０４．０３版）でピークを積分した。
直径約２ｃｍの若いジャガイモ塊茎に由来する脂質分析から、再生された約１００の個々のトランスジェニック系統のうち、多数のトランスジェニック植物からの塊茎において、総脂質、ＴＡＧ及びリン脂質画分中でのレベル増加が見られた。範囲は増加のないものから、かなり増加したものまで観察されたジャガイモ塊茎脂質の第１の分析は、成長の初期段階（直径約２ｃｍ）で通常の野生型ジャガイモ塊茎が、乾重量基準で約０．０３％のＴＡＧを含有したことを示した。
１６の独立した形質転換系統を代表する、２１の個々のトランスジェニック植物の塊茎で、０．５〜４．７重量％（乾重量）に総脂質の含有量が増加した（表１６）。系統＃６９の塊茎は、乾重量基準で平均３．３％と最も高いＴＡＧ蓄積を示した。これは、同一成長段階の野生型塊茎と比較して約１００倍の増加であった。同一トランスジェニック系統の塊茎はまた、若い塊茎において乾重量基準で１．０重量％という最も高レベルのリン脂質の蓄積が観察された（表１８）。トランスジェニック塊茎の脂肪酸組成の変化に伴って、脂質の蓄積もまた増強された。トランスジェニック塊茎は一貫して、総脂肪酸含有量及び総脂肪酸含有量に占めるＴＡＧ画分（表１７）の両方に関し、蓄積される飽和及びモノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）の比率は高く、かつ多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）のレベルは減少した。特に、１８：３（ＡＬＡ）のレベルは、野生型での約１７％からトランスジェニック塊茎では１０％未満へと減少した。総脂肪酸含有量中のオレイン酸（１８：１）のレベルは、野生型での約１％から、多数の系統で５％超、及び一部の塊茎で１５％超まで増加した。最適なトランスジェニック系統では、パルミチン酸レベルが増加したにもかかわらず、ステアリン酸（１８：０）レベルは減少した（表１６及び１７）。
塊茎の継続的な生長が可能であるように、トランスジェニックジャガイモ植物を温室内に維持した。系統＃６９の塊茎は大きいものほど、直径約２ｃｍの塊茎よりもＴＦＡ及びＴＡＧのレベルが増加した。
ＷＲＩ１及びＤＧＡＴ遺伝子と組み合わされて、内因性ＳＤＰ１遺伝子の発現を下方制御するサイレンシングＲＮＡをコードするキメラ遺伝子の付加により、ジャガイモ塊茎に得られるＴＦＡ及びＴＡＧのレベルは更に増加した。
ジャガイモの形質転換のための更なる遺伝子組み合わせ
新しい成長中のジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．栽培変種Ａｔｌａｎｔｉｃ）塊茎から、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により抽出した。ジャガイモＡＧＰａｓｅ小サブユニット及びＳＤＰ１をコードするｃＤＮＡの選択領域を、以下のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲから得た：ｓｔ−ＡＧＰｓ１：５’−ＡＣＡＧＡＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２５１）、ｓｔ−ＡＧＰａ１：５’−ＣＡＣＴＣＴＣＡＴＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣ−３’（配列番号２５２）、ｓｔ−ＳＤＰ１−ｓ１：５’−ＣＴＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２５３）、及びｓｔ−ＳＤＰ１−ａ１：５’−ＣＣＡＴＴＧＴＴＡＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＴＣ−３’（配列番号２５４）。次に、ＰＣＲ産物を精製し、ｐＧＥＭＴ Ｅａｓｙにライゲーションした。
表１６．ｐＪＰ３５０６のＴ−ＤＮＡで形質転換された代表的な若いジャガイモ塊茎における、植物開花前の総脂質収率（ジャガイモ塊茎の乾重量に占める重量％）及びその脂肪酸組成。系統６５の塊茎は野生型（非トランスジェニック）塊茎に相当した。
Figure 0006882160
表１７．ｐＪＰ３５０６のＴ−ＤＮＡで形質転換された代表的な若いジャガイモ塊茎における、植物開花前のＴＡＧ収率（ジャガイモ塊茎の乾重量に占める重量％）及びその脂肪酸組成。
Figure 0006882160
表１８．ｐＪＰ３５０６のＴ−ＤＮＡで形質転換された代表的な若いジャガイモ塊茎における、開花前のリン脂質収率（ジャガイモ塊茎の乾重量に占める重量％）及びその脂肪酸組成。
Figure 0006882160
ＤＮＡシーケンシングによる確認の後、クローン化されたＰＣＲ産物を直接、標的遺伝子配列として使用して、ヘアピンＲＮＡｉ構築物を作製するか、またはＰＣＲの反復により産物を融合させた。３つのＰＣＲ断片（ＳＤＰ１、ＡＧＰａｓｅ、ＳＤＰ＋ＡＧＰ）を引き続き、特異的制限部位を含んだｐＫａｎｎｉｂａｌベクターにクローニングし、所望する断片をセンス方向及びアンチセンス方向にクローニングした。選択した制限部位は、センス方向の断片のクローニングではＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩであり、アンチセンス方向の断片の挿入ではＫｐｎＩ及びＸｈｏＩであった。ｐＫａｎｎｉｂａｌのクローニング部位に断片を誘導する制限部位の付加によって、３つの標的遺伝子断片の増幅に使用されるプライマーセットを変更した。ｐＫａｎｎｉｂａｌの３５ＳプロモーターとＯＣＳターミネーターとの間に標的ＤＮＡ断片を含んでいる発現カセットをＮｏｔ１で切り出し、植物選択マーカーとしてハイグロマイシンを有するバイナリーベクターｐＷＢＶｅｃ２にクローニングした。このようなバイナリーベクターをＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＡＧＬ１株に導入し、上記のようなジャガイモの形質転換に使用した。
実施例１９．単子葉植物の含油量の増加
内胚乳での発現
内胚乳特異的プロモーターを使用して、穀粒成長期の内胚乳に、ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ及びオレオシンをコードする遺伝子の組み合わせを発現させることにより、単子葉植物種Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）の内胚乳、ひいては植物の穀粒での含油量が増加した。構築物（ｐＯＩＬ−Ｅｎｄｏ２と称した）は以下のキメラ遺伝子を含んでいた：（ａ）ＢｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍのＧｌｕ１遺伝子プロモーター：：ＺｍＷＲＩ１ポリペプチドをコードするＺｅａ ｍａｙｓ遺伝子のタンパク質コード領域（配列番号３５）：：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン遺伝子由来のターミネーター／ポリアデニル化領域、（ｂ）Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍのＢｘ１７グルテニン遺伝子のプロモーター：：ＡｔＤＧＡＴ１ポリペプチドをコードするＡ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子のタンパク質コード領域（配列番号１）：：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｎｏｓ遺伝子由来のターミネーター／ポリアデニル化領域、（ｃ）Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａのＧｌｕＢ４遺伝子プロモーター：：オレオシンポリペプチドをコードするＳｅｓａｍｅ ｉｎｄｉｃｕｍ遺伝子のタンパク質コード領域：：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン遺伝子由来のターミネーター／ポリアデニル化領域、及び（ｄ）３５Ｓプロモーター：：選択マーカー遺伝子としてのハイグロマイシン耐性コード領域。この構築物を使用して、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によってＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（栽培変種Ｆｉｅｌｄｅｒ）の未成熟胚を形質転換した。接種された未成熟胚をハイグロマイシンと作用させ、形質転換されたシュートを選抜した後、発根培地に移し、根が形成されたら土壌へと移した。
Ｔ１種子を結実した、ｐＯＩＬ−Ｅｎｄｏ２由来のＴ−ＤＮＡを含んだ３０の形質転換植物を得た。成熟した種子を３０の植物すべてから採取し、各ファミリーの６種子を半分に切った。胚を含んでいる半分は、後で発芽させるために貯蔵し、主に内胚乳を含んでいる残り半分は、抽出して含油量を試験した。これらの植物由来のＴ１種子中では、コムギゲノムに挿入されたＴ−ＤＮＡが、まだ分離していたため、Ｔ１種子はＴ−ＤＮＡに対してホモ接合性の形質転換、ヘテロ接合性の形質転換及びヌル（複数可）が混在していた。一部の穀粒の内胚乳で含油量の増加が観察され、中には５倍超のＴＡＧレベルの増加を示した穀粒もあった。６つの野生型穀粒（栽培変種Ｆｉｅｌｄｅｒ）の内胚乳の半分は、一部の穀粒での２．５％のＴＡＧ含有量と比較して、約０．４７重量％（範囲０．３７％〜０．６０％）のＴＡＧ含有量を有した。一部のファミリーは、６つの穀粒すべてで１．７％を上回るＴＡＧを有し、それ以外は、明らかに両方の野生型とは分離されており、ＴＡＧの含有量が増加していた。ＴＡＧ含有量の増加した内胚乳では、脂肪酸組成もまた変化しており、オレイン酸及びパルミチン酸の比率は増加を示し、リノール酸の比率は減少を示した（表１９）。Ｔ１穀粒は、対応する野生型穀粒と同じ速度で問題なく発芽し、１４のＴ０ファミリー由来の高油量及び低油量両方の個体を代表する植物は成熟するまで生長した。これらの植物は、完全な稔性をもつ雌雄であった。
この穀粒は、ヒトの消費する食料製品の調理にまたは動物飼料として有用であり、単位重量当たりのエネルギー含有量（エネルギー密度）の増加した穀粒を提供し、動物（例えば家禽、ブタ、ウシ、ヒツジ及びウマ等）の成長速度の増加をもたらす。
表１９．トランスジェニックコムギ内胚乳でのＴＡＧ含有量の脂肪酸組成（総脂肪酸に占める％）及び総ＴＡＧ含有量（半分の内胚乳のうち油の重量％）
Figure 0006882160
構築物ｐＯＩＬ−Ｅｎｄｏ２はまた、内胚乳中、ひいては穀粒中のＴＡＧ含有量の増加したトランスジェニック植物を得るために、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）及びイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）の形質転換にも使用する。
葉及び茎での発現
生育組織の含油量を増加させるために、モロコシ（Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ）及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）のアグロバクテリウム媒介性の形質転換に適した、一連のバイナリー発現ベクターを設計した。構築のための出発ベクターは、ｐＯＩＬ０９３−０９５、ｐＯＩＬ１３４及びｐＯＩＬ１００−１０４（実施例４を参照）であった。最初に、Ｚ．ｍａｙｓのＷＲＩ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、テンプレートとしてのｐＯＩＬ１０４及びＫｐｎＩ制限部位を含むプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。この断片を、ｐＯＩＬ０９５のＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ａｃｔｉｎ１構成的プロモーターの下流に、ＫｐｎＩ部位を利用してサブクローニングした。得られたベクターをｐＯＩＬ１５４と称した。Ｚ．ｍａｙｓユビキチンプロモーター（ｐＺｍＵｂｉ）の制御下でＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｒａｍａｎｎｉａｎａのＤＧＡＴ２ａをコードするＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩ断片としてｐＯＩＬ１３４から分離し、ｐＯＩＬ１５４のＮｏｔＩ部位に挿入して、ｐＯＩＬ１５５を得た。ｐＺｍＵｂｉプロモーターの制御下にあり、３´末端にＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＮＯＳターミネーター／ポリアデニル化領域が隣接するＰＡＴコード領域からなる発現カセットを、テンプレートとしてｐＪＰ３４１６を使用して、ＰＡＴコード領域を増幅することにより構築した。プライマーは、５´及び３´末端にそれぞれＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限部位を組み込むように設計した。ＢａｍＨＩ＋ＳａｃＩの二重消化後、ＰＡＴ断片をｐＺＬＵｂｉ１ｃａｓＮＫのそれぞれの部位にクローニングした。得られた中間体をｐＯＩＬ１４１と称した。次に、ＰＡＴ選択マーカーカセットをｐＯＩＬ１５５主鎖に導入した。この目的のため、ｐＯＩＬ１４１を最初にＮｏｔＩで切断して、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で平滑化し、続いてＡｓｃＩで消化した。次に、この２６２２ｂｐの断片を、ｐＯＩＬ１５５のＺｒａＩ−ＡｓｃＩ部位にサブクローニングし、ｐＯＩＬ１５６を得た。最後に、ｐＯＩＬ１５６のＷＲＩ１発現を誘導するＡｃｔｉｎ１プロモーターを、Ｚ．ｍａｙｓのＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーター（ｐＺｍＳＳＵ）と交換し、ｐＯＩＬ１５７を得た。このベクターは、テンプレートとしてのｐＯＩＬ１０４、ならびにＡｓｉＳＩ及びＰｍｌＩ制限部位を含むフランキングプライマーを使用して、Ｚ．ｍａｙｓのＳＳＵプロモーターのＰＣＲ増幅によって得た。次に、得られたアンプリコンをＳｐｅＩ＋ＭｌｕＩで切断し、ｐＯＩＬ１５６のそれぞれの部位にサブクローニングした。
その結果、これらのベクターは以下の発現カセットを含んでいた：
ｐＯＩＬ１５６：プロモーターＯ．ｓａｔｉｖａ Ａｃｔｉｎ１：：Ｚ．ｍａｙｓ ＷＲＩ１、プロモーターＺ．ｍａｙｓ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ：：Ｕ．ｒａｍｍａｎｉａｎａ ＤＧＡＴ２ａ及びプロモーターＺ．ｍａｙｓ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ：ＰＡＴ
ｐＯＩＬ１５７：プロモーターＺ．ｍａｙｓ ＳＳＵ：：Ｚ．ｍａｙｓ ＷＲＩ１、プロモーターＺ．ｍａｙｓ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ：：Ｕ．ｒａｍｍａｎｉａｎａ ＤＧＡＴ２ａ及びＺ．ｍａｙｓ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ：：ＰＡＴ。
Ｚ．ｍａｙｓ ＳＥＥ１老化プロモーター（Ｒｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４年、実施例４を参照）、Ｚ．ｍａｙｓ ＬＥＣ１転写因子（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）及びＳ．ｂｉｃｏｌｏｒ ＳＤＰ１ ｈｐＲＮＡｉ断片を含んでいる第２の一連のバイナリー発現ベクターを以下に従って構築した。最初に、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）を、ｐＤＣＯＴのＡａｔＩＩ＋ＳｎａＢＩ消化によってｐＯＲＥ０４に導入し、ｐＯＲＥ０４のＡａｔＩＩ＋ＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。得られた中間体ベクターをｐＯＩＬ１５８と称した。次に、Ｚ．ｍａｙｓユビキチンプロモーターの制御下でＰＡＴ選択マーカー遺伝子をｐＯＩＬ１５８にサブクローニングした。この目的のため、ｐＯＩＬ１４１を最初にＮｏｔＩで消化して、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で処理し、最後にＡｓｃＩで消化した。得られた断片をｐＯＩＬ１５８のＡｓｃＩ＋ＺｒａＩ部位に挿入し、ｐＯＩＬ１５９を得た。ｐＯＩＬ１５９の元のＲＫ２ ｏｒｉＶ複製起点をｐＪＰ３４１６のＳｗａＩ＋ＳｐｅＩ制限消化によってＲｉＡ４起点と交換し、続いてｐＯＩＬ１５９のＳｗａＩ＋ＡｖｒＩＩ部位にサブクローニングした。得られたベクターをｐＯＩＬ１６０と称した。以下の発現カセットを含んでいる１０．０１９ｋｂの「単子葉植物老化パート１」断片を合成した：Ｏ．ｓａｔｉｖａ Ａｃｔｉｎ１：：Ｚ．ｍａｙｓ発現にコドンを最適化したＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１、Ｚ．ｍａｙｓ ＳＥＥ１：：Ｚ．ｍａｙｓ ＷＲＩ１、Ｚ．ｍａｙｓ ＳＥＥ１：：Ｚ．ｍａｙｓ ＬＥＣ１。この断片をＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＶ断片としてｐＯＩＬ１６０のＳｐｅＩ−ＳｔｕＩ部位にサブクローニングし、ｐＯＩＬ１６１を得た。第２の７．９６７ｋｂの「単子葉植物老化パート２」断片を合成する。これは、以下の要素を含む：ＭＡＲ、Ｚ．ｍａｙｓユビキチン：：Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ／Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ ＳＤＰ１を標的とするｈｐＲＮＡｉ断片、Ｏ．ｓａｔｉｖａ Ａｃｔｉｎ１プロモーターの制御下の空のカセット。２つのＳ．ｂｉｃｏｌｏｒ ＳＤＰ１のＴＡＧリパーゼの配列（アクセッション番号ＸＭ＿００２４６３６２０；配列番号２４２及びＸＭ＿００２４５８４８６；配列番号１６９）、及び１つのＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ ＳＤＰ１配列（アクセッション番号ＡＫ３３４５４７）（配列番号２４３）を、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＳＤＰ１配列（アクセッション番号ＮＭ＿１２０４８６）を用いたＢＬＡＳＴ検索により得た。Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ ＳＤＰ１配列と高度の同一性を示したＳ．ｂｉｃｏｌｏｒのＸＭ＿００２４５８４８６配列の４つの断片（６７ｂｐ、９０ｂｐ、５０ｂｐ、５９ｂｐ）を包含する合成ヘアピン構築物（配列番号２４４）を設計した。加えて、両方のＳ．ｂｉｃｏｌｏｒのＳＤＰ１配列に対するサイレンシング効率を増加させるために、Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒのＸＭ＿００２４６３６２０ ＳＤＰ１リパーゼから生じる２７８ｂｐの断片を含めた。「単子葉植物老化パート２」断片をＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＶ断片としてｐＯＩＬ１６１のＢｓｉＷＩ−ＦｓｐＩ部位にサブクローニングする。得られたベクターをｐＯＩＬ１６２と称する。
遺伝子構築物ｐＯＩＬ１５６ ｐＯＩＬ１５７、ｐＯＩＬ１６２及びｐＯＩＬ１６３を使用し、アグロバクテリウム媒介性の形質転換を用いて、Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ及びＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍを形質転換する。トランスジェニック植物をハイグロマイシン耐性で選抜する。これは、未形質転換の対照植物と比較して生育組織でレベルの増加したＴＡＧ及びＴＦＡを含有する。このような植物は、干し草またはサイレージとして動物用の飼料を提供する際、ならびに穀粒を産生する際に有用であり、または油の抽出に使用することができる。
実施例２０．油の抽出及びバイオディーゼルの製造
葉からの脂質抽出
夏季に温室内で生長させた植物から、ｐＪＰ３５０２由来のＴ−ＤＮＡで形質転換されたトランスジェニックタバコ葉を採取した。葉を乾燥させ、次いで１〜３ｍｍ大の葉片に破砕した後、抽出した。後述のように、破砕した材料に選択溶媒で２４時間にわたってソックスレー（還流）抽出を施した。各抽出実験に５ｇの乾燥タバコ葉材料及び２５０ｍＬの溶媒を使用した。
ヘキサン溶媒抽出
ヘキサンは、中性（非極性）脂質を抽出する、カノーラ等の圧搾油糧種子からの商業的な油抽出に溶媒として一般に使用されるため、最初にこの方法を試した。脂質抽出量は５ｇの葉材料から１．４７ｇであり、脂質回収率は２９重量％であった。ＤＭＳＯ中でヘキサン抽出した脂質の１Ｈ ＮＭＲ分析を実施した。分析は、芳香族生成物の存在しない長鎖脂肪酸トリグリセリドの典型的シグナルを示した。次に、脂質をＧＣＭＳにかけ、主成分を同定した。ヘキサン抽出した脂質の直接的ＧＣＭＳ分析は、沸点が高すぎ、ＧＣＭＳ内で成分が分解されるため困難であることが実証された。このような状況では、最初に脂肪酸のメチルエステルを作製することが一般的な分析方法である。これを以下に従って実施した：１ｍＬのトルエンに１８ｍｇの脂質抽出物を溶解させ、３ｍＬの乾燥３Ｎメタノール性ＨＣＬを添加して、６０℃で一晩撹拌した。５ｍＬの５％ＮａＣｌ及び５ｍＬのヘキサンを冷却されたバイアルに加えて振盪させた。有機層を除去し、新たに５ｍＬのヘキサンを追加して抽出を繰り返した。複合有機画分を、８ｍＬの２％ＫＨＣＯ３によって中和して分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。ヘキサン中の濃度を１ｍｇ／ｍＬになるようにＮ２流下で溶媒を蒸発させ、ＧＣＭＳで分析した。存在する主脂肪酸は、１６：０（パルミチン、３８．９％）及び１８：１（オレイン、３１．３％）であった。
Figure 0006882160
アセトン溶媒抽出
アセトンは、その溶解特性により、葉からほぼすべての脂質、すなわち非極性脂質と極性脂質の両方を必然的に抽出するため、抽出溶媒として使用した。アセトン抽出した油は、ヘキサン抽出した脂質と外観は類似していた。脂質抽出量は５ｇのタバコ葉から１．５９ｇ、すなわち３１．８重量％であった。ＤＭＳＯ中で脂質の１ＨのＮＭＲ分析を実施した。芳香族生成物のシグナルが存在しない長鎖脂肪酸トリグリセリドに典型的なシグナルが観察された。
熱水溶媒抽出
タバコ葉から油を得るのに適しているかどうかを確認するため、熱水を抽出溶媒として試した。水抽出物質は、外観上はゲル様であり、冷却するとゲル化した。抽出量は１．９ｇ、すなわち３８重量％であった。この物質は濃密なゲル様であり、多くの場合、葉からの極性化合物、例えば糖及びその他の炭水化物等を含んでいた。ＤＭＳＯ中で物質の１Ｈ ＮＭＲ分析を実施した。分析は、芳香族生成物が抽出されていない長鎖脂肪酸トリグリセリドの典型的シグナルを示した。残留固体物質をヘキサンで抽出し、２０重量％の脂質を得た。これは、水抽出が非極性脂質の抽出には非効率であったことを示す。
エタノール溶媒抽出
タバコ葉から油を得るのに適しているかどうかを確認するため、エタノールを抽出溶媒として使用した。エタノール抽出した脂質は、水抽出及びヘキサン抽出した脂質の両方と外観が類似しており、色は黄赤色で、ゲル状の外観を有し、冷却するとゲル化した。脂質抽出量は５ｇのタバコ葉から１．８８ｇ、すなわち３７．６重量％であった。エタノール溶媒は、タバコ葉の極性化合物の一部も抽出したと思われる。
エーテル溶媒抽出
ジエチルエーテルを抽出溶媒として試した理由は、他の溶媒よりも不純物の少ない抽出が可能であり得ると考えたためである。抽出により１．４ｇ、すなわち２８重量％を得た。エーテル抽出した脂質は、外観上はヘキサン抽出物と類似しており、色は黄色っぽく、ヘキサン抽出物よりもわずかに清澄な外観をしていた。ジエチルエーテル抽出は最も清澄な油が得られたように見えたが、ＮＭＲ分析では、より多くの有機化合物の混合物を示した。
タバコ植物からのバイオディーゼル製造
トランスジェニックタバコ植物のバッチを冬季にわたり（通常の生長時季ではない）生長させ、自然光の少ない寒冷な季節の間、葉内の油生成を評価した。成熟植物からの葉は、乾重量基準で約１０％の油を有した。これは夏季に生長した植物よりもはるかに低かった。しかしながら、脂質を抽出して、以下に従ってバイオディーゼルに変換した。工程の各段階は、（ａ）粗脂質の抽出、（ｂ）脂質からのＴＡＧの精製、及び（ｃ）精製されたＴＡＧのバイオディーゼルへの変換であった。
ヘキサン（石油エーテル４０〜６０℃）を抽出溶媒として使用し、ほとんどを非極性脂質が占める油を得た。５００ｇのタバコ葉材料を乾燥させて計量し、次いで撹拌しながら一晩ヘキサンに浸漬した。混合物を濾過した後、ヘキサン抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、活性炭処理して油を脱色した。溶液を濾過して、得られた液体をロータリーエバポレーター内で蒸発させ、約４２グラムの原油を得た。これは色が黄緑で、冷却時に粘性の粘度を有した。この油の一部を使用して、直接バイオディーゼルを製造しようと試みたが、不純物の数及び大量の遊離脂肪酸が、多量の石鹸の生成を引き起こし、これがメチル化反応及び生成物の分離を妨げた。したがって、バイオディーゼルを製造するためには、エステル交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｆｉｃａｔｉｏｎ）反応の前に、この油を更に精製してＴＡＧ画分を濃縮させる必要があった。
冬季に生長させたサンプルに関する問題点の１つは、抽出物中に存在する遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルが比較的高く、その結果、過剰な石鹸を生じさせ、これがメチルエステル及びグリセロール生成物の分離を妨げたことであった。油中のＴＡＧを精製するための溶媒系をいくつか研究し、カラムクロマトグラフィーに好適である８０：２０のヘキサン／酢酸エチルの混合物を選択したヘキサン：酢酸エチル（８０：２０）を使用して、シリカカラムによる分離を実行した。より疎水性のＴＡＧが橙色／黄色の油としてカラムから最初に溶出した。次に溶出されたのは、濃緑色のバンドであった。これは葉緑素を含むタバコ葉のヘキサン溶解性成分の混合物を含有しており、多少のＴＡＧ及びＦＦＡが混在していた。純粋な酢酸エチルでカラムを洗浄して最終生成物を得たが、これは主にＦＦＡであった。
ＦＦＡ及びリン酸ならびにその他不純物よりもはるかに豊富であった精製済みＴＡＧから、直ちにバイオディーゼルを製造できた。これは、塩基触媒の存在下でＴＡＧをメタノールと反応させ、メチルエステル（バイオディーゼル）及びグリセロールを生成物として生成することにより行った。別の方法（酸触媒によるエステル化）を使用して脂肪酸をアルコールと反応させると、低純度のＴＡＧしか必要としない、ＦＦＡが存在するバイオディーゼルを製造することができる。固定床反応器、超臨界反応器及び超音波反応器等の他の方法は、化学触媒を使用しないか、またはそれを減少させるため、脂質からのバイオディーゼル製造にも用いることができる。しかしながら、塩基触媒方法は、出発油の水分及び遊離脂肪酸が少ない場合に限り、低温及び低圧しか必要とせずに、９８％超の変換収率を得られるため、精製されたＴＡＧの変換には最も経済的である。
精製されたＴＡＧを油温度６０℃にて、メトキシド溶液（ＮａＯＨとメタノールを完全に溶解されるまで混合した）で処理した。混合物を６０℃に維持し、２時間撹拌しながら、エステル交換反応を行った。反応混合物を室温まで冷却し、上部のバイオディーゼル層と下部のグリセロール層の二相に分離させた。次に、分液漏斗を使用して相を分離し、バイオディーゼルを回収した。
高油量の生育組織の熱水処理
生育植物部分を液体燃料等の工業製品に変換するためのより直接的な別の手法は、熱水処理（ＨＴＰ）によるものである。これを用いて、約３０重量％のＴＦＡを含有するトランスジェニックタバコ葉材料を、従来の石油精製原料に添加して再生可能ディーゼル（パラフィン系ディーゼル）を製造できる再生可能バイオ油に変換した。石油ディーゼルは多くの炭化水素化合物（主にアルカン）の混合物で、精製装置から２００〜３００℃で生じる画分であると定義され、典型的には主にＣ１３〜Ｃ２２炭化水素を含む。ＨＴＰによるトランスジェニックタバコ葉の典型的変換では、トランスジェニックタバコ生育植物の固体材料を水と混合し、濃度１６〜５０％の固体を作成する。次に、このスラリーを温度２７０〜４００℃にし、圧力７０〜３５０ｂａｒをかけた。反応時間は１〜６０分の間で変化し、実験は触媒としてＮａＯＨ及びＫＯＨあり、またはなしで実施した。
ＨＴＰ処理が終了し、反応物が冷却されると、３種類の生成物流、詳細にはガス、固体及び液体バイオ油に分離された。バイオ油収率は、原料量に対して、乾重量基準で２５〜４０％の間であった。図１８は、トランスジェニックタバコ葉材料が、対応する野生型タバコ葉材料と比較して、はるかに高いバイオ油収率を得たことを示す。
生育植物部分内の脂質のバイオディーゼルへの直接現場変換
別の一連の実験では、ＨＴＰ反応の水成分を、メタノール溶媒と置き換えた。メタノールの使用を試みる理由は多数あるが、１つは葉内のＴＡＧ油を一段階で直接（現場で）変換し、植物脂質中の脂肪酸のメチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成し、バイオディーゼルを直接製造するためである。前述のＨＴＰ実験と同様の反応条件及び装置を用い、水をメタノールに置き換え、反応温度は圧力２４０ｂａｒで３３５℃、ＮａＯＨを触媒とした。トランスジェニックタバコ生育植物部分が、投入重量に対して４７重量％のバイオ油を生成したのに対して、野生型タバコは３５重量％のバイオ油を生成した。得られた２種類のバイオ油のＨ１ ＮＭＲは、ごく少量のＦＡＭＥを示したのに対して、トランスジェニックタバコのバイオ油のＮＭＲは大量のバイオディーゼルＦＡＭＥを示した。
当業者であれば、広く説明される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されている本発明に対し、多くの変形及び／または改変が為され得ることを認識するであろう。それゆえ、本実施形態は、すべての点において、例示のためであり、限定ではないとみなされる。
本明細書で考察及び／または参照したすべての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、物品等の考察は、いずれも単に本発明の背景を提供するためのものである。これらの事項のいずれかまたはすべては、本出願の各請求項の優先日以前に存在していたという理由で、先行技術基盤の一部を形成する、または本発明に関連する分野における共通の一般知識であったことを承認するものと解釈されるべきではない。
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Claims (24)

  1. 油製品を製造するための方法であって、該方法が、
    （ｉ）反応器内で、
    （ａ）乾重量が少なくとも２ｇであり、非極性脂質の総含有量を乾重量基準で少なくとも５重量％有する生育植物部分と、
    （ｂ）水、アルコールまたは両方を含む溶媒と、を含む組成物を処理するステップであって、
    該処理は、酸化、還元または不活性環境にて組成物を温度約５０℃〜約４５０℃、圧力５〜３５０ｂａｒで１〜１２０分間加熱することを含むステップと、
    （ｉｉ）生育植物部分の乾重量に対して、少なくとも３５重量％の収率で反応器から油製品を回収し、それによって油製品を製造するステップと、を含む、方法。
  2. 工程（ｉ）の前記組成物が触媒をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記触媒がＮａＯＨまたはＫＯＨまたは両方を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記組成物中の前記触媒の濃度が０．１Ｍ〜２Ｍである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記生育植物部分が、少なくとも１ｋｇの乾重量を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記生育植物部分が、乾重量基準で少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または３０％〜７５％の非極性脂質の総含有量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記生育植物部分は、植物開花前の植物の葉または茎に由来する、またはそれら内にあり、前記生育植物部分は、少なくとも約8％、少なくとも約10％、少なくとも約11％、8％〜15％、または9％〜12％（w/w乾燥重量）の非極性脂質の総含有量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記組成物が、５％〜９０％の固体濃度を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 処理時間が、１〜６０分間である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 処理時間が、１０〜６０分間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 処理時間が、１５〜３０分間である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記溶媒が水である場合、前記方法により、前記生育植物部分の乾重量に対して、最小３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％または４０重量％から、最大５５重量％または６０重量％までの収率の前記油製品が製造される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記溶媒が約８０％の水を含む場合、前記油製品は約３０％のＣ１３〜Ｃ２２炭化水素化合物を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記溶媒がアルコールを含む場合、前記方法により、前記生育植物部分の乾重量に対して、最小３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％または４０重量％から、最大６５重量％または７０重量％までの収率の前記油製品が製造される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記溶媒が約５０％のメタノールを含む場合、前記油製品は約５０％の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記回収した油製品が、約１５重量％未満の含水量を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 非極性脂質の含有量が乾重量基準で２％未満である、相当する生育植物部分を用いた相当する方法と比較して、油製品の前記収率が少なくとも２重量％多い、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ステップ（ｉ）（ａ）において、前記生育植物部分が、乾燥、切断、破砕、粉砕、回転、加圧、圧縮または摩砕のうち１つ以上によって物理的に処理されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記生育植物部分は、植物の葉または茎または両方を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記回収した油製品の水素化脱酸素を更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記回収した油製品の水素処理により、前記油製品のケトンまたは糖のレベルを低減することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記回収した油製品の水素処理により、１種以上の燃料油、ディーゼル油、灯油またはガソリンを製造することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記油製品が、炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、アルカン（例えば、メタン、エタンまたは長鎖アルカン）、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオアルコール（例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール）、バイオ炭、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の混合物である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記脂肪酸エステルが、脂肪酸メチルエステル及び／または脂肪酸エチルエステルである、請求項２３に記載の方法。
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