DE3587718T2

DE3587718T2 - Herbizide Resistenz in Pflanzen.

Info

Publication number: DE3587718T2
Application number: DE3587718T
Authority: DE
Inventors: Paul Curtis Anderson; Kenneth A Hibberd
Original assignee: MGI Pharma Inc
Current assignee: MGI Pharma Inc
Priority date: 1984-03-06
Filing date: 1985-02-11
Publication date: 1994-08-04
Anticipated expiration: 2005-02-12
Also published as: EP0154204A3; EP0154204B1; AU3950785A; AU4494293A; BR8500986A; AU642633B2; CA1341465C; DE3587718D1; EP0154204A2; ATE100141T1; JPS60210929A; AU4608989A

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Gene und Enzyme, die Pflanzen, Pflanzengeweben und -samen Resistenz gegen Herbizide verleihen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf landwirtschaftlich wichtige Feldfrüchte, die gegen Herbizide resistent sind und die diese Eigenschaft ihrer Nachkommenschaft genetisch übertragen.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

2.1. UNKRAUTBEKÄMPFUNG

Die Verwendung von Herbiziden zur Bekämpfung von Unkräutern oder Pflanzen in Feldfrüchten ist fast eine universelle Praxis geworden. Der Markt für diese Herbizide nähert sich einer Milliarde Dollar jährlich. Selbst bei dieser umfangreichen Anwendung bleibt die Unkrautbekämpfung ein wichtiges und kostspieliges Problem für den Bauern.
Derzeitige Herbizide, die einzeln oder in sogenannten Tankmischungen verwendet werden, erfordern eine gute Handhabung, um wirksam zu sein. Zeit und Verfahren der Anwendung und das Stadium der Unkrautpflanzenentwicklung sind kritisch zum Erreichen einer guten Unkrautbekämpfung mit Herbiziden. Einige Unkrautarten sind einfach gegen die heutigen Herbizide resistent. Deshalb steigt die Bedeutung der Erzeugung von wirksamen Herbiziden jedes Jahr, besonders wenn andere Unkrautarten bekämpft werden und so den Konkurrenzkampf verringern. Die Anwendung großer Mengen gerade noch wirksamer Herbizide auf diese Unkräuter kann eine Verpflichtung zur Folge haben, in den anschließenden Jahren die gleiche Feldfrucht anzubauen, aufgrund einer chemischen Fortwirkung im Boden, die einen Fruchtwechsel mit einer Frucht, die gegen dieses Herbizid empfindlich ist, verhindert.
Andere Herbizide werden, obwohl sie nicht direkt für die Unkrautbekämpfung bei Feldfrüchten verwendet werden, als "Gesamtvegetations-Bekämpfungsmittel" verwendet, um Unkraut in gewissen Eisenbahn- und Industriesituationen vollständig auszuschalten. Diese Herbizide können durch Abfluß im Wasser oder durch andere natürliche Mittel auf Flächen abgelagert werden, wo Feldfrüchte angepflanzt werden. Demgemäß können auf Feldern, die durch Abfluß von einem Boden, auf dem Gesamtvegetations-Bekämpfungsmittel verwendet worden sind, betroffen sind, empfindliche Feldfrüchte abgetötet werden oder ihr Wachstum kann ernsthaft behindert werden.
Herbizide mit größerer Potenz, breiterem Unkrautspektrum und schnellerem Abbau im Boden hätten eine bedeutende Auswirkung auf diese Probleme. Leider weisen diese Verbindungen auch eine größere Feldfrucht-Phytotoxizität auf. Feldfrucht-Hybride oder -Sorten mit Resistenz gegen die Verbindungen würden eine attraktive Lösung bereitstellen, indem sie die Verwendung der Verbindungen ohne das Risiko der Schädigung der Feldfrucht gestatten würden.

2.2. GEWEBEKULTUR VON MAIS

Unabhängig von der Pflanzenart gibt es eine Anzahl von gemeinsamen Merkmalen, die für die meisten Gewebekultur- Programme zutreffen. Die Technik der Zell- und Gewebekultur ist in breitem Ausmaß entwickelt worden, und über Wachstum, Metabolismus und Differenzierung der Gewebekultur von Dikotylen sind viele Arbeiten gemacht worden (Yamada, 1977, in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Herausgeber Reinert und Bajaj, Seiten 144-159, Springer Verlag, Berlin). Jedoch sind erfolgreiche Gewebekulturstudien mit Monokotylen (z. B. den Zerealien, wie Mais, Reis, Weizen, Gerste, Sorghum, Hafer, Roggen und Hirse), die zu einer Pflanzenregeneration führen, nicht so gut dokumentiert wie bei den Dikotylen. Der Erfolg hängt häufig von der Wahl der Pflanzengewebe zur Kulturanzucht, die von Pflanzen vom geeigneten Genotyp herstammen, sowie von physiologischen und Entwicklungsstadien ab. Andere Merkmale, die offensichtlich ebenso wichtig sind, schließen die organische und anorganische Zusammensetzung des Wachstumsmediums und die physikalische Umgebung, in dem die Kulturen kultiviert werden, ein.
Bei Mais wurde die Entwicklung von Gewebekulturen, die zur Pflanzenregeneration in der Lage sind, nach der Identifizierung geeigneter Genotypen und Donorgewebe erzielt (Green und Rhodes, 1982 in Maize for Biological Research, Herausgeber W. F. Sheridan, Seiten 367-371, Plant Molecular Biology Association, Charlottesville, VA). Das erste entwickelte Verfahren, das Pflanzen aus Gewebekulturen von Mais regenerierte, verwendete unreife Embryonen als Donorgewebe. Mit N6- oder MS-Wachstumsmedien (nachstehend in Abschnitt 6 definiert) und einem synthetischen Auxin, wie beispielsweise 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), entwickeln sich Gewebekulturen schnell aus dem Scutellum der Embryonen. Die resultierenden Kulturen sind entwicklungsmäßig heterogen und enthalten eine Vielzahl von Gewebetypen. Die Entfernung der 2,4-D aus dem Wachstumsmedium gestattet, daß diese Kulturen eine große Zahl von regenerierten Pflanzen erzeugen. Kulturen dieses Typs haben sich als fähig erwiesen, Pflanzen über bis zu drei Jahren zu regenerieren.
Ein weiteres Donorgewebe, aus dem regenerierbare Gewebekulturen von Mais angezogen worden sind, sind unreife Narbenfäden. Dieses Gewebe ist die männliche Blüte, und wenn es reift, ist es für die Pollenerzeugung verantwortlich. Unreife Embryonen, Blütenstände und die wenigen anderen Gewebe in Zerealien, aus denen sich regenerierende Kulturen angezogen worden sind, weisen alle die gemeinsame Eigenschaft der Jugendlichkeit auf. Regenerierte Pflanzen, die aus Gewebekulturen erhalten werden, werden bis zur Reife in einem Gewächshaus, einer Wachstumskammer oder auf einem Feld gezogen. Der Nachwuchssamen, der in Kreuzungen mit regenerierten Pflanzen erzeugt wird, gestattet die Auswertung nachfolgender Generationen. Die grundsätzlichen Gewebekulturverfahren, die für Mais entwickelt wurden, sind auf viele andere Zerealien-Arten ausgedehnt worden.
Eine interessante Entwicklung in den letzten Jahren war das Ereignis somatischer Embryogenese in Gewebekulturen von Mais. Somatische Embryogenese ist der Prozeß, in dem sich Zellen aus Kallus-, Suspensions- oder Protoplastenkulturen zu vollständigen Embryonen ähnlich den zygoten Embryonen, die in Samen erzeugt werden, entwickeln. Es ist nun möglich, verläßlich Kulturen von Mais anzuziehen, die zwei wichtige Eigenschaften aufweisen. Eine ist, daß die Kallus-Kulturen brüchig sind, was bedeutet, daß sie weich und von losem Aufbau sind. Diese Eigenschaft ist wichtig, da Kulturen dieses Typs ein rasches Wachstum aufweisen und dies die Anzucht von Suspensions-Zellkulturen erleichtert. Die andere wertvolle Eigenschaft dieser brüchigen Kulturen ist ihre Fähigkeit, sehr große Zahlen somatischer Embryonen zu bilden. Die mikroskopische Überprüfung zeigt die Anwesenheit von vielen kleinen organisierten Strukturen auf der Oberfläche des Kallus. Diese Strukturen sind junge somatische Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstufen. Diese brüchigen Kulturen behalten ihr embryogenetisches Potential so lange wie zwei Jahre und haben die Fähigkeit aufgewiesen, äußerst große Zahlen somatischer Embryonen hervorzubringen.
Die somatischen Embryonen in diesen brüchigen Kalli entwickeln sich zur Reife, wenn die Kulturen in ein Medium überführt werden, das 5 bis 6% Saccharose und keine Hormone enthält. Nach ungefähr zwei Wochen Wachstum auf diesem Medium sind viele Embryonen ziemlich reif geworden. Sie keimen schnell und wachsen zu Pflanzen, wenn sie auf MS- oder N6-Medium, das 2% Saccharose enthält, gegeben werden. Die Pflanzen werden dann in Erde gesetzt und zur Reife gezogen.
Es ist nun gut dokumentiert, daß ein hohes Maß an genetischer Variabilität aus Pflanzengewebekultur gewonnen werden kann. Es ist gut dokumentiert, daß spontane genetische Variabilität in kultivierten Pflanzenzellen das Ergebnis von Mutation sein kann (Meredith und Carlson, 1982, in Herbicide Resistance in Plants, Herausgeber Lebaron und Gressel, Seiten 275-291, John Wiley and Sons, NY). Die Häufigkeit von Mutanten kann auch durch Verwendung chemischer oder physikalischer Mutagene gesteigert werden. Einiges von dieser Variabilität ist von landwirtschaftlicher Bedeutung. Mutanten für Krankheitsresistenz sind in Zuckerrohr für die F&ijlig;i-Krankheit, in Kartoffel für frühe und späte Trockenfäule, in Mais für "Southern Corn"-Blattbrand erhalten worden. Bei Reis, Mais und Weizen ist eine beträchtliche Variabilität an Merkmalen, die als einzelne Gene vererbt werden, mit Pflanzenzüchtungsbedeutung gewonnen worden, einschließlich der Zeit der Samenpflanzung bzw. -ausstreuung und -reifung, der Samenfarbe und -entwicklung, der Pflanzenhöhe, der Pflanzenmorphologie und der Fruchtbarkeit.
Gewebekulturen von Mais sind verwendet worden, um Mutanten für Krankheitsresistenz und Aminosäureüberproduktion zu gewinnen, wie nachstehend beschrieben.
"Texas male sterile cytoplasm" (cms-T)-Genotypen (männliche texanische Genotypen mit sterilem Plasma) von Mais sind für das Pathotoxin, das von dem Pilz Helminthosporium maydis, Unterart T, erzeugt wird, empfindlich, während Genotypen mit normalem Cytoplasma (N) resistent sind (Gengenbach et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74 : 5113-5117). Ähnlich sind Gewebekulturen, die aus cms-T-Genotypen erhalten worden sind, gegen das Pathotoxin empfindlich, während N-Genotyp-Kulturen resistent sind. Das Pathotoxin aus H. maydis, Unterart T, wurde verwendet, um resistente Zellinien aus empfindlichen cms-T-Kulturen unter Verwendung eines subletalen Anreichungs- Selektionsverfahren zu selektieren. Nach fünf Zyklen mit wachsendem Selektionsdruck wurden Zellinien gewonnen, die gegen letale Dosen des Pathotoxins resistent waren. Pflanzen, die aus diesen Zellinien regeneriert wurden, waren ebenso gegen das Pathotoxin resistent und waren männlich-fruchtbar. Die genetische Analyse der Nachkommenschaft, die aus resistenten, männlich-fruchtbaren Pflanzen erhalten wurde, zeigte, daß beide Merkmale mütterlich vererbt wurden. Die Infektion von Pflanzen mit Sporen von H. maydis, Unterart T, zeigte, daß die Selektion in Bezug auf Pathotoxin-Resistenz auch eine Resistenz von Pflanzen gegen den Erregerorganismus zur Folge hatte.
Die Selektion bezüglich Resistenz gegen Wachstumshemmung durch Lysin plus Threonin in äquimolaren Konzentrationen (LT) in Gewebekulturen von Mais lieferte eine stabile resistente Linie, LT19 (Hibberd und Green, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 559-563). Die genetische Analyse der Nachkommenschaft von Pflanzen, die aus LT19 regeneriert worden waren, zeigte, daß die LT-Resistenz als ein einziges dominantes Gen des Zellkerns vererbt wurde. Gewebekulturen, daß aus resistenten Embryonen angezogen wurden, erforderten 5-10fach höhere Konzentrationen an LT, um das Wachstum zu hemmen, als dies Kulturen aus den LT-empfindlichen Embryonen taten. Die LT- Resistenz in LT19 war als verringerte Empfindlichkeit von Wurzel- und Sprossenwachstum gegenüber der Anwesenheit von LT ausgeprägt. Das freie Reservoir von Threonin wurde in Kulturen, die aus unreifen Embryonen von LT-resistenten Pflanzen angezogen worden waren, sechsfach und in Körnern, die homozygot bezüglich LT19 waren, 75-100fach gesteigert, verglichen mit Kulturen und Körnern aus LT-empfindlichen Embryonen bzw. Pflanzen. Die Überproduktion von freiem Threonin steigerte den gesamten Threoningehalt in homozygoten LT19-Körnern um 33-59%. Die Ergebnisse zeigen, daß eine LT- Resistenz, die mit Gewebekulturverfahren selektiert worden war, vererbbar war und in Kulturen, Sämlingen und Körnern ausgeprägt war.

2.3. MECHANISMEN DER HERBIZIDRESISTENZ

Es gibt drei allgemeine Mechanismen, durch die Pflanzen gegen Herbizide resistent oder tolerant sein können. Diese Mechanismen schließen die Unempfindlichkeit am Wirkort des Herbizids (gewöhnlich einem Enzym), schnellen Metabolismus (Konjugation oder Abbau) des Herbizids oder schlechte Aufnahme und Transport des Herbizids ein. Die Veränderung des Wirkorts des Herbizids von einer empfindlichen in eine unempfindliche Form ist das bevorzugte Verfahren der Vermittlung von Resistenz an eine empfindliche Pflanzenart. Der Grund dafür ist, daß eine Resistenz dieser Art wahrscheinlich ein dominantes Merkmal ist, für die ein einzelnes Gen kodiert, und wahrscheinlich ganze Familien von Verbindungen, die sich einen einzigen Wirkort teilen, nicht nur einzelne Chemikalien umfaßt. Deshalb ist eine genaue Information bezüglich des biochemischen Orts und Mechanismus der Herbizidwirkung von großer Wichtigkeit und kann auf zwei Arten verwendet werden. Erstens kann die Information verwendet werden, um Zellselektionsstrategien für die wirksame Identifizierung und Isolierung von geeigneten Herbizid-resistenten Varianten zu entwickeln. Zweitens wird sie verwendet, um die abweichenden Zellinien und regenerierten Pflanzen, die das Ergebnis der Selektionen sind, zu charakterisieren.

2.4. HERBIZIDRESISTENZ-SELEKTION

Gewebekulturverfahren sind unter Verwendung einer Vielfalt von Herbiziden und Pflanzenarten verwendet worden, um bezüglich Resistenz (oder Toleranz) zu selektieren (siehe die Übersicht von Meredith und Carlson, 1982, in Herbicide Resistance in Plants, Herausgeber Lebaron und Gressel, Seiten 275-291, John Wiley and Sons, NY). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen können in zwei Kategorien eingeteilt werden, abhängig davon, ob eine Herbizidtoleranz stabil vererbt und in der Nachkommenschaft von Pflanzen, die aus den selektierten resistenten Kulturen regeneriert wurden, ausgeprägt wurde oder nicht. Dieses Kriterium stellt klar die Mutantennatur des selektierten Merkmals fest. Eine Anzahl von Gewebekultur- Untersuchungen sind durchgeführt worden, um bezüglich Toleranz gegen 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) in Karotten, Tabak und weißem Klee, gegen Amitrol in Tabak, gegen Asulam in Sellerie und gegen Paraquat in Tabak zu selektieren, wobei in keiner derselben die Mutantennatur des Resistenzmerkmals durch genetische Analyse festgestellt wurde. Diese Untersuchungen haben deshalb kaum für einen Beleg gesorgt, der die Fähigkeit von Gewebekultur-Selektionsverfahren demonstriert, Herbizidresistente Mutantenpflanzen zu erzeugen, die das Merkmal auf die Nachkommenschaft übertragen, welche die Resistenz ausprägt.
Drei Untersuchungen sind jedoch verfügbar, die den Nachweis erbringen, daß Gewebekulturverfahren verwendet werden können, um Herbizid-resistente Mutanten zu erhalten. Tabak, der auf Toleranz gegen Bentazon und Phenmedipham selektiert worden war, lieferte resistente Pflanzen (Radin und Carlson, 1978, Genet. Res., Camb., 32 : 85-90). Die genetische Analyse der Nachkommenschaft aus regenerierten Pflanzen lieferte in der F2-Generation Daten, die eine genetische Basis für die Resistenz in 8 bezüglich Bentazon und 2 bezüglich Phenmedipham selektierten Linien bestätigte. Die F2- Segregationsverhältnisse zeigten rezessive Einzelgen- Mutationen bei den meisten der Linien an, außer bei zwei Bentazon-Linien, in denen zwei Gene angezeigt wurden.
Chaleff und Parsons (1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5104-5107) verwendeten Gewebekultur-Selektionsverfahren, um Picloram-resistente Mutanten aus Tabak-Suspensionskulturen zu isolieren. Pflanzen wurden aus sechs von sieben resistenten selektierten Linien regeneriert. Die Resistenz gegen Picloram wurde in vier dieser Linien auf die Nachkommenschaft übertragen und war sowohl in Pflanzen als auch in Kallus- Geweben ausgeprägt. In allen vier Fällen waren die Segregationsverhältnisse diejenigen, die aus dominanten Einzelgen-Mutationen erwartet wurden. In einer zusätzlichen genetischen Analyse wurde gezeigt, daß zwei dieser Mutanten miteinander verbunden waren.
Tomaten-Kalluslinien wurden bezüglich ihrer Fähigkeit selektiert, bei Paraquat-Konzentrationen zu wachsen, die Zellen vom Wildtyp abtöteten (Thomas und Pratt, 1983, Theor. Appl. Genet. 63 : 109-113). Diploide Pflanzen wurden aus 9 der 19 isolierten Paraquat-resistenten Kalluslinien regeneriert. Neue Kalluskulturen wurden aus diesen regenerierten Pflanzen angezogen und zeigten typischerweise mindestens eine 30fache Zunahme gegenüber Wildtyp bei der Beständigkeit gegen Paraquat. Tests mit Kalluslinien, die aus sexueller Nachkommenschaft von regenerierten Pflanzen angezogen worden waren, zeigten, daß der Phänotyp mit Paraquat-Resistenz von drei Linien das Ergebnis von dominanten Mutationen im Zellkern war. Experimente mit Paraquatspray zeigten, daß eine leichte Paraquat-Resistenz auf der Pflanzenebene in nur einer der resistenten Linien ausgeprägt war.

2.5. HERBIZIDE IMIDAZOLINONE

Eine breite Auswahl von Imidazolinonen, insbesondere 2-(2- Imidazolin-2-yl)pyridine und 2-(2-Imidazolin-2-yl)chinoline oder Derivate derselben, weisen eine herbizide Wirkung auf. Siehe z. B. die Europäische Patentanmeldung 81 103 638.1 mit Los als Erfinder und American Cyanamid Company als Anmelder.
In dieser Anmeldung beschriebene beispielhafte Herbizide von besonderem Interesse sind 2-(5-Isopropyl-5-methyl-4-oxo-2- imidazolin-2-yl)nikotinsäure (AC 243,997), 2-(5-Isopropyl-5- methyl-4-oxo-2-imidazolin-2-yl)-3-chinolincarbonsäure (AC 252,214), [5-Ethyl-2-(5-isopropyl-5-methyl-4-oxo-2-imidazolin- 2-yl)]nikotinsäure (AC 263,499) und ihrer Säureadditionssalze.
Für die Zwecke der Bezugnahme in der vorliegenden Beschreibung werden die in diesem Abschnitt 2.5 beschriebenen Herbizide und strukturell verwandte Herbizideverbindungen zusammen als Imidazolinone oder die Imidazolinon-Herbizidfamilie bezeichnet.

2.6. HERBIZIDE SULFONAMIDE

Gewisse Sulfonamide weisen eine allgemeine und selektive herbizide Wirkung gegen Pflanzen auf. Derartige herbizide Sulfonamide werden in mindestens den folgenden erteilten US- Patenden offenbart:
4,435,206, 4,370,480, 4,302,241 4,424,073, 4,370,479, 4,293,330, 4,417,917, 4,369,320, 4,257,802, 4,398,939, 4,369,058, 4,231,784, 4,394,506, 4,368,067, 4,225,337, 4,391,627, 4,348,219, 4,221,585, 4,383,113, 4,342,587, 4,214,890, 4,378,991, 4,339,267, 4,190,432, 4,372,778, 4,339,266, 4,169,719, 4,371,391, 4,310,346, 4,127,405.
Ein derartiges herbizides Sulfonamid von speziellem Interesse ist 2-Chlor-N-[(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2- yl)aminocarbonyl]benzolsulfonamid, auch als Chlorsulfuron bekannt.
Für Zwecke der Bezugnahme in der vorliegenden Beschreibung werden die Herbizide, auf die in diesem Abschnitt 2.6 Bezug genommen wird, und strukturell verwandte herbizide Verbindungen zusammen als herbizide Sulfonamide bezeichnet.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung ist auf landwirtschaftlich wichtige Pflanzen, Pflanzengewebe und Pflanzensamen gerichtet, die gegen eine Hemmung durch ein 2-(2-Imidazolin-2-yl)pyridin- oder -chinolin-Herbizid bei Konzentrationen resistent sind, welche normalerweise das Wachstum und die Entwicklung dieser Pflanzen, Pflanzengewebe und Pflanzensamen hemmen, in denen diese Resistenz durch eine veränderte Acetohydroxysäure- Synthase vermittelt wird, die gegen Hemmung durch das Herbizid bei Konzentrationen resistent ist, die normalerweise die Aktivität einer unveränderten Acetohydroxysäure-Synthase hemmen. Die vorliegende Erfindung zielt auf die Einführung von Herbizidresistenz in jede landwirtschaftlich wichtige Feldfrucht ab, einschließlich gewisser Dikotylen, Monokotylen und spezieller Zerealien, wie beispielsweise Reis, Mais, Weizen, Gerste, Sorgum, Hafer, Roggen, Hirse und dergleichen, aber nicht darauf beschränkt.
Insbesondere ist diese Erfindung auf Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen, Pflanzengeweben und Pflanzensamen gerichtet, die ein Enzym enthalten, das gegen Hemmung durch ein Herbizid bei einer Konzentration resistent ist, die normalerweise die Wirkung dieses Enzyms vor der Veränderung hemmt. Dieses Enzym, eine veränderte Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) verleiht Pflanzen, Pflanzengeweben und -samen Resistenz gegen gewisse Herbizide. Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Erzeugung von Herbizidresistenten Zellinien, die eine Veränderung am primären Wirkort eines Herbizids aufweisen. Die vorliegende Erfindung verwendet eine Zellkultur-Technologie, um Herbizid-resistente Maislinien, die diese Herbizidresistenz-Eigenschaft genetisch auf ihre Nachkommenschaft übertragen, zu isolieren, zu charakterisieren und zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen, Pflanzengeweben und -Samen aus diesen resistenten Zellinien bereit, die ein Gen enthalten, das für eine veränderte Acetohydroxysäure-Synthase kodiert, welche gegen Hemmung durch ein Herbizid bei einer Konzentration, die normalerweise die Aktivität dieses Enzyms vor der Veränderung hemmt, resistent ist.
In den hierin aufgeführten Beispielen wird ein neues Enzym, eine veränderte Acetohydroxysäure-Synthase, die gegen Hemmung durch gewisse Imidazolinon- und/oder Sulfonamid-Herbizide resistent ist (bei Konzentrationen, die normalerweise die Aktivität des unveränderten Enzyms hemmen), beschrieben. Dieses Enzym verleiht Pflanzen, Pflanzengeweben und -samen Resistenz gegen die Herbizide. Mais-Genotypen, die diese veränderte AHAS exprimieren, werden beschrieben. Dieser Mais- Genotyp kann mit den Imidazolinon- oder Sulfonamid-Herbiziden verwendet werden, um wirksam Unkrautprobleme bei der Maiserzeugung zu bekämpfen.
Die vorliegende Erfindung zielt weiter darauf ab, daß die Herbizid-Resistenz in den hierin beschriebenen Pflanzen durch eine Anzahl anderer Mechanismen vermittelt werden kann. Z.B. kann die Resistenz durch ein Gen vermittelt werden, das für ein Enzym kodiert, welches aus irgendeiner Quelle erhalten werden kann, einschließlich eukaryontischen Organismen, prokaryontischen Organismen, aber nicht darauf beschränkt, oder ganz oder teilweise durch chemische oder enzymatische Syntheseverfahren hergestellt werden kann. Andere Resistenzmechanismen werden im vorstehenden Abschnitt 2.3 besprochen.
Es sollte verstanden werden, daß die folgende genaue Beschreibung eine einzige Ausführungsform der Erfindung darstellt. Diese Ausführungsform betrifft eine Veränderung in einem speziellen Enzym, Acetohydroxysäure-Synthase, die Pflanzen, Pflanzengewebe und -samen resistent gegen gewisse Imidazolinone macht, die Herbizide, für die eine Resistenz selektiert wurde. Unerwarteterweise wurde auch gefunden, daß diese Pflanzen, Pflanzengewebe und -samen resistent gegen gewisse Sulfonamid-Herbizide sind. Demgemäß kann das hierin offenbarte veränderte Enzym Resistenz gegen eine Anzahl von Herbiziden verleihen, die Acetohydroxysäure-Synthase als ihren primären Wirkort hemmen.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt das Wachstum von Mais-Zellsuspensionskulturen als Funktion der AC 243,997-Konzentration mit (leere Kreise) oder ohne (ausgefüllte Kreise) Medium-Ergänzung mit jeweils 1,0 mM Leucin, Valin und Isoleucin.
Fig. 2 zeigt den biosynthetischen Stoffwechsel für die Erzeugung von Leucin, Valin und Isoleucin in Pflanzen.
Fig. 3 zeigt das Sprossenlängenwachstum von Sämlingen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von AC 252,214 gezogen wurden.
Fig. 4 zeigt das Wurzellängenwachstum von Sämlingen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von AC 252,214 gezogen wurden.

5. GENAUE BESCHREIBUNG EINER AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG

Diese Ausführungsform der Erfindung betrifft Pflanzen, Pflanzengewebe und Pflanzensamen, die ein Enzym enthalten, das gegen die Hemmung durch 2-(2-Imidazolin-2-yl)pyridin- oder -chinolin-Herbizide und/oder Sulfonamid-Herbizide resistent ist. Das Enzym ist eine veränderte Acetohydroxysäure-Synthase, die Pflanzen, Pflanzengeweben und -samen Resistenz gegen die oben erwähnten Herbizide verleiht. Verfahren und Zusammensetzungen zur Erzeugung von Pflanzen, Pflanzengeweben und -samen werden bereitgestellt, welche ein Gen enthalten, das für eine veränderte AHAS kodiert. Ebenso werden Zellkultur-Selektionstechniken beschrieben, um neue Mais-Genotypen zu selektieren, die resistent sind gegen gewisse Imidazolinon- und/oder Sulfonamid-Herbizide. Die Erzeugung dieser Maislinien umfaßt die Isolierung, Charakterisierung und Entwicklung dieser Maislinien und die Regeneration von Pflanzen aus diesen Kulturen, die gegen die Herbizide resistent sind.
Das Verfahren dieser Erfindung kann für die Zwecke der Beschreibung in die folgenden Gebiete aufgeteilt werden:
(1) Bestimmung des primären Wirkorts der Imidazolinon- Herbizidfamilie;
(2) Charakterisierung der Auswirkungen der Imidazolinon- Herbizide auf Maiszellkulturen und die Strategie zur Selektion von Herbizid-resistenten Zellinien;
(3) Selektion und Charakterisierung von Herbizid-resistenten Zellinien;
(4) Regeneration von Herbizid-resistenten Pflanzen und Erzeugung von Samen; und
(5) Entwicklung von Herbizid-resistentem kommerziellem Hybridsamen.

5.1. BESTIMMUNG DES PRIMÄREN WIRKORTS DER IMIDAZOLINON-HERBIZIDFAMILIE

Der biochemische Wirkort der Herbizide, einschließlich der Imidazolinon-Familie und Sulfonamid-Familie von Herbiziden, aber nicht darauf beschränkt, in Maisgewebe wird bestimmt, indem man zuerst auswertet, welche allgemeinen zellmetabolischen Prozesse durch Einwirkung der phytotoxischen Verbindungen auf Gewebe betroffen sind. Der spezifische Wirkort wird dann durch die in-vitro-Auswertung der einzelnen Reaktionen innerhalb des betroffenen metabolischen Stoffwechselwegs oder Prozesses festgestellt.
Der primäre Wirkort kann durch Zugabe verschiedener Produkte des Stoffwechselwegs bzw. der -wege, von denen man annimmt, daß sie durch das Herbizid betroffen sind, zu dem dem Herbizid ausgesetzten Gewebe bestimmt werden. Diejenigen Produkte, die die wachstumshemmenden Wirkungen des Herbizids aufheben, zeigen den Stoffwechselweg bzw. die -wege an, die durch die Herbizide betroffen sind.

5.2. CHARAKTERISIERUNG DER WIRKUNGEN DER IMIDAZOLINON-HERBIZIDE AUF PFLANZENZELLKULTUREN UND STRATEGIEN FÜR DIE SELEKTION VON HERBIZID-RESISTENTEN ZELLINIEN

Eine wirksame Selektion einer gewünschten Herbizid-resistenten Mutante unter Verwendung von Gewebekulturtechniken erfordert die sorgfältige Festlegung von Selektionsbedingungen. Diese Bedingungen werden so optimiert, daß sie ein Wachstum und eine Akkumulierung von seltenen Herbizid-resistenten Zellen in der Kultur gestatten, während sie das Wachstum des Großteils der Zellpopulation hemmen. Die Situation wird durch die Tatsache kompliziert, daß die Lebensfähigkeit von einzelnen Zellen in einer Population in hohem Maß von der Lebensfähigkeit von Nachbarzellen abhängt.
Bedingungen, unter denen die Zellkulturen den Herbiziden ausgesetzt werden, werden durch die Eigenschaften der Wechselwirkung der Verbindungen mit dem Gewebe festgelegt. Derartige Faktoren wie die Akkumulation der Verbindungen durch Zellen in der Kultur und die Fortwirkung und Stabilität der Verbindungen sowohl in den Medien als auch in den Zellen müssen berücksichtigt werden. Ebenso ist es wichtig, ob die Wirkungen der Verbindungen nach deren Entfernung leicht aufgehoben werden können.
Außer den Faktoren, die mit der Chemie der Herbizidverbindungen verknüpft sind, müssen deren Wirkungen auf die Kulturlebensfähigkeit und -morphologie sorgfältig ausgewertet werden. Es ist insbesondere wichtig, Herbizideinwirkungsbedingungen zu wählen, die keine Auswirkung auf die Pflanzenregenerationsfähigkeit von Kulturen haben. Die Wahl der Herbizideinwirkungsbedingungen wird auch dadurch beeinflußt, ob das Herbizid Zellen abtötet oder einfach Zellteilungen hemmt.
Die Wahl eines Selektionsprotokolls hängt von den vorstehend beschriebenen Überlegungen ab. Jedes der nachstehend kurz beschriebenen Protokolle kann bei dem Selektionsverfahren verwendet werden, obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf diese Verfahren beschränkt ist. Im ersten Protokoll werden fein zerteilte Zellen in flüssiger Suspensionskultur über kurze Zeiträume einer hohen Herbizidkonzentration ausgesetzt. Man läßt dann die über lebenden Zellen sich erholen und akkumulieren, und sie werden dann über aufeinanderfolgend längere Zeiträume wieder ausgesetzt. Alternativ werden organisierte, teilweise differenzierte Zellkulturen unter kontinuierlicher Einwirkung von anfänglich niedrigen Herbizidkonzentrationen gezüchtet und subkultiviert. Die Herbizidkonzentrationen werden dann allmählich über mehrere Subkulturzeiträume gesteigert.

5.3. SELEKTION UND CHARAKTERISIERUNG VON RESISTENTEN ZELLINIEN

Die Selektionen werden durchgeführt, bis Zellen oder Gewebe gewonnen werden, von denen man beobachtet, daß sie gut in Gegenwart von normalerweise toxischen Herbizidkonzentrationen wachsen. Diese Zell-"Linien" werden dann wiederholt in Gegenwart von Herbizid subkultiviert und charakterisiert. Die Menge an Resistenz, die erhalten worden ist, wird durch Vergleich des Wachstums dieser Zellinien mit dem Wachstum unselektierter Zellen oder unselektierten Gewebes in Gegenwart verschiedener Herbizidkonzentrationen bestimmt. Die Stabilität des Herbizidresistenz-Merkmals der kultivierten Zellen kann ermittelt werden, indem man einfach die selektierten Zellinien in Abwesenheit von Herbizid über verschiedene Zeiträume kultiviert und dann das Wachstum nach erneuter Einwirkung von Herbizid auf das Gewebe analysiert.
In der vorliegenden Erfindung sind Zellinien, die aufgrund des Vorliegens eines veränderten Herbizid-Wirkorts resistent sind, von primärem Interesse. Zellinien können auch auf ihre Resistenz gegen Herbizide, die strukturell mit dem Selektionsmittel verwandt sind, getestet werden. Die resistenten Zellinien können auch unter Verwendung von chemischen Untersuchungen in vitro überprüft werden, um zu verifizieren, daß der Wirkort des Herbizids zu einer Form abgeändert ist, die weniger empfindlich ist.

5.4. PFLANZENREGENERATION UND SAMENERZEUGUNG

Zellinien, die zufriedenstellende Resistenzgrade aufgrund des Vorliegens eines veränderten Herbizid-Wirkorts aufweisen, werden durch ein Pflanzenregenerationsprotokoll geführt, um reife Pflanzen und Samen zu erhalten, die das Resistenz- Merkmal ausprägen. Das Pflanzenregenerationsprotokoll gestattet die Entwicklung somatischer Embryonen und das anschließende Wachstum von Wurzeln und Sprossen. Zur Bestimmung, daß das Herbizidresistenz-Merkmal in differenzierten Organen der Pflanze und nicht nur in der undifferenzierten Zellkultur ausgeprägt wird, werden frühe Pflanzenregenerationsschritte in Gegenwart von Herbizidkonzentrationen durchgeführt, die normalerweise die Bildung und das Wachstum von Sproß und Wurzel hemmen.
Reife Pflanzen werden dann aus Zellinien erhalten, von denen bekannt ist, daß sie das Merkmal ausprägen. Falls möglich, werden die regenerierten Pflanzen selbstbestäubt. Anderenfalls wird Pollen, der aus den regenerierten Pflanzen erhalten worden ist, mit aus Samen gezüchteten Pflanzen von landwirtschaftlich wichtigen Inzuchtlinien gekreuzt. Umgekehrt wird Pollen aus Pflanzen dieser Inzuchtlinien verwendet, um regenerierte Pflanzen zu bestäuben. Die Genetik des Merkmals wird dann durch Auswertung der Segregation des Merkmals in der Nachkommenschaft erster und späterer Generationen charakterisiert. Die Vererbbarkeit und Expression in Pflanzen von Merkmalen, die in Gewebekultur selektiert worden sind, sind von besonderer Wichtigkeit, wenn die Merkmale kommerziell nützlich sind.

5.5 ENTWICKLUNG VON HERBIZID-RESISTENTEM KOMMERZIELLEM HYBRIDSAMEN

Samen aus Pflanzen, die aus Gewebekultur regeneriert worden sind, wird auf dem Feld angebaut und selbstbestäubt, um echte Zuchtpflanzen zu erzeugen. Die Nachkommen aus diesen Pflanzen werden echte Zuchtlinien, die auf dem Feld unter einer Reihe von Umgebungsbedingungen bezüglich ihrer Herbizidresistenz bewertet werden. Die Herbizidresistenz muß ausreichend sein, um Mais bei der maximalen angegebenen Rate unter Feldbedingungen, die das Herbizid am aktivsten sein lassen, zu schützen. Geeignete Herbizidkonzentrationen und Verfahren der Anwendung sind diejenigen, die für das fragliche Herbizid entwickelt worden sind.
Der kommerzielle Wert von Herbizid-resistentem Mais ist am größten, wenn viele verschiedene Hybridkombinationen mit Resistenz im Handel erhältlich sind. Der Bauer baut üblicherweise mehr als eine Hybridart an, basierend auf solchen Unterschieden wie Reife, Stehvermögen oder anderen landwirtschaftlichen Merkmalen. Zusätzlich sind Hybride, die an einen Teil des Getreidegürtels angepaßt sind, wegen der Unterschiede in solchen Merkmalen wie Reife, Krankheit und Insektenresistenz nicht an einen anderen Teil angepaßt. Deshalb ist es notwendig, Herbizidresistenz in einer großen Zahl von Mutterlinien zu züchten, so daß viele Hybridkombinationen erzeugt werden können.
Das Hinzufügen von Herbizidresistenz zu landwirtschaftlichen Elitelinien wird am wirksamsten bewerkstelligt, wenn die genetische Steuerung der Herbizidresistenz verstanden wird. Dies erfordert das Kreuzen von resistenten und empfindlichen Pflanzen und die Untersuchung der Vererbungsmuster beim Segregieren von Generationen, um sicherzustellen, ob das Merkmal dominant oder rezessiv ausgeprägt wird, der Zahl der beteiligten Gene und irgendeiner möglichen Wechselwirkung zwischen Genen, falls mehr als eines für die Ausprägung erforderlich ist. Diese genetische Analyse kann ein Teil der anfänglichen Bemühungen sein, landwirtschaftlich herausragende, aber empfindliche Linien in resistente Linien zu überführen.
Ein Umwandlungsverfahren (Rückkreuzen) wird durchgeführt, indem man die ursprünglich resistente Linie mit empfindlichen Elitelinien kreuzt und die Nachkommenschaft mit der empfindlichen Mutterlinie rückkreuzt. Die Nachkommenschaft aus dieser Kreuzung segregiert, so daß einige Pflanzen das Resistenzgen (S) tragen, wohingegen andere dies nicht tun. Pflanzen, die das Resistenzgen (S) tragen, werden wieder mit der empfindlichen Mutterlinie gekreuzt, weil dies eine Nachkommenschaft zur Folge hat, die noch einmal bezüglich Resistenz und Empfindlichkeit segregiert. Dies wird wiederholt, bis die ursprünglich empfindliche Mutterlinie in eine resistente Linie überführt worden ist, jedoch alle anderen wichtigen Attribute, die ursprünglich in der empfindlichen Mutterlinie gefunden werden, besitzt. Für jede empfindliche Elitelinie, die in eine Herbizid-resistente Linie überführt werden soll, wird ein gesondertes Rückkreuzungsprogramm durchgeführt.
Nach der Rückkreuzung werden die neuen resistenten Linien und die geeigneten Kombinationen von Linien, die gute kommerzielle Hybride ergeben, bezüglich Herbizidresistenz sowie einer Anzahl wichtiger landwirtschaftlicher Merkmale bewertet. Resistente Linien und Hybride werden erzeugt, welche sortenecht mit den ursprünglichen empfindlichen Linien und Hybriden sind. Dies erfordert die Bewertung unter einer Reihe von Umgebungsbedingungen, in denen die Linien oder Hybride im allgemeinen kommerziell angebaut werden. Mutterlinien von Hybriden, die eine zufriedenstellende Leistung aufweisen, werden vermehrt und zur Hybridproduktion unter Verwendung von Standard-Hybridsamen-Maisproduktionspraktiken verwendet.

5.6. ALTERNATIVE VERFAHREN ZUM ERHALT HERBIZIDRESISTENTER MUTANTEN

Im allgemeinen kann jede Veränderung oder jeder Ersatz von AHAS, der zu Herbizidresistenz in Gewebekultur, Samen und regenerierten Pflanzen führt, in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden. AHAS kann in jeder Pflanzenart verändert oder ersetzt werden; von besonders großer Wichtigkeit sind die landwirtschaftlichen und Gartenanbaufrüchte, bei denen Herbizide verwendet werden. Derartige Pflanzen schließen z. B. monokotyledone Pflanzen und Zerealfrüchte, wie beispielsweise Mais, Reis, Weizen, Gerste, Sorghum, Hafer, Roggen und dergleichen, ein. Die Veränderung von AHAS kann durch eine Vielzahl von Mitteln bewerkstelligt werden, einschließlich der folgenden Verfahren, ohne darauf beschränkt zu sein: (1) spontane Veränderung und direkte Mutantenselektion in Gewebekulturen; (2) direkte oder indirekte Mutageneseverfahren an Gewebekulturen aller Typen, Samen und Pflanzen; und (3) Isolierung von Genen, Manipulation, Modifizierung oder ganze oder teilweise Synthese von Genen unter Verwendung von Molekularbiologie, chemischen Verfahren und Verfahren des Standes der Technik und Wiedereinführung der Herbizidresistenz-Gene in Pflanzen.
Zusätzlich kann jeder Typ von AHAS-Modifizierung verwendet werden, der zu einer Veränderung in der Resistenz oder Toleranz gegen chemische Verbindungen führt, die auf Pflanzen angewendet werden. Diese Veränderungen können eine Abänderung in der Enzymstruktur und Veränderungen in der Enzymexpression und/oder -funktion einschließen. Chemische Verbindungen schließen nicht nur diejenigen ein, die durch Verfahren der organischen Chemie synthetisiert werden können, sondern auch natürlich vorkommende Verbindungen, die die AHAS-Aktivität in der Pflanze beeinflussen können, wie beispielsweise Leucin und Valin. Herbizidresistenz kann auch durch Ersatz oder Ergänzung (d. h. Gentherapie oder Hinzufügen von weiteren Genen) mit irgendwelchen Mitteln einer endogenen AHAS durch irgendeine andere AHAS aus einer anderen Quelle, einschließlich prokaryontischer oder eukaryontischer Organismen, aber nicht darauf beschränkt, oder durch eine chemische Gesamt- oder Teilsynthese eines Gens, das die gleichen Reaktionen wie AHAS katalysiert, bewerkstelligt werden.
Für AHAS kodierende Gene liegen gemeinsam für die Stoffwechselwege von Aspartat und verzweigtkettigen Aminosäuren in Pflanzen und Organismen vor (Umbarger, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47 : 533-606). AHAS katalysiert den ersten Schritt in der Synthese der Aminosäuren Leucin, Valin und Isoleucin. Die AHAS-Aktivität wird in vivo durch verschiedene Endprodukte oder Kombinationen von Endprodukten des biosynthetischen Stoffwechselwegs gesteuert. AHAS-Gene mit einer Vielzahl von Regulator-Eigenschaften sind aus Mikroorganismen, einschließlich Escherichia coli, Hefe und Neurospora, aber nicht darauf beschränkt, erhältlich. Diese könnten AHAS-Gene einschließen, die auf natürliche Weise gegen die Imidazolinon-Herbizide resistent sind. Z.B. sind die Isozyme von AHAS (I, II und III), die in dem Bakterium E. coli vorliegen, gegen millimolare Konzentrationen von AC 243,997 unempfindlich, wenn sie in vitro getestet werden. Die Resistenz von E. coli gegen AC 243,997 scheint deshalb das Ergebnis eines unempfindlichen Wirkorts zu sein, nicht das Ergebnis vom Metabolismus des Herbizids. Die Resistenz in anderen Organismen ist wahrscheinlich gleicher Natur, was eine Vielzahl von Quellen für ein Gen bereitstellt, das für ein Herbizidresistenz des AHAS kodiert. Die Gene, die für alle drei E. coli-Isoenzyme kodieren, sind kloniert und sequenziert worden. Die Selektion bezüglich Imidazolinon-resistenter AHAS- Mutantengene in Mikroorganismen oder Pflanzen, einschließlich Pflanzengewebekulturen, würde eine mannigfaltige Quelle von Genen bereitstellen, die, wenn sie in Pflanzen überführt werden, Herbizid-resistente Pflanzen erzeugen.
Um isolierte Gene oder Gruppen von Genen in das Genom von Pflanzenzellen einzuführen, ist ein effizientes Wirtsgen- Vektorsystem notwendig. Die fremden Gene sollten in den transformierten Pflanzenzellen exprimiert und stabil (somatisch und sexuell) auf die nächste Generation von erzeugten Zellen übertragen werden. Der Vektor sollte in der Lage sein, ein Gen aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Pflanzen, Tieren, Bakterien, Pilzen oder Viren, aber nicht darauf beschränkt, in Pflanzenzellen einzuführen, beizubehalten und zu exprimieren. Zusätzlich sollte es möglich sein, den Vektor in eine große Vielzahl von Pflanzen einzuführen. Die Anordnung des neuen Gens im Pflanzengenom kann bei der Festlegung einer wirksamen Genexpression der genetisch manipulierten Pflanze wichtig sein. Zusätzlich muß das neue Gen, um wirksam zu sein, durch normale Züchtung an die Nachkommenschaft weitergegeben werden.
Eine gerichtete genetische Veränderung und Expression von Fremdgenen in dikotyledonen (breitblättrigen) Pflanzen, wie Tabak, Kartoffel und Alfalfa, ist unter Verwendung der T-DNA des Tumor-induzierenden (Ti) Plasmids von Agrobacterium tumefaciens als möglich nachgewiesen worden. Unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken und bakterieller Genetik kann irgendein fremdes Stück DNA in T-DNA in Agrobacterium insertiert werden. Nach Infektion durch das Bakterium oder Ti- Plasmid wird die Fremd-DNA in die Wirtspflanzenchromosomen insertiert, was so eine genetisch manipulierte Zelle und gegebenenfalls eine genetisch manipulierte Pflanze erzeugt. Ein zweiter Ansatz besteht darin, Wurzel-induzierende (Ri) Plasmide als Genvektoren einzuführen. Während Agrobacterium anscheinend nur Dikotylen angreift, sind viele wichtige Fruchtpflanzen (Mais, Weizen, Reis, Gerste, Hafer, Sorghum, Hirse und Roggen) Monokotylen, und es ist nicht bekannt, daß sie einer Transformation durch Agrobacterium zugänglich sind. Das Ti-Plasmid jedoch kann in Zukunft so manipuliert werden, das es als Vektor für monokotyledone Pflanzen wirksam ist. Zusätzlich kann es unter Verwendung des Ti-Plasmids als Modellsystem möglich sein, künstlich Genvektoren für monokotyledone Pflanzen zu konstruieren.
Ti-Plasmide oder andere Plasmide können auch durch künstliche Verfahren eingeführt werden, wie beispielsweise Mikroinjektion oder Fusion zwischen monokotyledonen Protoplasten und bakteriellen Sphäroplasten, die die T-Region enthalten, welche dann in die Pflanzen-DNA des Zellkerns integriert werden kann.
Genetische Manipulation von Pflanzen kann bewerkstelligt werden, indem man die gewünschte DNA, welche funktionelle Gene enthält, die für Herbizid-unempfindliche AHAS-Enzyme kodieren, in Pflanzengewebe oder Zellen unter Verwendung von DNA- Molekülen einer Vielfalt von Formen und Ursprüngen einführt, die einschließen, aber nicht begrenzt sind auf: Pflanzenpathogene, wie z. B. DNA-Viren, wie Blumenkohl- Mosaikvirus (CaMV) oder Geminiviren, RNA-Viren und Viroide; DNA-Moleküle, die von instabilen Pflanzengenom-Komponenten wie extrachromosomalen DNA-Elementen in Organellen (z. B. Chloroplasten oder Mitochondrien) oder im Zellkern kodierten Kontrollelementen abstammen; DNA-Moleküle aus stabilen Pflanzengenom-Komponenten (z . B. Replikationsstartpunkte und andere DNA-Sequenzen, die es gestatten, daß eingeführte DNA in die Organellen- oder Zellkerngenome integriert wird und normal repliziert, normal während der Zellteilung und sexuellen Reproduktion der Pflanze segregiert und auf nachfolgende Pflanzengenerationen vererbt wird).
Das Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) weist ein Gen auf, dessen Funktion es ist, zu verhindern, daß gewisse Insekten das Virus zerstören. Die verbleibenden Teile des Gens sind redundant und können durch (ein) Gen(e) ersetzt werden, das (die) für den Pflanzenzüchter nützlich ist (sind). Die Geminiviren (oder Zwillingsviren), die aus zwei in Protein-Zwillingskapseln aufgerollten Strängen von DNA zusammengesetzt sind, können verwendet werden, um Fremdgene in monokotyledone Pflanzen zu überführen. Transposons können ebenfalls verwendet werden, um Fremdgene in Pflanzen-DNA einzubringen.
DNA, die AHAS-Gene enthält, kann direkt durch infektiöse Plasmide, wie beispielsweise Ti, Viren oder Mikroorganismen, wie A. tumefaciens, durch die Verwendung von Liposomen, durch Mikroinjektion mit mechanischen oder Laserstrahl-Verfahren, durch ganze Chromosomenfragmente oder durch direktes Besprühen der Früchte mit einem infektiösen Pflanzenvirus in Pflanzenzellen oder -gewebe eingeführt werden.
Herbizid-resistente Pflanzen können unter Verwendung von irgendeinem der vorstehend beschriebenen Mittel und auch durch andere Mittel, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, herkömmlicher genetischer und Pflanzenzüchtungs-Verfahren, genetischer Ganzpflanzenverfahren und somatischer Hybridisierung durch Protoplastenfusion entwickelt werden.

6. BEISPIEL

Gemäß einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde bestimmt, daß der Wirkmechanismus der Imidazolinon-Herbizide und der primäre Wirkort der Herbizid- Aktivität das Enzym Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS) ist. Maisgewebekulturen, die gegen Imidazolinon-Herbizide resistent waren, wurden selektiert, und Pflanzen, die gegen das Herbizid resistent waren, wurden aus diesen Kulturen regeneriert. Ein verändertes AHAS-Enzym wurde in Herbizid-resistenten Kulturen identifiziert. Eine genaue Beschreibung der Erfindung wird in den nachstehenden Unterabschnitten gegeben.

6.1. HERBIZID-WIRKORT

Die Aufklärung des biochemischen Mechanismus der Wirkung der Imidazolinon-Herbizidfamilie wurde unter Verwendung der herbiziden Verbindung AC 243,997 (2-(5-Isopropyl-5-methyl-4- oxo-2-imidazolin-2-yl)nikotinsäure), nachstehend als 997 bezeichnet (American Cyanamid Co., Princeton, NJ) durchgeführt. Diese Verbindung ist für die meisten, wenn nicht alle höheren Pflanzenarten phytotoxisch.

6.1.1. PFLANZENMATERIAL

Nicht - regenerierbare "Black Mexican Sweet Corn",- Zellsuspensionskulturen (d. h. Zellkulturen, denen die Fähigkeit fehlt, Pflanzen zu regenerieren) wurden von Dr. Burle Gengenbach, Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota, St. Paul, MN, erhalten. Vorratszellkulturen wurden in flüssigen Murashige und Skoog (MS)-Medium aufrechterhalten (Murashige und Skoog, 1962, Physiol. Plant 15 : 473), das 2 mg 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) pro Liter enthielt, und wöchentlich durch 1 : 10 Verdünnung des Originalvolumens mit frischem Medium subkultiviert. Die Kulturen wurden in Dunkelheit bei 26ºC in 500 ml-Kolben, die 125 ml Medium enthielten, kultiviert.

6.1.2. WACHSTUMSHEMMENDE WIRKUNGEN VON 997

Homogene, undifferenzierte Pflanzenzellkulturen (d. h. Zellsuspensionskulturen) stellen ein bequemes System zur Untersuchung des Herbizid-Wirkmechanismus auf biochemischer Ebene bereit. Ein anfänglicher Vergleich von wachstumshemmenden Wirkungen von 997 auf Maiszellsuspensionskulturen und Maissämlinge, die von unreifen Embryonen abstammten, wurde vorgenommen. Die Wachstumshemmungsuntersuchungen zeigten, daß Maiszellsuspensionskulturen und Maissämlinge auf ähnliche Weise auf 997 reagierten, weshalb Maiszellsuspensionskulturen als Modellsystem bei allen Untersuchungen der Biochemie der Herbizidwirkung in der vorliegenden Ausführungsform dieser Erfindung verwendet wurden.
Wachstumshemmungsuntersuchungen wurden im 125 ml-Kolben, die 30 ml Testmedium enthielten, durchgeführt. 997 wurde Filtersterilisiert und dem sich nach Autoklavenbehandlung abkühlenden Medium zugeführt. Die Testmedien wurden mit Zellen geimpft, um ein abgesetztes Zellvolumen (15 Min. ohne Zentrifugieren) von 0,2 ml pro 10 ml Suspension zu ergeben.
Nach entweder sechs oder sieben Tagen Wachstum wurden die abgesetzten Zellvolumina wieder quantitativ bestimmt.
Die herbiziden Wirkungen von 997 auf Maissämlinge wurden bestimmt, indem man die Keimung und das Sämlingswachstum aus ausgeschnittenen reifen Maisembryonen bewertete (Green, 1974, Crop Sci. 14 : 54-58). Die Samen wurden 10 Minuten in 0,5%igem Hypochlorit sterilisiert und dann 24 Stunden mit sterilem destilliertem Wasser getränkt. Reife Embryonen wurden aseptisch ausgeschnitten und auf festem MS-Medium (9%igem Agar), das verschiedene Konzentrationen von 997 und kein 2,4-D enthielt, ausplattiert. Die Embryonen wurden so plaziert, daß ihre Sprossenachse vom Medium weg zeigte. Das Sprossenwachstum wurde nach sieben Tagen quantitativ bestimmt. Das Wachstum sowohl von Sämlingen als auch von Suspensionskulturen wurde bei extrem niedrigen Herbizidkonzentrationen, d. h. 1 bis 3 · 10&supmin;&sup8; M im Medium, zu 50% gehemmt. Sechs Mais-Inzuchtlinien mit verschiedenem Hintergrund, A188, A632 (Minnesota Crop Improvement Assoc., St. Paul, MN); W117 (University of Wisconsin, Madison, WI); B37, B73 (Iowa Crop Improvement Assoc.) und Mo17 (Illinois Crop Improvement Assoc., Champaign, IL) wurden getestet, und man fand, daß sie innerhalb der experimentellen Grenzen des Tests gleiche Empfindlichkeiten gegen 997 aufwiesen. Die hochdifferenzierten Sämlinge und die undifferenzierten Suspensionszellen wiesen beide ein hohes Maß an Empfindlichkeit gegen das Herbizid auf, was nahelegte, daß eine Pflanzenentwicklung für die Ausprägung von Empfindlichkeit nicht erforderlich war, und die Suspensionszellen konnten für vorläufige Untersuchungen zur Bestimmung des Wirkmechanismus der Verbindung 997 herangezogen werden.

6.1.3. WIRKUNGEN VON 997 AUF DIE PROTEINSYNTHESE

Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob wachstumshemmende Konzentrationen von 997 hemmende Effekte auf die Zellproteinsynthese aufwiesen.
Suspensionskulturzellen wurden 48 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 · 10&supmin;&sup5; M 997 präinkubiert und dann 12 Stunden lang 75 uCi von entweder ³&sup5;S-Methionin (1210 Ci/mMol, New England Nuclear, Boston, MA) oder ³H-DL-Leucin (55 Ci/mMol, ICN Pharmaceuticals Inc. - K and K Laboratories, Plainview, NY) pro 0,1 ml Zellen bei einer Zelldichte von 10% Zellenvolumen/Suspensionsvolumen ausgesetzt. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, 300 · g, mit kaltem MS-Kulturmedium gewaschen und mit einem kalten Mörser und Pistill in Gegenwart von einem Volumen 6M Harnstoff zerrieben. Der resultierende Extrakt wurde 5 Minuten bei 12 800 · g zentrifugiert. Das Pellet wurde dann nochmals extrahiert, und nach Zentrifugation wurden die Extrakte zusammengegeben. Protein wurde durch die Zugabe von 10%iger (Gew./Vol.) Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt. Das Protein wurde durch Zentrifugation entfernt und in 6M Harnstoff wieder aufgelöst. Der Einbau von Radiomarkierung in das Protein wurde durch Szintillationszählung bestimmt.
Man fand, daß 997 bei einer Konzentration von 1 · 10&supmin;&sup5; M signifikant die Proteinsynthese hemmte, wie es durch quantitative Bestimmung des Einbaus von radiomarkierten Aminosäuren in die mit TCA ausfällbaren Zellkomponenten bestimmt wurde. In Experimenten mit Zellen zu verschiedenen Nach-Subkultivierungszeiträumen lag die Proteinsynthesehemmung im Bereich von 50% bis 77%, bezogen auf Zellenfrischgewicht.
Für die Bestimmung, ob die Herbizidwirkungen auf die Proteinsynthese nicht-spezifisch waren, wurden Proteine in einer Dimension auf SDS-(Natriumdodecylsulfat)-10% Polyacrylamid-Plattengelen elektrophoretisch aufgetrennt (Laemmli, 1970, Nature 227: 680), und der Einbau von Radiomarkierung wurde durch Fluorographie sichtbar gemacht (Daten nicht gezeigt). Zellvolumina von 0,4 ml wurden ³&sup5;S- Methionin in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 · 10&supmin;&sup6; M Herbizid wie vorstehend beschrieben ausgesetzt, mit Mörser und Pistill zerrieben und dann mit 0,75 ml SDS-Probenpuffer extrahiert. Die Extrakte wurden durch Zentrifugation geklärt und 20 ul- oder 4 ul-Proben wurden direkt in die Gele geladen. Es zeigte sich, daß die Hemmung nicht-spezifischer Natur war. Alle in 6M Harnstoff löslichen intrazellulären Hauptproteinkomponenten zeigten abnehmende Gehalte an Radiomarkierung.

6.1.4. BESTIMMUNG DES MECHANISMUS DER PROTEINSYNTHESEHEMMUNG UND DESSEN BEZIEHUNG ZUR WACHSTUMSHEMMUNG

Die Wirkung von 997 auf Reservoirgrößen freier Aminosäuren wurde analysiert, um zu bestimmen, ob Abweichungen im Aminosäuremetabolismus mit den Veränderungen bei der Proteinsynthese verbunden waren (siehe Tabelle 1). TABELLE 1 Konzentrationen freier Aminosäuren in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 · 10&supmin;&sup5; M 997 (nMol pro g Gewebefrischgewicht) Mais in Suspensionskulturen Aminosäure Kontrolle Behandlung mit 997 Cystin a Abgeschätzt b Oxidiertes Cystein N.D. = nicht vorgenommen
Suspensionskulturzellen wurden 3,5 oder 48 Stunden mit 1 · 10&supmin;&sup5; M 997 behandelt. Die Zellen wurden durch Filtration aus der Suspension entfernt, und 1 g Frischgewicht-Mengen wurden mit Mörser und Pistill in 1 ml 5%iger TCA mit Sand zerrieben. 4 ml 5%ige TCA wurden dazugegeben, und der Extrakt wurde 10 Minuten bei 10 000 · g zentrifugiert. Das Pellet wurde nochmals extrahiert, und die Überstände wurden zusammengegeben und einer Kationenaustauschchromatographie unterzogen. Die Proben wurden auf Bond Elut SCX-Säulen (Analytichem International Inc., Harbor City, CA), die mit 5%iger TCA equilibriert worden waren, aufgetragen. Nach Auftragen der Proben wurden die Säulen mit 5 ml destilliertem entionisiertem Wasser gewaschen, und die Aminosäuren wurden mit 2 ml-Aliquoten 5%igem Vol./Vol. Triethylamin eluiert. Die Aliquoten wurden zusammengegeben (6 ml), lyophilisiert und mit einem Kontron Liquemat 111- Aminosäurenanalysator (Hesber, Middlesex TW5 OQU, England) einer Aminosäurenanalyse unterzogen.
997 wies eine differenzierte Wirkung auf die freien Aminosäurenkonzentrationen in Maisgewebe, das in Kultur wuchs, auf. Die Gesamtkonzentrationen freier Aminosäuren in "Black Mexican Sweet Corn"-Gewebe, das mit 997 behandelt worden war, stiegen im Vergleich zur Kontrollkultur an (Tabelle 1). Die biosynthetisch verwandten Aminosäuren Serin, Methionin und Cystein erfuhren die größten Zunahmen während der Herbizideinwirkung (3-, 8- bzw. 24fach, über einen Zeitraum vom 48 Stunden). Jedoch nahmen die biosynthetisch verwandten Aminosäuren Leucin, Valin und Isoleucin nach Herbizidbehandlung ab. Nach 48stündiger Herbizideinwirkung verringerten sich die Konzentrationen dieser Aminosäuren auf 8, 12 bzw. 31% der Konzentrationen, die in unbehandelten Zellkulturen beobachtet wurden.
Zellen wurden getestet, um zu bestimmen, ob die Herbizidinduzierte Wachstumshemmung das Ergebnis der verringerten Erhältlichkeit dieser drei verzweigtkettigen Aminosäuren war. Die Zellen wurden toxischen Konzentrationen von 997 (1 · 10&supmin;&sup6; M) in Medium, das entweder mit 1 mM Konzentrationen an Leucin, Valin und Isoleucin oder mit keinem Zusatz ergänzt war, ausgesetzt. Die Kulturwachstumsraten in Abwesenheit der Aminosäureergänzung und in Anwesenheit von 1 · 10&supmin;&sup6; M 997 verringerten sich auf 16% derjenigen von Herbizid-freien Kulturen. Die Ergänzung mit den verzweigtkettigen Aminosäuren hatte Wachstumsraten zur Folge, die durchschnittlich 91% derjenigen der Kontrollkulturen waren, was eine fast vollständige Aufhebung Herbizid-induzierter Wachstumshemmung zeigte.
Experimente wurden durchgeführt, um die optimalen Ergänzungskonzentrationen jeder dieser drei Aminosäuren zum Erhalt eines maximalen Herbizidschutzes zu bestimmen und um Einblick in den Wirkort der Verbindung zu gewinnen. Die wirksamste Kombination an verwendeten Konzentrationen betrug 1 mM jeder dieser drei Aminosäuren. 1 mM von jeweils Leucin und Valin erwiesen sich als die wirksamste paarweise Kombination, und Valin war als einzelne Ergänzung am wirksamsten (siehe Tabelle 2). Tabelle 2 Aufhebung der 997-Hemmung von Zellsuspensionskulturwachstum durch Leucin, Valin und Isoleucin¹
Keine Ergänzung (4 Replikate)
(&supmin;) 2,36
(&spplus;) 0,30
¹ Kolben wurden mit 0,18 ml Zellen pro 10 ml Medium geimpft. Nach 6-tägigem Wachstum wurde das Volumen der Zellen pro 10 ml Medium quantitativ bestimmt. Zahlen, die durch Semikolon getrennt sind, beziehen sich auf die mM- Konzentrationen von Valin, Leucin bzw. Isoleucin. (&spplus;) bezieht sich auf die Anwesenheit von 1 · 10&sup6; M 997 und (&supmin;) auf dessen Abwesenheit. Die Werte sind der Durchschnitt von zwei Replikaten.
Diese Ergebnisse zeigen, daß 997-induzierte Wachstumshemmung und Proteinsynthesehemmung das Ergebnis einer verringerten Erhältlichkeit der Aminosäuren Leucin, Valin und Isoleucin sind. Zusätzlich beinhalteten die Ergebnisse, daß ein Hauptort der 997-Wirkung mit dem biosynthetischen Leucin-, Valin-, Isoleucin-Stoffwechselweg verbunden ist. Es wurde weiter gefunden, daß eine Medienergänzung mit diesen drei Aminosäuren die wachstumshemmenden Wirkungen von 997 im Bereich einer Konzentration von 1 · 10&supmin;&sup8; bis 1 · 10&supmin;³ M aufheben konnte, was zeigte, daß dieser metabolische Weg den einzigen signifikanten Wirkort enthielt (siehe Fig. 1.). Eine volle Aufhebung konnte wegen einer toxischen Wirkung der Aminosäuren bei hoher Konzentration nicht erreicht werden.
Die Medienergänzung mit jeweils 1 mM Leucin, Isoleucin und Valin hob auch die wachstumshemmenden Wirkungen auf Zellsuspensionskulturen von zwei zusätzlichen Mitgliedern der Imidazolinon-Chemikalienfamilie auf, welche strukturell mit 997 verwandt sind (AC 252,214 [2-(5-Isopropyl-5-methyl-4-oxo- 2-imidazolin-2-yl)-3-chinolincarbonsäure, nachstehend als 214 bezeichnet] und AC 263,499 [5-Ethyl-2-(5-isopropyl-5-methyl-4- oxo-2-imidazolin-2-yl)nikotinsäure, nachstehend als 499 bezeichnet] (American Cyanamid Co., Princeton, NJ)). Die Ergebnisse zeigen, daß die gemachten Beobachtungen nicht einzigartig für 997 sind und zeigen, daß eine ganze Chemikalienfamilie sich den gleichen Mechanismus und Wirkort teilt.

6.1.5. IDENTIFIZIERUNG DES WIRKORTS DER IMIDAZOLINON-HERBIZIDE

Die Herbizidstruktur-Information und Herbizidtoxizitäts- Aufhebungsuntersuchungen mit den verzweigtkettigen Aminosäuren zeigten, daß Acetohydroxysäure-Synthase der Herbizid-Wirkort ist.
Der primäre Wirkort von AC 243,997 liegt wahrscheinlich in irgendeiner Reaktion bei der Biosynthese von Leucin und Valin aus Pyruvat und Isoleucin aus alpha-Ketobuttersäure (siehe Fig. 2.). Vier Enzyme in diesem Stoffwechselweg liegen bei der Synthese jeder dieser drei Aminosäuren gemeinsam vor. Da eine Medienergänzung mit allen drei Aminosäuren für eine maximale Aufhebung der Herbizidaktivität erforderlich ist, sind diese vier Enzyme die wahrscheinlichsten Orte für eine Herbizid- Wechselwirkung. Weiterhin weist AC 243,997 eine gewisse strukturelle Ähnlichkeit mit Leucin und Valin auf. Die Isopropyl- und Carboxyleinheiten am Herbizid-Molekül können in der gleichen räumlichen Konfiguration vorliegen wie die äquivalenten Einheiten an Leucin oder Valin. Das Enzym, das die erste Reaktion im Stoffwechselzyklus von Pyruvat katalysiert, Acetohydroxysäure-Synthase, scheint zwei Regulator-Bindungsstellen aufzuweisen, die Leucin bzw. Valin erkennen. Die Transaminase, die die letzte Reaktion im Stoffwechselweg katalysiert, weist eine Substrat- Bindungsstelle auf, die vermutlich eine gewisse Affinität zu Leucin, Valin und Isoleucin, den Produkten der Reaktion, aufweist. Die vorstehenden Beobachtungen machen diese beiden Enzyme zu den plausibelsten Kandidaten für weitere in-vitro- Untersuchungen. Die folgenden Absätze beschreiben Untersuchungen, die zeigten, daß die Imidazolinone die Aktivität von ARAS in vitro beeinflußten.
Tests wurden in einer Abwandlung des Verfahrens von Smith et al. (1979, Molec. Gen. Genet. 169: 299-314) durchgeführt. Pflanzenzellkulturmaterial wurde mit Sand in einer gleicher Menge (Gew./Vol.) von Zellaufschlußmedium, das 0,05 M Kaliumphosphat (pH 7,0), 0,1 mM MgSO&sub4; und 0,5 mM Dithiothreitol enthielt, mit einem kalten Mörser und Pistill zerrieben. Das Präparat wurde 20 Minuten bei 11 000 · g zentrifugiert, und der Überstand wurde auf AHAS-Aktivität getestet. Die Tests wurden in 1 ml-Volumina, die 0,05 M Kaliumphosphat (pH 8,0), 40 mM Pyruvat, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM Thiaminpyrophosphat, 0,2 ml Zellextrakt und verschiedene Konzentrationen des interessierenden Herbizids enthielten, durchgeführt. Die Reaktionsmischungen wurde 75 Minuten bei 30ºC inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,1 ml 50%iger (Vol./Vol.) H&sub2;SO&sub4; beendet. Nach 20minütiger weiterer Inkubation bei 40ºC wurde das Acetoin, das sich durch Ansäuern aus Acetolactat gebildet hatte, unter Verwendung des Verfahrens von Westerfield (1945, J. Biol. Chem. 161 : 495) quantitativ bestimmt. Zu 0,2 ml Reaktionsmischung wurden 0,8 ml Wasser, 0,5 ml 0,5%iges (Gew./Vol.) Kreatin und 0,5 ml 5% (Gew./Vol.) Naphthol in 10%iger (Gew./Vol.) NaOH gegeben. Nach Mischung wurden die Lösungen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Entwicklung von rosaroter Farbe wurde durch Messen der Lichtabsorbanz bei 530 nm quantitativ bestimmt.
Man fand, daß die AHAS-Aktivität aus Maiszellkulturen durch 997 signifikant gehemmt wurde. Die Enzymaktivität war durch 8 · 10&supmin;&sup6; M 997 um 50% verringert. AC 252,214 und AC 263,499 hemmten ebenfalls die Enzymaktivität. Diese Daten wiesen stark darauf hin, daß AHAS der primäre Ort der phytotoxischen Aktivität der Imidazolinon-Herbizidfamilie war.
Die Selektion und Charakterisierung einer Mutante mit einer veränderten AHAS, die auf zellulärer Ebene Herbizid-Resistenz verlieh, werden in den folgenden Unterabschnitten beschrieben.

6.2. CHARAKTERISIERUNG DER WIRKUNGEN DER IMIDAZOLINON-HERBIZIDE UND STRATEGIE FÜR DIE SELEKTION VON HERBIZID-RESISTENTEN MAISZELLEN

6.2.1. ANZUCHT UND AUFRECHTERHALTUNG VON MAISZELLKULTUREN. DIE PFLANZENREGENERATIONSFÄHIGKEIT BEIBEHALTEN

Brüchige embryogene Mais-Kalluskulturen wurden aus unreifen Hybridembryonen, die durch Bestäubung von Pflanzen der Inzuchtlinie A188 (University of Minnesota, Crop Improvement Association) mit Pollen von Pflanzen der Inzuchtlinie B73 (Iowa State University) erzeugt worden waren, angezogen. Die Kolben wurden geerntet, als die Embryonen eine Länge von 1,5 bis 2,0 mm erreicht hatten. Der ganze Kolben wurde in 50 Vol./Vol. kommerzieller Bleiche (2,63%iges Gew./Vol. Natriumhypochlorit) 20 Minuten bei Raumtemperatur oberflächensterilisiert. Die Kolben wurden dann mit sterilem destilliertem entionisiertem Wasser gewaschen. Unreife Embryonen wurden aseptisch isoliert und auf Anzucht/- Aufrechterhaltungs-Nähragarmedium gegeben, wobei die Wurzel/- Sprossenachse dem Medium ausgesetzt wurde. Das Anzucht/- Aufrechterhaltungs-Medium bestand aus N6-Basalmedium (Chihching in Proceedings of Symposium on Plant Tissue Culture, May 25-30, 1978, Science Press, Peking, Seiten 43-50) mit 2% (Gew./Vol.) Saccharose, 1,5 mg pro Liter 2,4-D, 6 mM Prolin und 0,9% (Gew./Vol.) Agar.
Die unreifen Embryonen wurden bei 26ºC unter schwachem Licht inkubiert. Zellproliferationen aus dem Scutellum der unreifen Embryonen wurden bezüglich brüchiger Konsistenz und der Anwesenheit gut definierter somatischer Embryonen ausgewertet. Gewebe mit dieser Morphologie wurde 10 bis 14 Tage nach dem anfänglichen Ausplattieren der unreifen Embryonen in frisches Medium überführt. Das Gewebe wurde dann routinemäßig alle 12 bis 16 Tage subkultiviert. 60 bis 80 mg-Mengen Gewebe wurden aus Gewebestücken, die eine Größe von ungefähr 1 g erreicht hatten, entfernt und in frisches Medium überführt. Das Subkultivieren beinhaltete immer eine sorgfältige visuelle Überwachung, um sicher zu sein, daß nur Gewebe der richtigen Morphologie aufrechterhalten wurde. Die Anwesenheit der somatischen Embryonen stellte sicher, daß die Kulturen unter den geeigneten Bedingungen Pflanzen entstehen lassen würden.

6.2.2. KALLUSKULTUR-WACHSTUMSHEMMUNG DURCH IMIDAZOLINON-HERBIZIDE

Da Mais im allgemeinen nach Sojabohnen auf dem Feld angebaut wird, erschien es vernünftig, Selektionen für eine Maisresistenz gegen 214 (ein Sojabohnen-Herbizid) anstelle von 997 (einer gesamtvegetativen Verbindung) durchzuführen. Deshalb wurden die Wirkungen von 214 auf das Kalluswachstum bestimmt. Gewebemengen mit einer durchschnittlichen Größe von 90 mg wurden auf Aufrechterhaltungs-Nähragarmedium überführt, das Konzentrationen von 214 im Bereich von 0,003 bis 3 mg pro Liter enthielt. Acht Gewebestücke wurden auf jede Schale gegeben, mit drei Schalen pro Herbizidkonzentration. Nach 14-tägigem Wachstum wurde das Gewebe wieder gewogen. Man fand, daß die Hemmung der Wachstumsrate in einem Konzentrationsbereich von 214 von 0,1 bis 0,3 mg pro Liter halbmaximal war. Bei keiner der getesteten Herbizidkonzentrationen wurde innerhalb eines 14-tägigen Zeitraums das Stattfinden von Zelltod beobachtet. Jedoch traten Kulturmorphologieänderungen bei Herbizidkonzentrationen auf, die mehr als eine halbmaximale Hemmung der Wachstumsrate ergaben. Besonders augenscheinlich war der Verlust an somatischer Embryobildung.
Wachstumshemmungsuntersuchungen, die über Zeiträume von mehr als 14 Tagen durchgeführt wurden, bei denen Gewebe entweder in Abwesenheit von Herbizid auf den gleichen Schalen über mehr als 14 Tage kultiviert wurde oder auf frische Schalen, die die gleiche Herbizidkonzentration enthielten, überführt wurde, zeigten halbmaximale wachstumshemmende Wirkungen bei geringeren Herbizidkonzentrationen (3- bis 10fach). Deshalb nehmen die wachstumshemmenden Wirkungen des Herbizids mit der Zeit sowie mit gesteigerten Herbizidmengen im Medium zu. Diese Beobachtung zeigte, daß das Herbizid sehr beständig war, d. h., daß es wahrscheinlich nicht zu irgendeinem großen Ausmaß metabolisiert wurde, und im Gewebe akkumulierte.

6.2.3. AUFHEBBARE WIRKUNGEN VON 214

Um zu bestimmen, ob die Wirkungen von 214 aufhebbar waren, wurden "Black Mexican Sweet Corn"-Zellen, die in flüssiger Suspensionskultur wuchsen, 0,03 mg 214 pro Liter über verschiedene Zeiträume bis zu 42 Stunden ausgesetzt. Das Wachstum wurde vollständig gehemmt. Die Zellen wurden dann mit Herbizid-freiem Medium gewaschen, und die Wachstumsrate wurde wieder in Abwesenheit von Herbizid ausgewertet. Man fand, daß die Zellen rasch zu einer ungehemmten Wachstumsrate zurückkehrten. Während der Herbizideinwirkung teilten sich die Zellen nicht, blieben aber lebensfähig und nahmen die Teilung wieder auf, wenn das Herbizid entfernt wurde. Die aufhebbare Natur der Herbizid-induzierten Wachstumshemmung zeigte, daß eine kontinuierliche Herbizideinwirkung bei dem Selektionsverfahren verwendet werden sollte, und nicht eine intermittierende Einwirkung einer gegebenen Dauer.

6.3. SELEKTION UND CHARAKTERISIERUNG EINER HERBIZID-RESISTENTEN ZELLINIE

Das Selektionsprotokoll, das verwendet wurde, um Herbizidresistente Zellen zu identifizieren und zu isolieren, wurde so gestaltet, daß berücksichtigt wurde, daß (1) die Wirkungen des Herbizids umkehrbar waren; (2) die Wirkungen des Herbizids im Verlauf der Zeit anstiegen; und (3) hohe Herbizidkonzentrationen die somatische Embryoentwicklung und potentiell die Pflanzenregenerationsfähigkeit nachträglich beeinflußten. Deshalb beinhaltete das Verfahren die kontinuierliche Einwirkung geringer Herbizidkonzentrationen über mehrere Subkulturzeiträume auf das Gewebe und das sorgfältige Registrieren des Wachstums des ganzen Gewebes in der Selektion. Auf diese Weise ließ man das Herbizid langsam mit kontinuierlichem Selektionsdruck wirken, was Herbizidtoleranten Zellen gestattete, im Verlauf der Zeit zu akkumulieren, und dennoch nicht das Potential für Pflanzenregeneration beeinträchtigen. Dieses Verfahren gestattete die Selektion von Zellen selbst mit kleinen Niveaus an Herbizidtoleranz (2- bis 3fach bezüglich Herbizidkonzentration).

6.3.1. SELEKTION EINER HERBIZID-RESISTENTEN ZELLINIE

Viele Selektionen wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Selektionsprotokolls durchgeführt. Die Selektion einer derartigen Herbizid-resistenten Linie, die identifiziert und charakterisiert wurde, wird nachstehend in Einzelheit beschrieben.
Ungefähr 13 g heftig wachsendes Mais-Kallusgewebe wurde in Aufrechterhaltungsmedium in Petrischalen, die 0,03 mg Herbizid 214 pro Liter enthielten, überführt. 30 Schalen wurden präpariert, und 80-90 mg Gewebe wurden in fünf Bereichen auf jeder Schale ausplattiert. Die Herbizidkonzentration wurde aus Wachstumshemmungsuntersuchungen so ausgewählt, daß sie für weniger als 20% bis 40% Wachstumshemmung während der ersten zwei Wochen der Herbizideinwirkung sorgte.
Nach 10 Tagen hatte die Masse des Gewebes mehr als 4fach zugenommen. Gewebestücke von 80 bis 90 mg, die eine heftige Wachstumsrate und eine Beibehaltung embrycgener Morphologie (d. h. Anwesenheit somatischer Embryonen) zeigten, wurden auf frischem Medium, daß 0,03 mg 214 pro Liter enthielt, subkultiviert. 30 Schalen, die durchschnittlich 7 Gewebestücke pro Schale enthielten, wurden präpariert. Jedes Gewebestück wurde gekennzeichnet und wurde der Ahn einer "Linie". Eine vollständige Genealogie wurde aufrechterhalten und für zukünftige Subkulturen aufgezeichnet. Anschließende Subkulturzeiträume lagen im Bereich von 15 bis 30 Tagen, abhängig vom Gesamtwachstum des Kallusgewebes.
Bei jeder Überführung wurde alles Gewebe, das Wachstum und Fähigkeit zur somatischen Embryobildung zeigte, auf frisches Medium gegeben, und die Zahl von Kallusstücken einheitlicher Größe innerhalb einer gegebenen "Linie" wurde notiert. Während des Verlaufs des Selektionsverfahrens nahm die Gesamtzahl von Linien ab, als die durch Herbizid vermittelte Wachstumshemmung intensiver wurde. Viele Linien nahmen jedoch an Größe zu. Am Ende des fünften Selektionszyklus wurde die Konzentration von 214 auf 0,1 mg pro Liter angehoben, um den Selektionsdruck zu steigern.
Zwischen dem fünften und sechsten Selektionszyklus begann die Gewebemenge in der Linie XA17 signifikant zuzunehmen. Das Gewebe, das die vergrößerte Wachstumsrate aufwies, wies eine Morphologie auf, die von der des Muttermaterials, aus dem die Selektion angezogen worden war, verschieden war. Die Zellen waren durchschnittlich kleiner und zytoplasmatisch dichter, was dem Gewebe einen gelben Farbton verlieh. Das Gewebe fuhr fort, über nachfolgende Subkulturzeiträume schnell zu wachsen, bis der allergrößte Teil des Gewebes in der Selektion als Linie XA17 identifiziert wurde. Bei der siebten Subkultur wurde Gewebe der Line XA17 zum Zweck der Charakterisierung aus der Selektion entfernt. Dieses Vorratsgewebe wurde auf vorstehend in 6.2.1. beschriebenem Aufrechterhaltungsmedium, das 0,1 mg 214 pro Liter enthielt, aufrechterhalten und akkumuliert.

6.3.2. CHARAKTERISIERUNG DER MAIS-ZELLINIE XA17

Die resistente Zellinie wurde charakterisiert, um: (1) die Größe der Resistenz; (2) das chemische Spektrum der Resistenz; und (3) die biochemische Grundlage für die Resistenz auszuwerten.
Zu Beginn wurde die maximale Konzentration von 214, bei der die Zellinie XA17 stabil wuchs, bestimmt. Vorratsgewebe, das in Anwesenheit von 0,1 mg 214 pro Liter aufrechterhalten worden war, wurde auf Medium überführt, das 214- Konzentrationen im Bereich bis zu 30 mg pro Liter enthielt. Das Gewebe wurde über mehrere Subkulturzeiträume aufrechterhalten, und die Wachstumsrate wurde ausgewertet. Gewebe der Linie XA17 wuchs normal bei einer maximalen Konzentration an 214 von 3,0 mg pro Liter, verglichen mit einem Maximum von 0,01 mg 214 pro Liter bei unselektiertem Gewebe.
Zweiwöchige Wachstumshemmungsuntersuchungen (wie vorstehend beschrieben) wurden mit 214, 997, 499 und Chlorsulfuron durchgeführt. Man fand, daß die Konzentrationen von 214, 997 und 499, die eine 50%ige Wachstumshemmung ergaben, 30 mg pro Liter bei 214 und mehr als 30 mg pro Liter bei 997 und 499 waren, verglichen mit Konzentrationen von 0,1 bis 0,3 mg pro Liter bei unselektiertem Gewebe. Die Wachstumsrate von Gewebe der Linie XA17 wurde durch 10 mg pro Liter Chlorsulfuron(2- Chlor-N-[4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)aminocarbonyl)benzolsulfonamid, auch als Chlorsulfuron, DPX 4189, bekannt, E. I. DuPont de Nemours and Company, Wilmington, DE) zu 50% gehemmt, verglichen mit 0,01 mg pro Liter bei unselektiertem Gewebe. Obwohl die Linie XA17 bezüglich Resistenz gegen 214 selektiert war, prägte sie eine mindestens 300fache Resistenzsteigerung (bezogen auf Konzentration) gegen die anderen getesteten Verbindungen aus.

6.3.3. AHAS-AKTIVITÄT DER MAISLINIE XA17

Tests wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Acetohydroxysäure-Synthase, die aus Gewebe der Linie XA17 extrahiert worden war, bezüglich der Herbizidempfindlichkeit verändert war. Eine derartige Änderung würde anzeigen, daß eine Veränderung dieses Enzyms die Herbizidresistenz vermittelte. Tests wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die AHAS-Aktivität von Kontrollgewebe wurde durch 997, 214 und 499 im Konzentrationsbereich von 1 · 10&supmin;&sup6; bis 1 · 10&supmin;&sup5; M zu 50% gehemmt. Die AHAS-Aktivität von Gewebe der Linie XA17 wurde durch 997, 214 und 499 im Bereich von 3 · 10&supmin;³ bis 3 · 10&supmin;¹ M Herbizidkonzentration zu 50% gehemmt, was eine mindestens 1000fache Änderung in der Herbizidempfindlichkeit, bezogen auf Konzentration, anzeigte. Man fand, daß die AHAS-Aktivität von Kontrollgewebe durch 1 · 10&supmin;&sup8; M Chlorsulfuron zu 50% gehemmt wurde, verglichen mit einer 50%igen Hemmung von AHAS der Linie XA17 bei 3 · 10&supmin;&sup7; M.
Die Ergebnisse zeigen, daß AHAS der Wirkort der getesteten Herbizide ist, und weiter, daß die Resistenz durch eine Veränderung des Wirkorts übermittelt wird. Da die Linie XA17 Resistenz auf der zellulären Ebene aufgrund des Vorliegens eines veränderten Wirkorts ausprägt, ist es wahrscheinlich, daß die Herbizidtoleranz sich auf viele Verbindungen, die an den gleichen Stellen auf AHAS wirken, erstreckt, einschließlich alle Mitglieder der Imidazolinon- und sulfonamid-Herbizidfamilien.
Die Imidazolinon- und Sulfonamid-Herbizidfamilien sind strukturell verschieden. Obwohl sie beide die AHAS-Aktivität in Pflanzen hemmen, gehen sie wahrscheinlich mit verschiedenen Stellen auf dem Enzym eine Wechselwirkung ein. Wenn sie mit verschiedenen Stellen eine Wechselwirkung eingehen, dann ist die Veränderung in der XA17-AHAS, die zur Imidazolinon- Resistenz Anlaß gab, offensichtlich wesentlich genug, um beide Stellen zu beeinflussen. Die AHAS-Veränderung von XA17-Gewebe kann auch die Bindung von Verbindungen, die keine Imidazolinone oder Sulfonamide sind, welche mit dem Enzym eine Wechselwirkung eingehen, betreffen.
Gleichgültig, ob die obige Erklärung von Wirkorten, die durch die Herbizide betroffen sind, richtig ist oder nicht, bleibt die Tatsache bestehen, daß Kallusgewebe und regenerierte Pflanzen der Linie XA17 beträchtliche Mengen an Toleranz gegen Mitglieder beider Herbizidfamilien ausprägen, verglichen mit anderen Mais-Zellkulturen oder -pflanzen.

6.4. PFLANZENREGENERATION UND SAMENPRODUKTION

6.4.1. PFLANZENREGENERATIONSPROTOKOLL

80 bis 90 mg-Mengen von Mais-Kallusgewebe wurden in Embryo- und sprossenentwicklungs-(Regenerations-)Medium in Petrischalen überführt. Das Medium bestand aus MS-Basalmedium, das mit 0,1 mg pro Liter 2,4-D und 1 · 10&supmin;&sup7; M Abscisinsäure ergänzt war. 0,25%iges Gelrite (Kelco Co., San Diego, CA) wurde anstelle von Agar als fester Träger verwendet. Das Gewebe wurde 1 Woche bei 26ºC im Dunkeln inkubiert. Die Schalen wurden dann bei 26ºC einer Lichtbehandlung (ungefähr 300 Fußkerzen, weiches weißes Fluoreszenzlicht) mit einem Zyklus von 14 Stunden Helligkeit, 10 Stunden Dunkelheit ausgesetzt. Sich entwickelnde Pflanzen, die eine Größe von 1-3 cm erreichten, wurden dann zur weiteren Entwicklung in Kolben oder Gläser überführt, die MS-Medium ohne Ergänzung enthielten. Als die Pflanzen das 2- oder 3-blättrige Stadium erreichten, wurden sie in Töpfe gegeben, die Vermikulit enthielten, und Licht bei 2600 Fußkerzen ausgesetzt. Diese Pflanzen wurden eine Woche mit 20%igem Vol./Vol. MS-Medium und dann mit Wasser bewässert, bis sie stabil wuchsen. Die Pflanzen wurden dann zum Wachstum bis zur Reife in Erde überführt.

6.4.2. HERBIZIDHEMMUNG DER PFLANZENREGENERATION

Die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von 214 auf die Pflanzenregeneration (Embryo- und Sprossenentwicklung) wurden ausgewertet. Unselektiertes Kulturgewebe wurde in Regenerationsmedium überführt, das verschiedene Konzentrationen an 214 im Bereich von 0,01 bis 0,3 mg pro Liter enthielt. Das Gewebe wurde dann den ersten drei Wochen des vorstehend beschriebenen Pflanzenregenerationsprotokolls unterzogen. Die Kultur wurde nach dieser Zeit bezüglich der Erzeugung gut definierter Sprossen bewertet.
Die Pflanzenregeneration wurde durch 214 im Konzentrationsbereich von 0,03 bis 0,1 mg pro Liter zu 50% gehemmt, bezogen auf die Zahl der gebildeten Sprossen. 0,3 mg 214 pro Liter hemmten die somatische Embryoentwicklung und Sprossenbildung vollständig.

6.4.3. EXPRESSION VON HERBIZIDRESISTENZ IN PFLANZEN DIE AUS KALLUSGEWEBE DER LINIE XA17 REGENERIERT WORDEN WAREN

Merkmale, die in undifferenzierten Zellkulturen selektiert und ausgeprägt werden, werden nicht notwendigerweise in den differenzierten Organen und Geweben einer sich entwickelnden Pflanze ausgeprägt. Deshalb war es notwendig, Pflanzen, die aus Kallusgewebe der Line XA17 regeneriert worden waren, in Gegenwart von normalerweise hemmenden Konzentrationen von 214 zu überprüfen. Gewebe der Linie XA17 wurde in Regenerationsmedium überführt, das 0,1, 0,3 und 3,0 mg 214 pro Liter enthielt. Sich normal entwickelnde Pflänzchen wurden bei allen drei Herbizidkonzentrationen erhalten, was zeigte, daß die Herbizidresistenz während der Pflanzenentwicklung ausgeprägt wurde.

6.4.4. REGENERATION VON REIFEN PFLANZEN UND SAMENERZEUGUNG

Reife Pflanzen wurden aus Kallusgewebe der Linie XA17 regeneriert, welches entweder über mindestens 3 Subkulturzyklen der Herbizideinwirkung entzogen worden war oder kontinuierlich 0,1, 0,3 oder 3,0 mg 214 pro Liter auf Aufrechterhaltungsmedium ausgesetzt worden war. Die Pflanzenregenerationshäufigkeit betrug in allen Fällen ungefähr eine Pflanze pro 100 g Zellkultur. Man zog die Pflanzen bis zur Reife, und die erhaltenen Pollen wurden verwendet, um Pflanzen der Inzuchtlinie B73 zu bestäuben.
Umgekehrt wurde Pollen aus B73-Pflanzen mit regenerierten Pflanzen der Linie XA17 gekreuzt. Man fand, daß der erhaltene Samen unter normalen Anpflanzungsbedingungen keimte. Das Maß der Ausprägung und die Genetik des Resistenzmerkmals in der Nachkommenschaft der regenerierten Pflanzen werden derzeit untersucht.

6.4.5. EXPRESSION VON HERBIZIDRESISTENZ IN DER NACHKOMMENSCHAFT REGENERIERTER PFLANZEN

Sämlingstests von Nachkommenschaft, die aus Pflanzen erhalten wurde, welche aus der Zellinie XA17 regeneriert worden waren, wurden wie nachstehend beschrieben durchgeführt, um zu bestimmen, ob die in Kultur selektierte Herbizidresistenz nach einem Sexualzyklus in Pflanzen vererbt und ausgeprägt wurde.
Eine regenerierte XA17-Pflanze mit einem normalen Kolben wurde mit Pollen bestäubt, der aus einer aus Samen gezüchteten, Herbizid-empfindlichen B73-Inzuchtpflanze erhalten worden war. 40 Tage nach der Bestäubung wurden Samen erhalten und geerntet.
Samen, die als Kontrolle in dem Vererbungstest verwendet werden sollten, wurden aus regenerierten Pflanzen einer Herbizid-empfindlichen Zellinie mit dem gleichen genetischen Hintergrund wie die Linie XA17 erhalten. Diese regenerierten Pflanzen wurden mit Pollen gekreuzt, der von einer aus Samen gezüchteten, Herbizid-empfindlichen B73-Inzuchtpflanze gewonnen worden war. Ungefähr 40 Tage nach Bestäubung wurden Samen geerntet.
20 Kontrollsamen und 10 XA17-Samen wurden mit 2,6%igem Natriumhypochlorit 20 Minuten oberflächensterilisiert und dann mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen. Der Samen wurde über Nacht mit sterilem Wasser getränkt, das eine kleine Menge des Fungizids Captan (N-Trichlormethylthio-4-cyclohexen-1,2- dicarboximid) enthielt. Die reifen Embryonen wurden dann aus dem Samen ausgeschnitten und auf festem MS-Medium ohne 2,4-D mit der Scutellum-Seite nach unten ausplattiert. 10 Kontrollsamen wurden auf Medium ausplattiert, das kein 214 enthielt, und 10 wurden in Gegenwart von 6 · 10&supmin;&sup8; M 214, das nach Behandlung in Autoklaven, aber vor Gelieren inkorporiert worden war, ausplattiert. Alle 10 XA17-Samen wurden in Gegenwart von 10 · 10&supmin;&sup8; M 214 ausplattiert. Die Sämlinge wurde sieben Tage nach Ausplattieren bewertet.
Kontrollsämlinge in Abwesenheit von 214 wuchsen innerhalb des Zeitraums von sieben Tagen normal, wobei sie eine durchschnittliche Sprossenlänge von 11,8 cm (Fig. 3) und eine durchschnittliche Wurzellänge von 8,1 cm (Fig. 4) erreichten. Eine Wachstumshemmung der Kontrollsämlinge in Gegenwart von 214 wurde zuerst am Tag 3 beobachtet. In den darauffolgenden Tagen fand kein weiteres Wachstum statt. Die durchschnittlich erreichte Sprossenlänge und Wurzellänge betrug 1,5 bzw. 1,1 cm.
20 Bei den 10 XA17-Sämlingen, die in Gegenwart von 214 gezogen wurden, war das Wachstum von fünf Sämlingen in gleichem Maß wie bei den Kontrollsämlingen, die in Gegenwart von 214 wuchsen, gehemmt. Fünf XA17-Sämlinge zeigten eine Resistenz gegen Wachstumshemmung durch 214 (Fig. 3 und Fig. 4).
Das Wurzelwachstum der resistenten Sämlinge war besonders bemerkenswert. Die Wurzeln durchdrangen das Herbizid-haltige Medium und wuchsen schnell mit beträchtlicher Verzweigung und erreichten Längen von 6-7 cm. Die Wurzeln von empfindlichen Sämlingen wuchsen wenig (0-1 cm) und verblieben auf der Oberfläche des Mediums. Die Daten zeigen, daß das Herbizidresistenzmerkmal, das in Kultur selektiert worden war, als dominante(s) Gen (oder Gene) vererbt wird und daß es für ein hohes Maß an Resistenz gegen 214 in Pflanzen sorgt.
Resistente und empfindliche Sämlinge wurden zum Wachstum bis zur Reife in Töpfe überführt. Das Merkmal wird aus diesen Pflanzen in landwirtschaftlich wichtige Inzuchtlinien zur kommerziellen Entwicklung eingekreuzt werden.

6.4.6. VERFAHREN ZUM ERHALT VON EINHEITLICHEM HERBIZID-RESISTENTEM SAMEN

Samen von Herbizid-resistenten regenerierten Pflanzen, der aus Kreuzungen mit Herbizid-empfindlichen Pflanzen erhalten worden ist, segregiert bezüglich des Herbizidresistenzmerkmals, ein resistenter zu einem empfindlichen. D.h., die Hälfte der Samen besitzt ein einziges Gen, das für die Resistenz kodiert, und die Hälfte der Samen weist keine Resistenz auf. Samen, die einheitlich das Merkmal ausprägen und bezüglich des resistenten Acetohydroxysäure-Synthasegens heterozygot oder homozygot sind, können durch Durchführung der folgenden Kreuzungen und Tests erhalten werden.
Samen, der von Herbizid-resistenten regenerierten Pflanzen erhalten wurde, die mit empfindlichen Pflanzen gekreuzt worden waren, wird eingepflanzt, zur sexuellen Reife gezogen und selbstbestäubt. Proben von Samen, der aus den resultierenden Kolben geerntet worden ist, werden unter Verwendung eines Sämlingtests auf Herbizidresistenz getestet. Die Hälfte der Kolben wird keinen resistenten Samen aufweisen. Die andere Hälfte wird Samen aufweisen, der das Resistenzmerkmal ausprägt, wobei das Merkmal 1 : 2 : 1 (homozygote Resistenz: heterozygote Resistenz: homozygote Empfindlichkeit) segregiert, d. h. 75% des Samens das Resistenzmerkmal trägt.
Samen aus Kolben, die das Resistenzmerkmal besitzen, werden dann hochgezogen und selbstbestäubt. Samen aus den resultierenden Kolben werden wieder auf Resistenz getestet. 25% dieser Kolben werden Samen aufweisen, die einheitlich Herbizidresistenz ausprägen. Diese Samen sind homozygot bezüglich des Resistenzmerkmals und stammen von homozygoten Pflanzen.
Samen, der bezüglich des Resistenzmerkmals einheitlich heterozygot ist, kann durch Ziehen von Pflanzen aus homozygotem Samen und Verwendung dieser Pflanzen entweder als männlicher oder als weiblicher Elternteil in Kreuzungen mit Pflanzen, denen das Resistenzgen fehlt, erhalten werden. Die Nachkommenschaft aus diesen Kreuzungen ist einheitlich Herbizid-resistent und heterozygot bezüglich des Resistenzgens.

7. BEISPIEL

7.1. SELEKTION ZUSÄTZLICHER HERBIZID-RESISTENTER MAIS-ZELLINIEN

Die folgenden Abschnitte beschreiben kurz die Selektion und teilweise Charakterisierung von zwei zusätzlichen Imidazolinon-resistenten Mais-Zellinien, QJ22 und UV18.

7.1.2. SELEKTION DER MAIS-ZELLINIE OJ22

Die Linie QJ22 wurde aus Maiszellkultur selektiert, wobei das in Einzelheit für die Selektion der Linie XA17 beschriebene Protokoll (Abschnitt 6.3.1.) verwendet wurde, mit den folgenden signifikanten Unterschieden: (1) Mais-Kallusgewebe wurde unter Verwendung des Herbizid 499 selektiert; und (2) das Gewebe, das verwendet wurde, um die Selektion zu anzuziehen, wurde aus einer zuvor selektierten Zellinie, XA119, erhalten. XA119 wurde in einer Selektion bezüglich 214- Toleranz identifiziert, und es ist gezeigt worden, daß es eine ungefähr 3fache Toleranzsteigerung für 214 auf der zellulären Ebene aufwies.
Die Selektionslinie QJ22 wurde bei einer 499-Konzentration von 0,1 mg pro Liter angezogen. Die Selektion wurde durch zwei sehr lange Subkulturzeiträume, die einen 12-wöchigen Zeitraum abdeckten, aufrecht erhalten. Die Linie QJ22 wurde nach 12-wöchiger Selektion als ein schnell wachsender Gewebeabschnitt mit guter Gewebemorphologie identifiziert. Das QJ22-Gewebe wurde innerhalb der folgenden Wochen in Gegenwart von 0,1 mg 499 pro Liter vergrößert. Nach 8-wöchiger Akkumulation wurde die Zellinie charakterisiert und Pflanzenregenerationsbemühungen wurden eingeleitet. Mehrere Sprossen und kleine Pflanzen wurden erhalten und werden zur Reife gezogen.

7.1.3. SELEKTION DER LINIE UV18

Die Linie UV18 wurde ebenfalls aus Maiszellkultur selektiert, wobei das für die Selektion der Linie XA17 in Einzelheit beschriebene Protokoll verwendet wurde, mit einem wichtigen Unterschied. Das Gewebe, das zur Anzucht der Selektion verwendet wurde, wurde einer Bestrahlung mit ultraviolettem Licht unterzogen, bevor es 214 ausgesetzt wurde.
Für die Einwirkung von ultraviolettem Licht wurde das Gewebe in dünner Schicht (1-3 mm) auf Aufrechterhaltungsmedium in Kunststoff-Petrischalen ausgebreitet. Diese Schalen wurden dann über Zeiträume von 0, 1, 2, 4 und 8 Minuten in Abwesenheit von sichtbarem Licht mit UV-Licht bestrahlt. Die Ultraviolettlicht-Quelle war eine Westinghouse Modell 782L-30 29W-Lampe (Westinghouse Electrical Corporation, Lamp Commercial Division, Bloomfield, NJ), die ungefähr 7 Zoll vom Gewebe entfernt aufgestellt wurde. Das bestrahlte Gewebe wurde über zwei Wochen im Dunkeln kultiviert. Überlebendes Gewebe wurde dann in Aufrechterhaltungsmedium, das 0,1 mg 214 pro Liter enthielt, zur Anzucht einer Selektion bezüglich 214- Resistenz überführt.
Die Linie UV18 wurde aus Gewebe identifiziert, das 2 Minuten ultraviolettem Licht ausgesetzt worden war. Es konnte nicht bestimmt werden, ob die Veränderung, die zur 214-Toleranz Anlaß gab, das Ergebnis der Ultraviolett-Bestrahlung oder einer spontanen Variation war, die -sich während des Selektionsprozesses ereignete.
Die UV18-Zellinie wurde zuerst nach 25-wöchiger Selektion, die 8 Subkulturzeiträume umfaßte, beobachtet. Das Gewebe im Selektionsverfahren war 0,1 mg 214 pro Liter über 4 Subkulturzeiträume ausgesetzt worden, gefolgt von der Einwirkung von 0,3 mg 214 pro Liter über 4 Subkulturzeiträume. UV18 wurde während der 9. Subkultur als schnellwachsender Gewebeabschnitt mit guter Morphologie identifiziert. Das Gewebe wuchs in Anwesenheit von 0,3 mg 214 pro Liter so schnell wie Kontrollgewebe in Abwesenheit von Herbizid.
Die Zellinie wurde in Anwesenheit von 214 schnell vergrößert und charakterisiert, Pflanzen wurden in Anwesenheit von normalerweise toxischen Konzentrationen von 214 (0,3 mg pro Liter) regeneriert, was zeigte, daß das Resistenzmerkmal in differenzierten Pflanzenorganen ausgeprägt wurde. Herbizidresistente Pflanzen, die aus der UV18-Zellkultur regeneriert worden sind, werden derzeit zur Reife gezogen.

7.1.4. CHARAKTERISIERUNG DER LINIEN QJ22 und UV18

Die resistenten Kallusgewebe wurden charakterisiert, um die Größe und das Spektrum der Herbizidtoleranz zu bestimmen. Kallusgewebe aus den Linien QJ22 und UV18 wurde mit einer Reihe von Konzentrationen der Verbindungen 214, 997, 499 und Chlorsulfuron Wachstumshemmungsuntersuchungen unterzogen. Tabelle 3 beschreibt die Ergebnisse dieser Untersuchungen. Die Zahlen stellen die -fache Steigerung in der Herbizidkonzentration dar, die von jeder der Zellinien toleriert werden kann, verglichen mit Kontrollgewebe. Die Werte wurden auf der Basis der Menge an Herbizid, das eine 50%ige Verringerung in der Wachstumsrate ergab, berechnet. In dem Fall, in dem eine mehr als 100fache Resistenz angegeben wird, war das Gewebe gegen die höchsten getesteten Konzentrationen vollständig tolerant. UV18 zeigte im allgemeinen eine Toleranz gegen Herbizide, die derjenigen der Linie XA17 ähnlich war. QJ22 ist von UV18 und XA17 signifikant verschieden, d. h. ein viel kleinerer Grad an Toleranz gegen 214 und im wesentlichen keine Toleranz gegen Chlorsulfuron wurden beobachtet. Tabelle 3 Selektierte Linie -fache Steigerung in der Toleranz Chlorsulfuron

7.1.5. HERBIZIDHEMMUNG DER AHAS-AKTIVITÄT DER MAISLINIEN QJ22 und UV18

Acetohydroxysäure-Synthase-Aktivität wurde wie vorstehend in Einzelheit für die Zellinie XA17 beschrieben aus den Zellinien UV18 und QJ22 extrahiert und getestet. Die AHAS-Aktivität aus beiden selektierten Linien war über einen 100-fachen Bereich von 997-Konzentration (3 · 10&supmin;&sup6; bis 3 · 10&supmin;&sup4; M) toleranter gegen 997, als es die AHAS-Aktivität aus Kontrollkulturen war. Die Ergebnisse legen nahe, daß UV18 und QJ22 wie XA17 aufgrund des Vorliegens eines veränderten Herbizidwirkorts Herbizidresistent waren. Zusätzlich können in diesen Zellinien andere Mechanismen bei der Vermittlung von Herbizidresistenz beteiligt sein.

8. HINTERLEGUNG VON ZELLINIEN UND SAMEN

Die folgenden Zellinien, wie hierin beschrieben, sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt worden, und es sind ihnen die folgenden Hinterlegungsnummern zugeteilt worden:
Zellinie Hinterlegungsnummern
XA17 40 100
QJ22 40 129
UV18 40 128
Samen, die von Pflanzen abstammten, die aus der Zellinie XA17, wie hierin beschrieben, gezogen wurden, sind bei in Vitro International, Inc., Ann Arbor, Michigan, hinterlegt worden, und es ist ihnen die IVI-Hinterlegungsnummer 10011 zugeteilt worden.
Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Bereich nicht auf die hinterlegte Zellinie oder die hinterlegten Samen beschränkt, da die hinter legten Ausführungsformen als einzelne Erläuterungen eines Aspekts der Erfindung anzusehen sind, und alle Zellinien oder Samen, die funktionell äquivalent sind, liegen im Bereich dieser Erfindung. In der Tat werden aus der vorangehenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen verschiedene Abänderungen der Erfindung zusätzlich zu denjenigen, die hierin gezeigt und beschrieben werden, dem Fachmann offenkundig.

Claims

1. Pflanze, deren Wachstum bei Niveaus, die normalerweise das Wachstum dieser Pflanze hemmen, resistent gegen Hemmung durch ein 2-(2-Imidazolin-2-yl)pyridin- oder -chinolin-Herbizid oder durch ein Sulfonamid-Herbizid ist, worin die Resistenz durch eine veränderte Acetohydroxysäure-Synthase verliehen wird, welche bei Niveaus, die normalerweise die Aktivität einer unveränderten Acetohydroxysäure-Synthase hemmen, gegen Hemmung durch besagtes Herbizid resistent ist.

2. Pflanze nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Dikotyle oder ein Monokotyle ist.

3. Pflanze nach Anspruch 2, worin die Pflanze aus einer aus Mais, Reis, Weizen, Gerste, Sorghum, Hafer, Roggen und Hirse bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Pflanze nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das Herbizid 5-Ethyl-2-(5-isopropyl-5-methyl-4-oxo-2-imidazolin- 2-yl)nicotinsäure; 2-(5-Isopropyl-5-methyl-4-oxo-2-imidazolin-2-yl)nicotinsäure; 2-(5-Isopropyl-5-methyl-4-oxo-2- imidazolin-2-yl)3-chinolincarbonsäure; oder 2-Chlor-N-[(4- methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)aminocarbonyl]benzolsulfonamid ist.

5. Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die veränderte Acetohydroxysäure-Synthase durch ein Gen codiert wird, das von der gleichen Pflanzenart durch Mutation oder von einem eukaryoten oder prokaryoten Organismus abgeleitet ist; oder das ganz oder teilweise durch chemische oder enzymatische Syntheseverfahren hergestellt ist.

6. Pflanzengewebekultur, deren Wachstum bei Niveaus, die normalerweise das Wachstum dieser Gewebekultur hemmen, resistent gegen Hemmung durch ein 2-(2-Imidazolin-2-yl)pyridin- oder -chinolin-Herbizid oder durch ein Sulfonamid-Herbizid ist, in der die Resistenz durch eine veränderte Acetohydroxysäure- Synthase verliehen wird, welche bei Niveaus, die normalerweise die Aktivität einer unveränderten Acetohydroxysäure-Synthase hemmen, gegen Hemmung durch besagtes Herbizid resistent ist.

7. Pflanzengewebekultur nach Anspruch 6, worin die Gewebekultur von einer Dikotyle oder einer Monokotyle abgeleitet ist.

8. Pflanzengewebekultur nach Anspruch 7, worin die Gewebekultur aus einer aus Mais, Reis, Weizen, Gerste, Sorghum, Hafer, Roggen und Hirse bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

9. Pflanzengewebekultur nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin das Herbizid 5-Ethyl-2-(5-isopropyl-5-methyl-4-oxo-2- imidazolin-2-yl)nicotinsäure; 2-(5-Isopropyl-5-methyl-4-oxo-2- imidazolin-2-yl)nicotinsäure; 2-(5-Isopropyl-5-methyl-4-oxo-2- imidazolin-2-yl)3-chinolincarbonsäure; oder 2-Chlor-N-[(4- methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)aminocarbonyl]benzolsulfonamid ist.

10. Pflanzengewebekultur nach einem der Ansprüche 5 bis 9, worin die veränderte Acetohydroxysäure-Synthase durch ein Gen codiert wird, das von der gleichen Pflanzenart durch Mutation oder von einem eukaryoten oder prokaryoten Organismus abgeleitet ist; oder das ganz oder teilweise durch chemische oder enzymatische Syntheseverfahren hergestellt ist.

11. Samen, aus dem eine Pflanze gezogen werden kann, deren Wachstum bei Niveaus, die normalerweise das Wachstum dieser Pflanzenart hemmen, resistent gegen Hemmung durch ein 2-(2- Imidazolin-2-yl)pyridin- oder -chinolin-Herbizid oder durch ein Sulfonamid-Herbizid ist, worin die Resistenz durch eine veränderte Acetohydroxysäure-Synthase verliehen wird, welche bei Niveaus, die normalerweise die Aktivität einer unveränderten Acetohydroxysäure-Synthase hemmen, gegen Hemmung durch besagtes Herbizid resistent ist.

12. Samen nach Anspruch 11, worin der Samen von einer Dikotyle oder ein Monokotyle abgeleitet ist.

13. Samen nach Anspruch 12, worin der Samen aus einer aus Mais, Reis, Weizen, Gerste, Sorghum, Hafer, Roggen und Hirse bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

14. Samen nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das Herbizid 5-Ethyl-2-(5-isopropyl-5-methyl-4-oxo-2-imidazolin- 2-yl)nicotinsäure; 2-(5-Isopropyl-5-methyl-4-oxo-2-imidazolin-2-yl)nicotinsäure; 2-(5-Isopropyl-5-methyl-4-oxo-2- imidazolin-2-yl)3-chinolincarbonsäure; oder 2-Chlor-N-[(4- methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)aminocarbonyl] benzolsulfonamid ist.

15. Samen nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin die veränderte Acetohydroxysäure-Synthase durch ein Gen codiert wird, das von der gleichen Pflanzenart durch Mutation oder von einem eukaryoten oder prokaryoten Organismus abgeleitet ist; oder das ganz oder teilweise durch chemische oder enzymatische Syntheseverfahren hergestellt ist.