JP6694452B2 - トリアゾール誘導体およびｐｄｅ４活性化体としてその使用 - Google Patents

Description

本発明の技術分野
本発明は化学式Ｉまたは化学式ＩＩの化合物に関する。これは、長鎖形体サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ−４（ＰＤＥ４）酵素（long form cyclic nucleotide phosphodiesterase-4 (PDE4) enzymes）（アイソフォーム）の活性化体（activators）である。本発明はこれらの活性化体の治療での使用にも関する。特に、本発明は、環式３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質応答の低減を要求する病気の治療または予防のための方法での使用のためのこれらの活性化体化合物に関する。

発明の背景
環式３’，５’−アデノシン一燐酸「ｃＡＭＰ」は、ほとんどの動物およびヒト細胞中の様々なホルモン、神経伝達物質および他の細胞外の生物学の要因の細胞の影響の形質導入に関係する重大な細胞内の生化学的メッセンジャーである。ｃＡＭＰの細胞内の濃度は、その生産速度と分解速度の間の相対的なバランスによってコントロールされる。ｃＡＭＰはアデニリルシクラーゼ上科（superfamily）の生合成酵素によって生成され、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）上科のメンバーによって分解される。ＰＤＥ上科のあるメンバー（たとえばＰＤＥ４）は、特異的にｃＡＭＰを分解する。一方、他のものは、特異的に環状グアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）を分解するか、またはｃＡＭＰとｃＧＭＰの両方を分解する。ＰＤＥ４酵素はｃＡＭＰを不活性化し、ｃＡＭＰを５’−ＡＭＰに加水分解することにより、その信号を終了する（Lugnier, C. Pharmacol Ther. 109: 366-398, 2006）。

４つのＰＤＥ４遺伝子（ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４ＣおよびＰＤＥ４Ｄ）が識別されている。その各々は代替プロモータおよびｍＲＮＡのスプライシングの使用を通じて多くの異なる酵素アイソフォームをコード化する。それらの一次構造に基づいて、触媒的に活性なＰＤＥ４スプライスバリエントは「長鎖」形式、「短鎖」形式または「超短鎖（super-short）」形式として分類することができる（Houslay, M.D. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 69: 249-315, 2001）。「デッドショート（dead short）」形式もさらに存在する。それは触媒的に活性ではない（Houslay, M.D., Baillie, G.S. and Maurice, D.H. Circ Res. 100: 950-66, 2007）。ＰＤＥ４の長鎖形体は、それらのアイソフォームに特有のＮ末端部分と触媒領域の間に位置する、上流保存領域（upstream conserved regions）１および２（ＵＣＲ１とＵＣＲ２）と呼ばれる２つの調節領域を持っている。ＵＣＲ１領域は短鎖形体には無く、超短鎖形体はＵＣＲ１を欠くだけでなく、トランケートされたＵＣＲ２領域を有する（Houslay, M.D., Schafer, P. and Zhang, K. Drug Discovery Today 10: 1503-1519, 2005）。

短鎖形体ではなくＰＤＥ４長鎖形体は、細胞内の二量体へ関連づけられる（Richter, W and Conti, M. J. Biol. Chem. 277: 40212-40221, 2002; Bolger, G. B. et al., Cell. Signal. 27: 756-769, 2015）。小分子によるＰＤＥ４長鎖形体の提案された陰性のアロステリックな変性が報告された（Burgin A. B. et al., Nat. Biotechnol. 28: 63-70, 2010; Gurney M. E. et al., Handb. Exp. Pharmacol. 204: 167-192, 2011）。ＰＤＥ４長鎖形体が、内因的な細胞メカニズム、たとえば燐酸化（MacKenzie, S. J. et al., Br. J. Pharmacol. 136: 421-433, 2002）およびフォスファチジン酸（Grange et al., J. Biol. Chem. 275: 33379-33387, 2000）によって活性化されることができることが当該技術分野で知られている。その正確なシーケンスがＰＤＥ４Ｄの上流保存領域１の一部を反映する５７のアミノ酸タンパク質（「ＵＣＲ１Ｃ」と呼ばれる；ＵＣＲ１Ｃのシーケンスはアミノ酸８０−１３６を反映し、一方ＵＣＲはアミノ酸１７−１３６である：ナンバリングはＰＤＥ４Ｄ３長鎖アイソフォームに基づいた）の異所的発現によるＰＤＥ４長鎖形体の活性化が最近報告された（Wang, L. et al., Cell. Signal. 27: 908-922, 2015: 「ＵＣＲ１Ｃはホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）の長鎖アイソフォームの新規な活性化体であり、また心筋細胞肥大を減ずる」）。
著者は、心臓肥大を防ぐために、潜在的な治療の戦略としてＰＤＥ４活性化が使用されるかもしれないとの仮説を立てた。

ＰＤＥ４長鎖形体の活性化体として働く小分子は開示されていない。製造と配合の容易さ、薬物動態学の改良された特性をはじめとした多くの理由で小分子活性化体は望ましい。

治療方法、特定の疾患治療または予防方法で使用される、式Ｉまたは式ＩＩのＰＤＥ４の長鎖形体の少なくとも１つの小分子活性化体を提供することが本発明の目的である。

発明の要約
発明の第１の態様では、式１の化合物が提供される：

式中、
Ｒ^１は、Ｈ、（Ｃ１−４）アルキルまたは（Ｃ１−４）アルキルオキシ、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
Ｒ^２およびＲ^６は、独立にＨ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、−ＣＮおよびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立にＨ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^１０およびＲ^１１は、ＨとＦから独立して選ばれる；
Ｒ^９はＨ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５は、独立にＨ、および（Ｃ１−４）アルキルから選択される；
Ｒ^１６およびＲ^１７は、存在する場合にはそれぞれ、Ｈおよび（Ｃ１−４）アルキルから独立して選択される；
あるいはその薬学的に受理可能な塩。

式−１のトリアゾール誘導体化合物は、実施例において、ＰＤＥ４長鎖形体酵素を活性化し、かつ細胞に対する治療上有用な影響を提供することが示される。

１つの実施態様では、本発明は、療法での使用のための式１の化合物を提供する。別の実施態様では、療法は、細胞内ｃＡＭＰ過剰シグナリングにより媒介される疾病または病気の治療または予防である。これらの疾病の中で、環式３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介される二次伝達物質反応の低減は治療上の利点を提供するだろう。さらに、その必要のある患者への式−１の有効な量の化合物を適用するステップを含む、細胞内ｃＡＭＰの過剰シグナリングにより媒介された病気または疾病を治療または予防する方法が提供される。さらに、細胞内ｃＡＭＰの過剰シグナリングにより媒介された病気または疾病を治療または予防するための医薬品の製造における式−１の化合物の使用が提供される。

本発明は、さらに療法で使用される、式−２の化合物を提供する：
式−２

式中、
Ｒ^１は、Ｈ、（Ｃ１−６）アルキルまたは（Ｃ３−７）シクロアルキルであり、該（Ｃ１−６）アルキルおよび（Ｃ３−７）シクロアルキルは任意に、ＯＨ、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、ＣＮおよびハロゲンから選択される１−３の置換基で置換される；
Ｒ^２およびＲ^６は、独立に、Ｈ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、Ｈ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、−ＣＮおよびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^１０およびＲ^１１は、ＨとＦから独立して選ばれる；
Ｒ^９はＨ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５は、独立にＨ、および（Ｃ１−４）アルキルから選択される；
Ｒ^１６およびＲ^１７は、存在する場合にはそれぞれ、Ｈおよび（Ｃ１−４）アルキルから独立して選択される；
あるいはその薬学的に受理可能な塩。

式−２の化合物は、実施例において、ＰＤＥ４長鎖形体酵素を活性化し、かつ細胞に対する治療上有用な影響を提供することが示される。

式−１または式−２の化合物は薬学的に受理可能な補形薬を含む医薬品組成物として提供することができる。先の態様のある実施態様では、甲状腺機能亢進症、ヤンセン骨幹端軟骨異形成症、上皮小体機能亢進症、家族性男性限定性早熟症、脳下垂体の腺腫、クッシング病、腎多嚢胞病、多嚢胞性肝疾患、マックーン−オルブライト症候群、コレラ、百日咳、炭疽菌、結核、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、分類不能型免疫不全（CVID）、黒色腫、膵臓癌、白血病、前立腺癌、副腎皮質の腫瘍、精巣癌、原発性色素性結節状副腎皮質病変(primary pigmented nodular adrenocortical disease:PPNAD)、カ−ニ−複合、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）、常染色体劣性多発性嚢胞腎症（ARPKD）、ヤングタイプ５の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ５）または心臓肥大から選ばれた症状の治療または予防のために本発明の化合物は提供される。

さらなる態様では、本発明は、式１Ａの化合物と式１Ｂの化合物を反応させるステップを含む、式−１の化合物またはその薬学的に受理可能な塩を調製する方法を提供する。
式１Ａ

ここで、Ｒ^１−Ｒ^１５は上記の式１で記載したとおりである。

本発明は、さらに、式１Ｃの化合物と式１Ｄの化合物を反応させるステップを含む、式−１の化合物またはその薬学的に受理可能な塩を調製する方法を提供する。
式１Ｃ

ここで、Ｒ^１−Ｒ^１５は上記の式１で記載したとおりである。

式１Ａおよび１Ｃの中間物も発明によって提供される。

また別の態様では、本発明は、以下のステップを含む長鎖形体ＰＤＥ４酵素を活性化することができる化合物を識別する方法を提供する：
ａ． 候補化合物と長鎖形体ＰＤＥ４酵素とを接触させること；
ｂ． 候補化合物が少なくとも式−１または式−２の化合物と同じレベルへ酵素を活性化するかどうか決定すること。

本発明の方法は実施例における方法のうちの１つによって行なわれることができる。１つの実施態様では、本発明の方法は、候補化合物が短鎖または超短鎖ＰＤＥ４酵素を活性化するかどうか判断する、先行するかまたは引き続くステップをさらに含む。長鎖形体ＰＤＥ４を活性化し、短鎖または超短鎖形体ＰＤＥ４を活性化しない化合物は、長鎖形体ＰＤＥ４に選択的である。ここに例証された化合物の１つ以上は、参照またはコントロールとして使用されることができる。

図１は、例Ａ、Ｂ、ＤおよびＬによる、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４の長鎖形体の活性化を示す； 図２は、例Ａによる、ＰＤＥ４Ａ４、ＰＤＥ４の別の長鎖形体の活性化を示す； 図３は、例Ａによる、ＰＤＥ４Ｂ１、ＰＤＥ４の別の長鎖形体の活性化を示す； 図４は、実験１の方法を使用する例Ａ、Ｂ、ＤおよびＬによって、ＰＤＥ４Ｂ２、ＰＤＥ４の短鎖形体の活性化の欠如を示し、このＰＤＥ４短鎖形体よりもＰＤＥ４長鎖形体の活性化に対する選択性を示す； 図５は、実施例Ａで、１０分でＰＤＥ４長鎖形体活性化体（１０μＭ）で処理され、次いで２分間ホルスコリン（Ｆ）（１０μＭ）で処理された時の、ＨＥＫ２９３細胞中での細胞内のｃＡＭＰレベルの低下を示す； 図６は、実施例Ａ、ＣおよびＤで、１０分でＰＤＥ４長鎖形体活性化体（１０μＭ）で処理され、次いで２分間ホルスコリン（Ｆ）（１０μＭ）で処理された時の、ＭＤＣＫ細胞中での細胞内のｃＡＭＰレベルの低下を示す； 図７は、０日目〜２０日目まで試験化合物の所定濃度を２日ごとに追加して、実験３に述べられた方法を使用して、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体（例Ａ）で処理されたＭＤＣＫ細胞中の生体外の嚢胞形成の抑制を示す； 図８は、実験４に述べられた方法を使用して、１０日目〜２０日目まで試験化合物の所定濃度を２日ごとに追加して、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体（例Ａ）で処理されたＭＤＣＫ細胞中の生体外の嚢胞形成の反転（reversal）を示す； 図９は、実験５に述べられた方法を使用して、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体（例Ａ）がアンドロゲン感受性（ＡＳ）のＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞の増殖を濃度依存的に抑制することを示す（７２時間で標準化された細胞インデックス）； 図１０は、実験５に述べられた方法を使用して、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体（例Ａ）は、濃度依存的にアンドロゲン非感受性（ＡＩ）のＬＮＣａＰのヒト前立腺癌細胞の増殖を抑制することを示す（７２時間の標準化された細胞インデックス）； 図１１は、オスのＣ５７ハツカネズミへのｉ．ｖ．およびｐ．ｏ．投与の後の、定義された時間ポイントでの全血分析によって決定された例Ａのマウスの薬物動態学プロフィールを示す； 図１２は、雄のＳＤラットへのｉ．ｖ．およびｐ．ｏ．投与の後の、定義された時間ポイントでの血漿分析によって決定された例Ａのラットの薬物動態学プロフィールを示す。 図１３は、（Ａ）禁止の濃度依存性、および（Ｂ）例Ａによるヒト患者由来の条件が不動にされた（human patient-derived conditionally immortalised OX161 cell line）ＯＸ１６１細胞株中の生体外の嚢胞形成の濃度依存性の反転を示す。

本発明の詳細な記述
本発明は、ＰＤＥ４酵素の長鎖アイソフォームを活性化することができる、新しい化合物の同定に基づく。化合物は小分子で、したがって、大きな生体分子、たとえばポリペプチド、タンパク質または抗体より簡単で、より安く、製造および調剤できると予想される。例において実証されるように、化合物は化学的に合成することができる。

例は、式−１と式−２の多くの化合物がＰＤＥ４の長鎖アイソフォームを活性化することができることを実証する。例は、本発明の試験されたある化合物について以下を例示する：ＰＤＥ４の短鎖形体を活性化しない。そのためにＰＤＥ４短鎖形体よりもＰＤＥ４長鎖形体を選択的に活性化する。人間と犬の細胞の細胞内のｃＡＭＰレベルを下げる；人間と犬の細胞の生体外の嚢胞形成を阻害し、戻しさえする；人間の前立腺癌細胞の増殖を抑制する；そして、好ましい薬物動態学特性を持っている。したがって、本発明の化合物は驚くほど有用である。

本発明の様々な実施態様は本明細書に記載される。各実施態様中で特定された特徴は、さらに他の特定された特徴と組み合わされて他の実施態様を提供することが認識されるだろう。

化合物 − 式−１
上に述べられたように、第１の態様は式−１の化合物を提供する。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^７とＲ^１１はＨである。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５はＨである。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^９は、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは、１〜３のフルオロで任意に置換される。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５は、Ｈである。また、Ｒ^９は（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは、１〜３のフルオロで任意に置換される。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^１はＨ、メチルまたはメトキシである。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^１はメチルである。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^２およびＲ^６は各々、Ｈとハロゲンから独立して選ばれる。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^２およびＲ^６は各々、Ｈとフルオロから独立して選ばれる。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^２とＲ^６は各々Ｈである。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は各々、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシから独立して選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは、１〜３のフルオロで任意に置換される。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^３およびＲ^５は各々、Ｈ、フルオロ、クロロ、メトキシ、ＣＮ、トリフルオロメチル、メトキシ、およびトリフルオロメトキシから独立して選ばれる。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^４はＨ、フルオロおよびメトキシから選ばれる。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^９はメチル、クロロおよびトリフルオロメトキシから選ばれる。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^９はクロロである。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨである。また、他方はフルオロである。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^８とＲ^１０は両方ともＨである。
式−１の化合物の実施態様では、Ｒ^９はクロロである。Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨであり、他方はフルオロである。

実施態様では、化合物は次のものから選ばれる：
Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−ベンジル−２−［３−（４−クロロフェニル）−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−ベンジル−２−［３−（４−クロロフェニル）−５−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、（Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−｛３−［４−（トリフルオロメトキシ）−フェニル］−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル｝アセトアミド、Ｎ−（３−クロロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−（３−シアノベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル −５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−［３−（トリフルオロメチル）ベンジル］−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−（３−メトキシベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−［３−（トリフルオロメトキシ）ベンジル］−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−（２−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−（４−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、およびそれらの薬学的に受理可能な塩類。

化合物 − 式−２
一層の態様は式−２の化合物を提供する。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^７とＲ^１１はＨである。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５はＨである。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^９は、Ｈ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^７，Ｒ^１１，Ｒ^１２，Ｒ^１３，Ｒ^１４およびＲ^１６はＨであり、Ｒ^９は、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^１はＨ、メチルまたはメトキシである。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^１はメチルである。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^２およびＲ^６は各々、Ｈとハロゲンから独立して選ばれる。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^２およびＲ^６は各々、Ｈとフルオロから独立して選ばれる。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^２とＲ^６は各々Ｈである。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は各々、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、（Ｃ１−４）アルキル、および（Ｃ１−４）アルキルオキシから独立して選ばれ、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^３およびＲ^５は各々独立して、Ｈ、フルオロ、クロロ、メトキシ、ＣＮ、トリフルオロメチル、メトキシ、およびトリフルオロメトキシから選ばれる。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^４はＨ、フルオロおよびメトキシから選ばれる。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^９はメチル、クロロおよびトリフルオロメトキシから選ばれる。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^９はクロロである。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨである。また、他方はフルオロである。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^８とＲ^１０は両方ともＨである。
式−２の化合物の実施態様では、Ｒ^９はクロロである。Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨであり、他方はフルオロである。

式１Ａおよび１Ｃの中間物
上に述べられたように、さらなる態様は式１Ａおよび１Ｃの化合物を提供する。
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^７とＲ^１１はＨである。
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^９は（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^７とＲ^１１はＨである。また、Ｒ^９は（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^１はＨ、メチルまたはメトキシである。
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^１はメチルである。
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^９はメチル、クロロおよびトリフルオロメトキシから選ばれる。
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^９はクロロである。
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨである。また、他方はフルオロである。
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^８とＲ^１０は両方ともＨである。
式１Ａの化合物の実施態様では、Ｒ^９はクロロである。Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨであり、他方はフルオロである。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^７とＲ^１１はＨである。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３はＨである。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^９は、Ｈ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、およびＲ^１３はＨであり、Ｒ^９は、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、−ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^１はＨ、メチルまたはメトキシである。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^１はメチルである。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^９はメチル、クロロおよびトリフルオロメトキシから選ばれる。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^９はクロロである。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨである。また、他方はフルオロである。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^８とＲ^１０は両方ともＨである。
式−１Ｃの化合物の実施態様では、Ｒ^９はクロロである。Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨであり、他方はフルオロである。

定義
ここに使用される時、用語「（Ｃ１−４）アルキル」は、１−４の炭素原子を有する、分岐したか分岐していないアルキル基を意味し、任意に環を含むことができる。（Ｃ１−４）アルキルの例としてはブチル、イソブチル、シクロブチル、第三ブチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、エチルおよびメチルを含んでいる。上記の式中で指定された場合、（Ｃ１−４）アルキルは例えば１〜３のフルオロで置換されてもよい。置換された（Ｃ１−４）アルキルの特に好ましい例はトリフルオロメチルである。あるいは（Ｃ１−４）アルキルは非置換であることができる。

用語「（Ｃ１−４）アルキルオキシ」は−Ｏ−（Ｃ１−４）アルキルを意味する。ここで（Ｃ１−４）アルキルは上に定義される意味を持っている。（Ｃ１−４）アルキルオキシの例としてはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシおよび第三ブトキシを含んでいる。上記の式中で指定された場合、（Ｃ１−４）アルキルオキシは弛緩されることができ、例えば１〜３のフルオロで置換されることができる。置換された（Ｃ１−４）アルキルオキシの特に好ましい例はトリフルオロメトキシである。あるいは（Ｃ１−４）アルキルオキシは非置換であることができる。本発明では、アルキルオキシは「オキシ」部位を介して分子の残りに付加される。用語「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩをいう。ＦおよびＣｌが特に好ましい。式−１又は２の１，２，４−トリアゾール誘導体は、一般に有機化学の技術で既知の方法によって調製されることができる。１，２，４−トリアゾール環の好適な形成方法は、たとえば、Katritzky, A.R.: Comprehensive heterocyclic chemistry (First Edition, Pergamon Press, 1984, see especially Volume 5, Part 4A, Five-membered rings with two or more nitrogen atoms)に述べられている。合成の間に一時的に保護される官能基にふさわしい保護基は、公知であり、たとえばWuts, P.G.M. and Greene, T.W.: Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, Wiley, New York, 2006を参照。

長鎖ＰＤＥ４アイソフォームの活性化
ＰＤＥ４長鎖アイソフォームは２つの調節領域、上流保存領域１（ＵＣＲ１）および上流保存領域２（ＵＣＲ２）を有する。これらは、アイソフォームに特有のＮ末端部分と触媒領域の間にある。ＵＣＲ１領域は短鎖形体においては無い。超短鎖形体はＵＣＲ１を欠くだけでなく、Ｎ末端トランケーテッドＵＣＲ２領域を有する（Houslay, M. D., Schafer, P. and Zhang, K. Drug Discovery Today 10: 1503-1519, 2005）。

４つのＰＤＥ４ファミリー、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４ＣおよびＰＤＥ４Ｄがある。本発明は、これらの４つのファミリーの１以上の長鎖アイソフォームの１つ以上を活性化することができる化合物に関する。したがって、長鎖アイソフォームＰＤＥ４は、長鎖アイソフォームＰＤＥ４Ａ、長鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｂ、長鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｃまたは長鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｄであることができる。疑問の回避のため、長鎖アイソフォームＰＤＥ４はＵＣＲ１領域を含む。典型的には、長鎖アイソフォームＰＤＥ４はヒトである。ＵＣＲ１は、哺乳類種の内に保存される（Houslay, MD, Sullivan, M and Bolger GB Adv Pharmacol. 1998;44:225-34）。したがって、他の実施態様では、長鎖アイソフォームＰＤＥ４はヒト以外の哺乳動物からのものでありえる。

理論によって拘束されるものではないが、本発明の式Ｉまたは式ＩＩのＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ＰＤＥ４長鎖形体に直接結合し、構造変化を引き起こすと考えられる小分子であり、それはこれらの酵素の触媒能力を増加し、安定し、アンカバーし、および／または維持する。薬物学の分野では、およびここに使用されるように、小分子は、生物学的プロセスの調節を行うことができる低分子量有機化合物として定義される。本発明による小分子活性化体は７００ダルトン以下の分子量を有する。これは、細胞膜を横切る急速な拡散を可能とし、かつ細胞内の作用部位に達することを可能にする（Veber, D. F. et al., J. Med. Chem. 45: 2615-2623, 2002）。本発明による小分子活性化体のための好ましい分子量は、２００ダルトン以上から６００ダルトン以下である。本発明による特に好ましい小分子活性化体は、、２５０ダルトン以上および５００ダルトン以下の分子量を有する（Lipinski, C. A. Drug Discovery Today: Technologies 1: 337-341, 2004）。

化合物がＰＤＥ４長鎖形体の活性化体として役立つことができるかどうかを検知する適切な１つの方法は、実験１に述べられたツーステップ・ラジオ分析手続きを使用している。要約すると、方法はテスト小分子活性化体とＰＤＥ４長鎖形体を、［^３Ｈ］のラベルが付けられたｃＡＭＰとインキュベートすることを含み、５’−アデノシン一燐酸（５’−ＡＭＰ）生成物へのｃＡＭＰのブレークダウンの変化を評価する。そのようなインキュベーションからの反応混合物のサンプルは、蛇毒５’ヌクレオチダーゼで続いて処理され、ヌクレオチド［^３Ｈ］ラベルが付けられた５’−ＡＭＰの荷電していないヌクレオシド［^３Ｈ］ラベルが付けられたアデノシンへの変換を許容し、それはＰＤＥ４活性および試験化合物の影響を評価するために分離され定量することができる（Thompson, W. J. and Appleman, M. M. Biochemistry 10: 311-316, 1971、次のものに述べられているようないくつかの修正をした、Marchmont, R. J. and Houslay, M. D. Biochem J. 187: 381-92, 1980）。

上記の分析手続きを使用して、実験１に詳細に述べられているように、本発明の好ましい小分子活性化体は、１００マイクロモル以下の試験化合物濃度で、５０％以上の１つ以上のＰＤＥ４長鎖形体のバックグラウンド・アクティビティの増加を発生する。本発明による特に好ましい小分子活性化体は、１０マイクロモル以下、たとえば３マイクロモルの試験化合物濃度で、５０％以上の１つ以上のＰＤＥ４長鎖形体のバックグラウンド・アクティビティの増加を発生する。

本発明の化合物は、ＰＤＥ４酵素の長鎖形体に選択的であり、ＰＤＥ４酵素の短鎖アイソフォームまたは超短鎖アイソフォームの活性化体として作用しないか、またはより少ない程度にしか働かない。したがって、短鎖または超短鎖アイソフォームＰＤＥ４は、短鎖または超短鎖アイソフォームＰＤＥ４Ａ、短鎖または超短鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｂ、短鎖または超短鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｃ、または短鎖または超短鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｄであることができる。疑問の回避のために、ＰＤＥ４の短鎖および超短鎖アイソフォームはＵＣＲ１領域を欠く。超短鎖アイソフォームはトランケートされたＵＣＲ２領域を含む。典型的には、短鎖または超短鎖アイソフォームＰＤＥ４は、ヒトのものであるが、他の哺乳類種からのものであることができる（ＵＣＲ２が保存される場合、Houslay, MD, Sullivan, M and Bolger GB Adv Pharmacol. 1998;44:225-34を参照）。

同じ分析条件の下で、実験１に述べられているように、本発明の小分子活性化体は、典型的には１００マイクロモル以下の試験化合物濃度でＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４ＣまたはＰＤＥ４Ｄ酵素の短鎖または超短鎖形体のバックグラウンド・アクティビティの５０％未満の増加を生成する。

たがって、典型的な化合物は、ＰＤＥ４の短鎖形体（あるいは超短鎖形体）の活性化のための分析における否定的な結果と、ＰＤＥ４の長鎖形体の活性化のための分析における肯定的な結果を提供する。１つの実施態様では、化合物は長鎖アイソフォームＰＤＥ４Ａを活性化し、短鎖および超短鎖アイソフォームＰＤＥ４Ａのどちらも活性化しない。別の実施態様では、化合物は長鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｂを活性化し、短鎖および超短鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｂのどちらも活性化しない。一層の実施態様では、化合物は長鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｃを活性化し、短鎖および超短鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｃのどちらも活性化しない。別の実施態様では、化合物は長鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｄを活性化し、短鎖および超短鎖アイソフォームＰＤＥ４Ｄのどちらも活性化しない。

ＰＤＥ４長鎖アイソフォームは、ＰＤＥ４Ａ４、ＰＤＥ４Ａ４／５、ＰＤＥ４Ａ５、ＰＤＥ４Ａ８、ＰＤＥ４Ａ１０、ＰＤＥ４Ａ１１、ＰＤＥ４Ｂ１、ＰＤＥ４Ｂ３、ＰＤＥ４Ｂ４、ＰＤＥ４Ｃ１、ＰＤＥ４Ｃ２、ＰＤＥ４Ｃ３、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ７、ＰＤＥ４Ｄ８、ＰＤＥ４Ｄ９およびＰＤＥ４Ｄ１１を含む。さらに長鎖アイソフォームは、４つのＰＤＥ４サブファミリーのいずれとも異なる命名法によって既に識別されているか、または呼ばれることができる。

ＰＤＥ４短鎖アイソフォームはＰＤＥ４Ａ１、ＰＤＥ４Ｂ２、ＰＤＥ４Ｄ１およびＰＤＥ４Ｄ２を含んでいる。さらに短鎖アイソフォームは、４つのＰＤＥ４サブファミリーのいずれとも異なる命名法によって既に識別されているか、または呼ばれることができる。

ＰＤＥ４超短鎖アイソフォームはＰＤＥ４Ｂ５、ＰＤＥ４Ｄ６およびＰＤＥ４Ｄ１０を含んでいる。超短鎖アイソフォームは、４つのＰＤＥ４サブファミリーのずれとも異なる命名法によって既に識別されているか、または呼ばれることができる。

下記の例は、ヒトＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ａ４およびＰＤＥ４Ｂ１長鎖アイソフォームの化合物の活性およびヒトＰＤＥ４Ｂ２短鎖アイソフォームの活性の欠如を例証する。これらのアイソフォームの詳細、およびＧｅｎＢａｎｋアクセションナンバーを含む多くの他の既知のアイソフォームの数値は、以下の表Ａ−Ｄに提供される。
表Ａ −既知のＰＤＥ４Ａアイソフォームの例

Ｌ＝長鎖；
Ｓ＝短鎖；
ＳＳ＝超短鎖；
Ｄ＝デッドショート
＊ ＰＤＥ４Ａ４Ｂクローンは正確であり、ＰＤＥ４Ａ４Ａはクローニングアーチファクト（artefact）を有し、また、ＰＤＥ４Ａ４Ｃはトランケーションアーチファクトを有することに注意。
＊＊この種は、Ｃ−およびＮ−末端トランケートされた。したがって、活性型をすべて検知するパンＰＤＥ４Ａ（pan PDE4A）抗血清によって検知されないだろう。

表Ｂ − 既知のＰＤＥ４Ｂアイソフォームの例

表Ｃ − 既知のＰＤＥ４Ｃアイソフォームの例

表Ｄ − 既知のＰＤＥ４Ｄアイソフォームの例

Ｌ＝長鎖；
Ｓ＝短鎖；
ＳＳ＝超短鎖；
Ｄ＝デッドショート
＊ ｎｂ Ｄ８は文献では元々ＰＤＥ４Ｄ６と呼ばれた。
（ｍ） メモリ・クローンはＡＹ２４５８６７、ＡＦ５３６９７７、ＡＦ５３６９７６である。

ｃＡＭＰの低減
理論によって拘束されるものではないが、本発明の化合物は１つ以上の細胞内区画でのｃＡＭＰレベルを下げることにより機能することができる。本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、このようにしてｃＡＭＰに依存するある細胞プロセスを調節する手段を提供することができる。過剰な細胞内ｃＡＭＰシグナリングは多くの疾病および不調を媒介する。したがって、本発明の化合物は、異常に高いｃＡＭＰレベル、増加したｃＡＭＰ−媒介シグナリングおよび／または低減したｃＡＭＰ消失、酵素または他のもの（例えば流出）に関連した疾病の治療に有用であると予想される。その治療は典型的に人間にされるが、非ヒト動物（たとえば人類以外の哺乳動物）への治療（例えば獣医学的治療）であることができる。

１つの態様では、本発明は、式−１または式−２のＰＤＥ４長鎖形体の小分子活性化体を提供し、これは環式の３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介される二次伝達物質応答の低減が必要とされる病気の治療または予防のための方法に有用である。

例えば、アデニリルシクラーゼ（たとえばＧＰＣＲｓとＧｓα）の上流のｃＡＭＰシグナリングの駆動に関与するタンパク質中の機能獲得型の遺伝子突然変異は、病理学的結果を備えた異常な過度のｃＡＭＰ活性に結びつく場合がある（Lania A, Mantovani G, Spada A. Ann Endocrinol (Paris). 73: 73-75, 2012.; Thompson, M. D. et al., Methods Mol. Biol. 448: 109-137, 2008; Weinstein LS, Liu J, Sakamoto A, Xie T, Chen M. Endocrinology. 145: 5459-5464, 2004; Lania A, Mantovani G, Spada A. Eur J Endocrinol. 145: 543-559, 2001。したがって、ｃＡＭＰアクションの終了を加速する能力を所有する本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、以下に詳述されるような望ましくない高いｃＡＭＰレベルまたは活性により特徴づけられる疾病の治療、予防または部分的なコントロールに有効であると予想される。

高いｃＡＭＰレベルが特徴の疾病
甲状腺機能亢進症（Hyperthyroidism）
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レセプター（ＴＳＨＲ）の刺激は、アデニリルシクラーゼのＧｓα−媒介による活性化を含む、ｃＡＭＰ依存シグナリング機構によって、甲状腺ホルモン、チロキシンおよびトリヨードサイロニンの増加した生成および放出に結びつく。ＴＳＨＲの中の機能獲得型突然変異が甲状腺機能亢進症の進行に関係することが報告された（Duprez, L. et al., Nat. Genet. 7: 396-401, 1994; Biebermann, H. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86: 4429-4433, 2001; Karges, B. et al., J. Endocrinol. 186: 377-385, 2005)。ＴＳＨＲとＧｓαの両方の突然変異の活性化も、甲状腺腫（goitre）および甲状腺腺腫（thyroid adenomas）で見つかった（Arturi, F. et al., Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 106: 234-236, 1998）。甲状腺腫中の増加したｃＡＭＰ活性は、ＴＳＨＲまたはＧｓα突然変異の活性化の結果であり、ｃＡＭＰレベルおよび信号伝達での異常上昇を打ち消すＰＤＥ４活性の保護適応性の増加を生産すると報告された（Persani, L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 85: 2872-2878, 2000）。

甲状腺機能亢進症の最も一般的な原因は、ＴＳＨＲでＴＳＨアクションを模倣する自己免疫疾患であるグレーブス病であり、甲状腺濾胞細胞の中の過度のｃＡＭＰ活性を導き、甲状腺機能亢進症の状態となる。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、甲状腺機能亢進症の治療、予防または部分的なコントロールに有効であると予想される。１つの実施態様では、甲状腺機能亢進症はグレーブス病に関係している。

ヤンセン骨幹端軟骨異形成症（Jansens’s Metaphyseal Chondrodysplasia）および上皮小体機能亢進症（Hyperparathyroidism）
ヤンセン骨幹端軟骨異形成症（ＪＭＣ）は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レセプター１（ＰＴＨＲ１）の機能獲得型突然変異に起因する非常にまれな病である（Thompson, M. D. et al., Methods Mol. Biol. 448: 109-137, 2008）。エフェクターとしてのアデニリルシクラーゼと組合わされたＰＴＨＲ１の構成活性化は、主として骨と腎臓の中での過度のｃＡＭＰシグナリングに関係し、高カルシウム血症および低リン酸血症により特徴付けられるイオン・ホメオスタシスの調節異常（Calvi, L.M. and Schipani, E. J. Endocrinol. Invest. 23: 545-554, 2000）、および発育（例えば低身長）、および物理的異常（例えば出目）を導く。

原発性上皮小体機能亢進症は組織拡大または非癌の腺腫による上皮小体からのＰＴＨの過度の放出に起因する。結果としてのＰＴＨＲ１レセプターの過度の刺激は、高カルシウム血症と低リン酸血症を示す患者からの、血漿イオン・ホメオスタシスの崩壊を引き起こす。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ＪＭＣと上皮小体機能亢進症の治療、予防または部分的なコントロールに有効であると予想される。

家族性男性性早熟症（精巣中毒症）（Familial Male Precocious Puberty (Testotoxicosis)）
家族性性早熟症（ＦＭＰＰ）は、家族性の性的早熟または性腺刺激ホルモン独立の精巣中毒症として知られており、少年が幼児期の性早熟症の徴候を一般に示す疾患である。少年の脊柱の長さは、骨端の成熟の迅速な進捗により短いことがある。ＦＭＰＰは、ライジッヒ細胞過形成および低い精細胞カウント（Latronico, A.C. et al., J Clin. Endocrinol. Metab. 80: 2490-2494, 1995; Kosugi, S. et al., Hum. Mol. Genet. 4: 183-188, 1995）に関連して、黄体形成ホルモン（ＬＨ）レセプター中の本質的に活性化する突然変異を備えた常染色体優性症状である。それは増加したｃＡＭＰ生産に結びつく。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ＦＭＰＰの治療、予防または部分的なコントロールに有効であると予想される。

脳下垂体腺腫およびクッシング病
脳下垂体の非癌性の腫瘍は集合的に脳下垂体の腺腫と呼ばれ、下垂体前葉の（adenohypophyseal）ホルモン（例えば成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモン）の分泌過多に結びつくことがある。それはＧＰＣＲとＧｓの組み合わせおよびｃＡＭＰ生成を介してそれらの作用を及ぼす。したがって、脳下垂体の腺腫は、多くのホルモン障害、たとえば先端巨大症（acromegly）（主として成長ホルモン過剰分泌による）、クッシング病（副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）および引き続く高コルチゾール血症（hypercortisolemia）、および／または一般的な下垂体機能亢進症（多数の下垂体前葉ホルモンの超過放出に関係する）を促進することができる様々な内分泌細胞内での高められたｃＡＭＰ媒体シグナリングの状態に導くことがある。脳下垂体の腺腫に対する現在の治療オプションは、ドーパミン受容体アゴニストでの治療を含んでいる。それは細胞内のｃＡＭＰレベルの低下を含む機構によって腫瘍サイズを減少させ、脳下垂体ホルモンの生成を低減する。本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、それらの標的組織（たとえば副腎）中の脳下垂体ホルモンの病理学的影響を減ずると予想される。

クッシング病では、脳下垂体腺腫はＡＣＴＨの生産過剰と関連づけられ、メラノコルチン２レセプター（ＭＣ２）の過剰活性、ステロイド合成のｃＡＭＰ媒介の刺激および副腎皮質からのコルチゾールの放出を介する高コルチゾール血症（hypercortisolemia）に結びつくことがある（Tritos, N. A. and Biller, B. M. Discov. Med. 13: 171-179, 2012）。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は。クッシング病の治療、予防または部分的なコントロールに有効であると予想される。

腎多嚢胞病
腎多嚢胞病（ＰＫＤ）は、病理学的には包嚢の発現が特徴である腎臓の遺伝病である。これは腎の構造の損傷および腎臓機能の低下をもたらす（Takiar, V. and Caplan, M. J. Biochim. Biophys. Acta. 1812: 1337-1343, 2011; Masoumi, A. et al., Drugs 67: 2495-2510, 2007）。２つのタイプのＰＫＤがある：常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）および常染色体劣性多発性嚢胞腎症（ＡＲＰＫＤ）である。ＡＤＰＫＤは、世界中の個体群の０．１％および０．２％の間に影響し、漸進的な包嚢発現および拡大した腎臓が特徴である。この疾病を持った人々のおよそ５０％は通常４０〜７０歳の間で、末期腎疾患にかかり、透析または腎臓移植を必要とするだろう。ＡＲＰＫＤは１：２０，０００の新生児に影響し、誕生の後の最初の数週に典型的に識別される。肺形成不全はＡＲＰＫＤを持った新生児の中の３０−５０％の死亡率に帰着する。

２つの遺伝子の欠損がＡＤＰＫＤの原因と思われる。患者の約８５％で、ＡＤＰＫＤの発現は、遺伝子ＰＫＤ１、エンコーディングポリシスチン−１（ＰＣ−１）の中の突然変異にリンクすることができる；ＰＫＤ２の中の患者突然変異の約１５％で、エンコーデングポリシスチン−２（ＰＣ−２）が関係する。サイクリックＡＭＰは、多発性嚢胞腎細胞の増殖および包嚢エクスパンジョンの重要な刺激であるが、正常ヒト腎臓細胞ではそうではないと確認された（Yamaguchi, T. et al., Kidney Int. 57: 1460-1471, 2000）。証拠の重要なものは、腎シストジェネシス（renal cystogenesis）の重要なファシリテーターとしてｃＡＭＰが関係することを示した（Masoumi, A. et al., Drugs 67: 2495-2510, 2007; Wallace, D. P. Biochim. Biophys. Acta. 1812: 1291-1300, 2011）。嚢胞形成におけるｃＡＭＰの役割と一致して、ｃＡＭＰレベルを低下させる薬剤（例えばバソプレッシンＶ２受容体拮抗薬およびソマトスタチン・レセプター・アゴニスト・オクトレオチド）は、ＰＫＤのげっ歯動物モデル中で効能を示した（Torres, V. E. et al., Nat. Med. 10: 363-364, 2004; Gattone, V. H. 2^nd et al., Nat. Med. 9: 1323-1326, 2003; Belibi, F. A. and Edelstein, C. L. Expert Opin. Investig. Drugs. 19: 315-328, 2010）。ゼブラフィッシュ胎児では、ｃＡＭＰ加水分解ＰＤＥ酵素亜型（ＰＤＥ１Ａ）の消耗は、嚢胞性の表現型の発現に帰着した。その一方でＰＤＥ１Ａ過剰発現は、ＰＣ２消耗に起因する嚢胞性の表現型を部分的に救った（Sussman, C. R., Ward, C. J., Leightner, A. C., Smith, J. L., Agarwal, R., Harris, P. C., Torres, V. E. J. Am. Soc. Nephrol. 25: 2222-2230, 2014）。ホスホジエステラーゼ活性化は、ＰＫＤ治療用の戦略として示唆された（Sun, Y., Zhou, H. and Yang, B-X. Acta Pharmacologica Sinica 32: 805-816, 2011）。

したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、腎多嚢胞病の治療、予防または部分的なコントロールに有効であると予想される。

例、特に図７および８では、試験化合物の所定濃度を０日目から２０日目までの２日ごとに追加した実験３、および試験化合物の所定濃度を１０日目から２０日目までの２日ごとに追加した実験４に述べられた方法を使用して、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体（例Ａ）で処理された犬ＭＤＣＫ細胞の中での生体外の嚢胞形成の抑制および反転を示す。

例、特に図１３では、試験化合物の所定濃度を０日目から１０日目までの２日ごとに追加した実験９、および試験化合物の所定濃度を１０日目から２０日目までの２日ごとに追加した実験１０に述べられた方法を使用して、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体（例Ａ）で処理されたヒトＯＸ１６１細胞の中で生体外での嚢胞形成の抑制および反転を示す。これは、本発明の化合物がｃＡＭＰによって媒介された疾病と病気を治療することができるという論理的根拠の実験的確認を提供する。

多嚢胞性肝疾患
多嚢胞性肝疾患（ＰＬＤ）は、肝臓のシストジェネシス（cystogenesis）（包嚢の数が２０を超過する場合と通常定義される）に関連したまれな遺伝性の症状である。それは、しばしばＡＤＰＫＤとともに起こる（Strazzabosco, M. and Somlo, S. Gastroenterology 140: 1855-1859, 2011; Gevers, T. J. and Drenth, J. P. Curr. Opin. Gastroenterol. 27: 294-300, 2010）。ＡＤＰＫＤと比較された時、小胞体と繊毛に関連した、変異されたタンパク質によって駆動される、ＰＬＤには異なる遺伝病理学があるかもしれない。増加した胆管細胞増殖、血管新生および高い流動分泌物はｃＡＭＰを媒介としたシグナリングを含む多数の信号伝達経路の調節異常を介して肝嚢腫形成を駆動するように作用する。肝臓のｃＡＭＰレベルの上昇は、胆汁の上皮細胞および胆管細胞増殖の増加におけるｃＡＭＰ依存性の塩化物および流動分泌物を刺激する（Janssen, M. J. et al., J. Hepatol. 52: 432-440, 2010）。ソマトスタチン（それはＧｉ−カップルド機構を介してｃＡＭＰレベルを低下する）は胆管細胞増殖および流動分泌物を減らす（Gong, A.Y. et al., Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 284: C1205-1214, 2003）。更に、合成ソマトスタチン・アナログ、オクトレオチドは、ｃＡＭＰ信号の低減を含む機構によってＰＬＤの動物モデルの中で効果を示した（Masyuk, T.V. et al., Gastroenterology 132: 1104-1116, 2007）。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ｃＡＭＰに少なくとも一部分起因する多嚢胞性肝疾患の治療、予防または部分的なコントロールに有効かもしれない。

ヤングタイプ５（ＭＯＤＹ５）
ＭＯＤＹ５は、腎嚢胞に関連したインスリン非依存性糖尿病の形式である。それは、肝細胞核因子−１β（ＨＮＦ−１β）をコーディングする遺伝子の突然変異によって引き起こされた常染色体優性疾患である。ＭＯＤＹ５によって影響を受けた患者の優勢な臨床像は、糖尿病の発症の前に頻繁に診断される腎機能障害である。何人かの患者では、ＨＮＦ−１β突然変異は、追加の表現型の特徴（たとえば膵萎縮、異常肝機能および生殖路異常）に帰着する場合がある。ハツカネズミでの研究は、ウロモデュリン（uromodulin:UMOD）およびＰＫＤ１遺伝子に対する影響に加えて、ＨＮＦ−１βの突然変異に関連した腎嚢胞形成を起こす機構がＰＫＤ２の転写活性化の重大な欠損を含んでいることを示唆する。ＰＫＤ１とＰＫＤ２のダウンレギュレーションは、腎嚢胞のｃＡＭＰで駆動される形成に関係している（Mancusi, S. et al., J. Nephrol. 26: 207-12, 2013）。ＨＮＦ−１βは、ＰＤＥ４Ｃプロモータに結合し、ＰＤＥ４Ｃの発現を規制する（Ma et al., PNAS 104: 20386, 2007）。

したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ＭＯＤＹ５の症状の治療、予防または部分的なコントロールに有効であると予想される。

心臓肥大、心不全、および不整脈
局所的な調節とｃＡＭＰ信号の一体化は、適切な心臓機能にとって重要であり、この信号の動揺は心不全に結びつく場合がある。慢性のβ−アドレナリン受容体刺激の際、心筋細胞の肥大は、高いｃＡＭＰと、ＰＫＡおよびＥｐａｃを含むその下流のエフェクターの活性化によって引き起こされる（Wang, L. et al., Cell. Signal. 27: 908-922, 2015およびその参照文献）。心筋細胞肥大は、心不全と不整脈の危険を増加させる。

したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、心臓肥大（心不全および／または不整脈）の治療、予防または部分的なコントロールに有効かもしれない。

増加したｃＡＭＰを媒介としたシグナリングに関連した疾病
Ｇタンパク質のアルファ・サブユニット（ＧＮＡＳ１）の活性化突然変異に関連した疾患
Ｇタンパク質Ｇｓはアデニリルシクラーゼ活性を刺激し、細胞内のｃＡＭＰレベルを増加させることによりそれらの生物学的作用を働かせるＧＰＣＲｓのためのトランスデューサーとして作用する。Ｇｓは、α、βおよびγサブユニットからなるヘテロ三量体のタンパク質である。αサブユニットのための、遺伝子、ＧＮＡＳ１の突然変異を活性化することは、様々な組織での異常なｃＡＭＰシグナリングを導き、一連の疾患を生じさせることが認識されている。

マックーン−オルブライト症候群
マックーン−オルブライト症候群（ＭＡＳ）は、３つの主要な特徴の、性早熟症、線維性骨形成異常およびカフェオレ病変により典型的に特徴づけられるまれな遺伝病である。ＭＡＳのための根本的な分子病理学は、ＧＮＡＳ１遺伝子の活性化突然変異を含んでいる（Diaz, A. Danon, M. and Crawford, J. J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 20: 853-880, 2007）したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、マックーン−オルブライト症候群を含むＧＮＡＳ１の、活性化突然変異に関連した病気の治療、予防または部分的なコントロールに有効であると予想される。

感染症中のアデニリルシクラーゼ活性の毒素により引き起こされた増加の改善
アデニリルシクラーゼ（ｃＡＭＰの生産の原因である酵素）は、多くの細菌毒素の影響の媒介に関係すると思われたるキーとなる生物学的目標である（Ahuja et al., Critical Reviews in Microbiology, 30: 187-196, 2004）。これらの毒素は、宿主免疫細胞および／または病原体に関連するアデニリルシクラーゼ活性の増強を通じてｃＡＭＰレベルを上げることにより、それらの効果を生む。したがって、ｃＡＭＰレベルを下げることによって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体が高いｃＡＭＰ活性に関係している感染症の症状の治療または部分的なコントロールに有用であると予想される。下記はそのような感染症のいくつかの例である：

コレラ
コレラ菌はコレラ毒素を産出する。それはＧｓのαサブユニットのアデノシン二燐酸リボシル化によって宿主細胞アデニリルシクラーゼ活性化およびｃＡＭＰ生産に結びつく。コレラ毒素によって引き起こされた下痢は、胃腸管の細胞の過度のｃＡＭＰ蓄積の結果であると考えられる。

百日咳
百日咳菌は小児疾患百日咳の原因である病原体である。百日咳菌毒素は、Ｇｉのαサブユニットのアデノシン二燐酸リボシル化を刺激し、間接的に標的細胞のｃＡＭＰレベルを増大する。バクテリアはさらに侵襲性のアデニリルシクラーゼを分泌する。それは有毒のｃＡＭＰレベルを生産し、宿主の免疫の防御を損う。

炭疽菌病
炭疽菌病は炭疽菌によって引き起こされる。それは一義的には家畜病であるが、接触により人間に感染する。炭疽病の感染は広範囲の浮腫を伴う。その発現は浮腫毒素によって駆動されると思われる。後者はアデニリルシクラーゼで、宿主カルモデュリンによって活性化され、宿主免疫細胞上に毒作用を起こす異常に高いレベルのｃＡＭＰを生産する。

結核
マイコバクテリウム結核は、アデニリルシクラーゼを多量に多数の領域で発現する。それは疾病病理学の毒性および生成に役割を果たすことができる。あるアデニリルシクラーゼ亜型（ＲＶ０３８６）が、宿主マクロファージに入り、かつ細胞内のｃＡＭＰを上げ毒性を引き起こすことが実証された（Agarwal et al., Nature, 460: 98-102, 2009）。

したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、感染症（コレラ、百日咳、炭疽菌および結核）の治療、予防または部分的なコントロールに有効である。

高いｃＡＭＰによるＰＫＡの活性化に依存する疾病
真核生物では、ｃＡＭＰはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化する。それはｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼとしても知られている。ＰＫＡは、四量体のホロ酵素として通常不活発であり、２つの触媒ユニットおよび２つの調節ユニットからなり、調節ユニットは触媒ユニットの触媒センターをブロックする。ｃＡＭＰはＰＫＡの調節ユニット上の特定位置に結合し、調節ユニットと触媒ユニット間の解離を引き起こし、それにより、触媒ユニットを活性化する。活性な触媒ユニットは、ＡＴＰからタンパク質基体の特定の残基までのリン酸塩のトランスファーに触媒作用を及ぼす。それは、それらのタンパク質基体の機能を調節することができる。

ＰＤＥ４長鎖形体活性化はｃＡＭＰレベルを下げる。また、ＰＫＡのｃＡＭＰ媒介の活性化を低減する。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ＰＫＡの阻害剤が治療効果の証拠を示す病気の治療または部分的なコントロールで有用であると予想されるだろう。

ｃＡＭＰによるＰＫＡの活性化に依存する疾患は、ＰＫＡ阻害剤（たとえばＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ）に対するそれらの反応によって識別されてもよい。Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳは、その解離と活性化を防ぐ、ＰＫＡのｃＡＭＰ結合部位を占めるｃＡＭＰのアナログである。

ＨＩＶ感染とＡＩＤＳ
ＨＩＶ感染者からのＴ細胞は、増加したレベルのｃＡＭＰを有し、正常なＴ細胞よりもＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳによる阻害に、より敏感である。ｃＡＭＰによるＰＫＡの過度の活性化は、ＨＩＶ感染での漸進的なＴ細胞機能不全に関係している（Aandahl, E. M. et al., FASEB J. 12: 855-862, 1998）。更に、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳの生体内の適用は、レトロウイルスに感染したハツカネズミのＴ細胞応答をリストアすると示された（Nayjib, B. et al., The Open Immunology Journal, 1: 20-24, 2008）。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ＨＩＶ感染とＡＩＤＳの治療、予防または部分的なコントロールに有用であると予想される。

分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）
Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳの生体外の適用は、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）の患者からのＴ細胞によるサイトカインＩＬ−１０の害された分泌を修正することが示された（Holm, A. M. et al., J. Immunol. 170: 5772-5777, 2003）。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ＣＶＩＤの治療、予防または部分的なコントロールに有用であると予想される。

高いｃＡＭＰによる、Ｅｐａｃ１およびＥｐａｃ２のどちらかまたは両方の活性化に依存する疾病
ＰＫＡに加えて、ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ（Ｅｐａｃ）によって直接活性化された交換タンパク質として知られている別の細胞内レセプターを活性化する。Ｅｐａｃには、Ｅｐａｃ１およびＥｐａｃ２の２つのアイソフォームがあり、両方とも、ｃＡＭＰに結合する調節領域、および小さなＧタンパク質、ＲａｓファミリーのＲａｐ１およびＲａｐ２のＧＴＰのためのＧＤＰの交換を促進する触媒領域からなる。さらに、Ｅｐａｃタンパク質は特定のセルの座で多くの他のセルのパートナーとの相互作用によってそれらの機能を働かせる。Ｅｐａｃシグナリングの病態生理学の変化は広範囲の疾病に関係している（ＢBreckler, M. et al., Cell. Signal. 23: 1257-1266, 2011）。

ｃＡＭＰによるＥｐａｃタンパク質の活性化に依存する疾患は、Ｅｐａｃ阻害剤に対するそれらの反応によって識別された。たとえばＥＳＩ−０９は、新規な非環状ヌクレオチドＥｐａｃ１およびＥｐａｃ２アンタゴニストであり、特異的に細胞内のＥｐａｃを媒介としたＲａｐ１活性化およびＡｋｔ燐酸化をブロックでき、同様に、膵臓のβ細胞中のＥｐａｃを媒介としたインシュリン分泌をブロックできる（Almahariq, M. et al., Mol. Pharmacol. 83: 122-128, 2013）。

黒色腫
Ｅｐａｃ１は、黒色腫中の移動および転移の促進に関係する（Baljinnyam, E. et al., Pigment Cell Melanoma Res. 24: 680-687, 2011、およびそこに引用された文献）。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、黒色腫の治療、予防または部分的なコントロールで有用であると予想される。

膵臓癌
正常な膵臓または周囲の組織と比較して、Ｅｐａｃ１が人間の膵癌細胞中で著しく増大することが最近示された（Lorenz, R. et al., Pancreas 37: 102-103, 2008）膵臓癌は、他のタイプの癌に通常有効な治療に対してしばしば抵抗性がある。Ｅｐａｃ阻害剤ＥＳＩ−０９を使用して、膵癌細胞移動侵入におけるＥｐａｃ１過剰発現の機能的な役割実証された（Almahariq, M. et al., Mol. Pharmacol. 83: 122-128, 2013）。これらの結果はＲＮＡｉを沈黙させる技術に基づいた結果と一致していて、Ｅｐａｃ１シグナリングの抑制が膵臓癌用の有効な治療の戦略かもしれないことを示唆する。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、膵臓癌の治療、予防または部分的なコントロールで有用であると予想される。

高いｃＡＭＰによるｃＡＭＰ−ゲート制御されたイオンチャネル（cAMP-gated ion channels）の変調に依存する疾病
ＰＫＡとＥｐａｃの活性化に加えて、高いｃＡＭＰのための別のエフェクター経路はｃＡＭＰ−ゲート制御されたイオンチャネルの活性化である。したがって、ｃＡＭＰ−ゲート制御されたイオンチャネルの阻害剤が治療効果の証拠を示す疾病の治療において、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体が有用であると予想されるだろう。

ｃＡＭＰ応答配列結合たんぱく質の活動亢進に関連した疾病
ｃＡＭＰ応答配列結合たんぱく質（ＣＲＥＢ）は、様々な細胞機能、たとえば細胞増殖、分化、生存およびアポトーシスの調節に含まれる重要な転写因子である（Cho et al., Crit Rev Oncog, 16: 37-46, 2011）。ＣＲＥＢ活性は、一連の細胞外のシグナル、たとえばストレス、成長因子および神経伝達物質の範囲を介するキナーゼ依存性燐酸化によって調節される。燐酸化はＣＲＥＢの二量体化を導き、および他の補活性化因子パートナー蛋白質（co-activator partner proteins）と一緒に、ｃＡＭＰ反応配列（ＣＲＥ部位）を含む標的遺伝子のプロモーター領域に結合することを可能にし、転写活性を開始する。ｃＡＭＰ経路（例えばｃＡＭＰ依存性蛋白質燐酸化酵素を媒介とした燐酸化を介する）は、ＣＲＥＢを媒介とした生物活性の重要なポジティブモジュレーターである。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、高いＣＲＥＢ活性に関連した病気の治療、予防または部分的なコントロールで有用であると予想される。

白血病
急性のリンパ患者および骨髄性白血病患者からの骨髄細胞は、ＣＲＥＢタンパク質およびｍＲＮＡを過剰発現することが報告された（Crans-Vargas et al., Blood, 99: 2617-9, 2002; Cho et al., Crit Rev Oncog, 16: 37-46, 2011）。更に、増加したＣＲＥＢレベルは、急性骨髄性白血病の被験者の中の不良な臨床反応と関連する（Crans-Vargas et al., Blood, 99: 2617-9, 2002; Shankar et al., Cancer Cell, 7:351-62, 2005）。ダウンレギュレーションが骨髄性細胞増殖および生存を抑制する一方、ＣＲＥＢのアップレギュレーションは、人間の白血病細胞増殖の刺激に関係している。本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、ＣＲＥＢのｃＡＭＰを媒介とした刺激の減衰によってＣＲＥＢ活性および機能を低減すると予想され、したがって、急性リンパ・骨髄性白血病の治療、予防または部分的なコントロールに有用性を持つと予想される。

前立腺癌
それが上皮内の新形成の発現を刺激するので、異常な過度のアンドロゲン活性は前立腺癌の進行において重要なドライバーである（Merkle et al., Cellular Signalling, 23: 507-515, 2011）。前立腺癌の治療において、化学または去勢手術に関するアンドロゲン・アブレーション・アプローチの使用によりこれは強く支持される。ホルスコリンのようなサイクリックＡＭＰを増加する薬剤は、ＣＲＥＢとの燐酸化および／または相互作用によるアンドロゲンレセプター活性化を含む多数の細胞内の機構によってアンドロゲンレセプター活性を高めることができる。Ｅｐａｃ１活性化も、前立腺癌中の細胞増殖の促進に関わる（Misra, U. K. and Pizzo, S. V. J. Cell. Biochem. 108: 998-1011, 2009; Misra, U. K. and Pizzo, S. V. J. Cell. Biochem. 113: 1488-1500, 2012）。したがって、前立腺癌の治療、予防または部分的なコントロールに、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は有用であると予想される。

例は、本発明の化合物が前立腺癌細胞の増殖を抑制することができることを実証する。これは、本発明の化合物がｃＡＭＰによって媒介された疾病と病気を治療することができるという論理的根拠に実験的確証を提供する。

ｃＡＭＰ加水分解ＰＤＥ酵素の低減された活性に関連した疾病
ＰＤＥ４、たとえばＰＤＥ８とＰＤＥ１１以外のｃＡＭＰ加水分解ＰＤＥアイソフォームについての遺伝子中の機能欠損の突然変異は、多くの疾病において検知される（Vezzosi, D. and Bertherat, J., Eur. J. Endocrinol. 165: 177-188, 2011; Levy, I. et al., Curr. Opin. Pharmacol. 11: 689-697, 2011; Azevedo, M. F. and Stratakis, C. A. Endocr. Pract. 17 Suppl 3: 2-7, 2011）。これらの突然変異は、下に詳述されるような病理学の結果をもたらす異常に高いｃＡＭＰレベルおよび／またはｃＡＭＰ活性の持続に結びつく場合がある。したがって、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、これらの疾病（副腎皮質の腫瘍、精巣癌、ＰＰＮＡＤおよびカ−ニ−複合）の治療、予防または部分的なコントロールで有用であると予想される。

副腎皮質腫瘍
ＰＤＥ１１Ａ４エンコーディング遺伝子での点突然変異の不活性化に関連した副腎皮質の腫瘍は、ＰＤＥ１１Ａ４の発現を低減し、ｃＡＭＰレベルを増加させた（Horvath, A. et al., Nat Genet. 38: 794-800, 2006; Horvath, A. et al., Cancer Res. 66: 11571-11575, 2006; Libe, R., et al., Clin. Cancer Res. 14: 4016-4024, 2008）。

精巣癌
ＰＤＥ１１Ａ活性を低減し、ｃＡＭＰレベルを増加させる突然変異は、精巣癌のいくつかの形式で観察された（Horvath. A. et al., Cancer Res. 69: 5301-5306, 2009）。

原発性色素沈着性結節性副腎皮質病変
（Primary pigmented nodular adrenocortical diseases (PPNAD)）
ＰＤＥ８Ｂ遺伝子中の突然変異もＰＰＮＡＤのための素因であると確認された。また、突然変異蛋白質は、低減されたｃＡＭＰ分解能力を示した（Horvath, A., Mericq, V. and Stratakis, C. A. N. Engl. J. Med. 358: 750-752, 2008; Horvath, A. et al., Eur. J. Hum. Genet. 16: 1245-1253, 2008）

カ−ニ−複合
ＰＲＫＡＲ１Ａ突然変異によって引き起こされたカ−ニ−複合（ＣＮＣ）では、何人かの患者は、さらに副腎および精巣癌に導く、ｃＡＭＰ信号伝達経路の異常な活性化を高める効果を奏する相乗効果を奏することがあるＰＤＥ１１Ａの欠損を持っている（Libe, R. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 96: E208-214, 2011）。

治療と薬量学
「治療」は療法による治療を意味し、人間または非ヒト動物（例えば獣医学の用途）、典型的には人類以外の哺乳動物、にかかわらず、症状上のある希望の治療効果を達成することをいう。例えば進行速度の低減、進行の速度の停止、病気の改善または症状の治癒を含む病気の進行の抑制をいう。予防策としての治療も含まれている。予防または予防は、症状の完全な予防を示さないし要求しない；発現がその代りに、本発明による予防または予防によって低減されるか遅れてもよい。

「治療上有効な量」は、本発明の化合物の１以上、または本発明の化合物の１以上を含む医薬製剤の１つ以上の量であって、治療効果（合理的なベネフィット・リスク比に見合う効果）を生むことに有効である量をいう。

本発明の化合物の適切な量は患者ごとに変わってもよいことが認識されるだろう。最適な量の決定は、一般に本発明の治療の任意の危険または有害な副作用に対する治療の有益性のレベルのバランスを必要とするだろう。選択された投与量は、具体的化合物の活性、投与ルート、適用の時間、化合物の排泄されるまでの時間、治療の期間、他の薬剤、併用して使用される化合物または物質、および患者の年齢、性別、体重、症状、健康状態および病歴を含む様々な要因に依存するだろう。一般に、投与量と投与ルートは、最終的に医師により決定されるが、一般的には、希望の結果を達成するような作用部位での局所濃度を達成するようにされる。投与は、１回分で、連続的にまたは断続的に治療の経過全体を通して生体内で達成することができる。適用の最も有効な手段および量を決定する方法は、当業者に公知で、療法に使用された配合物、療法の目的、治療されている標的細胞および治療されている被検者に応じて変わるだろう。単一の適用または多数回での適用は、扱う医師によって選択された投与量レベルおよびパターンで行なうことができる。

一般に、本発明の１つ以上の化合物の適切な投与量は、１日に体重１ｋｇあたり約０．００１〜５０ｍｇの範囲であることができ、好ましくは１日に体重１ｋｇあたり０．０１−２５、たとえば０．０１、０．０５、０．１０、０．２５、０．５０、１．０、２．５、１０または２５ｍｇである。化合物が塩、溶媒化合物、プロドラッグまたはその他同種のものである場合、適用される量は親化合物に基づいて計算されて、使用される実際の重量は比例して増加させることができる。

併用
本発明の化合物は、さらに細胞内のｃＡＭＰレベルの低下を通じてそれらの治療効果を生むことが知られていた薬の影響を模倣するか高める用途に適用されてもよい。

多くの治療上有益な薬は、細胞内のｃＡＭＰレベルの低下および／またはｃＡＭＰを媒介とした活性を低下させることを含む主作用様式があり、以下に要約される。

本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体はさらにｃＡＭＰレベルを低下するように作用するので、これらの作用薬は、ｃＡＭＰを媒介としたシグナリングのダウンレギュレーションを介する薬の薬理学的性質および治療の有効性を模倣しかつ／または増大するだろう。ある実施態様では、したがって、細胞内のｃＡＭＰレベルを低下させおよび／またはｃＡＭＰを媒介とした活性を低下させるもう一つの作用薬との併用剤の一部として、本発明の化合物が提供される。併用剤は、同時に、同時期に、連続してまたは別々に投与されてもよい。１つの実施態様では、より詳細に以下に記述されるように、本発明の化合物および別個のｃＡＭＰ低下作用薬は、単一組成薬として提供される。

併用薬は、本発明の化合物および次の１つ以上の化合物を含んでもよい：
（ｉ） プレシナプスのα−２アドレナリン受容体アゴニスト、任意にクロニジン、デクスメデトミジン（dexmedetomidine）またはグアンファシン；
（ｉｉ） β−１アドレナリン受容体遮断薬（「β遮断薬」）、任意にアテノロール、メトプロロール、ビソプロロール（Bisoprolol）、アセブトロールまたはベタキソロール（Betaxolol）。

α−２アドレナリン受容体アゴニストとの組み合わせ
α−２アドレナリン受容体刺激は、広範囲の組織中でアデニリルシクラーゼ活性のＧｉタンパク質を媒介とした阻害によってｃＡＭＰレベルを下げると知られている。脳および辺縁の交感神経系中のノルアドレナリン作動性ニューロン（noradrenergic neurones）において、プレシナプスのα−２アドレナリン受容体活性化がノルアドレナリン放出およびノルアドレナリン作動性の活性を阻害する。これらのレセプターでアゴニストとして働く薬（例えばクロニジン、デクスメデトミジン、グアンファシン）は、様々な臨床症状の治療に有効である。クロニジン（プロトタイプの作用薬）は高血圧症、神経障害性疼痛、オピオイドの解毒、不眠症、ＡＤＨＤ、トゥーレット症候群、睡眠時多汗症、中毒（麻薬、アルコールおよびニコチン離脱症状）、片頭痛、過覚醒、不安の治療、さらに獣医学的麻酔薬として有用であることが示されている。ＰＤＥ４長鎖形体活性化によるｃＡＭＰレベルの低下が、α−２アドレナリン受容体刺激を介して作用する薬と同様の結果を与えると予想されることができる。更に、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体がα−２アドレナリン受容体アゴニスとともに使用される時、薬力学的効果を強めると予想される。

β−１アドレナリン受容体遮断薬との組み合わせ
β−１アドレナリン受容体遮断薬は、高血圧症、心律動異常、および心筋梗塞後の心保護を含む一連の心臓血管の治療に使用される。それらの主作用機構は、特に心臓のβ−１アドレナリン作動性レセプタであるノルアドレナリンによって媒介される、過度の循環アドレナリンおよび交感神経活性の影響を弱めることを含んでいる。内因的および合成のβ−１アドレナリン受容体アゴニストは、Ｇｓ活性化を通じてアデニリルシクラーゼ活性を刺激し、様々な組織（たとえば心臓と腎臓）中の細胞内のｃＡＭＰレベルを上げる。従って、β−１アドレナリン受容体に媒介される活性をブロックする薬剤は、ｃＡＭＰ媒介シグナリングの増加を減ずることによりそれらの薬学的影響を及ぼす。ＰＤＥ４長鎖形体活性化がさらに心臓の組織中のｃＡＭＰ濃度および形質導入を低下させるとすれば、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、高血圧症、心律動異常、うっ血性心不全および心保護の治療または部分的なコントロールに有用であると予想される。付加的な非心臓血管の治療での有用性は、たとえば外傷後のストレスに関係する病気、不安、本態性振戦および緑内障のような、β−１アドレナリン作動性拮抗薬に応答する病気の治療に有用であると期待される。更に、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体は、β−１アドレナリン受容体遮断薬と併用されたとき、薬力学的効果を強めると予想されることができる。

治療法
一層の態様では、本発明は、そのような療法を必要とする患者の治療または疾病予防のための方法での使用のための、式−１または式−２のＰＤＥ４長鎖形体の小分子活性化体を提供する。疾病または疾患は、本明細書に記載された任意の疾病または疾患であることができ、以下のものを含む；増加したｃＡＭＰ生産およびシグナリングに関連した疾病、たとえば甲状腺機能亢進症、ヤンセン骨幹端軟骨異形成症、上皮小体機能亢進症、家族性男性性性早熟症、脳下垂体の腺腫、クッシング病、腎多嚢胞病、多嚢胞性肝疾患、ＭＯＤＹ５および心臓肥大；Ｇタンパク質のアルファ・サブユニット（ＧＮＡＳ１）の活性化突然変異に関連した疾患（たとえばマックーン−オルブライト症候群）を含む、増加したｃＡＭＰを媒介としたシグナリングに関係していると知られている疾病；感染症（たとえばコレラ、百日咳、炭疽菌および結核）における毒素により引き起こされたアデニリルシクラーゼ活性の増加の改善；高いｃＡＭＰによるＰＫＡの活性化に依存すると知られている疾病、たとえばＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ、および分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）の治療；高いｃＡＭＰによるＥｐａｃ１およびＥｐａｃ２のどちかまたは両方の活性化に依存すると知られている疾病、たとえば黒色腫および膵臓癌の治療；高いｃＡＭＰによるｃＡＭＰゲート制御されたイオンチャネルの変調に依存する疾病の治療；ｃＡＭＰ応答配列結合たんぱく質の活動亢進に関係していると知られている疾病、たとえば白血病と前立腺癌の治療；ｃＡＭＰ加水分解ＰＤＥ酵素の低減された活性に関係していると知られている疾病、たとえば副腎皮質の腫瘍、精巣癌、原発性色素性結節状副腎皮質病変（ＰＰＮＡＤ）およびカ−ニ−複合の治療；および、細胞内のｃＡＭＰレベルの低下を通じてそれらの治療効果を生むと知られている薬の影響を模倣するか高めること。

ここに使用される用語「本発明の化合物」、「式−１の化合物」、「式−２の化合物」などは、その薬学的に受理可能な派生物およびポリモルフ、アイソマーおよびアイソトープでラベルが付けられたそれらの変形体を包含する。更に、これらの用語は、ここに開示した化合物のサブ実施態様をすべて含んでいる。

薬学的に受理可能な派生物
本発明は、本発明の化合物、その薬学的に受理可能な塩、溶媒化合物、エステル、水化物またはそのアミドを含む医薬品組成物、および薬学的に受理可能な補形薬および任意に他の治療薬との混合物をさらに提供する。「受理可能な」の用語は、組成物の他の成分と相溶性であり、レシピエントに有害でないことを意味する。組成物は、例えば、経口、舌下、皮下、静脈内、硬膜外、鞘内、筋肉内、経皮的、鼻腔内、肺性、局所的、局所、または直腸内適用に好適なものを含み、典型的には適用のためのユニット剤形でのものを含む。

用語「薬学的に受理可能な塩」は、無機または有機の酸および塩基を含む、薬学的に受理可能な無毒な酸または塩基から調製された塩を含んでいる。塩基性基、たとえばアミノ基を含む本発明の化合物は、酸と薬学的に受理可能な塩類を形成することができる。本発明による化合物の薬学的に受理可能な酸付加塩の例は、有機カルボン酸、たとえば酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、ピルビン酸、シュウ酸、フマル酸、オキサロ酢酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸およびコハク酸；有機硫酸、たとえばメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸、および無機酸、たとえば塩酸、硫酸、リン酸およびスルファミン酸と作られた酸付加塩を含む。

酸性基、たとえばカルボキシ基を含む本発明の化合物は、塩基と薬学的に受理可能な塩類を形成することができる。本発明の化合物の薬学的に受理可能な塩基性塩は、金属塩、たとえばアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩）、亜鉛またはアルミニウムの塩類、およびアンモニアまたは薬学的に受理可能な有機アミンまたは、ヘテロ環式塩（たとえばエタノールアミン類（例えばジエタノールアミン）、ベンジルアミン、Ｎ−メチル−グルカミン、アミノ酸（例えばリジン）またはピリジンと作られた塩類が上げられるが、これらに制限されるものでは無い。酸と塩基のヘミ塩、たとえばヘミ硫酸塩も形成されてもよい。

本発明の化合物の化合物の薬学的に受理可能な塩類は、当該技術分野において公知の方法によって調製されることができる。薬学的に受理可能な塩類の調査については、Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002を参照。

プロドラッグ
本発明は、式１および２の化合物のプロドラッグを含んでいる。
プロドラッグは式−１または２の化合物の誘導体であり（それらは薬理活性がほとんどまたはまったくそれら自身なくてもよい）、生体内に適用された時、式−１または２の化合物に変換されることのできる化合物である。

プロドラッグは、たとえば式−１または２の化合物を形成するために生体内で代謝される適切な部位で式−１または２の化合物の中にある官能基を置換することにより生産することができる。Bundgaard, Design of Prodrugs 1985 (Elsevier), The Practice of Medicinal Chemistry 2003, 2^nd Ed, 561-585 and Leinweber, Drug Metab. Res. 1987, 18: 379で議論されるように、プロドラッグのデザインは当該技術分野において公知である。

式−１または２の化合物のプロドラッグの例は、それらの化合物のアミドおよびエステルである。例えば、式−１または２の化合物がカルボン酸基（ＣＯＯＨ）を含む場合、カルボン酸基の水素原子がエステル基を形成するために置換されることができる（例えば、水素原子をＣ１−６アルキルと置換することができる。化合物がアルコール基（−ＯＨ）を含む場合、アルコール性基の水素原子は置換され、エステルを形成することができる（例えば、水素原子は−Ｃ（Ｏ）Ｃ_１−６アルキルで置換される）。

溶媒化合物
化合物の対応する溶媒化合物を調製し、精製し、および／または取り扱うことは便利であるかまたは望ましく、本明細書に記載された任意の使用／方法において使用することができる。用語「溶媒化合物」は、溶質（たとえば化合物または化合物の塩）と溶剤の複合体をいうために使用される。溶剤が水である場合、溶媒化合物は水化物（例えば基体の１つの分子当たりに存在する水分子の数に応じてモノ水化物、ジ−水化物、トリ水化物など）と呼ばれることができる。

立体異性体
本発明の化合物が様々な立体異性体として存在してもよいことは認識されるだろう。本発明の化合物は鏡像異性体とラセミ混合物を含むすべての立体異性体の形式を含む。本発明は、その範囲内に任意のそのような立体異性体の使用、または式−１または２の化合物の個々の鏡像異性体を含む立体異性体の混合物または、そのような鏡像異性体の全体または一部のラセミ混合物を含んでいる。ここで適切な異性体は既知の方法（例えばクロマトグラフ法および再結晶技術）の使用または適応によってそれらの混合物から分けることができる。ここで適切な異性体は、既知の方法（例えば不斉合成）の使用または適応によって調製することができる。

アイソトープ
本発明は、１つ以上の原子が同じ原子番号であるが、自然界で通常見つかる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子で置き換えられた、式−１または２の化合物の薬学的に受理可能なアイソトープ標識化合物を含んでいる。

本発明の化合物へ取り込まれるのに適しているアイソトープの例は、水素のアイソトープ、たとえば^２Ｈおよび^３Ｈ、炭素、たとえば^１１Ｃ、^１３Ｃおよび^１４Ｃ、塩素、たとえば^３６Ｃｌ、フッ素、たとえば^１８Ｆ、ヨウ素、たとえば^１２３Ｉおよび^１２５Ｉ、窒素、たとえば^１３Ｎおよび^１５Ｎ、酸素、たとえば^１５Ｏ、^１７Ｏおよび^１８Ｏ、並びに硫黄、たとえば^３５Ｓがあげられる。例えば式−１または２のあるアイソトープで標識化合物、たとえば放射性同位体を組込むものは、薬および／または基体の生体内分布研究に役立つ。放射性同位体^３Ｈおよび^１４Ｃは、検知の方法および組み込みの手段の容易さを考慮すれば、この目的に特に役立つ。アイソトープ（たとえば^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１５Ｏおよび^１３Ｎ）のような陽電子放射アイソトープでの置換は、基体レセプター占有を検査するためのポジトロン放射トポグラフィー（ＰＥＴ）研究に役立つ。式−１または２のアイソトープでの標識化合物は、一般に当業者に公知の方法により、または明細書に記載された方法に類似の方法で、ラベルが付けられていない試薬の代わりに適切なアイソトープでラベルが付けられた試薬を使用したプロセスによって調製することができる。

医薬品組成物
経口投与のために、有効成分は、個別単位、たとえばタブレット、カプセル剤、散剤、顆粒、溶液、懸濁液などとして提供されることができる。経口投与に適している配合物も、即時に放出する方法、または徐々に放出する方法で本発明の化合物を供給するように設計されてもよい。ここで放出プロフィールは遅れるか、パルスとされるか、コントロールされるか、維持するか、または遅れるか維持されるか、または前記化合物の治療の効能を最適化するような方法に変性されることができる。速度を保持する方法で化合物を供給する手段は当該技術分野で知られており、それらの放出をコントロールするために前記化合物と放出速度の遅いポリマーを加えて調剤することができる。

速度を保持するポリマーの例としては、拡散または拡散およびポリマーエロージョンの組み合わせによって前記化合物を放出するために使用することができる、分解性または非分解性のポリマーが挙げられる。速度を保持するポリマーの例としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピル・セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、キサンタンゴム、ポリメタクリレート、ポリエチレンオキシドおよびポリエチレングリコールが挙げられる。

液体（複数相および分散系を含む）配合物は、乳剤、懸濁液、溶液、シロップ剤およびエリキシル剤であることができる。そのような配合物は、柔いかまたは硬いカプセル剤（たとえばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作られたもの）の中の充填物として存在することができ、典型的にはキャリアー（例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、適切な油、１つ以上の乳化剤および／または分散剤）を含む。液剤は、たとえば小袋の固体の再構成によって調製されていてもよい。

本発明の化合物は、速い溶解性、速い崩壊性の剤形として使用されてもよい（Liang and Chen, Expert Opinion in Therapeutic Patents 2001, 11(6): 981-986に述べられていたもの）。

タブレットの配合物はH. Lieberman and L. Lachman, Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets 1980, vol. 1 (Marcel Dekker, New York）で議論されている。

鼻腔内投与または吸入投与については、有効成分は、ドライ粉末吸入器からのドライ粉末の形で、または気圧調節された包装容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーまたは噴霧器からの溶液または懸濁液のエアゾルスプレーの形式で存在することができる。

非経口投与のためには、本発明の医薬品組成物は、ユニット投与量または複数投与量の包装容器内に存在してもよく、たとえば密封したガラス瓶およびアンプル中で所定量の噴射液体として存在してよく、また使用に先立って無菌の液状キャリア（例えば水）の追加だけを要求する凍結乾燥物（凍結乾燥された）の状態で貯蔵されてもよい。

非経口投与については、本発明の化合物は、血流、皮下組織、筋肉、または内臓へ直接適用されてもよい。適用にふさわしい手段としては、静脈内、動脈内、鞘内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、滑液内、皮下への投与を含む。適用にふさわしい装置は針（極微針を含む）付き注射器、針なしの注射器および注入技術を含んでいる。

非経口の配合物は典型的に水性または油性溶液である。溶液が水性の場合、たとえば糖（グルコース、マンニトール、ソルビトールなど）、塩類、炭水化物および緩衝剤（好ましくは３〜９のｐＨ）のような賦形剤を使用できるが、いくつかの用途では、無菌の非水性溶液として好ましくは配合され、または適切なビヒクル（たとえば無菌、発熱性物質を含まない水（ＷＦＩ）と共に使用される、乾燥した形式として調剤されることができる。

非経口の配合物は分解性ポリマー（たとえばポリエステル（たとえばポリ乳酸、ポリラクチド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ポリカプロ−ラクトン、ポリヒドロキシブチレート）、ポリオルソエステルおよびポリアンハイドライド）由来のインプラントを含んでいてもよい。これらの配合物は、皮下組織、筋組織、または直接特定の器官へ外科的切開によって適用されることができる、

無菌条件の下での非経口の配合物の調製は、たとえば凍結乾燥によって、当業者に公知の標準の製薬の技術を使用して、容易に遂行されることができる。

非経口液の調製で使用される本発明の化合物の可溶性は、たとえば共溶剤および／または溶解性向上剤の添加、たとえば界面活性剤、ミセル構造およびシクロデキストリンののような適切な配合技術の使用によって増加させられることができる。

そのような薬学的に受理可能な添加剤、例えば、Gennaro, A.R. et al, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2005, see especially Part 5: Pharmaceutical Manufacturingに記載されたものとの混合物において、活性な作用薬は、固体投与ユニットへ圧縮され、たとえば錠剤、タブレットにされ、またはカプセル剤、坐剤または貼付剤へ加工される。薬学的に受理可能な液体として、活性な作用薬は流体組成物として適用することができる。例えば、注入剤、エアゾルスプレーまたは溶液、懸濁液またはエマルションの形で適用することができる。

固体投与ユニットを作るために、従来の添加物、たとえば充填剤、着色剤、高分子結合材などの使用が考慮される。一般に、活性化合物の機能の邪魔をしない任意の薬学的に受理可能な添加物を使用することができる。本発明の活性な作用薬とともに適用することができる適切なキャリアーとしては、ラクトーゼ、スターチ、セルロース誘導体およびその他同種のもの、またはそれらの混合物を含む固形組成物が適量で使用されることができる。非経口投与においては、薬学的に受理可能な分散剤および／または湿潤剤（プロピレングリコールまたはブチレン・グリコール）を含む水性懸濁液、等張食塩水液および無菌注射剤溶液を使用することができる。

上記の本発明の組成物はさらに、前記組成物に適している包装材料とともに使用することができる。包装材料は、上記の組成物の使用のための指示を含むことができる。

いくつかの実施態様中で、本発明の１つ以上の化合物は、前記の症状の治療に使用される治療薬、つまり他の治療薬と共に使用することができる。他の療法と組み合わせた活性化合物の場合については、２つ以上の治療薬が、個々の投与量スケジュールおよび異なるルート経由で与えられてもよい。

本発明の化合物と上にリストされた作用薬との組み合わせは、一般知識を使用し、熟練した開業医に知られた投薬処方を使用して、医師が決定できる。本発明の化合物が１、２、３または４以上、好ましくは１または２，好ましくは１つの治療薬との併用で適用される場合、他の治療薬と化合物は、同時にまたは連続して適用することができる。連続して適用された時、それらは短い間隔を置かれた間隔（例えば５−１０分の期間）、またはより長い間隔（例えば１、２、３または４時間以上離れて、またはさらに必要な場合にはより長い期間で別々に）で投与することができる。正確な投与計画は、治療薬の特性にふさわしくされる。

１つの実施態様では、本発明は、療法で使用される、同時、個別または連続して投与される複合成分製剤としての、本発明の化合物および別の治療薬を含む生成物を提供する。１つの実施態様では療法は、環式３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介される二次伝達物質反応の低減が必要とされる病気の治療または予防である。複合成分製剤として提供される生成物は、本発明の組成物と別の治療薬を１つの医薬品組成物含む組成物、または本発明の化合物と他の治療薬を別の形体で含むもの、たとえばキット形体のものを含む。

１つの実施態様では、本発明は、本発明および別の治療薬の化合物を含む医薬品組成物を提供する。任意に、医薬品組成物は上に記述されるような薬学的に受理可能な補形薬を含んでもよい。１つの実施態様では、本発明は、２つ以上の別個の医薬品組成物を含むキットを提供する。その少なくとも１つは、本発明の化合物を含む。

１つの実施態様では、キットは、別々に前記の組成物を保持するための手段、たとえば包装容器、分割されたボトル、あるいは分割されたホイルパケットを含む。そのようなキットの一例はブリスターパックであり、タブレット、カプセル剤およびその他同種のものパッケージングに典型的に使用される。

本発明のキットは、異なる剤形を適用するために使用され、たとえば経口と非経口の剤形を投与する場合、異なる投与間隔で別個の組成物を投与する場合、または個別の組成物を互いに滴定する場合に使用される。法遵守の支援のために、本発明のキットは、典型的には適用の指示を含む。

本発明の併用療法では、本発明の化合物および別の治療薬は、同じか異なるメーカーによって生産および／また配合することができる。さらに、本発明の化合物および別の治療薬は、併用療法に一緒に使用されることができる：
（ｉ）医師への配合剤の提供に先立って（例えば本発明の化合物および別の治療薬を含むキットの場合）；
（ｉｉ）適用直前に医師によって（または医師のガイダンスの下で）；
（ｉｉｉ）患者自身により、例えば、本発明の化合物および別の治療薬の連続した適用中に。

製造方法および治療法
本発明は、さらに環式の３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質反応の低減が必要とされる疾病の治療または予防のための医薬品の製造における本発明の化合物の使用を提供する。ここで医薬品は別の治療薬と併用される適用のために調製されている。本発明は、さらに環式３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質反応の低減が必要とされる疾病の治療または予防のための医薬品の製造における他の治療薬の使用を提供する。ここで医薬品は本発明の化合物と併用される適用のために調製されている。

本発明は、さらに環式３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質反応の低減が必要とされる疾病の治療または予防での使用のための本発明の化合物を提供する、ここで本発明の化合物は別の治療薬との適用のために調製されている。本発明は、さらに環式３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質反応の低減が必要とされる疾病の治療または予防での使用のための他の治療薬を提供する、ここで他の治療薬は本発明の化合物との適用のために調製されている。

本発明は、さらに環式の３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質反応の低減が必要とされる疾病の治療または予防における使用のための本発明の化合物を提供する。ここで本発明の化合物は他の治療薬とともに適用される。本発明は、さらに環式の３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質反応の低減が必要とされる疾病の治療または予防における使用のための他の治療薬を提供する。ここで他の治療薬は本発明の化合物とともに適用される。

本発明は、さらに環式の３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質反応の低減が必要とされる疾病の治療または予防のための医薬品の製造における本発明の化合物の使用を提供する、ここで患者は先に（例えば２４時間以内に）他の治療薬で治療されている。本発明は、さらに環式の３’，５’−アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）によって媒介された二次伝達物質反応の低減が必要とされる疾病の治療または予防のための医薬品の製造における他の治療薬の使用を提供する、ここで患者は先に（例えば２４時間以内に）本発明の化合物で治療されている。

１つの実施態様では、別の治療薬は次のとおりである：
（ｉ） プレシナプスα−２アドレナリン受容体アゴニスト（presynaptic α-2 adrenergic receptor agonist）、任意にクロニジン、デデキスメデトミジンまたはグアンファシン；
（ｉｉ） β−１アドレナリン受容体遮断薬（「β−遮断薬」）、任意にアテノロール、メトプロロール、ビスオプロロール（Bisoprolol）、アセブトロールまたはベータキシロール（Betaxolol）。

実施例
本発明は、次の非制限的な例、および表と図を参照してさらに記述される：
表１は、本発明による、例ＡからＬの式−１および式−２の新規な小分子ＰＤＥ４長鎖形体活性化体の例を示す；
表２は、例ＡからＬによる、ＰＤＥ４Ｄ５（ＰＤＥ４の長鎖形体）の活性化を示す。
表３は、例Ａによる、ＰＤＥ４Ａ４（ＰＤＥ４の別の長鎖形体）の活性化を示す。
表４は、例Ａによる、ＰＤＥ４Ｂ１（ＰＤＥ４の別の長鎖形体）の活性化を示す。

図１は、例Ａ、Ｂ、ＤおよびＬによる、ＰＤＥ４Ｄ５（ＰＤＥ４の長鎖形体）の活性化を示す。
図２は、例Ａによる、ＰＤＥ４Ａ４（ＰＤＥ４の別の長鎖形体）の活性化を示す。
図３は、例Ａによる、ＰＤＥ４Ｂ１（ＰＤＥ４の別の長鎖形体）の活性化を示す。
図４は、例Ａ、Ｂ、ＤおよびＬによる、ＰＤＥ４Ｂ２（ＰＤＥ４の短鎖形体）に対する影響の欠如を示す。
図５は、１０分間本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体（１０μＭ）で処理された後、２分間ホルスコリン（Ｆ）（１０μＭ）で処理されたＨＥＫ ２９３細胞中の細胞内のｃＡＭＰレベルの低減を示す。
図６は、１０分間本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体（１０μＭ）で処理された後、２分間ホルスコリン（Ｆ）（１０μＭ）で処理されたＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞中で細胞内のｃＡＭＰレベルの低減を示す。
図７は、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたＭＤＣＫ細胞中の生体外の嚢胞形成の抑制を示す。
図８は、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたＭＤＣＫ細胞中の生体外の嚢胞形成の反転を示す。
図９は、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたアンドロゲン感受性（ＡＳ）ＬＮＣａＰの人間の前立腺癌細胞の増殖の抑制を示す。
図１０は、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたアンドロゲン非感受性の（ＡＩ）ＬＮＣａＰの人間の前立腺癌細胞の増殖の抑制を示す。
図１１は実施例Ａでのマウスの生体内での薬物動態学のプロフィールを示す。オスのＣ５７ハツカネズミへのｉ．ｖ．およびｐ．ｏ．投与後の定義された時間ポイントで全血分析によって決定された。
図１２は実施例Ａでのラットの生体内での薬物動態学のプロフィールを示す。オスのＳＤラットへのｉ．ｖ．およびｐ．ｏ．投与後の定義された時間ポイントでの血漿分析によって決定された。
図１３は、例Ａ、本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたＯＸ１６１細胞の中での生体外の嚢胞形成の（Ａ）抑制および（Ｂ）反転を示す。

実験の詳細
式−１と式−２の新規のＰＤＥ４長鎖形体活性化体の調製
反応は、薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＴＬＣのシリカゲル６０ Ｆ_２５４）によってモニターされた。フラッシュカラム・クロマトグラフィーはあらかじめパックされたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｔｒａｔ（登録商標）のシリカゲルカラム上で行なわれた。ＮＭＲスペクトルは２５℃でＢｒｕｋｅｒ ＡＶ３００分光計を使用して記録された。次の略語がＮＭＲシングルのアサインメントで使用される：
ｓ（シングレット）、ｄ（ダブレット）、ｔ（トリプレット）、ｑ（カルテット）、ｍ（多重線）、ｂｓ（広いシングレット）、ｄｄ（ダブレットのダブレット）、ｄｔ（トリプレットのダブレット）。

例Ａ：
Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド

ステップ１：Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−クロルアセトアミド
アルゴン下の−５℃（塩／氷浴）の無水ジクロロメタン（８０ ｍＬ）中の３−フルオロベンジルアミン（３．３２ｇ、２６．６ミリモル）およびトリエチルアミン（３．８７ ｍＬ、２７．９ミリモル）の撹拌された溶液に、クロロアセチルクロリド（２．２２ ｍＬ、２７．９ミリモル）を、１０分間滴下により加えた。反応液はさらに３０分間−５℃で撹拌され、次に、２時間室温で撹拌された。その後、その混合物は、クロロホルム（５０ ｍＬ）で薄められ、飽和された重炭酸ナトリウム水溶液（３×２０ ｍＬ）そして次に塩水（３×２０ ｍＬ）で洗われた。その後、有機質層は無水硫酸ナトリウム上で乾かされ、２ｃｍのシリカゲル・パッドによってろ過され、クロロホルム中の２％メタノールで洗い、濾液は減圧下で濃縮され、白色固形物としてＮ−（３−フルオロベンジル）−２−クロルアセトアミド（５．１５ｇ、２５．５ミリモル）を得た。

ステップ２：Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−ヨードアセトアミド
アセトニトリル（５０ ｍＬ）中のＮ−（３−フルオロベンジル）−２−クロルアセトアミド（５．１３ｇ、２５．４ミリモル）の撹拌された溶液に、ヨウ化ナトリウム（４．００ｇ、２６．７ミリモル）を加えた。その混合物は３時間９０℃（油浴）で還流され、次に、室温に冷却した。沈殿物をセライト（登録商標）の短いパッドを使用してろ過し、ジクロロメタンで洗った。濾液は減圧下で濃縮され、薄茶色固体として粗製生成物を得た。
粗製生成物は石油エーテル中の５％から３５％の酢酸エチルで溶出して、フラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製され、浅黄色粉末としてＮ−（３−フルオロベンジル）−２−ヨードアセトアミド（７．１１ｇ、２４．３ミリモル）を得た。

ステップ３：４−クロロ−３−フルオロベンゼン・カルボキシミド酸メチルエステル塩酸塩
メタノール中の塩酸溶液（３Ｎ；３ ｍＬ）、クロロトリメチルシラン（３．２６ｇ、３０．０ミリモル）、４−クロロ−３−フルオロベンゾニトリル（２．３３ｇ、１５ミリモル）を、室温でアルゴン下で撹拌しながら、乾式反応チューブに連続して加えた。その混合物は、１時間、撹拌しながら５０℃に加熱し、その間に、厚い白色の沈殿物が混合物内に生じた。シクロペンチルメチル・エーテル（５ ｍＬ）が加えられ、混合物は沈殿を緩めるための周期的な振盪と共にさらに１時間５０℃に加熱された。その後、室温にその混合物を冷却し、固体は濾別され、シクロペンチルメチル・エーテル（２×５ ｍＬ）で洗い、４−クロロ−３−フルオロベンゼン・カルボキシミド酸メチルエステル塩酸塩（１．４３ｇ、６．９ミリモル）を得た。

ステップ４：３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール
トルエン（３０ ｍＬ）中の４−クロロ−３−フルオロベンゼン・カルボキシミド酸メチルエステル塩酸塩（１８７ｍｇ、０．８３ミリモル）、ヒドラジン水化物（０．８８ ｍＬ、１８．０ミリモル）および塩化アルミニウム（１２０ｍｇ、０．９０ミリモル）の混合物が、３時間還流下に加熱された。その混合物は減圧下で濃縮され、トルエン中に採取され、減圧下で２回以上濃縮された。残渣はトルエン／アセトニトリル混合物（１２：１、２６ ｍＬ）中に懸濁された。プロピオン酸クロライド（０．３６ ｍＬ、４．１ミリモル）が加えられ、混合物は１１２℃で一晩加熱された。混合物は減圧の下で濃縮され、石油エーテル中の２０％から２５％の酢酸エチルで溶出して、フラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製され、３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（２８ｍｇ、０．１２ミリモル）を得た。

ステップ５：Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
ジメチル・フォルムアミド（２ ｍＬ）中の３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（２８ｍｇ、０．１２ミリモル）の、０℃のアルゴン下で撹拌された溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中の６０％分散液、６．３ｍｇ、０．１６ミリモル）が加えられた。１０分の後、ジメチルホルムアミド（３ ｍＬ）中のＮ−（３−フルオロベンジル）−２−ヨードアセトアミド（４６ｍｇ、０．１６ミリモル）の溶液が滴加された。室温にその反応を暖まらせ、７２時間撹拌された。その混合物は減圧下で濃縮され、次に、クロロホルム（２５ ｍＬ）と水（１０ ｍＬ）の間で分割された。有機質層は分離され、塩水（２×１０ ｍＬ）で洗われ、無水マグネシウム硫酸塩上で乾かされ、減圧下でろ過され濃縮された。粗製生成物は、石油エーテル中の２５％から３５％の酢酸エチルで溶出して、フラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製され、生成物はクロロホルム／メタノールから再結晶され、白色固形物としてＮ−（３−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド（１５．３ｍｇ、０．０３９ミリモル）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．８９−７．８０（２Ｈ，ｍ）、７．５６−７．４３（１Ｈ，ｍ）、７．３８−７．２２（１Ｈ，ｍ）、７．００（３Ｈ，ｍ）、６．６２（１Ｈ，ｓ）、４．８７（２Ｈ，ｓ）、４．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．９）、２．８５（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）、１．４１（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）．

例Ｂ：Ｎ−ベンジル−２−［３−（４−クロロフェニル）−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
ステップ１：Ｎ−ベンジル−２−クロルアセトアミド
−５℃（塩／氷浴）のトルエン（７０ ｍＬ）中のベンジルアミン（７．６４ ｍＬ（７０．０ミリモル）およびトリエチルアミン（１０．２２ ｍＬ、７３．５ミリモル））の撹拌された溶液に、クロロアセチルクロリド（５．８５ ｍＬ、７３．５ミリモル）を、１０分間にわたり滴下した。反応液は３０分間−５℃で撹拌されて、その後室温で２時間撹拌された。その後、その混合物は酢酸エチル（７０ ｍＬ）で薄められ、飽和された重炭酸ナトリウム水溶液（３×３０ ｍＬ）および塩水（３×３０ ｍＬ）で洗われた。その後、有機質層は無水硫酸ナトリウム上で乾かされ、減圧下でろ過され濃縮されて、白色固形物としてＮ−ベンジル−２−クロルアセトアミド（１１．０１ｇ、５９．９６ミリモル）を得た。

ステップ２：Ｎ−ベンジル−２−ヨードアセトアミド
アセトニトリル（６０ ｍＬ）中のＮ−ベンジル−２−クロルアセトアミド（１２．４３ｇ、６７．６６ミリモル）の撹拌された溶液に、ヨウ化ナトリウム（１０．６５ｇ、７１．０４ミリモル）を加えた。その混合物は、２．５時間９５℃（油浴）で緩やかに還流され、次に、室温に冷却された。沈殿は酢酸エチルで洗って、セライト（登録商標）の短いパッドを使用してろ過された。濾液は減圧の下で濃縮され、薄茶色固体として粗製生成物を得た。酢酸エチル／ジクロロメタン混合物でトリチュレートし、濾過をして、Ｎ−ベンジル−２−ヨードアセトアミド（３．９１ｇ）を得た。濾液は減圧下で濃縮され、５０％のクロロホルム／酢酸エチルで溶出するフラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製され、さらなる生成物（２．３５ｇ）の与えた。セライト（登録商標）のパッドは、にジクロロメタンそして次にクロロホルムでさらに洗われ、さらなる生成物（７．１０ｇ）を得た。生成物サンプルは一緒にされ空気中で乾かされ、白色粉体として単一バッチのＮ−ベンジル−２−ヨード・アセトアミド（１３．１４ｇ、４７．７６ミリモル）を与えた。

ステップ３：３−（４−クロロフェニル）−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール
無水メタノール（０．５Ｍ；４ ｍＬ）中のナトリウム・メトキシドの溶液に、４−クロロベンゾニトリル（１．３８ｇ、１０ミリモル）を加えた。結果として生じる懸濁液は、２．５時間アルゴン下の室温で撹拌された。無水メタノール（１０ ｍＬ）中のメトキシ酢酸酸ヒドラジド（１．０４ｇ、１０ミリモル）の溶液が混合物に加えられ、透明な溶液を得た。これは３時間還流に加熱され、その後、室温で一晩撹拌された。混合物は減圧の下で濃縮され、石油エーテル中の２０％から６０％の酢酸エチルで溶出するフラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製され、３−（４−クロロフェニル）−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（４１２ｍｇ、１．８４ミリモル）を白色固形物として得た。

ステップ４：Ｎ−ベンジル−２−［３−（４−クロロフェニル）−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
ジメチル・フォルムアミド（２ ｍＬ）中の３−（４−クロロフェニル）−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（４５ｍｇ、０。２０ミリモル）の０℃でアルゴン下の撹拌された溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中の６０％分散液、９．６ｍｇ、０．２４ミリモル）を加えた。１０分の後、ジメチルホルムアミド（３ ｍＬ）中のＮ−ベンジル−２−ヨードアセトアミド（６６ｍｇ、０．２４ミリモル）の溶液が滴加された。室温にその反応液を暖まらせ、７２時間撹拌された。その混合物は減圧の下で濃縮され、次に、ジクロロメタン（２５ ｍＬ）と水（１０ ｍＬ）の間で分割された。有機質層は分離され、塩水（２×１０ ｍＬ）で洗われ、無水マグネシウム硫酸塩上で乾かされ、減圧下でろ過され濃縮された。粗製生成物は、石油エーテル中の４０％から５０％の酢酸エチルで溶出されたフラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製され、生成物はクロロホルム／メタノール／ヘキサンから再結晶され、白色固形物としてＮ−ベンジル−２−［３−（４−クロロフェニル）−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド（２２ｍｇ、０．０５９ミリモル）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）８．０７−７．９６（２Ｈ，ｍ）、７．４９−７．３９（２Ｈ，ｍ）、７．３８−７．１９（５Ｈ，ｍ）、６．４８（１Ｈ，ｓ）、５．０１（２Ｈ，ｓ）、４．７０（２Ｈ，ｓ）、４．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．８）、３．４０（３Ｈ，ｓ）．

例Ｃ：Ｎ−ベンジル−２−［３−（４−クロロフェニル）−５−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
表題化合物はメトキシ酢酸ヒドラジドの代わりにアセトヒドラジドを使用して、例Ｂの方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）８．０５−７．９３（２Ｈ，ｍ）、７．４７−７．３９（２Ｈ，ｍ）、７．３８−７．２３（５Ｈ，ｍ）、６．６４（１Ｈ，ｓ）、４．８５（２Ｈ，ｓ）、４．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．８）、２．５５（３Ｈ，ｓ）．

例Ｄ：
Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−｛３−［４−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル｝アセトアミド
表題化合物は、４−クロロベンゾニトリルの代わりに４−（トリフルオロメトキシ）ベンゾニトリルを使用し、Ｎ−ベンジル−２−ヨードアセトアミドの代わりにＮ−（３−フルオロベンジル）−２−ヨードアセトアミド（例Ａの中で調製されたように）を使用して、例Ｂ、ステップ３および４の方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）８．０８−８．１２（２Ｈ，ｍ）、７．１９−７．３４（３Ｈ，ｍ）、６．９１−７．０１（３Ｈ，ｍ）、６．４５（１Ｈ，ｂｓ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、４．６８（２Ｈ，ｓ）、４．４６（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．９）および３．４２（３Ｈ，ｓ）．

例Ｅ：
（Ｎ−（３−クロロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド

ステップ１：３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール
トリアゾールは、４−クロロベンゾニトリルの代わりに４−クロロ−３−フルオロベンゾニトリルを使用し、およびメトキシ酢酸ヒドラジドの代わりにプロピオン酸ヒドラジドを使用して、例Ｂ、ステップ３の方法によって調製された。

ステップ２：Ｏ−第三ブチル−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］酢酸塩
ジメチルホルムアミド（１０ ｍＬ）中の３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（４９２ｍｇ、２．１８ミリモル）のアルゴン下で室温で撹拌された溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中６０％の分散液、１０５ｍｇ、２．６２ミリモル）を加えた。１０分の後、第三ブチルブロモ酢酸（３８６μＬ、２．６２ミリモル）が１分間で滴加された。その反応物は１８時間室温で撹拌された。その混合物は減圧の下で濃縮され、次に、石油エーテル中の５％から１５％の酢酸エチルで溶出したフラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製し、白色固形物としてＯ−第三ブチル−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］酢酸塩（６６１ｍｇ、１．９４ミリモル）を得た。

ステップ３：２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］酢酸
０℃のジクロロメタン（３０ ｍＬ）中のＯ−第三ブチル−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］酢酸塩（６６１ｍｇ、１．９４ミリモル）の撹拌された溶液に、トリフルオロ酢酸（１０ ｍＬ）を５分にわたり滴下した。室温にその反応を暖まらせ、１８時間撹拌された。その混合物は減圧下で濃縮され、粘稠な淡いブラウン色の油として粗製の２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］酢酸を与えた。それはさらなる精製なしで使用された。

ステップ４：２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセチル塩化物
ジクロロメタン（３０ ｍＬ）中の２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］酢酸（ステップ ３からの粗製品、約１．９４ミリモル）の撹拌された溶液に、塩化チオニル（２．３２ ｍＬ、３２．０ミリモル）を加えた。その混合物は６時間還流下で加熱された。粗製の２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセチル塩化物（約１．９４ミリモル）を与えるために、その混合物は減圧下で濃縮された。それはジクロロメタン（３３ ｍＬ）で採取され、それ以上の精製なしで使用された。

ステップ５：Ｎ−（３−クロロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
０℃でジクロロメタン中の３−クロロベニジルアミン（ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｙｚｌａｍｉｎｅ）（３９ｍｇ、０．２７ミリモル）およびトリエチルアミン（６３μＬ、０．４５ミリモル）の撹拌された溶液に、ジクロロメタン（３ｍＬ）中の２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセチル塩化物（ステップ ４からの粗製品、約０．１８ミリモル）を加えた。室温にその反応物を暖め、１８時間撹拌された。その混合物は減圧下で濃縮され、次にジクロロメタン中の０．５％から１％のメタノールで溶出されたフラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製され、白色固形物を得た。これはクロロホルムとヘキサンでトリチュレートされ、Ｎ−（３−クロロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イルアセトアミド（３０．４ｍｇ、０．０７５ミリモル）を白色固形物として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ９．９，１．８）、７．７９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ ８．３，１．９，０．８）、７．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ８．２，７．６）、７．１９−７．２５（３Ｈ，ｍ）、７．０８−７．１２（１Ｈ，ｍ）、６．５９（１Ｈ，ｂｓ）、４．８４（２Ｈ，ｓ）および４．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．９）、
２．８２（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）および１．３８（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）．

例Ｆ：Ｎ−（３−シアノベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
表題化合物はステップ５で３−クロロベンジルアミンの代わりに３−シアノベンジルアミンを使用して、例Ｅの方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．７８−７．８６（２Ｈ，ｍ）、７．５３−７．５９（２Ｈ，ｍ）、７．４０−７．４９（３Ｈ，ｍ）、６．７１（１Ｈ，ｂｓ）、４．８５（２Ｈ，ｓ）、４．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ６．２）、２．８２（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）および１．３８（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）．

例Ｇ：Ｎ−［３−（トリフルオロメチル）ベンジル］−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
表題化合物はステップ５で３−クロロベンジルアミンの代わりに３−（トリフルオロメチル）ベンジルアミンを使用して、例Ｅの方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．８３（１Ｈ，ｄｄ、Ｊ ９．９，１．８）、７．７８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ ８．３，１．９，０．８）、７．５１−７．５６（１Ｈ，ｍ）、７．４１−７．４７（４Ｈ，ｍ）、６．６４（１Ｈ，ｂｓ）、４．８５（２Ｈ，ｓ）、４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ ６．０）、２．８２（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）および１．３７（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）．

例Ｈ：Ｎ−（３−メトキシベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
表題化合物はステップ５で３−クロロベンジルアミンの代わりに３−メトキシベンジルアミンを使用して、例Ｅの方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ９．９，１．９）、７．７８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ ８．３，１．９，０．８）、７．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ８．２，７．５）、７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ ８．０）、６．７４−６．８２（３Ｈ，ｍ）、６．５３（１Ｈ，ｂｓ）、４．８３（２Ｈ，ｓ）および４．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．７）、３．７６（３Ｈ，ｓ）、２．８１（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）、１．３７（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）。

例Ｉ：Ｎ−［３−（トリフルオロメトキシ）ベンジル］−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
表題化合物はステップ５で３−クロロベンジルアミンの代わりに３−トリフルオロメトキシ）ベンジルアミンを使用して、例Ｅの方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ９．９，１．８）、７．７９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ ８．３，１．９，０．８）、７．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ８．２，７．５）、７．３４（１Ｈ，ｔ，Ｊ ７．９）、７．１１−７．１７（２Ｈ，ｍ）、７．０６−７．０８（１Ｈ，ｍ）、６．６１（１Ｈ，ｂｓ）、４．８５（２Ｈ，ｓ）、４．４９（２Ｈ，ｄ，Ｊ ６．０）、２．８１（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）、１．３７（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）．

例Ｊ：Ｎ−（２−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
表題化合物はステップ５で３−クロロベンジルアミンの代わりに２−フルオロベンジルアミンを使用して、例Ｅの方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ １０．０，１．９）、７．８１−７．７８（１Ｈ，ｍ）、７．４２−７．４７（１Ｈ，ｍ）、７．１９−７．３３（２Ｈ，ｍ）、７．００−７．１２（２Ｈ，ｍ）、６．６８（１Ｈ，ｂｓ）、４．８０（２Ｈ，ｓ）、４．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．９）、２．７９（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）、１．３５（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）。

例Ｋ：Ｎ−（４−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
表題化合物はステップ５で３−クロロベンジルアミンの代わりに４−フルオロベンジルアミンを使用して、例Ｅの方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ １０．０，１．８）、７．７７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ ８．３，１．９，０．８）、７．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ８．２，７．５）、７．１６−７．２２（２Ｈ，ｍ）、６．９６−７．０４（２Ｈ，ｍ）、６．５１（１Ｈ，ｂｓ）、４．８２（２Ｈ、ｓ）、４．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．９）、２．８０（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）、１．３６（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）．

例Ｌ：Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド
表題化合物はステップ５で３−クロロベンジルアミンの代わりに３，４−ジメトキシベンジルアミンを使用して、例Ｅの方法によって調製された。

^１Ｈ ＮＭＲ：
δ_Ｈ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）７．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ １０．０，１．８）、７．７７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ ８．３，１．９，０．８）、７．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ ８．０，７．７）、６．７３−６．８１（３Ｈ，ｍ）、６．４５（１Ｈ，ｂｓ）、４．８２（２Ｈ，ｓ）、４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．７）、３．８６（３Ｈ，ｓ）、３．８１（３Ｈ，ｓ）、２．８１（２Ｈ，ｑ，Ｊ ７．６）、１．３７（３Ｈ，ｔ，Ｊ ７．６）．

生物検定
細胞培養
ＨＥＫ ２９３およびＭＤＣＫ細胞（Public Health England, Cell Culture Collections）は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Seralab）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１，０００Ｕペニシリンおよび１，０００μｇストレプトマイシン（Life Technologies）で補われたＤＭＥＭ中で維持された；この培地は完全培地と名付けられた。クローンＨＥＫ ２９３細胞株は、０．６ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Enzo Life Sciences）で補われた完全培地中で維持された。

実験１：
全長ヒトＰＤＥ４アイソフォームＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ａ４、ＰＤＥ４Ｂ１およびＰＤＥ４Ｂ２を使用する本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体の同定（Marchmont, R. J. and Houslay, M. D. Biochem. J. 187: 381-92, 1980）

細胞株生成
ＨＥＫ ２９３細胞はメーカーによって概説されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ／Ｐｌｕｓ試薬（Invitrogen）を使用して、ｐＤＥＳＴ（登録商標） ＰＤＥ４発現ベクターでトランスフェクトされ、クローナルアイソレートがエキスパンドされ、全長ヒトＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ａ４およびＰＤＥ４Ｂ１長鎖アイソフォームおよび全長ヒトＰＤＥ４Ｂ２短鎖アイソフォームを安定して発現する細胞株を得た。これらは、ＨＥＫ−ＰＤＥ４Ｄ５、ＨＥＫ−ＰＤＥ４Ａ４、ＨＥＫ−ＰＤＥ４Ｂ１およびＨＥＫ−ＰＤＥ４Ｂ２細胞株とそれぞれ呼ばれた。

溶解物調製物（代表例としてＰＤＥ４Ｄ５を使用して）
ＨＥＫ−ＰＤＥ４Ｄ５細胞は、１００ｍｍのプレート中にシードされ、５％ＣＯ_２、９５％空気の雰囲気中で３７℃でインキュベートされた。細胞溶解物は、ＫＨＥＭバッファー［５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．２）、１．９２ｍＭ ＭｇＣｌ_２］を使用して調製された。細胞溶解物を調製するために、細胞を含んでいる１００ｍｍのプレートが氷の上に置かれ、氷冷ＰＢＳ（燐酸塩緩衝食塩水、ｐＨ ７．４）で洗われた。ＫＨＥＭバッファー（５００μｌ）が細胞に加えられた。その後、細胞はプレートからこすり落とされ、針（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ（登録商標）０．８、４０ｍｍ）を使用してトリチュレートされた。その後、溶解された細胞は、セルデブリスを除去するために１０分間２０００毎分回転数で遠心分離機にかけられた。また、上澄み（組み換えＰＤＥ４Ｄ５を含む細胞溶解物を含む）は新しいチューブに転送され、冷凍された。

細胞質ゾル・フラクション調製（代表例としてＰＤＥ４Ｄ５を使用して）
細胞溶解物を含む組み換えＰＤＥ４Ｄ５は、遠心分離管へ転送され、超遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）内に置かれ、３０分間４℃で高速（１００，０００ｇ）で回した。その後、細胞質ゾル・フラクションは集められた。また、そのタンパク質の量はＢＣＡタンパク質分析を使用して決定された。

ＰＤＥ分析（代表例としてＰＤＥ４Ｄ５を使用して）
ＰＤＥ分析が、過剰発現されたＰＤＥ４Ｄ５を含み、１０ｍＭＴｒｉｓ／５ ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１μＭ［３Ｈ］ｃＡＭＰ（Perkin Elmer）プラスＰＤＥ４Ｄ５細胞溶解物細胞質ゾル・フラクションの終末濃度を使用して、試験化合物を含むものと含まないもので行なわれた。インキュベーションが５分間３０℃で行なわれた。その後、サンプルはＰＤＥ酵素を変性（denature）するために２分間沸騰水中に置かれ、その後氷中に返された。１０分間サンプルを冷却し、蛇毒５’−ヌクレオチダーゼ（snake venom 5’-nucleotidase）（２５μｌ、１ｍｇ／ｍｌ；シグマ）が加えられた。チューブは１０分間３０℃で水浴中で攪拌されインキュベートされ、［３Ｈ］５’−ＡＭＰを［３Ｈ］−アデノシンに変換し、そして次に氷の上に置かれた１：１ダウエックス：水ストックとして調製されたダウエックス・イオン交換樹脂（シグマ）は徹底的に再懸濁され、エタノールで２：１に薄めた。結果として生じるダウエックス懸濁液（０．４ｍｌ）が、各チューブに加えられた。チューブは混合するために攪拌され、次に、最終撹拌の前に少なくとも１５分間氷の上でインキュベートされた。ダウエックス樹脂は３分間４℃で１３，０００ｇで遠心分離によってペレットにされ、上澄みの１５０μｌが、１ｍｌのＳｃｉｎｔｉＳａｆｅ３シンチレーション流体（Fisher）を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへ移された。チューブは混合するために徹底的に攪拌された。回収された［３Ｈ］−アデノシンはシンチレーション計数器中で１分間カウントを測定することにより定量された。

本発明の化合物は濃度に依存した方法で、ＰＤＥ４長鎖形体ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ａ４およびＰＤＥ４Ｂ１を活性化した。同じ分析条件の下で、本発明の化合物はＰＤＥ４短鎖形体、ＰＤＥ４Ｂ２を活性化しなかった。データは図１〜４の中のグラフ中に示される。

実験２：
ＰＤＥ４長鎖形体活性化体による、ＨＥＫ ２９３またはＭＤＣＫ細胞の細胞内のｃＡＭＰレベルの低減
１つのウェル当たり１００，０００個のＨＥＫ ２９３またはＭＤＣＫ細胞でシードし、一晩接着させた。その後、細胞は１０分間示された化合物（１０μＭ）で処理され、２分間ホルスコリン（１０μＭ、シグマ）で刺激された。メディアはアスピレートされ、塩酸（０．１Ｍ）が細胞を溶解するために加えられた。ｃＡＭＰ分析（Enzo Life Sciences）がメーカーの指示にしたがって行なわれた。本発明の化合物は、ホルスコリン刺激されたＨＥＫ ２９３またはＭＤＣＫ細胞中の細胞内のｃＡＭＰレベルを下げた。データは図５および６にグラフ形状で示される。

実験３：
ＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたＭＤＣＫ細胞の生体外の嚢胞形成の抑制
この研究では、確立した三次元の（３Ｄ）ＭＤＣＫ細胞モデルが、腎臓包嚢の形成に対するＰＤＥ４長鎖形体活性化体の影響を調査し、かつ腎多嚢胞病の治療でのそれらの可能性を評価するために使用された。３Ｄ包嚢はいくつかの修正がされたＭａｏら（Mao, Z., Streets, A. J., Ong, A. C. M. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 300(6): F1375-F1384, 2011）の方法に基づいて生成された。ＭＤＣＫ細胞（５０，０００細胞／ウエル）は、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、２ｍＭの Ｌ−グルタミン、２ｍＭの Ｌ−グルタミン、１，０００Ｕのペニシリンおよび１，０００μｇのストレプトマイシン（ＤＭＥＭ−２％ＦＢＳ）で補われた、ＤＭＥＭ中の１７ｍＭのＮａＯＨを含む氷上のコラーゲン（ライフ・テクノロジーズ； 終末濃度１ｍｇ／ｍＬ）へシードされた。３７℃でゲル化する際、ＤＭＥＭ−２％ＦＢＳの１ ｍＬが、１０μＭホルスコリン（シグマ）および１μｇ／ｍＬ［Ａｒｇ^８］−バソプレッシン酢酸塩塩（シグマ）が存在する状態で示された試験化合物と共に加えられた。メディアは２日ごとに２０日間補充された；すべてのフィードにおいて、試験化合物、ホルスコリンおよびバソプレッシンが加えられた。

位相コントラスト画像は２日ごとに２０日間Ｍｏｔｉｃ顕微鏡（ｘ２００拡大）で得られた。１つの条件当たり、１０のイメージが撮られ（二度ずつ）、平均包嚢半径を測定した。

本発明の化合物は、濃度依存性の態様でＭＤＣＫ細胞の生体外の嚢胞形成を阻害した。
例Ａについての２０日目の位相コントラスト画像、および包嚢半径を図７に示す。

実験４：
ＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたＭＤＣＫ細胞の生体外の嚢胞形成の反転
この研究では、あらかじめ決まった包嚢の形成を反転する、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体の可能性が評価された。実験は実験３の方法によって実行された。最初の１０日の間、ホルスコリンとバソプレッシンはすべてのフィード（２日ごと）で加えられた。しかし、試験化合物は加えられなかった。次の１０日の間、試験化合物、ホルスコリンおよびバソプレッシンがすべてのフィード（２日ごと）で加えられた。

位相コントラスト画像は２日ごとに２０日間Ｍｏｔｉｃ顕微鏡（ｘ２００拡大）で得られた。１つの条件当たり、１０のイメージがが撮られ（二度ずつ）、平均包嚢半径を測定した。

本発明の化合物は、濃度依存性の態様でＭＤＣＫ細胞の生体外の嚢胞形成を反転した。例Ａについての２０日目の位相コントラスト画像、および包嚢半径を図８に示す。

実験５：
ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞の増殖の抑制
この研究では、前立腺癌の治療でのＰＤＥ４長鎖形体活性化体の潜在的な有用性がＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞株を使用して研究された。実験は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら（Henderson, D. J. P., Byrne, A., Dulla, K., Jenster, G., Hoffmann, R., Baillie, G. S., Houslay, M. D. Br. J. Cancer 110: 1278-1287, 2014）によって記述された方法によって実行された。

ＬＮＣａＰ細胞培養
アンドロゲン感受性（ＡＳ）のＬＮＣａＰ細胞は、１０％のＦＢＳ（Ｓｅｒａｌａｂｓ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１，０００Ｕペニシリン−ストレプトマイシンで補われたＲＰＭＩ１６４０の中で維持された。ＬＮＣａＰのアンドロゲン非感受性（ＡＩ）細胞は、１０％のチャコールストリップされたＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１，０００Ｕペニシリン−ストレプトマイシンで補われたＲＰＭＩ１６４０の中のＬＮＣａＰ−ＡＳ細胞の、最低４週間のインキュベートによりインハウスで生成された。すべての組織培養試薬はライフ・テクノロジーズから得られた。

Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（Ｒｏｃｈｅ）増殖反応測定法
細胞増殖は電気的なインピーダンスの変化の関数として測定される。値は、細胞指数（細胞ステータスを表わす測定の無次元のユニット）によって表わされる。値の増加は、９６−ウエル電極プレートに接着し分割するにつれて増加する。ＬＮＣａＰ ＡＩ／ＡＳ細胞は２５，０００個／ウエルの細胞密度で、９６−ウエル電極プレート内に、試験化合物の様々な濃度での存在下または非存在下で置かれた（実験は３回）。

細胞指数（cell index number）は１０分ごとに１００時間まで測定され、ＲＴＣＡソフトウェアを使用して、分析され、ビヒクル処理された細胞（ｎ＝３）の細胞インデックスに規格化された。アンドロゲン感受性（ＡＳ）のＬＮＣａＰのヒト前立腺癌細胞の増殖に対する例Ａの影響は、図９に示される。アンドロゲン非感受性（ＡＩ）のＬＮＣａＰのヒト前立腺癌細胞の増殖に対する例Ａの影響は、図１０に示される。

実験６：
ヒト肝細胞を使用する例Ａの生体外のクリアランスの測定
ヒト肝細胞安定性は、薬の肝臓の代謝を生体外で評価するゴールドスタンダード方法と考えられる。例Ａの生体外のクリアランスは、小さな修正をされたＬａｕら（Lau, Y. Y. et al. Drug Metab. Dispos. 30: 1446-1454, 2002）の方法によって凍結保存されたヒト肝細胞を使用して評価された。

凍結保存された肝細胞は、３７℃で水浴中で溶かされ、５０ｍｌの肝細胞溶解メディアを含むチューブに転送された。肝細胞は３分間５００毎分回転数で遠心分離機にかけられた。上澄みは除去された。また、肝細胞はメディア中で再懸濁され、優しく混合され、３分間５００毎分回転数で再び遠心分離機にかけられた。上澄みは廃棄された。また、肝細胞ペレットは、２００万個の細胞／ｍｌの最終密度へメディア中で優しく再懸濁された。

インキュベーションは１μＭの最終の試験化合物濃度で実行された。化合物の原液はＤＭＳＯの中で調製され、希望の濃度に薄められ、肝細胞を加えた。インキュベーションは１００万個の細胞／ｍｌの肝細胞濃度で実行された。サンプル（１００μＬ）は、０、１５、３０、６０および１２０分間、３７℃でインキュベートされた（実験は２回）。インキュベート時間の終わりに、内部標準を含むアセトニトリルの２００μｌが加えられ、ウェルが密閉された。サンプルは２分間超音波で処理され、１０分間６０００毎分回転数で遠心分離機にかけられた。また、上澄みの５０μＬがＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析のために超純水５０μＬを含む９６ウエルプレートに移された。

サンプルはＳｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００（登録商標）システムを使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析された。この分析中の例Ａの半減期は５４分であり、例Ａが人間の肝細胞において適度に安定していることを示す。

実験７：オスのＣ５７ハツカネズミ中の例Ａの薬物動態学のプロフィール
１ｍｇ／ｍＬの透明な薬剤溶液を与えるために、例Ａは、５％のＤＭＡ＋１０％のＳｏｌｕｔｏｌ＋８５％（水の中の１０％のＨＰＢＣＤ）に溶かされた。薬剤溶液は、２ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖで３匹のハツカネズミに尾静脈から適用された。経口の胃管栄養による１０ｍｇ／ｋｇのｐ．ｏ．によりさらに３匹のハツカネズミに適用された。血液サンプル（約２０μＬ）は、ｉ．ｖ投与後の２、５および２０分、１、２、４、８および１２時間後に集められた。また経口服用後の、１５および３０分、１、２、４、８、１２および２４時間後に集められた。血液サンプルは蒸留水の３倍体積で薄められ、分析まで−８０℃で格納された。サンプルはＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＡＰＩ ５５００）によって分析された。

例Ａは、経口服用の後の４．９時間、ｉ．ｖ後の４．２時間のターミナルの半減期を示し、オスのＣ５７ハツカネズミにおいて６６％の経口の生体有用性を示した。異常な結果はハツカネズミで観察されなかった。ｉ．ｖ後およびｐ．ｏ．後の例Ａの平均全血濃度−時間プロフィールは、
図１１に示される。

実験８：オスＳＤラット中の例Ａの薬物動態学のプロフィール
１ｍｇ／ｍＬの透明な薬剤溶液を与えるために、例Ａは、５％のＤＭＡ＋１０％のＳｏｌｕｔｏｌ＋８５％（食塩水中の１０％のＨＰＢＣＤ）に溶かされた。薬剤溶液は、２ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖで３匹のラットに足背部静脈から適用された。また経口胃管栄養により１０ｍｇ／ｋｇのｐ．ｏ．でさらに３匹のラットに経口投与された。血液サンプル（約１５０μＬ）は、ｉ．ｖ投与後の２、５および２０分、１、２、４、８および１２時間後に集められた。また経口服用後の、５、１５および３０分、１、２、４、８、１２および２４時間後に集められた。血液サンプルは、サンプル採取の１５分以内に４℃（２０００ｇ、５分）で遠心分離機にかけられ、血漿サンプルを得た。血漿サンプルは分析まで−８０℃で格納された。サンプルはＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＡＰＩ ４０００）によって分析された。

例Ａは、経口服用の後の９．１時間、ｉ．ｖ後の２．２時間のターミナルの半減期を示し、オスのオスのＳＤラットにおいて１００％の経口の生体有用性を示した。異常な結果はラットで観察されなかった。ｉ．ｖの後およびｐ．ｏ．の後の例Ａの平均の血漿濃度−時間プロファイルは、図１２に示される。

実験９：本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたＯＸ１６１細胞の生体外の嚢胞形成の抑制
この研究では、人間のＡＤＰＫＤ患者由来（ＯＸ１６１）の細胞株が、生体外の腎臓包嚢の形成に対するＰＤＥ４長鎖形体活性化体の影響を調査し、腎多嚢胞病の治療でのそれらの可能性を評価するために使用された。ヒト不死化ＯＸ１６１の嚢胞性の管状の上皮細胞（）は、臨床の適応のためにＰＫＤ１（ＰＣ１）突然変異を持ったＡＤＰＫＤ患者から取り出された人間の腎臓から生成された（Parker, E., Newby, L. J., Sharpe, C. C., Rossetti, S., Streets, A. J., Harris, P. C., O’Hare, M. J., Ong, A. C. M. Kidney Int. 72(2): 157-165, 2007）。

ＯＸ１６１細胞（５０，０００細胞／ウエル）は、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、２ｍＭの Ｌ−グルタミン、２ｍＭの Ｌ−グルタミン、１，０００Ｕのペニシリンおよび１，０００μｇのストレプトマイシン（ＤＭＥＭ−２％ＦＢＳ）で補われた、ＤＭＥＭ中の１７ｍＭのＮａＯＨを含む氷上のコラーゲン（Life Technologies；終末濃度１ｍｇ／ｍＬ）へシードされた。３７℃でゲル化する際、ＤＭＥＭ−２％ＦＢＳの１ ｍＬが、１０のμＭホルスコリンが存在する状態で示された試験化合物と共に加えられた。メディアは２日ごとに１０日間補充された；すべてのフィードでは、試験化合物とホルスコリンが加えられた。

位相コントラスト画像は２日ごとに１０日間得られた。１つの症状当たり、１０のイメージが得られた（二重反復試験で）。また、平均包嚢エリアを計算した。

例Ａは、濃度依存の態様でＯＸ１６１細胞の生体外の嚢胞形成を阻害した。例Ａについての１０日目の位相コントラスト画像、および包嚢エリア・グラフは図１３（パネルＡ）に示される。

実験１０：本発明のＰＤＥ４長鎖形体活性化体で処理されたＯＸ１６１細胞の生体外の嚢胞形成の反転
この研究では、あらかじめ形成された包嚢の形成を反転する、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体の可能性が、ヒトＡＤＰＫＤの患者由来のＯＸ１６１細胞株で評価された。実験は実験９の方法によって実行された。最初の１０日の間、ホルスコリンはすべてのフィード（２日ごと）で加えられた。しかし、試験化合物は加えられなかった。次の１０日の間、試験化合物とホルスコリンはすべてのフィード（２日ごと）で加えられた。

位相コントラスト画像は２日ごとに２０日間撮られた。１つの症状当たり、１０のイメージが得られた（二重反復試験で）。また、平均包嚢エリアが計算された。例Ａは、濃度依存性の態様でＯＸ１６１細胞の生体外の嚢胞形成を反転した。例Ａについての２０日目の位相コントラスト画像、および包嚢エリア・グラフは図１３（パネルＢ）に示される。

表１：本発明にかかる、式−１および式−２（例Ａ−Ｌ）の新規な小分子ＰＤＥ４長鎖形体活性化体

実験１に述べられていた方法を使用して、表１に示される化合物は、ＰＤＥ４長鎖形体活性化体であると確認された。

表２：例Ａ−ＬによるＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４の長鎖形体の活性化
実験１に述べられた方法を使用して、次の濃度／ＰＤＥ４Ｄ５活性データが例Ａ−Ｌで得られた。データは図１のグラフに示される。

＊ 追加化合物のないベースの活性に対するカウントの平均増加％として測定された（ｎ＞＝２）。

表３：例ＡによるＰＤＥ４Ａ４、ＰＤＥ４の別の長鎖形体の活性化
実験１に述べられた方法を使用して、次の濃度／ＰＤＥ４Ａ４活性データが例Ａについて得られた。データは図２のグラフに示される。

＊ 追加化合物のないベースの活性に対するカウントの平均増加％として測定された（ｎ＞＝２）。

表４：例ＡによるＰＤＥ４Ｂ１、ＰＤＥ４の別の長鎖形体の活性化
実験１に述べられた方法を使用して、次の濃度／ＰＤＥ４Ｂ１活性データが例Ａについて得られた。 データは図３のグラフに示される。

＊ 追加化合物のないベースの活性に対するカウントの平均増加％として測定された（ｎ＞＝２）。

Claims (18)

1. 式−１の化合物：
   
   あるいはその薬学的に受理可能な塩、
   式中、Ｒ^１は、Ｈ、（Ｃ１−４）アルキルまたは（Ｃ１−４）アルキルオキシであり、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
   Ｒ^２およびＲ^６は、独立にＨ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、ＣＮおよびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
   Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立にＨ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
   Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^１０およびＲ^１１は、ＨとＦから独立して選ばれる；
   Ｒ^９はＨ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
   Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５は、独立にＨ、および（Ｃ１−４）アルキルから選択される；
   Ｒ^１６およびＲ^１７は、存在する場合にはそれぞれ、Ｈおよび（Ｃ１−４）アルキルから独立して選択される。
2. Ｒ^７およびＲ^１１はＨであり、および／またはＲ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５がＨであり、および／またはＲ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５はＨであり、Ｒ^９は（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される、請求項１記載の化合物またはその薬学的に受理可能な塩。
3. Ｒ^９は（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される、請求項１または２記載の化合物またはその薬学的に受理可能な塩。
4. Ｒ^１はＨ、メチルまたはメトキシである、請求項１から３のいずれか１項記載の化合物またはその薬学的に受理可能な塩。
5. Ｒ^２およびＲ^６は各々独立にＨとハロゲンから選ばれ、任意にＨおよびフルオロから選ばれる、請求項１から４のいずれか１項記載の化合物またはその薬学的に受理可能な塩。
6. Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立にＨ、ハロゲン、ＣＮ、（Ｃ１−４）アルキル、および（Ｃ１−４）アルキルオキシから選ばれ、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；任意にＲ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立にＨ、フルオロ、クロロ、メトキシ、ＣＮ、トリフルオロメチル、メトキシおよびトリフロオロメトキシから選ばれる、請求項１から５のいずれか１項記載の化合物またはその薬学的に受理可能な塩。
7. Ｒ^９はメチル、クロロ、およびトリフルオロメトキシから選ばれる、請求項１から６のいずれか１項記載の化合物またはその薬学的に受理可能な塩。
8. ａ． Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨであり、他方はフルオロである；
   ｂ． Ｒ^８とＲ^１０は両方ともＨである；または
   ｃ． Ｒ^９はクロロであり、Ｒ^８とＲ^１０のうちの１つはＨであり、Ｒ^８とＲ^１０の他方はフルオロである、請求項１から７のいずれか１項記載の化合物またはその薬学的に受理可能な塩。
9. 以下から選ばれた請求項１記載の化合物
   Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−ベンジル−２−［３−（４−クロロフェニル）−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−ベンジル−２−［３−（４−クロロフェニル）−５−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−（３−フルオロベンジル）−２−｛３−［４−（トリフルオロメトキシ）−フェニル］−５−メトキシメチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル｝アセトアミド、
   Ｎ−（３−クロロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−（３−シアノベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−［３−（トリフルオロメチル）ベンジル］−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−（３−メトキシベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−［３−（トリフルオロメトキシ）ベンジル］−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−（２−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−（４−フルオロベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−２−［３−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−５−エチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル］アセトアミド、
   またはその薬学的に受理可能な塩類。
10. 請求項１から９のいずれか１項記載の化合物またはその薬学的に受理可能な塩、および薬学的に受理可能な補形薬を含む医薬品組成物。
11. 療法で使用される請求項１から９のいずれか１項記載の化合物、またはその薬学的に受理可能な塩。
12. 細胞内の環式ＡＭＰ過剰シグナリングにより媒介される疾病または病気の治療または予防のために使用される、請求項１から９のいずれか１項記載の化合物、またはその薬学的に受理可能な塩。
13. 式−２の化合物あるいはその薬学的に受理可能な塩である、療法で使用される化合物：
    
    
    式中、Ｒ^１は、Ｈ、（Ｃ１−６）アルキルまたは（Ｃ３−７）シクロアルキルであり、該（Ｃ１−６）アルキルおよび（Ｃ３−７）シクロアルキルは任意に、ＯＨ、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、ＣＮおよびハロゲンから選択される１−３の置換基で置換される；
    Ｒ^２およびＲ^６は、独立に、Ｈ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
    Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、独立して、Ｈ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、ＣＮおよびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
    Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^１０およびＲ^１１は、ＨとＦから独立して選ばれる；
    Ｒ^９はＨ、（Ｃ１−４）アルキル、（Ｃ１−４）アルキルオキシ、（Ｃ１−４）アルキルスルホニル、Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^１６Ｒ^１７、Ｃ（Ｏ）−ＯＲ^１６、Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^１６Ｒ^１７、ＣＮ、およびハロゲンから選択され、該（Ｃ１−４）アルキルおよび（Ｃ１−４）アルキルオキシは１〜３のフルオロで任意に置換される；
    Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４およびＲ^１５は、独立にＨ、および（Ｃ１−４）アルキルから選択される；
    Ｒ^１６およびＲ^１７は、存在する場合にはそれぞれ、Ｈおよび（Ｃ１−４）アルキルから独立して選択される。
14. 療法が細胞内環式ＡＭＰ過剰シグナリングにより媒介される疾病または病気の治療または予防である、請求項１３記載の使用のための化合物。
15. 細胞内環式ＡＭＰ過剰シグナリングが以下により引き起こされる、請求項１２から１４のいずれか１項記載の、使用のための化合物：
    ａ． 腺腫によって生産された過度のホルモンレベル、
    ｂ． Ｇタンパク質と組み合わされたレセプター（ＧＰＣＲ）中の機能獲得型の遺伝子突然変異；
    ｃ． Ｇタンパク質Ｇｓのα−サブユニットをコード化する、ＧＮＡＳ１遺伝子内の活性化突然変異；または
    ｄ．細菌毒素。
16. 病気は癌である、請求項１２から１５のいずれか１項記載の、使用のための化合物。
17. 癌は前立腺癌である、請求項１６記載の、使用のための化合物。
18. 病気は以下である、請求項１２から１５のいずれか１項記載の、使用のための化合物：
    ａ． 下垂体腺腫、クッシング病、腎多嚢胞病または多嚢胞性肝疾患；
    ｂ． 甲状腺機能亢進症、ヤンセン骨幹端軟骨異形成症、上皮小体機能亢進症または家族性男性限定性早熟症；
    ｃ． マックーン−オルブライト症候群；
    ｄ． コレラ、百日咳、炭疽菌または結核；
    ｅ． ＨＩＶ、ＡＩＤＳまたは分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）；
    ｆ． 黒色腫、膵臓癌、白血病、前立腺癌、副腎皮質の腫瘍、精巣癌、原発性色素性結節状副腎皮質病変（ＰＰＮＡＤ）またはカ−ニ−複合；
    ｇ． 常染色体優性多発性嚢胞腎症（ＡＤＰＫＤ）または常染色体劣性多発性嚢胞腎症（ＡＲＰＫＤ）；
    ｈ．ヤングタイプ５の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ５）；または
    ｉ． 心臓肥大。