JP6479974B2

JP6479974B2 - 大規模エクリズマブ産生細胞培養を再現する方法

Info

Publication number: JP6479974B2
Application number: JP2017519880A
Authority: JP
Inventors: ハンターエフ．マランソン，; プラティクジャルリア，
Original assignee: アレクシオンファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2014-10-15
Filing date: 2015-10-13
Publication date: 2019-03-06
Anticipated expiration: 2035-10-13
Also published as: EP3207121A1; JP2017534274A; ES2719876T3; US20160108112A1; TR201903267T4; US20200172606A1; US11104726B2; WO2016061066A1; US10544209B2; EP3207121B1

Description

関連出願
この出願は、２０１４年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０６４，４５７号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権および利益を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年９月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＸＪ−１９７ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは６，２７４バイトである。

本発明は、細胞培養および組換えタンパク質の製造の方法に関する。

エクリズマブは、ヒト補体成分５（Ｃ５）に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体である。エクリズマブは、発作性夜間血色素尿症および非定型溶血性尿毒症症候群を処置するためにＦＤＡによって承認された。エクリズマブは、典型的には、大規模（１０，０００Ｌ）流加哺乳動物細胞培養を使用して産生される。

産生細胞培養の小規模モデルは、培養培地もしくは培地成分および／または哺乳動物細胞株を、大規模産生細胞培養でこれらを使用する前に試験するための手段を提供する。産生細胞培養の小規模モデルは、培養培地もしくは培地成分および／または哺乳動物細胞株を、大規模産生細胞培養でこれらを使用する前に汚染について試験するための手段も提供する。エクリズマブ産生プロセスの小規模モデルの必要性が存在する。

本発明は、小規模流加細胞培養を使用して大規模エクリズマブ産生細胞培養の正確な再現を可能にする一連の培養パラメーターの発見に少なくとも部分的に基づく。したがって、本明細書は、小規模流加細胞培養を使用して大規模エクリズマブ産生細胞培養を再現する方法を含む。

小規模培養において大規模エクリズマブ産生細胞培養を再現する方法であって、バイオリアクターの容量の約７０％から約９０％の間を占め、約２．５×１０^５から約７．５×１０^５ＮＳ０細胞／ｍＬの間の初期細胞密度を有する第１の培養培地を含有する４Ｌ〜１０Ｌのバイオリアクター（流加バイオリアクターなど）を提供するステップであって、細胞が組換えエクリズマブをコードする核酸を含有する、ステップ；バイオリアクター中で細胞を約１４％〜約１６％の間のｄＯ_２レベル、および約５０ＲＰＭから約７０ＲＰＭの間の回転撹拌で、約３４℃〜約３９℃で少なくとも８日間、培養する（流加培養するなど）ステップ；約１３×１０^５〜約２０×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、流加培養を維持する（例えば、継続する）ステップ；次いで（１）約１２０時間〜約１５０時間の期間にわたってフィード培養培地を第１の培養培地に連続的に添加するステップ；そしてフィード培養培地の連続的添加をスタートしてから約４０〜６０時間後に、（２）約９０時間〜約１０５時間の間の期間にわたってアルカリ塩基溶液を第１の培養培地に連続的に添加するステップを含む方法が本明細書に提供される。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地およびフィード培養培地の一方または両方は、処理済みウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、処理済みＮｅｗＺｅａｌａｎｄＢＳＡである。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、初期細胞密度は、約４．０×１０^５細胞／ｍＬから約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、バイオリアクターは、約４Ｌ〜約６Ｌの間の容量を有する。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、第１の培養培地は、バイオリアクターの容量の約８０％〜約８８％の間を占める。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、流加培養は、約３６℃〜約３７℃の温度で実施される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、回転撹拌は、約５５ＲＰＭから約６５ＲＰＭの間である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的細胞密度は、約１７×１０^５細胞／ｍＬから約１９×１０^５細胞／ｍＬの間である。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、アルカリ塩基溶液は、約９２時間〜約１００時間の間の期間にわたって第１の培養培地に連続的に添加される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、バイオリアクターは、第１の培養培地４．２Ｌを含有し、アルカリ塩基溶液は、約１．６５ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間の速度で第１の培養培地に連続的に添加される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、アルカリ塩基溶液は、約０．６５Ｍから約０．８５Ｍの間の炭酸ナトリウム、および約０．４Ｍから約０．６Ｍの間の炭酸水素ナトリウムを含む。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、単一のフィード培養培地は、第１の培養培地に連続的に添加される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、２種の異なるフィード培養培地は、第１の培養培地に連続的に添加される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、２種の異なるフィード培養培地のそれぞれは、約１５μＬ／分〜約３５μＬ／分の間の速度で第１の培養培地に連続的に添加される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、２種の異なるフィード培養培地のそれぞれは、約２０μＬ／分〜約２５μＬ／分の間の速度で第１の培養培地に連続的に添加される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、フィード培養培地は、約１３０時間〜約１３５時間の間の期間にわたって第１の培養培地に連続的に添加される。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、細胞が約１３×１０^５細胞／ｍＬ〜約２０×１０^５細胞／ｍＬの密度に到達する時点で、第１の培養培地にリノール酸、オレイン酸、およびコレステロールを含む脂質溶液のボーラスを添加することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、脂質溶液は、第１の培養培地１Ｌ当たり約１ｍＬの用量で添加される。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、培養中に第１の培養培地に消泡剤を添加することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、培養するステップで産生される組換えエクリズマブを収集することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、収集することは、細胞を溶解させることを含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、組換えエクリズマブは、第１の培養培地およびフィード培養培地の一方または両方から収集される。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、エクリズマブは、配列番号１を含み、またはそれからなる重鎖、および配列番号２を含み、またはそれからなる軽鎖を含む。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、細胞増殖、百分率細胞生存度、生存細胞密度、好気性グルコース消費量、エクリズマブ力価、比産生率（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｒａｔｅ）、容積産生率（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｒａｔｅ）、乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）産生、およびエクリズマブ品質の群より選択される１つまたは複数の細胞培養パラメーターを評価することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、決定された１つまたは複数の細胞培養パラメーターを、大規模エクリズマブ産生細胞培養における同じ１つまたは複数の細胞培養パラメーターと比較することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、大規模のエクリズマブ産生細胞培養は、１０，０００Ｌ−エクリズマブ産生細胞培養である。
特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
小規模培養において大規模エクリズマブ産生細胞培養を再現する方法であって、
バイオリアクターの容量の約７０％から約９０％の間を占め、約２．５×１０ ^５から約７．５×１０ ^５ＮＳ０細胞／ｍＬの間の初期細胞密度を有する第１の培養培地を含有する４Ｌ〜１０Ｌの流加バイオリアクターを提供するステップであって、前記細胞が組換えエクリズマブをコードする核酸を含む、ステップ；
前記バイオリアクター中で前記細胞を約１４％〜約１６％の間のｄＯ _２レベル、および約５０ＲＰＭから約７０ＲＰＭの間の回転撹拌で、約３４℃〜約３９℃で少なくとも８日間、培養するステップ；
約１３×１０ ^５〜約２０×１０ ^５細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、流加培養を維持するステップ、次いで；
（１）約１２０時間〜約１５０時間の期間にわたって前記フィード培養培地を前記第１の培養培地に連続的に添加するステップ、そしてフィード培養培地の連続的添加をスタートしてから約４０〜６０時間後に
（２）約９０時間〜約１０５時間の間の期間にわたってアルカリ塩基溶液を前記第１の培養培地に連続的に添加するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記第１の培養培地および前記フィード培養培地の一方または両方が、処理済みウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記処理済みＢＳＡが、処理済みＮｅｗＺｅａｌａｎｄＢＳＡである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記初期細胞密度が、約４．０×１０ ^５細胞／ｍＬから約６．０×１０ ^６細胞／ｍＬの間である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記バイオリアクターが、約４Ｌ〜約６Ｌの間の容量を有する、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記第１の培養培地が、前記バイオリアクターの容量の約８０％〜約８８％の間を占める、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記流加培養が、約３６℃〜約３７℃の温度で実施される、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記回転撹拌が、約５５ＲＰＭから約６５ＲＰＭの間である、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
標的細胞密度が、約１７×１０ ^５細胞／ｍＬから約１９×１０ ^５細胞／ｍＬの間である、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記アルカリ塩基溶液が、約９２時間〜約１００時間の間の期間にわたって前記第１の培養培地に連続的に添加される、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記バイオリアクターが、前記第１の培養培地４．２Ｌを含み、前記アルカリ塩基溶液が、約１．６５ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間の速度で前記第１の培養培地に連続的に添加される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記アルカリ塩基溶液が、約０．６５Ｍから約０．８５Ｍの間の炭酸ナトリウム、および約０．４Ｍから約０．６Ｍの間の炭酸水素ナトリウムを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
単一のフィード培養培地が、前記第１の培養培地に連続的に添加される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
２種の異なるフィード培養培地が、前記第１の培養培地に連続的に添加される、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記２種の異なるフィード培養培地のそれぞれが、約１５μＬ／分〜約３５μＬ／分の間の速度で前記第１の培養培地に連続的に添加される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記２種の異なるフィード培養培地のそれぞれが、約２０μＬ／分〜約２５μＬ／分の間の速度で前記第１の培養培地に連続的に添加される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記フィード培養培地が、約１３０時間〜約１３５時間の間の期間にわたって前記第１の培養培地に連続的に添加される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞が約１３×１０ ^５細胞／ｍＬ〜約２０×１０ ^５細胞／ｍＬの密度に到達する時点で、前記第１の培養培地にリノール酸、オレイン酸、およびコレステロールを含む脂質溶液のボーラスを添加するステップをさらに含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記脂質溶液が、前記第１の培養培地１Ｌ当たり約１ｍＬの用量で添加される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
培養中に前記第１の培養培地に消泡剤を添加するステップをさらに含む、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記培養するステップで産生された前記組換えエクリズマブを収集するステップをさらに含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
収集するステップが、前記細胞を溶解させることを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
組換えエクリズマブが、前記第１の培養培地および前記フィード培養培地の一方または両方から収集される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
エクリズマブが、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
エクリズマブが、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
細胞増殖、百分率細胞生存度、生存細胞密度、好気性グルコース消費量、エクリズマブ力価、比産生率、容積産生率、乳酸産生、およびエクリズマブ品質からなる群より選択される１つまたは複数の細胞培養パラメーターを評価するステップをさらに含む、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
決定された前記１つまたは複数の細胞培養パラメーターを、大規模エクリズマブ産生細胞培養における同じ１つまたは複数の細胞培養パラメーターと比較するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記大規模エクリズマブ産生細胞培養が、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養である、項目２７に記載の方法。

本明細書で使用する場合、名詞の前の単語「１つの（ａ）」または「複数の」は、１つまたは複数のその特定の名詞を示す。例えば、語句「哺乳動物細胞」は、「１つまたは複数の哺乳動物細胞」を示す。

用語「処理済みＢＳＡ」または「処理済みウシ血清アルブミン」は、本明細書に記載される方法によって生成されたウシ血清アルブミンを指す。例えば、処理済みＢＳＡを生成するために使用される方法は、血清アルブミンを含む溶液を加熱すること、血清アルブミンを含む溶液に安定剤を添加すること、および再構成された凍結乾燥血清アルブミンを含む溶液から不純物を沈殿させることを含まない。一部の例では、処理済みＢＳＡを生成するために使用される方法は、ウシ由来の血漿を提供することからスタートする。処理済みＢＳＡを生成するために使用することができる非限定的な方法は、本明細書に記載されている。

用語「処理済みＮＺＢＳＡ」または「処理済みＮｅｗＺｅａｌａｎｄＢＳＡ」は、ニュージーランドで繁殖および飼育されたウシ由来の血清アルブミンを含む本明細書に定義した処理済みＢＳＡを指す。処理済みＮＺＢＳＡの非限定的な例は、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＮＺＢＳＡである。

用語「エクリズマブ産生細胞培養」は、医薬組成物の製造に主に使用される組換えエクリズマブを産生させるために使用される大規模培養を指す。産生細胞培養は、少なくとも５００Ｌ、例えば、約１，０００Ｌもしくは少なくとも１，０００Ｌ、約２，０００Ｌもしくは少なくとも２，０００Ｌ、約３，０００Ｌもしくは少なくとも３，０００Ｌ、約４，０００Ｌもしくは少なくとも４，０００Ｌ、約５，０００Ｌもしくは少なくとも５，０００Ｌ、約６，０００Ｌもしくは少なくとも６，０００Ｌ、約７，０００もしくは少なくとも７，０００Ｌ、約８，０００Ｌもしくは少なくとも８，０００Ｌ、約９，０００Ｌもしくは少なくとも９，０００Ｌ、または約１０，０００Ｌもしくは少なくとも１０，０００Ｌの容積を有し得る。

用語「産生バイオリアクター」とは、本明細書で使用する場合、培養物中の哺乳動物細胞の増殖および培養物中の哺乳動物細胞による組換えタンパク質産物の産生に十分な条件下で、哺乳動物細胞培養物をインキュベートするために適切な容器を指す。。産生バイオリアクターの例は、当技術分野で公知である。

用語「哺乳動物細胞」とは、例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、ハムスターまたはウサギを含む任意の哺乳動物由来のまたはかかる哺乳動物から誘導された、任意の細胞を指す。一部の実施形態では、この哺乳動物細胞は、不死化細胞、分化細胞または未分化細胞であり得る。

用語「実質的に含まない」とは、本明細書で使用する場合、特定の物質（例えば、液体培養培地由来または哺乳動物細胞の溶解物由来の混入タンパク質）を、少なくとも９０％もしくは約９０％含まない、または約９５％、９６％、９７％、９８％含まない、または少なくとも９９％もしくは約９９％含まない、または約１００％含まない組成物（例えば、医薬組成物）を指す。

用語「培養」または「細胞培養」とは、本明細書で使用する場合、物理的条件の制御されたセットの下での、液体培養培地中での哺乳動物細胞の維持または増殖を指す。

用語「液体培養培地」または「培養培地」とは、哺乳動物細胞を培地中でｉｎｖｉｔｒｏで増殖させるのに十分な栄養素を含有する流体を指す。例えば、液体培養培地は、以下のうち１つまたは複数を含み得る：アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、セレンおよび他の必要な微量金属、ならびに炭酸水素ナトリウム。液体培養培地は、哺乳動物由来の血清を含み得る。一部の場合には、液体培養培地は、哺乳動物由来の血清も別の抽出物も含有しない（化学的に規定された液体培養培地）。液体培養培地は、微量金属、哺乳動物成長ホルモンおよび／または哺乳動物増殖因子を含有し得る。液体培養培地の非限定的な例は、本明細書に記載されており、さらなる例は、当技術分野で公知であり、市販されている。

用語「動物由来成分を含まない液体培養培地」とは、動物由来の任意の成分（例えば、タンパク質または血清）を含有しない液体培養培地を意味する。

用語「無血清液体培養培地」とは、動物血清を含有しない液体培養培地を指す。

用語「血清添加された液体培養培地」とは、動物血清を含む液体培養培地を指す。

用語「化学的に規定された液体培養培地」とは、化学的成分の実質的に全てが既知である液体培養培地を指す。例えば、化学的に規定された液体培養培地は、胎仔ウシ血清もウシ血清アルブミンもヒト血清アルブミンも含有しないが、それは、これらの調製物が、典型的には、アルブミンおよび脂質の複雑な混合物を含有するためである。

用語「無タンパク質液体培養培地」とは、いずれのタンパク質（例えば、いずれの検出可能なタンパク質）も含有しない液体培養培地を意味する。

「回転撹拌」とは、当技術分野で周知の用語であり、例えば、バイオリアクター中の培養物における溶存Ｏ_２濃度を増加させるための、例えば、時計回りまたは反時計回りの、概して円形の様式での、バイオリアクター（例えば、産生バイオリアクター）中での培養物の撹拌を指す。撹拌は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、円形または楕円形の動きで培養物を動かす装置、例えば、インペラを使用して、実施され得る。回転撹拌を実施するために使用され得る例示的なデバイスは、当技術分野で公知であり、市販されている。

用語「精製する」または「精製」とは、特定の文脈では、液体培養培地または細胞培養溶解物中に存在する１つまたは複数の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のタンパク質）から、組換えタンパク質を少なくとも部分的に単離することを意味する。精製の程度は、重量で少なくとも５％もしくは約５％、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％〜９９．９％もしくは約９５％〜９９．９％純粋であるなど、特定され得る。液体培養培地からまたは哺乳動物細胞溶解物からタンパク質を精製するための非限定的な方法は、本明細書に記載されており、その他は、当技術分野で公知である。

用語「流加細胞培養（ｆｅｄｂａｔｃｈｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ）」または「流加培養（ｆｅｄｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」は、細胞培養物からの液体培養培地の実質的なまたは著しい除去を伴わない初期細胞培養物へのフィード培養培地（例えば、液体または固体培養培地）の漸増的または連続的添加を意味する。一部の場合には、フィード培養培地は、培養期間の開始時に培養物中に存在する第１の液体培養培地と同じである。他の場合には、フィード培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態であり、かつ／または乾燥粉末として添加される。流加培養の一部の例では、２種の異なるフィード培養培地が初期細胞培養物に添加される。

「比産生率」または「ＳＰＲ」とは、本明細書で使用する場合、１日当たり哺乳動物細胞当たりの産生された組換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え抗体についてのＳＰＲは、通常、質量／細胞／日として測定される。組換え酵素についてのＳＰＲは、通常、単位／細胞／日または（単位／質量）／細胞／日として測定される。

「容積産生率（ｖｏｌｕｍｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｒａｔｅ）」または「ＶＰＲ」とは、本明細書で使用する場合、１日当たり培養物の容積当たり（例えば、バイオリアクター、容器またはチューブ容積の１Ｌ当たり）の産生された組換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え抗体についてのＶＰＲは、通常、質量／Ｌ／日として測定される。組換え酵素についてのＶＰＲは、通常、単位／Ｌ／日または質量／Ｌ／日として測定される。

特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されている；当技術分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定として解釈されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から、明らかである。

図１は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の薄い実線）および以前の５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の濃い実線）における時間をわたっての乳酸の平均濃度（実線）を示すグラフである。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図２は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の薄い実線）および以前の５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の濃い実線）における時間をわたってのナトリウムの平均濃度（実線）を示すグラフである。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図３は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の薄い実線）および以前の５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の濃い実線）における時間をわたっての平均オフラインｐＨ（ｏｆｆｌｉｎｅｐＨ）を示すグラフである。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図４は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の濃い実線）および以前の５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の薄い実線）における時間をわたっての平均生存細胞密度を示すグラフである。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図５は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の濃い実線）および本明細書に記載される方法を使用して培養した５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の薄い実線）における時間をわたっての平均生存細胞密度を示すグラフである（ｎ＝４０）。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図６は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の濃い実線）および以前の５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の薄い実線）における時間をわたっての平均百分率細胞生存度を示すグラフである。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図７は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の濃い実線）および本明細書に記載される方法を使用して培養した５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の薄い実線）における時間をわたっての平均百分率細胞生存度を示すグラフである（ｎ＝４０）。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図８は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の濃い実線）および以前の５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の薄い実線）における時間をわたってのエクリズマブの力価を示すグラフである。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図９は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の濃い実線）および本明細書に記載される方法を使用して培養した５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の薄い実線）における時間をわたってのエクリズマブの力価を示すグラフである（ｎ＝４０）。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図１０は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の濃い実線）および以前の５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の薄い実線）における時間をわたってのグルコース濃度を示すグラフである。破線は、データの±１標準偏差を表す。

図１１は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養（黒の濃い実線）および本明細書に記載される方法の間に培養した５Ｌエクリズマブ小規模培養（黒の薄い実線）における時間をわたってのグルコース濃度を示すグラフである（ｎ＝４０）。破線は、データの±１標準偏差を表す。

小規模培養で大規模エクリズマブ産生細胞培養を再現する方法が本明細書に提供される。これらの方法は、バイオリアクターの容量の約６０％から約９０％の間を占め、約２．０×１０^５から約７．５×１０^５ＮＳ０細胞／ｍＬの間の初期細胞密度を有する第１の培養培地を含有する２Ｌ〜２５Ｌのバイオリアクター（流加バイオリアクターなど）を提供するステップであって、細胞が組換えエクリズマブをコードする核酸を含有する、ステップ；バイオリアクター中で細胞を約１０％〜約２０％の間のｄＯ_２レベル、および約４０ＲＰＭから約８０ＲＰＭの間の回転撹拌で、約３４℃〜約３９℃で少なくとも８日間、培養する（流加培養するなど）ステップ；約１０×１０^５〜約２５×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、流加培養を維持する（例えば、継続する）ステップ；次いで（１）約１００時間〜約１７０時間の期間にわたってフィード培養培地を第１の培養培地に連続的に添加するステップ、そしてフィード培養培地の連続的添加をスタートしてから約５〜８０時間後に（２）約７０時間〜約１０５時間の間の期間にわたってアルカリ塩基溶液を第１の培養培地に連続的に添加するステップを含む。

大規模エクリズマブ産生細胞培養を再現する方法の非限定的な態様を以下に記載する。以下に記載する態様のいずれも、任意の組合せで、または当技術分野で公知の任意の他の要素とともに使用することができる。

バイオリアクター
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて流加培養物を培養するために使用されるバイオリアクターは、約２Ｌと約２５Ｌとの間（例えば、約２Ｌと約２４Ｌとの間、約２Ｌと約２２Ｌとの間、約２Ｌと約２０Ｌとの間、約２Ｌと約１８Ｌとの間、約２Ｌと約１８Ｌとの間、約２Ｌと約１６Ｌとの間、約２Ｌと約１４Ｌとの間、約２Ｌと約１２Ｌとの間、約２Ｌと約１０Ｌとの間、約２Ｌと約９Ｌとの間、約２Ｌと約８Ｌとの間、約２Ｌと約７Ｌとの間、約２Ｌと約６Ｌとの間、約２Ｌと約５Ｌとの間、約２Ｌと約４Ｌとの間、約２Ｌと約３Ｌとの間、約３Ｌと約２５Ｌとの間、約３Ｌと約２４Ｌとの間、約３Ｌと約２２Ｌとの間、約３Ｌと約２０Ｌとの間、約３Ｌと約１８Ｌとの間、約３Ｌと約１６Ｌとの間、約３Ｌと約１４Ｌとの間、約３Ｌと約１２Ｌとの間、約３Ｌと約１０Ｌとの間、約３Ｌと約９Ｌとの間、約３Ｌと約８Ｌとの間、約３Ｌと約７Ｌとの間、約３Ｌと約６Ｌとの間、約３Ｌと約５Ｌとの間、約３Ｌと約４Ｌとの間、約４Ｌと約２５Ｌとの間、約４Ｌと約２４Ｌとの間、約４Ｌと約２２Ｌとの間、約４Ｌと約２０Ｌとの間、約４Ｌと約１８Ｌとの間、約４Ｌと約１６Ｌとの間、約４Ｌと約１４Ｌとの間、約４Ｌと約１２Ｌとの間、約４Ｌと約１０Ｌとの間、約４Ｌと約９Ｌとの間、約４Ｌと約８Ｌとの間、約４Ｌと約７Ｌとの間、約４Ｌと約６Ｌとの間、約４Ｌと約５Ｌとの間、約５Ｌと約２５Ｌとの間、約５Ｌと約２４Ｌとの間、約５Ｌと約２２Ｌとの間、約５Ｌと約２０Ｌとの間、約５Ｌと約１８Ｌとの間、約５Ｌと約１６Ｌとの間、約５Ｌと約１４Ｌとの間、約５Ｌと約１２Ｌとの間、約５Ｌと約１０Ｌとの間、約５Ｌと約９Ｌとの間、約５Ｌと約８Ｌとの間、約５Ｌと約７Ｌとの間、約５Ｌと約６Ｌとの間、約６Ｌと約２５Ｌとの間、約６Ｌと約２４Ｌとの間、約６Ｌと約２２Ｌとの間、約６Ｌと約２０Ｌとの間、約６Ｌと約１８Ｌとの間、約６Ｌと約１６Ｌとの間、約６Ｌと約１４Ｌとの間、約６Ｌと約１２Ｌとの間、約６Ｌと約１０Ｌとの間、約６Ｌと約９Ｌとの間、約６Ｌと約８Ｌとの間、約６Ｌと約７Ｌとの間、約８Ｌと約２５Ｌとの間、約８Ｌと約２４Ｌとの間、約８Ｌと約２２Ｌとの間、約８Ｌと約２０Ｌとの間、約８Ｌと約１８Ｌとの間、約８Ｌと約１６Ｌとの間、約８Ｌと約１４Ｌとの間、約８Ｌと約１２Ｌとの間、約８Ｌと約１０Ｌとの間、約８Ｌと約９Ｌとの間、約９Ｌと約２５Ｌとの間、約９Ｌと約２４Ｌとの間、約９Ｌと約２２Ｌとの間、約９Ｌと約２０Ｌとの間、約９Ｌと約１８Ｌとの間、約９Ｌと約１６Ｌとの間、約９Ｌと約１４Ｌとの間、約９Ｌと約１２Ｌとの間、約９Ｌと約１０Ｌとの間、約１０Ｌと約２５Ｌとの間、約１０Ｌと約２４Ｌとの間、約１０Ｌと約２２Ｌとの間、約１０Ｌと約２０Ｌとの間、約１０Ｌと約１８Ｌとの間、約１０Ｌと約１６Ｌとの間、約１０Ｌと約１４Ｌとの間、約１０Ｌと約１２Ｌとの間、約１２Ｌと約２５Ｌとの間、約１２Ｌと約２４Ｌとの間、約１２Ｌと約２２Ｌとの間、約１２Ｌと約２０Ｌとの間、約１２Ｌと約１８Ｌとの間、約１２Ｌと約１６Ｌとの間、約１２Ｌと約１４Ｌとの間、約１４Ｌと約２５Ｌとの間、約１４Ｌと約２４Ｌとの間、約１４Ｌと約２２Ｌとの間、約１４Ｌと約２０Ｌとの間、約１４Ｌと約１８Ｌとの間、約１４Ｌと約１６Ｌとの間、約１６Ｌと約２５Ｌとの間、約１６Ｌと約２４Ｌとの間、約１６Ｌと約２２Ｌとの間、約１６Ｌと約２０Ｌとの間、約１６Ｌと約１８Ｌとの間、約１８Ｌと約２５Ｌとの間、約１８Ｌと約２４Ｌとの間、約１８Ｌと約２２Ｌとの間、約１８Ｌと約２０Ｌとの間、約２０Ｌと約２５Ｌとの間、約２０Ｌと約２４Ｌとの間、約２０Ｌと約２２Ｌまたは約２２Ｌと約２５Ｌとの間）の容量を有し得る。

第１の培養培地
本明細書に提供する方法は、第１の培養培地（例えば、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の例示的なタイプの培養培地のいずれか）を含有するバイオリアクターを提供するステップを含む。バイオリアクター中に存在する第１の培養培地の容積は、バイオリアクターの容量の約６０％と約９０％との間（例えば、約６０％と約８８％との間、約６０％と約８６％との間、約６０％と約８６％との間、約６０％と約８４％との間、約６０％と約８２％との間、約６０％と約８０％との間、約６０％と約７８％との間、約６０％と約７６％との間、約６０％と約７４％との間、約６０％と約７２％との間、約６０％と約７０％との間、約６０％と約６８％との間、約６０％と約６６％との間、約６０％と約６４％との間、約６２％と約９０％との間、約６２％と約８８％との間、約６２％と約８６％との間、約６２％と約８４％との間、約６２％と約８２％との間、約６２％と約８０％との間、約６２％と約７８％との間、約６２％と約７６％との間、約６２％と約７４％との間、約６２％と約７２％との間、約６２％と約７４％との間、約６２％と約７２％との間、約６２％と約７０％との間、約６２％と約６８％との間、約６２％と約６６％との間、約６４％と約９０％との間、約６４％と約８８％との間、約６４％と約８６％との間、約６４％と約８４％との間、約６４％と約８２％との間、約６４％と約８０％との間、約６４％と約７８％との間、約６４％と約７６％との間、約６４％と約７４％との間、約６４％と約７２％との間、約６４％と約７０％との間、約６４％と約６８％との間、約６８％と約９０％との間、約６８％と約８８％との間、約６８％と約８６％との間、約６８％と約８４％との間、約６８％と約８２％との間、約６８％と約８０％との間、約６８％と約７８％との間、約６８％と約７６％との間、約６８％と約７４％との間、約６８％と約７２％との間、約７０％と約９０％との間、約７０％と約８８％との間、約７０％と約８６％との間、約７０％と約８４％との間、約７０％と約８２％との間、約７０％と約８０％との間、約７０％と約７８％との間、約７０％と約７６％との間、約７０％と約７４％との間、約７２％と約９０％との間、約７２％と約８８％との間、約７２％と約８６％との間、約７２％と約８４％との間、約７２％と約８２％との間、約７２％と約８０％との間、約７２％と約７８％との間、約７２％と約７６％との間、約７４％と約９０％との間、約７４％と約８８％との間、約７４％と約８６％との間、約７４％と約８２％との間、約７４％と約８０％との間、約７４％と約７８％との間、約７６％と約９０％との間、約７８％と約９０％との間、約７８％と約８８％との間、約７８％と約８６％との間、約７８％と約８４％との間、約７８％と約８２％との間、約８０％と約９０％との間、約８０％と約８８％との間、約８０％と約８６％との間、約８０％と約８４％との間、約８２％と約９０％との間、約８２％と約８８％との間、約８２％と約８６％との間、約８４％と約９０％との間、約８４％と約８８％との間または約８６％と約９０％との間）であり得る。

バイオリアクター中に存在する第１の培養培地の容積は、約１．２Ｌと約２２Ｌとの間（例えば、約１．２Ｌと約２０Ｌとの間、約１．２Ｌと約１８Ｌとの間、約１．２Ｌと約１６Ｌとの間、約１．２と約１４Ｌとの間、約１．２と約１２Ｌとの間、約１．２Ｌと約１０Ｌとの間、約１．２Ｌと約９Ｌとの間、約１．２Ｌと約８Ｌとの間、約１．２Ｌと約７Ｌとの間、約１．２Ｌと約６Ｌとの間、約１．２Ｌと約５Ｌとの間、約１．２Ｌと約４Ｌとの間、約１．２Ｌと約３Ｌとの間、約１．２Ｌと約２Ｌとの間、約２．０Ｌと約２２Ｌとの間、約２．０Ｌと約２０Ｌとの間、約２Ｌと約１８Ｌとの間、約２Ｌと約１６Ｌとの間、約２Ｌと約１４Ｌとの間、約２Ｌと約１２Ｌとの間、約２Ｌと約１０Ｌとの間、約２Ｌと約９Ｌとの間、約２Ｌと約８Ｌとの間、約２Ｌと約７Ｌとの間、約２Ｌと約６Ｌとの間、約２Ｌと約５Ｌとの間、約２Ｌと約４Ｌとの間、約２Ｌと約３Ｌとの間、約３Ｌと約２２Ｌとの間、約３Ｌと約２０Ｌとの間、約３Ｌと約１８Ｌとの間、約３Ｌと約１６Ｌとの間、約３Ｌと約１４Ｌとの間、約３Ｌと約１２Ｌとの間、約３Ｌと約１０Ｌとの間、約３Ｌと約９Ｌとの間、約３Ｌと約８Ｌとの間、約３Ｌと約７Ｌとの間、約３Ｌと約６Ｌとの間、約３Ｌと約５Ｌとの間、約３Ｌと約４Ｌとの間、約４Ｌと約２２Ｌとの間、約４Ｌと約２０Ｌとの間、約４Ｌと約１８Ｌとの間、約４Ｌと約１６Ｌとの間、約４Ｌと約１４Ｌとの間、約４Ｌと約１２Ｌとの間、約４Ｌと約１０Ｌとの間、約４Ｌと約９Ｌとの間、約４Ｌと約８Ｌとの間、約４Ｌと約７Ｌとの間、約４Ｌと約６Ｌとの間、約４Ｌと約５Ｌとの間、約５Ｌと約２２Ｌとの間、約５Ｌと約２０Ｌとの間、約５Ｌと約１８Ｌとの間、約５Ｌと約１６Ｌとの間、約５Ｌと約１４Ｌとの間、約５Ｌと約１２Ｌとの間、約５Ｌと約１０Ｌとの間、約５Ｌと約９Ｌとの間、約５Ｌと約８Ｌとの間、約５Ｌと約７Ｌとの間、約５Ｌと約６Ｌとの間、約６Ｌと約２２Ｌとの間、約６Ｌと約２０Ｌとの間、約６Ｌと約１８Ｌとの間、約６Ｌと約１６Ｌとの間、約６Ｌと約１４Ｌとの間、約６Ｌと約１２Ｌとの間、約６Ｌと約１０Ｌとの間、約６Ｌと約９Ｌとの間、約６Ｌと約８Ｌとの間、約６Ｌと約７Ｌとの間、約７Ｌと約２２Ｌとの間、約７Ｌと約２０Ｌとの間、約７Ｌと約１８Ｌとの間、約７Ｌと約１６Ｌとの間、約７Ｌと約１４Ｌとの間、約７Ｌと約１２Ｌとの間、約７Ｌと約１０Ｌとの間、約７Ｌと約９Ｌとの間、約７Ｌと約８Ｌとの間、約８Ｌと約２２Ｌとの間、約８Ｌと約２０Ｌとの間、約８Ｌと約１８Ｌとの間、約８Ｌと約１６Ｌとの間、約８Ｌと約１４Ｌとの間、約８Ｌと約１２Ｌとの間、約８Ｌと約１０Ｌとの間、約８Ｌと約９Ｌとの間、約９Ｌと約２２Ｌとの間、約９Ｌと約２０Ｌとの間、約９Ｌと約１８Ｌとの間、約９Ｌと約１６Ｌとの間、約９Ｌと約１４Ｌとの間、約９Ｌと約１２Ｌとの間、約９Ｌと約１０Ｌとの間、約１０Ｌと約２２Ｌとの間、約１０Ｌと約２０Ｌとの間、約１０Ｌと約１８Ｌとの間、約１０Ｌと約１６Ｌとの間、約１０Ｌと約１４Ｌとの間、約１０Ｌと約１２Ｌとの間、約１２Ｌと約２２Ｌとの間、約１２Ｌと約２０Ｌとの間、約１２Ｌと約１８Ｌとの間、約１２Ｌと約１６Ｌとの間、約１２Ｌと約１４Ｌとの間、約１４Ｌと約２２Ｌとの間、約１４Ｌと約２０Ｌとの間、約１４Ｌと約１８Ｌとの間、約１４Ｌと約１６Ｌとの間、約１６Ｌと約２２Ｌとの間、約１６Ｌと約２０Ｌとの間、約１６Ｌと約１８Ｌとの間、約１８Ｌと約２２Ｌとの間、約１８Ｌと約２０Ｌとの間または約２０Ｌと約２２Ｌとの間）であり得る。

ＮＳ０細胞および初期細胞密度
本明細書に記載される方法で使用されるＮＳ０細胞は、ＮＳ０細胞のゲノム内に安定に組み込まれた、組換えエクリズマブをコードする組換え核酸を含有することができる。一部の実施形態では、組換えエクリズマブは、哺乳動物細胞によって液体培養培地中に分泌される。一部の場合には、培養された哺乳動物細胞は、シード培養物由来である。より具体的には、初期細胞培養物は、シードトレインプロセスの結果、または別のバイオリアクター由来の培養物である。

本明細書に記載される方法のいずれかの非限定例では、流加培養期間のスタート時にバイオリアクター中に存在する哺乳動物細胞の細胞密度（初期生存細胞密度などの初期細胞密度）は、約１．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．５×１０^５細胞／ｍＬ、約２．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．５×１０^５細胞／ｍＬ、約３．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．５×１０^５細胞／ｍＬ、約４．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．５×１０^５細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．５×１０^５細胞／ｍＬの間、約６．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．５×１０^５細胞／ｍＬの間、約７．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約６．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約７．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約６．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約６．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^５〜約６．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約６．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約６．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約５．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約５．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約５．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約５．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約４．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約４．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約４．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約３．０×１０^５細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約３．０×１０^５細胞／ｍＬの間または約１．０×１０^５細胞／ｍＬ〜約２．０×１０^５細胞／ｍＬの間である。

流加培養
当技術分野で公知であるように、流加培養は、細胞培養物由来の第１の培養培地の実質的なまたは著しい除去を伴わない初期細胞培養物へのフィード培養培地の漸増的（周期的）または連続的添加を含む。流加培養における細胞培養物は、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載される例示的なバイオリアクターのいずれか）中に置くことができる。一部の場合には、フィード培養培地は、第１の培養培地と同じである。フィード培養培地は、液体形態または乾燥粉末であり得る。一部の例示的な場合には、フィード培養培地は、第１の培養培地の濃縮形態である。

例えば、フィード培養培地の添加は（連続的または周期的に）培養期間の開始後、６時間と７日間との間、約６時間と約６日間との間、約６時間と約５日間との間、約６時間と約４日間との間、約６時間と約３日間との間、約６時間と約２日間との間、約６時間と約１日間との間、約１２時間と約７日間との間、約１２時間と約６日間との間、約１２時間と約５日間との間、約１２時間と約４日間との間、約１２時間と約３日間との間、約１２時間と約２日間との間、約１日間と約７日間との間、約１日間と約６日間との間、約１日間と約５日間との間、約１日間と約４日間との間、約１日間と約３日間との間、約１日間と約２日間との間、約２日間と約７日間との間、約２日間と約６日間との間、約２日間と約５日間との間、約２日間と約４日間との間、約２日間と約３日間との間、約３日間と約７日間との間、約３日間と約６日間との間、約３日間と約５日間との間、約３日間と約４日間との間、約４日間と約７日間との間、約４日間と約６日間との間、約４日間と約５日間との間、約５日間と約７日間との間または約５日間と約６日間との間である時点において行うことができる。

一部の例では、２種の異なるフィード培養培地（例えば、本明細書に記載される例示的な液体培養培地のいずれか）は、流加培養中に添加される（連続的または漸増的に）。添加される第１のフィード培養培地および第２のフィード培養培地の量または容積は、実質的に同じであることができ、または異なることができる。第１のフィード培養培地は、液体の形態であり得、第２のフィード培養培地は、固体の形態であり得る。一部の例では、第１および第２のフィード培養培地は、液体培養培地である。

流加培養は、少なくとも８日（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５日）にわたって実施することができる。例えば、流加培養は、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、または少なくとも２０日にわたって実施することができる。フィード培養培地（または第１および第２の液体フィード培養培地）は、連続的または周期的に添加することができる。

フィード培養培地の連続的添加
フィード培養培地が連続的に添加される場合、フィード培養培地の添加の速度は、培養期間にわたって一定に保持することができ、または増大させる（例えば、着実に増大させる）ことができる。フィード培養培地の連続的添加は、培養期間中の特定の時点（例えば、細胞が標的細胞密度、例えば、本明細書に記載される例示的な標的細胞密度のいずれかに到達するとき）でスタートすることができる。一部の実施形態では、フィード培養培地の連続的添加は、培養期間の２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、または７日目に開始することができる。培養物にフィード培養培地（例えば、第１および第２の液体フィード培養培地）を添加する例示的な容積および速度は、本明細書に記載されている。

一部の実施形態では、単一の液体フィード培養培地または第１および第２の液体フィード培養培地は、細胞培養物に連続的に添加される。単一の液体フィード培養培地の添加の速度、または第１および第２の液体フィード培養培地のそれぞれの添加の速度は、約１０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間（例えば、約１０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約８０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約７５μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約７０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約６５μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約６０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約５５μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約５０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約４５μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約４０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約３５μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約３０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約２５μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約２０μＬ／分との間、約１０μＬ／分と約１５μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約１６０μＬ／分，１５μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約８０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約７５μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約７０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約６５μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約６０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約５５μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約５０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約４５μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約４０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約３５μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約３０μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約２５μＬ／分との間、約１５μＬ／分と約２０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約８０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約７５μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約７０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約６５μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約６０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約５５μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約５０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約４５μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約４０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約３５μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約３０μＬ／分との間、約２０μＬ／分と約２５μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約１６０μＬ／分，３０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約８０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約７０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約６０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約５０μＬ／分との間、約３０μＬ／分と約４０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約８０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約７０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約６０μＬ／分との間、約４０μＬ／分と約５０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約８０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約７０μＬ／分との間、約５０μＬ／分と約６０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約８０μＬ／分との間、約６０μＬ／分と約７０μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約７０μＬ／分と約８０μＬ／分との間、約８０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約８０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約８０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約８０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約８０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約８０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約８０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約８０μＬ／分と約９０μＬ／分との間、約９０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約９０μＬ／分と約１５０μＬ／分との間、約９０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約９０μＬ／分と約１３０μＬ／分との間、約９０μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約９０μＬ／分と約１１０μＬ／分との間、約９０μＬ／分と約１００μＬ／分との間、約１００μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約１００μＬ／分と約１４０μＬ／分との間、約１００μＬ／分と約１２０μＬ／分との間、約１２０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間、約１２０μＬ／分と約１４０μＬ／分との間または約１４０μＬ／分と約１６０μＬ／分との間であり得る。

培養期間全体にわたる培養物に添加されるフィード培養培地の全容積または第１および第２の液体フィード培養培地のぞれぞれの全容積は、約５０ｍＬと約２２００ｍＬとの間（例えば、約５０ｍＬと約２１００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１９００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１２０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１１０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約９０ｍＬとの間、５０ｍＬと約８０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約７０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約６０ｍＬとの間、約６０ｍＬ〜約２２００ｍＬの間、約６０ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１２０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１１０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約９０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約８０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約７０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１２０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１１０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約９０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１２０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１１０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと１５０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約５００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約２００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約８００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約６００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約４００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約１２００ｍＬ，４００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約８００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約６００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約８００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１０００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１０００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１０００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１０００ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約１０００ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約１０００ｍＬと約１２００ｍＬとの間、約１２００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１２００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１２００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１２００ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約１２００ｍＬと約１４００ｍＬとの間、約１４００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１４００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１４００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１４００ｍＬと約１６００ｍＬとの間、約１６００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１６００ｍＬと約２０００ｍＬとの間、約１６００ｍＬと約１８００ｍＬとの間、約１８００ｍＬと約２２００ｍＬとの間、約１８００ｍＬと約２０００ｍＬとの間または約２０００ｍＬと約２２００ｍＬとの間であり得る。

培養期間全体にわたって培養物に添加されるフィード培養培地の全容積、または第１および第２の液体フィード培養培地のそれぞれの全容積は、第１の培養培地の容積、または接種後であるが、フィード培養培地を添加する前の培養物の容積の約１％と約１５％との間（例えば、約１％と約１４％との間、約１％と約１３％との間、約１％と約１２％との間、約１％と約１１％との間、約１％と約１０％との間、約１％と約９％との間、約１％と約８％との間、約１％と約７％との間、約１％と約６％との間、約１％と約５％との間、約１％と約４％との間、約１％と約３％との間、約１％と約２％との間、約２％と約１５％との間、約２％と約１３％との間、約２％と約１２％との間、約２％と約１１％との間、約２％と約１０％との間、約２％と約９％との間、約２％と約８％との間、約２％と約７％との間、約２％と約６％との間、約２％と約５％との間、約２％と約４％との間、約２％と約３％との間、約３％と約１５％との間、約３％と約１４％との間、約３％と約１３％との間、約３％と約１２％との間、約３％と約１１％との間、約３％と約１０％との間、約３％と約９％との間、約３％と約８％との間、約３％と約７％との間、約３％と約６％との間、約３％と約５％との間、約３％と約４％との間、約４％と約１５％との間、約４％と約１４％との間、約４％と約１３％との間、約４％と約１２％との間、約４％と約１１％との間、約４％と約１０％との間、約４％と約９％との間、約４％と約８％との間、約４％と約７％との間、約４％と約６％との間、約４％と約５％との間、約５％と約１５％との間、約５％と約１４％との間、約５％と約１３％との間、約５％と約１２％との間、約５％と約１１％との間、約５％と約１０％との間、約５％と約９％との間、約５％と約８％との間、約５％と約７％との間、約５％と約６％との間、約６％と約１５％との間、約６％と約１４％との間、約６％と約１３％との間、約６％と約１２％との間、約６％と約１１％との間、約６％と約１０％との間、約６％と約９％との間、約６％と約８％との間、約６％と約７％との間、約７％と約１５％との間、約７％と約１４％との間、約７％と約１３％との間、約７％と約１２％との間、約７％と約１１％との間、約７％と約１０％との間、約７％と約９％との間、約７％と約８％との間、約８％と約１５％との間、約８％と約１４％との間、約８％と約１３％との間、約８％と約１２％との間、約８％と約１１％との間、約８％と約１０％との間、約８％と約９％との間、約９％と約１５％との間、約９％と約１４％との間、約９％と約１３％との間、約９％と約１２％との間、約９％と約１１％との間、約９％と約１０％との間、約１０％と約１５％との間、約１０％と約１４％との間、約１０％と約１３％との間、約１０％と約１２％との間、約１０％と約１１％との間、約１１％と約１５％との間、約１１％と約１４％との間、約１１％と約１３％との間、約１１％と約１２％との間、約１２％と約１５％との間、約１２％と約１４％との間、約１２％と約１３％との間、約１３％と約１５％との間、約１３％と約１４％または約１４％と約１５との間）であり得る。

フィード培養培地の連続的添加、または第１および第２のフィード培養培地の連続的添加は、約２０時間〜約２００時間の間（例えば、約２０時間〜約１９０時間の間、約２０時間〜約１８０時間の間、約２０時間〜約１７０時間の間、約２０時間〜約１６０時間の間、約２０時間〜約１５０時間の間、約２０時間〜約１４０時間の間、約２０時間〜約１３０時間の間、約２０時間〜約１２０時間の間、約２０時間〜約１１０時間の間、約２０時間〜約１００時間の間、約２０時間〜約９０時間の間、約２０時間〜約８０時間の間、約２０時間〜約７０時間の間、約２０時間〜約６０時間の間、約２０時間〜約５０時間の間、約２０時間〜約４０時間の間、約２０時間〜約３０時間の間、約３０時間〜約２００時間の間、約３０時間〜約１９０時間の間、約３０時間〜１８０時間の間、約３０時間〜約１７０時間の間、約３０時間〜約１６０時間の間、約３０時間〜約１５０時間の間、約３０時間〜約１４０時間の間、約３０時間〜約１３０時間の間、約３０時間〜約１２０時間の間、約３０時間〜約１１０時間の間、約３０時間〜約１００時間の間、約３０時間〜約９０時間の間、約３０時間〜約８０時間の間、約３０時間〜約７０時間の間、約３０時間〜約６０時間の間、約３０時間〜約５０時間の間、約３０時間〜約４０時間の間、約４０時間〜約２００時間の間、約４０時間〜約１９０時間の間、約４０時間〜約１８０時間の間、４０時間〜約１７０時間の間、約４０時間〜約１６０時間の間、約４０時間〜約１５０時間の間、約４０時間〜約１４０時間の間、約４０時間〜約１３０時間の間、約４０時間〜約１２０時間の間、約４０時間〜約１１０時間の間、４０時間〜約１００時間の間、４０時間〜約９０時間の間、４０時間〜約８０時間の間、約４０時間〜約７０時間の間、約４０時間〜約６０時間の間、約４０時間〜約５０時間の間、約５０時間〜約２００時間の間、約５０時間〜約１９０時間の間、約５０時間〜約１８０時間の間、約５０時間〜約１７０時間の間、約５０時間〜約１６０時間の間、約５０時間〜約１５０時間の間、約５０時間〜約１４０時間の間、約５０時間〜約１３０時間の間、約５０時間〜約１２０時間の間、約５０時間〜約１１０時間の間、約５０時間〜約１００時間の間、約５０時間〜約９０時間の間、約５０時間〜約８０時間の間、約５０時間〜約７０時間の間、約５０時間〜約６０時間の間、約６０時間〜約２００時間の間、約６０時間〜約１９０時間の間、約６０時間〜約１８０時間の間、約６０時間〜約１７０時間の間、約６０時間〜約１６０時間の間、約６０時間〜約１５０時間の間、約６０時間〜約１４０時間の間、約６０時間〜約１３０時間の間、約６０時間〜約１２０時間の間、約６０時間〜約１１０時間の間、約６０時間〜約１００時間の間、約６０時間〜約９０時間の間、約６０時間〜約８０時間の間、約６０時間〜約７０時間の間、約７０時間〜約２００時間の間、約７０時間〜約１９０時間の間、約７０時間〜約１８０時間の間、約７０時間〜約１７０時間の間、約７０時間〜約１６０時間の間、約７０時間〜約１５０時間の間、約７０時間〜約１４０時間の間、約７０時間〜約１３０時間の間、約７０時間〜約１２０時間の間、約７０時間〜約１１０時間の間、約７０時間〜約１００時間の間、約７０時間〜約９０時間の間、約７０時間〜約８０時間の間、約８０時間〜約２００時間の間、約８０時間〜約１９０時間の間、約８０時間〜約１８０時間の間、約８０時間〜約１７０時間の間、約８０時間〜約１６０時間の間、約８０時間〜約１５０時間の間、約８０時間〜約１４０時間の間、約８０時間〜約１３０時間の間、約８０時間〜約１２０時間の間、約８０時間〜約１１０時間の間、約８０時間〜約１００時間の間、約８０時間〜約９０時間の間、約９０時間〜約２００時間の間、約９０時間〜約１９０時間の間、９０時間〜約１８０時間の間、約９０時間〜約１８０時間の間、約９０時間〜約１７０時間の間、約９０時間〜約１６０時間の間、約９０時間〜約１５０時間の間、約９０時間〜約１４０時間の間、約９０時間〜約１３０時間の間、約９０時間〜約１２０時間の間、約９０時間〜約１１０時間の間、約９０時間〜約１００時間の間、約１００時間〜約２００時間の間、約１００時間〜約１９０時間の間、約１００時間〜約１８０時間の間、約１００時間〜約１７０時間の間、約１００時間〜約１６０時間の間、約１００時間〜約１５０時間の間、約１００時間〜約１４０時間の間、約１００時間〜約１３０時間の間、約１００時間〜約１２０時間の間、約１００時間〜約１１０時間の間、約１１０時間〜約２００時間の間、約１１０時間〜約１９０時間の間、約１１０時間〜約１８０時間の間、約１１０時間〜約１７０時間の間、約１１０時間〜約１６０時間の間、約１１０時間〜約１５０時間の間、約１１０時間〜約１４０時間の間、約１１０時間〜約１３０時間の間、約１１０時間〜約１２０時間の間、約１２０時間〜約２００時間の間、約１２０時間〜約１９０時間の間、約１２０時間〜約１８０時間の間、約１２０時間〜約１７０時間の間、約１２０時間〜約１６０時間の間、約１２０時間〜約１５０時間の間、約１２０時間〜約１４０時間の間、約１２０時間〜約１３０時間の間、約１３０時間〜約２００時間の間、約１３０時間〜約１９０時間の間、約１３０時間〜約１８０時間の間、約１３０時間〜約１７０時間の間、約１３０時間〜約１６０時間の間、約１３０時間〜約１５０時間の間、約１３０時間〜約１４０時間の間、約１３０時間〜約１３５時間の間、約１４０時間〜約２００時間の間、約１４０時間〜約１９０時間の間、約１４０時間〜約１８０時間の間、約１４０時間〜約１７０時間の間、約１４０時間〜約１６０時間の間、約１４０時間〜約１５０時間の間、約１５０時間〜約２００時間の間、約１５０時間〜約１９０時間の間、約１５０時間〜約１８０時間の間、約１５０時間〜約１７０時間の間、約１５０時間〜約１６０時間の間、約１６０時間〜約２００時間の間、約１６０時間〜約１９０時間の間、約１６０時間〜約１８０時間の間、約１６０時間〜約１７０時間の間、約１７０時間〜約２００時間の間、約１７０時間〜約１９０時間の間、約１７０時間〜約１８０時間の間、約１８０時間〜約２００時間の間、約１８０時間〜約１９０時間または約１９０時間〜約２００時間の間の期間にわたって行うことができる。

フィード培養培地の連続的添加、または第１および第２のフィード培養培地の連続的添加は、例えば、流加培養の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目または８日目に開始することができる。フィード培養培地の連続的添加、または第１および第２のフィード培養培地の連続的添加は、培養物が、例えば、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ、約１．１×１０^６細胞／ｍＬ、約１．２×１０^６細胞／ｍＬ、約１．３×１０^６細胞／ｍＬ、約１．４×１０^６細胞／ｍＬ、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ、約１．６×１０^６細胞／ｍＬ、約１．７×１０^６細胞／ｍＬ、約１．８×１０^６細胞／ｍＬ、約１．９×１０^６細胞／ｍＬ、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ、約２．１×１０^６細胞／ｍＬ、約２．２×１０^６細胞／ｍＬ、約２．３×１０^６細胞／ｍＬ、約２．４×１０^６細胞／ｍＬ、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／，Ｌとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬ，１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬ，１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ，１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ，１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ，１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ，１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ，１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ，１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬまたは約２．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間の標的細胞密度に到達したときに開始される。

本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、第１および第２の液体フィード培養培地の連続的添加は、同じ時間および流量でスタートし、培養期間にわたって添加される全容積ならびに、第１および第２の液体フィード培養培地のそれぞれの添加の時間の長さは、同じ、または実質的に同じである。

フィード培養培地の周期的添加
一部の実施形態では、フィード培養培地の漸増的（周期的な）添加は、哺乳動物細胞が標的細胞密度（例えば、本明細書に記載される例示的な標的細胞密度のいずれか）に到達するときに始めることができる。漸増的フィード培養培地添加は、規則的な間隔で（例えば、毎日、隔日、もしくは３日ごとに）行うことができ、または細胞が特定の標的細胞密度（例えば、培養期間にわたって増大する標的細胞密度）に到達するときに行うことができる。一部の実施形態では、添加されるフィード培養培地の量は、フィード培養培地の第１の漸増的添加とフィード培養培地の後続の添加との間で次第に増大させることができる。培養期間にわたって培養物に添加されるフィード培養培地の全容積は、本明細書に記載されるフィード培養培地の例示的な全容積のいずれかであり得る。

培養培地
培養するステップで使用することができる液体培養培地は、当技術分野で公知である。液体培養培地（例えば、第１の培養培地および／またはフィード培養培地、ならびに第１の培養培地、第１のフィード培養培地、および第２のフィード培養培地の１つまたは複数）は、哺乳動物血清（例えば、胎仔ウシ血清もしくはウシ血清、例えば、ＮｅｗＺｅａｌａｎｄウシ血清）、および／または成長ホルモンもしくは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンもしくは上皮増殖因子）を補充することができる。代替としてまたは追加的に、液体培養培地（例えば、第１の培養培地および／またはフィード培養培地、ならびに第１の培養培地、第１のフィード培養培地、および第２のフィード培養培地の１つまたは複数）は、化学的に規定された液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地または血清含有液体培養培地であり得る。液体培養培地（例えば、第１の培養培地および／またはフィード培養培地、ならびに第１の培養培地、第１のフィード培養培地、および第２のフィード培養培地の１つまたは複数）は、例えば、処理済みウシ血清アルブミンを含み得る。化学的に規定された液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地、および血清含有液体培養培地の非限定的な例は、市販されている。

液体培養培地は、典型的には、エネルギー源（例えば、グルコースなどの炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸＋システインの基本セット）、低濃度で要求されるビタミンおよび／もしくは他の有機化合物、遊離脂肪酸、ならびに／または微量元素を含有する。液体培養培地は、必要に応じて、例えば、哺乳動物ホルモンもしくは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮増殖因子）、塩および緩衝液（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、ならびに／またはこれらもしくは他の添加剤の任意の組合せを補充することができる。

本明細書に記載される方法において有用であり得る液体培養培地の非限定的な例には、例えば、ＣＤＣＨＯ、ＯｐｔｉＣＨＯおよびＦｏｒｔｉＣＨＯ（全てＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹから入手可能）、ＨｙｃｅｌｌＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｅｘ−ｃｅｌｌＣＤＣＨＯＦｕｓｉｏｎ培地（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ならびにＰｏｗｅｒＣＨＯ培地（ＬｏｎｚａＧｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．；Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれる。本発明の方法においてこれもまた有用であり得る培地成分には、化学的に規定された（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２つまたはそれ超のアミノ酸）およびＣＤ増殖因子が含まれるがこれらに限定されない。液体培養培地および培地成分のさらなる例は、当技術分野で公知である。

哺乳動物細胞の培養において使用される培養培地は、約６．５と約７．５との間（例えば、約６．５と約７．４との間、約６．５と約７．３との間、約６．５と約７．２との間、約６．５と約７．１との間、約６．５と約７．０との間、約６．５と約６．９との間、約６．５と約６．８との間、約６．５と約６．７との間、約６．６と約７．５との間、約６．６と約７．４との間、約６．６と約７．３との間、約６．６と約７．２との間、約６．６と約７．１との間、約６．６と約７．０との間、約６．６と約６．９との間、約６．６と約６．８との間、約６．７と約７．５との間、約６．７と約７．４との間、約６．７と約７．３との間、約６．７と約７．２との間、約６．７と約７．１との間、約６．７と約７．０との間、約６．７と約６．９との間、約６．８と約７．５との間、約６．８と約７．４との間、約６．８と約７．３との間、約６．８と約７．２との間、約６．８と約７．１との間、約６．８と約７．０との間、約６．９と約７．５との間、約６．９と約７．４との間、約６．９と約７．３との間、約６．９と約７．２との間、約６．９と約７．１との間、約７．０と約７．５との間、約７．０と約７．４との間、約７．０と約７．３との間、約７．０と約７．２との間、約７．１と約７．５との間、約７．１と約７．４との間、約７．１と約７．３との間、約７．２と約７．５との間、約７．２と約７．４との間または約７．３と約７．５との間）のｐＨを有し得る。

当業者は、培養において使用される液体培養培地が、培養期間中同じであり得るか、または変化し得る（例えば、第１の培養培地およびフィード培養培地、または第１の培養培地、ならびに第１および／もしくは第２のフィード培養培地は、同じタイプの培地または異なるタイプの培地であり得る）ことを理解されたい。

一部の実施形態では、流加培養物に添加される培養培地は、固体組成物であり得る。流加培養物に添加することができる固体培養培地の例は、当技術分野で公知である。

本明細書に記載される方法で使用される培養培地のいずれも、処理済みＢＳＡを含み得る。処理済みＢＳＡは、本明細書に記載される方法によって生成されたウシ血清アルブミンである。例えば、処理済みＢＳＡを生成するための方法は、血清アルブミンを含む溶液を加熱すること、血清アルブミンを含む溶液に安定剤を添加すること、および再構成された凍結乾燥血清アルブミンを含む溶液から不純物を沈殿させることを含まない。処理済みＢＳＡを生成するための方法は、ウシ由来の血漿を提供するステップからスタートすることができる。処理済みＢＳＡは、例えば、ウシ由来の血漿を提供するステップ、血漿を脱塩するステップ、限外濾過を使用して血漿を濾過するステップ、血漿から真性グロブリンを沈殿させるステップ、血漿を濾過して沈殿した真性グロブリンを除去するステップ、血漿に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して血清アルブミンおよび免疫グロブリンを含む溶出液を得るステップ、硫安沈殿法を使用して溶出液から免疫グロブリンを沈殿させるステップ、溶出液から沈殿した免疫グロブリンを除去するステップ、溶出液を濃縮およびフリーズドライして血清アルブミンを含む凍結乾燥材料を生成するステップ、ならびに任意選択で凍結乾燥材料を溶液に再構成するステップを含む方法によって生成されたＢＳＡであり得る。処理済みＢＳＡの非限定的な例は、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＮＺＢＳＡである。

本明細書に記載される方法のいずれかで使用される培養培地のいずれも、０．１ｇ／Ｌまたはそれ超（例えば、少なくとも０．２ｇ／Ｌ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ、少なくとも０．４ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも０．６ｇ／Ｌ、少なくとも０．７ｇ／Ｌ、少なくとも０．８ｇ／Ｌ、少なくとも０．９ｇ／Ｌ、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、少なくとも１．１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．３ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．７ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも１．９ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも２．１ｇ／Ｌ．少なくとも２．２ｇ／Ｌ、少なくとも２．３ｇ／Ｌ、少なくとも２．４ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも２．６ｇ／Ｌ、少なくとも２．７ｇ／Ｌ、少なくとも２．８ｇ／Ｌ、少なくとも２．９ｇ／Ｌまたは少なくとも３．０ｇ／Ｌ）の処理済みＢＳＡ（ＮＺ処理済みＢＳＡなど）を含み得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、処理済みＢＳＡを含有する培養培地は、約０．１ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌの間（例えば、約０．１ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．１ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．９ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．８ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．７ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．６ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．５ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．４ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．３ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．２ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．１ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．９ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．８ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．７ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．６ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．５ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．４ｇ／Ｌとの間、約０．１ｇ／Ｌと約０．３ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．１ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．９ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．８ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．７ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．６ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．５ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．４ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．３ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．２ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．１ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約１．０ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約０．９ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約０．８ｇ／Ｌとの間、約０．５ｇ／Ｌと約０．７ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．１ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．９ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．８ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．７ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．６ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．５ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．４ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．３ｇ／Ｌとの間、約１．０ｇ／Ｌと約１．２ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．１ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約２．０ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約１．９ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約１．８ｇ／Ｌとの間、約１．５ｇ／Ｌと約１．７ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．６ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．５ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．４ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．３ｇ／Ｌとの間、約２．０ｇ／Ｌと約２．２ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約３．０ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約２．９ｇ／Ｌとの間、約２．５ｇ／Ｌと約２．８ｇ／Ｌとの間または２．５ｇ／Ｌと約２．７ｇ／Ｌとの間）の処理済みＢＳＡを含有し得る。

０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みＢＳＡを含む培養培地は、第１の培養培地であり得、第１の培養培地およびフィード培養培地の両方であり得、または第１の培養培地、第１のフィード培養培地、および第２のフィード培養培地の１つもしくは複数であり得る。本明細書に記載される方法のいずれかにおける流加培養は、２種の異なるフィード培養培地の使用を含むことができ、２種の異なるフィード培養培地の一方または両方は、０．１ｇ／Ｌまたはそれ超の処理済みＢＳＡを含む。

当技術分野で周知であるように、処理済みＢＳＡを含有する培養培地は、液体培養培地中に所望の最終濃度の処理済みＢＳＡを得るのに十分な量の処理済みＢＳＡ（固体状態での、または溶液としての）を液体培養培地に添加することによって生成することができる。

一部の実施形態では、第１の培養培地は、第１の培養培地１Ｌ当たり脂質溶液約１ｍＬの濃度で脂質溶液（オレイン酸、リノール酸、およびコレステロールを含む）を含有する。

一部の方法では、培養物中に存在する処理済みＢＳＡの濃度は、培養期間全体にわたって実質的に一定のままであり得る。他の方法では、培養物中に存在する処理済みＢＳＡの濃度は、培養期間中に増大し得る。一部の実施形態では、処理済みＢＳＡは、培養期間のスタート時の液体培養培地（第１の培養培地）中に存在し得る。他の実施形態では、処理済みＢＳＡは、培養期間のスタート後に第１の液体培養培地に添加されてもよい（例えば、ボーラス注射によって、または処理済みＢＳＡを含有するフィード培養培地を添加することによって）。

脂質溶液の添加
本明細書に記載される例は、細胞が、例えば、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ、約１．１×１０^６細胞／ｍＬ、約１．２×１０^６細胞／ｍＬ、約１．３×１０^６細胞／ｍＬ、約１．４×１０^６細胞／ｍＬ、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ、約１．６×１０^６細胞／ｍＬ、約１．７×１０^６細胞／ｍＬ、約１．８×１０^６細胞／ｍＬ、約１．９×１０^６細胞／ｍＬ、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ、約２．１×１０^６細胞／ｍＬ、約２．２×１０^６細胞／ｍＬ、約２．３×１０^６細胞／ｍＬ、約２．４×１０^６細胞／ｍＬ、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬと約１．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／、Ｌとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．１×１０^６細胞／ｍＬと約１．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．２×１０^６細胞／ｍＬと約１．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬ、１．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬ、１．３×１０^６細胞／ｍＬと約１．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ、１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．４×１０^６細胞／ｍＬと約１．６×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ、１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬと約１．７×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ、１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．６×１０^６細胞／ｍＬと約１．８×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ、１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．７×１０^６細胞／ｍＬと約１．９×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ、１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．８×１０^６細胞／ｍＬと約２．０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬ、１．９×１０^６細胞／ｍＬと約２．１×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬと約２．２×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．１×１０^６細胞／ｍＬと約２．３×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約２．２×１０^６細胞／ｍＬと約２．４×１０^６細胞／ｍＬとの間または約２．３×１０^６細胞／ｍＬと約２．５×１０^６細胞／ｍＬの密度に到達するとき、培養物に脂質溶液（オレイン酸、リノール酸、およびコレステロールを含む脂質溶液）のボーラスを添加することをさらに含み得る。

一部の実施形態では、脂質溶液１ｍＬが、例えば、それぞれ約０．８５Ｌ、それぞれ約０．９Ｌ、それぞれ約０．９５Ｌ、それぞれ約１．００Ｌ、それぞれ約１．０５Ｌ、それぞれ約１．１Ｌ、またはそれぞれ約１．１５Ｌの培養物について添加される。例えば、脂質溶液４．２ｍＬが、典型的には、培養物約４．２Ｌに添加される。

塩基溶液の添加
本明細書に記載される方法は、培養物に塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）を添加することをさらに含む。塩基溶液は、例えば、約８．０以上（例えば、約８．５以上、約９．０以上、約９．５以上、約１０．０以上、約１０．５以上、約１１．０以上、約１１．５以上または約１２．０以上）のｐＨを有する、緩衝され、滅菌された溶液であり得る。塩基溶液は、例えば、アルカリ塩基溶液であり得る。アルカリ塩基溶液の非限定的な例は、（ｉ）約０．５Ｍと約１．０Ｍとの間（例えば、約０．５Ｍと約０．９５Ｍとの間、約０．５Ｍと約０．９Ｍとの間、約０．５Ｍと約０．８５Ｍとの間、約０．５Ｍと約０．８Ｍとの間、約０．５Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．５Ｍと約０．７０Ｍとの間、約０．５Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．５Ｍと約０．６Ｍとの間、約０．５Ｍと約０．５５Ｍとの間、約０．５５Ｍと約１．０Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．９５Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．９Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．８５Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．８Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．７Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．６Ｍとの間、約０．６Ｍと約１．０Ｍとの間、約０．６Ｍと約０．９５Ｍとの間、約０．６Ｍと約０．９Ｍとの間、約０．６Ｍと約０．８５Ｍとの間、約０．６Ｍと約０．８０Ｍとの間、約０．６Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．６Ｍと約０．７Ｍとの間、約０．６Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．６５Ｍと約１．０Ｍとの間、約０．６５Ｍと約０．９５Ｍとの間、約０．６５Ｍと約０．９Ｍとの間、約０．６５Ｍと約０．８５Ｍとの間、約０．６５Ｍと約０．８Ｍとの間、約０．６５Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．６５Ｍと約０．７Ｍとの間、約０．７Ｍと約１．０Ｍとの間、約０．７Ｍと約０．９５Ｍとの間、約０．７Ｍと約０．９Ｍとの間、約０．７Ｍと約０．８５Ｍとの間、約０．７Ｍと約０．８Ｍとの間、約０．７Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．７５Ｍと約１．０Ｍとの間、約０．７５Ｍと約０．９５Ｍとの間、約０．７５Ｍと約０．９Ｍとの間、約０．７５Ｍと約０．８５Ｍとの間、約０．７５Ｍと約０．８Ｍとの間、約０．８Ｍと約１．０Ｍとの間、約０．８Ｍと約０．９５Ｍとの間、約０．８Ｍと約０．９Ｍとの間、約０．８Ｍと約０．８５Ｍとの間、約０．８５Ｍと約１．０Ｍとの間、約０．８５Ｍと約０．９５Ｍとの間、約０．８５Ｍと約０．９Ｍとの間、約０．９Ｍと約１．０Ｍとの間、約０．９Ｍと約０．９５Ｍとの間または約０．９５Ｍと約１．０Ｍとの間）の炭酸ナトリウムおよび（ｉｉ）約０．２５Ｍと約０．７５Ｍとの間（例えば、約０．２５Ｍと約０．７０Ｍとの間、約０．２５Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．２５Ｍと約０．６０Ｍとの間、約０．２５Ｍと約０．５５Ｍとの間、約０．２５Ｍと約０．５０Ｍとの間、約０．２５Ｍと約０．４５Ｍとの間、約０．２５Ｍと約０．４０Ｍとの間、約０．２５Ｍと約０．３５Ｍとの間、約０．２５Ｍと約０．３０Ｍとの間、約０．３０Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．３０Ｍと約０．７０Ｍとの間、約０．３０Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．３０Ｍと約０．６０Ｍとの間、約０．３０Ｍと約０．５５Ｍとの間、約０．３０Ｍと約０．５０Ｍとの間、約０．３０Ｍと約０．４５Ｍとの間、約０．３０Ｍと約０．４０Ｍとの間、約０．３０と約０．３５Ｍとの間、約０．３５Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．３５Ｍと約０．７０Ｍとの間、約０．３５Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．３５Ｍと約０．６０Ｍとの間、約０．３５Ｍと約０．５５Ｍとの間、約０．３５Ｍと約０．５０Ｍとの間、約０．３５Ｍと約０．４５Ｍとの間、約０．３５Ｍと約０．４０Ｍとの間、約０．４Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．４０Ｍと約０．７０Ｍとの間、約０．４０Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．４０Ｍと約０．６０Ｍとの間、約０．４０Ｍと約０．５５Ｍとの間、約０．４０Ｍと約０．５０Ｍとの間、約０．４０Ｍと約０．４５Ｍとの間、約０．４５Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．４５Ｍと約０．７０Ｍとの間、約０．４５Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．４５Ｍと約０．６０Ｍとの間、約０．４５Ｍと約０．５５Ｍとの間、約０．４５Ｍと約０．５０Ｍとの間、約０．５０Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．５０Ｍと約０．７０Ｍとの間、約０．５０Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．５０Ｍと約０．６０Ｍとの間、約０．５０Ｍと約０．５５Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．５５と約０．７０Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．５５Ｍと約０．６０Ｍとの間、約０．６０Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．６０Ｍと約０．７０Ｍとの間、約０．６０Ｍと約０．６５Ｍとの間、約０．６５Ｍと約０．７５Ｍとの間、約０．６５Ｍと約０．７０Ｍとの間または約０．７０Ｍと約０．７５Ｍとの間）の炭酸水素ナトリウムの濃度を有する。培養物に添加され得る塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）のさらなる例は、当技術分野で周知である。

塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）は、連続的または周期的に培養物に添加することができる。培養物へのアルカリ塩基溶液の連続的添加は、フィード培養培地が培養物に添加される初期時点（例えば、本明細書に記載される培養物へのフィード培養培地の添加を開始するための例示的な時点のいずれか）の約５時間〜約８０時間（例えば、約５時間〜約７５時間、約５時間〜約７０時間、約５時間〜約６５時間、約５時間〜約６０時間、約５時間〜約５５時間、約５時間〜約５０時間、約５時間〜約４５時間、約５時間〜約４０時間、約５時間〜約３５時間、約５時間〜約３０時間、約５時間〜約２５時間、約５時間〜約２０時間、約５時間〜約１５時間、約１０時間〜約８０時間、約１０時間〜約７５時間、約１０時間〜約７０時間、約１０時間〜約６５時間、約１０時間〜約６０時間、約１０時間〜約５５時間、約１０時間〜約５０時間、約１０時間〜約４５時間、約１０時間〜約４０時間、約１０時間〜約３５時間、約１０時間〜約３０時間、約１０時間〜約２５時間、約１０時間〜約２０時間、約１０時間〜約１５時間、約１５時間〜約８０時間、約１５時間〜約７５時間、約１５時間〜約７０時間、約１５時間〜約６５時間、約１５時間〜約６０時間、約１５時間〜約５５時間、約１５時間〜約５０時間、約１５時間〜約４５時間、約１５時間〜約４０時間、約１５時間〜約３５時間、約１５時間〜約３０時間、約１５時間〜約２５時間、約２０時間〜約８０時間、約２０時間〜約７５時間、約２０時間〜約７０時間、約２０時間〜約６５時間、約２０時間〜約６０時間、約２０時間〜約５５時間、約２０時間〜約５０時間、約２０時間〜約４５時間、約２０時間〜約４０時間、約２０時間〜約３５時間、約２０時間〜約３０時間、約２０時間〜約２５時間、約２５時間〜約８０時間、約２５時間〜約７５時間、約２５時間〜約７０時間、約２５時間〜約６５時間、約２５時間〜約６０時間、約２５時間〜約５５時間、約２５時間〜約５０時間、約２５時間〜約４５時間、約２５時間〜約４０時間、約２５時間〜約３５時間、約３０時間〜約８０時間、約３０時間〜約７５時間、約３０時間〜約７０時間、約３０時間〜約６５時間、約３０時間〜約６０時間、約３０時間〜約５５時間、約３０時間〜約５０時間、約３０時間〜約４５時間、約３０時間〜約４０時間、約３５時間〜約８０時間、約３５時間〜約７５時間、約３５時間〜約７０時間、約３５時間〜約６５時間、約３５時間〜約６０時間、約３５時間〜約５５時間、約３５時間〜約５０時間、約３５時間〜約４５時間、約４０時間〜約８０時間、約４０時間〜約７５時間、約４０時間〜約７０時間、約４０時間〜約６５時間、約４０時間〜約６０時間、約４０時間〜約５５時間、約４０時間〜約５０時間、約４５時間〜約８０時間、約４５時間〜約７５時間、約４５時間〜約７０時間、約４５時間〜約６５時間、約４５時間〜約６０時間、約４５時間〜約５５時間、約５０時間〜約８０時間、約５０時間〜約７５時間、約５０時間〜約７０時間、約５０時間〜約６５時間、約５０時間〜約６０時間、約５５時間〜約８０時間、約５５時間〜約７５時間、約５５時間〜約７０時間、約５５時間〜約６５時間、約６０時間〜約８０時間、約６０時間〜約７５時間、約６０時間〜約７０時間、約６５時間〜約８０時間、約６５時間〜約７５時間、または約７０時間〜約８０時間）後である時点においてスタートする（開始する）ことができる。一部の実施形態では、塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）の添加は、培養期間をスタートして約７０時間〜約１７０時間の間（例えば、約７０時間〜約１６５時間の間、約７０時間〜約１６０時間の間、約７０時間〜約１５５時間の間、約７０時間と約１５０時間との間、約７０時間〜約１４５時間の間、約７０時間〜約１４０時間の間、約７０時間〜約１３５時間の間、約７０時間〜約１３０時間の間、約７０時間〜約１２５時間の間、約７０時間〜約１２０時間の間、約７０時間〜約１１５時間の間、約７０時間〜約１１０時間の間、約７０時間〜約１０５時間の間、約７０時間〜約１００時間の間、約７０時間〜約９５時間の間、約７０時間〜約９０時間の間、約７０時間〜約８５時間の間、約７０時間〜約８０時間の間、約７５時間〜約１７０時間の間、約７５時間〜約１６５時間の間、約７５時間〜約１６０時間の間、約７５時間〜約１５５時間の間、約７５時間と約１５０時間との間、約７５時間〜約１４５時間の間、約７５時間〜約１４０時間の間、約７５時間〜約１３５時間の間、約７５時間〜約１３０時間の間、約７５時間〜約１２５時間の間、約７５時間〜約１２０時間の間、約７５時間〜約１１５時間の間、約７５時間〜約１１０時間の間、約７５時間〜約１０５時間の間、約７５時間〜約１００時間の間、約７５時間〜約９５時間の間、約７５時間〜約９０時間の間、約７５時間〜約８５時間の間、約８０時間〜約１７０時間の間、約８０時間〜約１６５時間の間、約８０時間〜約１６０時間の間、約８０時間〜約１５５時間の間、約８０時間と約１５０時間との間、約８０時間〜約１４５時間の間、約８０時間〜約１４０時間の間、約８０時間〜約１３５時間の間、約８０時間〜約１３０時間の間、約８０時間〜約１２５時間の間、約８０時間〜約１２０時間の間、約８０時間〜約１１５時間の間、約８０時間〜約１１０時間の間、約８０時間〜約１０５時間の間、約８０時間〜約１００時間の間、約８０時間〜約９５時間の間、約８０時間〜約９０時間の間、約８５時間〜約１７０時間の間、約８５時間〜約１６５時間の間、約８５時間〜約１６０時間の間、約８５時間〜約１５５時間の間、約８５時間と約１５０時間との間、約８５時間〜約１４５時間の間、約８５時間〜約１４０時間の間、約８５時間〜約１３５時間の間、約８５時間〜約１３０時間の間、約８５時間〜約１２５時間の間、約８５時間〜約１２０時間の間、約８５時間〜約１１５時間の間、約８５時間〜約１１０時間の間、約８５時間〜約１０５時間の間、約８５時間〜約１００時間の間、約８５時間〜約９５時間の間、約９０時間〜約１７０時間の間、約９０時間〜約１６５時間の間、約９０時間〜約１６０時間の間、約９０時間〜約１５５時間の間、約９０時間と約１５０時間との間、約９０時間〜約１４５時間の間、約９０時間〜約１４０時間の間、約９０時間〜約１３５時間の間、約９０時間〜約１３０時間の間、約９０時間〜約１２５時間の間、約９０時間〜約１２０時間の間、約９０時間〜約１１５時間の間、約９０時間〜約１１０時間の間、約９０時間〜約１０５時間の間、約９０時間〜約１００時間の間、約９５時間〜約１７０時間の間、約９５時間〜約１６５時間の間、約９５時間〜約１６０時間の間、約９５時間〜約１５５時間の間、約９５時間と約１５０時間との間、約９５時間〜約１４５時間の間、約９５時間〜約１４０時間の間、約９５時間〜約１３５時間の間、約９５時間〜約１３０時間の間、約９５時間〜約１２５時間の間、約９５時間〜約１２０時間の間、約９５時間〜約１１５時間の間、約９５時間〜約１１０時間の間、約９５時間〜約１０５時間の間、約１００時間〜約１７０時間の間、約１００時間〜約１６５時間の間、約１００時間〜約１６０時間の間、約１００時間〜約１５５時間の間、約１００時間と約１５０時間との間、約１００時間〜約１４５時間の間、約１００時間〜約１４０時間の間、約１００時間〜約１３５時間の間、約１００時間〜約１３０時間の間、約１００時間〜約１２５時間の間、約１００時間〜約１２０時間の間、約１００時間〜約１１５時間の間、約１００時間〜約１１０時間の間、約１０５時間〜約１７０時間の間、約１０５時間〜約１６５時間の間、約１０５時間〜約１６０時間の間、約１０５時間〜約１５５時間の間、約１０５時間と約１５０時間との間、約１０５時間〜約１４５時間の間、約１０５時間〜約１４０時間の間、約１０５時間〜約１３５時間の間、約１０５時間〜約１３０時間の間、約１０５時間〜約１２５時間の間、約１０５時間〜約１２０時間の間、約１０５時間〜約１１５時間の間、約１１０時間〜約１７０時間の間、約１１０時間〜約１６５時間の間、約１１０時間〜約１６０時間の間、約１１０時間〜約１５５時間の間、約１１０時間と約１５０時間との間、約１１０時間〜約１４５時間の間、約１１０時間〜約１４０時間の間、約１１０時間〜約１３５時間の間、約１１０時間〜約１３０時間の間、約１１０時間〜約１２５時間の間、約１１０時間〜約１２０時間の間、約１１５時間〜約１７０時間の間、約１１５時間〜約１６５時間の間、約１１５時間〜約１６０時間の間、約１１５時間〜約１５５時間の間、約１１５時間と約１５０時間との間、約１１５時間〜約１４５時間の間、約１１５時間〜約１４０時間の間、約１１５時間〜約１３５時間の間、約１１５時間〜約１３０時間の間、約１１５時間〜約１２５時間の間、約１２０時間〜約１７０時間の間、約１２０時間〜約１６５時間の間、約１２０時間〜約１６０時間の間、約１２０時間〜約１５５時間の間、約１２０時間と約１５０時間との間、約１２０時間〜約１４５時間の間、約１２０時間〜約１４０時間の間、約１２０時間〜約１３５時間の間、約１２０時間〜約１３０時間の間、約１２５時間〜約１７０時間の間、約１２５時間〜約１６５時間の間、約１２５時間〜約１６０時間の間、約１２５時間〜約１５５時間の間、約１２５時間と約１５０時間との間、約１２５時間〜約１４５時間の間、約１２５時間〜約１４０時間の間、約１２５時間〜約１３５時間の間、約１３０時間〜約１７０時間の間、約１３０時間〜約１６５時間の間、約１３０時間〜約１６０時間の間、約１３０時間〜約１５５時間の間、約１３０時間と約１５０時間との間、約１３０時間〜約１４５時間の間、約１３０時間〜約１４０時間の間、約１３５時間〜約１７０時間の間、約１３５時間〜約１６５時間の間、約１３５時間〜約１６０時間の間、約１３５時間〜約１５５時間の間、約１３５時間と約１５０時間の間、約１３５時間〜約１４５時間の間、約１４０時間〜約１７０時間の間、約１４０時間〜約１６５時間の間、約１４０時間〜約１６０時間の間、約１４０時間〜約１５５時間の間、約１４０時間と約１５０時間との間、約１４５時間〜約１７０時間の間、約１４５時間〜約１６５時間の間、約１４５時間〜約１６０時間の間、約１４５時間〜約１５５時間の間、約１５０時間〜約１７０時間の間、約１５０時間〜約１６５時間の間、約１５０時間〜約１６０時間の間、約１５５時間〜約１７０時間の間、約１５５時間〜約１６５時間の間、または約１６０時間〜約１７０時間の間）の後である時点において開始される。

培養物への塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）の添加の速度は、例えば、約１０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約８０μＬ／分の間、１０μＬ／分〜約７５μＬ／分、約１０μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約５５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約５０μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約４５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約４０μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約３５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約３０μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約２５μＬ／分の間、約１０μＬ／分〜約２０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約８０μＬ／分の間、１５μＬ／分〜約７５μＬ／分、約１５μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約５５μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約５０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約４５μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約４０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約３５μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約３０μＬ／分の間、約１５μＬ／分〜約２５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約８０μＬ／分の間、２０μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約５５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約５０μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約４５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約４０μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約３５μＬ／分の間、約２０μＬ／分〜約３０μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約８０μＬ／分の間、２５μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約５５μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約５０μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約４５μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約４０μＬ／分の間、約２５μＬ／分〜約３５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約８０μＬ／分、３０μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約５５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約５０μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約４５μＬ／分の間、約３０μＬ／分〜約４０μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約８０μＬ／分、３５μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約５５μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約５０μＬ／分の間、約３５μＬ／分〜約４５μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約８０μＬ／分、４０μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約５５μＬ／分の間、約４０μＬ／分〜約５０μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約８０μＬ／分の間、４５μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約４５μＬ／分〜約５５μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約８０μＬ／分、５０μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約５０μＬ／分〜約６０μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約８０μＬ／分、５５μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約５５μＬ／分〜約６５μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約８０μＬ／分、６０μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約６０μＬ／分〜約７０μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約６５μＬ／分〜約８０μＬ／分、６５μＬ／分〜約７５μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約７０μＬ／分〜約８０μＬ／分の間、約７５μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約７５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約７５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約７５μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約７５μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約７５μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約７５μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約７５μＬ／分〜約８５μＬ／分の間、約８０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約８０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約８０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約８０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約８０μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約８０μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約８０μＬ／分〜約９０μＬ／分の間、約８５μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約８５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約８５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約８５μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約８５μＬ／分〜約１００μＬ／分の間、約８５μＬ／分〜約９５μＬ／分の間、約９０μＬ／分〜約１２０μＬ／分の間、約９０μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約９０μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約９０μＬ／分〜約１０５μＬ／分の間、約９０μＬ／分〜約１００μＬ／分、約９５μＬ／分〜約１２０μＬ／分、約９５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約９５μＬ／分〜約１１０μＬ／分の間、約９５μＬ／分〜約１０５μＬ／分、約１００μＬ／分〜約１２０μＬ／分、約１００μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、約１００μＬ／分〜約１１０μＬ／分、約１０５μＬ／分〜約１２０μＬ／分、約１０５μＬ／分〜約１１５μＬ／分の間、または約１１０μＬ／分〜約１２０μＬ／分であり得る。

塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）の培養物への添加の速度は、約０．３ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．８０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．７５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．７０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．６５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．６０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．５５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．５０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．４５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．４０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．３５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．３０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．２５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．２０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．１５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．１０ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．０５ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約１．００ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約０．８ｍＬ／時間の間、約０．３ｍＬ／時間〜約０．６ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．８０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．７５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．７０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．６５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．６０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．５５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．５０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．４５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．４０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．３５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．３０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．２５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．２０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．１５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．１０ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．０５ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約１．００ｍＬ／時間の間、約０．５ｍＬ／時間〜約０．８ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．８０ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．７５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．７０ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．６５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．６０ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．５５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．５０ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．４５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．４０ｍＬ／時間の間、約１、０ｍＬ／時間〜約１．３５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．３０ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．２５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．２０ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．１５ｍＬ／時間の間、約１．０ｍＬ／時間〜約１．１０ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．８０ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．７５ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．７０ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．６５ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．６０ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．５５ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．５０ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．４５ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．４０ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．３５ｍＬ／時間の間、約１．２ｍＬ／時間〜約１．３０ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．８０ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．７５ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．７０ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．６５ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．６０ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．５５ｍＬ／時間の間、約１．４ｍＬ／時間〜約１．５０ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約１．８０ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約１．７５ｍＬ／時間の間、約１．６ｍＬ／時間〜約１．７０ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約１．８０ｍＬ／時間の間、約１．６５ｍＬ／時間〜約１．７５ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約１．７０ｍＬ／時間〜約１．８０ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約１．７５ｍＬ／時間〜約１．８５ｍＬ／時間の間、約１．８０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．８０ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．８０ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．８０ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．８０ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．８０ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．８０ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．８０ｍＬ／時間〜約１．９０ｍＬ／時間の間、約１．８５ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．８５ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．８５ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．８５ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．８５ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．８５ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．８５ｍＬ／時間〜約１．９５ｍＬ／時間の間、約１．９０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．９０ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．９０ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．９０ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．９０ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．９０ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約１．９５ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約１．９５ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約１．９５ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約１．９５ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約１．９５ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約１．９５ｍＬ／時間〜約２ｍＬ／時間の間、約２．０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約２．０ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約２．０ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約２．０ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約２．０ｍＬ／時間〜約３ｍＬ／時間の間、約３．０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約３．０ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約３．０ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約３．０ｍＬ／時間〜約４ｍＬ／時間の間、約４．０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約４．０ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間、約４．０ｍＬ／時間〜約５ｍＬ／時間の間、約５．０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間、約５．０ｍＬ／時間〜約６ｍＬ／時間の間または約６．０ｍＬ／時間〜約７ｍＬ／時間の間であり得る。

培養期間全体にわたる培養物への塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）の全容積は、約５０ｍＬと約１１００ｍＬとの間（例えば、約５０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１２０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１１０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約１００ｍＬとの間、約５０ｍＬと約９０ｍＬとの間、５０ｍＬと約８０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約７０ｍＬとの間、約５０ｍＬと約６０ｍＬとの間、約６０ｍＬ〜約１１００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１２０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１１０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約１００ｍＬとの間、約６０ｍＬと約９０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約８０ｍＬとの間、約６０ｍＬと約７０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１２０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１１０ｍＬとの間、約８０ｍＬと約１００ｍＬとの間、約８０ｍＬと約９０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１２０ｍＬとの間、約１００ｍＬと約１１０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと１５０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１４０ｍＬとの間、約１２０ｍＬと約１３０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１６０ｍＬとの間、約１４０ｍＬと約１５０ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約５００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１８０ｍＬとの間、約１６０ｍＬと約１７０ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約８００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約６００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約４００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約３００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約２００ｍＬとの間、約１８０ｍＬと約１９０ｍＬとの間、約２００ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約８００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約６００ｍＬとの間、約２００ｍＬと約４００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約１１００ｍＬ、４００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約８００ｍＬとの間、約４００ｍＬと約６００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約１０００ｍＬとの間、約６００ｍＬと約８００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約１１００ｍＬとの間、約８００ｍＬと約１０００ｍＬとの間または約９００ｍＬと約２１００ｍＬとの間であり得る。

培養期間全体にわたって培養物に添加される塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）の全容積は、第１の培養培地の容積、または接種後であるが、フィード培養培地を添加する前の培養物の容積の約１％と約７％との間（例えば、約１％と約６％との間、約１％と約５％との間、約１％と約４％との間、約１％と約３％との間、約１％と約２％との間、約２％と約７％との間、約２％と約６％との間、約２％と約５％との間、約２％と約４％との間、約２％と約３％との間、約３％と約７％との間、約３％と約６％との間、約３％と約５％との間、約３％と約４％との間、約４％と約７％との間、約４％と約６％との間、約４％と約５％との間、約５％と約７％との間、約５％と約６％との間または約６％と約７％との間）であり得る。

塩基溶液（例えば、アルカリ塩基溶液）の連続的添加は、約７０時間〜約１２５時間の間（例えば、約７０時間〜約１２０時間の間、約７０時間〜約１１０時間の間、約７０時間〜約１００時間の間、約７０時間〜約９０時間の間、約７０時間〜約８０時間の間、約８０時間〜約１２５時間の間、約８０時間〜約１２０時間の間、約８０時間〜約１１０時間の間、約８０時間〜約１００時間の間、約８０時間〜約９０時間の間、約９０時間〜約１２５時間の間、約９０時間〜約１２０時間の間、約９０時間〜約１１０時間の間、約９０時間〜約１００時間の間、約９２時間〜約１００時間の間、約１００時間〜約１２５時間の間、約１００時間〜約１２０時間の間、約１００時間〜約１１０時間の間、約１１０時間〜約１２５時間の間、約１１０時間〜約１２０時間の間または約１２０時間〜約１２５時間の間の期間にわたって行うことができる。

消泡剤の添加
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、流加培養中に、第１の培養培地に消泡剤を添加することをさらに含む。流加培養物に添加される消泡剤の量は、当技術分野で周知である。例えば、消泡剤は、必要に応じて発泡を制御するために、およそ１ｍＬアリコート中の第１の培養培地に添加することができる。

撹拌
細胞の流加培養は、通常、培養物を混合するためのいくつかの形態の撹拌を含む。例えば、流加培養で使用される撹拌は、インペラを使用する回転撹拌であり得る。撹拌は、約４０ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭ（例えば、約４０ＲＰＭ〜約７５ＲＰＭ、約４０ＲＰＭ〜約７０ＲＰＭ、４０ＲＰＭ〜約６５ＲＰＭ、約４０ＲＰＭ〜約６０ＲＰＭ、約４０ＲＰＭ〜約５５ＲＰＭ、約４０ＲＰＭ〜約５０ＲＰＭ、約４０ＲＰＭ〜約４５ＲＰＭ、約４５ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭ、約４５ＲＰＭ〜約７５ＲＰＭ、約４５ＲＰＭ〜約７０ＲＰＭ、約４５ＲＰＭ〜約６５ＲＰＭ、約４５ＲＰＭ〜約６０ＲＰＭ、約４５ＲＰＭ〜約５５ＲＰＭ、約４５ＲＰＭ〜約５０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ〜約７５ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ〜約７０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ〜約６５ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ〜約６０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ〜約５５ＲＰＭ、約５５ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭ、約５５ＲＰＭ〜約７５ＲＰＭ、約５５ＲＰＭ〜約７０ＲＰＭ、約５５ＲＰＭ〜約６５ＲＰＭ、約５５ＲＰＭ〜約６０ＲＰＭ、約６０ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭ、約６０ＲＰＭ〜約７５ＲＰＭ、約６０ＲＰＭ〜約７０ＲＰＭ、約６０ＲＰＭ〜約６５ＲＰＭ、約６５ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭ、約６５ＲＰＭ〜約７５ＲＰＭ、約６５ＲＰＭ〜約７０ＲＰＭ、約７０ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭ、約７０ＲＰＭ〜約７５ＲＰＭ、または約７５ＲＰＭ〜約８０ＲＰＭの回転数で行うことができる。撹拌は、連続的または周期的に実施することができる。

温度
本明細書に記載される流加培養するステップは、約３２℃〜約３９℃、例えば、約３２℃〜約３８．５℃、約３２℃〜約３８℃、約３２℃〜約３７．５℃、約３２℃〜約３７℃、約３２℃〜約３６．５℃、約３２℃〜約３６℃、約３２℃〜約３５．５℃、約３２℃〜約３５℃、約３２℃〜約３４．５℃、約３２℃〜約３４℃、約３２℃〜約３３．５℃、約３２℃〜約３３℃、約３２℃〜約３２．５℃、約３２．５℃〜約３９℃、約３２．５℃〜約３８．５℃、約３２．５℃〜約３８℃、約３２．５℃〜約３７．５℃、約３２．５℃〜約３７℃、約３２．５℃〜約３６．５℃、約３２．５℃〜約３６℃、約３２．５℃〜約３５．５℃、約３２．５℃〜約３５℃、約３２．５℃〜約３４．５℃、約３２．５℃〜約３４℃、約３２．５℃〜約３３．５℃、約３２．５℃〜約３３℃、約３３℃〜約３９℃、約３３℃〜約３８．５℃、約３３℃〜約３８℃、約３３℃〜約３７．５℃、約３３℃〜約３７℃、約３３℃〜約３６．５℃、約３３℃〜約３６℃、約３３℃〜約３５．５℃、約３３℃〜約３５℃、約３３℃〜約３４．５℃、約３３℃〜約３４℃、約３３℃〜約３３．５℃、約３３．５℃〜約３９℃、約３３．５℃〜約３８．５℃、約３３．５℃〜約３８℃、約３３．５℃〜約３７．５℃の間、約３３．５℃〜約３７℃、約３３．５℃〜約３６．５℃、約３３．５℃〜約３６℃、約３３．５℃〜約３５．５℃、約３３．５℃〜約３５℃、約３３．５℃〜約３４．５℃、約３３．５℃〜約３４℃、約３４℃〜約３９℃、約３４℃〜約３８．５℃、約３４℃〜約３８℃、約３４℃〜約３７．５℃、約３４℃〜約３７℃、約３４℃〜約３６．５℃、約３４℃〜約３６℃、約３４℃〜約３５．５℃、約３４℃〜約３５℃、約３４℃〜約３４．５°、約３４．５℃〜約３９℃、約３４．５℃〜約３８．５℃、約３４．５℃〜約３８℃、約３４．５℃〜約３７．５℃、約３４．５℃〜約３７℃、約３４．５℃〜約３６．５℃、約３４．５℃〜約３６℃、約３４．５℃〜約３５．５℃、約３４．５℃〜約３５℃、約３５℃〜約３９℃、約３５℃〜約３８．５℃、約３５℃〜約３８℃、約３５℃〜約３７．５℃、約３５℃〜約３７℃、約３５℃〜約３６．５℃、約３５℃〜約３６℃、約３５℃〜約３５．５℃、約３５．５℃〜約３９℃、約３５．５℃〜約３８．５℃、約３５．５℃〜約３８℃、約３５．５℃〜約３７．５℃、約３５．５℃〜約３７℃、約３５．５℃〜約３６．５℃、約３５．５℃〜約３６℃、約３６℃〜約３９℃、約３６℃〜約３８．５℃、約３６℃〜約３８℃、約３６℃〜約３７．５℃、約３６℃〜約３７℃、約３６℃〜約３６．５℃、約３６．５℃〜約３９℃、約３６．５℃〜約３８．５℃、約３６．５℃〜約３８℃、約３６．５℃〜約３７．５℃、約３６．５℃〜約３７℃、約３７℃〜約３９℃、約３７℃〜約３８．５℃、約３７℃〜約３８℃、約３７℃〜約３７．５℃、約３７．５℃〜約３９℃、約３７．５℃〜約３８．５℃、約３７．５℃〜約３８℃、約３８℃〜約３９℃、約３８℃〜約３８．５℃、または約３８．５℃〜約３９℃）の温度で実施することができる。例えば、ＮＳ０を、培養期間の開始から最後まで約３６．５℃の温度でインキュベートすることができる。当業者は、この温度が、培養期間中に、例えば、１時間毎に、または毎日、僅かに変化され得るまたは変動し得ることを理解する。例えば、この温度は、培養期間のスタートの約１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１４日後もしくは１５日後に、または培養期間内の任意の時点において、変化またはシフト（例えば、上昇または低下）され得る。例えば、この温度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０．０℃、上方にシフトされ得る。別の一例では、この温度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０℃、下方にシフトされ得る。

ＣＯ_２
流加培養するステップは、約１％〜１５％のＣＯ_２、最大でも１４％もしくは約１４％のＣＯ_２、最大でも１３％もしくは約１３％のＣＯ_２、最大でも１２％もしくは約１２％のＣＯ_２、最大でも１１％もしくは約１１％のＣＯ_２、最大でも１０％もしくは約１０％のＣＯ_２、最大でも９％もしくは約９％のＣＯ_２、最大でも８％もしくは約８％のＣＯ_２、最大でも５％もしくは約５％のＣＯ_２、最大でも６％もしくは約６％のＣＯ_２、最大でも５％もしくは約５％のＣＯ_２、最大でも４％もしくは約４％のＣＯ_２、最大でも３％もしくは約３％のＣＯ_２、最大でも２％もしくは約２％のＣＯ_２、または最大でも１％もしくは約１％のＣＯ_２を含有する雰囲気を使用して実施することができる。産生バイオリアクター中にＣＯ_２をスパージするための方法は、当技術分野で周知である。

本明細書に記載される方法のいずれも、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８５％、８０％、８５％、９０％、もしくは約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％、もしくは約９５％の湿度、または約１００％の湿度を含む加湿雰囲気中で、第１の期間中に細胞を流加培養するステップも含み得る。

ｄＯ_２
流加培養するステップは、約１０％と約２０％との間（例えば、約１０％と約１９％との間、約１０％と約１８％との間、約１０％と約１７％との間、約１０％と約１６％との間、約１０％と約１５％との間、約１０％と約１４％との間、約１０％と約１３％との間、約１０％と約１２％との間、約１０％と約１１％との間、約１１％と約２０％との間、約１１％と約１９％との間、約１１％と約１８％との間、約１１％と約１７％との間、約１１％と約１６％との間、約１１％と約１５％との間、約１１％と約１４％との間、約１１％と約１３％との間、約１１％と約１２％との間、約１２％と約２０％との間、約１２％と約１９％との間、約１２％と約１８％との間、約１２％と約１７％との間、約１２％と約１６％との間、約１２％と約１５％との間、約１２％と約１４％との間、約１２％と約１３％との間、約１３％と約２０％との間、約１３％と約１９％との間、約１３％と約１８％との間、約１３％と約１７％との間、約１３％と約１６％との間、約１３％と約１５％との間、約１３％と約１４％との間、約１４％と約２０％との間、約１４％と約１９％との間、約１４％と約１８％との間、約１４％と約１７％との間、約１４％と約１６％との間、約１４％と約１５％との間、約１５％と約２０％との間、約１５％と約１９％との間、約１５％と約１８％との間、約１５％と約１７％との間、約１５％と約１６％との間、約１６％と約２０％との間、約１６％と約１９％との間、約１６％と約１８％との間、約１６％と約１７％との間、約１７％と約２０％との間、約１７％と約１９％との間、約１７％と約１８％との間、約１８％と約２０％との間、約１８％と約１９％との間または約１９％と約２０％との間）の細胞培養物中の溶存酸素（ｄＯ_２）を維持することによって実施することができる。

ｐＨ
流加培養するステップの間、細胞培養物のｐＨは、アルカリ塩基溶液（上述した）などの塩基溶液の添加によって特定のｐＨ値で維持することができる。細胞培養物のｐＨは、約６．５と約７．５との間（例えば、約６．５と約７．４との間、約６．５と約７．３との間、約６．５と約７．２との間、約６．５と約７．１との間、約６．５と約７．０との間、約６．５と約６．９との間、約６．５と約６．８との間、約６．５と約６．７との間、約６．５と約６．６との間、約６．６と約７．５との間、約６．６と約７．４との間、約６．６と約７．３との間、約６．６と約７．２との間、約６．６と約７．１との間、約６．６と約７．０との間、約６．６と約６．９との間、約６．６と約６．８との間、約６．６と約６．７との間、約６．７と約７．５との間、約６．７と約７．４との間、約６．７と約７．３との間、約６．７と約７．２との間、約６．７と約７．１との間、約６．７と約７．０との間、約６．７と約６．９との間、約６．７と約６．８との間、約６．８と約７．５との間、約６．８と約７．４との間、約６．８と約７．３との間、約６．８と約７．２との間、約６．８と約７．１との間、約６．８と約７．０との間、約６．８と約６．９との間、約６．９と約７．５との間、約６．９と約７．４との間、約６．９と約７．３との間、約６．９と約７．２との間、約６．９と約７．１との間、約６．９と約７．０との間、約７．０と約７．５との間、約７．０と約７．４との間、約７．０と約７．３との間、約７．０と約７．２との間、約７．０と約７．１との間、約７．１と約７．５との間、約７．１と約７．４との間、約７．１と約７．３との間、約７．１と約７．２との間、約７．２と約７．５との間、約７．２と約７．４との間、約７．２と約７．３との間、約７．３と約７．５との間、約７．３と約７．４との間または約７．４と約７．５との間）のｐＨで維持することができる。

エクリズマブ
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて培養される哺乳動物細胞によって産生される組換えタンパク質は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む組換えエクリズマブであり得る。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて培養される哺乳動物細胞によって産生される組換えタンパク質は、配列番号１の重鎖および配列番号２の軽鎖を含む組換えエクリズマブであり得る。

エクリズマブの重鎖および軽鎖をコードする核酸は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，３５５，２４５号における核酸配列、およびＡｎら、ｍＡｂｓ、１巻：６号、５７２〜５７９頁、２００９年におけるＦｃ領域配列を参照のこと）。

１つまたは複数の細胞培養パラメーターの評価
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、流加培養における１つまたは複数の細胞培養パラメーターを評価することをさらに含む。細胞培養パラメーターの非限定的な例としては、細胞増殖、百分率細胞生存度、生存細胞密度、好気性グルコース消費量、エクリズマブ力価、比産生率、容積産生率、乳酸レベル、エクリズマブ品質（例えば、断片化および結合親和性）、乳酸産生、グルコースレベル、ならびにｐＨがある。

１つまたは複数の細胞培養パラメーターを評価するために使用することができる方法は、当技術分野で周知である。例えば、細胞増殖および百分率細胞生存度は、例えば、ＶｉＣｅｌｌＸＲ自動細胞計数器を使用して決定することができる。培養物中に存在するエクリズマブの量は、分光光度的吸光度またはブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して決定することができる。培養物中に存在するエクリズマブの量は、連続希釈によって力価として決定することができる。グルコースレベルおよび乳酸レベルは、当技術分野で周知の方法、例えば、Ａｂｃａｍによって販売されているグルコースアッセイキットおよびＬ−乳酸アッセイキットを使用して決定することができる。流加培養物中のｐＨは、例えば、培養物中にｐＨプローブを配置することによって決定することができる。

１つまたは複数の評価された細胞培養パラメーターは、大規模エクリズマブ産生細胞培養で決定される同じ１つまたは複数の細胞培養パラメーターと比較することができる。

エクリズマブの収集
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、流加培養するステップで産生された組換えエクリズマブを収集するステップをさらに含む。一部の例では、収集するステップは、哺乳動物細胞を溶解させることを含む。一部の例では、組換えエクリズマブは、培養培地（例えば、第１の液体培養培地およびフィード培養培地の一方もしくは両方、または第１の液体培養培地、第１の液体フィード培養培地、および第２の液体フィード培養培地の１つ、２つ、もしくは３つ）から収集される。哺乳動物細胞を溶解させるための方法は、当技術分野で周知である。培地から組換え抗体（エクリズマブなど）を収集するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、親和性クロマトグラフィーおよび／または濾過を含む。

収集されたエクリズマブの精製
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、収集された組換えエクリズマブを精製するステップをさらに含む。当技術分野で公知であるように、収集された組換え抗体（エクリズマブなど）は、当技術分野で公知の方法を使用して精製することができる。例えば、濾過およびクロマトグラフィー（例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ樹脂を使用する）、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）の１つまたは複数のステップを、収集された組換え抗体（例えば、エクリズマブ）を精製するために形成することができる。収集された組換え抗体（例えば、エクリズマブ）を精製するためのさらなる方法は、当技術分野で周知である。

精製された組換えエクリズマブは、液体培養培地由来の混入タンパク質、ならびに／または哺乳動物細胞の溶解物由来の混入ＤＮＡ、タンパク質、脂質、および炭水化物を実質的に含まない（少なくとも９０％、または約９０％含まない、あるいは約９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％、もしくは約９９％含まないなど）場合がある。

収集または精製されたエクリズマブの等電性プロファイル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｒｏｆｉｌｅ）のシフト
一部の例では、収集または精製された組換えエクリズマブの等電性プロファイルを、参照によって本明細書に組み込まれる、２０１４年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０６４，３９７号に記載される方法を使用してシフトさせる（より酸性の等電性プロファイルにシフトさせる）ことができる。

エクリズマブの製剤化
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、収集された組換えエクリズマブ、精製された組換えエクリズマブ、またはシフトされた組換えエクリズマブを医薬組成物に製剤化することをさらに含む。収集された組換えエクリズマブ、精製された組換えエクリズマブ、またはシフトされた組換えエクリズマブを医薬組成物に製剤化することは、精製された組換えエクリズマブ、収集された組換えエクリズマブ、またはシフトされた組換えエクリズマブを薬学的に許容される賦形剤に混合または添加して医薬組成物を創製するステップを含み得る。薬学的に許容される賦形剤（例えば、天然に存在しない薬学的に許容される賦形剤）の例は、当技術分野で周知である。

本発明を、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない、以下の実施例においてさらに記載する。

（実施例１）
エクリズマブ産生細胞培養を再現することにおける以前の試み
エクリズマブは、典型的には、１０，０００Ｌ流加哺乳動物細胞培養を使用して産生される。産生細胞培養物中の哺乳動物細胞は、培養期間中に培養培地に組換えエクリズマブを分泌する。以前の試みは、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養で観察される培養パラメーターを再現しようとするためになされた。１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養を再現することにおける以前の試みは、失敗に終わった。なぜなら、以前の小規模培養は、１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養と比較して、時間をわたっての培養物中の乳酸のレベルの低下、時間をわたっての培養物中のナトリウムの低下、および時間をわたってのｐＨの異なる傾向を示したためである（それぞれ図１、２、および３を参照のこと）。さらに、以前の小規模培養は、時間をわたっての生存細胞密度の増大、培養期間中の後の時点における百分率細胞生存度の増大、培養期間中の後の時点におけるエクリズマブの力価の増大、および培養期間中の後の時点における培養物中のグルコース濃度の増大を示した（それぞれ図４、６、８、および１０を参照のこと）。

（実施例２）
エクリズマブ産生細胞培養を正確に再現するための新しい小規模培養
新しい小規模モデルを開発および試験して、新しい細胞小規模培養モデルが１０，０００Ｌエクリズマブ産生細胞培養の培養パラメーターを正確に再現するか否かを決定した。

新しく開発した小規模培養は、以下の方法を使用して培養した。Ａｐｐｌｉｋｏｎ７Ｌ容器を、培養物をインキュベートするために使用した。Ａｐｐｌｉｋｏｎ７Ｌ容器は、容器にガスを導入するためのＬ型ドリル穴スパージャーおよびオーバーレイポート、４つの１２ｍｍポート（ｐＨセンサー、溶存酸素センサー、セプタム、および排気コンデンサーのための）、三重添加トップポート（ｔｒｉｐｌｅａｄｄｉｔｉｏｎｔｏｐ−ｐｏｒｔ）、試料／回収浸漬管、ならびにオーバーヘッドモーター駆動インペラシャフトを含有する。容器をガス供給システム、外部コントロールに接続するために、管類をこれらのポートに取り付け、２種の異なる液体フィード培養培地、塩基溶液、および脂質溶液を、培養期間中に、バイオリアクターに与えた。

バイオリアクターを、内部蒸気発生のために脱イオン水５〜１０ｍＬを使用してオートクレーブした。接種の前に、第１の液体培養培地３．７Ｌをバイオリアクターに添加した。次いで培地を、空気および二酸化炭素をスパージし、６０ＲＰＭで初期撹拌しながら３６．５℃で保持した。接種する前の６時間内に、リノール酸、オレイン酸、およびコレステロールを含有する第１の脂質溶液３．７ｍＬを、ヘッドプレートセプタムを通じてバイオリアクターに添加した。ｐＨおよびｄＯ_２センサーを接種前に標準化し、ｄＯ_２センサーを第１の脂質溶液を添加した後であるが、接種の前に、１００％空気飽和に対して較正した。

シードトレインＮＳ０細胞培養物を使用して、５×１０^５細胞／ｍＬの初期生存細胞密度、および４．２Ｌの初期培養物容積を生じさせるのに（接種後）バイオリアクターに添加されるシードトレインＮＳ０細胞培養物の正確な容積を計算した。次いで細胞培養物を、６０ＲＰＭの回転撹拌速度、３６．５℃の温度、７．００のｐＨ、および１５％のｄＯ_２を使用して培養した。使用したガス発生ストラテジーは、１５％のｄＯ_２設定ポイントを維持するのにオンデマンドで必要とされる場合、累積的な最大で３０．０ＳＬＰＨの追加のＯ_２とともに、０〜３０．０ＳＬＰＨの空気を使用することであった。使用した空気オーバーレイは、２２５ｍＬ／分の空気であった。培養期間の０日目〜５日目において、ｐＨ設定ポイントをｐＨ７．００±０．０５に設定した。培養期間の５日目〜９日目において（または標的細胞密度が培養の２日目に満たされる場合、フィードをスタートして４８時間後）、ｐＨ設定ポイントをｐＨ７．００±０．２５に設定した。１０日目〜培養物回収において、ｐＨ設定ポイントをｐＨ７．００±０．０５に設定した。

細胞培養物が１８×１０^５細胞／ｍＬに等しい、またはそれ超の標的細胞密度を達成したら、第２の脂質溶液（オレイン酸、リノール酸、およびコレステロールを含有する）の１ｍＬ／Ｌボーラス添加を、バイオリアクターに添加した（典型的には４．２ｍＬ）。第２の脂質溶液の添加の後、２種の異なる液体フィード培養培地（第１および第２の液体フィード培養培地）の培養物への添加を開始した。第１および第２の液体フィード培養培地のそれぞれ１６８ｍＬを、５．５日（１３３．３時間）にわたってバイオリアクターに連続的に添加した。５．５日にわたって添加した第１の液体フィード培養培地の正味の容積は、初期培養物容積の４％であった。５．５日にわたって添加した第２の液体フィード培養培地の正味の容積は、初期培養物容積の４％であった。第１および第２の液体フィード培養培地の両方のフィードは、典型的には、培養期間を開始しておよそ７２時間後〜開始期間後のおよそ２０５．３時間で行う。第１の液体フィード培養培地および第２の液体フィード培養培地の両方を、１分当たりおよそ２１μＬで、マルチシリンジポンプセットアップで培養物に添加した。

Ｇｉｂｃｏの動物由来成分を含まない（ＡＯＦ）ＦｏａｍＡｗａｙを、ヘッドプレートセプタムを通じて１．０ｍＬのショットで必要に応じて添加した。

０．７５Ｍ炭酸ナトリウムおよび０．５Ｍ炭酸水素ナトリウムを含有する塩基溶液１６８ｍＬを９６時間にわたって培養物に連続的に添加し、連続的添加は、第１の液体フィード培養培地および第２の液体フィード培養培地の培養物への連続的添加をスタートしておよそ４８時間後である時点において開始した。一般に、塩基溶液は、培養期間をスタートして１２０時間後から培養期間をスタートして２１６時間後の間に培養物に連続的に添加した。塩基溶液は、１分当たりに基づいて連続流でマルチシリンジポンプを使用してヘッドプレートトリポート（ｔｒｉｐｏｒｔ）ラインを通じて培養物の液面の真上に添加した。

各小規模培養における培養期間にわたる培養物中の生存細胞密度、百分率細胞生存度、エクリズマブ力価、およびグルコース濃度を、当技術分野で周知の方法を使用して決定した。

得られたデータは、以前の小規模エクリズマブ細胞培養と対照的に、新しく開発した小規模エクリズマブ流加細胞培養が、エクリズマブ産生細胞培養における時間をわたっての生存細胞密度（図５を図４と比較されたい）、エクリズマブ産生細胞培養における時間をわたっての百分率細胞生存度（図７を図６と比較されたい）、エクリズマブ産生細胞培養における時間をわたってのエクリズマブの力価（図９を図８と比較されたい）、およびエクリズマブ産生細胞培養における時間をわたってのグルコースの濃度（図１１を図１０と比較されたい）を正確に再現することができることを示す。

つまり、データは、本明細書に提供する小規模培養方法が、エクリズマブ産生細胞培養の細胞培養パラメーターの少なくとも４つを正確に再現することを示す。

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するのではなく説明する意図であることを、理解すべきである。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims

小規模培養において大規模エクリズマブ産生細胞培養を再現する方法であって、
接種の前に、リノール酸、オレイン酸およびコレステロールを含む第１の脂質溶液３．７ｍＬを添加するステップ；
バイオリアクターの容量の７０％から９０％の間を占め、２．５×１０^５から７．５×１０^５ＮＳ０細胞／ｍＬの間の初期細胞密度を有する第１の培養培地を含有する４Ｌ〜１０Ｌの流加バイオリアクターを提供するステップであって、前記細胞が組換えエクリズマブをコードする核酸を含む、ステップ；
前記バイオリアクター中で前記細胞を１４％〜１６％の間のｄＯ_２レベル、および５０ＲＰＭから７０ＲＰＭの間の回転撹拌で、３４℃〜３９℃で少なくとも８日間、培養するステップ；
１３×１０^５〜２０×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、流加培養を維持するステップ；
前記細胞の培養が１８×１０ ^５細胞／ｍＬに等しい、またはそれ超の標的細胞密度を達成した後に、オレイン酸、リノール酸およびコレステロールを含む第２の脂質溶液の１ｍＬ／Ｌボーラスを前記バイオリアクターに添加するステップ、次いで；
（１）１２０時間〜１５０時間の期間にわたって前記フィード培養培地を前記第１の培養培地に連続的に添加するステップ、そしてフィード培養培地の連続的添加をスタートしてから４０〜６０時間後に
（２）９０時間〜１０５時間の間の期間にわたってアルカリ塩基溶液を前記第１の培養培地に連続的に添加するステップ
を含む、方法。
前記第１の培養培地および前記フィード培養培地の一方または両方が、処理済みウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
前記処理済みＢＳＡが、処理済みＮｅｗＺｅａｌａｎｄＢＳＡである、請求項２に記載の方法。
前記初期細胞密度が、４．０×１０^５細胞／ｍＬから６．０×１０^６細胞／ｍＬの間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記バイオリアクターが、４Ｌ〜６Ｌの間の容量を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記第１の培養培地が、前記バイオリアクターの容量の８０％〜８８％の間を占める、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
前記流加培養が、３６℃〜３７℃の温度で実施される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
前記回転撹拌が、５５ＲＰＭから６５ＲＰＭの間である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
前記標的細胞密度が、１７×１０^５細胞／ｍＬから１９×１０^５細胞／ｍＬの間である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記アルカリ塩基溶液が、９２時間〜１００時間の間の期間にわたって前記第１の培養培地に連続的に添加される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
前記バイオリアクターが、前記第１の培養培地４．２Ｌを含み、前記アルカリ塩基溶液が、１．６５ｍＬ／時間〜１．８５ｍＬ／時間の間の速度で前記第１の培養培地に連続的に添加される、請求項１０に記載の方法。
前記アルカリ塩基溶液が、０．６５Ｍから０．８５Ｍの間の炭酸ナトリウム、および０．４Ｍから０．６Ｍの間の炭酸水素ナトリウムを含む、請求項１１に記載の方法。
単一のフィード培養培地が、前記第１の培養培地に連続的に添加される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
２種の異なるフィード培養培地が、前記第１の培養培地に連続的に添加される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
前記２種の異なるフィード培養培地のそれぞれが、１５μＬ／分〜３５μＬ／分の間の速度で前記第１の培養培地に連続的に添加される、請求項１４に記載の方法。
前記２種の異なるフィード培養培地のそれぞれが、２０μＬ／分〜２５μＬ／分の間の速度で前記第１の培養培地に連続的に添加される、請求項１５に記載の方法。
前記フィード培養培地が、１３０時間〜１３５時間の間の期間にわたって前記第１の培養培地に連続的に添加される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
培養中に前記第１の培養培地に消泡剤を添加するステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
前記培養するステップで産生された前記組換えエクリズマブを収集するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
収集するステップが、前記細胞を溶解させることを含む、請求項１９に記載の方法。
組換えエクリズマブが、前記第１の培養培地および前記フィード培養培地の一方または両方から収集される、請求項１９に記載の方法。
エクリズマブが、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
エクリズマブが、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む、請求項２２に記載の方法。
細胞増殖、百分率細胞生存度、生存細胞密度、好気性グルコース消費量、エクリズマブ力価、比産生率、容積産生率、乳酸産生、およびエクリズマブ品質からなる群より選択される１つまたは複数の細胞培養パラメーターを評価するステップをさらに含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。