KR20230170728A - 포유류 세포의 관류 배양 방법 - Google Patents
포유류 세포의 관류 배양 방법 Download PDFInfo
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Abstract
약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 함유하는 용기를 제공하는 단계; 약 32℃ 내지 약 39℃에서 일정 기간 동안 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg에서 유지되는, 단계를 포함하는 포유류 세포의 관류 배양 방법이 본원에 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2021년 4월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제63/174,900호에 대한 우선권을 주장하며, 그 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함한다.
기술분야
본 발명은 생명공학 방법 및 재조합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 포유류 세포는 종종 치료적 또는 상업적으로 중요한 단백질을 생산하기 위해 이용된다. 다양한 제품 유통의 현재 상황에서, 생명공학 회사들은 치료 단백질 의약 물질을 매우 유연하고 비용 효과적으로 제조하기 위한 혁신적인 해결책을 개발하기 위해 점점 더 많은 노력을 기울이고 있다.
본 발명은, 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 함유하는 용기를 제공하는 단계; 약 32℃ 내지 약 39℃에서 일정 기간 동안 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며, 용기내 제1 액체 배양 배지의 삼투질농도 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지되며, 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지되지 않는 다른 관류 세포 배양 방법과 비교하여 배양 성장 및 건강 개선을 달성하는 포유류 세포의 관류 배양 방법의 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg(예를 들어, 이에 속하는 임의의 하위범위)의 삼투질농도를 갖는 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 함유하는 용기를 제공하는 단계; 약 32℃ 내지 약 39℃(예를 들어, 이에 속하는 임의의 하위범위)에서 일정 기간 동안 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg(예를 들어, 이에 속하는 임의의 하위범위)에서 유지되는, 단계를 포함하는 포유류 세포의 관류 배양 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 제1 액체 배양 배지는 약 270 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 8 g/L 초과의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 10 g/L 초과의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 12 g/L 초과의 폴록사머를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 폴록사머는 Pluronic F68이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지의 pH는 약 6.8 내지 약 7.1이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 염화나트륨을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일정 기간에 걸쳐 증가된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 100 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 120 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 동시에 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 연속적으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 주기적으로 수행된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지에 제3 부피의 수용액을 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지된다.
일부 실시형태에서, 수용액은 염 용액이다. 일부 실시형태에서, 염 용액은 염화나트륨 용액 또는 염화칼륨 용액이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 동시에 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 연속적으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 주기적으로 수행된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 제1 액체 배양 배지에 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/mg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지된다.
일부 실시형태에서, 제3 액체 배양 배지는 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제3 액체 배양 배지는 약 10 mOsm/kg 내지 약 270 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제3 액체 배양 배지는 약 50 mOsm/kg 내지 약 200 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제3 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제3 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제3 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 100 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 120 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 동시에 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 연속적으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 주기적으로 수행된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 포유류 세포는 CHO 세포이다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기는 생물반응기이다. 일부 실시형태에서, 생물반응기는 관류 생물반응기이다.
또한, 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg(예를 들어, 이에 속하는 임의의 하위범위)의 삼투질농도를 갖는 제1 액체 배양 배지에 배치된 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 포유류 세포를 함유하는 용기를 제공하는 단계; 약 32℃ 내지 약 39℃에서 일정 기간 동안 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계(예를 들어, 이에 속하는 임의의 하위범위); 및 상기 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg(예를 들어, 이에 속하는 임의의 하위범위) 내지 약 380 mOsm/kg에서 유지되는, 단계; 및 포유류 세포로부터, 또는 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 제조 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 제1 액체 배양 배지는 약 270 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 8 g/L 초과의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 10 g/L 초과의 폴록사머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 12 g/L 초과의 폴록사머를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 폴록사머는 Pluronic F68이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지의 pH는 약 6.8 내지 약 7.1이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 염화나트륨을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일정 기간에 걸쳐 증가된다. 일부 실시형태에서, 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 100 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 120 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 동시에 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 연속적으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 주기적으로 수행된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로 분비된다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로부터 회수된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지에 제3 부피의 수용액을 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지된다. 일부 실시형태에서, 수용액은 염 용액이다. 일부 실시형태에서, 염 용액은 염화나트륨 용액 또는 염화칼륨 용액이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 동시에 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 연속적으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 주기적으로 수행된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 제1 액체 배양 배지에 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지된다.
일부 실시형태에서, 제3 액체 배양 배지는 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 액체 배양 배지는 약 0 mOsm/kg 내지 약 270 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제3 액체 배양 배지는 약 50 mOsm/kg 내지 약 200 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제3 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제3 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제3 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 100 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다. 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 120 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 일정 기간 동안 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 동시에 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 연속적으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 주기적으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 제1, 제2, 및/또는 제3 액체 배양 배지로 분비된다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 제1, 제2, 및/또는 제3 액체 배양 배지로부터 회수된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 포유류 세포는 CHO 세포이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기는 생물반응기이다. 일부 실시형태에서, 생물반응기는 관류 생물반응기이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편 또는 조작된 단백질이다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 재조합 단백질은 포유류 세포로부터 회수된다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 재조합 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 단리된 재조합 단백질을 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 재조합 단백질이 본원에 제공된다. 또한, 본원에는 본원에 기재된 임의의 재조합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물, 및 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
또한, 치료적 유효량의 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 명사는 그 특정 명사가 하나 이상임을 나타낸다. 예를 들어, "하나의 재조합 포유류 세포"란 어구는 "하나 이상의 재조합 포유류 세포"를 포괄하여 나타낸다.
용어 "포유류 세포"는 임의의 포유동물(예를 들어, 인간, 햄스터, 마우스, 녹색 원숭이, 래트, 돼지, 소, 또는 토끼)로부터의 또는 그로부터 유래된 임의의 세포를 의미한다. 예를 들어, 포유류 세포는 불멸화된 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 포유류 세포는 분화된 또는 미분화된 세포이다. 포유류 세포의 비제한적 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 포유류 세포의 추가 예는 당업계에 알려져 있다.
용어 "배양" 또는 "세포 배양"은 제어된 일련의 물리적 조건 하에서의 포유류 세포의 유지 또는 증식을 의미한다.
용어 "포유류 세포의 배양물," "배양물" 또는 "세포 배양물"은, 물리적 조건들의 조절된 세트 하에서 유지 또는 증식된 복수의 포유류 세포들을 함유하는 액체 배지를 의미한다.
용어 "액체 배양 배지" 또는 "액체 배지"는, 세포(예를 들어, 포유류 세포)가 시험관내에서 성장 또는 증식하도록 하는 충분한 영양분을 함유한 유체를 의미한다. 예를 들어, 액체 배지는 하기 중 1가지 이상을 함유할 수 있다: 아미노산 (예를 들어, 20가지의 아미노산), 퓨린 (하이포잔틴), 피리미딘 (예를 들어, 티미딘), 콜린, 이노시톨, 티아민, 폴산, 비오틴, 칼슘, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티미딘, 시아노코발아민, 피루베이트, 리포산, 마그네슘, 글루코스, 나트륨, 칼륨, 철, 구리, 아연, 및 나트륨 중탄산염. 일부 실시형태에서, 액체 배양 배지는 포유동물의 혈청을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 액체 배양 배지는 혈청 또는 포유동물로부터의 다른 추출물을 함유하지 않는다(규정된 액체 배양 배지). 일부 실시형태에서, 액체 배양 배지는 미량 금속, 포유류 성장 호르몬, 및/또는 포유류 성장 인자를 함유할 수 있다. 액체 배양 배지의 또 다른 예는 최소 배지(예를 들어, 무기 염, 탄소원, 및 물만을 함유하는 배지)이다. 액체 배양 배지의 비제한적 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 액체 배양 배지의 추가의 예는 당업계에 알려져 있으며 상업적으로 이용 가능하다. 액체 배양 배지는 임의의 밀도의 포유류 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 생물 반응기로부터 제거된 액체 배양 배지의 부피에는 포유류 세포가 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "동물 유래 성분이 없는 액체 배양 배지"는 포유동물로부터 유래된 임의의 성분(예를 들어, 단백질 또는 혈청)을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "무혈청 액체 배양 배지"는 포유류 혈청을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "혈청 함유 액체 배양 배지"는 포유류 혈청을 함유하는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "화학적으로 규정된 액체 배양 배지"는 당업계의 용어로서, 모든 화학적 성분이 알려져 있는 액체 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 화학적으로 규정된 액체 배양 배지는 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민, 또는 인간 혈청 알부민을 함유하지 않으며, 이는 이러한 제조물이 전형적으로 알부민과 지질의 복합 믹스(complex mix)를 함유하기 때문이다.
용어 "무단백질 액체 배양 배지"는 임의의 단백질(예를 들어, 임의의 검출 가능한 단백질)을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "정화된 액체 배양 배지"는 박테리아 또는 효모 세포가 실질적으로 존재하지 않는(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99% 존재하지 않는) 박테리아 또는 효모 세포 배양물로부터 얻은 액체 배양 배지를 의미한다.
"교반"이란 용어는 생물반응기 안의 액체 배양 배지의 일부를 휘젓거나 흔드는 것을 의미한다. 이는 예를 들어, 생물 반응기에서 액체 배양 배지 중 용존 O2 농도를 증가시키기 위해 수행된다. 교반은 당해 분야에 알려진 방법, 예를 들어 기기 또는 프로펠러를 사용하여 수행될 수 있다. 생물반응기 안의 일정 분량의 액체 배양 배지를 교반하는 데 사용될 수 있는 예시적 장치 및 방법들은 당해 기술분야에 알려져 있다.
용어 "면역글로불린"은 적어도 15개의 아미노산(예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 아미노산)의 면역글로불린 단백질의 아미노산 서열(예를 들어, 가변 도메인 서열, 프레임워크 서열, 또는 불변 도메인 서열)을 함유하는 폴리펩티드를 의미한다. 면역글로불린은 예를 들어, 경쇄 면역글로불린의 적어도 15개의 아미노산, 예를 들어 중쇄 면역글로불린의 적어도 15개의 아미노산을 포함할 수 있다. 면역글로불린은 단리된 항체(예를 들어, IgG, IgE, IgD, IgA, 또는 IgM)일 수 있다. 면역글로불린은 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 scFv 단편일 수 있다. 면역글로불린은 또한, 이중 특이적 항체 또는 삼중 특이적 항체, 또는 다이머, 트라이머, 멀티머 항체, 또는 디아바디, Affibody®, 또는 Nanobody®일 수 있다. 면역글로불린은 또한, 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 함유한 조작된 단백질(예를 들어, 융합 단백질)일 수 있다. 면역글로불린의 비제한적 예는 본원에 기재되어 있으며, 면역글로불린의 추가 예는 당업계에 알려져 있다. 재조합 면역글로불린은 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
용어 "조작된 단백질"은 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하는 내인성 핵산에 의해 자연적으로 인코딩되지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 조작된 단백질의 예는 효소(예를 들어, 조작된 효소의 안정성 및/또는 촉매 활성의 증가를 야기하는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 첨가를 가짐), 융합 단백질, 항체(예를 들어, 2가 항체, 3가 항체, 또는 디아바디), 및 적어도 하나의 재조합 스캐폴딩 서열(recombinant scaffolding sequence)을 함유한 항원-결합 단백질을 포함한다.
용어 "분비 단백질" 또는 "분비 재조합 단백질"은, 포유류 세포 내에서 번역될 때 적어도 하나의 분비 신호 서열을 본래 함유하고, 적어도 부분적으로는 포유류 세포에서 분비 신호 서열의 효소적 절단을 통해, 세포 외 공간(예를 들어, 액체 배양 배지)으로 적어도 일부가 분비되는 단백질(예를 들어, 재조합 단백질)을 의미한다. 당업자는 "분비" 단백질이 분비된 단백질로 간주되기 위해 세포로부터 완전히 해리될 필요가 없음을 이해할 것이다.
용어 "관류 생물 반응기"는 제1 액체 배양 배지에 복수의 세포(예를 들어, 포유류 세포)를 함유하는 생물 반응기를 의미하며, 여기서 생물 반응기에 존재하는 세포의 배양은 제1 액체 배양 배지의 주기적 또는 연속적 제거, 및 그와 동시에 또는 그 직후에 이루어지는 생물 반응기로의 실질적으로 동일한 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가를 포함한다. 일부 예에서, 배양 기간(예를 들어, 일일 단위의 액체 배양 배지 재공급 속도) 동안 증분 기간(예를 들어, 약 24시간의 기간, 약 1분 내지 약 24시간의 기간, 또는 24시간 초과의 기간)에 걸쳐 제거되고 첨가되는 제1 액체 배양 배지 부피의 증분 변화(예를 들어, 증가 또는 감소)가 존재한다. 매일 제거되고 교체되는 배지의 분율은 배양되는 특정 세포, 초기 시딩(seeding) 밀도, 및 특정 시간에서의 세포 밀도에 따라 달라질 수 있다. "RV" 또는 "반응기 부피"는 배양 공정의 시작 시 존재하는 액체 배양 배지의 부피(예를 들어, 시딩 후 존재하는 액체 배양 배지의 총 부피)를 의미한다.
"비생산율" 또는 "SP"는 본 기술 분야의 용어로서, 본원에서 사용되는 바와 같이 일일 포유류 세포당 생성된 재조합 치료용 단백질의 질량 또는 효소 활성을 나타낸다. 재조합 치료용 항체의 SP는 일반적으로 질량/세포/일로서 측정된다. 재조합 치료용 효소의 SPR은 일반적으로 단위/세포/일 또는 (단위/질량)/세포/일로서 측정된다.
"체적 생산율" 또는 "VP"는 본 기술 분야의 용어로서, 본원에서 사용되는 바와 같이 일일 배양물 체적당 (예를 들어, 생물 반응기, 베셀(vessel), 또는 튜브 체적 1 L당) 생성된 재조합 치료용 단백질의 질량 또는 효소 활성을 나타낸다. 재조합 치료용 항체의 VP는 일반적으로 질량/L/일로서 측정된다. 재조합 치료용 효소의 VP는 일반적으로 단위/L/일 또는 질량/L/일로서 측정된다.
구 "농도에서의 폴록사머" 및 "폴록사머 농도"는 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 구 "X g/L 이상의 폴록사머" 및 "X g/L 또는 X g/L 초과의 농도에서의 폴록사머"는 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 당업계에 알려진 다른 적합한 방법 및 물질 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법, 및 예는 예시일 뿐이며 이를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 진탕 플라스크에서 다양한 삼투질농도(mOsm/kg)로 수행된 배치 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)의 그래프이다. (n = 2). 0, 4, 및 7일차의 평균 삼투질농도는 mOsm으로 표시된다.
도 1b는 Ambr15 미세생물반응기에서 다양한 삼투질농도(mOsm/kg)로 수행된 배치 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)의 그래프이다. (n = 2). 0, 2, 5, 7, 및 9일차의 평균 삼투질농도는 mOsm으로 표시된다.
도 2a는 진탕 플라스크의 삼투질농도(mOsm/kg)에 대한 4일차 평균 세포 직경(μm)의 그래프이다.
도 2b는 Ambr15 미세생물반응기의 삼투질농도(mOsm/kg)에 대한 5일차 평균 세포 직경(μm)의 그래프이다.
도 3a는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다. Run V22(“V22”)는 생물반응기에서 높은 삼투질농도를 초래한, 농축된 세포 배양 배지 공급물 대 물 공급물의 비율을 가졌다.
도 3b는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)(실선) 및 Vi-CELL 평균 직경(μm)(점선)의 그래프이다. Run V22 (“V22”)는 높은 삼투질농도를 경험했으며, 이는 성장률 감소 및 생존율 감소를 초래했다.
도 3c는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 수확량 생산율(VP)(g/L/일)(실선) 및 수확 역가(g/L)(점선)의 그래프이다. Run V22 (“V22”)는 높은 삼투질농도를 가졌으며, 이는 생산율을 감소시켰다.
도 3d는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존율(%)(실선) 및 락트산염 탈수소효소(LDH) 생성(U/L/일)(점선)의 그래프이다. Run V22 (“V22”)는 높은 삼투질농도를 가졌고, 이는 낮은 배양 상태를 나타내는 높은 LDH 생산으로 이어졌다.
도 3e는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 글루코스 농도(g/L)(실선) 및 락트산염 농도(g/L)(점선)의 그래프이다. Run V22 (“V22”)는 높은 삼투질농도를 가졌고, 이는 증가된 락트산염 생성을 초래했다.
도 4a는 Protein 3 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)(실선) 및 생존율(%)(점선)의 그래프이다. 높은 삼투질농도로 인해 VCD 및 배양 생존율이 감소했다.
도 4b는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 락트산염 농도(g/L)(실선) 및 락트산염 삼투질농도(mOsm/kg)(점선)의 그래프이다. 높은 삼투질농도로 인해 락트산염 생성이 증가하였다.
도 5a는 다양한 삼투질농도 프로필을 보여주는 관류 세포 배양 생물반응기 세트에서 시간 경과에 따른 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 5b는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)(실선) 및 Vi-CELL 평균 직경(μm)(점선)의 그래프이다. VCD 프로필의 차이는 다양한 배양 삼투질농도에 해당한다.
도 6a는 모든 데이터를 사용하여 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 전도도(mS/cm)에 대한 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 6b는 반응기 규모 및 배양 단계(낮거나 높은 바이오매스)를 특징으로 하는 데이터를 사용하여 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 전도도(mS/cm)에 대한 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 7은 자동화된 전도도 피드백 제어를 갖춘 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 전도도(mS/cm)(실선) 및 삼투질농도(mOsm/kg)(개별 데이터 포인트)의 그래프이다.
도 8a는 자동화된 전도도 피드백 제어를 갖춘 10L 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 8b는 일관된 VCD 프로필을 나타내는 10L 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)(실선) 및 Vi-CELL 평균 직경(μm)(점선)의 그래프이다.
도 9는 다양한 프로브 유형으로 측정한 삼투질농도 표준물질의 삼투질농도(mOsm/kg)에 대한 전도도(mS/cm)의 그래프이다.
도 10은 라만 분광학 측정으로부터 예측된 삼투질농도를 갖는 100L 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 11은 60-일 관류 세포 배양 공정 중 30일차의 10L 생물반응기에서의 삼투질농도(mOsm/kg)에 대한 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)의 그래프이다.
도 1b는 Ambr15 미세생물반응기에서 다양한 삼투질농도(mOsm/kg)로 수행된 배치 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)의 그래프이다. (n = 2). 0, 2, 5, 7, 및 9일차의 평균 삼투질농도는 mOsm으로 표시된다.
도 2a는 진탕 플라스크의 삼투질농도(mOsm/kg)에 대한 4일차 평균 세포 직경(μm)의 그래프이다.
도 2b는 Ambr15 미세생물반응기의 삼투질농도(mOsm/kg)에 대한 5일차 평균 세포 직경(μm)의 그래프이다.
도 3a는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다. Run V22(“V22”)는 생물반응기에서 높은 삼투질농도를 초래한, 농축된 세포 배양 배지 공급물 대 물 공급물의 비율을 가졌다.
도 3b는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)(실선) 및 Vi-CELL 평균 직경(μm)(점선)의 그래프이다. Run V22 (“V22”)는 높은 삼투질농도를 경험했으며, 이는 성장률 감소 및 생존율 감소를 초래했다.
도 3c는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 수확량 생산율(VP)(g/L/일)(실선) 및 수확 역가(g/L)(점선)의 그래프이다. Run V22 (“V22”)는 높은 삼투질농도를 가졌으며, 이는 생산율을 감소시켰다.
도 3d는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존율(%)(실선) 및 락트산염 탈수소효소(LDH) 생성(U/L/일)(점선)의 그래프이다. Run V22 (“V22”)는 높은 삼투질농도를 가졌고, 이는 낮은 배양 상태를 나타내는 높은 LDH 생산으로 이어졌다.
도 3e는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 글루코스 농도(g/L)(실선) 및 락트산염 농도(g/L)(점선)의 그래프이다. Run V22 (“V22”)는 높은 삼투질농도를 가졌고, 이는 증가된 락트산염 생성을 초래했다.
도 4a는 Protein 3 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)(실선) 및 생존율(%)(점선)의 그래프이다. 높은 삼투질농도로 인해 VCD 및 배양 생존율이 감소했다.
도 4b는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 락트산염 농도(g/L)(실선) 및 락트산염 삼투질농도(mOsm/kg)(점선)의 그래프이다. 높은 삼투질농도로 인해 락트산염 생성이 증가하였다.
도 5a는 다양한 삼투질농도 프로필을 보여주는 관류 세포 배양 생물반응기 세트에서 시간 경과에 따른 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 5b는 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)(실선) 및 Vi-CELL 평균 직경(μm)(점선)의 그래프이다. VCD 프로필의 차이는 다양한 배양 삼투질농도에 해당한다.
도 6a는 모든 데이터를 사용하여 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 전도도(mS/cm)에 대한 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 6b는 반응기 규모 및 배양 단계(낮거나 높은 바이오매스)를 특징으로 하는 데이터를 사용하여 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 전도도(mS/cm)에 대한 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 7은 자동화된 전도도 피드백 제어를 갖춘 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 전도도(mS/cm)(실선) 및 삼투질농도(mOsm/kg)(개별 데이터 포인트)의 그래프이다.
도 8a는 자동화된 전도도 피드백 제어를 갖춘 10L 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 8b는 일관된 VCD 프로필을 나타내는 10L 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)(실선) 및 Vi-CELL 평균 직경(μm)(점선)의 그래프이다.
도 9는 다양한 프로브 유형으로 측정한 삼투질농도 표준물질의 삼투질농도(mOsm/kg)에 대한 전도도(mS/cm)의 그래프이다.
도 10은 라만 분광학 측정으로부터 예측된 삼투질농도를 갖는 100L 생물반응기에서 수행된 관류 세포 배양 실행에서 시간 경과에 따른 삼투질농도(mOsm/kg)의 그래프이다.
도 11은 60-일 관류 세포 배양 공정 중 30일차의 10L 생물반응기에서의 삼투질농도(mOsm/kg)에 대한 생존 세포 밀도(VCD)(백만개 세포/mL)의 그래프이다.
약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 함유하는 용기를 제공하는 단계; 약 32℃ 내지 약 39℃에서 일정 기간 동안 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg에서 유지되는 단계를 포함하는 포유류 세포의 관류 배양 방법이 본원에 제공된다. 이들 방법의 일부 실시형태는 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지에 제3 부피의 수용액을 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지된다. 이들 방법의 일부 실시형태는 제1 액체 배양 배지에 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지된다. 일부 예에서, 제3 액체 배양 배지는 염화나트륨(NaCl) 또는 염화칼륨(KCl)을 포함한다. 일부 예에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제3 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다. 다른 예에서, 삼투질농도는 제3 액체 배양 배지의 유속에 의해 제어된다. 다른 예에서, 제3 액체 배양 배지는 약 0 mOsm/kg 내지 약 270 mOsm/kg의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 액체 배양 배지의 삼투압농도가 380 mOsm/kg을 초과하는 경우, 삼투질농도가 약 0 mOsm/kg 내지 약 100 mOsm/kg인 제3 액체 배양 배지가 사용될 수 있다. 일부 예에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지내 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제3 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다.
또한, 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 제1 액체 배양 배지에 배치된 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 포유류 세포를 함유하는 용기를 제공하는 단계; 약 32℃ 내지 약 39℃에서 일정 기간 동안 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계; 상기 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg에서 유지되는, 단계; 및 포유류 세포로부터, 또는 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 제조 방법이 본원에 제공된다. 이들 방법의 일부 실시형태는 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지에 제3 부피의 수용액을 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지된다. 이들 방법의 일부 실시형태는 제1 액체 배양 배지에 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지된다. 일부 예에서, 제3 액체 배양 배지는 염화나트륨(NaCl) 또는 염화칼륨(KCl)을 포함한다. 일부 예에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제3 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다. 다른 예에서, 제3 액체 배양 배지는 약 0 mOsm/kg 내지 약 270 mOsm/kg의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 액체 배양 배지의 삼투압농도가 380 mOsm/kg을 초과하는 경우, 삼투질농도가 약 0 mOsm/kg 내지 약 100 mOsm/kg인 제3 액체 배양 배지가 사용될 수 있다. 일부 예에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지내 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제3 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 일정 기간 동안 제1 및 제2 액체 배양 배지에서, 또는 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도를 갖는 세포 배양물을 달성할 수 있다. 세포 배양물의 생존가능한 세포 밀도의 확인 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 5일(예를 들어, 적어도 10일, 적어도 15일, 적어도 20일, 적어도 25일, 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 55일, 적어도 60일, 적어도 65일, 또는 적어도 70일)의 배양 기간에 걸쳐 세포 생존력 백분율이 75% 초과(예를 들어, 80% 초과, 85% 초과 또는 90% 초과)인 세포 배양물을 제공한다.
배양량(10L 내지 10,000L 유가식, 50 내지 500L 내지 2000L, 50L, 500L, 1000L, 2000L)
본원에 기재된 임의의 방법은 약 10 L 내지 약 10,000 L (예를 들어, 약 10 L 내지 약 8,000L, 약 10 L 내지 약 7,000 L, 약 10 L 내지 약 6,000 L, 약 10 L 내지 약 5,000 L, 약 10 L 내지 약 4,000 L, 약 10 L 내지 약 3,000 L, 약 10 L 내지 약 2,500 L, 약 10 L 내지 약 2,000 L, 약 10 L 내지 약 1,500 L, 약 10 L 내지 약 1,000 L, 약 10 L 내지 약 500 L, 약 10 L 내지 약 200 L, 약 10 L 내지 약 100 L, 약 20 L 내지 약 10,000 L, 약 20 L 내지 약 8,000 L, 약 20 L 내지 약 7,000 L, 약 20 L 내지 약 6,000 L, 약 20 L 내지 약 5,000 L, 약 20 L 내지 약 4,000 L, 약 20 L 내지 약 3,000 L, 약 20 L 내지 약 2,500 L, 약 20 L 내지 약 2,000 L, 약 20 L 내지 약 1,500 L, 약 20 L 내지 약 1,000 L, 약 20 L 내지 약 500 L, 약 20 L 내지 약 200 L, 약 20 L 내지 약 100 L, 약 100 L 내지 약 10,000 L, 약 100 L 내지 약 8,000 L, 약 100 L 내지 약 7,000 L, 약 100 L 내지 약 6,000 L, 약 100 L 내지 약 5,000 L, 약 100 L 내지 약 4,000 L, 약 100 L 내지 약 3,000 L, 약 100 L 내지 약 2,000 L, 약 100 L 내지 약 1,500 L, 약 100 L 내지 약 1,000 L, 약 100 L 내지 약 800 L, 약 100 L 내지 약 700 L, 약 100 L 내지 약 600 L, 약 100 L 내지 약 500 L, 약 100 L 내지 약 400 L, 약 100 L 내지 약 300 L, 약 100 L 내지 약 200 L, 약 500 L 내지 약 10,000 L, 약 500 L 내지 약 8,000 L, 약 500 L 내지 약 7,000 L, 약 500 L 내지 약 6,000 L, 약 500 L 내지 약 5,000 L, 약 500 L 내지 약 4,000 L, 약 500 L 내지 약 3,000 L, 약 500 L 내지 약 2,000 L, 약 500 L 내지 약 1,500 L, 약 500 L 내지 약 1,000 L, 약 500 L 내지 약 750 L, 약 1,000 L 내지 약 10,000 L, 약 1,000 L 내지 약 8,000 L, 약 1,000 L 내지 약 7,000 L, 약 1,000 L 내지 약 6,000 L, 약 1,000 L 내지 약 5,000 L, 약 1,000 L 내지 약 4,000 L, 약 1,000 L 내지 약 3,000 L, 약 1,000 L 내지 약 2,000 L, 약 1,000 L 내지 약 1,500 L, 약 2,000 L 내지 약 10,000 L, 약 2,000 L 내지 약 8,000 L, 약 2,000 L 내지 약 7,000 L, 약 2,000 L 내지 약 6,000 L, 약 2,000 L 내지 약 5,000 L, 약 2,000 L 내지 약 4,000 L, 약 2,000 L 내지 약 3,000 L, 약 3,000 L 내지 약 10,000 L, 약 3,000 L 내지 약 8,000 L, 약 3,000 L 내지 약 7,000 L, 약 3,000 L 내지 약 6,000 L, 약 3,000 L 내지 약 5,000 L, 약 3,000 L 내지 약 4,000 L, 약 4,000 L 내지 약 10,000 L, 약 4,000 L 내지 약 8,000 L, 약 4,000 L 내지 약 7,000 L, 약 4,000 L 내지 약 6,000 L, 약 4,000 L 내지 약 5,000 L, 약 5,000 L 내지 약 10,000 L, 약 5,000 L 내지 약 8,000 L, 약 5,000 L 내지 약 7,000 L, 약 5,000 L 내지 약 6,000 L, 약 6,000 L 내지 약 10,000 L, 약 6,000 L 내지 약 8,000 L, 약 6,000 L 내지 약 7,000 L, 약 7,000 L 내지 약 10,000 L, 약 7,000 L 내지 약 8,000 L, 또는 약 8,000 L 내지 약 10,000 L, 또는 10 L, 20 L, 50 L, 100 L, 500 L, 1,000 L, 또는 2,000 L)의 부피를 갖는 제1 액체 배양 배지에 포유류 세포(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 포유류 세포)를 함유하는 용기(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 용기)를 제공하는 인큐베이션을 포함할 수 있다. 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계는 세포 유지 및 증식을 허용하는 조건 하에서 수행된다.
제1 액체 배양 배지는 약 270 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg (예를 들어, 약 270 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 305 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 295 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 290 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 285 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 280 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 275 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 305 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 295 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 290 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 285 mOsm/kg, 약 275 mOsm/kg 내지 약 280 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 305 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 295 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 290 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 285 mOsm/kg, 약 285 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 285 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 약 285 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 285 mOsm/kg 내지 약 305 mOsm/kg, 약 285 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 285 mOsm/kg 내지 약 295 mOsm/kg, 약 285 mOsm/kg 내지 약 290 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 305 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 295 mOsm/kg, 약 295 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 295 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 약 295 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 295 mOsm/kg 내지 약 305 mOsm/kg, 약 295 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 305 mOsm/kg, 약 305 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 305 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 약 305 mOsm/kg 내지 약 310 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg 내지 약 315 mOsm/kg, 또는 약 315 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg)의 삼투질농도를 가질 수 있다. 제1 액체 배양 배지의 비제한적 양태 및 예가 본원에 기재되어 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1 액체 배양 배지(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적인 제1 액체 배양 배지)에 첨가된 제2 부피의 제2 액체 배양 배지(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적인 제2 액체 배양 배지) (및 선택적으로 제3 액체 배양 배지)는 일정 기간 동안 더 이른 시점에 첨가된 첨가된 제2 부피의 제2 액체 배양 배지와 비교하여, 일정 기간 동안 적어도 10% (예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 200 적어도 300%, 적어도 400%, 또는 적어도 500%, 또는 약 10% 내지 약 500%, 약 10% 내지 약 400%, 약 10% 내지 약 300%, 약 10% 내지 약 200%, 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 500 약 20% 내지 약 400%, 약 20% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 500%, 약 30% 내지 약 400%, 약 30% 내지 약 300%, 약 30% 내지 약 200%, 약 30% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 500약 40% 내지 약 400%, 약 40% 내지 약 300%, 약 40% 내지 약 200%, 약 40% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 500%, 약 50% 내지 약 400%, 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 500%, 약 60% 내지 약 400%, 약 60% 내지 약 300%, 약 60% 내지 약 200%, 약 60% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 500%, 약 70% 내지 약 400%, 약 70% 내지 약 300%, 약 70% 내지 약 200%, 약 70% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 500%, 약 80% 내지 약 400%, 약 80% 내지 약 300%, 약 80% 내지 약 200%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 500%, 약 90% 내지 약 400%, 약 90% 내지 약 300%, 약 90% 내지 약 200%, 약 90% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 500%, 약 100% 내지 약 400%, 약 100% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 150%, 약 200% 내지 약 500%, 약 200% 내지 약 400%, 약 200% 내지 약 300%, 약 200% 내지 약 250%, 약 300% 내지 약 500%, 약 300% 내지 약 400%, 약 400% 내지 약 500%, 또는 약 450% 내지 약 500%) 증가된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1 액체 배양 배지(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적인 제1 액체 배양 배지) (및 선택적으로 제3 액체 배양 배지)에 첨가된 제2 부피의 제2 액체 배양 배지(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적인 제2 액체 배양 배지)는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로, 일정 기간 동안 더 이른 시점에 첨가된 제2 부피의 제2 액체 배양 배지와 비교하여, 적어도 10% (예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 120%, 적어도 140%, 적어도 160%, 적어도 180%, 적어도 200%, 적어도 220%, 적어도 240%, 적어도 260%, 적어도 280%, 적어도 300%, 적어도 320%, 적어도 340%, 적어도 360%, 적어도 380%, 적어도 400%, 적어도 420%, 적어도 440%, 적어도 460%, 적어도 480%, 또는 적어도 500%, 또는 약 10% 내지 약 500% (예를 들어, 또는 본원에 기재된 이 범위의 임의의 하위범위) 증가된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 액체 배양 배지 (및 선택적으로 제3 액체 배양 배지) 첨가된 제2 액체 배양 배지의 유속은 일정 기간 동안 더 이른 시점에 제2 액체 배양 배지의 유속과 비교하여, 적어도 10% (예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 120%, 적어도 140%, 적어도 160%, 적어도 180%, 적어도 200%, 적어도 220%, 적어도 240%, 적어도 260%, 적어도 280%, 또는 적어도 300%, 또는 약 10% 내지 약 300%, 약 10% 내지 약 250%, 약 10% 내지 약 200%, 약 10% 내지 약 150%, 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 250%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 300%, 약 30% 내지 약 250%, 약 30% 내지 약 200%, 약 30% 내지 약 150%, 약 30% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 300%, 약 40% 내지 약 250%, 약 40% 내지 약 200%, 약 40% 내지 약 150%, 약 40% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 300%, 약 60% 내지 약 250%, 약 60% 내지 약 200%, 약 60% 내지 약 150%, 약 60% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 300%, 약 70% 내지 약 250%, 약 70% 내지 약 200%, 약 70% 내지 약 150%, 약 70% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 300%, 약 80% 내지 약 250%, 약 80% 내지 약 200%, 약 80% 내지 약 150%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 300%, 약 90% 내지 약 250%, 약 90% 내지 약 200%, 약 90% 내지 약 150%, 약 90% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 150%, 약 150% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 200% 내지 약 300%, 약 200% 내지 약 250%, 또는 약 250% 내지 약 300%) 증가된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 일정 기간 동안 제1 액체 배양 배지 (및 선택적으로 제3 액체 배양 배지) 첨가된 제2 액체 배양 배지의 유속은 일정 기간 동안 더 이른 시점에 제2 액체 배양 배지의 유속과 비교하여, 적어도 10% (예를 들어, 적어도 12%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 18%, 적어도 20%, 적어도 22%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 28%, 적어도 30%, 적어도 32%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 38%, 적어도 40%, 적어도 42%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 48%, 적어도 50%, 적어도 52%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 58%, 적어도 60%, 적어도 62%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 68%, 적어도 70%, 적어도 72%, 적어도 74%, 적어도 76%, 적어도 78%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 약 1% 내지 약 100%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 45%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 35%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 25%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 100%, 약 15% 내지 약 90%, 약 15% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 100%, 약 35% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 80%, 약 35% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 60%, 약 35% 내지 약 50%, 약 35% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 100%, 약 45% 내지 약 90%, 약 45% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 70%, 약 45% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100%) 감소된다. 제2 액체 배양 배지의 비제한적 양태 및 예가 본원에 기재되어 있다.
기간(30 내지 60일; 7 내지 90일, 45일, 60일)
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 예에서, 기간은 약 5일 내지 약 100일 (예를 들어, 약 5일 내지 약 95일, 약 5일 내지 약 90일, 약 5일 내지 약 85일, 약 5일 내지 약 80일, 약 5일 내지 약 75일, 약 5일 내지 약 70일, 약 5일 내지 약 65일, 약 5일 내지 약 60일, 약 5일 내지 약 55일, 약 5일 내지 약 50일, 약 5일 내지 약 45일, 약 5일 내지 약 40일, 약 5일 내지 약 35일, 약 5일 내지 약 30일, 약 5일 내지 약 25일, 약 5일 내지 약 20일, 약 5일 내지 약 15일, 약 5일 내지 약 10일, 약 5일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 95일, 약 7일 내지 약 90일, 약 7일 내지 약 85일, 약 7일 내지 약 80일, 약 7일 내지 약 75일, 약 7일 내지 약 70일, 약 7일 내지 약 65일, 약 7일 내지 약 60일, 약 7일 내지 약 55일, 약 7일 내지 약 50일, 약 7일 내지 약 45일, 약 7일 내지 약 40일, 약 7일 내지 약 35일, 약 7일 내지 약 30일, 약 7일 내지 약 25일, 약 7일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 15일, 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 100일, 약 10일 내지 약 95일, 약 10일 내지 약 90일, 약 10일 내지 약 85일, 약 10일 내지 약 80일, 약 10일 내지 약 75일, 약 10일 내지 약 70일, 약 10일 내지 약 65일, 약 10일 내지 약 60일, 약 10일 내지 약 55일, 약 10일 내지 약 50일, 약 10일 내지 약 45일, 약 10일 내지 약 40일, 약 10일 내지 약 35일, 약 10일 내지 약 30일, 약 10일 내지 약 25일, 약 10일 내지 약 20일, 약 10일 내지 약 15일, 약 15일 내지 약 100일, 약 15일 내지 약 95일, 약 15일 내지 약 90일, 약 15일 내지 약 85일, 약 15일 내지 약 80일, 약 15일 내지 약 75일, 약 15일 내지 약 70일, 약 15일 내지 약 65일, 약 15일 내지 약 60일, 약 15일 내지 약 55일, 약 15일 내지 약 50일, 약 15일 내지 약 45일, 약 15일 내지 약 40일, 약 15일 내지 약 35일, 약 15일 내지 약 30일, 약 15일 내지 약 25일, 약 15일 내지 약 20일, 약 30일 내지 약 100일, 약 30일 내지 약 90일, 약 30일 내지 약 80일, 약 30일 내지 약 70일, 약 30일 내지 약 60일, 약 30일 내지 약 50일, 약 30일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 100일, 약 40일 내지 약 90일, 약 40일 내지 약 80일, 약 40일 내지 약 70일, 약 40일 내지 약 60일, 약 40일 내지 약 50일, 약 50일 내지 약 100일, 약 50일 내지 약 90일, 약 50일 내지 약 80일, 약 50일 내지 약 70일, 약 50일 내지 약 60일, 약 60일 내지 약 100일, 약 60일 내지 약 90일, 약 60일 내지 약 80일, 약 60일 내지 약 70일, 약 70일 내지 약 100일, 약 70일 내지 약 90일, 약 70일 내지 약 80일, 약 80일 내지 약 100일, 약 80일 내지 약 90일, 또는 약 90일 내지 약 100일, 또는 7일, 21일, 28일, 30일, 31일, 45일, 60일, 또는 90일)이다.
포유류 세포
본원에 제공된 방법에서 배양된(예를 들어, 관류 배양된) 포유류 세포는 현탁액 내에서 성장하는 세포 또는 부착 세포일 수 있다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법에서 배양될 수 있는 포유류 세포의 비제한적 예로는 다음이 포함된다: 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, CHO DG44 세포 또는 CHO-K1s 세포), Sp2.0, 골수종 세포(예를 들어, NS/0), B-세포, 하이브리도마 세포, T-세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포(예를 들어, HEK 293E 및 HEK 293F), 아프리카 그린 원숭이 신장 상피 세포(Vero) 세포, NSO 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, PerC6 세포, Vero 세포, HT-1080 세포 및 마딘-다비 개과(Madin-Darby Canine)(코커 스패니얼) 신장 상피 세포(MDCK) 세포. 부착 세포가 배양되는 일부 예에서, 배양물은 또한, 복수의 마이크로캐리어(예를 들어, 하나 이상의 기공을 함유하는 마이크로캐리어)를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법에서 배양될 수 있는 부가적인 포유류 세포는 당업계에 알려져 있다.
포유류 세포는 재조합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적인 재조합 단백질)을 인코딩하는 재조합 핵산(예를 들어, 포유류 세포의 게놈에 안정적으로 통합된 핵산)을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 재조합 단백질인 예시적 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산의 비제한적 예를 이하 설명한다. 일부 경우에, 생물반응기(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 생물반응기)에서 배양되는 포유류 세포는 더 큰 배양물로부터 유래되었다.
재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 분자 생물학 및 분자 유전학에 알려진 매우 다양한 방법을 사용하여 포유류 세포에 도입될 수 있다. 비제한적 예는 형질감염(예를 들어, 리포펙션), 형질도입(예를 들어, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 레트로바이러스 감염), 및 전기영동을 포함한다. 일부 경우에, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포의 염색체에 안정적으로 통합되지 않지만(일시적 형질감염), 다른 경우에 핵산은 통합된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 플라스미드 및/또는 포유류 인공 염색체(예를 들어, 인간 인공 염색체)에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 핵산은 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스 벡터)를 이용하여 세포에 도입될 수 있다. 핵산은 프로모터 서열(예를 들어, 강한 프로모터, 예컨대 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터, 또는 유도성 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 핵산을 함유한 벡터는 요망되는 경우에, 또한, 선택 가능한 마커(예를 들어, 포유류 세포에 히그로마이신, 푸로마이신, 또는 네오마이신 내성을 제공하는 유전자)를 함유할 수 있다.
일부 경우, 재조합 단백질은 분비된 단백질이고, 포유류 세포에 의해 세포외 배지(예를 들어, 관류 배양 시 제1 및/또는 제2 액체 배지, 또는 유가 배양(feed batch culturing) 시 제1 액체 배지 및/또는 공급 액체 배지) 내로 방출된다. 예를 들어, 가용성 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 분비 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 재조합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 함유할 수 있으며, 이러한 분비 신호 펩타이드는 포유류 세포에 존재하는 효소에 의해 절단되어 후속해서 세포외 배지(예를 들어, 제1 및/또는 제2 액체 배지) 내로 방출된다.
용기(10 L 내지 10,000 L 유가식, 50 L 내지 500 L 내지 2,000 L, 50 L, 500 L, 1,000 L, 2,000 L)
본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법에서 배양 단계는 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기)를 사용하여 수행될 수 있다. 생물반응기(예를 들어, 관류 생물반응기)는 약 10 L 내지 약 10,000 L (예를 들어, 약 10 L 내지 약 8,000L, 약 10 L 내지 약 7,000 L, 약 10 L 내지 약 6,000 L, 약 10 L 내지 약 5,000 L, 약 10 L 내지 약 4,000 L, 약 10 L 내지 약 3,000 L, 약 10 L 내지 약 2,500 L, 약 10 L 내지 약 2,000 L, 약 10 L 내지 약 1,500 L, 약 10 L 내지 약 1,000 L, 약 10 L 내지 약 500 L, 약 10 L 내지 약 200 L, 약 10 L 내지 약 100 L, 약 20 L 내지 약 10,000L, 약 20 L 내지 약 8,000 L, 약 20 L 내지 약 7,000 L, 약 20 L 내지 약 6,000 L, 약 20 L 내지 약 5,000 L, 약 20 L 내지 약 4,000 L, 약 20 L 내지 약 3,000 L, 약 20 L 내지 약 2,500 L, 약 20 L 내지 약 2,000 L, 약 20 L 내지 약 1,500 L, 약 20 L 내지 약 1,000 L, 약 20 L 내지 약 500 L, 약 20 L 내지 약 200 L, 약 20 L 내지 약 100 L, 약 100 L 내지 약 10,000 L, 약 100 L 내지 약 8,000 L, 약 100 L 내지 약 7,000 L, 약 100 L 내지 약 6,000 L, 약 100 L 내지 약 5,000 L, 약 100 L 내지 약 4,000 L, 약 100 L 내지 약 3,000 L, 약 100 L 내지 약 2,000 L, 약 100 L 내지 약 1,500 L, 약 100 L 내지 약 1,000 L, 약 100 L 내지 약 800 L, 약 100 L 내지 약 700 L, 약 100 L 내지 약 600 L, 약 100 L 내지 약 500 L, 약 100 L 내지 약 400 L, 약 100 L 내지 약 300 L, 약 100 L 내지 약 200 L, 약 500 L 내지 약 10,000 L, 약 500 L 내지 약 8,000 L, 약 500 L 내지 약 7,000 L, 약 500 L 내지 약 6,000 L, 약 500 L 내지 약 5,000 L, 약 500 L 내지 약 4,000 L, 약 500 L 내지 약 3,000 L, 약 500 L 내지 약 2,000 L, 약 500 L 내지 약 1,500 L, 약 500 L 내지 약 1,000 L, 약 500 L 내지 약 750 L, 약 1,000 L 내지 약 10,000 L, 약 1,000 L 내지 약 8,000 L, 약 1,000 L 내지 약 7,000 L, 약 1,000 L 내지 약 6,000 L, 약 1,000 L 내지 약 5,000 L, 약 1,000 L 내지 약 4,000 L, 약 1,000 L 내지 약 3,000 L, 약 1,000 L 내지 약 2,000 L, 약 1,000 L 내지 약 1,500 L, 약 2,000 L 내지 약 10,000 L, 약 2,000 L 내지 약 8,000 L, 약 2,000 L 내지 약 7,000 L, 약 2,000 L 내지 약 6,000 L, 약 2,000 L 내지 약 5,000 L, 약 2,000 L 내지 약 4,000 L, 약 2,000 L 내지 약 3,000 L, 약 3,000 L 내지 약 10,000 L, 약 3,000 L 내지 약 8,000 L, 약 3,000 L 내지 약 7,000 L, 약 3,000 L 내지 약 6,000 L, 약 3,000 L 내지 약 5,000 L, 약 3,000 L 내지 약 4,000 L, 약 4,000 L 내지 약 10,000 L, 약 4,000 L 내지 약 8,000 L, 약 4,000 L 내지 약 7,000 L, 약 4,000 L 내지 약 6,000 L, 약 4,000 L 내지 약 5,000 L, 약 5,000 L 내지 약 10,000 L, 약 5,000 L 내지 약 8,000 L, 약 5,000 L 내지 약 7,000 L, 약 5,000 L 내지 약 6,000 L, 약 6,000 L 내지 약 10,000 L, 약 6,000 L 내지 약 8,000 L, 약 6,000 L 내지 약 7,000 L, 약 7,000 L 내지 약 10,000 L, 약 7,000 L 내지 약 8,000 L, 또는 약 8,000 L 내지 약 10,000 L, 또는 약 10 L, 약 20 L, 약 50 L, 약 100 L, 약 500 L, 약 1,000 L, 또는 약 2,000 L)의 내부 부피(용량)를 가질 수 있다.
배양 시스템
본원에 기재된 방법 중 일부는 용기 및 용기 내에 배치된 제1 액체 배지(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 배양 배지)를 포함하는 시스템(예를 들어, 관류 배양 시스템)을 사용한다. 용기는 약 10 L 내지 약 25,000 L(예를 들어, 또는 본원에 기재된 이 범위의 임의의 하위범위)의 내부 부피(용량)를 가질 수 있다. 용기는 금속(예를 들어, 스테인리스강), 플라스틱 또는 유리 또는 이들의 임의의 조합으로 제작될 수 있다.
시스템은 용기 내에 배치된 액체 배지를 교반하기 위한 장치(예를 들어, 임펠러(impellor) 및 상기 임펠러를 회전시키는 모터)를 포함할 수 있다. 이러한 용기는 물질(예를 들어, 액체 배지, 폴록사머-188, 염기 또는 산(pH 조절에 필요한 대로)을 상기 용기 내에 배치된 액체 배지에 첨가하고/거나 액체 배지(예를 들어, 정화된(clarified) 액체 배지, 또는 세포 배양물 시료)를 제거할 수 있게 하는 하나 이상의 포트(및 선택적으로 펌프)를 포함할 수 있다.
배양 시스템은 또한, 배양 기간 동안 액체 배지 내 pH, dO2, 온도 및 pCO2를 모니터링하기 위한 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양 시스템은 정전용량 센서, 전도도 센서 및/또는 라만 센서를 포함하는 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물반응기는 정전용량 센서, 전도도 센서 및/또는 라만 센서를 포함하는 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필터 투과물은 정전용량 센서, 전도도 센서 및/또는 라만 센서를 포함하는 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 배양 시스템은, 실질적으로 세포가 없는 정화된 액체 배지를 제공하기 위해 세포 배양물 부피를 가진 여과 장치(예를 들어, 교대 접선(tangential) 여과 또는 접선 유동 여과를 수행하는 장치)를 포함할 수 있다. 배양 시스템은 용기 내에 배치된 액체 배지의 온도를 조절할 수 있게 하는 가열/냉각 장치를 포함할 수 있다. 세포 배양물 시스템의 부가적인 특징은 당업계에 잘 알려져 있다.
관류 배양
일부 예에서, 관류 배양은 일정 기간 동안 용기(예를 들어, 생물반응기)로부터 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하는 단계, 및 상기 생물반응기에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계를 포함하며, 여기서, 제1 부피 및 제2 부피는 거의 동일하다.
다른 예에서, 관류 배양은 용기(예를 들어, 생물반응기)로부터 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하는 단계, 및 상기 용기에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지 및 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 첨가하는 단계를 포함하며, 여기서, 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하다.
포유류 세포는 일부 세포 체류 장치에 의해 또는 세포 침강과 같은 기술을 통해 생물반응기 내에 보유된다.
관류 배양에서 배지의 제거 및 첨가는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있거나, 제거와 첨가의 일정 조합으로 수행될 수 있다. 또한, 제거 및 첨가는 예를 들어 생물반응기 부피의 0.1% 내지 400%, 약 25% 내지 400%, 약 25% 내지 약 300%, 약 25% 내지 약 200%, 약 25% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 400%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 400%, 약 100% 내지 약 400%, 약 100% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 200%, 또는 약 25%, 약 50%, 약 75%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 약 350% 또는 약 400%의 부피를 제거하고 대체하는 속도로, 연속적으로 수행될 수 있다.
제거된 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가된 제2 부피의 제2 액체 배양 배지(및 선택적으로, 첨가된 제3 액체 배양 배지)는 일부 경우, 각각 24시간의 기간에 걸쳐 대략 동일하게 유지될 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지가 제거되는 속도(부피/단위 시간) 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 첨가되는 속도(부피/단위 시간)(및 선택적으로, 제3 부피의 제3 액체 배양 배지가 첨가되는 속도(부피/단위 시간)는 변할 수 있고, 특정 세포 배양물 시스템의 조건에 따라 다르다.
제1 부피의 제1 액체 배양 배지가 제거되는 속도(부피/단위 시간) 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 첨가되는 속도(부피/단위 시간)(및 선택적으로, 제3 부피의 제3 액체 배양 배지가 첨가되는 속도(부피/단위 시간)는 대략 동일하거나, 다를 수 있다.
대안적으로, 제거되고 첨가된 부피는 각각 24시간의 기간에 걸쳐 점차 증가함으로써 변할 수 있다. 예를 들어, 각각 24시간 이내에 제거된 제1 액체 배양 배지의 부피 및 첨가된 제2 액체 배양 배지의 부피(및 선택적으로, 첨가된 제3 액체 배양 배지의 부피)는 배양 기간에 걸쳐 증가될 수 있다. 부피는 배양 기간에 걸쳐, 생물반응기 부피의 0.5% 내지 약 20%인 부피로부터 증가할 수 있다. 상기 부피는 배양 기간에 걸쳐, 생물반응기 용량 또는 배양 기간의 시작 시 세포 배양물의 부피의 약 25% 내지 약 150%까지 증가할 수 있다.
본원에 기재된 방법들의 일부 예에서, 배양 기간의 처음 48시간 내지 96시간 후, (배양 기간 이내에서) 각각의 24시간의 기간에서, 제거된 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가된 제2 부피의 제2 액체 배양 배지(및 선택적으로, 또한 첨가된 제3 부피의 제3 액체 배양 배지)는 배양 기간의 시작 시 세포 배양물의 부피의 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 70%이다.
숙련된 실무자는 제1 액체 배양 배지와 제2 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지일 수 있음을 인식할 것이다. 다른 경우에, 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지는 서로 다른 유형의 액체 배양 배지이거나, 서로 다른 농도의 액체 배양 배지일 수 있다. 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 및 제3 액체 배양 배지와 비교하여, 하나 이상의 배지 성분에 대해 더욱 농축될 수 있다.
제1 부피의 제1 액체 배양 배지는 임의의 자동화된 시스템을 사용하여 제거될 수 있다. 예를 들어 교대 접선 유동 여과가 사용될 수 있다. 대안적으로, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지는, 포유류 세포를 배제한 분자량 컷오프를 가진 멸균 막을 통해 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 삼출(seeping) 또는 중력식 유동(gravity flow)에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지는 적어도 1분, 적어도 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 40분, 50분 또는 1시간의 기간 동안 교반 속도를 정지시키거나 상당히 감소시키고, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 생물반응기의 상부로부터 제거하거나 흡인함으로써 제거될 수 있다.
제2 부피의 제2 액체 배양 배지 (및 선택적으로 제3 부피의 제3 액체 배양 배지)는 펌프에 의해 제1 액체 배양 배지에 첨가될 수 있다. 제2 액체 배양 배지 (및 선택적으로 제3 액체 배양 배지)는 제1 액체 배양 배지에 직접, 또는 자동화된 방식으로 제2 부피의 제2 액체 배양 배지 (및 선택적으로 제3 부피의 제3 액체 배양 배지)를 피펫팅하거나 주입함으로써 제1 액체 배양 배지에 첨가될 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시형태에는 약 32℃ 내지 약 39℃의 온도에서 적어도 약 7일의 기간 동안 교반하면서 용기를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg에서 유지되는 단계가 포함된다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시형태에는 약 32℃ 내지 약 39℃의 온도에서 적어도 약 7일의 기간 동안 교반하면서 용기를 인큐베이션하는 단계; 및 상기 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지 및 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg에서 유지되는 단계가 포함된다.
관류 배양의 일부 예는 약 32℃ 내지 약 39℃의 온도에서 적어도 약 7일의 배양 기간 동안 교반하면서 제1 액체 배양 배지를 함유하는 배양 시스템을 인큐베이션하는 단계; 및 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하고, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg에서 유지된다.
관류 배양의 일부 예는 약 32℃ 내지 약 39℃의 온도에서 적어도 약 7일의 배양 기간 동안 교반하면서 제1 액체 배양 배지를 함유하는 배양 시스템을 인큐베이션하는 단계; 및 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지 및 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하고, 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg에서 유지된다.
일부 실시형태에서, 제1 액체 배양 배지는 약 260 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg (예를 들어, 약 260 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 340 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 340 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 340 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 340 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 340 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg 내지 약 340 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg, 약 320 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 320 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 320 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 320 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 320 mOsm/kg 내지 약 340 mOsm/kg, 약 330 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 330 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 330 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 330 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 330 mOsm/kg 내지 약 340 mOsm/kg, 약 340 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 340 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 340 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 340 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 350 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 350 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 350 mOsm/kg 내지 약 360 mOsm/kg, 약 360 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 360 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 370 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 370 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg, 약 380 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 380 mOsm/kg 내지 약 390 mOsm/kg, 또는 약 390 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg)의 삼투질농도를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 액체 배양 배지는 약 260 mOsm/kg, 약 270 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg, 약 290 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg, 약 310 mOsm/kg, 약 320 mOsm/kg, 약 330 mOsm/kg, 약 340 mOsm/kg, 약 350 mOsm/kg, 약 360 mOsm/kg, 약 380 mOsm/kg, 약 390 mOsm/kg, 또는 약 400 mOsm/kg의 삼투질농도를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 약 260 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg (예를 들어, 약 260 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 1,200 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 700 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 260 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 1,200 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 700 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 1,200 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 700 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 1,200 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 700 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 1,200 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 700 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 2400 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 2200 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,200 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,200 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 1,200 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 1,400 mOsm/kg, 약 1,400 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 1,400 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 1,400 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 1,400 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 1,400 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 1,400 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 1,400 mOsm/kg 내지 약 1,500 mOsm/kg, 약 1,500 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 1,500 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 1,500 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 1,500 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 1,500 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg, 약 1,500 mOsm/kg 내지 약 1,600 mOsm/kg, 약 1,600 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 1,600 mOsm 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 1,600 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 1,600 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 1,800 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 1,800 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 1,800 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 1,800 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 2,200 mOsm/kg, 약 2,200 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg, 약 2,200 mOsm/kg 내지 약 2,400 mOsm/kg, 또는 약 2,400 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg)의 삼투질농도를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 약 260 mOsm/kg, 약 280 mOsm/kg, 약 300 mOsm/kg, 약 320 mOsm/kg, 약 340 mOsm/kg, 약 350 mOsm/kg, 약 360 mOsm/kg, 약 380 mOsm/kg, 약 400 mOsm/kg, 약 420 mOsm/kg, 약 440 mOsm/kg, 약 450 mOsm/kg, 약 460 mOsm/kg, 약 480 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg, 약 520 mOsm/kg, 약 540 mOsm/kg, 약 550 mOsm/kg, 약 560 mOsm/kg, 약 580 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg, 약 620 mOsm/kg, 약 640 mOsm/kg, 약 650 mOsm/kg, 약 660 mOsm/kg, 약 680 mOsm/kg, 약 700 mOsm/kg, 약 72 mOsm/kg, 약 740 mOsm/kg, 약 750 mOsm/kg, 약 760 mOsm/kg, 약 780 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg, 약 820 mOsm/kg, 약 840 mOsm/kg, 약 850 mOsm/kg, 약 860 mOsm/kg, 약 880 mOsm/kg, 약 900 mOsm/kg, 약 920 mOsm/kg, 약 940 mOsm/kg, 약 950 mOsm/kg, 약 960 mOsm/kg, 약 980 mOsm/kg, 약 1000 mOsm/kg, 약 1,100 mOsm/kg, 약 1,200 mOsm/kg, 약 1,300 mOsm/kg, 약 1,400 mOsm/kg, 약 1,500 mOsm/kg, 약 1,600 mOsm/kg, 약 1,700 mOsm/kg, 약 1,800 mOsm/kg, 약 1,900 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg, 약 2,100 mOsm/kg, 약 2,200 mOsm/kg, 약 2,300 mOsm/kg, 약 2,400 mOsm/kg, 또는 약 2,500 mOsm/kg의 삼투질농도를 가질 수 있다.
액체 배양 배지의 삼투질농도를 측정하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 삼투질농도는 오프라인 샘플링을 사용하여 빙점 강하로 측정된다. 상업적으로 이용 가능한 삼투압계, 예를 들어, OsmoTECH® pro 다중-시료 마이크로-삼투압계도 당업계에 잘 알려져 있다. 삼투질농도의 연속 모니터링은 라만 분광법을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Moretto et al., Am Pharma Rev., 14(3), 2011], 및 [Whelan et al., Biotechnol. Prog., 28(5): 1355-1362, September-October 2012]를 참조한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지에 제3 부피의 수용액을 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지, 및 수용액의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg (예를 들어, 또는 본원에 기재된 이 범위의 임의의 하위범위)으로 유지된다. 예를 들어, 수용액은 염 용액, 예를 들어, 염화나트륨 용액 및 염화칼륨 용액일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 액체 배양 배지는 본원에 기재된 임의의 제1 액체 배양 배지일 수 있으며, 제2 액체 배양 배지는 본원에 기재된 임의의 제2 액체 배양 배지일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는 제1 액체 배양 배지에 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg (예를 들어, 또는 이 범위의 임의의 하위 범위)으로 유지된다. 이들 방법의 일부 실시형태에서, 제1 액체 배양 배지는 본원에 기재된 임의의 예시적인 제1 액체 배양 배지일 수 있으며, 제2 액체 배양 배지는 본원에 기재된 임의의 예시적인 제2 액체 배양 배지일 수 있다. 이들 방법의 일부 실시형태에서, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 예에서, 조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함한다.
일부 예에서, 제3 액체 배양 배지는 약 0 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg (예를 들어, 약 0 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 250 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 200 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 150 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg/ 내지 약 100 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 80 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 60 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg, 내지 약 40 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 20 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 10 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 5 mOsm/kg, 약 0 mOsm/kg 내지 약 1 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 250 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 200 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 150 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 100 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 80 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 60 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg, 내지 약 40 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 20 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 10 mOsm/kg, 약 1 mOsm/kg 내지 약 5 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 300 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 250 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 200 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 150 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 100 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 80 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 60 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg, 내지 약 40 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 20 mOsm/kg, 약 5 mOsm/kg 내지 약 10 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 10 mOsm/kg 내지 약 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mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 500 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 600 mOsm/kg 내지 약 800 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 800 mOsm/kg 내지 약 1,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 1,000 mOsm/kg 내지 약 2,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 2,000 mOsm/kg 내지 약 3,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 3,000 mOsm/kg 내지 약 4,000 mOsm/kg, 약 4,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 4,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 4,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 4,000 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 4,000 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 4,000 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 4,000 mOsm/kg 내지 약 6,000 mOsm/kg, 약 4,000 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 5,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 5,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 5,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 5,000 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 5,000 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 5,000 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 5,000 mOsm/kg 내지 약 5,000 mOsm/kg, 약 6,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 6,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 6,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 6,000 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 6,000 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 6,000 mOsm/kg 내지 약 7,000 mOsm/kg, 약 7,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 7,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 7,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 7,000 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 7,000 mOsm/kg 내지 약 8,000 mOsm/kg, 약 8,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 8,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 8,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 8,000 mOsm/kg 내지 약 9,000 mOsm/kg, 약 9,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 약 9,000 mOsm/kg 내지 약 11,000 mOsm/kg, 약 9,000 mOsm/kg 내지 약 10,000 mOsm/kg, 약 10,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg, 또는 약 11,000 mOsm/kg 내지 약 12,000 mOsm/kg)의 삼투질농도를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 액체 배양 배지는 염화나트륨(NaCl) 또는 염화칼륨(KCl)을 포함한다.
일부 실시형태는 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1, 제2 및 제3 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 용기내에서 측정된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도는 다음 중 하나 이상에 의해 제어된다: 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지 및 수용액(예를 들어, 물)의 비율, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지 및 농축 오스몰라이트 (예를 들어, 염화나트륨)의 비율, 용기(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 용기(예를 들어, 생물반응기))내 생존 세포 밀도, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지의 pH, 용기(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 용기(예를 들어, 생물반응기))내 용해된 CO2 (dCO2)의 수준, 용기(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 용기(예를 들어, 생물반응기))로의 탄소(예를 들어, 글루코스) 입력.
Pluronic® F-68 (폴록사머-188)
폴록사머-188은 당업계에 공지된 분자이다. 폴록사머-188은 에틸렌옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 비이온성 합성 블록 공중합체이다. 폴록사머-188은 7680 내지 약 9510의 평균 분자량을 가지고, 이의 조성물의 약 81.8 중량% 1.9 중량%는 옥시에틸렌으로 표시된다. 예를 들어, 폴록사머-188은 하기 식 I로 나타낸 구조를 가지고, 식 I에서, a는 80이고 b는 27이다. 폴록사머-188은 CAS 넘버 9003-11-6를 가진다.
[화학식 I]
폴록사머-188은 예를 들어, Sigma-Aldrich(St.Louis, MO), Mediatech, Inc.(Manassas, VA), MAST Therapeutics, Inc.(San Diego, CA), EMD Millipore(Billerica, MA), BASF(Ludwigshafen, Germany), Pluronic® F-68 Life Technologies(Carlsbad, CA) 및 PhytoTechnology Laboratories, LLC(Shawnee Mission, KS)를 포함한 다수의 상이한 공급업체들로부터 상업적으로 입수가능하다.
일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 약 8 g/L 초과의 농도(예를 들어, 약 9.0 g/L의 농도 또는 9.0 g/L 초과의 농도, 약 10.0 g/L의 농도 또는 10.0 g/L 초과의 농도, 약 12.0 g/L의 농도 또는 12.0 g/L 초과의 농도, 약 14.0 g/L의 농도 또는 14.0 g/L 초과의 농도, 또는 약 16.0 g/L의 농도 또는 16.0 g/L 초과의 농도)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 액체 배양 배지는 폴록사머-188을 약 8 g/L 내지 약 16 g/L (예를 들어, 약 8.0 g/L 내지 약 14.0 g/L, 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L, 약 8.0 g/L 내지 약 10.0 g/L, 약 10.0 g/L 내지 약 16.0 g/L, 약 10.0 g/L 내지 약 12.0 g/L, 약 12.0 g/L 내지 약 16.0 g/L, 약 12.0 g/L 내지 약 14.0 g/L, 약 14.0 g/L 내지 약 16.0 g/L, 또는 약 15.0 g/L 내지 약 16.0 g/L,)의 농도로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제3 액체 배양 배지는 폴록사머-188을 약 0 g/L 내지 약 8 g/L (예를 들어, 약 0 g/L 내지 약 6 g/L, 약 0 g/L 내지 약 4 g/L, 약 0 g/L 내지 약 2 g/L, 약 0 g/L 내지 약 1 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 8 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 8 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 8 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 8 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 6.0 g/L 내지 약 8 g/L, 또는 약 7.0 g/L 내지 약 8 g/L)의 농도로 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시형태는 시간 경과에 따라 배양물 내 폴록사머-188 농도를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 다음의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 인자에 기초하여 선택되는 폴록사머-188 농도를 포함한다: 기체 유속 및 배지내 생존 세포 밀도. 이들 방법에서, 배지 내 선택된 폴록사머-188 농도는 배양 단계 이전에 폴록사머-188을 상기 배지에 첨가함으로써 및/또는 배양 단계 동안에 폴록사머-188을 상기 배지에 첨가함으로써 달성될 수 있다. 선택된 폴록사머-188 농도는 본원에 기재된 폴록사머-188의 예시적인 농도 또는 범위들 중 임의의 농도 또는 범위일 수 있다.
배양 배지
액체 배양 배지는 당업계에 알려져 있다. 액체 배양 배지(예를 들어, 제1, 제2 및/또는 제3 액체 배양 배지)는 포유류 혈청(예를 들어, 송아지 태아 혈청 및 소 혈청), 및/또는 성장 호르몬 또는 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 및 표피 성장 인자)로 보충될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 액체 배양 배지(예를 들어, 제1, 제2 및/또는 제3 액체 배지)는 화학적으로-정의된 액체 배양 배지, 동물-유래 구성성분-무함유 액체 배양 배지, 혈청-무함유 액체 배양 배지 또는 혈청-함유 액체 배양 배지일 수 있다. 화학적으로 규정된 액체 배양 배지, 동물 유래 성분이 없는 액체 배양 배지, 무혈청 액체 배양 배지, 및 혈청 함유 액체 배양 배지의 비제한적 예는 상업적으로 이용 가능하다.
액체 배지는 전형적으로 에너지 소스(예를 들어, 탄수화물, 예컨대 글루코스), 필수 아미노산(예를 들어, 20개의 아미노산으로 된 기본 세트 + 시스테인), 비타민 및/또는 저농도에서 필요한 다른 유기 화합물, 자유 지방산, 및/또는 미량 원소를 함유한다. 액체 배양 배지(예를 들어, 제1, 제2 및/또는 제3 액체 배지)에는 요망되는 경우, 예를 들어, 포유류 호르몬 또는 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 및 완충제(예를 들어, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트 염), 뉴클레오사이드 및 염기(예를 들어, 아데노신, 티미딘 및 하이포크산틴), 단백질 및 조직 가수분해물, 및/또는 이들 첨가제의 임의의 조합이 보충될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서 세포(예를 들어, 포유류 세포)를 배양하는 데 사용될 수 있는 매우 다양한 액체 배양 배지는 당업계에 알려져 있다. 본 공정에 또한 유용할 수 있는 배지 성분은 화학적으로 규정된(CD) 가수분해물, 예를 들어 CD 펩톤, CD 폴리펩티드(2개 이상의 아미노산), 및 CD 성장 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 액체 배지 및 배지 구성성분의 부가적인 예는 당업계에 알려져 있다.
당업자는 본원에 기재된 제1 액체 배양 배지, 제2 액체 배양 배지, 및 제3 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지이거나 상이한 배지일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
세포 배양물로부터 얻은 액체 배양 배지는 세포 및/또는 바이러스가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지를 얻기 위해 여과되거나 정화될 수 있다. 세포를 제거하기 위해 액체 배양 배지를 여과 또는 정화하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 0.2 μm 여과 및 교번 접선 유동(ATFTM) 시스템을 이용한 여과). 포유류 세포는 또한, 원심분리를 사용하고 실질적으로 세포가 없는 액체 배양 배지인 상층액을 제거하거나, 또는 세포가 액체 배지를 함유하는 용기 또는 생물반응기의 중력적 하부에 침강할 수 있게 하고 침강된 재조합 세포로부터 떨어져 있는 액체 배양 배지(실질적으로 세포가 없는 액체 배양 배지)를 제거함으로써, 액체 배지로부터 제거될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1, 제2, 및/또는 제3 액체 배양 배지의 pH는 약 6.0 내지 약 6.8 (예를 들어, 이에 속하는 임의의 하위범위)이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1, 제2 및/또는 제3 액체 배양 배지는 염화나트륨 또는 염화칼륨을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 제1, 제2 및/또는 제3 액체 배양 배지는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: L-아르기닌, L-아스파라긴, L-글루타민, L-히스티딘, 하이드록시-L-프롤린, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-발린, 콜린, 이노시톨, 비오틴, 칼슘, 엽산, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B12, 리포산, 글루타티온, 리놀레산, 피루브산염, HEPES, 제일철, 시트르산, 아연, 구리, 셀레나이트, 에탄올아민, 푸트레신, 스페르민, 칼륨, 인산염, 마그네슘, 알루미늄, 바나듐산염, 몰리브덴산염, 망간, 니켈, 규산염, 및 주석.
pH (6 내지 8, 6.5 내지 7.5)
본원에 기재된 방법은 약 6.8 내지 약 7.1의 pH에서 수행된다.
제1, 제2, 및/또는 제3 액체 배양 배지의 pH는 약 6.8 내지 약 7.1 (예를 들어, 약 6.8 내지 약 7.0, 약 6.8 내지 약 6.9, 약 6.9 내지 약 7.1, 약 6.9 내지 약 7.0, 또는 약 7.0 내지 약 7.2)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1, 제2, 및/또는 제3 액체 배양 배지의 pH는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 또는 약 7.1일 수 있다.
온도(30℃ 내지 40℃; 37℃)
포유류 세포를 인큐베이션하는 단계는 약 32℃ 내지 약 39℃ (예를 들어, 약 32℃ 내지 약 38℃, 약 32℃ 내지 약 36℃, 약 32℃ 내지 약 35℃, 약 32℃ 내지 약 34℃, 약 34℃ 내지 약 39℃, 약 34℃ 내지 약 38℃, 약 34℃ 내지 약 36℃, 약 35℃ 내지 약 39℃, 약 35℃ 내지 약 38℃, 약 35℃ 내지 약 37℃, 약 36℃ 내지 약 39℃, 약 36℃ 내지 약 38℃, 또는 약 37℃ 내지 약 39℃)의 온도에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계는 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 또는 약 39℃의 온도에서 수행된다.
당업자는 배양 단계 중의 특정 시점에(예를 들어, 매시간 또는 매일) 온도가 변경될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 생물반응기에 세포(예를 들어, 포유류 세포)를 초기 접종하고 나서 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 또는 약 20일 이상 후에 온도가 변경되거나 바뀔 수 있다(예를 들어, 높아지거나 낮아질 수 있다). 예를 들어, 온도는 상향 이동될 수 있다(예를 들어, 최대 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 최대 약 10℃의 변화). 예를 들어, 온도는 낮아질 수 있다(예를 들어, 최대 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19℃, 또는 최대 또는 약 20℃의 변화).
CO
2
(용존 CO2를 20 내지 200 mmHg; 80 내지 140 mmHg의 범위의 부분압으로 제어)
인큐베이션 단계는 생물반응기 내 액체 배지를 최대 또는 약 15%의 CO2(예를 들어, 최대 또는 약 14% CO2, 12% CO2, 10% CO2, 8% CO2, 6% CO2, 5% CO2, 4% CO2, 3% CO2, 2% CO2, 또는 최대 또는 약 1% CO2)를 함유하는 분위기에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 pCO2를 적어도 10% (예를 들어, 적어도 12%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 18%, 적어도 20%, 적어도 22%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 28%, 적어도 30%, 적어도 32%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 38%, 적어도 40%, 적어도 42%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 48%, 적어도 50%, 적어도 52%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 58%, 적어도 60%, 적어도 62%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 68%, 적어도 70%, 적어도 72%, 적어도 74%, 적어도 76%, 적어도 78%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 증가시키는 단계, 및 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 용기(예를 들어, 생물반응기))내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH를 적어도 8% (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 12%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 18%, 적어도 20%, 적어도 22%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 28%, 적어도 30%, 적어도 32%) 증가시키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태에서, 용기(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 용기(예를 들어, 생물반응기))내 제1, 제2, 및/또는 제3 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 (예를 들어, 적어도 12%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 18%, 적어도 20%, 적어도 22%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 28%, 적어도 30%, 적어도 32%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 38%, 적어도 40%, 적어도 42%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 48%, 적어도 50%, 적어도 52%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 58%, 적어도 60%, 적어도 62%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 68%, 적어도 70%, 적어도 72%, 적어도 74%, 적어도 76%, 적어도 78%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 증가된다.
재조합 단백질
본원에 제공된 방법에 의해 생성될 수 있는 재조합 단백질의 비제한적인 예로는, 면역글로불린(경쇄 및 중쇄 면역글로불린), 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 단편), 효소(예를 들어, 갈락토시다제(예를 들어, 알파-갈락토시다제), 미오자임(Myozyme) 또는 세레자임(Cerezyme)), 단백질(예를 들어, 인간 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자(TNF), 또는 인터페론 알파 또는 베타), 또는 면역원성 또는 항원성 단백질 또는 단백질 단편(예를 들어, 백신용 단백질) 등이 있다. 재조합 단백질은 적어도 하나의 다기능 재조합 단백질 스캐폴드를 함유하는 조작된 항원-결합 폴리펩티드일 수 있다(예를 들어, 문헌[Gebauer et al., Current Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009]; 및 미국 특허 출원 공개 번호 제2012/0164066호(본원에 그의 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 재조합 항원-결합 단백질 참조).
항체인 재조합 단백질의 비제한적인 예로는 다음이 포함된다: 파니투무맙(panitumumab), 오말리주맙(omalizumab), 아바고보맙(abagovomab), 아브식시맙(abciximab), 악톡수맙(actoxumab), 아달리무맙(adalimumab), 아데카투무맙(adecatumumab), 아펠리모맙(afelimomab), 아푸투주맙(afutuzumab), 알라시주맙(alacizumab), 알라시주맙, 알렘투주맙(alemtuzumab), 알리로쿠맙(alirocumab), 알투모맙(altumomab), 아마툭시맙(amatuximab), 아마툭시맙, 아나투모맙(anatumomab), 안루킨주맙(anrukinzumab), 아폴리주맙(apolizumab), 아르시투모맙(arcitumomab), 아티누맙(atinumab), 토실리주맙(tocilizumab), 바실리지맙(basilizimab), 벡투모맙(bectumomab), 벨리무맙(belimumab), 베바시주맙(bevacizumab), 베실레소맙(besilesomab), 베즐로톡수맙(bezlotoxumab), 비시로맙(biciromab), 카나키누맙(canakinumab), 세르톨리주맙(certolizumab), 세툭시맙(cetuximab), 식수투무맙(cixutumumab), 다클리주맙(daclizumab), 데노수맙(denosumab), 덴수맙(densumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 에팔리주맙(efalizumab), 에푼구맙(efungumab), 에프라투주맙(epratuzumab), 에르투막소맙(ertumaxomab), 에타라시주맙(etaracizumab), 피기투무맙(figitumumab), 골리무맙(golimumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 티욱세탄(tiuxetan), 이고보맙(igovomab), 임가투주맙(imgatuzumab), 인플릭시맙(infliximab), 이놀리모맙(inolimomab), 이노투주맙(inotuzumab), 라베투주맙(labetuzumab), 레브리키주맙(lebrikizumab), 목세주모맙(moxetumomab), 나탈리주맙(natalizumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오레고보맙(oregovomab), 팔리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 페르투주맙(pertuzumab), 라니비주맙(ranibizumab), 리툭시맙(rituximab), 토실리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 트랄로키누맙(tralokinumab), 투코투주맙(tucotuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 벨투주맙(veltuzumab), 잘루투무맙(zalutumumab) 및 자툭시맙(zatuximab).
본원에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있는 재조합 항체의 추가 예는 당업계에 알려져 있다. 본 방법에 의해 생성될 수 있는 재조합 단백질의 부가적인 비제한적인 예로는 다음이 포함된다: 알글루코시다제(alglucosidase) 알파, 라로니다제(laronidase), 아바타셉트(abatacept), 갈설파제(galsulfase), 루트로핀(lutropin) 알파, 항혈우병 인자, 아갈시다제(agalsidase) 베타, 인터페론 베타-1a, 다르베포에틴(darbepoetin) 알파, 테넥테플라제(tenecteplase), 에타네르셉트(etanercept), 응고 인자 IX, 여포 자극 호르몬, 인터페론 베타-1a, 이미글루세라제(imiglucerase), 도르나제(dornase) 알파, 에포에틴 알파, 인슐린 또는 인슐린 유사체, 메카세르민(mecasermin), 인자 VIII, 인자 VIIa, 항-트롬빈 III, 단백질 C, 인간 알부민, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 인터루킨-11, 라로니다제, 이두르수파제(idursuphase), 갈설파제, α-1-프로테이나제 저해제, 락타제, 아데노신 데아미나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 티로트로핀 알파(예를 들어, Thyrogen®) 및 알테플라제. 본 방법에 의해 생산가능한 재조합 단백질의 추가 예로, 산성 α-글루코시다아제, 알글루코시다아제 알파(예컨대, Myozyme® 및 Lumizyme®), α-L-이두로니다아제(예컨대, Aldurazyme®), 이두로네이트 설파타아제, 헤파란 N-설파타아제, 갈락토오스-6-설파타아제, 산성 β-갈락토시다아제, β-글루코로니다아제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제, 산성 리파아제, 리소좀 산성 세라미다아제, 산성 스핑고마이엘리나아제, β-글루코시다아제(예컨대, Cerezyme® 및 Ceredase®), 갈락토실세라미다아제, α-갈락토시다아제-A(예컨대, Fabrazyme®), 산성 β-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 뉴라미니다아제, 헥소사미니다아제 A 및 헥소사미니다아제 B가 있다.
분비된 가용성 재조합 단백질은 세포(예를 들어, 포유류 세포)로부터 액체 배지를 제거하거나 그렇지 않다면 물리적으로 분리함으로써, 액체 배양 배지(예를 들어, 제1, 제2 및 제3 액체 배양 배지)로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 피펫팅, 및/또는 흡인을 비롯한 세포(예를 들어, 포유류 세포)로부터 액체 배양 배지를 제거하기 위한 여러 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 이어서 분비된 재조합 단백질은 다양한 유형의 크로마토그래피(예를 들어, 친화도 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피), 및/또는 여과(예를 들어, 분자량 컷오프 여과)를 비롯한 다양한 생화학적 기법을 이용하여 액체 배양 배지로부터 회수되고 추가로 정제될 수 있다.
재조합 단백질의 회수
본원에 기재된 방법들의 일부 실시형태는 포유류 세포 및/또는 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지 중 하나 이상으로부터 재조합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 재조합 단백질)을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 회수는 포유류 세포를 용해하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 회수는 배지(예를 들어, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지 중 하나 이상)로부터 재조합 단백질을 수집하는 것을 포함할 수 있다.
수집은 배양이 예를 들어, 약 60 x 106개 세포/mL 초과, 62 x 106개 세포/mL, 64 x 106개 세포/mL, 66 x 106개 세포/mL, 68 x 106개 세포/mL, 70 x 106개 세포/mL, 72 x 106개 세포/mL, 74 x 106개 세포/mL, 76 x 106개 세포/mL, 78 x 106개 세포/mL, 80 x 106개 세포/mL 초과, 약 82 x 106개 세포/mL 초과, 약 84 x 106개 세포/mL 초과, 약 86 x 106개 세포/mL 초과, 약 88 x 106개 세포/mL 초과, 약 90 x 106개 세포/mL 초과, 약 92 x 106개 세포/mL 초과, 약 94 x 106개 세포/mL 초과, 약 96 x 106개 세포/mL 초과, 약 98 x 106개 세포/mL 초과, 약 100 x 106개 세포/mL 초과, 약 102 x 106개 세포/mL 초과, 약 104 x 106개 세포/mL 초과, 약 106 x 106개 세포/mL 초과, 약 108 x 106개 세포/mL 초과, 약 110 x 106개 세포/mL 초과, 약 112 x 106개 세포/mL 초과, 약 114 x 106개 세포/mL 초과, 약 116 x 106개 세포/mL 초과, 약 118 x 106개 세포/mL 초과, 약 120 x 106개 세포/mL 초과, 약 122 x 106개 세포/mL 초과, 약 124 x 106개 세포/mL 초과, 약 126 x 106개 세포/mL 초과, 약 128 x 106개 세포/mL 초과, 약 130 x 106개 세포/mL 초과, 약 132 x 106개 세포/mL 초과, 약 134 x 106개 세포/mL 초과, 약 136 x 106개 세포/mL 초과, 약 138 x 106개 세포/mL 초과, 약 140 x 106개 세포/mL 초과, 약 142 x 106개 세포/mL 초과, 약 144 x 106개 세포/mL 초과, 약 146 x 106개 세포/mL 초과, 약 148 x 106개 세포/mL 초과, 약 150 x 106개 세포/mL 초과, 약 152 x 106개 세포/mL 초과, 약 154 x 106개 세포/mL 초과, 약 156 x 106개 세포/mL 초과, 약 158 x 106개 세포/mL 초과, 약 160 x 106개 세포/mL 초과, 약 162 x 106개 세포/mL 초과, 약 164 x 106개 세포/mL 초과, 약 166 x 106개 세포/mL 초과, 약 168 x 106개 세포/mL 초과, 약 170 x 106개 세포/mL 초과, 약 172 x 106개 세포/mL 초과, 약 174 x 106개 세포/mL 초과, 약 176 x 106개 세포/mL 초과, 약 178 x 106개 세포/mL 초과, 약 180 x 106개 세포/mL 초과, 약 182 x 106개 세포/mL 초과, 약 184 x 106개 세포/mL 초과, 약 186 x 106개 세포/mL 초과, 약 188 x 106개 세포/mL 초과, 약 190 x 106개 세포/mL 초과, 약 192 x 106개 세포/mL 초과, 약 194 x 106개 세포/mL 초과, 약 196 x 106개 세포/mL 초과, 약 198 x 106개 세포/mL 초과, 또는 약 200 x 106개 세포/mL 초과)의 생존 세포 밀도를 달성한 후에 수행될 수 있다.
재조합 단백질의 제형화
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시형태는 재조합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 재조합 단백질, 예를 들어, 회수된 재조합 단백질 또는 회수되고 정제된 재조합 단백질)을 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 제형화는 재조합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 재조합 단백질, 예를 들어, 회수된 재조합 단백질 또는 회수되고 정제된 재조합 단백질)에 약제학적으로 허용가능한 부형제를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 제형화는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 재조합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 재조합 단백질, 예를 들어, 회수된 재조합 단백질 또는 회수되고 정제된 재조합 단백질)과 혼합하는 것을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제(예를 들어, 비천연 발생 약제학적으로 허용가능한 부형제)의 예는 당 분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 재조합 단백질, 예를 들어, 회수된 재조합 단백질 또는 회수되고 정제된 재조합 단백질)은 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 투여를 위해 제형화된다.
약제학적 조성물 및 키트
또한, 본원에 기재된(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된) 임의의 재조합 단백질 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로 (예를 들어, 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 투여)와 양립가능하도록 제형화된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 (예를 들어, 인산염 완충 식염수)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체가 필요로 하고 견딜 수 있는 투여량 및 빈도에 따라 제형의 단일 또는 다중 투여가 제공될 수 있다.
또한 약제학적 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물)을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하는 것에 대한 설명서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물의 적어도 1회 용량(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회) 용량을 포함할 수 있다.
치료 방법
본원에 기재된(본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된) 임의의 재조합 단백질 중 적어도 하나를 포함하는 본원에 기재된 치료적 유효량의 임의의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 것이 본원에 제공된다.
투여는 예를 들어, 1주일에 적어도 1회(예를 들어, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 적어도 10회, 적어도 11회, 또는 적어도 12회) 수행될 수 있다.
본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하지 않는 하기 실시예로 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1. 삼투질농도 제어 방법
관류 배양을 수반하는 방법은 많은 액체 배양 배지를 사용하며, 각 배치를 준비하는 데 상당한 비용이 필요하다. 액체 배양 배지의 대부분은 물이다. 그러나, 세포 밀도가 높으면 영양분 소비로 인해 삼투질농도가 크게 떨어지기 때문에, 단일 액체 배양 배지를 전체 고밀도 세포 관류 공정에 사용할 수 없다. 예를 들어, 12 g/L 글루코스 소비로 인해 67 mOsm/kg 감소가 초래된다.
전형적인 삼투질농도(290 mOsm/kg 내지 320 mOsm/kg)를 갖는 단일 액체 배양 배지를 사용하면, 높은 세포 밀도에서 낮은 삼투질농도가 발생했다. 저삼투성 조건은 세포 건강을 악화시키고 생산성을 감소시켰다. 그러나, 세포 배양(예를 들어, 관류 세포 배양) 시작부터 단일 고삼투질농도 액체 배양 배지를 사용하면 락트산염 생성이 폭주하고 세포 배양이 감소할 수 있다.
본원에 기재된 (제1 액체 배양 배지에 첨가되는) 제2 액체 배양 배지(4x 액체 배양 배지 제형)는 (유가 배양을 위한 공급 액체 배양 배지에 비해) 상대적으로 높은 삼투질농도를 가질 수 있고, 7 미만의 pH를 가져 침전을 방지할 수 있다. 이 제2 액체 배양 배지는 pH 6 내지 pH 7에서도 실온에서 1주일 미만 동안 안정적일 수 있다. 제2 액체 배양 배지 안정성을 높이기 위해 적어도 두 가지 대안을 사용할 수 있다: 1) 시스테인과 티로신을 제거하거나, 또는 2) 시스테인과 티로신의 대체 형태(예를 들어, 각각 피루베이트/시스테인 및 글리신-티로신)를 사용한다.
관류 세포 배양에서 삼투질농도를 제어하기 위해, 농축된 제2 액체 배양 배지를 사용할 수 있으며, 다양한 양의 세 번째 저삼투질농도 액체(예를 들어, 물)로 희석할 수 있다. 삼투질농도 증가가 필요한 경우, 농축된 염화나트륨(NaCl) 용액을 선택적으로 첨가할 수도 있다. 또한, 용존 CO2 농도와 배양물의 pH를 변경하여 삼투질농도를 조절할 수 있다.
실시예 2. 세포 배양 성능에 대한 삼투질농도의 영향
세포 배양 성능(예를 들어, 생존 세포 밀도)에 대한 삼투질농도의 영향을 결정하기 위해, 포유류 세포를 약 290 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 액체 배양 배지에서 성장시켰다. 도 1a 및 1b는 각각 단백질 1 및 단백질 2를 발현하는 포유류 세포에서 시간 경과에 따른 생존 세포 밀도를 나타낸다. 도 1a 및 1b의 데이터는 포유류 세포가 380 mOsm/kg 초과의 삼투질농도를 갖는 액체 배양 배지에서 성장할 때 포유류 세포의 더 느린 성장이 관찰되었음을 보여준다.
4일 및 5일차의 각각의 평균 세포 직경이 테스트된 삼투질농도로 표시되었다(도 2a 및 2b). 도 2a 및 2b의 데이터는 삼투질농도가 높을수록 평균 세포 크기가 더 커지는 것을 보여줬으며, 이는 삼투질농도가 세포 형태에 영향을 미친다는 것을 설명한다.
도 3a 및 3b는 농축된 세포 배양 배지(삼투질농도 1320 mOsm/kg) 및 물을 각각 공급하는 2개의 생물반응기의 삼투질농도 및 세포 배양 성장을 보여준다. 농축된 배지 공급 대 물 공급의 비율은 배양의 성장 단계에 따라 다양해졌다. 용기 22(“V22”)는 용기 27(“V27”)보다 물 대 배지의 비율이 더 낮았으며, 그 결과 10일차에 시작된 배양에서 높은 삼투질농도가 초래되었다(도 3a). 이로 인해 V27에 비해 V22의 성장률이 감소했다(도 3b). 또한 높은 삼투질농도로 인해 생산성이 감소하고(도 3c), 락트산염 탈수소효소 생성이 많아져, 배양 건강이 감소했음을 나타낸다(도 3d). 높은 삼투질농도에 대한 한 가지 반응은 V22에서 락트산염 생성이 증가한 것이고(도 3e), 이는 계속해서 락트산염의 양을 증가시킨다(“락트산염 생성 폭주”).
도 4a 및 4b는 삼투질농도 증가를 초래한, 락트산염 생성이 높은 배양 결과를 나타낸다. 삼투질농도가 400 mOsm/kg를 초과하면, 락트산염 생성 속도가 증가하고, 세포 성장과 생존력이 감소했다.
실시예 3. 삼투질농도 제어 옵션
안전한 작동을 위한 관류 배양에 대한 삼투질농도 임계값은 최고 360 내지 420 mOsm/kg의 범위였다. 삼투질농도는 다양한 수단을 통해, 예를 들어, 1) 농축된 세포 배양 배지를 공급하고 피드백 제어와 함께 물 희석률을 조절함으로써, 2) 염기 첨가에 영향을 미치도록 공정 매개변수를 변경함으로써(예를 들어, 더 높은 삼투질농도가 요구될 때, 높은 pH 및 pCO2), 3) 생물반응기 캠페인 내에서 적어도 2개의 서로 다른 액체 배양 배지, 예를 들어, 낮은 삼투질농도를 갖는 성장 액체 배양 배지 및 높은 삼투질농도를 갖는 생산 액체 배양 배지를 사용함으로써, 4) 높은 세포 밀도로 염, 예를 들어, 피드백 제어를 갖는 NaCl 및/또는 KCl을 첨가하여, 삼투질농도를 증가시킴으로써, 제어할 수 있다. 무세포 배양 투과액의 오프라인 삼투질농도 측정을 기반으로 삼투질농도를 제어하기 위한 공정 변경을 수동으로 수행할 수 있다. 대안적으로, 온라인 삼투질농도 예측을 기반으로, 자동화된 피드백 제어를 구현할 수 있다. 온라인 삼투질농도는 적절한 모델과 함께 온라인 정전용량 측정, 온라인 전도도 측정, 또는 라만 분광학 측정으로부터 예측할 수 있다.
도 5a 및 5b는 성장 단계에서 생산 단계로 진행되는 공급 배지 삼투질농도의 단계적 변화를 나타낸다. 각 생물반응기에 대해, 주어진 시점에 NaCl 첨가를 수동으로 켠 다음, 실험 기간 동안 NaCl 흐름을 일정하게 유지했다. 도 5a 및 5b의 데이터는 동일한 정전용량 설정점에도 불구하고 서로 다른 삼투질농도에서 서로 다른 VCD 프로파일을 나타냈다. 이는 삼투질농도를 제어하기 위해 일정한 NaCl 공급 속도를 사용하는 데 한계가 있음을 보여준다.
도 6a 및 6b는 삼투질농도 조절이 필요한 수확 단계 동안 높은 세포 밀도에서 삼투질농도와 전도도의 우수한 상관 관계를 나타냈다.
전도도는 ABER 프로브로 측정되었으며, 두 측정값의 평균이 도 7에 표시되었다. 설정점을 유지하기 위해, 전도도 피드백 제어를 기반으로 5 M NaCl을 생물반응기에 공급하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 대조군은 5일차에 시작하였고, 배양 기간 초기에는 염 첨가가 필요하지 않았다. NaCl 첨가는 10일 경에 시작하였다. 전도도 피드백 제어를 기반으로 한 NaCl 첨가는 배양 수확 단계 전반에 걸쳐 일관된 전도도 및 삼투질농도를 가져왔다. 또한, 전도도 피드백 제어를 기반으로 한 NaCl 첨가는 지속적인 NaCl 첨가를 사용하는 공정에 비해 공정 혼란 중에 삼투질농도 일탈을 줄이는 데 도움이 된다.
도 8a 및 8b의 데이터는 자동화된 전도도 제어가 유사한 삼투질농도 경향을 생성한 4가지 실험적 실행 모두에 대해 동일한 정전용량 설정점에서 유사한 생존 세포 밀도 프로필을 보여주었다.
도 9는 두 가지 다른 프로브 유형으로 전도도와 삼투질농도 사이의 양호한 상관관계를 보여주었다.
도 10은 라만 분광법을 사용하여 삼투질농도를 정확하게 예측할 수 있으며 라만 프로브를 생물반응기 또는 무세포 관류 수확물에 배치할 수 있음을 보여주었다.
도 11에 도시된 바와 같이, 관류 세포 배양 과정에서 생존 세포 밀도가 과정 중간에 낮은 지점에 도달하는 경향이 관찰되었다. 이는 생물반응기의 정전용량 센서로 측정한 바와 같이, 일정한 정전용량 값을 유지하기 위해 바이오매스 농도를 제어할때의 세포 크기 증가로 인해 발생했다. 이들 배양의 후반부에서는, 세포 크기가 감소하고 생존 세포 밀도가 증가한다.
여러 배치의 데이터를 수집한 결과, 삼투질농도와 배양시에 도달한 가장 낮은 생존 세포 밀도 사이에 상관관계가 있으며, 삼투질농도가 높을수록 세포 밀도가 낮다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 발견은 60일 과정 중 30일째 VCD를 30일째 배양 삼투질농도와 비교하여 플롯한 도면에 설명되어 있다. 삼투질농도를 원하는 수준으로 제어할 수 있는 능력을 사용하면, 공정 중 VCD의 변화를 최소화할 수 있고, 공정 내 일관성이 향상되었다.
기타 실시형태
본 발명을 발명의 상세한 설명과 함께 설명하였지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이지 이를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 양태, 이점, 및 변형은 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
Claims (120)
- 포유류 세포의 관류 배양 방법으로서,
약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 함유하는 용기를 제공하는 단계;
약 32℃ 내지 약 39℃에서 일정 기간 동안 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
상기 일정 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며, 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg로 유지되는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서,
제1 액체 배양 배지는 약 270 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제1항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 8 g/L 초과의 폴록사머를 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 10 g/L 초과의 폴록사머를 포함하는, 방법. - 제4항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 12 g/L 초과의 폴록사머를 포함하는, 방법. - 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
폴록사머는 Pluronic F68인, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 액체 배양 배지의 pH가 약 6.8 내지 약 7.1인, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 염화나트륨을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제9항에 있어서,
제2 액체 배양 배지는 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일정 기간에 걸쳐 증가되는, 방법. - 제11항에 있어서,
첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가되는, 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함하는, 방법. - 제13항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함하는, 방법. - 제14항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제17항에 있어서,
용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가되는, 방법. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제19항에 있어서,
제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 100 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제20항에 있어서,
제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 120 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 동시에 수행되는, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 연속적으로 수행되는, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 주기적으로 수행되는, 방법. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지에 제3 부피의 수용액을 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지되는, 방법. - 제26항에 있어서,
수용액이 염 용액인, 방법. - 제27항에 있어서,
염 용액은 염화나트륨 용액 또는 염화칼륨 용액인, 방법. - 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 동시에 수행되는, 방법. - 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 연속적으로 수행되는, 방법. - 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 주기적으로 수행되는, 방법. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 제1 액체 배양 배지에 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/mg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지되는, 방법. - 제32항에 있어서,
제3 액체 배양 배지가 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제32항 또는 제33항에 있어서,
용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함하는, 방법. - 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함하는, 방법. - 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함하는, 방법. - 제32항에 있어서,
제3 액체 배양 배지는 약 10 mOsm/kg 내지 약 270 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제37항에 있어서,
제3 액체 배양 배지는 약 50 mOsm/kg 내지 약 200 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제37항 또는 제38항에 있어서,
용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제3 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함하는, 방법. - 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제3 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함하는, 방법. - 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제3 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함하는, 방법. - 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1, 제2 및 제3 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제42항에 있어서,
방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제43항에 있어서,
용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가되는, 방법. - 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제45항에 있어서,
제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 100 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제46항에 있어서,
제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 120 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제32항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 동시에 수행되는, 방법. - 제32항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 연속적으로 수행되는, 방법. - 제32항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 주기적으로 수행되는, 방법. - 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
포유류 세포는 CHO 세포인, 방법. - 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
용기가 생물반응기인, 방법. - 제53항에 있어서,
생물반응기가 관류 생물반응기인, 방법. - 재조합 단백질의 생산 방법으로서,
약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는 제1 액체 배양 배지에 배치된 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 포유류 세포를 함유하는 용기를 제공하는 단계;
약 32℃ 내지 약 39℃에서 일정 기간 동안 포유류 세포를 인큐베이션하는 단계;
상기 일정 기간 동안, 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 제1 부피와 제2 부피가 거의 동일하며, 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도가 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg로 유지되는, 단계; 및
포유류 세포로부터 또는 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제55항에 있어서,
제1 액체 배양 배지는 약 270 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제55항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 8 g/L 초과의 폴록사머를 포함하는, 방법. - 제57항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 10 g/L 초과의 폴록사머를 포함하는, 방법. - 제58항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 12 g/L 초과의 폴록사머를 포함하는, 방법. - 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
폴록사머는 Pluronic F68인, 방법. - 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 액체 배양 배지의 pH가 약 6.8 내지 약 7.1인, 방법. - 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 염화나트륨을 포함하는, 방법. - 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 액체 배양 배지가 약 800 mOsm/kg 내지 약 2,500 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제63항에 있어서,
제2 액체 배양 배지는 약 1,200 mOsm/kg 내지 약 1,800 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제55항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 일정 기간에 걸쳐 증가되는, 방법. - 제65항에 있어서,
첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가되는, 방법. - 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함하는, 방법. - 제67항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함하는, 방법. - 제68항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제67항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함하는, 방법. - 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제71항에 있어서,
용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가되는, 방법. - 제55항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제73항에 있어서, 제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 100 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법.
- 제74항에 있어서, 제1 및 제2 액체 배양 배지에서의 120 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법.
- 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지의 삼투질농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제55항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 동시에 수행되는, 방법. - 제55항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 연속적으로 수행되는, 방법. - 제55항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 주기적으로 수행되는, 방법. - 제55항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
재조합 단백질은 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로 분비되는, 방법. - 제80항에 있어서,
재조합 단백질이 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로부터 회수되는, 방법. - 제55항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 용기내 제1 및 제2 액체 배양 배지에 제3 부피의 수용액을 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지되는, 방법. - 제82항에 있어서,
수용액이 염 용액인, 방법. - 제83항에 있어서,
염 용액은 염화나트륨 용액 또는 염화칼륨 용액인, 방법. - 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 동시에 수행되는, 방법. - 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 연속적으로 수행되는, 방법. - 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 주기적으로 수행되는, 방법. - 제55항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 제1 액체 배양 배지에 제3 부피의 제3 액체 배양 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 부피는 제2 및 제3 부피의 합과 거의 동일하고, 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도는 일정 기간에 걸쳐 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg으로 유지되는, 방법. - 제88항에 있어서,
제3 액체 배양 배지가 약 270 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제88항 또는 제89항에 있어서,
용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제2 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함하는, 방법. - 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함하는, 방법. - 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제2 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함하는, 방법. - 제88항에 있어서,
제3 액체 배양 배지는 약 0 mOsm/kg 내지 약 270 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제93항에 있어서,
제3 액체 배양 배지는 약 50 mOsm/kg 내지 약 200 mOsm/kg의 삼투질농도를 갖는, 방법. - 제93항 또는 제94항에 있어서,
용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 유지하는 것은 일정 기간 동안 제3 액체 배양 배지의 유속을 조정하는 것을 포함하는, 방법. - 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제3 액체 배양 배지의 유속을 증가시키는 것을 포함하는, 방법. - 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서,
조정 단계는 일정 기간 동안 특정 시점에서 제3 액체 배양 배지의 유속을 감소시키는 것을 포함하는, 방법. - 제88항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 특정 시점에서 용기내 제1, 제2 및 제3 액체 배양 배지의 pH 및 pCO2 중 하나 또는 둘 다를 조정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제98항에 있어서,
방법은 일정 기간에 걸쳐 용기내 pCO2를 증가시키고, 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pH를 증가시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제99항에 있어서,
용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 pCO2 및 pH는 일정 기간에 걸쳐 생존 세포 밀도를 기준으로 증가되는, 방법. - 제88항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 60 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제101항에 있어서,
제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 100 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제102항에 있어서,
제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지에서의 120 x 106개 세포/mL 초과의 생존 세포 밀도가 일정 기간 동안 달성되는, 방법. - 제88항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 일정 기간 동안 용기내 제1, 제2, 및 제3 액체 배양 배지의 삼투질농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제88항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 동시에 수행되는, 방법. - 제88항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 연속적으로 수행되는, 방법. - 제88항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
일정 기간에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가, 및 제3 부피의 첨가는 주기적으로 수행되는, 방법. - 제88항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
재조합 단백질은 제1, 제2, 및/또는 제3 액체 배양 배지로 분비되는, 방법. - 제108항에 있어서,
재조합 단백질이 제1, 제2, 및/또는 제3 액체 배양 배지로부터 회수되는, 방법. - 제55항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서,
포유류 세포는 CHO 세포인, 방법. - 제55항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서,
용기가 생물반응기인, 방법. - 제111항에 있어서,
생물반응기가 관류 생물반응기인, 방법. - 제55항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서,
재조합 단백질은 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편 또는 조작된 단백질인, 방법. - 제55항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
재조합 단백질이 포유류 세포로부터 회수되는, 방법. - 제55항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 재조합 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제115항에 있어서,
방법은 단리된 재조합 단백질을 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제55항 내지 제114항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 재조합 단백질.
- 제117항의 재조합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제118항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
- 치료적 유효량의 제118항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
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