JP6330025B2 - 染色及びサンプル処理用の方法及び組成物 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日出願の米国特許仮出願第６１／７９９，１５２号、表題「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｆｌｕｉｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」の利益を主張し、ここにその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。

（発明の分野）
本開示は概して、粒子対比剤に関し、より具体的には、サンプル中の血球などの粒子を識別し、定量化する、全体的又は部分的に自動化された装置で使用する粒子対比剤組成物に関する。

血球分析は、患者の健康状態の概要を示すために、最も一般的に行われる医学的検査のうちの１つである。血液サンプルは、患者の体から採取され、凝固を防ぐために抗凝固剤を含む試験管中に保管される場合がある。全血サンプルは通常、赤血球（erythrocytes）、白血球（leukocytes）及び血小板（thrombocytes）などの、主に３種類の血球を含む。各種類は、その種類のサブクラスに更に分けられる。例えば、主に５つのタイプ、つまりサブクラスの白血球（ＷＢＣ）は、異なる形状と機能を有する。白血球は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を含み得る。赤血球のタイプにもサブクラスがある。サンプル中の粒子の出現は、病態、細胞成熟度、及びその他の要因によって異なり得る。赤血球のサブクラスは、網赤血球及び有核赤血球を含み得る。

ＲＢＣ、ＷＢＣ、又は血小板の濃度を推定する血球算定は、用手で、又は自動分析器を用いて実施できる。血球算定を用手で行う場合、１滴の血液を薄層塗抹標本として顕微鏡用スライドにのせる。従来は、顕微鏡用スライド上の血液を乾燥させ、染色した塗抹標本を用主検査を使用して、５種類の白血球の数又は相対量を決定している。組織学的な色素及び染料を用いて、細胞又は細胞構造を染色している。例えば、ライト染色は、光学顕微鏡下での検査のための血液塗抹標本の染色に用いられている組織学的染料である。サンプル染色は、染色剤が正確に適用され、細胞構造が適切に保存されることを確実にするために、複数の溶液を正しい順序で使用することを伴う。第１工程で、固定剤をサンプルに適用して、サンプルの分解（degredation）を防ぎ、細胞構造を維持することができる。その後、第２工程で透過剤をサンプルに適用し、染色剤を細胞に入れることができるように、細胞膜を溶解できる。第３工程で、染色剤をサンプルに適用して、適当な構造を染色できる。観察するためにサンプルを更にリンスしてよく、又は追加工程を行って、更なる染料、対比染料の適用、若しくは、他の処置を実施してもよい。

これらの工程を、適切な順序で適切な時間をかけて行うことが重要である。サンプルが固定前に透過処理されると、サンプル中の細胞構造が固定前に分解される恐れがあり、本来の細胞形態のあらゆる識別能が失われる。加えて、透過工程に先立って染色は起こり得ず、すなわち、染色剤は適切に細胞に浸透せず、細胞内の構造を染色しない。加えて、固定、透過処理、及び染色などの任意の工程をあまりにも迅速に実施すると、細胞の形態が失われる恐れ、並びに／又は、細胞及びその内部構造が正しく染色されない恐れがある。現在の染色手法は、複数の工程とかなりの時間を要する。

現在の染色手法は、サンプルを対比剤で、一般に約１：５００又は１：５０００に希釈することを必要とする。このように、現在の染色手法における正しい染色が得られる。

自動分析器は、広く普及しつつある。自動分析器を用いて全血球算定（ＣＢＣ）が得られるが、ある種の機器は、粒子、つまり細胞が細い管に沿ってセンサー領域を通過する際のインピーダンス又は動的光散乱に基づいて、血液サンプル中の異なる粒子、つまり細胞の数を計数する。自動ＣＢＣは、別々に数えられ得るＲＢＣ、ＷＢＣ及び血小板（ＰＬＴ）を含む異なる種類の細胞の違いを識別する、機器又は方法を利用する場合がある。例えば、最小粒径又は体積を必要とする計算手法は、大きい細胞のみを計数するのに使用され得る。血液中の異常細胞などの特定の細胞は、計数されず、つまり正しく同定されない場合がある。互いに付着している小さい細胞は、大きい細胞と誤って数えられる恐れがある。計数エラーが疑われると、細胞を検証し、同定するために、機器による結果を人力で見直す必要があり得る。

自動血球算定手法は、フローサイトメトリーを伴う場合がある。フローサイトメトリーは、狭い流路を設け、個々の血球の通過を検知して計数することを伴う。フローサイトメトリー法は、流体中に浮遊した粒子、例えば、血液サンプル中の細胞を検出し、その粒子を粒子の種類、寸法、及び体積分布について分析して、血液サンプル中の各粒子の種類の濃度、つまり粒子体積を推定するために使用されている。流体中に浮遊した粒子を分析するのに好適な方法の例として、沈降、顕微鏡的特性決定、インピーダンスをベースとする計算、及び動的光散乱が挙げられる。これらの手段は、検査誤差を生じやすい。一方、粒子の種類及び濃度の正確な特性決定は、医療診断などの用途において重要である場合がある。

撮像をベースとする計算手法では、表示画面を通過し得る調製したサンプルのピクセルデータ像は、デジタルカメラに連結された顕微鏡の対物レンズを用いて取り込まれる。ピクセル画像データをデータ処理手法を用いて解析でき、またモニタに表示することもできる。

フローセルを有する自動診断システムの態様は、米国特許第６，８２５，９２６号（Ｔｕｒｎｅｒら）、並びに同第６，１８４，９７８号、同第６，４２４，４１５号、及び同第６，５９０，６４６号（全てＫａｓｄａｎら）に開示されており、ここに、本明細書に完全に記載されているものとして参照することにより組み込まれる。
動的光散乱又はインピーダンスを用いる自動システムは、全血球算定（ＣＢＣ）：総白血球数（ＷＢＣ）、赤血球の総細胞容積（ＲＢＣ分布）、ヘモグロビンＨＧＢ（血中ヘモグロビン量）；平均赤血球容積（ＭＣＶ）（赤血球の平均容積）；ＭＰＶ（平均ＰＬＴ容積）；ヘマトクリット（ＨＣＴ）；ＭＣＨ（ＨＧＢ／ＲＢＣ）（赤血球当たりの平均ヘモグロビン量）；及びＭＣＨＣ（ＨＧＢ／ＨＣＴ）（細胞中ヘモグロビン平均濃度）を得るのに用いられている。自動化又は部分的自動化プロセスは、白血球の５種類の分画及び血液サンプル分析を容易にするために用いられている。

米国特許第６，８２５，９２６号明細書 米国特許第６，１８４，９７８号明細書 米国特許第６，４２４，４１５号明細書 米国特許第６，５９０，６４６号明細書

上記の様々な自動システムは、サンプルの迅速分析に依存している。染色プロセスの工程数及びその持続時間は、自動粒子分析システムの速度及び効率の律速因子となり得る。染色プロセスを短縮できれば、自動粒子分析システムはより効率的に、染色プロセスが単一工程で実施できれば、更により効率的になり得る。加えて、サンプルの総量を最小限にとどめれば、自動粒子分析システムはより効率的になり得る。

自動粒子分析システム中で撮像される血液流体サンプルを染色するための、粒子対比剤組成物が開示される。この粒子対比剤組成物は、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、メチルグリーン、エオシンＹ、及びサフラニンＯからなる群から選択される、少なくとも１種の粒子対比剤を含んでよい。この粒子対比剤組成物は更に、界面活性剤、サポニン、四級アンモニウム塩、非イオン性界面活性剤、洗剤、及び双極性界面活性剤からなる群から選択される、透過剤を含んでよい。この粒子対比剤組成物は更に、グルタルアルデヒド（gluteraldehyde）及びホルムアルデヒドからなる群から選択される、固定剤を含んでよい。

一実施形態では、透過剤は、染色条件下で約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で存在するサポニンであってよい。固定剤は、染色条件下で０．１％以下の濃度をもたらすのに十分な量で存在するグルタルアルデヒドであってよい。

一実施形態では、少なくとも１種の粒子対比剤は、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、及びエオシンＹを含んでよい。クリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比は、染色条件下で約１：９０〜約１：１１０であってよい。エオシンＹは、染色条件下で約３μＭ〜約３００μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。

一実施形態では、クリスタルバイオレットは、染色条件下で約６μＭ〜約１０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。ニューメチレンブルーは、染色条件下で約７０μＭ〜約２．４ｍＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。エオシンＹは、染色条件下で約１０μＭ〜約５０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。

いくつかの実施形態では、クリスタルバイオレットは、およそ９０％以上の純度である。ニューメチレンブルーは、およそ７０％以上の純度であってよい。エオシンＹは、およそ８０％以上の純度であってよい。

いくつかの実施形態では、クリスタルバイオレットは、染色条件下で約７．８μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在する。ニューメチレンブルーは、染色条件下で約７３５μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在する。エオシンＹは、染色条件下で約２７μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。いくつかの実施形態では、粒子対比剤組成物は、緩衝成分を更に含んでよい。

自動粒子分析システムを用いて撮像される血液流体サンプルの粒子を処理する方法が開示される。この方法は、血液流体サンプルを粒子対比剤組成物と混合してサンプル混合液を得る工程と、約３７℃〜約６０℃の温度で９０秒未満サンプル混合液をインキュベートする工程と、を含んでよい。粒子対比剤組成物は、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、メチルグリーン、エオシンＹ、及びサフラニンＯからなる群から選択される少なくとも１種の粒子対比剤と、界面活性剤、サポニン、四級アンモニウム塩、非イオン性界面活性剤、洗剤、及び双極性界面活性剤からなる群から選択される透過剤と、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドからなる群から選択される固定剤と、を含む。

いくつかの実施形態では、粒子対比剤は、染色条件下で約１：１〜約１：５００のクリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比をもたらすのに十分な量で、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルーを含んでよい。サポニンは、染色条件下で約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で含まれてよい。グルタルアルデヒドは、染色条件下で０．１％以下の濃度をもたらすのに十分な量で含まれてよい。この方法は、６０秒未満インキュベートされるサンプル混合液を含んでよい。

いくつかの実施形態では、粒子対比剤組成物は、染色条件下で約６μＭ〜約１０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットを含んでよい。ニューメチレンブルーは、染色条件下で約７０μＭ〜約２．４ｍＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。エオシンＹは、染色条件下で約１０μＭ〜約５０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。血液流体サンプルを、約１：２〜約１：１０の血液流体サンプル対粒子対比剤組成物の比で、粒子対比剤組成物と混合してよい。

いくつかの実施形態では、この方法は、サンプル混合液を４６℃〜約４９℃まで４０〜５０秒間加熱する工程を含んでよい。

いくつかの実施形態では、クリスタルバイオレットは、およそ９０％以上の純度であってよい。ニューメチレンブルーは、およそ７０％以上の純度であってよい。エオシンＹは、およそ８０％以上の純度であってよい。

いくつかの実施形態では、粒子対比剤は、染色条件下で約７．８μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットと、染色条件下で約７３５μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するニューメチレンブルーと、染色条件下で約２７μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するエオシンＹと、を含んでよい。粒子対比剤組成物は、緩衝成分を更に含んでよい。血液流体サンプルを、約１：３〜約１：４の血液流体サンプル対粒子対比剤組成物の比で、粒子対比剤組成物と混合してよい。サンプル混合液を、約４７℃まで約４５秒間加熱してよい。

上記したもの及び本発明の実施形態の多くの他の特徴及び付随する利点は、下記の実施形態への参照により、付随の図と共に考慮されると、明らかとなりより理解されるだろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、メチルグリーン、エオシンＹ、及びサフラニンＯからなる群から選択される少なくとも１種の粒子対比剤と、
界面活性剤、サポニン、四級アンモニウム塩、非イオン性界面活性剤、洗剤、及び双極性界面活性剤からなる群から選択される透過剤と、
グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドからなる群から選択される固定剤と、を含む、自動粒子分析システム中で撮像される血液流体サンプルを染色するための粒子対比剤組成物。
（項目２）
前記透過剤が、染色条件下で約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で存在するサポニンであり、
前記固定剤が、染色条件下で０．１％以下の濃度をもたらすのに十分な量で存在するグルタルアルデヒドである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記少なくとも１種の粒子対比剤が、クリスタルバイオレットと、ニューメチレンブルーと、エオシンＹと、を含み、
前記クリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比が、染色条件下で約１：９０〜約１：１１０であり、
前記エオシンＹが、染色条件下で約３μＭ〜約３００μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在する、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約６μＭ〜約１０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、
前記ニューメチレンブルーが、染色条件下で約７０μＭ〜約２．４ｍＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、
前記エオシンＹが、染色条件下で約１０μＭ〜約５０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在する、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記クリスタルバイオレットが、およそ純度９０％以上であり、
前記ニューメチレンブルーが、およそ純度７０％以上であり、
前記エオシンＹが、およそ純度８０％以上である、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約７．８μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、
前記ニューメチレンブルーが、染色条件下で約７３５μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、
前記エオシンＹが、染色条件下で約２７μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在する、項目５に記載の組成物。
（項目７）
緩衝成分を追加的に含む、項目４に記載の組成物。
（項目８）
血液流体サンプルを項目１に記載の粒子対比剤組成物と混合して、サンプル混合液を得る工程と、
前記サンプル混合液を、約３７℃〜約６０℃の温度で９０秒未満インキュベートする工程と、を含む、自動粒子分析システムを用いて撮像される血液流体サンプルの粒子を処理する方法。
（項目９）
前記粒子対比剤組成物が、
染色条件下で約１：１〜約１：５００のクリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比をもたらすのに十分な量の、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルーと、
染色条件下で約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量のサポニンと、
染色条件下で０．１％以下の濃度をもたらすのに十分な量のグルタルアルデヒドと、を含み、
前記サンプル混合液をインキュベートする工程が、前記サンプル混合液を６０秒未満加熱する工程を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記粒子対比剤組成物が、
染色条件下で約６μＭ〜約１０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットと、
染色条件下で約７０μＭ〜約２．４ｍＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するニューメチレンブルーと、
染色条件下で約１０μＭ〜約５０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するエオシンＹと、を含み、
前記血液流体サンプルを粒子対比剤組成物と混合する工程が、約１：２〜約１：１０の血液流体サンプル対粒子対比剤組成物の比まで混合する工程を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記サンプル混合液をインキュベートする工程が、前記サンプル混合液を４６℃〜約４９℃まで４０〜５０秒間加熱する工程を含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記クリスタルバイオレットが、およそ純度９０％以上であり、
前記ニューメチレンブルーが、およそ純度７０％以上であり、
前記エオシンＹが、およそ純度８０％以上である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記粒子対比剤組成物が、
染色条件下で約７．８μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットと、
染色条件下で約７３５μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するニューメチレンブルーと、
染色条件下で約２７μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するエオシンＹと、
緩衝成分と、を含み、
前記血液流体サンプルを粒子対比剤組成物と混合する工程が、約１：３〜約１：４の血液流体サンプル対粒子対比剤組成物の比まで混合する工程を含み、
前記サンプル混合液をインキュベートする工程が、前記サンプル混合液を約４７℃まで約４５秒間加熱する工程を含む、項目１１に記載の方法。

本明細書は、別の図における類似する参照番号の使用が、同様の、すなわち類似する構成要素を説明することを目的としている、以下の添付図面を参照する。
一実施形態によるサンプル流体を運ぶフローセルの概略図である。 一実施形態による粒子対比剤組成物の調製の概略図である。 一実施形態による迅速一段階染色プロセスのフローチャートである。 一実施形態による迅速一段階染色プロセスによって染色された、選択された白血球の代表図である。 一実施形態による粒子対比剤組成物で染色されたサンプルの、選択された白血球（while blood cells）の代表図である。 初期実施例１によって染色された細胞の代表図である。 初期実施例２によって染色された細胞の代表図である。 初期実施例３によって染色された細胞の代表図である。 初期実施例４によって染色された細胞の代表図である。 初期実施例によって染色された細胞の代表図である。 初期実施例５によって染色された細胞の代表図である。 初期実施例６によって染色された細胞の代表図である。

本開示は、サンプルの視覚的識別を迅速に起こさせるための、驚くべきかつ思いもよらない粒子対比剤組成物に関する。この粒子対比剤組成物は、自動フローサイトメトリーシステムにおいて特に有用であり得る。この粒子対比剤組成物は、粒子対比剤、透過剤、及び固定剤の組み合わせからなる。一実施形態では、粒子対比剤組成物は、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、サポニン、及びグルタルアルデヒドの混合物である。驚くほどに効果的な実施形態では、染色条件（staining condutions）下で、クリスタルバイオレットは約７．８μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、ニューメチレンブルーは約７３５μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、サポニンは約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、組成物は更に、約２７μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するエオシンＹを含み、グルタルアルデヒドは、０．１％以下の濃度をもたらすのに十分な量で存在する。

これらの例示の実施例は、本明細書で説明する全般的な主題を読者に紹介するために提供されるものであり、本開示の概念の範囲を制限することを意図するものではない。以下の項では、類似する数字が類似する要素を示す図面を参照して、様々な追加的特徴及び実施例について説明し、指示的な記述を用いて例示の実施形態を説明するが、例示の実施形態と同様に、本開示を制限するために用いられるべきではない。本明細書の図に含まれる要素は、正確な縮尺ではなく描かれる場合がある。

本発明の粒子対比剤組成物は、血液流体サンプルに適用されるとき、標準的な血液塗抹標本染料によって処理された血液塗抹標本と同様に、特にライト染料による血液塗抹標本染色と同様に、かかるサンプル中の細胞の染色を引き起こす。ライト染料は、血球の種類（例えばＷＢＣ）の識別を容易にする組織学的染料である。光学顕微鏡下で検査される末梢血液塗抹標本及び骨髄穿刺液の染色に主に使用される。細胞遺伝学的には、症候群及び疾患の診断を容易にするため、染色体の染色に用いられる。緩衝化ライト染料、ライト−ギムザ染料、及び緩衝化ライト−ギムザ染料として知られる関連染料がある。ライト染色プロセスはアルコール溶媒を含むため、この染色法は、生存細胞を破壊し、実質的に無傷細胞を得られない。また、より強い着色をもたらすメイグリュンワルド染色も、実施に長時間かかる。

本発明の態様及び実施形態は、血液分析などの自動化した画像系サンプル分析を行うのに使用されるとき、例えば、染料／色素組成物及び／又はこれらの組み合わせを含む特定の粒子対比剤組成物は、思いもよらない特性と効率を有するという、驚くべきかつ思いもよらない発見をベースにしている。

血液学−粒子分析システム
本明細書に開示される組成物及び方法は、様々な異なる種類の血液学的撮像システムと共に使用できる。特に、本明細書に記載の組成物及び方法を、フローセル分析などの画像系サンプル分析で使用できる。かかるフローセル分析の例として、フローサイトメトリーの従来既知の方法を挙げることができる。加えて、本明細書に記載の組成物及び方法は、以下に簡単に説明され、同時出願の、表題「Ｆｌｏｗｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」（出願番号＿＿／＿＿＿，＿＿＿、２０１４年３月１７日出願）及び「Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」（出願番号ＰＣＴ＿＿＿＿＿＿＿＿、２０１４年３月１７日出願）（この両方は参照することにより本明細書に組み込まれる）に詳細に説明される、フローセル分析システム及び方法で有利に使用できる。

図１は、サンプル流３２中の微細粒子をデジタル画像処理を利用して撮像するよう構成される、高光学分割撮像装置２４の観察ゾーン２３を通ってサンプル流体（例えば、以下に記載するサンプル混合液）を運ぶための、代表的なフローセル２２の模式図である。フローセル２２は、以下で更に詳細に説明するように、粒子対比剤組成物との接触などの処理を受け得るサンプル流体源２５と連結される。フローセル２２は、サンプル流体の粘度を超える粘度を有する澄明グリセロール溶液などの、１つ以上の粒子及び／又は細胞内オルガネラ配列液（ＰＩＯＡＬ）源２７にも連結される。

サンプル流体を、サンプル供給管２９の遠位端２８にある平坦な開口部を通して、ＰＩＯＡＬ流が実質的に確立されており、その結果、リボン状のサンプル流の上部及び下部（又は反対側）に安定かつ対称的なＰＩＯＡＬの層流が得られる点において、フローセル２２の内部に注入する。サンプル及びＰＩＯＡＬ流は、実質的に狭まっている流路に沿って、注入されたサンプル流体と共にＰＩＯＡＬを動かす精密定量ポンプによって供給され得る。ＰＩＯＡＬは、流路が狭まるゾーン２１において、サンプル流体を包み、圧縮する。したがって、ゾーン２１における流路径の減少は、サンプル流３２の形状に着目するのに寄与し得る。サンプル流体リボン３２は、ＰＩＯＡＬに包まれ、ＰＩＯＡＬに沿って狭窄ゾーン２１の下流に運ばれ、例えば、ＣＣＤを用いて画像を収集する高光学分割撮像装置２４の観察ゾーン２３の前面、ないしは別の方法で通過する。サンプル流体リボンは、ＰＩＯＡＬと共に放出口３３まで流れる。

本明細書に示されるように、狭窄ゾーン２１は、遠位径ＤＴが近位径ＰＴ未満であるように、近位径ＰＴを有する近位流路部２１ａ、及び遠位径ＤＴを有する遠位流路部２１ｂを有してよい。したがってサンプル流体は、近位部２１ａの遠位、かつ遠位部２１ｂの近位である場所で、サンプル管２９の遠位端２８を通って注入され得る。したがって、ＰＩＯＡＬ流がゾーン２１によって圧縮されると、サンプル流体はＰＩＯＡＬの包みに入ることができ、このときサンプル流体注入管は遠位出口を有し、ここを通ってサンプル流体が流れているシース液中に注入され、この遠位出口はフローセルの流路径の縮小部によって囲まれる。

対物レンズ４６を有するデジタル高光学分割撮像装置２４は、リボン状のサンプル流３２を横切る光軸に沿って方向付けられる。光センサアレイ上に焦点を合わせたデジタル画像を解像し、収集するため、対物レンズ４６とフローセル３３との間の相対距離を、モータ駆動部５４の操作によって可変させる。

粒子対比剤組成物
図２は、一実施形態による粒子対比剤組成物の調製の概略図である。ブロック２０８において、粒子対比剤２０２、透過剤２０４、及び固定剤２０６を合わせて、粒子対比剤組成物２１０を作る。一実施形態では、粒子対比剤２０２、透過剤２０４、及び固定剤２０６を同時に組み合わせる。別の実施形態では、任意の順序で、粒子対比剤２０２、透過剤２０４、及び固定剤２０６のうちの１つを、粒子対比剤２０２、透過剤２０４、及び固定剤２０６のうちの別の１つと組み合わせ、その後、粒子対比剤２０２、透過剤２０４、及び固定剤２０６のうち最後のものと組み合わせる。ブロック２０８での混合は、任意の順序で任意の好適な方法で実施してよい。

代替の実施形態では、透過剤２０４及び固定剤２０６のうち１つは、粒子対比剤組成物２１０に含まれない。更なる実施形態では、以下により詳細に記載するように、追加の材料を粒子対比剤組成物２１０の一部としてブロック２０８で組み合わせる。

粒子対比剤組成物２１０をキットの一部として提供してもよい。粒子対比剤組成物２１０を、既に調製して、又は、混合すべき１つ以上の構成成分として提供してもよい。

粒子対比剤
粒子対比剤２０２は、ライト染料に類似するものなど、可視的識別をもたらすことが可能な任意の対比剤であってよい。かかる対比剤の例として、アルシアンブルー及びアルシアンブルー８６（ＰＡＳ中性及び酸性粘液物質）；アリザリンレッドＳ；アルラレッドＡＣ（アゾ染料赤色染料＃４０）；アニリンブルー（Analine Blue）（シュウ酸により強調されるシリア）；オーラミンＯ；アズールＢ；アズールＣ；ビスマルクブラウン；ブリリアントブルーＦＣＦ（クーマシーブルー（Comassie blue））；ブリリアントクレシルブルー；ブリリアントグリーン；カルミン（Carmium）（カルミン酸及びカリウムミョウバンからなる赤色核染料）；コンゴレッド；クロラゾールブラック（Chlorozol black）Ｅ（核黒色、細胞灰色、グリコーゲンピンク色）；酢酸クレシルバイオレット；ダローレッド；エオシンブルー；エリスロシンＢ（赤色染料＃３）；エチルエオシン；ファーストグリーンＦＣＦ（緑色染料＃３）；塩基性フクシン（Fuchin basic）−（核及び鞭毛）；フルオレセイン−（マーキュロクロム）；ギムザ−末梢血液塗抹標本；ハリスヘマトキシリン−退行性核染色；インジゴカルミン（青色染料＃２）；ヤーヌスグリーンＢ（ミトコンドリア）；ジェンナー染料−（末梢血液塗抹標本）；ライトグリーンＳＦイエローイッシュ；マクニール−（４色血液染色）；マラカイトグリーン；メチルオレンジ；マルチウスイエロー；マイヤーヘマトキシリン−退行性核染色；メチルバイオレット２Ｂ；メテナミン銀−過ヨウ素酸（Peroidic acid）；メチレンバイオレット；メイグリュンワルド−血液学的染色；ＭＴＴ−ホルマザン染料；ムシカルミン−原発腫瘍染色；ニュートラルレッド；ニグロシン；ナイルブルーＡ；ヌクレアファーストレッドＣ．Ｉ．６０７６０；ナフトール（Napthal）ＡＳ；ニトロブルーテトラゾリウム−ファーストホルマザン染料；オレンジＧ；オレンジＩＩ；オルセイン；パパニコロー染料ＥＡＳ−ブリリアント細胞質染色；パラローズアニリン；パラローズアナリン（Pararosanaline）；過ヨウ素酸シッフ−（ＰＡＳ、特定の炭水化物染色）；フロキシン（Phyloxine）Ｂ；プロタルゴールＳ；ピロニンＢ；ピロニンＹ；レスズリン；ロマノフスキー−ギムザ；ローズベンガル；サフラニンＯ；スダンブラックＢ；スダンＩＩＩ−（α−ナフトール（napthol）と共に骨髄顆粒を染色する）；スダンＩＶ−トリグリセリドを染色する；タルトラジン−（アゾ染料黄色＃５）；チオニン−メタクロマチンを染色する；トリフェニルテトラゾリウム；ＴＴＣ−ホルマザン赤色染料；トルイジンブルーＯ；ライト染料−（従来の血液塗抹標本用固定剤、緩衝剤、及び染料）；並びにライトギムザが挙げられる。

通常とは異なる取り組みと実験から、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、サフラニンＯ、エオシンＹ及びメチルグリーンのうち少なくとも１つを含む粒子対比剤２０２の使用によって、本明細書に更に詳細に説明するように、粒子対比剤組成物２１０において驚くほどに効果的な結果が得られることが判明している。粒子対比剤２０２を、画像を利用した分類及び下位分類のため、生存細胞及び／又は実質的に無傷細胞を染色するのに有効な量で加える。粒子対比剤２０２は、上記粒子対比剤の２つ以上の任意の組み合わせであってよい。粒子対比剤２０２を選択し、生体及び／又は実質的に無傷細胞の「ライト様」染色像を効果的に得ることができる。

一実施形態では、粒子対比剤２０２はクリスタルバイオレットを含む。クリスタルバイオレットは、染色条件下で約１μＭ〜約１００μＭに達するのに十分な量で存在してよい。本明細書で使用されるとき、用語「染色条件下で」は、構成成分がサンプルと混合されるときを意味する。クリスタルバイオレットは、染色条件下で約６μＭ〜約１０μＭに達するのに十分な量で存在してよい。クリスタルバイオレットは、染色条件下で約７．８μＭに達するのに十分な量で存在してよい。クリスタルバイオレットは、染色条件下でほぼ約７．８μＭ付近に達するのに十分な量で存在してよい。クリスタルバイオレットは、少なくとも９０％の純度まで精製され得る。クリスタルバイオレットは、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９８％の純度まで精製され得る。クリスタルバイオレットは、少なくとも９９％の純度まで精製され得る。粒子対比剤２０２は、クリスタルバイオレット単独であってもよく、又は１つ以上の追加の粒子対比剤と組み合わせたクリスタルバイオレットであってもよい。

一実施形態では、粒子対比剤２０２はニューメチレンブルーを含む。ニューメチレンブルーは、染色条件下で約７０μＭ〜約２．４ｍＭに達するのに十分な量で存在してよい。ニューメチレンブルーは、染色条件下で約５００μＭ〜約９５０μＭに達するのに十分な量で存在してよい。ニューメチレンブルーは、染色条件下で約７３５μＭに達するのに十分な量で存在してよい。ニューメチレンブルーは、染色条件下でほぼ約７３５μＭ付近に達するのに十分な量で存在してよい。ニューメチレンブルーは、少なくとも７０％の純度まで精製され得る。ニューメチレンブルーは、少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％，８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製され得る。ニューメチレンブルーは、少なくとも１００％の純度まで精製され得る。

いくつかの実施形態では、粒子対比剤２０２がクリスタルバイオレットとニューメチレンブルーの両方を含むとき、驚くほどに効果的な結果が得られる。クリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比は、約１：１〜約１：５００（モル／モル）であってよい。クリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比は、約１：５０〜約１：１６０（モル／モル）であってよい。クリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比は、約１：９０〜約１：１１０（モル／モル）であってよい。

一実施形態では、粒子対比剤２０２はエオシンＹを含む。エオシンＹは、染色条件下で約３μＭ〜約３００μＭに達するのに十分な量で存在してよい。エオシンＹは、染色条件下で約１０μＭ〜約５０μＭに達するのに十分な量で存在してよい。エオシンＹは、染色条件下で約２７μＭに達するのに十分な量で存在してよい。エオシンＹは、染色条件下でほぼ約２７μＭ付近に達するのに十分な量で存在してよい。エオシンＹは、少なくとも８０％の純度まで精製され得る。エオシンＹは、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％，８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製され得る。エオシンＹは、少なくとも１００％の純度まで精製され得る。

いくつかの実施形態では、粒子対比剤２０２がクリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、及びエオシンＹの組み合わせであって、それぞれが上記濃度及び純度の任意の組み合わせを有するとき、驚くほどに効果的な結果が得られる。いくつかの実施形態では、粒子対比剤２０２は、具体的には、約７．８μＭに達するのに十分な量で存在するクリスタルバイオレット、約７３５μＭに達するのに十分な量で存在するニューメチレンブルー、及び約２７μＭに達するのに十分な量で存在するエオシンＹである。いくつかの実施形態では、粒子対比剤２０２は、具体的には、約７．８μＭに達するのに十分な量で存在する少なくとも９９％の純度のクリスタルバイオレット、約７３５μＭに達するのに十分な量で存在する少なくとも９９％の純度のニューメチレンブルー、及び約２７μＭに達するのに十分な量で存在する少なくとも９９％の純度のエオシンＹである。

一実施形態では、粒子対比剤２０２はサフラニンＯを含む。サフラニンＯは、染色条件下で約１μＭ〜約１００μＭに達するのに十分な量で存在してよい。サフラニンＯは、染色条件下で約３μＭ〜約３０μＭに達するのに十分な量で存在してよい。サフラニンＯは、染色条件下で約９μＭに達するのに十分な量で存在してよい。サフラニンＯは、染色条件下でほぼ約９μＭ付近に達するのに十分な量で存在してよい。サフラニンＯは、少なくとも８０％の純度まで精製され得る。サフラニンＯは、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％，８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製され得る。サフラニンＯは、少なくとも１００％の純度まで精製され得る。

一実施形態では、粒子対比剤２０２はメチルグリーンを含む。メチルグリーンは、染色条件下で約０．１ｇ／Ｌに達するのに十分な量で存在してよい。メチルグリーンは、染色条件下でほぼ約０．１ｇ／Ｌ付近に達するのに十分な量で存在してよい。メチルグリーンは、少なくとも８０％の純度まで精製され得る。メチルグリーンは、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％，８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の純度まで精製され得る。メチルグリーンは、少なくとも１００％の純度まで精製され得る。

いくつかの実施形態では、粒子対比剤２０２は、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、サフラニンＯ、エオシンＹ及びメチルグリーンのうち１つ以上を、例えば、撮像のために呈示されるとき、サンプル中粒子の細胞内含有物質の特徴を強調することによって、粒子中に視覚的識別をもたらすのに有効な量で含む。粒子対比剤２０２は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球、並びに網赤血球、有核赤血球、血小板、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、又は細胞片の細胞内構造を、強調する及び／又は染色するのに十分な量で存在してよい。視覚化可能な識別、つまり視覚的な識別には、任意の光源（例えば、ＵＶ、可視光、ＩＲ）を用いて視覚化可能、ないしは別の方法で検出可能にできる任意の粒子又は粒子内の特徴部を含んでよい。

粒子対比剤組成物２１０が２つ以上の粒子対比剤２０２を含む実施形態では、粒子対比剤２０２のそれぞれの量は、粒子分類及び下位分類の視覚的識別をもたらすのに、粒子対比剤２０２が単独で、競争的に、及び／又は増強的に作用するかによって、適切に調整してよい。

透過剤
いくつかの実施形態では、透過剤２０４は界面活性剤を含んでよい。いくつかの実施形態では、透過剤２０４はサポニンを含んでよい。代替の実施形態では、透過剤２０４は、四級アンモニウム塩、非イオン性界面活性剤、及び双極性界面活性剤のうち少なくとも１つを含んでよい。透過剤は、細胞内含有物質への粒子対比剤２０２の到達性を改善するため、細胞の透過性を変えることができる。透過剤を選択し、迅速一段階染色法を可能にするのに十分な量で含めてよい。

非イオン性界面活性剤の例として、（１）ポリエチレングリコール又はポリオキシエチレンエタノールにエーテル結合している直鎖脂肪族疎水性物質を含むポリオキシエチレンアルキル又はアリールエーテル（ポリエトキシレート）、例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５；（２）ポリエチレングリコールにエーテル結合している分枝鎖脂肪族／芳香族（例えば、オクチルフェノール）疎水性物質、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（登録商標）−１００；（３）ポリエチレングリコールにエーテル結合している直鎖脂肪族／芳香族（例えば、ｎ−ノニルフェノール）疎水性物質、例えば、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）Ｃ０８９７；及び（４）ポリエチレングリコールにエーテル結合している直鎖脂肪族（例えば、カルボン酸）疎水性物質、例えば、Ｍｙｒｊ（登録商標）５３、並びにその他のものを挙げてよい。非イオン性ポリオキシエチレンアルキル又はアリールエーテル（ポリエトキシレート）界面活性剤の例として、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３０）；ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３５）；ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５２）；ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５８）；ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７２）；ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７６）；ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）；ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９２）；ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９６）；ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９８）；ポリオキシエチレン（２１）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７２１）；ポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７００）；及びその他のものを挙げてよい。非イオン性界面活性剤の更なる例として、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（登録商標）−１００（非還元型又は還元型）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４（非還元型又は還元型）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（登録商標）−１６５、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ（登録商標）−３０５（非還元型又は還元型）、及びその他のものを挙げてよい。

一実施形態では、透過剤２０４は、染色条件下で約０．１０ｇ／Ｌ〜約０．２０ｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量でＢｒｉｊ（登録商標）３５を含んでよい。Ｂｒｉｊ（登録商標）３５は、染色条件下で約０．１０ｇ／Ｌ〜約０．１６ｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。Ｂｒｉｊ（登録商標）３５は、約．０１２ｇ／Ｌ〜約０．１４ｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で存在してよい。

双極性界面活性剤の例として、ＴＤＡＰＳ（テトラデシルジメチルアンモニオプロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、約１２〜約１６個の炭素原子を有するアルキルＮ，Ｎ−ジメチルＮ−オキシド、ラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＯ）、ＤＤＡＰＳ（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、及びその他のものを挙げてよい。

いくつかの実施形態では、透過剤２０４は、赤血球の溶解に十分な剤を含む。いくつかの実施形態では、透過剤２０４は、網赤血球又は有核赤血球以外の赤血球の溶解に十分な剤を含む。いくつかの実施形態では、透過剤２０４は、赤血球の溶解に十分な剤を含むが、白血球、網赤血球、有核赤血球、血小板、及びその他の細胞は実質的に無傷のまま残る。いくつかの実施形態では、透過剤２０４は、白血球、網赤血球、有核赤血球、及び／又は血小板の群及び／又は核膜を、より透過性及び／又は多孔性にして、粒子対比剤２０２による到達を促進する。

いくつかの実施形態では、透過剤２０４は、サンプル中の細胞に粒子対比剤２０２が入れるようにするのに必要な孔、つまり開口部を素早く作ることができるように選択される。

通常とは異なる取り組みと実験から、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＣＤＳ）（Ｆｔ．Ｌａｕｄｅｒｄａｌｅ，Ｆｌｏｒｉｄａ）から入手可能な５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃを含む透過剤２０４の使用によって、粒子対比剤組成物２１０のいくつかの実施形態において驚くほどに効果的な結果が得られることが判明している。５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃはサポニンを含む。５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃは概して、本明細書に参照することによって組み込まれる米国特許第６，６３２，６７６号に説明されている。

通常とは異なる取り組みと実験から、染色条件下で約１０ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で存在するサポニンを含む透過剤２０４の使用によって、粒子対比剤組成物２１０のいくつかの実施形態において驚くほどに効果的な結果が得られることが判明している。いくつかの実施形態では、サポニンは、約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で存在する。いくつかの実施形態では、サポニンは、四級アンモニウムで置換したサポニンエーテルであってよい。

固定剤
いくつかの実施形態では、染色及び撮像中に白血球が確実に分解しないように、固定剤２０６を選択してよい。いくつかの実施形態では、固定剤２０６は、確実に他の細胞及び細胞構造を分解しないようにしてよい。固定剤の例として、グルタルアルデヒド（glutaraldyde）；ホルムアルデヒド；架橋剤；等張生理食塩水中ピクリン酸アンモニア（例えば、メチレンブルー染色向け）；エチルアルコール；メタノール（例えば、室温、−２０℃、又は−７０℃で）；ハイデンハインＳｕｓａ−ＨｇＣｌ_２、ＮａＣｌ、トリクロロ酢酸、ホルマリン；ブアン液−ピクリン酸、ホルマリン、酢酸；Ｄｕｂｏｓｅｑ−Ｂｒａｚｉｌ−８０％ ＥｔＯＨを加えたブアン；カルノア液−ＥｔＯＨ、クロロホルム、酢酸；ツェンカー液−ＨｇＣ_ｌ２、Ｋ_２ＣｒＯ_７、ＮａＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ；酢酸カーミン；Ｇａｔｅｎｓｂｙ液−クロム酸、四酸化オスミウム、ＮａＣｌ；Ｂａｋｅｒ液−ホルマリン、ＣａＣｌ_２；Ｓｍｉｔｈ液−Ｋ_２Ｃｒ_２Ｏ_７、ホルマリン、酢酸；１％メチルグリーン、１％酢酸；フェノール、ホルマリン、グリセロール、ゲンチアナバイオレット（Genetian violet）；シャウディン液−ＨｇＣｌ_２、ＥｔＯＨ、酢酸；シャンピー液−クロム酸、Ｋ_２ＣｒＯ_７、ＯｓＯ_４；Ｆｌｅｍｉｎｇ液−クロム酸（Cromic acid）、ＯｓＯ４、酢酸；ホルモル−銀−ホルムアルデヒド、ＡｇＮＯ_３；Ｓｔｒｅｃｋ組織固定液−ブロノポール、ジアゾリジニル尿素、ＺｎＳＯ_４ ^・７Ｈ_２Ｏ、クエン酸ナトリウム；ＰＢＳ中１％イミダゾリジニル（imidazolidnyl）尿素；グリオキサール；Ｇｌｙｏｆｉｘ、Ｐｒｅｆｅｒ、Ｓａｆｅｆｉｘ、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ；グライダント−ヒダントイン；ジメチロール尿素；ヒドロキシメチルグリシネートナトリウム；Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ液；塩化第二水銀（Mecuric chloride）（Ｂ−５）；Ｈｏｌｌａｎｄｅ液；及びその他のものを挙げてよい。加えて、好適な代表的な固定剤は、任意の以下のものを単独で又は組み合わせて含んでよい。

いくつかの実施形態では、固定剤２０６は、酸化剤、水銀、ピクリン酸、ｈｅｐｅｓ−ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｂｕｆｆｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ（ＨＯＰＥ）固定液、又は水溶性保存剤であってよい。酸化剤の例として、重クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウム、及びその他のものが挙げられる。水銀の例として、Ｂ−５、ツェンカー固定液（Zernker's fixative）、及びその他のものが挙げられる。水溶性保存剤の例として、メチルパラベン、プロピルパラベン、ジメチロール尿素、２−ピリジンチオール−１−オキシド、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、及びその他のものが挙げられる。

通常とは異なる取り組みと実験から、グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドのうち少なくとも１つを含む固定剤２０６の使用によって、粒子対比剤組成物２１０のいくつかの実施形態において驚くほどに効果的な結果が得られることが判明している。

いくつかの実施形態では、０．１重量％以下のグルタルアルデヒドを含む固定剤２０６の使用によって、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。

追加の構成成分
いくつかの実施形態では、ブロック２０８において、任意の追加の構成成分２１２を粒子対比剤組成物２１０内に任意に混合できる。追加の構成成分２１２の例として、緩衝成分、粘度調整剤、抗菌剤、浸透圧調整剤、イオン強度調整剤、界面活性剤、キレート剤、及びその他のものが挙げてよい。いくつかの実施形態では、粒子対比剤組成物２１０がリン酸緩衝生理食塩水を含むとき、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。

代表的な粘度調整剤として、天然ヒドロコロイド（及び誘導体）、例えばカラギーナン、イナゴマメゴム、グアーガム、及びゼラチン；糖（及び誘導体）、例えばデキストロース、フルクトース；ポリデキストロース；デキストラン；ポリデキストラン；糖類；並びに多糖類；半合成ヒドロコロイド（及び誘導体）、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース；合成ヒドロコロイド（及び誘導体）、例えばＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）；並びに粘土（及び誘導体）、例えばベントナイト及びＶｅｅｇｕｍ（登録商標）が挙げられる。

迅速一段階染色プロセス
図３は、一実施形態による迅速一段階染色プロセス３００のフローチャートである。迅速一段階染色プロセス３００はいくつかの下位工程を含むことができるが、用語「一段階」は、染色手順中に、サンプルを複数の異なる溶液に入れる必要がないことを区別するために用いられる。図２を参照して上述したように、粒子対比剤組成物２１０はブロック３０２で調製される。所望により、いくつかの実施形態では、任意の粒子対比剤２０２などの構成成分を、ブロック３０６で精製してよい。粒子対比剤２０２を精製することで、サンプルと接すると形成される沈殿物のレベルを抑えることができ、それによって、バックグラウンドを低下し、画像又はスライド（つまり、手作業で調製された顕微鏡用試料）を更に確認する必要を少なくして、画像系血液サンプル分析の結果を改善する。

ブロック３０８において、粒子対比剤組成物２１０をサンプルと組み合わせる。粒子対比剤組成物２１０は、任意の好適な方法で、例えば互いに混合して、サンプルと組み合わせることができる。ブロック３０８での組み合わせは、サンプルを特定量の粒子対比剤組成物２１０で希釈することを含んでよい。サンプルは、粒子対比剤組成物２１０で希釈されてよい。希釈量は、画像系解析中、フレーム当たり最適細胞数をもたらすように選択されてよい。希釈量は、画像系解析中、フレーム当たり最適白血球数をもたらすように選択されてよい。希釈量は、任意のその他画像系ではない解析において、最適量をもたらすように別の方法で選択されてよい。

通常とは異なる取り組みと実験から、粒子対比剤組成物２１０対サンプルの比を約２：１〜約２０：１で使用することで、粒子対比剤組成物２１０のいくつかの実施形態において驚くほどに効果的な結果が得られることが判明している。粒子対比剤組成物２１０対サンプルの比は、約３：１〜約１０：１であってよい。粒子対比剤組成物２１０対サンプルの比は、約３：１〜約４：１であってよい。粒子対比剤組成物２１０対サンプルの比は、約３：１又は約４：１であってよい。いくつかの実施形態では、ほぼ３：１付近又はほぼ４：１付近の粒子対比剤組成物２１０対サンプルの比を用いて、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。

４０ｍＬの５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ及び５０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水を含む粒子対比剤を、粒子対比剤組成物２１０対サンプルの希釈率を１０：１で用いることで、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。４０ｍＬの５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、追加のサポニン、及び４０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水を含む粒子対比剤を、粒子対比剤組成物２１０対サンプルの希釈率を５：１で用いることで、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。４０ｍＬの５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ、追加のサポニン、及び３６ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水を含む粒子対比剤を、粒子対比剤組成物２１０対サンプルの希釈率を４：１で用いることで、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。

いくつかの実施形態では、サンプルを、インキュベートに関して以下で記載するものうち任意の温度など、高温で粒子対比剤組成物２１０と組み合わせる。

本明細書で使用されるとき、組み合わせたサンプル及び粒子対比剤組成物２１０を、サンプル混合液と称する。

ブロック３１０において、サンプル混合液を特定の時間、特定の温度でインキュベートする。インキュベーションによって、細胞又はその内部構造の透過性を増すことができ、粒子対比剤２０２が細胞又は細胞構造により浸潤することを可能にする。インキュベーション時間及び温度は、粒子対比剤組成物２１０が適切にサンプルを透過し、固定し、染色できるように選択されてよい。インキュベーション時間及び温度は、白血球、血小板、及び有核赤血球を実質的に無傷に保ったまま、赤血球を確実に溶解するように選択されてよい。

通常とは異なる取り組みと実験から、約３７℃〜約６０℃の温度で約１〜６０秒間サンプル混合液をインキュベートすることで、粒子対比剤組成物２１０のいくつかの実施形態において驚くほどに効果的な結果が得られることが判明している。サンプル混合液を、約４６℃〜約４９℃の温度に加熱してよい。サンプル混合液を、４０〜５０秒間インキュベートしてよい。サンプル混合液を、最大１時間までインキュベートしてよい。いくつかの実施形態では、サンプル混合液を約４８℃で約４５秒間インキュベートすることによって、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。いくつかの実施形態では、サンプル混合液を約４７℃で約４５秒間インキュベートすることによって、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。

いくつかの実施形態では、ブロック３０８における混合と、ブロック３１０におけるインキュベーションは、サンプル混合液の撮像装置中での処理、並びに撮像装置のラインの洗い流し、及び／又は洗浄にかかるのとおよそ同じ時間、又はそれより短い時間で完了する。このようにして、第２のサンプル混合液を組み合わせ、インキュベートしている間に、第１のサンプル混合液を撮像できる。第１のサンプル混合液が撮像され、撮像装置が洗浄されると、直ちに第２のサンプル混合液を撮像できる。

代替の実施形態では、ブロック３０８における混合と、ブロック３１０におけるインキュベーションは、サンプル混合液の撮像装置中での処理、並びに撮像装置のラインの洗い流し、及び／又は洗浄にかかる時間の２倍未満で完了する。このようにして、第１のサンプル混合液が撮像されている間に、第２のサンプル混合液を撮像準備ができた状態にすることができ、第３のサンプル混合液及び第４のサンプル混合液を混合及びインキュベーションの処理中とすることができる。第１のサンプル混合液が撮像され、撮像装置が洗浄されると、直ちに第２のサンプル混合液を撮像できる。第３のサンプル混合液は混合及びインキュベーションを終了している状態とすることができ、第４のサンプル混合液は依然として混合及びインキュベーション中とすることができる。第２のサンプル混合液が撮像され、撮像装置が洗浄されると、直ちに第３のサンプル混合液を撮像でき、その間、第４のサンプル混合液の混合及びインキュベーションが終了し始め、第５のサンプル混合液は混合及びインキュベーションし始める。このプロセスをいつまでも継続し、サンプル混合液を連続的に撮像できる。

通常とは異なる取り組みと実験から、粒子対比剤組成物２１０の特定の実施形態、粒子対比剤組成物２１０をサンプルと組み合わせる特定の方法、及びサンプル混合液をインキュベートする特定の方法の組み合わせによって、驚くほどに効果的な結果を得られることが判明している。

具体的には、染色条件下で約７．８μＭである純度９０％以上のクリスタルバイオレットと、染色条件下で約７３５μＭである純度７０％以上のニューメチレンブルーと、染色条件下で約２７μＭである純度８０％以上のエオシンＹと、染色条件下で約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌである前処理済みサポニンと、染色条件下で約０．１％以下であるグルタルアルデヒドと、を含む、粒子対比剤組成物２１０を用い、粒子対比剤２１０をサンプルと、粒子対比剤２１０対サンプルの比が約３：１〜約４：１で組み合わせ、得られるサンプル混合液を約４８℃で約４５秒間インキュベートすることによって、驚くほどに効果的な結果を得ることができる。

特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、非アルコール系溶媒システム中の染料を用いる自動視覚的分析器によって、生体細胞及び／又は実質的に無傷細胞の「ライト様」染色像を効率よく取得することを可能にする。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、様々な細胞成分、核分葉、及び顆粒構造がはっきりと識別できるような、サンプルの迅速染色を可能にする。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、超生体染色に好適である。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、粒子分類及び下位分類を視覚的に識別する。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、血清、能脊髄液、胸膜液、関節液、精液、腹膜液、羊水、洗浄液、骨髄穿刺液、滲出液（effusions）、滲出液（exudates）、又は血液サンプル中の粒子の細胞内含有物質の特徴を強調するのに効果的である。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、血小板、網赤血球、有核赤血球、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、円柱、細菌、上皮、及び／又は寄生体の染色に効果的である。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、例えば、細胞中の一次及び二次顆粒を分別染色することによって、粒子分類及び下位分類の視覚的識別、例えば、未熟な顆粒球の下位分類、及び分別染色による成熟度判定、つまり一次及び二次顆粒の強調の補助に効果的である。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、赤血球、網赤血球、有核赤血球、及び血小板の計数及び特性決定、並びに、白血球分画及び白血球特性決定及び分析に関する、視覚的識別をもたらすのに効果的である。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、生体細胞及び／又は生存細胞及び／又は実質的に無傷のままの構造を有する細胞における、視覚的識別をもたらすのに効果的である。特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球、並びに網赤血球、有核赤血球、血小板、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、又は細胞片の細胞内構造の染色に効果的である。

本明細書に記載される特定の効果的な粒子対比剤組成物２１０及び染色法によって可能となる迅速染色は、手動若しくは半自動撮像及び／又は分析法と共に使用できる。

通常とは異なる取り組みと実験から、非アルコール系溶媒システム中に粒子対比剤を含む粒子対比剤組成物２１０の特定の実施形態を用いて、発明者らの知見において初めて、生体細胞及び／又は実質的に無傷細胞の「ライト様」染色像をもたらし得、様々な細胞成分、核分葉、及び顆粒構造を明らかにでき、これら粒子及び／又は細胞内特徴部を視覚的に区別可能な、驚くほどに効果的な結果を得られることが判明している。

通常とは異なる取り組みと実験から、表１に記載されるように構成される粒子対比剤組成物２１０を用いるとき、作用染色試薬が４０ｍＬのニューメチルブルー及び５ｍＬのクリスタルバイオレットを混合することによって作製される場合、驚くほどに効果的な結果を得られることが判明している。

図４は、表１に示す粒子対比剤組成物２１０によって、上記迅速一段階染色法を用いて染色したサンプルから選択した、白血球の代表図である。白血球は無傷であり、ライト染料の染色特性を示す。様々な種類の白血球（例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球など）が肉眼で識別可能である。

いくつかの実施形態における、本開示の粒子対比剤組成物によって染色された細胞の特徴を表２に示す。

特定の実施形態では、安定性、保存容易性、廃棄性、及び／又は制限された毒性のために、染料／色素組成物は処方される。

図５は、一実施形態による粒子対比剤組成物２１０を用いて染色したサンプルから選択した、白血球の代表図であり、用手ウェットマウント撮像及び自動フロー撮像によって撮像された細胞を含む。

初期実験
以下の実施例を参照して説明するように、多くの染色組成物及び方法を試験し、変更して、先に開示された実施形態を得た。

初期実施例１では、二段階染色法があり、ここではサンプル及び粒子対比剤組成物の初期実施形態を混合し、４０秒間４７．５℃でインキュベートし、その後反応停止試薬をサンプル混合液に加えた。粒子対比剤組成物は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＨ Ｓｅｒｉｅｓ Ｄｉｌｕｔｅｎｔと、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｙｓｅ Ｓ ＩＩＩ ｄｉｆｆ Ｌｙｔｉｃ Ｒｅａｇｅｎｔと、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＨ Ｓｅｒｉｅｓ Ｐａｋ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔと、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＨ Ｓｅｒｉｅｓ ＲＥＴＩＣ ＰＡＫ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔと、を含めた。結果を図６に示す。

実施例１の後の初期実施例２では、実施例１の二段階染色法を一段階染色法に置き換えた。実施例１の結果と比較して、改善された好塩基球の結果が図７において見られる。

初期実施例３では、グルタルアルデヒドを含まない粒子対比剤組成物によって、フローセル中の剪断力によって破壊され得る弱化された白血球が得られた。損傷した膜を示している実施例３の結果の像は、図８に示される。

実施例３の後の初期実施例４では、グルタルアルデヒドを粒子対比剤組成物に添加した。実施例４では、白血球細胞膜はより無傷であったが、核膜は依然として損傷していた。ＰＩＯＡＬを調整してグリセロール含量を減らした後は、図９に示されるように、撮像中の、白血球の形態の大部分は変わらなかった。

ニューメチレンブルー及びクリスタルバイオレットである粒子対比剤組成物を用いた、２種染料染色による初期実施例では、好酸球以外のほとんどの細胞の種類が良好に識別でき、図１０に示されるように、やや一貫性がなく、必ずしも好中球と容易に区別できなかった。続く実施例５及び６では、第３の粒子対比剤を粒子対比剤組成物に添加した。

実施例５では、メチルグリーンを粒子対比剤組成物に添加した。メチルグリーンは、好酸球のより良好な染色を促進したが、細胞核は所望される紫ではなく、青く染色された。図１１は、実施例５の、好中球が青く染色された核を有するが、顆粒の詳細が消えた像を示す。

実施例６では、粒子対比剤組成物中の第３の粒子対比剤として、メチルグリーンの代わりにエオシンＹを使用した。図１２に示されるように、エオシンＹは、核の紫の染色と、わずかなオレンジ光沢色と一致する顆粒の染色を保った。

上記実験及び追加実験により、開示される実施形態及び特許請求される実施形態が優先的な結果をもたらすことが判定されている。

本開示で論じた全ての特許、特許公開、特許出願、雑誌論文、書籍、技術文献などは、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用されるいかなる見出しは、整理目的のみのものであり、決して本開示又は請求項を制限するものと解釈されない。

図に描写する又は上述する構成要素の異なる配置が、示していない又は記載していない構成要素及び工程と同様に可能である。同様に、いくつかの特徴及び部分的組み合わせが有益であり、他の特徴及び部分的組み合わせへの参照なしに用いられてもよい。本発明の実施形態は制限的でなく例示的な目的のために記載されており、代替の実施形態が本特許の読者に明らかになるだろう。特定の場合では、方法工程又は操作が異なる順序で実施、つまり実行されてよく、あるいは、操作を追加、削除、又は変更してもよい。本発明の特定の態様では、ある要素若しくは構造を提供するため、又は、ある機能を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素と置き換えてよく、複数の構成要素を単一の構成要素と置き換えてよいことが理解され得る。かかる置換が本発明の特定の実施形態の実行に有効でない場合を除き、かかる置換は本発明の範囲内であると見なされる。したがって、本発明は上記又は図に描写の実施形態に制限されず、下記の請求項の範囲から逸脱することなく様々な実施形態及び修正が生じ得る。

Claims (13)

1. クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、メチルグリーン、エオシンＹ、及びサフラニンＯからなる群から選択される少なくとも２種の粒子対比剤と、
   界面活性剤、サポニン、四級アンモニウム塩、非イオン性界面活性剤、洗剤、及び双極性界面活性剤からなる群から選択される透過剤であって、染色条件下で約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量で存在する、透過剤と、
   グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドからなる群から選択される固定剤と、を含む、自動粒子分析システム中で撮像される血液流体サンプルを染色するための粒子対比剤組成物。
2. 前記透過剤がサポニンであり、
   前記固定剤が、染色条件下で０．１％以下の濃度をもたらすのに十分な量で存在するグルタルアルデヒドである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記少なくとも１種の粒子対比剤が、クリスタルバイオレットと、ニューメチレンブルーと、エオシンＹと、を含み、
   前記クリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比が、染色条件下で約１：９０〜約１：１１０であり、
   前記エオシンＹが、染色条件下で約３μＭ〜約３００μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在する、請求項２に記載の組成物。
4. 前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約６μＭ〜約１０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、
   前記ニューメチレンブルーが、染色条件下で約７０μＭ〜約２．４ｍＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、
   前記エオシンＹが、染色条件下で約１０μＭ〜約５０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在する、請求項３に記載の組成物。
5. 前記クリスタルバイオレットが、およそ純度９０％以上であり、
   前記ニューメチレンブルーが、およそ純度７０％以上であり、
   前記エオシンＹが、およそ純度８０％以上である、請求項４に記載の組成物。
6. 前記クリスタルバイオレットが、染色条件下で約７．８μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、
   前記ニューメチレンブルーが、染色条件下で約７３５μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在し、
   前記エオシンＹが、染色条件下で約２７μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在する、請求項５に記載の組成物。
7. 緩衝成分を追加的に含む、請求項４に記載の組成物。
8. 血液流体サンプルを粒子対比剤組成物と混合して、サンプル混合液を得る工程と、
   前記サンプル混合液を、約３７℃〜約６０℃の温度で９０秒未満インキュベートする工程と、を含む、自動粒子分析システムを用いて撮像される血液流体サンプルの粒子を処理する方法であって、
   前記粒子対比剤組成物は、
   クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルー、メチルグリーン、エオシンＹ、及びサフラニンＯからなる群から選択される少なくとも２種の粒子対比剤と、
   界面活性剤、サポニン、四級アンモニウム塩、非イオン性界面活性剤、洗剤、及び双極性界面活性剤からなる群から選択される透過剤と、
   グルタルアルデヒド及びホルムアルデヒドからなる群から選択される固定剤と、を含む、方法。
9. 前記粒子対比剤組成物が、
   染色条件下で約１：１〜約１：５００のクリスタルバイオレット対ニューメチレンブルーの比をもたらすのに十分な量の、クリスタルバイオレット、ニューメチレンブルーと、
   染色条件下で約５０ｍｇ／Ｌ〜約７５０ｍｇ／Ｌの濃度をもたらすのに十分な量のサポニンと、
   染色条件下で０．１％以下の濃度をもたらすのに十分な量のグルタルアルデヒドと、を含み、
   前記サンプル混合液をインキュベートする工程が、前記サンプル混合液を６０秒未満加熱する工程を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記粒子対比剤組成物が、
    染色条件下で約６μＭ〜約１０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットと、
    染色条件下で約７０μＭ〜約２．４ｍＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するニューメチレンブルーと、
    染色条件下で約１０μＭ〜約５０μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するエオシンＹと、を含み、
    前記血液流体サンプルを粒子対比剤組成物と混合する工程が、約１：２〜約１：１０の血液流体サンプル対粒子対比剤組成物の比まで混合する工程を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記サンプル混合液をインキュベートする工程が、前記サンプル混合液を４６℃〜約４９℃まで４０〜５０秒間加熱する工程を含む、請求項９に記載の方法。
12. 前記クリスタルバイオレットが、およそ純度９０％以上であり、
    前記ニューメチレンブルーが、およそ純度７０％以上であり、
    前記エオシンＹが、およそ純度８０％以上である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記粒子対比剤組成物が、
    染色条件下で約７．８μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するクリスタルバイオレットと、
    染色条件下で約７３５μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するニューメチレンブルーと、
    染色条件下で約２７μＭの濃度をもたらすのに十分な量で存在するエオシンＹと、
    緩衝成分と、を含み、
    前記血液流体サンプルを粒子対比剤組成物と混合する工程が、約１：３〜約１：４の血液流体サンプル対粒子対比剤組成物の比まで混合する工程を含み、
    前記サンプル混合液をインキュベートする工程が、前記サンプル混合液を約４７℃まで約４５秒間加熱する工程を含む、請求項１１に記載の方法。