JP5707482B2 - 二重特異性二価抗ｖｅｇｆ／抗ａｎｇ−２抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ-Ａ）及びヒトアンジオポエチン-２（ＡＮＧ-２）に対する二重特異性二価抗体、その生産方法、前記抗体を含有する薬学的組成物、及びその使用に関する。

血管新生は、固形腫瘍、眼内新生血管症候群、例えば増殖性網膜症又は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、関節リウマチ、及び乾癬を含む様々な疾患の病変形成に関与する(Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; and Garner, A., Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710)。固形腫瘍の場合、新生血管は、腫瘍細胞が正常細胞と比較して増殖優位性及び増殖自立性を獲得することを可能にする。このように、腫瘍切片における微小血管の密度と、乳癌並びに幾つかの他の腫瘍における患者の生存度との間に相関が観察されている(Weidner, N., et al., N Engl J Med. 324 (1991) 1-8; Horak, E.R., et al., Lancet 340 (1992) 1120-1124; and Macchiarini, P., et al., Lancet 340 (1992) 145-146)。

ＶＥＧＦ及び抗ＶＥＧＦ抗体
ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ-Ａ）（配列番号：１０５）が、例えばLeung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12 and Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24に記載されている。VEGFは、正常及び異常血管新生の制御、及び腫瘍及び眼内疾患に伴う新生血管に関与する(Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; and Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039)。ＶＥＧＦは、幾つかの供給源から単離されたホモ二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞に対し特異性の高いマイトジェン活性を示す。ＶＥＧＦは、胚性脈管形成の間の新しい血管の形成において、また成人期の間の血管新生において重要な調整機能を有する(Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439-442; reviewed in Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25。ＶＥＧＦが果たす役割の重要性が、一つのＶＥＧＦ対立遺伝子の不活性化が脈管構造の発生不全により胚性致死をもたらすことを示す研究において実証された(Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439-442。更に、ＶＥＧＦは単球対し強いケモアトラクタント活性を有し、内皮細胞においてプラスミノーゲンアクチベーター及びプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターを誘導し得、また微小血管透過性も誘導しうる。後者の活性により、それは時に血管透過性因子（ＶＰＦ）とも呼ばれる。ＶＥＧＦの単離及び特性が総説されている；Ferrara, N., et al., J. Cellular Biochem., 47 (1991) 211-218 and Connolly, D.T., J. Cellular Biochem., 47 (1991) 219-223を参照のこと。一つのＶＥＧＦ遺伝子の選択的ｍＲＮＡスプライシングは、ＶＥＧＦの５つのアイソフォームを生じる。

抗ＶＥＧＦ中和抗体は、マウスにおいて様々なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制する(Kim, K.J., et al., Nature 362 (1993) 841-844; Warren, S.R., et al., J. Clin. Invest. 95 (1995) 1789-1797; Borgstrom, P., et al., Cancer Res. 56 (1996) 4032-4039; and Melnyk, O., et al., Cancer Res. 56 (1996) 921-924)。ＷＯ９４／１０２０２、ＷＯ９８／４５３３２、ＷＯ２００５／００９００及びＷＯ００／３５９５６はＶＥＧＦに対する抗体に言及する。ヒト化モノクローナル抗体ベバシズマブ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で市販されている）は、腫瘍治療において使用される抗ＶＥＧＦ抗体である（ＷＯ９８／４５３３１）。

ラニビズマブ（商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））は、ベバシズマブ（アバスチン）と同じ親マウス抗体に由来するモノクローナル抗体断片である。それは、親分子よりずっと小さく、ＶＥＧＦ-Ａへの強い結合を与えるために親和性成熟されている（ＷＯ９８／４５３３１）。加齢による失明の一般形態である加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）の「滲出型」の治療に認可されたのが抗血管新生である。別の抗ＶＥＧＦ抗体は、例えばＨｕＭａｂ Ｇ６-３１であり、例えばＵＳ２００７／０１４１０６５に記載されている。

ＡＮＧ-２及び抗ＡＮＧ-２抗体
ヒトアンジオポエチン-２（ＡＮＧ-２）（あるいはＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２と略称される）（配列番号：１０６）は、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60 and Cheung,A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91に記載されている。アンジオポエチン-１及び-２（ＡＮＧ-１（配列番号：１０７）及びＡＮＧ-２（配列番号：１０６））は、血管内皮に選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリーであるＴｉｅに対するリガンドとして発見された。Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48。現在、アンジオポエチンファミリーの４つの確定メンバーがある。アンジオポエチン-３及び-４（Ａｎｇ-３及びＡｎｇ-４）は、マウス及びヒトにおける同じ遺伝子座の広く分岐したカウンターパートを表しうる。Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28。ＡＮＧ-１及びＡＮＧ-２はもともと、組織培養実験において、アゴニスト及びアンタゴニストとしてそれぞれ同定された（ＡＮＧ-１については: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69；ＡＮＧ-２については: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照のこと）。全ての知られているアンジオポエチンは主にＴｉｅ２に結合し、Ａｎｇ-１及び-２は双方とも３ｎＭの親和性（Ｋｄ）でＴｉｅ２に結合する。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。Ａｎｇ-１はＥＣ生存を支援し、内皮の完全性を促進することが示されたが、Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; Kwak, H.J., et al., FEBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, C., et al., Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G., et al., Science 286 (1999) 2511-2514; Thurston, G., et al., Nat. Med. 6 (2000) 460-63、ＡＮＧ-２は逆の効果を有し、生存因子ＶＥＧＦ又は塩基性線維芽細胞増殖因子の不在において、血管の不安定化及び退縮を促進した。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。しかしながら、ＡＮＧ-２機能の多くの研究は、更なる複雑な状況を提案した。ＡＮＧ-２は血管発芽及び血管退縮双方において役割を果たしうる血管リモデリングの複雑な調節因子でありうる。ＡＮＧ-２のこのような役割を裏付けするように、発現分析は、ＡＮＧ-２が成人条件の血管新生出芽においてＶＥＧＦと共に急速に誘発されるが、ＡＮＧ-２が血管退縮の条件ではＶＥＧＦの不存在下において誘発されることを示す。Holash, J., et al., Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J., et al., Oncogene 18 (1999) 5356-62。状況依存的役割と一致して、ＡＮＧ-２は同じ内皮特異的受容体、Ｔｉｅ-２（Ａｎｇ-１によって活性化される）に特異的に結合するが、その活性化に対して状況依存効果を持つ。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。

角膜血管新生アッセイは、ＡＮＧ-１及びＡＮＧ-２双方が類似な効果を有し、ＶＥＧＦと相乗的に作用して新しい血管の成長を促進することを示した。Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40。用量依存内皮応答があるという可能性が、インビトロにおいて高濃度で、ＡＮＧ-２がまた血管新生促進性でありうるという観察により生じた。Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52。高濃度においてＡＮＧ-２は、ＰＩ-３キナーゼ及びＡｋｔ経路を介するＴｉｅ２の活性化を通して、血清欠乏アポトーシスの間、内皮細胞に対するアポトーシス生存因子として作用する。Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52。

他のインビトロ実験は、持続した曝露間に、ＡＮＧ-２の作用はＴｉｅ２のアンタゴニストからアゴニストの作用に徐々にシフトし得、後の時点で、それは血管形成及び新生血管の安定化に直接貢献しうることが提示された。Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70。更に、ＥＣがフィブリンゲルにおいて培養されると、ＡＮＧ-２によるＴｉｅ２の活性化も観察され、ＡＮＧ-２の作用がＥＣの分化状態に依存しうることがおそらく提案される。Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70。三次元コラーゲンゲルにおいて培養される微少血管ＥＣにおいて、ＡＮＧ-２はまた、Ｔｉｅ２活性化を誘発し、毛細血管様構造の形成を促進しうる。Mochizuki, Y., et al., J. Cell. Sci. 115 (2002) 175-83。血管成熟のインビトロモデルとしての３-Ｄスフェロイド共培養の使用は、ＥＣ及び間葉系細胞間の直接の接触はＶＥＧＦへの応答性を抑止するが、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ-２の存在は発芽を誘発することが示された。Korff, T., et al., Faseb J. 15 (2001) 447-57。Etoh, T.H. et al. demonstrated that ECs that constitutively express Tie2, the expression of MMP-1,-9 and u-PA were strongly upregulated by ANG-2 in the presence of VEGF.Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53。インビボ瞳孔膜モデルにより、Lobov, I.B. et al.は、ＡＮＧ-２が内因性ＶＥＧＦの存在下において、毛細血管直径の急速な増加、基底膜のリモデリング、内皮細胞の増殖及び遊走を促進し、新しい血管の発芽を刺激することを示した。Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10。対照的に、ANG-2は、内因性VEGF無しでは、内皮細胞死及び血管退縮を促進する。Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10。同様に、インビボ腫瘍モデルにより、Vajkoczy, P., et al.は、多細胞凝集が、宿主及び腫瘍内皮によるＶＥＧＦＲ-２及びＡＮＧ-２の同時発現を介した血管新生発芽による血管増殖を開始することを示した。Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85。このモデルは、増殖腫瘍の確立された微少血管が、連続的なリモデリングによって特徴付けられ、おそらくＶＥＧＦ及びＡＮＧ-２の発現によって媒介されることを示した(Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85)。

Ｔｉｅ-２及びアンジオポエチン-１のノックアウトマウス試験は類似な表現型を示し、アンジオポエチン-１刺激によるＴｉｅ-２リン酸化が、発生中の血管のリモデリング及び安定化を媒介し、血管新生中の血管成熟及び内皮細胞支援細胞接着を促進することを示した(Dumont, D.J., et al., Genes & Development, 8 (1994) 1897-1909; Sato, T.N., Nature, 376 (1995) 70-74; (Thurston, G., et al., Nature Medicine 6 (2000) 460-463)。アンジオポエチン-１の役割は成人において保存されていると考えられており、それは広範に恒常的に発現されている(Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50; Zagzag, D., et al., Exp Neurology 159 (1999) 391-400)。対照的に、アンジオポエチン-２発現は血管リモデリングの部位に主に限定され、そこではそれはアンジオポエチン-１の恒常的な安定化又は成熟化機能を阻止し、血管が、発芽シグナルに対してより応答でありうる可塑的状態に戻り留まることを可能にすると考えられている(Hanahan, D., 1997; Holash, J., et al., Oncogene 18 (199) 5356-62; Maisonpierre, P.C., 1997)。病理学的血管新生におけるアンジオポエチン-２発現の研究は、多くの腫瘍タイプが血管アンジオポエチン-２発現を示すことを発見した(Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60)。機能研究は、アンジオポエチン-2が腫瘍血管新生に関与することを提案し、マウス異種移植モデルにおいてアンジオポエチン-２過剰発現を増加腫瘍と関連付ける(Ahmad, S.A., et al., Cancer Res., 61 (2001) 1255-1259)。他の研究はアンジオポエチン-２過剰発現を腫瘍血管過多と関連付けた(Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129)。

近年、アンジオポエチン-１、アンジオポエチン-２及び／又はＴｉｅ-２が、考えられる抗癌治療標的として提案された。例えばＵＳ６，１６６，１８５、ＵＳ５，６５０，４９０及びＵＳ５，８１４，４６４は、抗Ｔｉｅ-２リガンド及び受容体抗体を各々開示する。可溶性Ｔｉｅ-２を用いた研究は、齧歯類において腫瘍の数及びサイズを低下することを報告した(Lin, 1997; Lin 1998)。Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91は、Ｔｉｅ-２の細胞外ドメインを発現するヒトメラノーマ細胞株を生成し、これらをヌードマウスに注入し、可溶性Ｔｉｅ-２が腫瘍増殖及び腫瘍血管新生の顕著な阻害をもたらすことを報告した。アンジオポエチン-１及びアンジオポエチン-２双方がＴｉｅ-２に結合するとして、アンジオポエチン-１、アンジオポエチン-２又はＴｉｅ-２のどれが、抗癌治療に魅力的な標的かどうかこれらの研究からは不明である。しかしながら、効果的な抗アンジオポエチン-２治療が癌などの疾患の治療に有益であると考えられており、そこでは進行は異常血管新生に依存し、プロセスの遮断は疾患進行の防止を導きうる(Folkman, J., Nature Medicine. 1 (1995) 27-31)。

更に、幾つかのグループが、アンジオポエチン-２に結合する抗体及びペプチドの使用を報告した。例えば、ＵＳ６，１６６，１８５及びＵＳ２００３／１０１２４１２９を参照のこと。ＷＯ０３／０３０８３３、ＷＯ２００６／０６８９５３、ＷＯ０３／０５７１３４又はＵＳ２００６／０１２２３７０。

アンジオポエチン-２の限局的な発現の効果の研究は、アンジオポエチン-１／Ｔｉｅ-２シグナルをアンタゴナイズすることは密着した血管構造を緩め、ＥＣを血管新生誘導因子からの活性化シグナルに曝すことを示した(Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50)。アンジオポエチン-１の阻害から生じるこの血管新生促進効果は、抗アンジオポエチン-１治療が効果的な抗癌治療とならないことを示す。

ＡＮＧ-２は、発生中に、血管リモデリングが生じている部位で発現される。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。成人個体では、ＡＮＧ-２発現は、血管リモデリングの部位並びに高く血管に富んだ腫瘍、グリオーマ、Osada, H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09); Koga, K., et al., Cancer Res. 61 (2001) 6248-54、肝細胞癌、Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45、胃癌、Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Lee, J.H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 355-61、甲状腺腫瘍、Bunone, G., et al., Am J Pathol 155 (1999) 1967-76、非小細胞肺癌、Wong, M.P., et al., Lung Cancer 29 (2000) 11-22、及び結腸の癌、Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43、及び前立腺Wurmbach, J.H., et al., Anticancer Res. 20 (2000) 5217-20を含む、に制限される。幾つかの腫瘍細胞はＡＮＧ-２を発現することが発見された。例えば、Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45は、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）の１２のサンプルの内１０においてＡＮＧ-２ ｍＲＮＡを検出した。Ellisのグループは、ＡＮＧ-２が腫瘍上皮において遍在的に発現されることを報告した。Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43。他の調査員が類似な発見を報告した。Chen, L., et al., J. Tongji Med. Univ. 21 (2001) 228-35。保存されたヒト乳癌サンプルにおいてＡＮＧ-２ ｍＲＮＡレベルを検出することにより、Sfiligoi, C., et al., Int. J. Cancer 103 (2003) 466-74は、ＡＮＧ-２ ｍＲＮＡが、腋窩リンパ節浸潤、短い無病期間及び低い全生存度と顕著に関連することを報告した。Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29は、それぞれ病理学的ステージ-Ｉ〜-ＩＩＩＡを有する、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の全部で２３６の患者を調査した。免疫組織化学を使用し、彼らは、１６．９％のＮＳＣＬＣ患者がＡＮＧ-２陽性であることを発見した。ＡＮＧ-２陽性腫瘍の微小血管密度は、ＡＮＧ-２陰性のそれより著しく高かった。ＡＮＧ-２のこのような血管新生効果は、ＶＥＧＦ発現が高い場合にのみ見られた。更に、ＡＮＧ-２の陽性発現は、不良な術後生存を予測するための重要な要因であった。Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129。しかしながら、彼らはＡｎｇ-１発現及び微小血管密度の間に有意な相関を見出さなかった。Tanaka, F., et al., Cancer Res.62 (2002) 7124-7129。これらの結果は、ＡＮＧ-２が、幾つかのタイプの癌の患者の予後不良の指標であることを示唆する。

近年、ＡＮＧ-２ノックアウトマウスモデルを使用して、Yancopoulosのグループは、ANG-2が生後血管新生に必要であることを報告した。Gale, N.W., et al., Dev.Cell 3-(2002) 411-23。彼らは、眼の硝子体脈管構造の発生的プログラム退縮はANG-2ノックアウトマウスにおいて生じず、それらの網膜血管が網膜中心動脈から出芽しないことを示した。Gale, N.W., et al., Dev.Cell 3 (2002) 411-23。彼らはまた、ＡＮＧ-２の欠失は、リンパ管のパターニング及び機能において深刻な欠陥をもたらすことを発見した。Gale, N.W., et al., Dev.Cell 3 (2002) 411-23。Ａｎｇ-１による遺伝子救済はリンパ性欠陥を修復するが、血管新生欠陥は修復しない。N.W., et al., Dev.Cell 3 (2002) 411-23。

Peters及び彼の同僚は、可溶性Tie2が、組換えタンパク質として、又はウィルス発現ベクター中において送達される場合、マウスモデルにおけるマウス乳癌及びメラノーマのインビボ増殖を阻害したことを報告した。Lin, P., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 (1998) 8829-34; Lin, P., et al., J. Clin.Invest.100 (1997) 2072-78。そのように治療された腫瘍組織における脈管密度は高く低減された。更に、可溶性Ｔｉｅ２は、腫瘍細胞条件培地によって刺激されたラット角膜において血管新生を阻害した。Lin, P., et al., J. Clin.Invest.100 (1997) 2072-78。更に、Isner及び彼のチームは、ＶＥＧＦへのＡＮＧ-２の追加が、ＶＥＧＦ単独より、著しく長くそして周囲に広がった新生血管を促進したことを示した。Asahara, T., et al., Circ.Res.83 (1998) 233-40。過剰な可溶性Tie2受容体は、ＡＮＧ-２によるＶＥＧＦ誘発新生血管の調節を妨げた。Asahara, T., et al., Circ.Res.83 (1998) 233-40.Siemeister, G., et al., Cancer Res.59:3 (1999) 3185-91は、ヌードマウス異種移植を用いて、異種移植片におけるＦｌｔ-１又はＴｉｅ２どちらかの細胞外リガンド結合ドメインの過剰発現が、経路の顕著な阻害をもたらし、もう一方では補われないことを示し、ＶＥＧＦ受容体経路及びＴｉｅ２経路が、インビボ血管新生のプロセスに必須な２つの独立したメディエーターとして考えられるべきであることを提案した。Siemeister, G., et al., Cancer Res.59:3 (1999) 3185-91。これはWhite, R., R., et al., , Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100 (2003) 5028-33によるより最近の文献によって証明されている。彼らの研究において、特異的に結合しＡＮＧ-２を阻害するヌクレアーゼ抵抗性ＲＮＡアプタマーが、ラット角膜微少ポケット血管新生モデルにおいてｂＦＧＦによって誘発される新生血管を顕著に阻害することが示された。

二重特異性抗体
広範な組換え抗体フォーマットが近年に開発され、例えばＩｇＧ抗体フォーマット及び単鎖ドメインの融合による四価二重特異性抗体などである(例えばColoma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO2001/077342; and Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234を参照)。

また、２つ以上の抗原に結合可能な、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）がもはや保たれていない幾つかの他の新しいフォーマット、例えばダイア-、トリア-又はテトラボディ、ミニボディ、幾つかの単鎖フォーマット（ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ-ｓｃＦｖ）が開発されている(Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。

全てのこのようなフォーマットは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を更なる結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ）に融合するために、又は例えば２つのＦａｂ断片又はｓｃＦｖｓを融合するためにリンカーを使用する(Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14)。自然発生的な抗体への高い類似性を維持することによって、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体結合により媒介される補体依存細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの保持が所望されうることを留意しておかなければならない。

ＷＯ２００７／０２４７１５において、組換え多価、多重特異性結合タンパク質としてデュアル可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物学的に活性な抗体二量体の調製プロセスがＵＳ６，８９７，０４４に報告されている。ペプチドリンカーによって互いに結合された少なくとも４つの可変ドメインを有する多価Ｆ_Ｖ抗体コンストラクトがＵＳ７，１２９，３３０に報告されている。二量体及び多量体抗原結合構造がＵＳ２００５／００７９１７０に報告されている。天然免疫グロブリンではない、結合構造によって共有結合で互いに結合された３又は４つのＦａｂ断片を含んでなる三-又は四-価単一特異性抗原結合タンパク質がＵＳ６，５１１，６６３に報告されている。ＷＯ２００６／０２０２５８では、原核生物及び真核生物細胞において効果的に発現され得、治療及び診断方法において有用な四価二重特異性抗体が報告されている。２種類のポリペプチド二量体を含んでなる混合物から、少なくとも一つの鎖間ジスルフィド架橋で結合されない二量体から、少なくとも一つの鎖間ジスルフィド架橋で結合される二量体を分離し、優先的に合成する方法がＵＳ２００５／０１６３７８２に報告されている。二重特異性四価受容体がＵＳ５，９５９，０８３に報告されている。３又は４つの機能的抗原結合部位を有する組換え抗体がＷＯ２００１／０７７３４２に報告されている。

多重特異性及び多価抗原結合ポリペプチドがＷＯ１９９７／００１５８０に報告されている。ＷＯ１９９２／００４０５３は、同じ抗原決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体から典型的には調製されるホモコンジュゲートが、合成架橋結合によって共有結合的に連結されることを報告する。抗原に対して高アビディティーを有するオリゴマーモノクローナル抗体がＷＯ１９９１／０６３０５に報告されており、典型的にはＩｇＧクラスのオリゴマーが分泌され、２つ以上の免疫グロブリンモノマーが互いに会合し、四価又は六価のＩｇＧ分子が形成される。ヒツジ由来抗体及び組換え抗体コンストラクトがＵＳ６，３５０，８６０に報告されており、インターフェロンガンマ活性が病原性である疾患を治療するために使用されうる。ＵＳ２００５／０１００５４３では、二重特異性抗体の多価キャリアである標的可能コンストラクトが報告されており、すなわち、標的可能コンストラクト各分子が、２つ以上の二重特異性抗体のキャリアとして機能しうる。遺伝子操作された二重特異性四価抗体がＷＯ１９９５／００９９１７に報告されている。ＷＯ２００７／１０９２５４では、安定化ｓｃＦｖから成る又は安定化ｓｃＦｖを含む安定化結合分子が報告されている。

ＶＥＧＦ及びＡＮＧ-２インヒビターの組合せ
ＷＯ２００７／０６８８９５は、ＡＮＧ-２アンタゴニスト及びＶＥＧＦ、ＫＤＲ及び／又はＦＬＴＬアンタゴニストの組合せを参照する。ＷＯ２００７／０８９４４５は、ＡＮＧ-２及びＶＥＧＦインヒビターの組合せを参照する。

ＷＯ２００３／１０６５０１は、アンジオポエチンに結合し、多量体化ドメインを有する融合タンパク質を参照する。ＷＯ２００８／１３２５６８は、アンジオポエチン及びＶＥＧＦに結合する融合タンパク質に関する。ＷＯ２００３／０２０９０６は、受容体の複数のリガンド結合ドメインを有する多価タンパク質コンジュゲートに関する。

ＷＯ２００９／１３６３５２は、抗血管新生化合物に関する。

発明は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、
ｉ）前記第一抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：２を含み；
ｉｉ）前記第二抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：４を含む
ことを特徴とする抗体に関する。

発明の一態様では、発明による二重特異性抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；及び
ｂ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている、ＡＮＧ-２に特異的に結合する完全長抗体の修飾重鎖及び修飾軽鎖
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：７のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：５のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：８のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：６のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：１１のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：９のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：１２のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：１０のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：１５のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：１３のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：１６のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：１４のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

また、発明の更なる態様は、前記二重特異性抗体を含んでなる薬学的組成物、癌の治療のための前記組成物、癌の治療に対する医薬の製造のための前記二重特異性抗体の使用、癌を患っている患者の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に前記二重特異性抗体を投与することによる方法である。

また、発明の更なる態様は、前記二重特異性抗体を含んでなる薬学的組成物、血管疾患の治療のための前記組成物、血管疾患の治療に対する医薬の製造のための前記二重特異性抗体の使用、血管疾患を患っている患者の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に前記二重特異性抗体を投与することによる方法である。

発明の更なる態様は、発明による二重特異性抗体の鎖をコードする核酸分子である。
発明は更に、原核生物又は真核生物宿主細胞において前記核酸を発現可能な発明による前記核酸を有する発現ベクター、及び発明による二重特異性抗体の組換え生産のための、かかるベクターを有する宿主を提供する。

発明は、発明によるベクターを含んでなる原核生物又は真核生物宿主細胞を更に含む。

発明は更に、発明による二重特異性抗体の生産方法であって、原核生物又は真核生物宿主細胞において発明による核酸を発現させる工程、及び前記細胞又は細胞培養上清から前記二重特異性抗体を回収する工程を特徴とする方法含む。発明は更に、二重特異性抗体の生産のためのかかる方法によって得られる抗体を含む。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、及び配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、及び配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、及び配列番号：１６のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

発明による二重特異性二価抗体は、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ-２標的治療を必要としているヒト患者に対して利点を示す。発明による抗体は、このような疾患、特に癌を患っている患者に利益をもたらす非常に価値のある特性を有する。発明による二重特異性抗体は、腫瘍増殖及び／又は腫瘍血管新生又は血管疾患の阻害に非常に効果的である。発明による二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体は、価値のある薬物動態／薬力学特性、例えば安定性、（例えば低用量で）良好な（すなわち、ゆっくりした）クリアランスを示す。

発明による二重特異性抗体は、
ａ）腫瘍増殖阻害（例えば、発明による二重特異性抗体により、腫瘍停滞が、２つの単一特異性抗体の組合せと比較して低濃度ですでに得られ得る）（例えば、実施例９及び１０のＣｏｌｏ２０５及びＫＰＬ-４腫瘍モデルでは、腫瘍停滞が、１０ｍｇ／ｋｇのＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６＋１０ｍｇ／ｋｇのアバスチンの組合せと比較して、１０ｍｇ／ｋｇのＸＭＡｂ１によってすでに得られた）、及び／又は
ｂ）腫瘍血管新生又は血管疾患の阻害（例えば、発明による二重特異性抗体による最大抗血管新生効果が、２つの単一特異性抗体の組合せと比較して低濃度ですでに得られ得る）（例えば、実施例８のマウス角膜血管新生アッセイでは、最大抗血管新生効果が、１０ｍｇ／ｋｇのＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６＋１０ｍｇ／ｋｇのアバスチンの組合せと比較して、１０ｍｇ／ｋｇのＸＭＡｂ１を用いて既に達成された）
において非常に効果的である。

ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含むＸＭａｂ例の例示的な二価二重特異性抗体フォーマット。 ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含むＯＡｓｃＦａｂ例の例示的な二価二重特異性抗体フォーマット。 ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含むＯＡｓｃＸＦａｂ１などの例示的な二価二重特異性抗体フォーマット。 ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含むＯＡｓｃＸＦａｂ２及びＯＡｓｃＸＦａｂ３などの例示的な二価二重特異性抗体フォーマット。 ＶＥＧＦ（第一工程）、次いでｈＡｎｇ-２（第二工程）へ結合する＜ＶＥＧＦ-Ａｎｇ-２＞ＸＭａｂ１の同時結合。 結合活性ｍＡｂ＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞抗体の定量化のＥＬＩＳＡ原理。 結合活性＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞ＸＭａｂ１抗体の定量化のＥＬＩＳＡのキャリブレーション曲線。 マウス角膜血管新生アッセイ − 発明による二重特異性抗体の投与による、縁からＶＥＧＦ勾配に向かう血管成長の阻害。 マウス角膜血管新生アッセイ − 発明による二重特異性の投与による、縁からＶＥＧＦ勾配に向かう血管新生／血管増殖の阻害 − 二重特異性＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞抗体ＸＭａｂ１、＜Ａｎｇ２＞Ｍａｂ ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６（ＬＣ０６）、＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）、及びＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６と＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）との組合せの比較。 発明による二重特異性抗体によるヒト結腸直腸癌Ｃｏｌｏ２０５（小腫瘍）のマウス異種移植におけるインビボ腫瘍増殖阻害 − 二重特異性＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞抗体ＸＭａｂ１、＜Ａｎｇ２＞Ｍａｂ ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６（ＬＣ０６）、＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）、及びＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６と＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）との組合せの比較。 発明による二重特異性抗体によるヒト結腸直腸癌Ｃｏｌｏ２０５（大腫瘍）のマウス異種移植におけるインビボ腫瘍増殖阻害 − 二重特異性＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞抗体ＸＭａｂ１、＜Ａｎｇ２＞Ｍａｂ ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６（ＬＣ０６）、＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）、及びＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６及び＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）の組合せの比較。 発明による二重特異性抗体によるヒト乳癌ＫＰＬ-４（小腫瘍）のマウス異種移植におけるインビボ腫瘍増殖阻害 − 二重特異性＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞抗体ＸＭａｂ１、＜Ａｎｇ２＞Ｍａｂ ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６（ＬＣ０６）、＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）、及びＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６と＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）との組合せの比較。 発明による二重特異性抗体によるヒト乳癌ＫＰＬ-４（大腫瘍）のマウス異種移植におけるインビボ腫瘍増殖阻害 − 二重特異性＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞抗体ＸＭａｂ１、＜Ａｎｇ２＞Ｍａｂ ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６（ＬＣ０６）、＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）、及びＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６と＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）との組合せの比較。 発明による二重特異性抗体による胃癌Ｎ８７のマウス異種移植におけるインビボ腫瘍増殖阻害 − 二重特異性＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞抗体ＸＭａｂ１、＜Ａｎｇ２＞Ｍａｂ ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６（ＬＣ０６）、＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）、及びＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６と＜ＶＥＧＦ＞Ｍａｂベバシズマブ（アバスチン）との組合せの比較。

（発明の詳細な説明）
発明は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、
ｉ）前記第一抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：２を含み；
ｉｉ）前記第二抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：４を含む
ことを特徴とする抗体に関する。

発明の一態様では、発明による二重特異性抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている、ＡＮＧ-２に特異的に結合する完全長抗体の修飾重鎖及び修飾軽鎖
を含んでなることを特徴とする。

ヒト血管内皮増殖因子及びヒトアンジオポエチン-２（ＡＮＧ-２）に特異的に結合する二重特異性抗体の二重特異性二価抗体フォーマットが、ＷＯ２００９／０８０２５３に記載されている（図１の、ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含む例示的スキームを参照のこと）。この二重特異性二価抗体フォーマットに基づく抗体は、本発明の実施例においてＸＭａｂと呼ばれる。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：７のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：５のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：８のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：６のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：１１のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：９のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：１２のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：１０のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：１５のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：１３のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：１６のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：１４のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：１９のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：１７のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：２０のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：１８のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：２３のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：２１のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：２４のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：２２のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：２７のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：２５のアミノ酸配列、及び
ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：２８のアミノ酸配列、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：２６のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、及び配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、及び配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、及び配列番号：１６のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、及び配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、及び配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、及び配列番号：２８のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

発明の別の態様では、発明による二重特異性は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）重鎖のＮ末端が軽鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結されている、ＡＮＧ-２に特異的に結合する第二完全長抗体の重鎖及び軽鎖
を含んでなることを特徴とする。

ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン-２（ＡＮＧ-２）に特異的に結合するこの二重特異性抗体のこの二重特異性二価抗体の例示的スキームを図２ａに示し、ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含む。この二重特異性二価抗体フォーマットに基づく抗体は、本発明の実施例においてＯＡｓｃＦａｂと呼ばれる。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：３０のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：３１のアミノ酸配列、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：２９のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：３３のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：３４のアミノ酸配列、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：３２のアミノ酸配列
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、第二完全長抗体の重及び軽鎖の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、次の位置間へのジスルフィド結合の導入によってジスルフィド安定化される：重鎖可変ドメイン位置４４から軽鎖可変ドメイン位置１００(番号付けは常にKabatのEU indexに従う；(Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。このような更なるジスルフィド安定化は、第二完全長抗体重及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ間のジスルフィド結合の導入によって得られる。安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入する技術が、例えばＷＯ９４／０２９３５０， Rajagopal, V., et al, Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi, et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25 (1998) 387-393; or Schmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721に記載されている。

従って一実施態様では、このような二重特異性二価抗体は、重鎖可変ドメイン位置４４及び軽鎖可変ドメイン位置１００間に、第二完全長抗体重及び軽鎖の可変ドメイン間のジスルフィド結合を含んでなることを特徴とし、また
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：３６のアミノ酸配列、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：３７のアミノ酸配列、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：３５のアミノ酸配列
を含む。

発明の別の態様では、発明による二重特異性抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）ＡＮＧ-２に特異的に結合する第二完全長抗体の重鎖及び軽鎖
を含んでなることを特徴とし、
重鎖のＮ末端はペプチドリンカーによって軽鎖のＣ末端に結合され、
可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されている。

ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン-２（ＡＮＧ-２）に特異的に結合するこの二重特異性抗体のこの二重特異性二価抗体の例示的スキームを図２ｂに示し、ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含む。この二重特異性二価抗体フォーマットに基づく抗体は、実施例においてＯＡｓｃＸＦａｂ１と呼ばれる。

一実施態様では、このような二重特異性抗体は
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：３９、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：４０、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：３８
を含んでなることを特徴とする。

発明の別の態様では、発明による二重特異性抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）ＡＮＧ-２に特異的に結合する第二完全長抗体の重鎖及び軽鎖
を含んでなることを特徴とし、
重鎖のＮ末端はペプチドリンカーによって軽鎖のＣ末端に結合され、
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている。

ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン-２（ＡＮＧ-２）に特異的に結合するこの二重特異性抗体のこの二重特異性二価抗体の例示的スキームを図２ｃに示し、ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含む。この二重特異性二価抗体フォーマットに基づく抗体は、実施例においてＯＡｓｃＸＦａｂ２及びＯＡｓｃＸＦａｂ３と呼ばれる。

一実施態様では、このような二重特異性抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：４２、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：４３、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：４１
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：４５、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：４６、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：４４
を含んでなることを特徴とする。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：２９、配列番号：３０、及び配列番号：３１のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：３２、配列番号：３３、及び配列番号：３４のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：３５、配列番号：３６、及び配列番号：３７のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：３８、配列番号：３９、及び配列番号：４０のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：４１、配列番号：４２、及び配列番号：４３のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

従って、発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなる二重特異性二価抗体であって、配列番号：４４、配列番号：４５、及び配列番号：４６のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする抗体である。

好ましくは、発明による二重特異性二価抗体のＣＨ３ドメインは、例えばＷＯ９６／０２７０１１，Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; and Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681に幾つかの例と共に詳細に記載されてる「ノブ-インツ-ホール」技術によって変更される。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用面が、これらの２つのＣＨ３ドメインを有する両重鎖のヘテロ二量体化を増加するように変更される。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々は「ノブ」であり得、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はヘテロ二量体を安定化し(Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)、収率を増加させる。

発明の好ましい態様では、発明による全ての二重特異性抗体は、
一重鎖のＣＨ３ドメイン及び他方の重鎖のＣＨ３ドメインが各々、抗体ＣＨ３ドメイン間のもとの接触面を含む接触面で会合することを特徴とし；
ここで前記接触面は二重特異性抗体の形成を促進するように変更されており、ここで変更は以下を特徴とする：
ａ） 一重鎖のＣＨ３ドメインが変更され、
これにより、二重特異性抗体内で他方の重鎖のＣＨ３ドメインのもとの接触面に会合する一重鎖のＣＨ３ドメインのもとの接触面内で、
アミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、これにより一重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内に隆起が生成され、これが他方の重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内のキャビティに配置可能となり、
また
ｂ） 他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更され、
これにより、二重特異性抗体内で第一ＣＨ３ドメインのもとの接触面と会合する第二ＣＨ３ドメインのもとの接触面内で
アミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、これにより第二ＣＨ３ドメインの接触面内にキャビティが生成され、その中に第一ＣＨ３ドメインの接触面内の隆起が配置可能となる。

このように、発明による抗体は好ましくは、
ａ）の完全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の完全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン各々が、抗体ＣＨ３ドメイン間のもとの接触面における変更を含む接触面で会合することを特徴とし；ここで、
ｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて
アミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより一方の重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内に隆起が生成され、これが他方の重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内のキャビティに配置可能となり
また
ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて
アミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより第二ＣＨ３ドメインの接触面内にキャビティが生成され、その中に第一ＣＨ３ドメインの接触面内の隆起が配置可能となる。

好ましくは、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基はアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）から成る群から選択される。

好ましくは、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基はアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）から成る群から選択される。

発明の一態様では、両ＣＨ３ドメインは、両ＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成されるように、各ＣＨ３ドメインの相応する位置へのアミノ酸としてシステイン（Ｃ）の導入により更に変更される。

一実施態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。CH3ドメイン間の更なる鎖間ジスルフィド架橋もまた使用され得(Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681)、例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインへのＹ３４９Ｃ変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインへのＥ３５６Ｃ変異又はＳ３５４Ｃ変異の導入によりなされる。

別の実施態様では、発明による二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。別の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む（一方のＣＨ３ドメインにおける更なるＹ３４９Ｃ変異及び他方のＣＨ３ドメインにおける更なるＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ変異は鎖間ジスルフィド架橋を形成する）(番号付けは常にKabatのEU indexに従う; (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)))。しかし、ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されるような他のノブ-イン-ホール技術も、代わりに又は追加として使用できる。従って、二重特異性抗体の別の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異である(番号付けは常にKabatのEU indexに従う; (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)))。

別の実施態様では、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を、更に「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異を含む。

別の実施態様では、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、又は前記三価二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異を、２つのＣＨ３ドメインの他方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を、また更に「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異を、「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異を含む。

発明の一実施態様では、発明による二重特異性抗体は、一又は複数の次の特性を有することを特徴とする（実施例３〜７に記載されるアッセイにおいて決定される）：
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＶＥＧＦに結合する；
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＡＮＧ-２に結合する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＡＮＧ-２誘発Ｔｉｅ２リン酸化を、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１０ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２へのＡＮＧ-２の結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘発増殖を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する。

一実施態様では、二重特異性二価抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなることを特徴とし、
ｉ）前記第一抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：２を含み；
ｉｉ）前記第二抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：４を含む；
ことを特徴とし、
また、一又は複数の次の特性を有する（実施例３〜７に記載されるアッセイにおいて決定される）：
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＶＥＧＦに結合する；
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＡＮＧ-２に結合する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＡＮＧ-２誘発Ｔｉｅ２リン酸化を、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１０ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２へのＡＮＧ-２の結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘発増殖を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する。

発明の一態様では、発明によるこのような二重特異性抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている、ＡＮＧ-２に特異的に結合する完全長抗体の修飾重鎖及び修飾軽鎖；
を含んでなることを特徴とし、
また、一又は複数の次の特性を有する（実施例３〜７に記載されるアッセイにおいて決定される）：
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＶＥＧＦに結合する；
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＡＮＧ-２に結合する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＡＮＧ-２誘発Ｔｉｅ２リン酸化を、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１０ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２へのＡＮＧ-２の結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘発増殖を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する。

一実施態様では、二重特異性二価抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなることを特徴とし、
ｉ）前記第一抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：１（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：２（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）を含み；
ｉｉ）前記第二抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：３（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：４（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）を含む
ことを特徴とする。

一実施態様では、二重特異性二価抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含んでなることを特徴とし、
ｉ）前記第一抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：１（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：２（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）を含み；
ｉｉ）前記第二抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：３（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：４（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）を含む；
ことを特徴とし、
また、一又は複数の次の特性を有する（実施例３〜７に記載されるアッセイにおいて決定される）：
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＶＥＧＦに結合する；
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＡＮＧ-２に結合する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＡＮＧ-２誘発Ｔｉｅ２リン酸化を、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１０ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２へのＡＮＧ-２の結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘発増殖を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する。

発明の一態様では、発明による二重特異性抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖、
ここで、第一完全長抗体の重鎖が配列番号：７のアミノ酸配列を含み（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、第一完全長抗体の軽鎖が配列番号：５のアミノ酸配列を含む（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、及び
ｂ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている、ＡＮＧ-２に特異的に結合する完全長抗体の修飾重鎖及び修飾軽鎖、
ここで、第二完全長抗体の修飾重鎖が配列番号：８のアミノ酸配列を含み（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、第二完全長抗体の修飾軽鎖が配列番号：６のアミノ酸配列を含む（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）
を含んでなることを特徴とする。

発明の一態様では、発明による二重特異性抗体は、
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖、
ここで、第一完全長抗体の重鎖が配列番号：７のアミノ酸配列を含み（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、第一完全長抗体の軽鎖が配列番号：５のアミノ酸配列を含む（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、及び
ｂ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている、ＡＮＧ-２に特異的に結合する完全長抗体の修飾重鎖及び修飾軽鎖、
ここで、第二完全長抗体の修飾重鎖が配列番号：８のアミノ酸配列を含み（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）、第二完全長抗体の修飾軽鎖が配列番号：６のアミノ酸配列を含む（ＣＤＲに１以下のアミノ酸残基置換を有する）；
を含んでなることを特徴とし、
また、一又は複数の次の特性を有する（実施例３〜７に記載されるアッセイにおいて決定される）：
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＶＥＧＦに結合する；
− 二重特異性二価抗体が、５ｎＭ以下の結合親和性のＫＤ値でＡＮＧ-２に結合する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＡＮＧ-２誘発Ｔｉｅ２リン酸化を、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１０ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、Ｔｉｅ２へのＡＮＧ-２の結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合を２０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、１５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する；
− 二重特異性二価抗体が、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ誘発増殖を１０ｎＭ以下のＩＣ５０で（一実施態様では、５ｎＭ以下のＩＣ５０で）阻害する。

ここで使用される場合、「抗体」とは、抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。「結合部位」又は「抗原結合部位」なる用語は、ここで使用される場合、リガンドが実際に結合する抗体分子の領域を意味する。「抗原結合部位」なる用語は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＨ／ＶＬ）の対）を含む。

抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。

発明による「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、２つの異なる抗原、第一抗原としてＶＥＧＦ、及び第二抗原としてＡＮＧ-２、に特異的である。

「単一特異性」抗体なる用語は、ここで使用される場合、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。

「価」なる用語は、本出願内で使用される場合、抗体分子における特定数の結合部位の存在を意味する。従って、「二価」、「四価」、及び「六価」なる用語は、抗体分子における２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在をそれぞれ意味する。発明による二重特異性抗体は「二価」である。

「ＶＥＧＦ」なる用語は、ここで使用される場合、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ-Ａ）（配列番号：４７）を指し、例えばLeung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12 and Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24に記載されている。ＶＥＧＦは、正常及び異常血管新生の制御、及び腫瘍及び眼内疾患に伴う新生血管に関与する(Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; and Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039)。ＶＥＧＦは、幾つかの供給源から単離されたホモ二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞に対し特異性の高いマイトジェン活性を示す。

「ＡＮＧ-２」なる用語は、ここで使用される場合、ヒトアンジオポエチン-２（あるいはＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２と略称される）（配列番号：４８）を指し、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60 and Cheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91に記載されている。アンジオポエチン-１及び-２（ＡＮＧ-１（配列番号：１０７）及びＡＮＧ-２（配列番号：１０６））は、血管内皮に選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリーであるＴｉｅに対するリガンドとして発見された。Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48。現在、アンジオポエチンファミリーの４つの確定メンバーがある。アンジオポエチン-３及び-４（Ａｎｇ-３及びＡｎｇ-４）は、マウス及びヒトにおける同じ遺伝子座の広く分岐したカウンターパートを表しうる。Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28。ＡＮＧ-１及びＡＮＧ-２はもともと、組織培養実験において、アゴニスト及びアンタゴニストとしてそれぞれ同定された（ANG-1については: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69;ANG-2については: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照のこと）。全ての知られているアンジオポエチンは主にＴｉｅ２に結合し、Ａｎｇ-１及び-２は双方とも３ｎＭの親和性（Ｋｄ）でＴｉｅ２に結合する。Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60。

発明の二重特異性抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に異なる度合で寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の度合は、それらの領域が配列間の可変性に従って決定されている、アミノ酸配列の収集データベースとの比較によって決定される。また、発明の範囲内に含まれるものは、より少ないＣＤＲから成る機能的抗原結合部位である（すなわち、結合特異性が３、４又は５つのＣＤＲによって決定される）。例えば、６つのＣＤＲの完全なセット未満が、結合に十分でありうる。幾つかの場合では、ＶＨ又はＶＬドメインで十分であろう。

発明の抗体は、一又は複数の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を更に含む。免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプ、またＩｇＧ及びＩｇＡの場合にはそれらのサブタイプを含む。

「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、ここで使用される場合、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。

「キメラ抗体」なる用語は、一供給源又は種からの可変領域、すなわち結合領域、及び異なる供給源又は種由来の定常領域の少なくとも一部を含んでなる抗体を指し、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される。マウス可変領域及びヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体が好ましい。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、発明による特性を作成するために、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、定常領域がもとの抗体の形態から修飾又は変化されたものである。このようなキメラ抗体は「クラス-スイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードしているＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードしているＤＮＡセグメントを含んでなる免疫グロブリン遺伝子の発現の産物である。キメラ抗体の生産方法は一般的な組換えＤＮＡを含み、遺伝子トランスフェクション技術は当分野でよく知られている。例えばMorrison, S.L., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 (1984) 6851-6855; ＵＳ５，２０２，２３８及びＵＳ５，２０４，２４４を参照のこと。

「ヒト化抗体」なる用語は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を指す。好ましい実施態様では、マウスＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に移植され、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上述した抗原を認識する配列を表すものに相応する。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、発明による特性を作成するために、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、定常領域がもとの抗体の形態からさらに修飾又は変化されたものである。

「ヒト抗体」なる用語は、ここで使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は、当分野の水準においてよく知られている（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリン産生なく、免疫化によりヒト抗体の完全レパートリー又はセレクションを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）において産生されうる。このような生殖系変異体マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジによりヒト抗体の産生を生じるだろう（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照のこと）。ヒト抗体はファージディスプレイライブラリにおいても生産されうる（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。また、Cole, A., et al. and Boerner, P., et al.の技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。発明によるキメラ及びヒト化抗体について既に述べたように、「ヒト抗体」なる用語は、ここで使用される場合、発明による特性を作成するために、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチング」、すなわちＦｃ部分の変更又は変異によって（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）、定常領域において修飾されたそのような抗体も含む。

「組換えヒト抗体」なる用語は、ここで使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作成又は単離される全てのヒト抗体を含むことを意図し、例えば、ＮＳ０又はＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離される抗体、又は宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体である。このような組換えヒト抗体は、再編成形態において可変及び定常領域を有する。発明による組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異を受けている。このように、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系ＶＨ及びＶＬ配列に由来し関連するが、インビボでヒト抗体生殖系レパートリー内に天然には存在しない場合がある配列である。

「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、ここで使用される場合、抗原への抗体の結合に直接関与する軽及び重鎖の対のそれぞれを意味する。可変ヒト軽及び重鎖のドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結される、配列が広く保存された４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβ-シートコンホメーションを採用し、ＣＤＲはβ-シート構造を連結するループを形成しうる。各鎖におけるＣＤＲはフレームワーク領域によりそれらの三次元構造に保たれ、他の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体重及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、従って、発明の更なる目的を提供する。

「超可変領域」又は「抗体の抗原結合部」なる用語は、ここで使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定義される超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽及び重鎖は、Ｎ-からＣ-末端へ、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各鎖上のＣＤＲは、このようなフレームワークアミノ酸によって分けられている。特に、重鎖のＣＤＲ３が、抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (KabatのEU Indexによる番号付け（以下、Kabatによる番号付けと略す）を含む)の標準定義に従って決定される。

ここで使用される場合、「結合する」又は「特異的に結合する」なる用語は、インビトロアッセイ、好ましくは精製野生型抗原を用いるプラズモン共鳴アッセイ(BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) (実施例3)における、抗原（ヒトVEGF又はヒトANG-2何れか）のエピトープへの抗体の結合を指す。結合の親和性は、ｋａ(抗体／抗原複合体からの抗体の会合に対する速度定数)、ｋ_Ｄ（解離定数）、及びＫ_Ｄ（ｋ_Ｄ／ｋａ）なる用語によって定義される。一実施態様では、結合又は特異的な結合は、１０^−８ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０^−９Ｍ〜１０^−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を意味する。

「エピトープ」なる用語は、抗体に特異的に結合できる何れかのポリペプチド決定因子を含む。ある実施態様では、エピトープ決定因子は分子の化学的活性表面群、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルを含み、ある実施態様では、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の電荷特性を有しうる。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。

ある実施態様では、抗体は、それが、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原を特異的に結合すると言われる。

「完全長抗体」なる用語は、２つの「完全長抗体重鎖」及び２つの「完全長抗体軽鎖」から成る抗体を意味する（図１を参照）。「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ-ＣＨ１-ＨＲ-ＣＨ２-ＣＨ３と略される、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）；及び場合によってはサブクラスＩｇＥの抗体の場合は抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）から成るポリペプチドである。好ましくは、「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＬ-ＣＬと略される、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成るポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）でありうる。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメイン間、及び完全長抗体重鎖のヒンジ領域間を、ポリペプチド間ジスルフィド結合によって結合される。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥなどの天然抗体である。発明による完全長抗体は、単一種、例えばヒトからであり得、又はそれらはキメラ又はヒト化抗体でありうる。発明による完全長抗体は、各々がＶＨ及びＶＬの対によって形成される２つの抗原結合部位を含み、その双方は同じ抗原に特異的に結合する。前記完全長抗体の重又は軽鎖のＣ末端は、前記重又は軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を意味する。前記完全長抗体の重又は軽鎖のＮ末端は、前記重又は軽鎖のＮ末端の最後のアミノ酸を意味する。

「ペプチドリンカー」なる用語は、発明内で使用される場合、好ましくは合成起源のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。発明によるこれらのペプチドは、ペプチドリンカーにより、第二完全長抗体（第二抗原に特異的に結合する）の重鎖のＮ末端に軽鎖のＣ末端を結合するために使用される。第二完全長抗体重及び軽鎖内のペプチドリンカーは、少なくとも３０アミノ酸の長さ、好ましくは３２〜５０アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列のペプチドである。一つでは、ペプチドリンカーは、３２〜４０アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列のペプチドである。一実施態様では、前記リンカーは（ＧｘＳ）ｎであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝８、９又は１０及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７又は８及びｍ＝０、１、２又は３）、好ましくはｘ＝４、ｎ＝６又は７及びｍ＝０、１、２又は３、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝７及びｍ＝２である。一実施態様では、前記リンカーは（Ｇ_４Ｓ）_６Ｇ_２である。

「定常領域」なる用語は、本出願内で使用される場合、可変領域以外の抗体のドメインの和を意味する。定常領域は、抗原の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を呈する。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体は、クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分けられ、これらの幾つかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などのサブクラスに更に分けられうる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びｍと呼ばれる。５つの抗体クラス全てに見られる軽鎖定常領域はｋ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる。

「ヒト起源由来定常領域」なる用語は、本出願において使用される場合、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ又はラムダ領域を意味する。このような定常領域は当分野の水準においてよく知られており、例えばKabat, E.A.に記載されている(例えばJohnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788を参照)。

好ましくは、発明による二重特異性二価抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの定常領域を有する。

ＩｇＧ４サブクラスの抗体は低減されたＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合を示すが、他ＩｇＧサブクラスの抗体は結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７ (Ｆｃ糖質欠如)、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、及びＨｉｓ４３５は、変更されると、同様に低減されたＦｃ受容体結合を提供する残基である(Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP0307434)。

一実施態様では、発明による抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して低減されたＦｃＲ結合を有し、二重特異性二価抗体は、Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５及び／又はＤ２６５において変異を有するＩｇＧ４サブクラス又はＩｇＧ１サブクラスのＦｃＲに関して、及び／又はＰＶＡ２３６変異を有する。

発明の別の態様では、二重特異性二価抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）第二抗原に特異的に結合する第二完全長抗体の重鎖及び軽鎖
を含んでなることを特徴とし、
重鎖のＮ末端はペプチドリンカーによって軽鎖のＣ末端に結合され、
可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている。

好ましくは、この二重特異性二価抗体フォーマットのＣＨ３ドメインは、例えばＷＯ９６／０２７０１１, Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; and Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681に幾つかの例と共に詳細に記載されてる「ノブ-インツ-ホール」技術によって変更される。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用面は、これらの２つのＣＨ３ドメインを有する両重鎖のヘテロ二量体化を増加するように変更される。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々は「ノブ」であり得、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はヘテロ二量体を安定化し(Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)、収率を増加させる。更なる詳細及び実施態様については、上記を参照のこと。

発明の別の態様では、二重特異性二価抗体は、
ａ） 第一抗原に特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ） 第二抗原に特異的に結合する第二完全長抗体の重鎖及び軽鎖
を含んでなることを特徴とし、
重鎖のＮ末端はペプチドリンカーによって軽鎖のＣ末端に結合され、
可変ドメインＶＬ及びＶＨは互いに置換されている。

二重特異性二価抗体フォーマットの例示的スキームが図２ｂに示され、ノブ−インツ−ホール修飾ＣＨ３ドメインを含む。この二重特異性二価抗体フォーマットに基づく抗体は、実施例においてＯＡｓｃＸＦａｂ１と呼ばれる。

一実施態様では、このような二重特異性抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：３９、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：４０、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：３８
を含んでなることを特徴とする。

発明の別の態様はでは、二重特異性二価抗体は、
ａ）第一抗原に特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ａ）第二抗原に特異的に結合する第二完全長抗体の重鎖及び軽鎖、
を含んでなることを特徴とし、
重鎖のＮ末端はペプチドリンカーによって軽鎖のＣ末端に結合され、
定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置換されている。

二重特異性二価抗体フォーマットの例示的スキームが図２ｃに示され、ノブ-インツ-ホール修飾ＣＨ３ドメインを含む。この二重特異性二価抗体フォーマットに基づく抗体は、実施例においてＯＡｓｃＸＦａｂ２及びＯＡｓｃＸＦａｂ３と呼ばれる。

一実施態様では、このような二重特異性抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：４２、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：４３、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：４１
を含んでなることを特徴とする。

一実施態様では、このような二重特異性抗体は、
ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：４５、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：４６、及び
ｂ）ペプチドリンカーを介して第二完全長抗体の軽鎖に連結される第二完全長抗体の重鎖として配列番号：４４
を含んでなることを特徴とする。

発明による抗体は、組換え手段によって生産される。このように、本発明の一態様は、発明による抗体をコードする核酸であり、更なる態様は、発明による抗体をコードする前記核酸を含んでなる細胞である。組換え生産のための方法は当分野の水準で広く知られており、原核生物及び真核生物細胞におけるタンパク質発現、及びその後の抗体ポリペプチドの単離、そして通常は薬学的に許容可能な純度までの精製を含む。宿主細胞における上述の抗体の発現については、それぞれの修飾された軽及び重鎖をコードする核酸が、標準的な方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核生物又は真核生物宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又は大腸菌細胞において実施され、抗体が該細胞(上澄又は溶解後の細胞)から回収される。抗体の組換え生産の一般的な方法は当分野の水準においてよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説に記載されている。

従って、発明の一実施態様は、発明による二重特異性抗体の調製方法であって、
ａ）前記抗体をコードしている核酸分子を含んでなるベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程；及び
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する工程
を含んでなる。

二重特異性抗体は、例えば、プロテインＡ-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの一般的な免疫グロブリン精製方法によって、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用して容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源としての役割を果たす。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに挿入され得、次いでこれは他に免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。

二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体（又はミュータント）は、適切なヌクレオチド変化を抗体ＤＮＡに導入することによって、又はヌクレオチド合成によって調製される。このような修飾は、しかしながら、非常に限られた範囲においてのみ実施されうる。例えば、修飾は、ＩｇＧアイソタイプ及び抗原結合などの上述の抗体特性を変更しないが、組換え生産の収率、タンパク質安定性を改善し得、又は精製を容易にしうる。

「宿主細胞」なる用語は、本出願において使用される場合、本発明による抗体を生成するために操作されうる任意の細胞システムを意味する。一実施態様では、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が宿主細胞として使用される。ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」なる表現は互換可能に使用され、かかる全ての表現は子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」なる言葉は、転換の回数に関わらず、一次対象細胞及びそれらに由来する培養物を含む。また、全ての子孫が、故意又は偶発の変異により、ＤＮＡ内容物において正確に同一ではない場合があることが理解される。もともとの形質転換細胞に対してスクリーニングされるのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。

ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; and Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現システム(HEK 293)は、Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 and by Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。

原核生物に適したコントロール配列は、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

核酸は、別の核酸配列と機能的関係で配されている場合、「作用可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結されており；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は、近接し、かつ読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、一般的な手法に従って使用される。

抗体の精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当分野でよく知られている他のものを含む標準的な技術によって、細胞成分又は他の混入物、例えば他細胞核酸又はタンパク質を除去するために実施される。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照。異なる方法が十分に確立され、タンパク質精製のために広く使用されており、例えば微生物タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）及び混合モードイオン交換）、チオフィリック（thiophilic）吸着（例えば、β-メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを用いたもの）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル-セファロース、アザ-アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、又はｍ-アミノフェニルボロン酸を用いたもの）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）-及びＣｕ（ＩＩ）-アフィニティ物質を用いたもの）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）などがある（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。

本発明によるヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ-２に対する二重特異性抗体は、有益な特性、例えば高い安定性及び及び有益な薬物動態／薬力学特性、例えば（例えば低用量で）良好な（すなわち、ゆっくりした）クリアランスを有することが発見された。

発明による二重特異性二価抗体は、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ-２標的治療を必要としているヒト患者に利益を示す。

更に、それらは、生物学的又は薬理学的活性を有し、インビボ腫瘍増殖阻害及び／又は腫瘍血管新生の阻害を示す。

発明による二重特異性抗体は、
ａ）腫瘍増殖阻害（例えば、発明による二重特異性抗体により、腫瘍停滞が、２つの単一特異性抗体の組合せと比較して低濃度ですでに得られ得る）（例えば、実施例９及び１０のＣｏｌｏ２０５及びＫＰＬ-４腫瘍モデルでは、腫瘍停滞が、１０ｍｇ／ｋｇのＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６＋１０ｍｇ／ｋｇのアバスチンの組合せと比較して、１０ｍｇ／ｋｇのＸＭＡｂ１によってすでに得られた）、及び／又は
ｂ）腫瘍血管新生又は血管疾患の阻害（例えば、発明による二重特異性抗体による最大抗血管新生効果が、２つの単一特異性抗体の組合せと比較して低濃度ですでに得られ得る）（例えば、実施例８のマウス角膜血管新生アッセイでは、最大抗血管新生効果が、１０ｍｇ／ｋｇのＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６＋１０ｍｇ／ｋｇのアバスチンの組合せと比較して、１０ｍｇ／ｋｇのＸＭＡｂ１を用いて既に達成された）
において非常に効果的である。

最後に、本発明によるヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ-２に対する二価二重特異性は、有益な効果／毒性プロファイルを有し得、抗ＶＥＧＦ及び抗ＡＮＧ-２治療を必要としている患者に利益をもたらしうる。

発明の一態様は、発明による抗体を含んでなる薬学的組成物である。発明の別の態様は、薬学的組成物の製造のための、発明による抗体の使用である。発明の更なる態様は、発明による抗体を含んでなる薬学的組成物の製造方法である。別の態様では、本発明は、薬学的担体と共に製剤化される本発明による抗体を含有する組成物、例えば薬学的組成物を提供する。

発明の一実施態様は、癌の治療のための発明による二重特異性抗体である。

発明の別の態様は、癌の治療のための前記薬学的組成物である。

発明の別の態様は、癌の治療に対する医薬の製造のための、発明による抗体の使用である。

発明の別の態様は、癌を患っている患者の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に発明による抗体を投与することによって為される。

発明の別の態様は、転移の防止のための前記薬学的組成物である。

発明は、転移の防止のために、発明による二重特異性抗体を含む。

発明の別の態様は、転移の防止に対する医薬の製造のための、発明による二重特異性抗体の使用である。

発明の別の態様は、原発癌を患っている患者における転移予防の方法であって、かかる予防治療を必要としている患者に発明による二重特異性抗体を投与することによって為される。

我々は、インビボの同所性及び皮下性癌モデルにおいて、自然転移／二次腫瘍の非常に効果的な防止を示すことができた（実施例９を参照）（腫瘍細胞が静脈内に注入される実験モデルとは対照的に、これは臨床条件と類似し、細胞が原発腫瘍から広まり、肺又は肝臓などの二次臓器（二次腫瘍）に転移する）。

発明による「転移」なる用語は、原発腫瘍から患者の他の一又は複数の部位への癌細胞の伝達を指し、そこでは次いで二次腫瘍が発生する。癌が転移したか決定するための手段は当分野で知られており、骨スキャン、胸部Ｘ線、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩスキャン、及び腫瘍マーカーテストを含む。

「転移の防止」又は「二次腫瘍の防止」なる用語は、ここで使用される場合、同じ意味を持ち、原発腫瘍から患者の他の一又は複数の部位への癌細胞の更なる伝達を阻害又は低減する、癌を患っている患者における転移に対する予防手段を指す。これは、原発性の腫瘍又は癌の転移が防止、遅延、又は低減されることを意味し、これにより、二次腫瘍の発生が防止、遅延、又は低減される。好ましくは、転移、すなわち肺の二次腫瘍が防止又は低減され、これは原発腫瘍から肺への癌細胞の転移性伝達が防止又は低減されることを意味する。

ここで使用される場合、「薬学的な担体」は、生理学的に適合性のある任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延化剤等を含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば注射又は注入による）に適している。

本発明の組成物は当該技術分野において知られている様々な方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は態様は所望される結果に応じて変わる。ある投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、その不活性化を防止するための材料で化合物を被覆し、又はそれと共に化合物を同時投与することが必要である場合がある。例えば、化合物はリポソーム又は希釈剤等の適切な担体で被験者に投与されうる。薬物学的に許容可能な希釈剤は、生理食塩水及び緩衝水溶液を含む。薬物学的な担体は、滅菌水溶液又は分散体、及び滅菌注射用溶液又は分散体の即時調製のための滅菌パウダーを含む。薬物学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野で知られている。

ここで使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」なる語句は、通常は注射による、経腸と局所投与以外の投与態様を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外、胸骨内への注射及び注入を含む。

ここで使用される「癌」なる用語は、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部もしくは頚部の癌、皮膚もしくは眼内メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（stomach cancer、gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓もしくは尿道の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫を指し、上記癌の何れかの難治性型、又は上記癌の一又は複数の組み合わせを含む。

発明の別の態様は、抗血管新生剤としての発明による二重特異性抗体又は前記薬学的組成物である。このような抗血管新生剤は、癌、特に固形腫瘍、及び他の血管疾患の治療に使用されうる。

発明の一実施態様は、血管疾患の治療のための、発明による二重特異性抗体である。

発明の別の態様は、血管疾患の治療のための前記薬学的組成物である。

発明の別の態様は、血管疾患の治療に対する医薬の製造のための、発明による抗体の使用である。

発明の別の態様は、血管疾患を患っている患者の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に発明による抗体を投与することによって為される。

「血管疾患」なる用語は、癌、炎症性疾患、性動脈硬化症、虚血症、外傷、敗血症、ＣＯＰＤ、喘息、糖尿病、ＡＭＤ、網膜障害、脳卒中、肥満症、急性肺傷害、出血、脈管漏出、例えばサイトカイン誘発アレルギー、Ｇｒａｖｅｓ病、橋本自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞動脈炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、クローン病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、特に固形腫瘍、眼内新生血管症候群、例えば増殖性網膜症又は加齢性網膜黄斑部変性（ＡＭＤ）、慢性関節リウマチ、及び乾癬を含む（Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; and Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp 1625-1710）。

このような組成物はまた、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含みうる。微生物の存在の防止は、上掲の滅菌方法、又は様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸及び同様なものの包含双方によって確実にされうる。また、組成物に、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム、及び同様なものを含むことが所望されうる。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることにより、注射可能な薬学的形態の長期吸収がもたらされうる。

選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用されてもよい本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られた一般的な方法により、薬学的に許容可能な投薬形態に製剤化される。

本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性とならないで、特定の患者、組成物、投与態様に対して、所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分量が得られるように変化させうる。選択される投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、投与経路、投与時間、用いられる特定化合物の排出率、治療期間、他の薬剤、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康及び先の医療歴、及び医学分野でよく知られた類似の要因を含む様々な薬物動態学的因子に依存するであろう。

組成物は、無菌で、組成物がシリンジにより送達可能な程度に流動的でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張緩衝生理食塩水である。

適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散体の場合は要求される粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを含めることが好ましい。

ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という表現は互換可能に用いられ、全てのそのような標記は子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句は、一次対象細胞及び何度培養が継代されたかに関わらず初代のものから誘導された培養を含む。全ての子孫が、故意又は偶発の変異により、DNA内容物において正確に同一ではない場合があることが理解される。元々の形質転換細胞についてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。区別される標記が意図される場合は、文脈から明らかであろう。

ここで使用される「形質転換」なる用語は、宿主細胞中へのベクター／核酸のトランスファープロセスを意味する。恐るべき細胞壁障壁のない細胞が宿主細胞として使用される場合、形質移入は、例えばGraham, F., L.,及びvan der Eb, Virology 52 (1973) 456-467により記載されるようなリン酸カルシウム沈殿法により実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合等による細胞中へのＤＮＡの導入のための他の方法がまた使用されうる。原核生物細胞又は実質的な細胞壁構成を含む細胞が使用される場合、例えば一つの形質移入法は、Cohen, S.N.等, PNAS 69 (1972) 2110-2114により記載される塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。

ここで使用される場合、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（また、転写物とも称される）がその後ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的には、遺伝子産物と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核生物細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。

「ベクター」とは、挿入された核酸分子を宿主細胞中及び／又は宿主細胞間にトランスファーする核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。該用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体組込み）のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。一以上の記載された機能を提供するベクターもまた含まれる。

「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入された場合、転写され、翻訳されてポリペプチドになるポリヌクレオチドである。「発現系」は通常は、所望の発現産物を産出するように機能可能な発現ベクターから成る適切な宿主細胞を指す。

以下の実施例、配列表及び図は、本発明の理解を援助するために提供され、その真の範囲は添付の請求の範囲に記載される。発明の精神から逸脱することなしで記載された手順に変更をなすことができることが理解される。

実験手順
実施例
材料及び一般的方法
ヒト免疫グロブリン軽及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に提供されている。抗体鎖のアミノ酸はEU番号付けに従って番号付けされ参照される(Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))。

組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるように標準的な方法をＤＮＡの操作に使用した。分子生物学試薬を製造者の説明に従い使用した。

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、化学合成によって作成されるオリゴヌクレオチドから調製される。特異制限エンドヌクレアーゼ切断部位にはさまれる遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーションによって組立て、その後、指示制限部位、例えばＫｐｎＩ／ＳａｃＩ又はＡｓｃＩ／ＰａｃＩによって、ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ (Stratagene)に基づくｐＧＡ４クローニングベクター中にクローン化した。サブクローン化遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。

遺伝子合成断片を、Ｇｅｎｅａｒｔ(Regensburg, Germany)で得られる規格に従い注文した。Ａｎｇ-２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の軽及び重鎖をコードする全遺伝子セグメントを、真核生物細胞における分泌のためのタンパク質を標的にするリーダーペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードする５’-端ＤＮＡ配列、及び合成遺伝子の５’及び３’端のユニーク制限部位を用いて合成した。ジスルフィド安定化「ノブ-インツ-ホール」修飾重鎖を担持するＤＮＡ配列を、「ノブ」重鎖におけるＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ変異、及び「ホール」重鎖におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を用いて設計した。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を、MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany)又はSequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany)で実施される二本鎖配列決定によって決定した。

ＤＮＡ及びタンパク質配列分析及び配列データ管理
ＧＣＧ(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)ソフトウェアパッケージversion 10.2及びInfomax's Vector NT1 Advance suite version 8.0を、配列作成、マッピング、分析、アノテーション及び図説のために使用した。

発現ベクター
記載した抗体の発現のために、ＣＭＶ-Ｉｎｔｒｏｎ ＡプロモーターによるｃＤＮＡ構成又はＣＭＶプロモーターによるゲノム構成に基づいての一過性発現（例えばＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ又はＨＥＫ２９３-Ｆ）細胞又は安定発現（例えばＣＨＯ細胞）のための発現プラスミドの変異体を使用した。

抗体発現カセットの他に、ベクターは次のものを含んだ：
− 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製の起点、及び
− 大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子。
抗体遺伝子の転写ユニットは次の要素から成る：
− ５’末端のユニーク制限部位
− ヒトサイトメガロウイルスからの最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ｃＤＮＡ構成の場合、続くイントロンＡ配列、
− ヒト抗体遺伝子の５’-非翻訳領域、
− 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− ｃＤＮＡとしての又は免疫グロブリンエキソン-イントロン構成を伴ってのゲノム構成としてのヒト抗体鎖（重鎖、修飾重鎖又は軽鎖）、
− ポリアデニル化シグナル配列を有する３’未翻訳領域、及び
− ３’末端でのユニーク制限部位。

一過性及び安定トランスフェクションのために、より多量なプラスミドを、形質転換された大腸菌培養物(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)からのプラスミド調製により調製した。

細胞培養技法
標準の細胞培養技法を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載されるように使用した。

ＨＥＫ２９３-Ｆシステムにおける一過性トランスフェクション
組換え免疫グロブリン変異体を、製造者の指示に従いFreeStyle^ＴＭ 293発現システムを用いて、ヒト胎児由来腎臓２９３-Ｆ細胞の一過性トランスフェクションにより発現させた(Invitrogen, USA)。簡単には、懸濁FreeStyle^ＴＭ 293-F細胞を、FreeStyle^ＴＭ 293発現培地において３７°Ｃ／８ ％ＣＯ_２で培養し、細胞を、トランスフェクションの日に１−２ｘ１０^６生細胞／ｍｌの密度で新鮮な培地に播種した。DNA-293fectin^ＴＭ複合体を、単一特異性親抗体の２５０ｍｌの最終トランスフェクション体積に対し、３２５μｌの293fectin^ＴＭ (Invitrogen, Germany)及び２５０μｇの重及び軽鎖プラスミドＤＮＡを１：１モル比において使用して、Opti-MEM（登録商標）Ｉ培地(Invitrogen, USA)において調製した。２つの重鎖及び１つの軽鎖を有する「ノブ-インツ-ホール」DNA-293fectin複合体を、２５０ｍｌの最終トランスフェクション体積（ＯＡｓｃＦａｂ及びＯＡｓｃＸＦａｂ）に対し、３２５μｌの293fectin^ＴＭ (Invitrogen, Germany)及び２５０μｇの「ノブ-インツ-ホール」重鎖１及び２及び軽鎖プラスミドＤＮＡをおおむね１：１：１のモル比において使用して、Opti-MEM（登録商標）Ｉ培地(Invitrogen, USA)において調製した。発現収率の最適化により該比は異なりうる。ＸＭａｂ DNA-293fectin複合体を、２５０ｍｌの最終トランスフェクション体積に対し、３２５μｌの293fectin^ＴＭ (Invitrogen, Germany)及び２５０μｇの「ノブ-インツ-ホール」重鎖１及び２及び軽鎖プラスミドＤＮＡを１：１：１：１のモル比において使用して、Opti-MEM（登録商標）Ｉ培地(Invitrogen, USA)において調製した。発現収率の最適化に対して該比は異なりうる。抗体を含む細胞培養上清を、トランスフェクションの７日後、３０分間、１４０００ｇでの遠心分離によって収穫し、滅菌フィルター（０．２２μｍ）を通して濾過した。上清を、精製まで、−２０°Ｃで保管した。

タンパク質決定
精製された抗体及び誘導体のタンパク質濃度を、Pace, C.N., et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423によるアミノ酸配列に基づいて算出したモル消衰係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することにより決定した。

上清における抗体濃度決定
細胞培養上清液における抗体及び誘導体の濃度を、プロテインＡアガロースビーズ（Roche）による免疫沈澱法により推定した。６０μｌのプロテインＡアガロースビーズを、ＴＢＳ-ＮＰ４０(50mM Tris, pH7.5, 150mM NaCl, 1% Nonidet-P40)において３回洗浄した。続いて、１〜１５ｍｌの細胞培養上清液を、ＴＢＳ-ＮＰ４０においてプレ平衡化されたプロテインＡアガロースビーズに適用した。室温での１時間のインキュベーションの後、ビーズを、Ultrafree- MC-filterカラム (Amicon)上で、０．５ｍｌのＴＢＳ-ＮＰ４０により１回、０．５ｍｌの２×リン酸緩衝溶液（２×ＰＢＳ, Roche）により２回、そして０．５ｍｌの１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）により、すばやく４回、洗浄した。結合抗体を、３５μｌのＮｕＰＡＧＥ（商標登録）ＬＤＳサンプルバッファー(Invitrogen)の添加により溶出した。サンプルの半分をそれぞれ、ＮｕＰＡＧＥ（商標登録）サンプル還元剤と組み合わすか、又は末還元のままにし、そして７０℃で１０分間、加熱した。そして、２０μｌを、４−１２％ ＮｕＰＡＧＥ（商標登録）Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥに対しＭＯＰＳ緩衝液、及び還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥに対し、ＮｕＰＡＧＥ（商標登録） 抗酸化ランニング緩衝液添加剤（Invitrogen）と共にＭＥＳ緩衝液を用いる）に適用し、そしてクーマシーブルーを用いて染色した。

細胞培養上清液における抗体及び誘導体の濃度を、プロテインＡ-ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって測定した。簡単には、プロテインＡに結合する抗体及び誘導体を含む細胞培養上清液を、５０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３）においてHiTrapプロテインAカラム(GE Healthcare)に適用し、Dionex HPLC-Systemにおいて、５５０ｍＭの酢酸を用いてマトリックスから溶出した。溶出されたタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク領域の積分により定量化した。精製された標準のＩｇＧ１抗体が、標準として作用した。

あるいは、細胞培養上清液における抗体及び誘導体の濃度を、Sandwich-IgG-ELISAにより測定した。簡単には、StreptaWell High Bind Strepatavidin A-96 ウエルマイクロタイタープレート (Roche)を、１００μｌ／ウェルのビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕獲分子Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ-Ｆｃガンマ＞ＢＩ(Dianova)により、０．１μｇ／ｍｌで室温で１時間、あるいは４℃で一晩、被覆し、その後、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（PBST, Sigma）を用いて３回、洗浄した。それぞれの抗体含有細胞培養上清液のＰＢＳ(Sigma)中における１００μＬ／ｗｅｌｌの希釈系列を、ウェルに加え、室温でマイクロタイタープレートシェーカー上で１−２時間インキュベートした。ウェルを、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴにより３回、洗浄し、そして結合された抗体を、室温でマイクロタイタープレートシェーカー上で１−２時間、検出抗体として０．１μｇ／ｍｌでの１００μｌのＦ（ａｂ’）２＜ｈＦｃガンマ＞ＰＯＤ(Dianova)により検出した。結合されなかった検出抗体を、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴにより３回、洗浄し、そして結合された検出抗体を１００μｌのＡＢＴＳ／ウェルの添加により検出した。吸光度の決定を、Tecan Fluor分光計で、４０５ｎｍの測定波長（４９２ｎｍの参照波長）で実施した。

二重特異性抗体の精製
二重特異性抗体を、Protein A-Sepharose^TM (GE Healthcare, Sweden)を使用するアフィニティークロマトグラフィー及びSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーにより、細胞培養上澄から精製した。簡単には、滅菌濾過細胞培養上澄を、PBSバッファー(10 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl and 2.7mM KCl, pH 7.4)を用いて平衡化したHiTrap ProteinA HP（５ｍｌ）カラムに適用した。非結合タンパク質を平衡バッファーを用いて洗浄した。抗体及び抗体変異体を、０．１Ｍのクエン酸バッファー（ｐＨ２．８）を用いて溶出し、タンパク質含有画分を０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５を用いて中和した。次いで、溶出タンパク質画分をプールし、3mlの体積までAmicon Ultra centrifugal filter device (MWCO: 30 K, Millipore)を用いて濃縮し、 20mM Histidin, 140 mM NaCl, pH 6.0を用いて平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60 gel濾過カラム(GE Healthcare, Sweden)に搭載した。高分子量凝集５％未満の精製された二重特異性抗体を有する画分をプールし、−８０°Ｃで１．０ｍｇ／ｍｌのアリコートとして保管した。

ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（商標登録）Ｐｒｅ-Ｃａｓｔゲルシステム(Invitrogen)を、その製造業者の指示に従って使用した。具体的には、４−２０％ＮｕＰＡＧＥ（商標登録）Ｎｏｖｅｘ（商標登録）TRIS-Glycine Pre-Cast gels及びNovex（商標登録）TRIS-Glycine SDSランニングバッファーを使用した。(例えば図３を参照)。サンプルの還元を、ゲルのランニング前にＮｕＰＡＧＥ（登録商標）サンプル還元剤によって行った。

分析サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー処理を、HPLCクロマトグラフィーにより実施した。簡単には、プロテインA精製された抗体を、Agilent HPLC 1100システムにおいて、300mM NaCl, 50mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5におけるTosoh TSKgel G3000SWカラムに、又はDionex HPLC-システムにおいて、2xPBSにおけるSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に適用した。溶出されたタンパク質を、UV吸光度及びピーク領域の積分により定量化した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901が、標準として作用した。(例えば図４を参照)。

質量分析法
クロスオーバー抗体の全体の脱グリコシル化の質量を、電子噴霧イオン化質量分析（ＥＳＩ-ＭＳ）により決定し、確認した。手短に言及すると、１００μｇの精製された抗体を、１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）中において５０ｍＵのN-Glycosidase F (PNGaseF, ProZyme)により、３７℃で１２−２４時間、２ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質濃度で脱グリコシル化し、そして続いてSephadex G25カラム(GE Healthcare)においてＨＰＬＣにより脱塩した。それぞれのＨ及びＬ鎖の質量を、脱グリコシル化及び還元の後、ＥＳＩ−ＭＳにより決定した。手短に言及すると、１１５μｌ中における５０μｇの抗体を、６０μｌの１ＭのＴＣＥＰ及び５０μｌの８Ｍのグアニジン塩酸塩と共にインキュベートし、続いて脱塩した。全質量及び還元された重及び軽鎖の質量を、NanoMate源を具備するQ-Star Elite MSシステムにおいてESI-MSにより決定した。

ＨＥＫ２９３-Ｔｉｅ２細胞株の生成
アンジオポエチン-２抗体のＡＮＧＰＴ２刺激Ｔｉｅ２リン酸化への干渉、及び細胞上におけるＴｉｅ２へのＡＮＧＰＴ２の結合を決定するために、組換えＨＥＫ２９３-Ｔｉｅ細胞株を生成した。簡単には、ＣＭＶプロモーターのコントロール下で完全長ヒトＴｉｅ２（配列番号：１０８）をコードするｐｃＤＮＡ３をベースにするプラスミド(RB22-pcDNA3 Topo hTie2)及びネオマイシン耐性マーカーを、トランスフェクション剤としてFugene (Roche Applied Science)を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトし、耐性細胞をＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ、５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８において選択した。個々のクローンをクローニングシリンダーによって単離し、その後、ＦＡＣＳによってＴｉｅ２発現を分析した。クローン２２が、Ｇ４１８の非存在下においても高く安定したＴｉｅ２発現を有するクローンとして同定された（ＨＥＫ２９３-Ｔｉｅ２ クローン２２）。ＨＥＫ２９３-Ｔｉｅ２ クローン２２をその後、細胞アッセイに使用した：ＡＮＧＰＴ２誘発Ｔｉｅ２リン酸化及びＡＮＧＰＴ２細胞リガンド結合アッセイ。

ＡＮＧＰＴ２誘発Ｔｉｅ２リン酸化アッセイ
ＡＮＧＰＴ２抗体によるＡＮＧＰＴ２誘発Ｔｉｅ２リン酸化の阻害を、次のアッセイ原則に従って測定した。ＨＥＫ２９３-Ｔｉｅ２ クローン２２を、ＡＮＧＰＴ２抗体の有無において５分間、ＡＮＧＰＴ２で刺激し、Ｐ−Ｔｉｅ２をサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。簡単には、ウェルあたり２ｘ１０５のＨＥＫ２９３-Ｔｉｅ２クローン２２細胞を一晩、１００μｌ ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、５００μｇ／ｍｌジェネテシン中において、ポリ-Ｄ-リシンでコートされた９６ウェルにおいて増殖させた。翌日、ＡＮＧＰＴ２抗体のtitration rowをマイクロタイタープレートにおいて調製し（４倍濃度、７５μｌの最終量／ウェル、２つ組）、７５μｌのＡＮＧＰＴ２ (R&D systems # 623-AN]希釈(四倍濃度溶液として３．２ μｇ／ｍｌ）と混合した。抗体及びＡＮＧＰＴ２を、室温で１５分間プレインキュベートした。１００μｌの混合物をＨＥＫ２９３-Ｔｉｅ２クローン２２細胞に加え（1 mM NaV3O4, Sigma #S6508で５分間プレインキュベートし）、３７°Ｃで５分間インキュベートした。その後、細胞を、２００μｌの氷冷ＰＢＳ＋１ｍＭのＮａＶ３Ｏ４／ウェルで洗浄し、氷上において120μlの溶解バッファー (20mM Tris, pH 8.0, 137 mM NaCl, 1% NP-40, 10% glycerol, 2mM EDTA, 1 mM NaV3O4, 1 mM PMSF 及び10 μg/ml Aprotinin)／ウェルの添加によって溶解させた。細胞をマイクロタイタープレートシェーカー上で４°Ｃで３０分間溶解させ、１００μｌの溶解物を、事前の遠心分離及び全タンパク質決定を行うことなく、ｐ-Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート(R&D Systems, R&D #DY990)に移した。Ｐ-Ｔｉｅ２量を、製造者の指示に従って定量化し、阻害のＩＣ５０値をXLfit4 analysis plug-in for Excel (Dose-response one site, model 205)を使用して決定した。ＩＣ５０値を実験内で比較することができるが、実験ごとに異なりうる。

ＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
ＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Promocell #C-12200) 増殖を、ＶＥＧＦ抗体の細胞機能を測定するために選択した。簡単には、９６ウェルあたり、５０００のＨＵＶＥＣ細胞(low passage number,≦5 passages)を、コラーゲンＩでコートされたBD Biocoat Collagen I 96ウェルマイクロタイタープレート(BD #354407 / 35640）において、１００μｌの飢餓培地(EBM-2 Endothelial basal medium 2, Promocell # C-22211, 0.5% FCS, Penicilline/Streptomycine)中において一晩インキュベートした。様々な濃度の抗体をｒｈＶＥＧＦ(３０ｎｇ１／ｍｌの最終濃度, BD # 354107)と混合し、室温で１５分間プレインキュベートした。その後、混合物をＨＵＶＥＣ細胞に加え、それらを７２時間、３７°Ｃ、５％ＣＯ２でインキュベートした。分析の日に、プレートを３０分間室温に平衡化させ、細胞生存度／増殖を、マニュアルに従いCellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assayキットを使用して決定した(Promega, # G7571/2/3)。蛍光を分光光度計において決定した。

実施例 １ａ
二重特異性二価ドメイン交換二重特異性二価ドメイン交換抗体分子ＸＭａｂの発現及び精製
上の材料及び方法に記載される手順に従い、二重特異性二価ドメイン交換＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体分子ＸＭａｂ１、ＸＭａｂ１及びＸＭａｂ３を発現させ、精製した。＜ＶＥＧＦ＞部分のＶＨ及びＶＬ（配列番号：１及び配列番号：２）はベバシズマブに基づく。＜ＡＮＧ２＞部分のＶＨ（配列番号：３）を、ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６のＶＨ配列のＥ６Ｑ変異（位置６のオリジナルのアミノ酸グルタミン酸（Ｅ）をグルタミン（Ｑ）で置換した）から得た（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７１８２（ＷＯ２０１０／０４０５０８）に記載され、ファージディスプレイによって得られた配列のさらに成熟された断片である）。＜ＡＮＧ２＞部分のＶＬ（配列番号：４）を、ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６のＶＬ配列から得た（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７１８２（ＷＯ２０１０／０４０５０８）を参照）。二重特異性二価ドメイン交換＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体ＸＭａｂ１、ＸＭａｂ２及びＸＭａｂ３を発現させ、精製した。これらの二重特異性二価抗体の関連軽及び重鎖アミノ酸配列を、配列番号：５−８（ＸＭａｂ１）、配列番号：９−１２（ＸＭａｂ２）、及び配列番号：１３−１６（ＸＭａｂ３）に記載する。

例示的な構造については図1を参照のこと。

二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体ＸＭａｂ４、ＸＭａｂ５及びＸＭａｂ６（関連軽及び重鎖アミノ酸配列を、配列番号：１７−２０（ＸＭａｂ４）、配列番号：２１−２４（ＸＭａｂ５）、及び配列番号：２５−２８（ＸＭａｂ６）に記載する）を同様に発現させ、精製させる。
結合親和性及び他の特性を記載のように決定した。

実施例 １ｂ
二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体分子ＯＡｓｃＦａｂの発現及び精製
上の材料及び方法に記載される手順に従い、二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体分子ＯＡｓｃＦａｂ１、ＯＡｓｃＦａｂ２、ＯＡｓｃＦａｂ３を発現させ、精製した。＜ＶＥＧＦ＞部分のＶＨ及びＶＬ（配列番号：１及び配列番号：２）はベバシズマブに基づく。＜ＡＮＧ２＞Ｅ６Ｑ部分のＶＨ（配列番号：３）を、ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６のＶＨ配列のＥ６Ｑ変異（位置６のオリジナルのアミノ酸グルタミン酸（Ｅ）をグルタミン（Ｑ）で置換した）から得た（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７１８２（ＷＯ２０１０／０４０５０８）に記載され、ファージディスプレイによって得られた配列のさらに成熟された断片である）。＜ＡＮＧ２＞Ｅ６Ｑ部分のＶＬ（配列番号：４）を、ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６のＶＬ配列から得た（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７１８２（ＷＯ２０１０／０４０５０８）（ＷＯ２０１０／０４０５０８）を参照）。これらの二重特異性二価抗体の関連軽及び重鎖アミノ酸配列を、配列番号：２９−３１（ＯＡｓｃＦａｂ１）、配列番号：３２−３４（ＯＡｓｃＦａｂ２）、及び配列番号：３５−３７（ＯＡｓｃＦａｂ３）に記載する。例示的な構造については図２ａを参照のこと。ＯＡｓｃＦａｂ１、ＯＡｓｃＦａｂ１、ＯＡｓｃＦａｂ２及びＯＡｓｃＦａｂ３の発現をウエスタンブロットによって確認した。ＯＡｓｃＦａｂ２及びＯＡｓｃＦａｂ３の精製から以下の収率を得た。

結合親和性及び他の特性を記載の通りに決定する。

実施例 １ｃ
二重特異性二価ドメイン交換＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体分子ＯＡｓｃＸＦａｂの発現及び精製
上の材料及び方法に記載される手順に従い、二重特異性二価ドメイン交換＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体分子ＯＡｓｃＸＦａｂ１、ＯＡｓｃＸＦａｂ２、ＯＡｓｃＸＦａｂ３を発現させ、精製した。＜ＶＥＧＦ＞部分のＶＨ及びＶＬ（配列番号：１及び配列番号：２）はベバシズマブに基づく。＜ＡＮＧ２＞Ｅ６Ｑ部分のＶＨ（配列番号：３）を、ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６のＶＨ配列のＥ６Ｑ変異（位置６のオリジナルのアミノ酸グルタミン酸（Ｅ）をグルタミン（Ｑ）で置換した）から得た（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７１８２（ＷＯ２０１０／０４０５０８）に記載され、ファージディスプレイによって得られた配列のさらに成熟された断片である）。＜ＡＮＧ２＞Ｅ６Ｑ部分のＶＬ（配列番号：４）を、ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６のＶＬ配列から得た（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７１８２（ＷＯ２０１０／０４０５０８）を参照）。これらの二重特異性二価抗体の関連軽及び重鎖アミノ酸配列を、配列番号：３８−４０（ＯＡｓｃＸＦａｂ１）、配列番号：４１−４３（ＯＡｓｃＸＦａｂ２）、及び配列番号：４４−４６（ＯＡｓｃＸＦａｂ３）に記載する。例示的な構造については、図２ｂ（ＯＡｓｃＸＦａｂ１）及び図２ｃ（ＯＡｓｃＸＦａｂ２，ＯＡｓｃＸＦａｂ３）を参照のこと。発現をウエスタンブロットによって確認した。

結合親和性及び他の特性を記載の通りに決定する。

実施例 ２
二重特異性抗体の安定性
変性温度（ＳＹＰＲＯオレンジ法）
タンパク質変性が生じる温度（すなわち、タンパク質構造の温度誘発喪失）を決定するために、疎水性環境において強い蛍光を示す疎水性蛍光色素（SYPROオレンジ, Invitrogen）を利用する方法を使用した。タンパク質変性により、疎水性パッチが溶媒にさらされ蛍光の増加に至る。変性温度より上の温度で蛍光強度は再度低下し、これにより最大強度が得られる温度が変性温度として定義される。該方法はEricsson, U.B., et al., Anal Biochem 357 (2006) 289-298 and He, F., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 99 (2010) 1707-1720に記載されている。

タンパク質サンプルを、２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中におよそ１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＳＹＰＲＯオレンジ（５０００ｘ原液）と混合させ、１：５０００の最終希釈を得た。２０μＬの体積を３８４ウェル-プレートに移し、温度依存蛍光をLightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR System (Roche Applied Sciences)において０．３６°Ｃ／分の加熱率で記録した。

動的光散乱（ＤＬＳ）による凝集温度
熱誘起タンパク質凝集が生じる温度を動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した。ＤＬＳは、マイクロ秒スケールによる散乱光強度の変動から、溶液中における巨大分子のサイズ分布に関する情報を出す。サンプルが徐々に加熱されると、凝集が特定の温度で開始され、粒子サイズの増加が生じる。粒子サイズが増加する温度が凝集温度として定義される。凝集及び変性温度は必ずしも同一である必要はなく、これは変性が必ずしも凝集に対する必要条件ではないからである。

凝集温度測定に対し、DynaPro DLS platereader(Wyatt technologies)を使用した。測定に先行して、サンプルを３８４-ウェルフィルタープレート(Millipore MultiScreen 384-well Filtration System, 0.45 μm)により濾過し、オプティカル３８４-ウェルプレート(Corning #3540)に入れた。３５μＬのサンプル体積を、製剤バッファー中（２０ｍＭ クエン酸、１８０ｍＭ スクロース、２０ｍＭ アルギニン、０．０２％ ポリソルベート２０）におよそ１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で使用した。各ウェルを、蒸発を避けるために２０μＬのパラフィンオイル（Ｓｉｇｍａ）で覆った。サンプルを０．０５°Ｃ／分の割合で２５°Ｃから８０°Ｃまで加熱し、ＤＬＳデータを、実行につき最大１５のサンプル数について連続的に得た。

ＤＬＳによる凝集率
凝集は強い光散乱シグナルを生じさせるため、ＤＬＳは溶液中における巨大分子の凝集を検出する高感度法である。従って、分子の凝集傾向は、ＤＬＳデータの反復取得により経時観察される。潜在凝集を実行レートに加速させるために、測定を５０°Ｃで実施した。

サンプルの調製を上記のように実施した。ＤＬＳデータを最大で１００時間まで記録した。凝集率（ｎｍ／日）を時間に対する平均直径の線形フィッティングの傾きとして算出した。

製剤バッファー中における安定性
二重特異性分子を凝集／断片化に関するそれらの安定性について評価するために、サンプルを、製剤バッファー（２０ｍＭクエン酸、１８０ｍＭ スクロース、２０ｍＭ アルギニン、０．０２％ ポリソルベート２０）中において、およそ１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で４０°Ｃで３週間インキュベートした。コントロールサンプルを−８０°Ｃで３週間貯蔵した。

凝集及び低分子量（ＬＭＷ）種の定量化のためにサイズ排除クロマトグラフィーをＨＰＬＣによって実施した。２５−１００μｇ量のタンパク質を、Ultimate3000 HPLC system (Dionex)において、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７．５中においてＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムに用いた。溶出タンパク質をＵＶ吸光により２８０ｎｍで定量化した。

実施例 ３：
二重特異性抗体＜ＶＥＧＦ-Ａｎｇ-２＞の結合特性
Ａ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析にり特徴付けられる結合特性
両抗原の同時結合を、BIAcore T100 instrument (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行うことにより確認した。ＶＥＧＦを標準的なアミンカップリング化学を使用してＣＭ５センサーチップに固定化した。第一工程では、＜ＶＥＧＦ-Ａｎｇ-２＞ＸＭＡｂを、２５°ＣのＨＢＳバッファー(10mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4)中に１０μｇ／ｍｌの濃度で注入した。固定化ＶＥＧＦへの抗体の結合後、ｈＡｎｇ-２を第二工程において１０μｇ／ｍｌで注入した（図３）。

更なる実験では、＜ＶＥＧＦ-Ａｎｇ-２＞ＸＭａｂの親和性及び結合キネティクスを決定した。簡潔には、ヤギ＜ｈＩｇＧ-Ｆｃガンマ＞ポリクローナル抗体を、Ａｎｇ-２及びＶＥＧＦに対する二重特異性抗体の提示のためにアミンカップリングによりＣＭ４チップ上に固定化した。結合を、ＨＢＳバッファー中において２５°Ｃ又は３７°Ｃで測定した。精製したＡｎｇ-２-Ｈｉｓ(R&D systems又はインハウス精製)又はＶＥＧＦ(R&D systems又はインハウス精製)を、溶液中に０．３７ｎＭ及び３０ｎＭの間、又は３．７ｎＭ及び２００ｎＭの間の様々な濃度で加えた。会合を３分間の注入により測定し；解離をチップをＨＢＳバッファーを用いて１０分間洗浄することにより測定し、ＫＤ値を１：１ラングミュア結合モデルを用いて推定した。Ａｎｇ-２調製物の不均一性により、１：１結合は観察されたなかった。したがって、ＫＤ値は見かけの値である。ＶＥＧＦに対する＜ＶＥＧＦ-Ａｎｇ-２＞ＸＭａｂの決定された親和性は極めて高く、算出したｏｆｆ-ｒａｔｅは３７°ＣであってもＢｉａｃｏｒｅ規格外であった。表１に両抗原に対する結合定数をまとめる。

Ｂ）結合活性二重特異性＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞ＸＭａｂ１の定量化のためのアッセイ
ＳＰＲ分析に加え、結合活性二重特異性ｍＡｂ＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞抗体の量を定量化するためにＥＬＩＳＡを実施した。このアッセイでは、第一工程においてｈＡｎｇ２がｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）のウェルに直接コートされる。一方、サンプル／参照基準（ｍＡｂ＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞）を別のＭＴＰのウェルにおいてジゴキシゲニン化ＶＥＧＦを用いてプレインキュベートした。プレインキュベーション及びコーティングの後、過剰な非結合Ａｎｇ２を、Ａｎｇ２でコートされたＭＴＰを洗浄することによって除去した。＜Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ＞及びＶＥＧＦ-Ｄｉｇのプレインキュベート混合物を次いで、ｈＡｎｇ２でコートされたＭＴＰに移しインキュベートした。インキュベーション後、過剰なプレインキュベーション溶液を洗浄により除去し、その後西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ジゴキシゲニン抗体でインキュベートした。抗体-酵素コンジュゲートはＡＢＴＳ（登録商標）基質の呈色反応を触媒する。シグナルをＥＬＩＳＡリーダーにより４０５ｎｍの波長（基準波長：４９０ｎｍ（［４０５／４９０］ｎｍ））で測定した。各サンプルの吸光度値を２つ組において決定した。（この試験システムを例示するスキームを図４に示し、定量化に対するＥＬＩＳＡのキャリブレーション曲線を図５に示す）。

実施例 ４
Ｔｉｅ２リン酸化
抗ＡＮＧＰＴ２関連活性が二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧＰＴ２＞抗体ＸＭＡｂ１において維持されていることを確認するために、Ｔｉｅ２リン酸化アッセイを実施した。ＸＭＡｂ１の効果を、上記のようにＡＮＧＰＴ２刺激Ｔｉｅ２リン酸化アッセイにおいて決定した。

ＸＭＡｂ１が、上記のようにＡＮＧＰＴ２刺激Ｔｉｅ２リン酸化アッセイにおいてＡＮＧＰＴ２刺激Ｔｉｅ２リン酸化を干渉することが示された。ＸＭＡｂ１に対するＩＣ５０は７．４ｎＭ＋／−２．３であった。

実施例 ５
Ｔｉｅ-２へのｈｕＡＮＧ-２結合の阻害（ＥＬＩＳＡ）
相互作用ＥＬＩＳＡを３８４ウェルマイクロタイタープレート(MicroCoat, DE, Cat.No.464718)において室温で実施した。各インキュベーション工程後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍｌのＴｉｅ-２タンパク質で１時間コートした。その後、ウェルを、０．２％Ｔｗｅｅｎ-２０及び２％ＢＳＡ (Roche Diagnostics GmbH, DE)で補充されたＰＢＳで１時間ブロックした。ＰＢＳ中における精製二重特異性Ｘｍａｂ抗体の希釈を０．２μｇ／ｍｌのhuAngiopoietin-2(R&D Systems, UK, Cat.No. 623-AN)と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化抗アンジオポエチン-２クローンＢＡＭ０９８１(R&D Systems, UK)及び１：３０００に希釈されたストレプトアビジンＨＲＰ(Roche Diagnostics GmbH, DE, Cat.No.11089153001)の混合物を１時間加えた。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、新鮮に調製されたＡＢＴＳ試薬(Roche Diagnostics GmbH, DE, buffer #204 530 001, tablets #11 112 422 001)で室温で３０分間展開させる。吸光度を４０５ｎｍで測定し、ＩＣ５０を決定した。ＸＭａｂ１は、１２ｎＭのＩＣ５０によるＴｉｅ-２へのＡＮＧ-２結合の阻害を示した。

実施例 ６
ｈＶＥＧＦ受容体へのｈＶＥＧＦ結合の阻害（ＥＬＩＳＡ）
試験を３８４ウェルマイクロタイタープレート(MicroCoat, DE, Cat.No. 464718)において室温で実施した。各インキュベーション工程後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。初めに、プレートを１μｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ-Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３２１-ＦＬ）で１時間コートした。その後、ウェルを０．２％ Ｔｗｅｅｎ-２０及び２％ＢＳＡ(Roche Diagnostics GmbH, DE)で補充されたPBSで1時間ブロックした。ＰＢＳ中における精製二重特異性ＸＭａｂ抗体の希釈を０．１５μｇ／ｍｌのｈｕＶＥＧＦ１２１(R&D Systems, UK, Cat.No. 298-VS)と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、０．５μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦクローンＭａｂ９２３(R&D Systems, UK)及び１：２０００の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ(GE Healthcare, UK, Cat.No.NA9310V)の混合物を１時間加えた。その後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。プレートを、新鮮に調製されたＡＢＴＳ試薬（Roche Diagnostics GmbH, DE, buffer #204 530 001, tablets #11 112 422 001)で室温で３０分間展開させた。吸光度を４０５ｎｍで測定し、ＩＣ５０を決定した。ＸＭａｂ１は、１０ｎＭのＩＣ５０によりＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦ結合の阻害を示した。

実施例 ７
ＨＵＶＥＣ増殖
抗ＶＥＧＦ関連活性が二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ２＞抗体ＸＭＡｂ１において維持されているか確認するために、ＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖アッセイを実施した。上記のようにＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおけるベバシズマブと類似した様式において、ＸＭＡｂ１がＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖を干渉することが示された。ＸＭＡｂ１は、親抗体ベバシズマブ（アバスチン）と類似して、濃度依存様式において、ＶＥＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖を阻害する。ＩＣ５０は、ベバシズマブについては１．１ｎＭ、ＸＭＡｂについては２．３ｎＭであった。

実施例 ８
マウス角膜微少ポケット血管新生アッセイ
８〜１０週の年齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスをCharles River, Sulzfeld, Germanyから購入した。プロトコルをRogers, M.S., et al., Nat Protoc 2 (2007) 2545-2550に記載される方法に従い変更した。簡潔には、約５００μｍの幅を有する微少ポケットを、麻酔マウスにおいて手術用ブレード及びシャープピンセットを用いて角膜の縁から頭頂におよそ１ｍｍのところに顕微鏡下で調製した。０．６ｍｍの直径を有するディスク(Nylaflo（登録商標）, Pall Corporation, Michigan)をインプラントし、インプラントの表面を滑らかにした。ディスクを対応する増殖因子又はビヒクルにおいて少なくとも３０分間インキュベートした。３、５及び７日後（又はあるいは３日後のみ）、眼を撮影し血管反応を測定した。アッセイを、角膜の全面積あたりの新しい血管の面積のパーセンテージを算出することによって定量化した。

ディスクに３００ｎｇのＶＥＧＦ又はコントロールとしてＰＢＳを搭載し、７日間インプラントした。縁からディスクへの血管の成長を３、５及び７日目に経時にモニタした。ディスクインプランテーションの一日前、抗体（＜Ａｎｇ-２／ＶＥＧＦ＞ＸＭＡｂ１、＜ｈＶＥＧＦ＞アバスチン（ベバシズマブ））を、アバスチン及びＸＭＡｂ１について１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。コントロールグループの動物はビヒクルを受けた。適用量は１０ｍｌ／ｋｇであった。

インビボにおけるＶＥＧＦ誘発血管新生に対するＸＭＡｂ１の効果を試験するために、我々はマウス角膜血管新生アッセイを実施した。このアッセイでは、ＶＥＧＦ浸漬Ｎｙｌａｆｌｏディスクが、無血管角膜のポケットに、縁上血管に対し固定距離でインプラントされる。血管は直ちに展開中のＶＥＧＦ勾配に対して角膜中に成長する。我々の結果はＸＭＡｂ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の全身性投与が、研究３〜５日目に、縁からＶＥＧＦ勾配への血管の成長をほぼ完全に阻害したことを示す（図６）。更なる実験では、直接比較試験を実施した。ディスクに３００ｎｇのＶＥＧＦ又はコントロールとしてＰＢＳを搭載し、３日間インプラントした。縁からディスクへの血管の増殖を３日目に経時にモニタした。ディスクインプランテーションの一日前に抗体（二重特異性＜Ａｎｇ-２／ＶＥＧＦ＞抗体ＸＭＡｂ１、親＜ＶＥＧＦ＞抗体ベバシズマブ（アバスチン）、親＜Ａｎｇ-２＞抗体ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６、及び＜ＶＥＧＦ＞抗体ベバシズマブ（アバスチン）及び＜Ａｎｇ-２＞抗体ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６の組合せ）を、ベバシズマブ（アバスチン）に対し１０ｍｇ／ｋｇ、ＸＭＡｂ１に対し１０ｍｇ／ｋｇ、ベバシズマブ（アバスチン）に対し１０ｍｇ／ｋｇ、ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６に対し１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。ベバシズマブ（アバスチン）及びＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６の組合せをベバシズマブ（アバスチン）に対し１０ｍｇ／ｋｇ、ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６に対し１０ｍｇ／ｋｇで投与した。コントロールグループの動物はビヒクルを受けた。適用量は１０ｍｌ／ｋｇであった。

我々の結果（図７及び下の表を参照）は、ＸＭＡｂ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の全身性投与が、ベバシズマブ及びＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６の組合せと同等に、研究３日目で、縁からＶＥＧＦ勾配への血管の成長をほぼ完全に阻害したことを示す。抗Ａｎｇ-２単剤治療は対照的に、ＶＥＧＦ誘発血管新生をわずかにのみ阻害した（図７）。最大効果が、１０ｍｇ／ｋｇのＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６＋１０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブ（アバスチン）の組合せと比較して、１０ｍｇ／ｋｇの低い濃度ですでに得られた。

実施例 ９
Ｓｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスのＣｏｌｏ２０５異種移植モデルにおける二重特異性抗体＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体のインビボ効果
細胞株及び培養条件：
Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸直腸癌細胞(ATCC No. CCL-222)。腫瘍細胞株を、１０％ウシ胎児血清(PAA Laboratories, Austria)及び２ｍＭのＬ-グルタミンで補充されたＲＰＭＩ １６４０培地(PAA, Laboratories, Austria)において、３７°Ｃで、水飽和雰囲気において５％ＣＯ_２でルーチン的に培養した。継代２−５が移植に使用される。

動物：
雌のＳＣＩＤ ｂｅｉｇｅマウス；到着時に４−５週の年齢(Charles River Germanyから購入)を特定病原体除去条件下、１２時間の明かり／１２時間の暗闇の一日サイクルを、関連ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い維持した。実験研究プロトコルは地方自治体によって検討され認可された。到着後、動物を、新しい環境に慣れさせるため及び観察のために一週間、動物施設の検疫所に保持した。継続的な健康モニタリングが定期的に実施される。ダイエット食(Provimi Kliba 3337)及び水(酸性化 ｐＨ２．５−３）を自由に与えた。研究の開始時のマウスの年齢は約10週である。

腫瘍細胞注入：
注入の日に、腫瘍細胞を培養フラスコ(Greiner)から収集し(トリプシン-EDTA)、50mlの培養培地に移し、一度洗浄し、PBS中に再懸濁させた。PBSを用いた更なる洗浄工程及び濾過(セルストレーナー; Falconφ100μm)の後、最終細胞タイターを２．５ｘ １０^７／ｍｌに調整した。腫瘍細胞懸濁液を、細胞凝集を避けるためにホールピペットを用いて注意深く混合した。この後、細胞懸濁液を広口針(1.10 x 40 mm)を使用して1.0mlのツベルクリンシリンジ(Braun Melsungen)に充填した；注入には、針のサイズを変更し(0.45 x 25 mm)、注入ごとに新しい針を使用した。麻酔を、閉循環システムにおいて、プレインキュベーションチャンバー(plexiglas)、個々のマウスノーズマスク(silicon)、不燃性又は非爆発性の麻酔化合物イソフルラン(cp-pharma)を用いて、小動物のためのStephens吸入ユニットを使用して実施した。注入の2日前に動物の毛を剃り、細胞注入のために、麻酔動物の皮膚を解剖鉗子を用いて注意深く持ち上げ、１００μｌの細胞懸濁液(= 2.5 x 10⁶細胞)を動物の右側腹部に皮下注入した。

動物の治療
動物の治療を、〜１００ｍｍ３の平均腫瘍体積でランダム化の日にそれぞれ開始した。マウスを、次の表に示すように異なる化合物を用いて週に一度、腹腔内処置した。

モニタリング：
動物を、それらの健康状態について週に２ｘコントロールした。体重を、細胞注入後、週に２ｘ記録した。腫瘍寸法を、ステージ分類の最初、及びその後は全治療期間中、週に２回キャリパーにより測定した。腫瘍体積を、ＮＣＩプロトコル（腫瘍量＝１／２ａｂ^２、ここで「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ腫瘍の長及び短直径である）に従い算出した。終了基準を、臨界腫瘍量（１．７ｇ又はO＞１．５ｃｍまで）、ベースラインから２０％より多い体重減少、腫瘍潰瘍化又は動物の不良な一般状態とした。

結果（（図８）を参照）は、二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体ＸＭＡｂ１が、単一特異性抗体での治療と比較して、Ｓｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスにおける異種移植腫瘍モデルＣｏｌｏ２０５において、より高い腫瘍増殖阻害を示したことを示す。ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６及びベバシズマブの組合せの効果は、ＸＭＡｂ１と同等な結果を示した。ＸＭＡｂ１の最大効果は１０ｍｇ／ｋｇにより既に達せられた。

第二の実験では、より大きな腫瘍に対するＸＭＡｂ１の効果を分析した。

動物の治療
動物の治療を、〜４００ｍｍ３の平均腫瘍体積でランダム化の日にそれぞれ開始した。マウスを、次の表に示すように異なる化合物を用いて週に一度、腹腔内処置した。

モニタリング：
動物を、それらの健康状態について週に２ｘコントロールした。体重を、細胞注入後、週に２ｘ記録した。腫瘍寸法を、ステージ分類の最初、及びその後は全治療期間中、週に２回キャリパーにより測定した。腫瘍体積は、ＮＣＩプロトコル（腫瘍量＝１／２ａｂ^２、ここで「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ腫瘍の長及び短直径である）に従い算出される。終了基準を、臨界腫瘍量（１．７ｇ又はO＞１．５ｃｍまで）、ベースラインから２０％より多い体重減少、腫瘍潰瘍化又は動物の不良な一般状態とした。

結果（（図９）を参照）は、二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体ＸＭＡｂ１が、コントロールと比較して大きい腫瘍において効果を示さなかった単一特異性抗体での治療と比較して、Ｓｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスにおける異種移植腫瘍モデルＣｏｌｏ２０５において、より高い腫瘍増殖阻害を示したことを示す。ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６及びベバシズマブの組合せの効果は、ＸＭＡｂ１と同等な結果を示した。ＸＭＡｂ１の最大効果は１０ｍｇ／ｋｇにより既に達せられた。

総合すると、結果は、腫瘍サイズと独立して、ＸＭＡｂ１が、単一特異性抗体での治療と比較して優れた効果を示すことを実証する。

これらのモデルにおける腫瘍停滞が、１０ｍｇ／ｋｇのＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６＋１０ｍｇ／ｋｇのＡｖａｓｔｉｎの組合せと比較して、１０ｍｇ／ｋｇＸＭＡｂ１の低い濃度ですでに得られた。

実施例 １０
Ｓｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスの同所性ＫＰＬ-４異種移植モデルにおける二重特異性抗体＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体のインビボ効果
腫瘍細胞株
ヒト乳癌細胞株ＫＰＬ-４((Kurebayashi, J., et al., Br. J. Cancer 79 (1999) 707-17))を、炎症性皮膚転移を有する乳癌患者の悪性胸水から得た。腫瘍細胞株を、１０％ウシ胎児血清(PAN Biotech, Germany)及び２ｍＭのＬ-グルタミン（PAN Biotech, Germany）で補充されたＤＭＥＭ培地(PAN Biotech, Germany)において、３７°Ｃで、水飽和雰囲気において５ ％ ＣＯ_２でルーチン的に培養した。培養継代を、週に３回、トリプシン／ＥＤＴＡ １ｘ（ＰＡＮ）分割により実施した。

マウス
到着後、雌のＳＣＩＤ ｂｅｉｇｅマウス（年齢１０−１２週；体重１８−２０ｇ）Charles River, Sulzfeld, Germany)を、それらを新しい環境に慣れさせるため及び観察のために一週間、ＡＡＬＡＡＣ認可の動物施設の検疫所に保持した。継続的な健康モニタリングを実施した。マウスを、１２時間の明かり／１２時間の暗闇の一日サイクルで、国際ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従いＳＰＦ条件下に維持した。ダイエット食(Kliba Provimi 3347)及び水(濾過)を自由に与えた。実験研究プロトコルは、地方自治体により検討され、認証された(Regierung von Oberbayern; registration no. 211.2531.2-22/2003)。

腫瘍細胞注入
注入の日に、腫瘍細胞を培養フラスコ(Greiner TriFlask)から収集し(トリプシン-ＥＤＴＡ)、５０ｍｌの培養培地に移し、一度洗浄し、PBS中に再懸濁させた。PBSを用いた更なる洗浄工程及び濾過(セルストレーナー; Falconφ100μm)の後、最終細胞タイターを１．５ｘ１０^８／ｍｌに調整した。腫瘍細胞懸濁液を、細胞凝集を避けるためにホールピペットを用いて注意深く混合した。麻酔を、閉循環システムにおいて、プレインキュベーションチャンバー(plexiglas)、個々のマウスノーズマスク(silicon)、不燃性又は非爆発性の麻酔化合物イソフルラン(Pharmacia-Upjohn, Germany)を用いて、小動物のためのStephens吸入ユニットを使用して実施した。注入の２日前に、動物の毛を剃った。i.m.f.p.注入のために、細胞を、各麻酔マウスのright penultimate inguinal mammary fat padに、２０μｌの量で同所性注入した。同所性移植のために、細胞懸濁液を、Hamilton microliterシリンジ及び３０Ｇｘ１／２”針を使用して、乳頭の下の皮膚から注入した。

動物の治療
動物の治療を、〜８０ｍｍ３の平均腫瘍体積でランダム化の日にそれぞれ開始した。マウスを、次の表に示すように異なる化合物を用いて週に一度、腹腔内処置した。

腫瘍増殖のモニタリング
動物を、それらの健康状態について週に２ｘコントロールした。体重を、細胞注入後、週に２ｘ記録した。腫瘍寸法を、ステージ分類の日、治療期間の開始時は週に２回、キャリパーにより測定した。腫瘍体積を、ＮＣＩプロトコル(B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, Chapter 5, page 92)（腫瘍量＝１／２ａｂ^２、ここで「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ腫瘍の長及び短直径である）に従い算出した。

終了基準を、臨界腫瘍量（１．７ｇ又はO＞１．５ｃｍまで）、ベースラインから２０％より多い体重減少、腫瘍潰瘍化又は動物の不良な一般状態とした。

結果（（図１０）を参照）は、二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体ＸＭＡｂ１が、単一特異性抗体での治療と比較して、Ｓｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスにおける異種移植腫瘍モデルＣｏｌｏ２０５において、より高い腫瘍増殖阻害を示したことを示す。ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６及びベバシズマブの組合せの効果は、ＸＭＡｂ１と同等な結果を示した。ＸＭＡｂ１の最大効果は１０ｍｇ／ｋｇにより既に達せられた。

第二の実験では、より大きな腫瘍に対するＸＭＡｂ１の効果を分析した。

動物の治療
動物の治療を、〜１６０ｍｍ３の平均腫瘍体積でランダム化の日にそれぞれ開始した。マウスを、次の表に示すように異なる化合物を用いて週に一度、腹腔内処置した。

モニタリング：
動物を、それらの健康状態について週に２ｘコントロールした。体重を、細胞注入後、週に２ｘ記録した。腫瘍寸法を、ステージ分類の日、治療期間の開始時は週に２回、キャリパーにより測定した。腫瘍体積を、ＮＣＩプロトコル(B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, Chapter 5, page 92)(腫瘍量＝１／２ａｂ^２、ここで「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ腫瘍の長及び短直径である）に従い算出した。

終了基準を、臨界腫瘍量（１．７ｇ又はφ＞１．５ｃｍまで）、ベースラインから２０％より多い体重減少、腫瘍潰瘍化又は動物の不良な一般状態とした。

結果（（図１１）を参照）は、二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体ＸＭＡｂ１が、単一特異性抗体での治療と比較して、Ｓｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスにおける異種移植腫瘍モデルＣｏｌｏ２０５において、より高い腫瘍増殖阻害を示したことを示す。ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６及びベバシズマブの組合せの効果は、ＸＭＡｂ１と同等な結果を示した。ＸＭＡｂ１の最大効果は１０ｍｇ／ｋｇにより既に達せられた。

総合すると、結果は、腫瘍サイズと独立して、ＸＭＡｂ１が、単一特異性抗体での治療と比較して優れた効果を示すことを実証する。

これらのモデルにおける腫瘍停滞が、１０ｍｇ／ｋｇのＡｎｇ２ｉ-ＬＣ０６＋１０ｍｇ／ｋｇのアバスチンの組合せと比較して、１０ｍｇ／ｋｇのＸＭＡｂ１の低い濃度ですでに得られた。
実施例 １１
ｓ．ｃ．における微少血管密度に対するＸＭＡｂ１による治療の効果Ｃｏｌｏ２０５異種移植
血管密度を、腫瘍スライドの全血管をカウントすることによって評価した。血管を、パラフィン包埋切片に対し蛍光抗マウスＣＤ３４抗体（クローンＭＥＣ１４．７）で標識した。血管を定量化し、微小血管密度を、ｍｍ^２あたりの血管として算出した。全ての結果を平均±ＳＥＭとして表した。実験グループ間の有意な差を決定するために、Ｄｕｎｎｅｔｔｓ法を使用した。ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。結果は、全腫瘍内ＭＶＤが、処置された腫瘍において低下したことを示す。ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６での治療がＭＶＤを２９％低減し、ベバシズマブが０％、ベバシズマブ＋ＡＮＧ２ｉ-ＬＣ０６が１５％、ＸＭＡｂ１が２８％低減した。

実施例 １２
ｓ．ｃ．における二重特異性抗体＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体のインビボ効果Ｓｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスにおけるＮ８７異種移植モデル
腫瘍細胞株
ヒト胃癌細胞株Ｎ８７癌細胞（ＮＣＩ-Ｎ８７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ５８２２））。腫瘍細胞株を、１０％ウシ胎児血清(PAN Biotech, Germany)及び２ｍＭのＬ-グルタミン(PAN Biotech, Germany)で補充されたＲＰＭＩ１６４０において、３７°Ｃで、水飽和雰囲気において５％ＣＯ_２でルーチン的に培養した。培養継代を、週に３回、トリプシン／ＥＤＴＡ１ｘ（ＰＡＮ）分割により実施した。

マウス
到着後、雌のＳＣＩＤ ｂｅｉｇｅマウス（年齢１０−１２週；体重１８−２０ｇ）Charles River, Sulzfeld, Germany)を、それらを新しい環境に慣れさせるため及び観察のために一週間、ＡＡＬＡＡＣ認可の動物施設の検疫所に保持した。継続的な健康モニタリングを実施した。マウスを、１２時間の明かり／１２時間の暗闇の一日サイクルで、国際ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従いＳＰＦ条件下に維持した。ダイエット食(Kliba Provimi 3347)及び水(濾過)を自由に与えた。実験研究プロトコルは、地方自治体により検討され、認証された(Regierung von Oberbayern; registration no. 211.2531.2-22/2003)。

腫瘍細胞注入
注入の日に、細胞を培養フラスコ(Greiner T 75)から収集し、５０ｍｌの培養培地に移し、一度洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。ＰＢＳで更に洗浄した後、細胞濃度をVi-Cell^ＴＭ(Cell Viability Analyzer, Beckman Coulter, Madison, Wisconsin, U.S.A.)を用いて測定した。腫瘍細胞懸濁液（ＰＢＳ）を、慎重に混合し（細胞凝集を低減するため）、氷上に保持した。細胞懸濁液を１．０ｍｌシリンジに充填した。注入に対し、０．４５ｘ２５ｍｍの針サイズを使用した。原発腫瘍を生成するために、１００μｌ量のＰＢＳ中における５ｘ１０^６のＮ８７腫瘍細胞を、各マウスの右側腹部に皮下注入した。

動物の治療
動物の治療を、〜１３０ｍｍ３の平均腫瘍体積でランダム化の日にそれぞれ開始した。マウスは、次の表に示すように異なる化合物を用いて週に一度、腹腔内処置される。

腫瘍増殖のモニタリング
動物を、それらの健康状態について週に１ｘコントロールした。体重を、細胞注入後、週に１ｘ記録した。腫瘍寸法を、ステージ分類の日、治療期間の開始時は週に２回、キャリパーにより測定した。腫瘍体積を、ＮＣＩプロトコル(B. Teicher; Anticancer drug development guide, Humana Press, 1997, Chapter 5, page 92)(腫瘍量＝１／２ａｂ^２、ここで「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ腫瘍の長及び短直径である）に従い算出した。

終了基準を、臨界腫瘍量（１．７ｇ又はφ＞１．５ｃｍまで）、ベースラインから２０％より多い体重減少、腫瘍潰瘍化又は動物の不良な一般状態とした。

結果は、二重特異性二価＜ＶＥＧＦ-ＡＮＧ-２＞抗体ＸＭＡｂ１が、単一特異性抗体での治療と比較して、Ｓｃｉｄ ｂｅｉｇｅマウスにおける異種移植腫瘍モデルＣｏｌｏ２０５において、より高い腫瘍増殖阻害を示したことを示す（図１２）。

Claims (16)

1. ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第一抗原結合部位、及びヒトＡＮＧ-２に特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性二価抗体であって、
   ｉ）前記第一抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：２を含むこと、及び
   ｉｉ）前記第二抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号：３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号：４を含むことを特徴とし、
   更に、ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第一完全長抗体の重鎖及び軽鎖、及び
   ｂ）定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置換されている、ＡＮＧ-２に特異的に結合する完全長抗体の修飾重鎖及び修飾軽鎖
   を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。
2. ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：７、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：５、及び
   ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：８、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：６
   を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：１１、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：９、及び
   ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：１２、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：１０
   を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
4. ａ）第一完全長抗体の重鎖として配列番号：１５、及び第一完全長抗体の軽鎖として配列番号：１３、及び
   ｂ）第二完全長抗体の修飾重鎖として配列番号：１６、及び第二完全長抗体の修飾軽鎖として配列番号：１４
   を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
5. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む薬学的組成物。
6. 癌の治療のための請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
7. 癌治療用医薬の製造における、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
8. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む、癌を患っている患者を治療するための医薬。
9. 血管疾患の治療のための請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
10. 血管疾患治療用医薬の製造における、請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
11. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む、血管疾患を患っている患者を治療するための医薬。
12. 請求項１から４の何れか一項に記載の二重特異性抗体をコードしている核酸。
13. 請求項１２に記載の核酸を有する発現ベクターであって、原核生物又は真核生物宿主細胞において前記核酸を発現可能である発現ベクター。
14. 請求項１３に記載のベクターを含む原核生物又は真核生物宿主細胞。
15. 請求項１から４に記載の二重特異性抗体の調製方法であって、
    ａ）前記抗体をコードしている核酸分子を含むベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程；
    ｂ）前記抗体分子の合成を可能にする条件下で該宿主細胞を培養する工程；及び
    ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する工程
    を含む、方法。
16. 請求項１５に記載の方法によって得られる二重特異性抗体。

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