JP5766124B2 - 炎症性疾患および自己免疫疾患の処置の組成物および方法 - Google Patents

Description

本出願は、２００９年１月２１日に出願された米国仮特許出願番号６１／１４６，１１１の優先権を主張し、上記米国仮特許出願は、その全容が参照によって本明細書に援用される。

（背景）
ＩＬ−２は、ＩＬ−２結合に際して細胞内シグナル伝達事象を一緒に活性化するＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγならびに他の２つの受容体サブユニットにＩＬ−２を提示する役目をするＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）の３つの膜貫通受容体サブユニットに結合する。ＩＬ−２Ｒβγによって伝えられるシグナルは、ＰＩ３−キナーゼ、Ｒａｓ−ＭＡＰ−キナーゼ、およびＳＴＡＴ５経路のシグナルを含む。

Ｔ細胞は、典型的に組織中に存在する低濃度のＩＬ−２に応答するためにＣＤ２５の発現を必要とする。ＣＤ２５を発現するＴ細胞は、自己免疫性炎症を抑制するのに不可欠であるＣＤ４^＋ＦＯＸＰ３^＋調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞）およびＣＤ２５を発現するように活性化されたＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の両方を含む。ＦＯＸＰ３⁻ＣＤ２５^＋Ｔエフェクター細胞（Ｔ−ｅｆｆ）は、ＣＤ４^＋細胞またはＣＤ８^＋細胞のいずれかであってもよく、これらの両方は、炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）となり得、自己免疫病、器官移植片拒絶、または移植片対宿主病の一因となり得る。ＩＬ−２刺激ＳＴＡＴ５シグナル伝達は、正常なＴ−ｒｅｇ細胞の成長および生存にとってならびに高ＦＯＸＰ３発現にとって重大である。

ＩＬ−２は３つのＩＬ−２Ｒ鎖のそれぞれに対して低い親和性を有するため、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２Ｒγに対する親和性のさらなる低下は、ＣＤ２５に対する親和性の増加によって補うことができるかもしれない。ＣＤ２５に対して１７０倍まで高い親和性を示すＩＬ−２の変異性改変体が生成された（特許文献１；Ｒａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４巻、１０６９６〜７０１頁（２００５年））。これらの改変体は、細胞表面ＣＤ２５と数日間結合して、ＩＬ−２依存性細胞株の成長を長期にわたって促進することが報告された。発明者らは、変異体が、持続的なＴ細胞成長を刺激し、したがって、ウイルス免疫療法の方法においておよびがんまたは他の過剰増殖障害を処置するのに有用であり得ることを報告する。高用量のＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）は、抗腫瘍免疫を誘発するためにがん患者に投与されるが、これは、望ましくない毒性と関連することが多い処置である。特許文献２は、低下した毒性を有すると述べられるＩＬ−２改変体を記載する。該特許は、毒性が、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγのみを発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩＬ−２誘発刺激に起因すると考える。そこに記載されるＩＬ−２改変体は、それらが、ＮＫ細胞よりも、ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を選択的に活性化するので、低下した毒性を有すると述べられた。さらに、ＩＬ−２改変体は、一般に免疫系を刺激することが有益である治療方法、たとえばがんまたは感染症の処置に有用であると述べられた。

米国特許出願公開第２００５／０１４２１０６号明細書 米国特許第６，９５５，８０７号明細書

（概要）
炎症誘発性であり得るＦＯＸＰ３⁻ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の成長／生存よりも、ＦＯＸＰ３^＋調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞）の成長／生存を優先的に促進する、ＩＬ−２の免疫抑制変異性改変体が、本明細書において提供される。他のＴ細胞に対するＴ−ｒｅｇの比を増加させることによっておよび／またはＦＯＸＰ３⁻ＣＤ２５^＋Ｔ細胞を活性化せずに、Ｔ−ｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３発現を増加させることによって、これらの改変体は、望ましくない炎症を抑制するはずである。

これらのＩＬ−２改変体の特有の特性は、２組の変異から生じる。１組の変異は、ＩＬ−２受容体のシグナル伝達鎖（ＩＬ−２Ｒβ／ＣＤ１２２および／もしくはＩＬ−２Ｒγ／ＣＤ１３２）に対する親和性の低下ならびに／またはＩＬ−２受容体の一方もしくは両方のサブユニットからのシグナル伝達事象を誘発するための能力の低下をもたらす。変異の第２の組は、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）に対するより高い親和性を付与し、Ｒａｏら（米国特許出願公開第２００５／０１４２１０６号）によって記載される変異を含んでいてもよい。

本明細書において記載されるように、ある種のＩＬ−２改変体は、Ｔ−ｒｅｇ細胞の生存、増殖、活性化、および／または機能を優先的に誘発するシグナル伝達事象を誘発する。ある実施形態では、ＩＬ−２改変体は、Ｔ−ｒｅｇ細胞において、ＳＴＡＴ５リン酸化ならびに／またはＩＬ−２Ｒの下流の１つもしくは複数のシグナル伝達分子、たとえばｐ３８、ＥＲＫ、ＳＹＫ、およびＬＣＫのリン酸化を刺激するための能力を保持する。他の実施形態では、ＩＬ−２改変体は、Ｔ−ｒｅｇ細胞の生存、増殖、活性化、および／または機能にとって重要である、ＦＯＸＰ３またはＩＬ−１０などのような、遺伝子またはタンパク質の転写またはタンパク質発現をＴ−ｒｅｇ細胞において刺激するための能力を保持する。他の実施形態では、ＩＬ−２改変体は、ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の表面上のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ複合体のエンドサイトーシスを刺激するための能力の低下を示す。他の実施形態では、ＩＬ−２改変体は、ＡＫＴおよび／またはｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的）の非効率的なリン酸化、リン酸化の低下、リン酸化の欠如などのような、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の非効率的な刺激、刺激の低下、または刺激の欠如を示す。他の実施形態では、ＩＬ−２改変体は、ｗｔ ＩＬ−２がＳＴＡＴ５リン酸化および／またはＴ−ｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２Ｒの下流の１つもしくは複数のシグナル伝達分子のリン酸化を刺激する能力を保持し、さらに、ＦＯＸＰ３⁻ＣＤ４^＋細胞もしくはＦＯＸＰ３⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５、ＡＫＴ、および／もしくはｍＴＯＲまたはＩＬ−２Ｒの下流の他のシグナル伝達分子の非効率的なリン酸化、リン酸化の低下、またはリン酸化の欠如を示す。他の実施形態では、ＩＬ−２改変体は、ＦＯＸＰ３⁻ＣＤ４^＋細胞もしくはＦＯＸＰ３⁻ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の生存、成長、活性化および／または機能を刺激するのに非効率的であるかまたは刺激することができない。

炎症性障害または自己免疫障害を処置するための方法が提供される。方法は、治療有効量の１つまたは複数の免疫抑制ＩＬ−２改変体を被験体に投与するステップを含む。

調節性Ｔ細胞の増殖、生存、成長、または活性化を促進するための方法がさらに提供される。方法は、ＦＯＸＰ３陽性（ＦＯＸＰ３^＋）Ｔ細胞を免疫抑制ＩＬ−２改変体と接触させるステップを含む。

炎症性障害または自己免疫の処置のための医薬の調製における免疫抑制ＩＬ−２改変体の使用もまた提供される。

インビボにおいて治療薬の安定性および／または半減期を延長する、さらなるタンパク質配列または他の化学物質に結合体化されたＩＬ−２改変体の組成物もまた提供される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
被験体において炎症性障害を処置するための方法であって、治療有効量のＩＬ−２改変体を炎症性障害の処置を必要とする被験体に投与するステップを含み、前記ＩＬ−２改変体は、
（ａ）配列番号１に少なくとも８０％同一のアミノ酸の配列を含み、
（ｂ）ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激し、および
（ｃ）配列番号１として記載されるポリペプチドと比較して、ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発するための能力が低下している、方法。
（項目２）
前記炎症性障害は、喘息、糖尿病、関節炎、アレルギー、器官移植片拒絶、および移植片対宿主病からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＩＬ−２改変体は、配列番号１に少なくとも９０％同一のアミノ酸の配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＩＬ−２改変体は、配列番号１に少なくとも９５％同一のアミノ酸の配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＩＬ−２改変体は、配列番号１として記載されるポリペプチドよりも、ＩＬ−２Ｒαに対する高い親和性を有する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ＩＬ−２改変体は、インビトロにおいて、ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞の成長または生存を促進する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＩＬ−２改変体は、アミノ酸３０、アミノ酸３１、アミノ酸３５、アミノ酸６９、およびアミノ酸７４からなる群より選択される位置に、配列番号１において記載されるポリペプチド配列において変異を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記３０位の変異は、Ｎ３０Ｓである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記３１位の変異は、Ｙ３１Ｈである、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記３５位の変異は、Ｋ３５Ｒである、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記６９位の変異は、Ｖ６９Ａである、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記７４位の変異は、Ｑ７４Ｐである、項目７に記載の方法。
（項目１３）
前記ＩＬ−２改変体は、機能的ＩＬ−２受容体複合体を含むエクスビボＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘発するが、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発するための能力が低下している、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＩＬ−２改変体は、８８位に、配列番号１において記載されるポリペプチド配列において変異を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記８８位の変異は、Ｎ８８Ｄである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＩＬ−２改変体は、インビボにおいて前記ＩＬ−２改変体の血清半減期を延長する化学物質またはポリペプチドに結合体化される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞の成長または生存を促進するための方法であって、ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞をＩＬ−２改変体と接触させるステップを含み、前記ＩＬ−２改変体は、
（ａ）配列番号１に少なくとも８０％同一のアミノ酸の配列を含み、
（ｂ）前記ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激し、および
（ｃ）配列番号１として記載されるポリペプチドと比較して、ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発するための能力が低下している、方法。
（項目１８）
前記ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞は、インビトロにおいて接触させられる、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ＩＬ−２改変体は、インビボにおいて前記ＩＬ−２改変体の血清半減期を延長する化学物質またはポリペプチドに結合体化される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
炎症性疾患の処置のための医薬の調製におけるＩＬ−２改変体の使用であって、前記ＩＬ−２改変体は、
（ａ）配列番号１に少なくとも８０％同一のアミノ酸の配列を含み、
（ｂ）ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激し、および
（ｃ）配列番号１として記載されるポリペプチドと比較して、ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発するための能力が低下している、使用。
（項目２１）
前記ＩＬ−２改変体は、インビボにおいて前記ＩＬ−２改変体の血清半減期を延長する化学物質またはポリペプチドに結合体化される、項目２０に記載の方法。

図１は、ＩＬ−２改変体の配列を示す図である。生殖系ヒトＩＬ−２と異なる配列は、グレーで網掛けされていない。 図２Ａは、フローサイトメトリーデータおよびゲーティング戦略の例を示す図である。代表的なデータを図１Ａ中に示す。ここで、９．５％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋であり、９．９％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻であり、６．７％のＣＤ８^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻である。ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、典型的に、非常にまれである。図２Ｂは、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｃは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｄは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｅは、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中のＦＯＸＰ３^＋／ＦＯＸＰ３⁻細胞の比を示す図である。図２Ｆは、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２媒介性ＦＯＸＰ３アップレギュレーションを示す図である。 図２Ａは、フローサイトメトリーデータおよびゲーティング戦略の例を示す図である。代表的なデータを図１Ａ中に示す。ここで、９．５％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋であり、９．９％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻であり、６．７％のＣＤ８^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻である。ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、典型的に、非常にまれである。図２Ｂは、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｃは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｄは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｅは、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中のＦＯＸＰ３^＋／ＦＯＸＰ３⁻細胞の比を示す図である。図２Ｆは、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２媒介性ＦＯＸＰ３アップレギュレーションを示す図である。 図２Ａは、フローサイトメトリーデータおよびゲーティング戦略の例を示す図である。代表的なデータを図１Ａ中に示す。ここで、９．５％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋であり、９．９％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻であり、６．７％のＣＤ８^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻である。ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、典型的に、非常にまれである。図２Ｂは、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｃは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｄは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｅは、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中のＦＯＸＰ３^＋／ＦＯＸＰ３⁻細胞の比を示す図である。図２Ｆは、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２媒介性ＦＯＸＰ３アップレギュレーションを示す図である。 図２Ａは、フローサイトメトリーデータおよびゲーティング戦略の例を示す図である。代表的なデータを図１Ａ中に示す。ここで、９．５％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋であり、９．９％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻であり、６．７％のＣＤ８^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻である。ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、典型的に、非常にまれである。図２Ｂは、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｃは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｄは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｅは、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中のＦＯＸＰ３^＋／ＦＯＸＰ３⁻細胞の比を示す図である。図２Ｆは、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２媒介性ＦＯＸＰ３アップレギュレーションを示す図である。 図２Ａは、フローサイトメトリーデータおよびゲーティング戦略の例を示す図である。代表的なデータを図１Ａ中に示す。ここで、９．５％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋であり、９．９％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻であり、６．７％のＣＤ８^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻である。ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、典型的に、非常にまれである。図２Ｂは、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｃは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｄは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｅは、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中のＦＯＸＰ３^＋／ＦＯＸＰ３⁻細胞の比を示す図である。図２Ｆは、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２媒介性ＦＯＸＰ３アップレギュレーションを示す図である。 図２Ａは、フローサイトメトリーデータおよびゲーティング戦略の例を示す図である。代表的なデータを図１Ａ中に示す。ここで、９．５％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋であり、９．９％のＣＤ４^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻であり、６．７％のＣＤ８^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻である。ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、典型的に、非常にまれである。図２Ｂは、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｃは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｄは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞の相対数を示す図である。図２Ｅは、ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中のＦＯＸＰ３^＋／ＦＯＸＰ３⁻細胞の比を示す図である。図２Ｆは、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２媒介性ＦＯＸＰ３アップレギュレーションを示す図である。 図３は、ＩＬ−２ムテインが、Ｔ−ｒｅｇにおけるホスホ−ＳＴＡＴ５を刺激するが、他のＴ細胞におけるシグナルの刺激に非効率的であることを示す図である。Ｔ細胞は、実施例３に記載されるようにＩＬ−２を用いて刺激した。ホスホ−ＳＴＡＴ５は、フローサイトメトリーによって測定し、ホスホ−ＡＫＴはＥＬＩＳＡ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって測定した。略語は、以下のとおりである：Ｔ−ｒｅｇ、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞；ＣＤ４ Ｔ−ｅｆｆ、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻「エフェクター」Ｔ細胞；ＣＤ８ Ｔ−ｅｆｆ、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻「エフェクター」Ｔ細胞。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
ＦＯＸＰ３^＋調節性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞）は、正常な免疫恒常性および自己組織に対する免疫寛容を維持するのにならびに望ましくない炎症を抑制するのに不可欠である。Ｔ−ｒｅｇ細胞は、おそらく一時的な因子および環境因子によって調節されるであろう複数のメカニズムを通してそれらの抑制因子および調節機能を働かせる。現在の免疫抑制治療薬は、一般に、個々の炎症誘発性の経路を標的にし、そのため、部分的な効能を示すかまたは特異疾患に適用可能であることが多い。代替の免疫抑制様式は、天然の抑制細胞が炎症の部位に適切な抑制分子／活性を伝えることをより可能にするために、天然の抑制細胞の数および活性化状態の上昇を含んでいてもよい。

Ｔ−ｒｅｇ細胞の増殖、生存、活性化、および／または機能を選択的に促進する治療剤が本明細書において記載される。「選択的に促進する」によって、治療剤が、Ｔ−ｒｅｇ細胞において活性を促進するが、非調節性Ｔ細胞において、活性を促進するための能力が限られているかまたはそれを欠くことが意味される。Ｔ−ｒｅｇ細胞の増殖、生存、活性化、および／または機能を選択的に促進する作用物質をスクリーニングするためのアッセイが本明細書においてさらに記載される。スクリーニングされてもよい作用物質は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、たとえばモノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一価抗体、二価抗体、および多価抗体を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない。

ある実施形態では、作用物質は、ＩＬ−２改変体である。特に、ＩＬ−２改変体は、Ｔ−ｒｅｇ細胞の成長／生存のこれらの活性を促進するが、非調節性Ｔ細胞（ＦＯＸＰ３⁻ＣＤ２５^＋）およびナチュラルキラー細胞の増殖、生存、活性化、および／または機能を促進するための能力が野生型ＩＬ−２と比較して低下している。ある実施形態では、そのようなＩＬ−２改変体は、ＩＬ−２ＲサブユニットＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）に対する親和性の上昇ならびにシグナル伝達サブユニットＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２Ｒγに対する親和性の低下の組み合わせを通して機能する。ＩＬ−２およびその改変体が、免疫賦活剤として、たとえば、がんまたは感染症を処置するための方法において、当技術分野において使用されてきたのに対して、本明細書において記載されるＩＬ−２改変体は、免疫抑制作用物質として、たとえば、炎症性障害を処置するための方法において、特に有用である。

ＩＬ−２改変体は、野生型ＩＬ−２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸の配列を含む。ＩＬ−２改変体は、野生型ＩＬ−２の機能的断片に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸の配列をさらに含む。本明細書において使用されるように、「野生型ＩＬ−２」は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するものとする：

ここで、Ｘは、Ｃ、Ｓ、Ａ、またはＶ（配列番号１）である。

改変体は、野生型ＩＬ−２アミノ酸配列内に１つまたは複数の置換、欠失、または挿入を含有していてもよい。残基は、一文字アミノ酸コード、その後に続くＩＬ−２アミノ酸位置によって本明細書において示され、たとえば、Ｋ３５は、配列番号１の３５位のリシン残基である。置換は、一文字アミノ酸コード、その後に続くＩＬ−２アミノ酸位置、その後に続く置換一文字アミノ酸コードによって本明細書において示され、たとえば、Ｋ３５Ａは、配列番号１の３５位のリシン残基のアラニン残基との置換である。

一態様では、本発明は、野生型ＩＬ−２よりもＩＬ−２Ｒαに対する高い親和性を有する免疫抑制ＩＬ−２改変体を提供する。米国特許出願公開第２００５／０１４２１０６号（その全体が参照によって本明細書において組み込まれる）は、野生型ＩＬ−２が有するよりも、ＩＬ−２Ｒαに対する高い親和性を有するＩＬ−２改変体およびそのような改変体を作製し、かつスクリーニングするための方法を記載する。好ましいＩＬ−２改変体は、ＩＬ−２Ｒαに接触するＩＬ−２配列の位置か、またはＩＬ−２Ｒαに接触する他の位置の方向づけを改変するＩＬ−２配列の位置に１つまたは複数の変異を含み、ＩＬ−２Ｒαに対するより高い親和性がもたらされる。変異は、公開された結晶構造に基づいて、ＩＬ−２Ｒαに極めて接近していることが公知のエリア中にまたはその近くにあってもよい（Ｘｉｎｑｕａｎ Ｗａｎｇ、Ｍａｔｈｉａｓ Ｒｉｃｋｅｒｔ、Ｋ． Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｇａｒｃｉａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０巻：１１５９頁 ２００５年）。ＩＬ−２Ｒαに接触すると考えられるＩＬ−２残基は、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｌ７２、およびＹ１０７を含む。

ＩＬ−２Ｒαに対するより大きな親和性を有するＩＬ−２改変体は、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、またはＫ７６における変化を含むことができる。好ましい改変体は、１つまたは複数の以下の変異を有するものを含む：Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ３０Ｄ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｓ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、およびＱ７４Ｐ。

免疫抑制ＩＬ−２改変体はまた、ＩＬ−２Ｒを介して野生型ＩＬ−２によって活性化されるある種の経路を通してのシグナル伝達の改変を示し、Ｔ−ｒｅｇの優先的な増殖／生存／活性化をもたらす改変体をも含む。ＩＬ−２Ｒの活性化に際してリン酸化されることが公知の分子は、ＳＴＡＴ５、ｐ３８、ＥＲＫ、ＳＹＫ、ＬＣＫ、ＡＫＴ、およびｍＴＯＲを含む。野生型ＩＬ−２と比較して、免疫抑制ＩＬ−２改変体は、ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞において低下したＰＩ３Ｋシグナル伝達能力を有することができ、これは、野生型ＩＬ−２と比較した、ＡＫＴおよび／またはｍＴＯＲのリン酸化における低下によって測定することができる。そのような改変体は、ＩＬ−２ＲβもしくはＩＬ−２Ｒγに接触する位置か、またはＩＬ−２ＲβもしくはＩＬ−２Ｒγに接触する他の位置の方向づけを改変する位置に変異を含んでいてもよい。ＩＬ−２Ｒβに接触すると考えられるＩＬ−２残基は、Ｌ１２、Ｑ１３、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｍ２３、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、およびＥ９５を含む。ＩＬ−２Ｒγに接触すると考えられるＩＬ−２残基は、Ｑ１１、Ｌ１８、Ｑ２２、Ｅ１１０、Ｎ１１９、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｉ１２９、Ｓ１３０、およびＴ１３３を含む。ある実施形態では、ＩＬ−２改変体は、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｑ２２、Ｄ８４、Ｎ８８、またはＥ９５に変異を含む。そのような変異の例は、Ｅ１５Ｑ、Ｈ１６Ｎ、Ｑ２２Ｅ、Ｄ８４Ｎ、Ｎ８８Ｄ、およびＥ９５Ｑを含む。

ある実施形態では、ＩＬ−２改変体は、変異の組み合わせを含む。変異の組み合わせを有するＩＬ−２改変体の例は、図１に提供され、ｈａＷＴ（配列番号２）、ｈａＤ（配列番号３）、ｈａＤ．１（配列番号４）、ｈａＤ．２（配列番号５）、ｈａＤ．４（配列番号６）、ｈａＤ．５（配列番号７）、ｈａＤ．６（配列番号８）、ｈａＤ．８（配列番号９）、およびｈａＤ．１１（配列番号１０）ｄを含む。好ましい実施形態では、ＩＬ−２改変体は、ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激するが、野生型ＩＬ−２と比較して、ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞において、ＳＴＡＴ５およびＡＫＴリン酸化を誘発する能力が低下している。そのような特性を有する好ましい改変体は、ｈａＤ、ｈａＤ．１、ｈａＤ．２、ｈａＤ．４、ｈａＤ．５、ｈａＤ．６、およびｈａＤ．８を含む。

ＩＬ−２改変体は、野生型ＩＬ−２配列と比較して、ＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−２Ｒγに対する親和性に対して効果を有していない１つまたは複数の変異をさらに含んでいてもよいが、ＩＬ−２改変体が、ＦＯＸＰ３を発現しない他のＴ細胞よりも、ＦＯＸＰ３^＋Ｔ−ｒｅｇの優先的な増殖、生存、活性化、または機能を促進することを条件とする。好ましい実施形態では、そのような変異は、保存的変異である。

ＩＬ−２改変体は、患者に投与された場合にＩＬ−２改変体の血清半減期を増加させるための１つまたは複数の化合物を含んでいてもよい。そのような半減期を延長する分子は、水溶性ポリマー（たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、低密度リポタンパク質および高密度リポタンパク質、抗体Ｆｃ（単量体または二量体）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、ならびにＴＧＦ−β潜伏関連ペプチド（ＴＧＦ−β ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＬＡＰ）を含む。ＰＥＧ化ＴＴＲなどのような、血清半減期延長分子の組み合わせを含むＩＬ−２改変体もまた企図される（米国特許出願公開第２００３／０１９５１５４号）。

（免疫抑制ＩＬ−２改変体を作製するための方法）
免疫抑制ＩＬ−２改変体は、免疫賦活ＩＬ−２改変体を産生するための米国特許第６，９５５，８０７号（参照によって本明細書において組み込まれる）において記載されるものを含む、当技術分野において公知の任意の適した方法を使用して産生することができる。そのような方法は、ＩＬ−２改変体をコードするＤＮＡ配列を構築するステップおよび適切に形質転換された宿主においてそれらの配列を発現するステップを含む。この方法は、本発明の組換え改変体を産生する。しかしながら、改変体はまた、化学合成または化学合成および組換えＤＮＡ技術の組み合わせによって産生されてもよい。バッチ式産生方法または灌流産生方法は、当技術分野において公知である。Ｆｒｅｓｈｅｙ， Ｒ． Ｉ．（編）、「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、第２版、１９９２年、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ． Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｍａｔｈｅｒ， Ｊ． Ｐ．「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｃａｌｅｕｐ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （０．５−５０ ｌｉｔｅｒｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇ ５７巻：２１９〜５２７頁（１９９８年）；Ｈｕ， Ｗ． Ｓ．およびＡｕｎｉｎｓ， Ｊ． Ｇ．、「Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８巻：１４８〜１５３頁（１９９７年）；Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖ， Ｋ． Ｂ．、Ｔｓａｉ， Ｙ．、Ｍｏｌｅｓ， Ｄ．、Ｍａｔａｎｇｕｉｈａｎ， Ｒ．、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｙ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｕｘｏｓｔａｔ．」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １２巻：１００〜１０９頁（１９９６年）を参照されたい。

改変体を産生するための組換え法の一実施形態では、ＤＮＡ配列は、野生型ＩＬ−２をコードするＤＮＡ配列を単離または合成し、次いで、部位特異的変異誘発によって１つまたは複数のコドンを変化させることによって構築される。この技術は、周知である。たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるＭａｒｋら、「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇｅｎｅ」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１巻、５６６２〜６６頁（１９８４年）；および米国特許第４，５８８，５８５号を参照されたい。

ＩＬ−２改変体をコードするＤＮＡ配列を構築するための他の方法は、化学合成である。これは、たとえば、本明細書において記載される特性を示すＩＬ−２改変体をコードするタンパク質配列の化学的手段によるペプチドの直接的な合成を含む。この方法は、ＩＬ２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、またはＩＬ−２ＲγとのＩＬ−２の相互作用に影響を与える位置に天然アミノ酸および非天然アミノ酸を組み込んでいてもよい。その代わりに、所望のＩＬ−２改変体をコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して化学的手段によって合成されてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のＩＬ−２改変体のアミノ酸配列に基づき、その中で組換え改変体が産生される宿主細胞において有利なコドンを好ましくは選択して設計される。この点に関して、遺伝子コードが縮重しており、アミノ酸が１つを超えるコドンによってコードされてもよいことが十分に認識される。たとえば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドン、ＴＴＣまたはＴＴＴによってコードされ、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによってコードされ、ｈｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによってコードされる。Ｔｒｐ（Ｗ）は、単一のコドン、ＴＧＧによってコードされる。したがって、特定のＩＬ−２改変体をコードする所与のＤＮＡ配列について、そのＩＬ−２改変体をコードする多くのＤＮＡ縮重配列があるということが理解される。

ＩＬ−２改変体をコードするＤＮＡ配列はまた、特定部位の変異誘発、化学合成、または他の方法によって調製されるかどうかに関わらず、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよいし、または含んでいなくてもよい。そのようなシグナル配列は、存在する場合、ＩＬ−２改変体の発現のために選ばれた細胞によって認識されるシグナル配列であるべきである。それは、原核生物、真核生物、またはその２つの組み合わせであってもよい。それはまた、本来のＩＬ−２のシグナル配列であってもよい。シグナル配列の包含は、ＩＬ−２改変体が作製される組換え細胞から、ＩＬ−２改変体を分泌することが所望されるかどうかに依存する。選ばれた細胞が原核生物である場合、ＤＮＡ配列がシグナル配列をコードしないことが一般に好ましい。選ばれた細胞が真核生物である場合、シグナル配列がコードされること、最も好ましくは、野生型ＩＬ−２シグナル配列が使用されることが一般に好ましい。

標準的な方法は、ＩＬ−２改変体をコードする遺伝子を合成するために適用されてもよい。たとえば、完全なアミノ酸配列は、逆翻訳遺伝子を構築するために使用されてもよい。ＩＬ−２改変体をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーが合成されてもよい。たとえば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成され、次いで、ライゲーションされてもよい。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的な組み立てのために５’または３’オーバーハングを含有する。

一度、組み立てられたら（合成、特定部位の変異誘発、または他の方法によって）、ＩＬ−２改変体をコードするＤＮＡ配列は、発現ベクターの中に挿入され、所望の形質転換宿主におけるＩＬ−２改変体の発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結される。適切な組み立ては、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および適した宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認されてもよい。当技術分野において周知であるように、宿主においてトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子は、選ばれた発現宿主において機能的な転写および翻訳発現制御配列に作動可能に連結されなければならない。発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。種々様々の発現宿主／ベクター組み合わせが使用されてもよい。

細菌、真菌類（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、または他の適切な動物細胞もしくは細胞株およびトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を含む、任意の適した宿主が、ＩＬ−２改変体を産生するために使用されてもよい。特に、これらの宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、真菌、酵母、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）などのような昆虫細胞、組織培養における、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳ／Ｏなどのようなマウス細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＮＴ１０などのようなアフリカミドリザル細胞、およびヒト細胞などのような動物細胞、ならびに植物細胞の株などのような周知の真核生物および原核生物の宿主を含んでいてもよい。動物細胞発現については、培養物中のＣＨＯ細胞およびＣＯＳ７細胞、特にＣＨＯ細胞株ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）またはＨＫＢ株が好ましい。

もちろん、すべてのベクターおよび発現制御配列が機能して、本明細書において記載されるＤＮＡ配列を等しく十分に発現するとは限らないということを理解されたい。また、すべての宿主が同じ発現系で等しく十分に機能するとは限らない。しかしながら、当業者は、不必要な実験作業を用いずに、これらのベクター、発現制御配列、および宿主から選択を行ってもよい。たとえば、ベクターを選択する際に、ベクターはその中で複製しなければならないので、宿主は考慮されなければならない。ベクターコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのような、ベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現もまた考慮されたい。たとえば、本発明における使用のための好ましいベクターは、ＩＬ−２改変体をコードするＤＮＡのコピー数が増幅されることを可能にするものを含む。そのような増幅可能なベクターは、当技術分野において周知である。それらは、たとえば、ＤＨＦＲ増幅（たとえばＫａｕｆｍａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃＤＮＡ Ｇｅｎｅ： Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｕｔｉｌｉｚｅｄ Ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、２巻、１３０４〜１９頁（１９８２頁）を参照されたい）またはグルタミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（たとえば米国特許第５，１２２，４６４号および欧州特許出願公開第３３８，８４１号を参照されたい）によって増幅することができるベクターを含む。

ＩＬ−２改変体は、改変体を産生するために使用される宿主生物に依存して、グリコシル化されても、グリコシル化されなくてもよい。細菌が宿主に選ばれる場合、産生されるＩＬ−２改変体は、グリコシル化されない。他方、おそらく、本来のＩＬ−２がグリコシル化されるのと同じ方法ではないが、真核細胞は、ＩＬ−２改変体をグリコシル化する。形質転換宿主によって産生されるＩＬ−２改変体は、任意の適した方法によって精製することができる。ＩＬ−２を精製するための様々な方法が公知である。たとえばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２巻 編：Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｂｅｎ Ｍ． Ｄｕｎｎ、Ｈｉｄｄｅ Ｌ． Ｐｌｏｅｈｇ、Ｄａｖｉｄ Ｗ． Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、Ｐａｕｌ Ｔ． Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ、Ｕｎｉｔ ６．５ （Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９７、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ）を参照されたい。

ＩＬ−２改変体の生物学的活性は、当技術分野において公知の任意の適した方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、下記の実施例において記載されるものを含む。

（適応症）
疾患、障害、または状態は、Ｔ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体の被験体への投与による処置が適用可能であってもよく、またはその投与によって予防されてもよい。そのような疾患、障害、および状態は、炎症、自己免疫疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨の炎症、線維性疾患および／または骨分解、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、少関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性の腸疾患に基づく関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群（ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｒｅｔｅｒ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、少関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸疾患に基づく関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、脊髄炎（ｍｙｏｌｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｌｉｔｉｓ）、皮膚筋炎、変形性関節症、結節性多発動脈炎（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓｓａ）、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性多発性筋痛（ｐｌｏｙｍｙａｌｇｉａ ｒｈｅｕｍａｔｉｃａ）、サルコイドーシス、強皮症、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、プラーク乾癬、滴状乾癬、逆型乾癬、膿胞性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、狼瘡、スティル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｈｌｅｒｏｓｉｓ）（ＭＳ）、喘息、ＣＯＰＤ、ギラン−バレー疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎（たとえばグレーブス病）、アジソン病、レーノー現象、自己免疫性肝炎、ＧＶＨＤ、移植拒絶反応、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、治療有効量のＴ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体を含む医薬組成物が提供される。

用語「処置」は、障害の少なくとも１つの症状もしくは他の局面の軽減もしくは予防、疾患重症度の低下、およびその他同種のものを包含する。Ｔ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体は、実用的な治療剤を構成するために、完全な治癒を達成する必要はなく、または疾患のすべての症状もしくは症状発現を取り除く必要もない。関係のある分野において認識されるように、治療剤として使用される薬物は、所与の疾患状態の重症度を低下させてもよいが、有用な治療剤と見なされるために、疾患のすべての症状発現を消失させる必要はない。同様に、予防的に施される処置は、実用的な予防薬を構成するために、状態の発症を予防するのに完全に有効である必要はない。単に疾患の影響を低下させること（たとえば、その症状の数値もしくは重症度を低下させることによって、または他の処置の有効性を増加させることによって、または他の有益な効果をもたらすことによって）、または被験体において疾患が生じるかもしくは悪化する可能性を減少させることは、十分である。本発明の一実施形態は、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超えた持続性の改善を誘発するのに十分な量かつ時間で、Ｔ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体を患者に投与するステップを含む方法に関する。

（医薬組成物）
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容される希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／または補助剤と一緒に、治療有効量の１つまたは複数の、本発明のＴ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体を含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、そのような医薬組成物を投与することによって患者を処置するための方法を提供する。用語「患者」は、ヒトおよび動物被験体を含む。

ある実施形態では、許容される処方材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒である。ある実施形態では、医薬組成物は、たとえば、組成物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変する、維持する、または保存するための処方材料を含有していてもよい。そのような実施形態では、適した処方材料は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなど）；抗菌薬；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウムなど）；バッファー（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸など）；充填剤（マンニトールもしくはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；増量剤；単糖；二糖；および他の炭水化物（グルコース、スクロース、マンノース、もしくはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）；着色剤、矯味矯臭薬、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など）；溶剤（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのようなポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定性促進剤（スクロースもしくはソルビトールなど）；張性促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）；デリバリービヒクル；希釈剤；賦形剤ならびに／または医薬補助剤を含むが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版（Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｒｍｏ編）、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。

使用されることとなるＴ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体含有医薬組成物の治療有効量は、たとえば、治療の状況および目的に依存する。当業者は、処置のための適切な投薬量レベルは、部分的に、送達される分子、Ｔ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体が使用される適応症、投与のルート、ならびに患者のサイズ（体重、体表面、もしくは器官サイズ）および／または状態（年齢および健康状態）に依存して変わるということを十分に理解する。

ある実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を用量設定し、かつ投与のルートを改変してもよい。典型的な投薬量は、上記に言及される因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。特定の実施形態では、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、任意選択で１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。

投薬頻度は、使用される処方物における特定のＴ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体の薬物動態学的パラメーターに依存する。典型的に、所望の結果を達成する投薬量に達するまで、臨床医は、組成物を投与する。したがって、組成物は、ある期間にわたって、単一の用量としてもしくは２回以上の用量（これは、同じ量の所望の分子を含有していても、していなくてもよい）としてまたは移植デバイスもしくはカテーテルを介して継続的な注入剤として投与されてもよい。適切な投薬量のさらなる改善は、当業者らによってルーチン的に成され、彼らによってルーチン的に行なわれる作業の範囲内にある。

医薬組成物の投与のルートは、たとえば、経口的な、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内ルートによる注射を通しての；徐放性系または移植デバイスによる、公知の方法に従う。ある実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって、または継続的注入によって、または移植デバイスによって、投与されてもよい。

（組み合わせ療法）
さらなる実施形態では、Ｔ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体は、患者が罹患している状態を処置するのに有用な他の作用物質と組み合わせて投与される。そのような作用物質の例は、タンパク質性および非タンパク質性薬物の両方を含む。複数の治療薬が共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）される場合、投薬量は、関連技術において認識されるように、それに応じて調節されてもよい。「共投与」および組み合わせ療法は、同時の投与に限定されず、さらに、少なくとも１つの他の治療剤を患者に投与することを含む処置の経過の間にＴ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体が少なくとも一度投与される処置レジメンを含む。

ある実施形態では、Ｔ−ｒｅｇ選択的ＩＬ−２改変体は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路のインヒビター、たとえばラパマイシン（ラパミューン、シロリムス）と組み合わせて投与される。ＩＬ−２と組み合わせたこの経路のインヒビターは、Ｔ−ｒｅｇの豊富化に有利である。

記載されている本発明、以下の実施例は、限定ではなく例証として提示される。

（実施例）
（実施例１：ＩＬ−２変異体のパネル）
Ｔ−ｒｅｇではなく、ＦＯＸＰ３⁻ＣＤ２５^＋「エフェクター」Ｔ細胞（Ｔ−ｅｆｆ）を刺激する能力が低下したＩＬ−２改変体を生成する可能性を試験するために、ＩＬ−２Ｒβ鎖および／またはＩＬ−２Ｒγ鎖と相互作用することが予測されるアミノ酸が改変された一連のＩＬ−２変異体を生成した。これらの改変体はまた、ＣＤ２５に対する高い親和性を付与した１組の以前に記載された変異を含有した（Ｒａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４巻、１０６９６〜７０１頁（２００５年）における改変体「２〜４」）。この一連の改変体を図１に示す。改変体ｈａＷＴは、ＣＤ２５に対する高い親和性に寄与する変異のみを含有した。改変体ｈａＤ、ｈａＤ．１、ｈａＤ．２などはまた、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２Ｒγとの相互作用を改変することが予測される変異を含有した。すべてのアッセイにおいて、改変体ｈａＤ．１１は、いかなるシグナルをも誘発することができず、いかなる細胞表現型をも改変することができず、そのため、ＩＬ−２Ｒシグナル伝達を伴わないＣＤ２５結合についての対照として役立った。すべてのＩＬ−２改変体は、製造しやすさの改善のためにＣ１２５Ｓ変異を含有し、ＦＬＡＧおよびＨＩＳタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＳＳＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１１）で終結した。

いくつかのアッセイは、ＩＬ−２改変体がシグナル伝達事象およびＴ細胞成長を誘発する能力を評価するために使用した。これらは、
１．Ｔ細胞サブセットの成長および生存ならびにＦＯＸＰ３発現の測定
２．細胞シグナル伝達（たとえばフローサイトメトリー法およびＥＬＩＳＡベースの方法を使用する、リン酸化ＳＴＡＴ５およびＡＫＴの検出）
を検出するためのアッセイを含んだ。

（実施例２：ＦＯＸＰ３^＋細胞の豊富化および長期Ｔ細胞培養の間のＦＯＸＰ３アップレギュレーションの保持）
全ＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を用いてウェル当たり４×１０^６細胞で２４ウェルプレート中で活性化した。培養の３日目に、細胞を３回洗浄し、３日間新鮮な培地中に置いた。次いで、細胞を洗浄し、１０ｎＭまたは１００ｐＭのＩＬ−２改変体を有する９６ウェル平底プレート中に接種した。３日後、細胞は、フローサイトメトリーによってカウントし、分析した（図２Ａ）。

期待されるように、ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞は、ＷＴ ＩＬ−２および改変体ｈａＷＴにとりわけ反応したが、変異ＩＬ−２Ｒβおよび／またはγ接触残基を含有したすべての改変体は、活性化ＣＤ８^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の蓄積の促進で非常に非効率的であった（図２Ｂ）。同様の傾向は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞について観察された（図２Ｃ）。対照的に、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の成長／生存は、ＷＴ ＩＬ−２に類似する程度までいくつかのＩＬ−２改変体によって刺激された（図２Ｄ）。その結果として、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の中のＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞に対するＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞の比は、ＩＬ−２Ｒβγ接触残基変異を有するいくつかのＩＬ−２改変体によって増加した（図２Ｅ）。さらに、変異は、Ｔ−ｒｅｇにおいてＩＬ−２刺激ＦＯＸＰ３アップレギュレーションを弱めなかった（図２Ｆ）。

（実施例３：ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞においてシグナル伝達を低下させるが、Ｔ−ｒｅｇにおいてＳＴＡＴ５シグナル伝達を刺激する変異）
ＩＬ−２改変体を、Ｔ細胞サブセットにおいて、ＡＫＴおよびＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激するそれらの能力についてスクリーニングした。いくつかのＩＬ−２改変体は、刺激の１０分後のＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５の刺激において、ｗｔ ＩＬ−２と同じくらい強力であったか、またはほぼ同じくらい強力であった。培地からＩＬ−２を洗い流してから３時間後に、いくつかのＩＬ−２改変体（ｈａＤ、ｈａＤ．１、ｈａＤ．２、ｈａＤ．４、ｈａＤ．６、およびｈａＤ．８）は、ｗｔ ＩＬ−２で見られたものよりも高いレベルで持続性のＳＴＡＴ５シグナル伝達を刺激し続けた。対照的に、ＦＯＸＰ３⁻Ｔ細胞について、１０分間の刺激後、ｈａＤ改変体に対するＳＴＡＴ５およびＡＫＴの反応は、ｗｔ ＩＬ−２またはｈａＷＴによって刺激されたものに比べれば全く高くなかった。３時間後に、ｗｔ ＩＬ−２で見られたものに類似する弱いＳＴＡＴ５およびＡＫＴのシグナルが、Ｔ−ｅｆｆにおいて観察されたが、この後期の時点で、ｗｔ ＩＬ−２シグナル伝達は大幅に小さくなった。ＦＯＸＰ３^＋Ｔ細胞において、ＡＫＴシグナル伝達は、ＩＬ−２によって通常刺激されない（Ｚｅｉｓｅｒ Ｒら、２００８年 Ｂｌｏｏｄ １１１巻：４５３頁）、したがって、全Ｔ細胞溶解物において観察されたホスホ−ＡＫＴシグナルは、Ｔ−ｅｆｆに起因し得る。

方法：あらかじめ活性化させ（２〜３日間、抗ＣＤ３を用いて）、置いておいた（２〜５日間、新鮮な培地中で）Ｔ細胞を、３７℃で１０分間、１ｎＭ ｗｔまたは変異体ＩＬ−２に曝露した。次いで、細胞は、染色し（１０分の時点）または洗浄し、さらに３時間培養した（３時間の時点）。ＥＬＩＳＡによってホスホ−ＡＫＴを測定するために、５０μｌ培養物を、等容量の２×溶解緩衝液を追加することによって停止させ、溶解物は、製造業者のプロトコールに従って多重ＥＬＩＳＡプレートを用いて、ホスホ−ＡＫＴについて測定した（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）。フローサイトメトリーによってホスホ−ＳＴＡＴ５を測定するために、５０μｌ培養物は、１ｍｌのＦＯＸＰ３ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の追加によって停止させ、２０分間２５℃でインキュベーションし、そしてＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＦＯＸＰ３染色プロトコールに従い細胞表面マーカー、ＦＯＸＰ３およびホスホ−ＳＴＡＴ５を染色した。

Claims (19)

1. 被験体において炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための組成物であって、該組成物は、ＩＬ−２改変体を含み、該ＩＬ−２改変体は、
   （ａ）配列番号１に少なくとも９０％同一のアミノ酸の配列を含み、
   （ｂ）ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激し、
   （ｃ）配列番号１として記載されるポリペプチドと比較して、ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発する能力が低下しており、および
   （ｄ）（ｉ）配列番号１として記載されるポリペプチドよりも高い、ＩＬ−２Ｒα親和性を有するか、（ｉｉ）配列番号１として記載されるポリペプチドよりも低下した、ＩＬ−２Ｒβおよび／もしくはＩＬ−２Ｒγ親和性を有するか、または、（ｉｉｉ）該（ｉ）と（ｉｉ）の両方であり、
   該炎症性疾患、障害または状態は、自己免疫疾患、器官移植片拒絶、または、移植片対宿主病である、組成物。
2. 前記炎症性疾患、障害または状態は、喘息、糖尿病、関節炎、アレルギー、器官移植片拒絶、および移植片対宿主病からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＩＬ−２改変体は、配列番号１に少なくとも９５％同一のアミノ酸の配列を含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ＩＬ−２改変体は、配列番号１として記載されるポリペプチドよりも高い、ＩＬ−２Ｒα親和性を有する、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ＩＬ−２改変体は、インビトロにおいて、ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞の成長または生存を促進する、請求項１に記載の組成物。
6. 前記ＩＬ−２改変体は、アミノ酸３０、アミノ酸３１、アミノ酸３５、アミノ酸６９、およびアミノ酸７４からなる群より選択される位置に、配列番号１において記載されるポリペプチド配列において変異を含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記３０位の変異は、Ｎ３０Ｓである、請求項６に記載の組成物。
8. 前記３１位の変異は、Ｙ３１Ｈである、請求項６に記載の組成物。
9. 前記３５位の変異は、Ｋ３５Ｒである、請求項６に記載の組成物。
10. 前記６９位の変異は、Ｖ６９Ａである、請求項６に記載の組成物。
11. 前記７４位の変異は、Ｑ７４Ｐである、請求項６に記載の組成物。
12. 前記ＩＬ−２改変体は、機能的ＩＬ−２受容体複合体を含むエクスビボＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を誘発するが、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発する能力が低下している、請求項１に記載の組成物。
13. 前記ＩＬ−２改変体は、配列番号１において記載されるポリペプチド配列の８８位において変異を含む、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記８８位の変異は、Ｎ８８Ｄである、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記ＩＬ−２改変体は、インビボにおいて該ＩＬ−２改変体の血清半減期を延長する化学物質またはポリペプチドに結合体化されている、請求項１に記載の組成物。
16. 炎症性疾患、障害または状態の処置のための医薬の調製におけるＩＬ−２改変体の使用であって、該ＩＬ−２改変体は、
    （ａ）配列番号１に少なくとも９０％同一のアミノ酸の配列を含み、
    （ｂ）ＦＯＸＰ３陽性調節性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激し、
    （ｃ）配列番号１として記載されるポリペプチドと比較して、ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を誘発する能力が低下しており、および
    （ｄ）（ｉ）配列番号１として記載されるポリペプチドよりも高い、ＩＬ−２Ｒα親和性を有するか、（ｉｉ）配列番号１として記載されるポリペプチドよりも低下した、ＩＬ−２Ｒβおよび／もしくはＩＬ−２Ｒγ親和性を有するか、または、（ｉｉｉ）該（ｉ）と（ｉｉ）の両方であり、
    該炎症性疾患、障害または状態は、自己免疫疾患、器官移植片拒絶、または、移植片対宿主病である、使用。
17. 前記ＩＬ−２改変体は、インビボにおいて該ＩＬ−２改変体の血清半減期を延長する化学物質またはポリペプチドに結合体化されている、請求項１６に記載の使用。
18. 前記ＩＬ−２改変体は、
    配列番号３に記載のアミノ酸；
    配列番号４に記載のアミノ酸；
    配列番号５に記載のアミノ酸；
    配列番号６に記載のアミノ酸；
    配列番号８に記載のアミノ酸；および
    配列番号９に記載のアミノ酸；
    からなる群より選択されるアミノ酸の配列を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
19. 前記ＩＬ−２改変体は、
    配列番号３に記載のアミノ酸；
    配列番号４に記載のアミノ酸；
    配列番号５に記載のアミノ酸；
    配列番号６に記載のアミノ酸；
    配列番号８に記載のアミノ酸；および
    配列番号９に記載のアミノ酸；
    からなる群より選択されるアミノ酸の配列を含む、請求項１６〜１７のいずれかに記載の使用。

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