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JP5563673B2 - 新規メイタンシノイドを含む改良された細胞毒性薬 - Google Patents

新規メイタンシノイドを含む改良された細胞毒性薬 Download PDF

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JP5563673B2 JP2013000052A JP2013000052A JP5563673B2 JP 5563673 B2 JP5563673 B2 JP 5563673B2 JP 2013000052 A JP2013000052 A JP 2013000052A JP 2013000052 A JP2013000052 A JP 2013000052A JP 5563673 B2 JP5563673 B2 JP 5563673B2
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Description

発明の詳細な説明
本願は、２００３年５月２０日に出願された予備出願第６０／４７１，７３９号の利益を主張する。該出願の開示内容は引用によって本明細書に援用する。
発明の分野
本発明は、メイタンシノイドと細胞結合剤を含む改良された細胞毒性複合体の製造法に関する。これらの複合体は、特定の細胞集団に標的化された様式で送達されるので治療的用途を有する。本発明はまた、細胞毒性複合体の製造に使用されうるチオール部分を有するメイタンシノイドの製造法にも関する。本発明はさらに、新規メイタンシノイド、及び新規メイタンシノイド合成時の新規中間体にも関する。
発明の背景
モノクロナール抗体−薬物複合体による腫瘍細胞の特異的標的化の試みに関する多くの報告がある（Ｓｅｌａら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ １８９−２１６（Ｃ．Ｖｏｇｅｌ編、１９８７）；Ｇｈｏｓｅら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇｓ １−２２（Ｅ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ編、１９８３）；Ｄｉｅｎｅｒら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ １−２３（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２５−５３（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８）；Ｂｕｍｏｌら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ５５−７９（Ｊ．Ｒｏｄｗｅｌｌ編、１９８８））。メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、及びクロランブシルのような細胞毒性薬が様々なマウスモノクロナール抗体に連結されている。場合によっては、薬物分子は、血清アルブミン（Ｇａｒｎｅｔｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：２４０７−２４１２（１９８６）；Ｏｈｋａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：８１−８６（１９８６）；Ｅｎｄｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：１０７６−１０８０（１９８０））、デキストラン（Ｈｕｒｗｉｔｚら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：２５−３５（１９８０）；Ｍａｎａｂｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４：２８９−２９１（１９８５）；Ｄｉｌｌｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：４８８６−４８９１（１９８６）；Ｓｈｏｖａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８２７６−８２８０（１９８８））、又はポリグルタミン酸（Ｔｓｕｋａｄａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．７３：７２１−７２９（１９８４）；Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１６０２−１６０７（１９８４）；Ｔｓｕｋａｄａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５２：１１１−１１６（１９８５））のような中間担体分子を通じて抗体分子に連結されることもあった。
そのような免疫複合体の製造には様々なリンカー技術が使用されており、切断性及び非切断性のリンカーともに研究されている。しかしながら、ほとんどの場合、薬物の完全な細胞毒性能力は、薬物分子が標的部位で非修飾形で複合体から放出されうる場合にしか観察され得ない。
抗体−薬物複合体の製造に使用されている一つの切断性リンカーは、シス−アコニット酸を利用した酸不安定性リンカーである。これは、受容体媒介性エンドサイトーシス時に遭遇するエンドソームやリソソームのような異なる細胞内コンパートメントの酸性環境を利用したものである。ＳｈｅｎとＲｙｓｅｒは、この方法をダウノルビシンと巨大分子担体との複合体の製造に導入した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８−１０５４（１９８１））。ＹａｎｇとＲｅｉｓｆｅｌｄは、同じ
技術を使用してダウノルビシンを抗黒色腫抗体に連結した（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８０：１１５４−１１５９（１９８８））。最近、Ｄｉｌｌｍａｎらも酸不安定性リンカーを同様に使用してダウノルビシンを抗Ｔ細胞抗体と複合体化した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：６０９７−６１０２（１９８８））。
Ｔｒｏｕｅｔらが探求した代替の手法は、ダウノルビシンをペプチドスペーサアームを介して抗体に連結するというものであった（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６２６−６２９（１９８２））。これは、リソソームペプチダーゼの作用によってそのような複合体から遊離薬物が放出されるという前提のもとに実施された。
しかしながら、インビトロの細胞毒性試験から、抗体−薬物複合体が、複合体化されていない遊離薬物と同じ細胞毒性力を達成するのは稀であることが明らかになった。このことは、薬物分子が抗体から放出される機序が極めて非効率的であることを示唆している。イムノトキシンの分野では、モノクロナール抗体と触媒活性タンパク質トキシン間をジスルフィドブリッジで連結して形成した複合体のほうが、その他のリンカーを含有する複合体より細胞毒性が強いことが示されている。Ｌａｍｂｅｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１２０３５−１２０４１（１９８５）；Ｌａｍｂｅｒｔら、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ １７５−２０９（Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌ編、１９８８）；Ｇｈｅｔｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６１０−２６１７（１９８８）参照。これは、抗体分子とトキシン間のジスルフィド結合の効率的切断に寄与するグルタチオンの細胞内濃度が高いことに起因していた。にもかかわらず、薬物と巨大分子間の複合体の製造にジスルフィドブリッジを使用した例はあまり報告されていない。Ｓｈｅｎらは、メトトレキサートをメルカプトエチルアミド誘導体に転化した後、ジスルフィド結合を介してポリ−Ｄ−リシンと複合体化することについて記載している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０９０５−１０９０８（１９８５））。さらに、トリスルフィド含有毒性薬のカリチェアミシン(calicheamicin)と抗体との複合体の製造について記載した報告がいくつかある（Ｈｉｎｍ
ａｎら、５３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３３３６−３３４２（１９９３）、Ｈａｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１３，４０−４６（２００２）、Ｈａｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１３，４７−５８（２００２））。
ジスルフィドで連結された抗体−薬物複合体が少ない一つの理由は、ジスルフィドブリッジを介して薬物を抗体に連結するのに容易に使用できる硫黄原子含有部分を持つ細胞毒性薬が入手できないことである。さらに、既存の薬物をそれらの細胞毒性能力を低下させずに化学修飾するのは困難である。
メイタンシノイドは非常に細胞毒性の強い薬物である。メイタンシンは、Ｋｕｐｃｈａｎらが東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから初めて単離し、メトトレキサート、ダウノルビシン及びビンクリスチンのような従来のがん化学療法薬より１００〜１０００倍細胞毒性が強いことを示した（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、一部の微生物もメイタンシノイド、例えばメイタンシノール及びメイタンシノールのＣ−３エステルを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成のメイタンシノールＣ−３エステル及びメイタンシノール類似体も報告されている（Ｋｕｐｃｈａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２１：３１−３７（１９７８）；Ｈｉｇａｓｈｉｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ２７０：７２１−７２２（１９７７）；Ｋａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２：３４４１−３４５１（１９８４））。メイタンシノールの類似体（それからＣ−３エステルが製造される）の例は、芳香環上（例えば脱クロロ）又はＣ−９、Ｃ−１４（例えばヒドロキシル化メチル基）、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２０及びＣ−４，５で修飾されているメイタンシノールなどである。
天然及び合成のメイタンシノールＣ−３エステルは２つのグループに分類できる。
（ａ）単純カルボン酸とのＣ−３エステル（米国特許第４，２４８，８７０号；４，２６５，８１４号；４，３０８，２６８号；４，３０８，２６９号；４，３０９，４２８号；４，３１７，８２１号；４，３２２，３４８号；及び４，３３１，５９８号）、及び
（ｂ）Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体とのＣ−３エステル（米国特許第４，１３７，２３０号；４，２６０，６０８号；５，２０８，０２０号；及びＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１２：３４４１（１９８４））。
（ｂ）グループのエステルは（ａ）グループのエステルよりもかなり細胞毒性が強いことが分かった。
メイタンシンは有糸分裂阻害薬である。Ｌ１２１０細胞をインビボでメイタンシンで処理すると、６７％の細胞が有糸分裂に集積したと報告されている。非処理対照細胞は３．２〜５．８％の範囲の分裂指数を示すことが報告されている（Ｓｉｅｂｅｒら、４３ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９７５，Ｂｉｂｌ．Ｈａｅｍａｔ．４９５−５００（１９７６））。ウニ卵及び二枚貝卵を用いた実験から、メイタンシンは、微小管タンパク質のチューブリンの重合の阻害を通じて微小管の形成を妨害することによって分裂を阻害することが示唆されている（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２−１００５（１９７５））。
インビトロでは、Ｐ３８８、Ｌ１２１０、及びＬＹ５１７８のマウス白血病細胞懸濁液が、１０−３〜１０−１μｇ／μｌの用量のメイタンシンによって阻害されることが見出されている。中でもＰ３８８株が最も感受性が高かった。メイタンシンはまた、ヒト上咽頭がん細胞のインビトロ成長の活性阻害薬であることも示され、ヒト急性リンパ芽球性白血病株ＣＥＭは、わずか１０−７ μｇ／ｍｌの濃度で阻害されたことも報告されている（Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｌｉｐｐｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１７３５−１７３８（１９７５））。
インビボでもメイタンシンは活性であることが示されている。Ｐ３８８リンパ性白血病系の腫瘍成長は、高い治療指数を示唆する５０〜１００倍の用量範囲で阻害されることが示されている。また顕著な阻害活性は、Ｌ１２１０マウス白血病系、ヒトルイス肺がん系及びヒトＢ−１６悪性黒色腫系でも示されるようである（Ｋｕｐｃｈａｎ、Ｐｅｄ．Ｐｒｏｃ．３３：２２８８−２２９５（１９７４））。細胞結合剤との複合体化に使用されるメイタンシノイドは、米国特許第５，２０８，０２０号及び５，４１６，０６４号並びにＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：１２７−１３１（１９９２）及びＬｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：８６１８−８６２３（１９９６）に記載されている。これらの複合体において、細胞結合剤はジスルフィド結合を介してメイタンシノイドＤＭ１［Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン、１、ＣＡＳ番号：１３９５０４−５０−０、図１］に連結されている。
上記特許において、アシル化Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン側鎖を持つメイタンシノイド薬は、式２ａ、ｂ：
Figure 0005563673
である。式２ａ中、ｌは１〜１０の整数を表す。このように、式２ａのメイタンシノイドは非置換メチレン基に接続された硫黄原子を有している（−ＣＨ２−Ｓ−）。そのようなメイタンシノイド化合物中のスルフヒドリル基又はそのようなメイタンシノイドを持つジスルフィド連結細胞結合剤−メイタンシノイド複合体中のジスルフィド基は、スルフヒドリル又はジスルフィド基に隣接するα炭素上に立体障害をもたらす嵩高い置換基がないので、“非障害”である。図２ｂ中、ｍは０、１、２又は３を表す。従って、式２ｂのメイタンシノイドも非置換メチレン基に接続された硫黄原子を有している。例外はｍ＝０で、Ｒ２＝ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３の場合である。ｍ＝０の場合、メイタンシノイドは、ジスルフィド結合を介して細胞結合剤と複合体化した後、チオール官能基又はジスルフィド官能基を持つ炭素上に１個の置換基を持つことになる。しかしながら、この場合、硫黄原子はカルボニル基に対してβ位にあるので、これらのメイタンシノイド及びそのようなメイタンシノイドと細胞結合剤とのジスルフィド結合を介した複合体は、β脱離を受けやすいために不安定であることが分かっている。
発明の要旨
本発明は、立体障害されたチオール基を持つ（チオール官能基を持つα炭素上に１又は２個の置換基を持つ）メイタンシノイドと細胞結合剤との連結によって、ジスルフィド結合を持つα炭素原子上に置換基を持たない従来報告のメイタンシノイドで製造された複合体に比べて、インビボで非常に改良された抗腫瘍活性を有する複合体が得られたという思いがけない発見に基づいている。別の意外な発見は、改良された生物活性は、立体障害が複合体中のジスルフィド結合のメイタンシノイド側で最適な場合に得られるということであった。さらに、スルフヒドリル基を持つメイタンシノイドのアシル化アミノ酸側鎖のアシル基は、アミドのカルボニル基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を持たなければならない。
これらの発見は、ジスルフィド連結細胞結合剤−メイタンシノイド複合体は、ジスルフィド結合を持つ２個のα炭素原子上の置換が、ジスルフィド結合のいずれかの側に様々な程度の立体障害をもたらし得るように構築できることを示している。
従って、本発明は、新規な立体障害されたチオール及びジスルフィド含有メイタンシノイド、すなわち硫黄原子を持つα炭素原子上に１又は２個のアルキル置換基を持つメイタンシノイドの合成について記載する。さらに、アシル化アミノ酸側鎖のアシル基は、アミドのカルボニル基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を持つ。
これらの新規メイタンシノイドの細胞結合剤複合体の製造及び生物学的評価についても記載する。
本発明の一態様において、硫黄原子を持つ炭素原子上にモノ又はジ−アルキル置換を持
つ新規なチオール及びジスルフィド含有メイタンシノイドを記載する。
第二の態様において、本発明は、これらの新規メイタンシノイドの合成法を開示する。
第三の態様において、これらの新規メイタンシノイドと細胞結合剤との連結法を記載する。これらの複合体は、標的細胞に特異的に送達され細胞毒性があるので治療薬として有用である。これらの複合体は、以前に報告された薬剤に比べて非常に改良された治療効果を動物腫瘍モデルにおいて示す。
更に詳しくは、本発明は以下の事項を提供する。
Ｃ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ、又はＣ−２０のデスメチルに、障害されたスルフヒドリル基を持つアシル基でアシル化されたアミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドであって、チオール官能基を持つ前記アシル基の炭素原子は１又は２個の置換基を有し、前記置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらに前記置換基の一つはＨであってもよく、そして前記アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有するメイタンシノイド。
式４’：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ’は、
（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡ ｏ （ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ １０ 、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して０又は１〜５の整数であるが、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの少なくとも二つはいかなるときも０でなく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル
又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］で表される化合物。
Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、ＺがＨである式４’で表される化合物。
Ｒ1及びＲ2がメチルであり、ＺがＨである式４’で表される化合物。
Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｚが−ＳＣＨ3である式４’で表される化合物。
Ｒ１及びＲ２がメチルであり、Ｚが−ＳＣＨ３である式４’で表される化合物。
式（Ｉ−Ｌ）、（Ｉ−Ｄ）、又は（Ｉ−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙは、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；そして
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ又はＣ−２０のデスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す］で表される化合物。
Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、ＺがＨである上記化合物。
Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、ＺがＨである上記化合物。
Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ3である上記化合物。
Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ3である上記化合物。
式４：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙは、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；そして
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］で表される化合物。
Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8がそれぞれＨであり；ｌ及びｍがそれぞれ１であり；ｎが０であり；ＺがＨである式４の化合物。
Ｒ1及びＲ2がメチルであり；Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり；ｎが０であり；ＺがＨである式４の化合物。
Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ3である式４の化合物。
Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ3である式４の化合物。
メイタンシノイドが上記化合物のいずれかである、細胞結合剤に連結された少なくとも一つのメイタンシノイドを含むメイタンシノイド−細胞結合剤複合体。
細胞結合剤が少なくとも一つの抗体、好ましくはヒト化又はリサーフェス化ＭＹ９、ヒト化又はリサーフェス化抗Ｂ４、又はヒト化又はリサーフェス化Ｃ２４２の結合部位を含む、上記いずれかのメイタンシノイド−細胞結合剤複合体。
有効量の上記いずれかのメイタンシノイド−細胞結合剤複合体、その製薬学的に許容しうる塩又は溶媒和物、及び製薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
メイタンシノイドをＣ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ、又はＣ−２０のデスメチルの位置でアシル化アミノ酸側鎖でエステル化する方法であって、アシル基は保護されたスルフヒドリル官能基を持ち、保護チオール官能基を持つアシル基の炭素原子は１又は２個の置換基を有し、前記置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらに置換基の一つはＨであってもよく、前記アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有し、前記方法は、メイタンシノイドをＣ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ又はＣ−２０のデスメチルの位置でアシル化アミノ酸（アシル基は保護されたスルフヒドリル基を持つ）と反応させることを含む方法。
式（IV−Ｌ）、（IV−Ｄ）、又は（IV−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲ又はＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；そして
Ｍａｙはメイタンシノイドである］で表されるメイタンシノイドエステルを製造するためのメイタンシノイドのエステル化法であって、前記方法は、前記メイタンシノイドを、Ｃ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ、又はＣ−２０のデスメチルの位置で、式（III−Ｌ）、（III−Ｄ）、又は（III−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖又は分枝アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；そして
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］の化合物と反応させることを含む方法。
Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれＨであり；ｌ及びｍがそれぞれ１であり；ｎが０である上記方法。
式（III）の化合物が式（III−Ｌ）で表される上記方法。
式（III−Ｌ）の化合物が、化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）、１５ｂ（Ｓ，Ｒ）又は１５ａ（
Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物である上記方法。
式（III−Ｄ）の化合物が、化合物１５（Ｒ，Ｓ）、１５（Ｒ，Ｒ）又は１５（Ｒ，Ｓ
）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物である上記方法。
式（III−Ｄ，Ｌ）の化合物が、保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基でア
シル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンであり、硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである上記方法。
１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物が、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物を得る
ことを含むプロセスによって製造される上記方法。
化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）が、
（１）（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを（Ｓ）−４−（メチルジチオ）ペンタン酸１９に転化し；
（２）化合物１９をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２０）に転化し；そして
（３）化合物２０をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）を得る
ことを含む方法によって製造される上記方法。
化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）が、
（１）（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを（Ｒ）−４−（メチルジチオ）ペンタン酸２４に転化し；
（２）化合物２４をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２５）に転化し；そして
（３）化合物２５をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）を得る
ことを含む方法によって製造される上記方法。
化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物が、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をＮ−メチル−Ｄ−アラニンと反応させて前記化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物を得る
ことを含むプロセスによって製造される上記方法。
保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンが、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をラセミ体のＮ−メチルアラニンと反応させて、保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンを得る
ことを含むプロセスによって製造される上記方法。
Ｒ１及びＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８がそれぞれＨであり；ｌ及びｍがそれぞれ１であり；ｎが０である上記方法。
式（III−Ｌ）の化合物が、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンを含有する化合物１０（Ｓ）で
ある上記方法。
式（III−Ｄ）の化合物が、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニンを含有する化合物１０（Ｒ）で
ある上記方法。
式（III−Ｄ，Ｌ）の化合物が、ラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する化合物１０
（Ｓ，Ｒ）である上記方法。
Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン又はラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する化合物１０が、
（１）イソブチレンスルフィド（５）をアセトニトリルのアニオンと反応させて化合物６を得；
（２）化合物６を加水分解して４−メルカプト−４−メチルペンタン酸（７）を得；
（３）化合物７をメチルメタンチオールスルホネートとの反応によってジスルフィド８に転化し；
（４）化合物８をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル９に転化し；そして
（５）化合物９をＮ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンと反応させて、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する前記化合物１０を得る
ことを含むプロセスによって製造される上記方法。
ジアステレオマーが存在する場合それを分離し、そしてシアノ結合シリカ上のＨＰＬＣによってメイタンシノイドを精製する、上記方法のいずれか一つの方法によるメイタンシノイドの製造法。
上記方法のいずれかによって精製メイタンシノイドを製造し、そして該精製メイタンシノイドを、反応性ジチオ基又はスルフヒドリル基を含む細胞結合剤と反応させることを含むメイタンシノイド−細胞結合剤複合体の製造法。
反応性ジチオ基がジチオピリジル基又は置換ジチオピリジル基である、上記メイタンシノイド−細胞結合剤複合体の製造法。
上記方法のいずれかによって精製メイタンシノイドを製造し、そして該精製メイタンシノイドを、マレイミド基又はハロアセチル基を含む細胞結合剤と反応させることを含むメイタンシノイド−細胞結合剤複合体の製造法。
式４２’：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２’は、
（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡ ｏ （ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、及びＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純又は置換アリール、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ １０ 、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して０又は１〜５の整数であるが、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの少なくとも二つはいかなるときも０でなく；そして
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］のメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールのエステル化法であって、前記方法は、構造１１のメイタンシノール：
Figure 0005563673
をＣ−３の位置で、式（III’−Ｌ）、（III’−Ｄ）、又は（III’−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２’は、
（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡ ｏ （ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、及びＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純又は置換アリール、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ １０ 、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して０又は１〜５の整数であるが、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの少なくとも二つはいかなるときも０でなく；そして
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］の化合物と反応させることを含む方法。
式（Ｉ）の化合物が式（Ｉ−Ｌ）で表される式４2’のメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールのエステル化法。
Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨである式４2’のメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールのエステル化法。
式４２：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲ又はＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］のメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールのエステル化法であって、前記方法は、構造１１のメイタンシノール：
Figure 0005563673
をＣ−３の位置で、式（III−Ｌ）、（III−Ｄ）、又は（III−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲ又はＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］の化合物と反応させることを含む方法。
式（III）の化合物が式（III−Ｌ）で表される、式４ａのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
前記式（III−Ｌ）の化合物が、化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）、１５ｂ（Ｓ，Ｒ）又は１５
ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物である、式４ａのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
前記式（III−Ｄ）の化合物が、化合物１５（Ｒ，Ｓ）、１５（Ｒ，Ｒ）、又は１５（
Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物である、式４ａのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
前記式（III−Ｄ，Ｌ）の化合物が、保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基
でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンであり、硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである、式４ａのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物が、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物を得る
ことを含むプロセスによって製造される、式４ａのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
前記化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）が、
（１）（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを（Ｓ）−４−（メチルジチオ）ペンタン酸１９に転化し；
（２）化合物１９をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２０）に転化し；そして
（３）化合物２０をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）を得る
ことを含む方法によって製造される、メイタンシノールの上記エステル化法。
前記化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）が、
（１）（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを（Ｒ）−４−（メチルジチオ）ペンタン酸２４に転化し；
（２）化合物２４をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２５）に転化し；そして
（３）化合物２５をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）を得る
ことを含む方法によって製造される、メイタンシノールの上記エステル化法。
化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物が、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をＮ−メチル−Ｄ−アラニンと反応させて前記化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物を得る
ことを含むプロセスによって製造されうる、式４ａのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンが、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をラセミ体のＮ−メチルアラニンと反応させて、保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンを得る
ことを含むプロセスによって製造される、式４ａのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
Ｒ１及びＲ２がメチルであり；Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８がそれぞれＨであり；ｌ及びｍが１であり；ｎが０である、式４ｂのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
前記式（III−Ｌ）の化合物が、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンを含有する化合物１０であ
る、式４ｂのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
前記式（III−Ｄ）の化合物が、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニンを含有する化合物１０であ
る、式４ｂのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
前記式（III−Ｄ，Ｌ）の化合物が、ラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する化合物
１０である、式４ｂのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン又はラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する化合物１０が、
（１）イソブチレンスルフィド（５）をアセトニトリルのアニオンと反応させて化合物６を得；
（２）化合物６を加水分解して４−メルカプト−４−メチルペンタン酸（７）を得；
（３）化合物７をメチルメタンチオールスルホネートとの反応によってジスルフィド８に転化し；
（４）化合物８をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル９に転化し；そして
（５）化合物９をＮ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンと反応させて、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン又はラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する化合物１０を得る
ことを含むプロセスによって製造される、式４ｂのメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールの上記エステル化法。
１０によるメイタンシノールのエステル化の後、ジアステレオマーが存在する場合それ
を分離し、そしてシアノ結合シリカ上のＨＰＬＣによってメイタンシノイドを精製する上記方法が、式４ｂのメイタンシノイドを得るためにジスルフィド結合を還元することをさらに含む上記方法。
メイタンシノールをエステル化して式４ｂのメイタンシノイドを得る上記いずれかの方法によって精製メイタンシノイドを製造し、そして該メイタンシノイドを、スルフヒドリル基又は反応性ジチオ基、好ましくはジチオピリジル基又は置換ジチオピリジル基を含む細胞結合剤と反応させることを含むメイタンシノイド−細胞結合剤複合体の製造法。
メイタンシノールをエステル化して式４ｂのメイタンシノイドを得る上記いずれかの方法によって精製メイタンシノイドを製造し、そして該メイタンシノイドを、マレイミド又はハロアセチル基を含む細胞結合剤と反応させることを含むメイタンシノイド−細胞結合剤複合体の製造法。
上記複合体を用いる治療法。
式（III）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有す
る直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；そして
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］の化合物。
化合物１０（Ｓ）、１０（Ｒ）又はラセミ体１０。
Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する化合物１０の製造法であって、
（１）イソブチレンスルフィド（５）をアセトニトリルのアニオンと反応させて化合物６を得；
（２）化合物６を加水分解して４−メルカプト−４−メチルペンタン酸（７）を得；
（３）化合物７をメチルメタンチオールスルホネートとの反応によってジスルフィド８に転化し；
（４）化合物８をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル９に転化し；そして
（５）化合物９をＮ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンと反応させて、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する前記化合物１０を得る
ことを含む方法。
化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物。
化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物の製造法であって、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１４）に転化し；
（３）化合物１４をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物を得る
ことを含む方法。
化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物。
化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物の製造法であって、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をＮ−メチル−Ｄ−アラニンと反応させて前記化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物を得る
ことを含む方法。
保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基でアシル化され、硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである、ラセミ体のＮ−メチルアラニン。
保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンの製造法であって、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をラセミ体のＮ−メチルアラニンと反応させて、保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンを得る
ことを含む方法。
化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）。
化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）。
化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）の製造法であって、
（１）（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを（Ｓ）−４−（メチルジチオ）ペンタン酸１９に転化し；
（２）化合物１９をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２０）に転化し；そして
（３）化合物２０をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）を得る
ことを含む方法。
化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の製造法であって、
（１）（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを（Ｒ）−４−（メチルジチオ）ペンタン酸２４に転化し；
（２）化合物２４をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２５）に転化し；そして
（３）化合物２５をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）を得る
ことを含む方法。
有効量の上記いずれかのメイタンシノイド化合物、その製薬学的に許容しうる塩又は溶媒和物、及び製薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
抗体をさらに含む、メイタンシノイド化合物を含む上記医薬組成物。
選択された細胞集団に細胞死を誘導する方法であって、標的細胞又は標的細胞を含有する組織を、有効量の上記いずれかのメイタンシノイド−細胞結合剤、その塩又は溶媒和物に接触させることを含む方法。
発明の詳細な説明
本発明は、新規な立体障害されたチオール及びジスルフィド含有メイタンシノイド、すなわち硫黄原子を持つα炭素原子が１又は２個のアルキル置換基を持つメイタンシノイドを開示する。本発明はまた、これらの新規メイタンシノイドの合成法も開示する。新規メイタンシノイドの合成において中間体として有用な新規化合物もさらに開示する。また、本発明はこれらの新規メイタンシノイドと細胞結合剤との複合体の製造も開示する。
既存の薬物をそれらの細胞毒性能を低減させずに修飾するのは極めて難しいことが技術的に明らかになっている。開示された本発明は、立体障害されたチオール又はジスルフィド部分を含有する新規メイタンシノイド分子の合成法を教示することによってこの問題を克服している。開示された新規メイタンシノイドは、従前のメイタンシノイドの細胞毒性力を保存、及び時には増強さえする。
該メイタンシノイド−細胞結合剤複合体は、標的化された様式で望まざる細胞だけに対して適用されるメイタンシノイドが最大限の細胞毒性作用を行使できるため、非標的健常細胞の損傷による副作用が回避される。従って、本発明は、殺滅又は溶解されるべき疾患細胞又は異常細胞、例えば腫瘍細胞（特に充実性腫瘍細胞）、ウィルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫細胞（自己抗体産生細胞）、活性化細胞（移植片拒絶又は移植片対宿主疾患に関与する細胞）、又は任意のその他の型の疾患細胞又は異常細胞を、最小限の副作用で除去するのに有用な薬剤、及びそれを製造するための新規方法を提供する。
従って、本発明は、新規メイタンシノイドと細胞結合剤を含む改良された細胞毒性複合体の製造法を教示する。該複合体は従前のメイタンシノイド及び細胞結合剤と比べて非常に改良された生物活性を有する。本発明はさらに、細胞結合剤への化学連結を可能にする、立体障害されたチオール又はジスルフィド部分を有するメイタンシノイド誘導体の合成法も教示する。該誘導体は、結合形態でも放出形態でもその両方の状態でも高い細胞毒性を発揮する。本発明による細胞毒性複合体は、細胞結合剤に連結された一つ以上のメイタンシノイドを含む。メイタンシノイドを細胞結合剤に連結するには、まずメイタンシノイ
ドを修飾しなければならない。
細胞結合剤に連結できるメイタンシノイドを製造するために本発明で使用できるメイタンシノイドは当該技術分野で周知であり、公知法に従って天然源から単離することも、公知法に従って合成的に製造することもできる。
適切なメイタンシノイドの例は、メイタンシノール及びメイタンシノール類似体などである。適切なメイタンシノール類似体の例は、修飾された芳香環を持つもの及びその他の位置に修飾を有するものなどである。
修飾された芳香環を持つ適切なメイタンシノール類似体の具体例は、
（１）Ｃ−１９−脱クロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元によって製造）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−脱メチル）＋／−Ｃ−１９−脱クロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセス又はアクチノマイセスを用いる脱メチル化又はＬＡＨを用いる脱塩素化によって製造）；及び
（３）Ｃ−２０−脱メトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−脱クロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（アシルクロリドを用いるアシル化によって製造）
などである。
その他の位置に修飾を有する適切なメイタンシノール類似体の具体例は、
（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２Ｓ又はＰ２Ｓ５との反応によって製造）；
（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（脱メトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジアから製造）；
（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの変換によって製造）；
（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号及び４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌーディフローラ(Trewia nudiflora)より単離）；
（６）Ｃ−１８−Ｎ−脱メチル（米国特許第４，３６２，６６３号及び４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの脱メチル化によって製造）；及び
（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって製造）
などである。
メイタンシノイドを細胞結合剤に連結させるために、メイタンシノイドは連結部分を含む。該連結部分は、特定の部位で完全活性メイタンシノイドの放出を可能にする化学結合を含有する。適切な化学結合は当該技術分野で周知であり、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、光に不安定な結合（光解離性結合）、ペプチダーゼに不安定な結合及びエステラーゼに不安定な結合などである。好適なのはジスルフィド結合である。
米国特許第５，２０８，０２０号（引用によって本明細書に援用）の開示内容はそのような結合を持つメイタンシノイドの製造を教示している。
本発明によれば、連結部分は立体障害されたチオール又はジスルフィド部分を含む。
反応性化学基を含有する連結部分を含む特に好適なメイタンシノイドは、連結部分に立
体障害されたチオール又はジスルフィド結合を含有するメイタンシノールのＣ−３エステル及びその類似体である。
メイタンシノイド上の多くの位置が、連結部分を化学的に連結するための位置として役割を果たすことができる。例えば、ヒドロキシル基を持つＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位及びヒドロキシ基を有するＣ−２０位はいずれも有用であると期待される。しかしながら、Ｃ−３位が好適で、メイタンシノールのＣ−３位が特に好適である。
さらに、連結部分を有するメイタンシノールのエステルの合成について、以下にＣ−３位にジスルフィド結合含有連結部分を有するものに関して記載するが、当業者であれば、前述のような他の化学結合を有する連結部分も、前述のような他のメイタンシノイド及び他の連結位置と同様に本発明に使用できることは分かるであろう。
本発明の様々なメイタンシノイドの構造を図２に示す。立体障害されたチオール又はジスルフィド部分を有するメイタンシノイドの合成は、図３の参照によって説明できる。以下に例示した多くの方法は、チオール含有メイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３と呼ぶ）及びＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４と呼ぶ）を利用する。ＤＭ３（４ａ）及びＤＭ４（４ｂ）は以下の構造式によって表される。
Figure 0005563673
本発明の新規な立体障害されたチオール及びジスルフィド含有メイタンシノイドのインビトロ細胞毒性は、インビトロにおける様々な望まざる細胞株の増殖を抑制するそれらの能力で評価できる（図４）。例えば、ヒト乳がん細胞株ＳＫ−Ｂｒ−３、又はヒト類表皮がん細胞株ＫＢのような細胞株は、これらの新規メイタンシノイドの細胞毒性の評価に使用できる。評価される細胞は、化合物に７２時間暴露され、細胞の生存画分を公知方法による直接アッセイで測定できる。次にアッセイの結果からＩＣ５０値が算出できる。
立体障害されたチオール又はジスルフィド部分を有するメイタンシノイドの製造
本発明の新規メイタンシノイドは、Ｃ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ、又はＣ−２０のデスメチルに、障害されたスルフヒドリル基を持つアシル基でアシル化されたアミノ酸側鎖を有するものである。チオール官能基を持つ該アシル基の炭素原子は１又は２個の置換基を有し、前記置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらに該置換基の一つはＨであってもよく、そして該アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有する。
好ましくは、該メイタンシノイド化合物は、式４’：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ’は、
（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡ ｏ （ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ １０ 、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して０又は１〜５の整数であるが、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの少なくとも二つはいかなるときも０でなく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］で表される。
式４’で表される化合物の好適な態様において、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2はＨであり、ＺはＨである；Ｒ1及びＲ2はメチルであり、ＺはＨである；Ｒ1はメチルであり、Ｒ2はＨであり、Ｚは−ＳＣＨ3である；又はＲ1及びＲ2はメチルであり、Ｚは−ＳＣＨ3である。
更に好ましくは、メイタンシノイドは、式（Ｉ−Ｌ）、（Ｉ−Ｄ）、又は（Ｉ−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙは、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺを表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；そして
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ又はＣ−２０のデスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す］で表される化合物である。
更に好適なのはＣ−３エステルで、それは式４：
Figure 0005563673
によって表される化合物である。式中、置換基は前述の定義の通りである。
特に好適なのは、Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、ＺがＨである上記いずれかの
化合物；Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、ＺがＨである化合物；Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ3である化合物；並びに、Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ3である化合物である。さらに、Ｌ−アラニル立体異性体が本発明の複合体に最も有用なので好適である。
式４の好適な態様はＤＭ３及びＤＭ４を含む。すなわち、ＺがＨであり、Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8がそれぞれＨであり、そしてｌ及びｍが１であり、ｎが０である式４のメイタンシノイド（ＤＭ３、化合物４ａ）；ＺがＨであり、Ｒ1及びＲ2がいずれもメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０である式４のメイタンシノイド（ＤＭ４、化合物４ｂ）；Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍがそれぞれ１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ3である式４のメイタンシノイド；
並びに、Ｒ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であり、Ｚが−ＳＣＨ3である式４のメイタンシノイドを含む。
１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニルの例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、プロペニル、ブテニル及びヘキセニルなどであるが、これらに限定されない。
３〜１０個の炭素原子を有する分枝アルキル又はアルケニルの例は、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、１−エチル−プロピル、イソブテニル及びイソペンテニルなどであるが、これらに限定されない。
３〜１０個の炭素原子を有する環状アルキル又はアルケニルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、及びシクロヘキセニルなどであるが、これらに限定されない。
単純アリールは６〜１０個の炭素原子を有するアリールなどで、置換アリールは、６〜１０個の炭素原子を有し、少なくとも１個の、１〜４個の炭素原子を含有するアルキル置換基、又はメトキシ、エトキシなどのアルコキシ置換基、又はハロゲン置換基又はニトロ置換基を持つアリールなどである。
６〜１０個の炭素原子を含有する単純アリールの例は、フェニル及びナフチルなどである。
置換アリールの例はニトロフェニル、ジニトロフェニルなどである。
ヘテロサイクリック芳香族ラジカルは、Ｎ、Ｏ又はＳから選ばれる１又は２個のヘテロ原子を含有する３〜１０員環を有する基などである。
ヘテロ環ラジカルは、Ｎ、Ｏ又はＳから選ばれる１又は２個のヘテロ原子を含有する３〜１０員環系を含む環状化合物などである。
ヘテロサイクリック芳香族ラジカルの例は、ピリジル、ニトロ−ピリジル、ピロリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、及びフリルなどである。
ヘテロ環ラジカルの例は、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピロリル、ピペリジニル、ピペラジニル、及びモルホリノなどである。
立体障害されたチオール又はジスルフィド部分を有する新規メイタンシノイドは以下の新規に開示される方法によって製造できる。
メイタンシノイドの合成。
図３ａにメイタンシノイドＤＭ４（４ｂ）の合成におけるステップを示す。イソブチレンスルフィド（５）をアセトニトリルのアニオンと反応させてメルカプト化合物６を得る。６を塩基で加水分解して４−メルカプト−４−メチルペンタン酸（７）を得た。７からジスルフィド８への転化はメチルメタンチオールスルホネート（ＭｅＳＳＯ２Ｍｅ）との反応によって達成される。８からＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル９への転化とその後のＮ−メチル−Ｌ−アラニンとの反応によってカルボン酸１０が得られた。これをシリカゲル上カラムクロマトグラフィーで精製した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び塩化亜鉛の存在下で１０をメイタンシノール（１１）と反応させ、Ｎ−アシル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニルメイタンシノイドＬ−ＤＭ４ＳＭｅ（４ｅ）とＮ−アシル−Ｎ−メチル−Ｄ−アラニルメイタンシノイドＤ−ＤＭ４ＳＭｅ（４ｆ）との混合物を得た。ジアステレオマー混合物をシアノ結合カラムを用いてＨＰＬＣによって分離した。所望のＬ−アミノ酸含有異性体４ｅを回収し、ジチオトレイトールで還元してチオール含有Ｌ−アミノアシルメイタンシノイドＤＭ４（４ｂ）を得た。これを再度シアノ結合カラムを用いてＨＰＬＣで精製した。
図３ｂにメイタンシノイドＤＭ３（４ａ）の合成におけるステップを示す。４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートとの反応によってメチルジスルフィドに転化し、１３を得た。１３からＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４への転化とその後のＮ−メチル−Ｌ−アラニンとの反応によってカルボン酸１５が得られた。これをシリカゲル上カラムクロマトグラフィーで精製した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び塩化亜鉛の存在下で１５をメイタンシノール（１１）と反応させ、Ｎ−アシル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニルメイタンシノイドＬ−ＤＭ３ＳＳＭｅ（４ｃ）とＮ−アシル−Ｎ−メチル−Ｄ−アラニルメイタンシノイドＤ−ＤＭ３ＳＳＭｅ（４ｄ）との混合物を得た。ジアステレオマー混合物をシアノ結合カラムを用いてＨＰＬＣによって分離した。所望のＬ−アミノ酸含有異性体を回収し、ジチオトレイトールで還元してメルカプト−Ｌ−アミノ酸含有メイタンシノイドＤＭ３（４ａ）を得た。これを再度シアノ結合カラムを用いてＨＰＬＣで精製した。
図３ｃ及びｄに、（Ｓ）−４−メチルジチオ−１−オキソペンチル部分又は（Ｒ）−４−メチルジチオ−１−オキソ−ペンチル部分のいずれかを持つＤＭ３の合成を示す。（Ｒ）−１，３−ブタンジオール（１６）をそのジトシレート１７に転化し、次いでシアン化ナトリウム及びエチルキサントゲン酸カリウムと順次反応させてニトリル１８を得た（図３ｃ）。塩基性加水分解とその後のジスルフィド交換によって（Ｓ）−４−メチルジチオ−ペンタン酸１９を得た。１９からスクシンイミジルエステル２０への転化、次いでＮ−メチル−Ｌ−アラニンとの反応によってＮ−メチル−Ｎ−［４−（Ｓ）−メチルジチオ−１−オキソ−ペンチル］−Ｓ−アラニン（１５ａ）を得た。化合物１５で前述したように、メイタンシノールとの反応でＬ−ＤＭ３ＳＭｅの２種類のジアステレオマー、４ｇ及び４ｈを得た。同様に、（Ｓ）−１，３−ブタンジオール（２１）を（Ｒ）−４−メチルジチオ−ペンタン酸２４に、次いで１５ｂに転化した。前述のように、メイタンシノールとの反応でＤＭ３ＳＭｅの２種類のジアステレオマー、４ｋ及び４ｌを得た。
従って、本発明は、メイタンシノイドをＣ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１
５のヒドロキシ、又はＣ−２０のデスメチルの位置でアシル化アミノ酸側鎖でエステル化する方法を提供する。前記アシル基は保護されたスルフヒドリル基を持ち、保護されたチオール官能基を持つアシル基の炭素原子は１又は２個の置換基を有し、前記置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらに置換基の一つはＨであってもよく、前記アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有し、前記方法は、メイタンシノイドをＣ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ又はＣ−２０のデスメチルの位置でアシル化アミノ酸（アシル基は保護されたスルフヒドリル基を持つ）と反応させることを含む。
好適な態様において、本発明は、式４２’：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２’は、
（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡ ｏ （ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、及びＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純又は置換アリール、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ １０ 、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して０又は１〜５の整数であるが、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの少なくとも二つはいかなるときも０でなく；そして
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］のメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールのエステル化法を提供する。前記方法は、構造１１のメイタンシノール：
Figure 0005563673
をＣ−３の位置で、式（III’−Ｌ）、（III’−Ｄ）、又は（III’−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２’は、
（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ９＝ＣＲ１０）ｐ（Ｃ≡Ｃ）ｑＡ ｏ （ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍＤｕ（ＣＲ１１＝ＣＲ１２）ｒ（Ｃ≡Ｃ）ｓＢｔ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、及びＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純又は置換アリール、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ １０ 、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して０又は１〜５の整数であるが、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの少なくとも二つはいかなるときも０でなく；そして
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］の化合物と反応させることを含む。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ−Ｌ）で表され、また好ましくは、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2はＨである。
更に好適な態様において、本発明は、式４2：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］のメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールのエステル化法を提供する。前記方法は、構造１１のメイタンシノール：
Figure 0005563673
をＣ−３の位置で、式（III−Ｌ）、（III−Ｄ）、又は（III−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく
；そして
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］で表される化合物と反応させることを含む。
ジアステレオマーはシアノ結合シリカ上ＨＰＬＣによって分離できる。
更に好適な態様において、本発明は、式（IV−Ｌ）、（IV−Ｄ）、又は（IV−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲ又はＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；そして
Ｍａｙはメイタンシノイドである］で表されるメイタンシノイドエステルを製造するためのメイタンシノイドのエステル化法を提供する。前記方法は、前記Ｍａｙを、Ｃ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ、又はＣ−２０のデスメチルの位置で、式（III−Ｌ）、（III−Ｄ）、又は（III−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく
；そして
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］の化合物と反応させることを含む。
なお更に好適な態様において、本発明は、式４２：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］のメイタンシノイドを得るためのメイタンシノールのエステル化法を提供する。前記方法は、メイタンシノールをＣ−３の位置で、式（III−Ｌ）、（III−Ｄ）、又は（III−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又
はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］の化合物と反応させることを含む。
好ましくは、式（Ｉ）で表される化合物はＬ立体異性体である。
上記方法に関して、Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍがそれぞれ１であり、ｎが０である場合；又はＲ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０である場合が好適である。
ＤＭ３を製造する場合、式（III−Ｌ）の化合物は、１５ａ（Ｓ，Ｓ）、１５ｂ（Ｓ，
Ｒ）又は１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物である；式（III−Ｄ）の化合物
は、化合物１５を得るためにラセミ体のアシル基又はＲもしくはＳキラリティのいずれかを有するアシル基でアシル化されたＮ−メチル−Ｄ−アラニンである；及び式（III−Ｄ
，Ｌ）の化合物は、保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンである。
１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物は、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）と１５ｂ（Ｓ，Ｒ）の混合物を得る
ことを含むプロセスによって製造できる。
同様に、化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物は、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をＮ−メチル−Ｄ−アラニンと反応させて前記化合物１５（Ｒ，Ｓ）と１５（Ｒ，Ｒ）の混合物を得る
ことを含むプロセスによって製造できる。
保護されたチオール官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンは、
（１）４−メルカプトペンタン酸（１２）をメチルメタンチオールスルホネートと反応させて化合物１３を得；
（２）化合物１３をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１４に転化し；
（３）化合物１４をラセミ体のＮ−メチルアラニンと反応させて、保護されたチオール
官能基を持つカルボキシル基（硫黄原子を持つ炭素中心は構造１５の化合物を得るためにラセミ体又はＲもしくはＳキラリティのいずれかである）でアシル化されたラセミ体のＮ−メチルアラニンを得る
ことを含むプロセスによって製造できる。
化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）は、
（１）（Ｒ）−１，３−ブタンジオールを（Ｓ）−４−（メチルジチオ）ペンタン酸１９に転化し；
（２）化合物１９をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２０）に転化し；そして
（３）化合物２０をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ａ（Ｓ，Ｓ）を得る
ことを含むプロセスによって製造できる。
化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）は、
（１）（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを（Ｒ）−４−（メチルジチオ）ペンタン酸２４に転化し；
（２）化合物２４をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２５）に転化し；そして
（３）化合物２５をＮ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて前記化合物１５ｂ（Ｓ，Ｒ）を得る
ことを含むプロセスによって製造できる。
ＤＭ４を製造する場合、式（III−Ｌ）の化合物は、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンを含有
する化合物１０である；式（III−Ｄ）の化合物は、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニンを含有す
る化合物１０である；及び式（III−Ｄ，Ｌ）の化合物は、ラセミ体のＮ−メチルアラニ
ンを含有する化合物１０である。
Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する化合物１０は、
（１）イソブチレンスルフィド（５）をアセトニトリルのアニオンと反応させて化合物６を得；
（２）化合物６を加水分解して４−メルカプト−４−メチルペンタン酸（７）を得；
（３）化合物７をメチルメタンチオールスルホネートとの反応によってジスルフィド８に転化し；
（４）化合物８をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル９に転化し；そして
（５）化合物９をＮ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンと反応させて、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン、又はラセミ体のＮ−メチルアラニンを含有する化合物１０を得る
ことを含むプロセスによって製造される。
本発明によれば、式III：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ２は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２ＳＺ２を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；
Ｚ２は、ＳＲ又は−ＣＯＲであり、Ｒは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル、分枝アルキル又は環状アルキル、又は単純もしくは置換アリール又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルである］の化合物も新規である。
式IIIの化合物は、当業者であれば、化合物１０及び１５の製造に関して本明細書中に
開示したのと類似の方法によって容易に製造できる。
メイタンシノイドのインビトロ細胞毒性
本発明のメイタンシノイドのインビトロ細胞毒性を図４に示す。障害されたジスルフィド結合を持つ新規メイタンシノイド（４ｃ、４ｅ）は、試験した細胞株に対して非常に効力が高い。このように、４ｃはＡ−３７５細胞及びＳＫ−Ｂｒ−３細胞を、それぞれ１．５×１０−１１Ｍ及び７．０×１０−１２ＭのＩＣ５０値で殺滅する。同様に、メイタンシノイド４ｅも効力が高く、Ａ−３７５及びＳＫ−Ｂｒ−３細胞に対してそれぞれ３．２×１０−１１Ｍ及び９．０×１０−１２ＭのＩＣ５０値を有する。本発明の障害されたチオール含有メイタンシノイド４ａのインビトロ効力を従前のメイタンシノイド１のそれと比較すると（図４ｃ、ｄ）、新規メイタンシノイドは従前のものより２０〜５０倍も効力が高いことが示される。
細胞結合剤の製造
本発明の化合物の治療薬としての有効性は、適当な細胞結合剤の注意深い選択にかかっている。細胞結合剤は現在知られている、又は知られるようになるあらゆる種類のものであってよく、ペプチド及び非ペプチドを含む。一般的に、これらは抗体（特にモノクロナール抗体）、リンホカイン、ホルモン、成長因子、ビタミン、栄養輸送分子（トランスフェリンなど）、又は任意のその他の細胞結合分子又は物質であり得る。
使用されうる細胞結合剤のさらに具体的な例は、
ポリクロナール抗体；
モノクロナール抗体；
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｖのような抗体フラグメント（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４７０−４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０−２４４（１９６０））；
インターフェロン（例えば、α、β、γ）；
リンホカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６；
ホルモン、例えばインスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、アンドロゲン及びエストロゲンのようなステロイドホルモン；
成長因子及びコロニー刺激因子、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ５：１５５−１５８（１９８４））；
トランスフェリン（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：９３２−９３７（１９８５））；及び
ビタミン、例えば葉酸。
モノクロナール抗体技術は、特異的モノクロナール抗体の形態で極めて特異的な細胞結合剤の製造を可能にしている。当該技術分野で特によく知られているのは、マウス、ラット、ハムスター又は任意のその他の哺乳動物を、問題の抗原、例えば無傷の標的細胞、標的細胞から単離した抗原、全ウィルス、弱毒化全ウィルス、及びウィルスコートタンパク質のようなウィルスタンパク質で免疫化することによって産生されるモノクロナール抗体製造技術である。感作ヒト細胞も使用できる。モノクロナール抗体の別の製造法は、ｓｃＦｖ（一本鎖可変領域）、特にヒトｓｃＦｖのファージライブラリーの使用である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、米国特許第５，８８５，７９３号及び５，９６９，１０８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７；Ｌｉｍｉｎｇら、ＷＯ９９／０６５８７参照）。さらに、米国特許第５，６３９，６４１号に開示されているリサーフェス化抗体もヒト化抗体として使用できる。
適当な細胞結合剤の選択は、標的にされる特定の細胞集団に応じて選択の余地があるが、一般的にヒトモノクロナール抗体が、適当なものが入手できれば好適である。
例えば、モノクロナール抗体、ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり｛Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎら、８ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ．，５２１（１９８４）｝、標的細胞が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の疾患の場合のようにＣＤ３３を発現していれば使用できる。同様に、モノクロナール抗体、抗Ｂ４は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するマウスＩｇＧ１抗体であり｛Ｎａｄｌｅｒら、１３１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４４−２５０（１９８３）｝、標的細胞がＢ細胞であるか、又は非ホジキンリンパ腫もしくは慢性リンパ芽球性白血病の場合のようにこの抗原を発現している疾患細胞であれば使用できる。同様に、ＣａｎＡｇ抗原に結合するモノクロナール抗体、Ｃ２４２（米国特許第５，５５２，２９３号）は、結腸直腸、膵臓及び胃がんのようなＣａｎＡｇ発現腫瘍の治療に使用できる。
さらに、骨髄細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病由来の疾患細胞に対する細胞結合剤として使用できる。活性化Ｔ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶の防止、移植片対宿主疾患の治療及び予防、並びに急性Ｔ細胞白血病の治療に使用できる。メラニン細胞に結合するＭＳＨは、黒色腫の治療に使用できる。葉酸は、卵巣及びその他の腫瘍上に発現されている葉酸受容体を標的にするのに使用できる。上皮成長因子は、肺及び頭部及び頚部のような扁平上皮がんを標的にするのに使用できる。ソマトスタチンは、神経芽細胞腫及びその他の腫瘍タイプを標的にするのに使用できる。
乳腺及び精巣のがんは、それぞれ細胞結合剤としてエストロゲン（又はエストロゲン類似体）又はアンドロゲン（又はアンドロゲン類似体）でうまく標的化できる。
細胞毒性複合体の製造
本発明は、細胞結合剤に連結された少なくとも一つのメイタンシノイドを含むメイタンシノイド−細胞結合剤複合体も提供する。該細胞結合剤は、メイタンシノイドのＣ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ又はＣ−２０のデスメチルの位置に見られるアシル化アミノ酸側鎖のアシル基上に存在するチオール又はジスルフィド官能基を用いてメイタンシノイドに連結されており、該アシル化アミノ酸側鎖のアシル基は、そのチオール又はジスルフィド官能基を１又は２個の置換基を有する炭素原子上に持っている。前記置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又は
アルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらに前記置換基の一つはＨであってもよく、そして該アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有する。
好適な細胞結合剤複合体は、細胞結合剤に連結された少なくとも一つのメイタンシノイドを含み、該メイタンシノイドは、式４１’：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ1’は、
（ＣＲ7Ｒ8）l（ＣＲ9＝ＣＲ10）p（Ｃ≡Ｃ）qＡo（ＣＲ5Ｒ6）mＤu（ＣＲ11＝ＣＲ12）r（Ｃ≡Ｃ）sＢt（ＣＲ3Ｒ4）nＣＲ1Ｒ2Ｓ−を表し、式中、
Ｒ 1 及びＲ 2 は、それぞれ独立して、ＣＨ 3 、Ｃ 2 Ｈ 5 、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり、さらにＲ 2 はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、及びＤは、それぞれ独立して、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル又はシクロアルケニル、単純又は置換アリール、又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、及びＲ12は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；そして
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立して０又は１〜５の整数であるが、ただしｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ及びｕの少なくとも二つはいかなるときも０でない］で表される。
好ましくは、Ｒ1はメチルでＲ2はＨであるか、又はＲ1及びＲ2はメチルである。
なお更に好適な細胞結合剤複合体は、細胞結合剤に連結された少なくとも一つのメイタンシノイドを含み、該メイタンシノイドは、式（II−Ｌ）、（II−Ｄ）、又は（II−Ｄ，Ｌ）：
Figure 0005563673
［式中、
Ｙ１は、（ＣＲ ７ Ｒ ８ ）ｌ（ＣＲ ５ Ｒ ６ ）ｍ（ＣＲ ３ Ｒ ４ ）ｎＣＲ１Ｒ２Ｓ−を表し、式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル、ヘテロサイクリック芳香族又はヘテロ環ラジカ
ルであり、さらにＲ２はＨであってもよく；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル又はアルケニル、３〜１０個の炭素原子を有する分枝又は環状アルキル又はアルケニル、フェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカルであり；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜５の整数であり、さらにｎは０であってもよく；そして
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４のヒドロキシメチル、Ｃ−１５のヒドロキシ又はＣ−２０のデスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す］で表される。
なお更に好適なのは、メイタンシノイドが式４１：
Figure 0005563673
［式中、置換基は上記式（II）で定義の通りである］で表されるメイタンシノイド−細胞結合剤複合体である。
特に好適なのは、Ｒ1がメチルであり、Ｒ2がＨであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍがそれぞれ１であり、ｎが０であるいずれかの上記化合物；並びにＲ1及びＲ2がメチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれＨであり、ｌ及びｍが１であり、ｎが０であるいずれかの上記化合物である。
さらに、Ｌ−アミノアシル立体異性体が好適である。
本発明の代表的細胞毒性複合体は、抗体／メイタンシノイド、抗体フラグメント／メイタンシノイド、上皮成長因子（ＥＧＦ）／メイタンシノイド、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）／メイタンシノイド、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）／メイタンシノイド、ソマトスタチン／メイタンシノイド、葉酸／メイタンシノイド、エストロゲン／メイタンシノイド、エストロゲン類似体／メイタンシノイド、アンドロゲン／メイタンシノイド、及びアンドロゲン類似体／メイタンシノイドである。
チオール含有メイタンシノイドを、適当に修飾された細胞結合剤と反応させて細胞毒性複合体を製造する。これらの複合体は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、又はＨＰＬＣによって精製できる。
スルフヒドリル基含有メイタンシノイド由来の複合体の製造スキームを図５に示す。さらに詳しくは（図５ａ、ｂ）、水性緩衝液中の抗体溶液をモル過剰の抗体修飾剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、３ａ）とインキュベートしてジチオピリジル基を導入する（図５ａ）、又はＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ、３ｂ）とインキュベートしてジチオピリジル基を導入する（図５ｂ）。次に、修飾抗体をチオール含有メイタンシノイド（例えば４ａ又は４ｂ）と反応させて、ジスルフィドで連結された抗体−メイタンシノイド複合体を製造する。メイタンシノイド−抗体複合体は、次いでゲルろ過によって精製してもよい。
あるいは、抗体をモル過剰の２−イミノチオランのような抗体修飾剤とインキュベートしてスルフヒドリル基を導入してもよい。次に、修飾抗体を適当なジスルフィド含有メイタンシノイドと反応させてジスルフィド連結抗体−メイタンシノイド複合体を製造する。メイタンシノイド−抗体複合体は、次いでゲルろ過によって精製してもよい。
抗体分子あたりに結合されたメイタンシノイド分子の数（図５ａ〜５ｄではｗで示される）は、２５２ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比率を分光光度的に測定することによって決定できる。抗体分子あたり平均１〜１０個のメイタンシノイド分子がこの方法で連結できる。抗体分子あたりの連結メイタンシノイド分子の好適な平均数は２〜５であり、最も好適なのは３〜４．５である。
あるいは、水性緩衝液中の抗体溶液をモル過剰の抗体修飾剤、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、２６）とインキュベートすればマレイミド基が導入される（図５ｃ）、又はＮ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ、２７）とインキュベートすればヨードアセチル基が導入される（図５ｄ）。次に、修飾抗体をチオール含有メイタンシノイド（例えば４ａ又は４ｂ）と反応させて、チオエーテルで連結された抗体−メイタンシノイド複合体を製造する。メイタンシノイド−抗体複合体は、次いでゲルろ過によって精製してもよい。
抗体分子あたりに結合されたメイタンシノイド分子の数は前述のように分光学的分析によって決定できる。
このように、本発明は、前述の方法の一つによって精製メイタンシノイドを製造し、そして該精製メイタンシノイドを、反応性ジチオ又はスルフヒドリル基を含む細胞結合剤と反応させることを含むメイタンシノイド−細胞結合剤複合体の製造法を提供する。好ましくは、反応性ジチオ基はジチオピリジル基又は置換ジチオピリジル基である。特に好ましくは、反応性ジチオ基は、ニトロピリジルジチオ又はジニトロピリジルジチオ基を含む。
別の方法において、精製メイタンシノイドは、マレイミド基又はハロアセチル基を含む細胞結合剤と反応させる。
本発明の細胞結合剤とメイタンシノイド薬との複合体は、それらの様々な望まざる細胞株の増殖抑制能をインビトロで評価できる（図６）。例えば、ヒト結腸がん細胞株ＣＯＬＯ ２０５、ヒト黒色腫細胞株Ａ−３７５、ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０のような細胞株は、これらの複合体の細胞毒性の評価に使用できる。評価される細胞を化合物に２４時間暴露し、細胞の生存画分を公知方法によって直接アッセイで測定すればよい。次いでアッセイの結果からＩＣ５０値が算出できる。
本発明の抗体−メイタンシノイド複合体のインビトロ効力及び標的特異性を図６、１０及び１２に示す。このように、図６は、ｈｕＣ２４２−ＤＭ３及びｈｕＣ２４２−ＤＭ４とも抗原陽性ＣＯＬＯ ２０５細胞の殺滅に非常に効力があることを示しており、ＩＣ５０値はそれぞれ１．３×１０−１１Ｍ及び１．１×１０−１１Ｍである。これに対し、抗原陰性のＡ−３７５細胞は感受性が約５００倍も低く、本発明のメイタンシノイド複合体が非常に高効力で特異的であることを示している。同様に、図１０及び１２は、それぞれ抗体ＭＹ９−６及び抗Ｂ４を用いた本発明のメイタンシノイド複合体の高効力と標的特異性を示している。
本発明の抗体と障害されたチオール含有メイタンシノイドとの複合体のインビボにおける抗腫瘍効果を、マウスにおけるいくつかの異なるヒト腫瘍モデルで、従前のメイタンシノイド複合体のそれと比較した。第一のモデルで（図７）、樹立皮下ヒト結腸腫瘍ＨＴ−２９異種移植片を持つＳＣＩＤマウスを、従前のメイタンシノイドＤＭ１の抗体複合体（ｈｕＣ２４２−ＤＭ１）、又は２種類の新規メイタンシノイド複合体（ｈｕＣ２４２−ＤＭ３、ｈｕＣ２４２−ＤＭ４）のいずれかで処置した。ｈｕＣ２４２−ＤＭ１による処置で１８日間の腫瘍成長遅延がもたらされた。これに対し、新規薬剤は顕著により有効で、腫瘍成長遅延がｈｕＣ２４２−ＤＭ３の場合２８日間、ｈｕＣ２４２−ＤＭ４の場合３６日間であった。
第二のモデルで（図８）、樹立皮下ヒト結腸腫瘍ＣＯＬＯ ２０５異種移植片を持つマウスを、従前のメイタンシノイドＤＭ１の抗体複合体（ｈｕＣ２４２−ＤＭ１）、又は２種類の新規メイタンシノイド複合体（ｈｕＣ２４２−ＤＭ３、ｈｕＣ２４２−ＤＭ４）のいずれかで処置した。ｈｕＣ２４２−ＤＭ１による処置では腫瘍退縮は見られず、２０日間の腫瘍成長遅延が得られた。これに対し、新規薬剤は顕著により有効であった。ｈｕＣ２４２−ＤＭ３による処置群では４５日間持続する完全腫瘍退縮が達成された。ｈｕＣ２４２−ＤＭ４はなおさらに有効で、全ての処置マウスの治癒がもたらされた。
第三のモデルで（図９）、樹立皮下ヒト骨髄性白血病ＨＬ６０異種移植片を持つマウスを、従前のメイタンシノイドＤＭ１の抗体複合体（ＭＹ９−６−ＤＭ１）、又は２種類の新規メイタンシノイド複合体（ＭＹ９−６−ＤＭ３、ＭＹ９−６−ＤＭ４）のいずれかで処置した。ＭＹ９−６−ＤＭ１による処置では腫瘍退縮は見られず、５日間の腫瘍成長遅延が得られた。これに対し、新規薬剤は顕著により有効であった。腫瘍退縮がもたらされた。ＭＹ９−６−ＤＭ３もＭＹ９−６−ＤＭ４も、２０日間を超える腫瘍成長遅延をもたらした。
第四のモデルでは（図１１）、本発明のメイタンシノイド（ｈｕＭＹ９−６−ＤＭ４）を、従前のメイタンシノイド複合体（ｈｕＭＹ９−６−ＤＭ１）のそれと、ＨＬ−６０細胞で樹立された皮下異種移植片モデルで直接比較した。等用量で、本発明の複合体ＭＹ９−６−ＤＭ４による処置は８５日間持続する完全腫瘍退縮をもたらした。これに対し、従前のメイタンシノイドの複合体はずっと活性が低く、約４８日間の腫瘍成長遅延しか示さなかった。
第五のモデルで（図１３ａ）、本発明のメイタンシノイドとｈｕＢ４抗体との複合体は、皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍モデルで用量依存的に高い抗腫瘍活性を示している。非毒性の用量で完全な腫瘍退縮と治癒が達成されている（図１３ａ、ｂ）。
上記５つの効果実験の結果から、本発明の立体障害されたチオール含有メイタンシノイドは、従前のメイタンシノイド−細胞結合剤複合体と比べて、非常に改良された抗腫瘍活性を細胞結合剤複合体に付与していることが示されている。
組成物及び使用法
本発明は、有効量の本発明のいずれかのメイタンシノイド−細胞結合剤、その製薬学的に許容しうる塩又は溶媒和物、及び製薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
本発明はまた、治療を必要とする患者に有効量の上記いずれかの複合体を投与することを含む治療法も提供する。
同様に、本発明は、選択された細胞集団に細胞死を誘導する方法も提供する。該方法は、標的細胞又は標的細胞を含有する組織を、有効量の本発明のいずれかのメイタンシノイド−細胞結合剤、その塩又は溶媒和物を含む細胞毒性薬に接触させることを含む。標的細胞は細胞結合剤が結合できる細胞である。
所望であれば、他の抗腫瘍薬のようなその他の活性薬を複合体と共に投与してもよい。
適切な製薬学的に許容しうる担体、希釈剤、及び賦形剤は周知であり、臨床状況の適応に応じて当業者が決定できる。
適切な担体、希釈剤及び／又は賦形剤の例は、（１）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有又は非含有、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、及び（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースなどであり、トリプタミンのような抗酸化剤及びトゥイーン２０のような安定化剤を含有してもよい。
選択された細胞集団における細胞死の誘導法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで実施できる。
インビトロにおける使用例は、自己骨髄を同一患者に移植する前に疾患細胞又は悪性細胞を殺滅するために処理する；骨髄を移植する前にコンピテントＴ細胞を殺滅するため及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を予防するために処理する；標的抗原を発現していない所望の変異株以外の全細胞を殺滅するために細胞培養物を処理する；又は望まざる抗原を発現している変異株を殺滅する、などである。
非臨床的なインビトロにおける使用条件は当業者によって容易に決定される。
臨床的エクスビボにおける使用例は、がんの治療又は自己免疫疾患の治療で自家移植の前に骨髄から腫瘍細胞又はリンパ細胞を除去する、又はＧＶＨＤ予防のために移植前に自己又は同種の骨髄又は組織からＴ細胞及びその他のリンパ細胞を除去するといったことである。処理は以下のように実施できる。患者又は他人から骨髄を採取し、次いで、濃度範
囲約１０μＭ〜１ｐＭの本発明の細胞毒性薬を加えた血清含有培地中で、約３０分間〜約４８時間、３７℃でインキュベートする。濃度及びインキュベーション時間の正確な条件、すなわち用量は当業者によって容易に決定される。インキュベーション後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、公知方法に従って患者の静脈内に戻す。患者が、骨髄採取と処理細胞の再注入との間に侵襲的化学療法又は全身照射のような他の治療コースを受ける状況においては、標準的医学装置を用いて処理骨髄細胞を液体窒素中で凍結保存する。
臨床的インビボにおける使用の場合、本発明の細胞毒性薬を、無菌性及びエンドトキシンレベルについて試験した溶液又は凍結乾燥粉末として供給する。複合体投与の適切なプロトコルの例は以下の通りである。複合体を週１回４週間にわたって各週静脈内ボーラスとして投与する。ボーラス投与は、５０〜１０００ｍｌの生理食塩水（これに５〜１０ｍｌのヒト血清アルブミンを加えてもよい）に入れて投与される。用量は１投与あたり１０μｇ〜２０００ｍｇで、静脈内投与である（１日１００ｎｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲）。４週間の治療後、患者は週単位で治療を継続できる。投与経路、賦形剤、希釈剤、用量、時間などに関する具体的な臨床プロトコルは、臨床状況の適応に応じて当業者が決定できる。
選択された細胞集団に細胞死を誘導するインビボ又はエクスビボ法に従って治療できる医学的状態の例は、あらゆる種類の悪性疾患、例えば、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、
膵臓、卵巣、及びリンパ器官のがん；全身性狼瘡、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症のような自己免疫疾患；腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、及び骨髄移植拒絶のような移植片拒絶；移植片対宿主疾患；ＣＭＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなどのようなウィルス感染；及びランブル鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症、及び当業者が決定するその他のような寄生虫感染などである。
以下に本発明を非制限的実施例を参照しながら説明する。特に明記しない限り、全てのパーセント、比率、部などは重量による。以下に記載の実施例は、Ｒ１がＣＨ ３ 、Ｒ２がＨ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８がそれぞれＨ、ｌ及びｍがそれぞれ１、ｎが０である化合物に関する。同様の合成は、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、又は１〜１０個の炭素原子を有する高級アルキル、アルケニル、又はフェニル、置換フェニル又はヘテロサイクリック芳香族もしくはヘテロ環ラジカル；そしてｌ、ｍ及びｎがそれぞれ１〜５の整数、さらにｎは０であってもよい本発明のその他の化合物についても実施できる。
全試薬はニュージャージー州のＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から、又はその他の市販品を購入した。メイタンシノール（１１）は過去に記載（米国特許第６，３３３，４１０号）ように製造した。核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ装置で取り、質量スペクトルは、エレクトロスプレーイオン化を用い、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００装置で取った。
実施例１
メイタンシノイド４ｂの合成
４−メルカプト−４−メチルペンタン酸（７）：５００ｍＬフラスコに撹拌棒と１５０ｍＬ添加漏斗を備え付けた。この系をアルゴン雰囲気下に置いた。１５０ｍＬの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びヘキサン中２．５Ｍのｎ−ＢｕＬｉ ７５ｍＬ（１８．７ｍｍｏｌ）をカニューレ経由で加え、溶液を−７８℃のドライアイス／アセトン浴中で冷却した。アセトニトリル（７．３ｇ、９．４ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）をシリンジ経由で１滴ずつ約５分間にわたって加えた。反応を３０分間撹拌している間に白色のリチウム−アセトニトリル沈殿物が形成された。イソブチレンスルフィド（１５ｇ、１７ｍｍｏｌ）を１
００ｍＬの無水ＴＨＦに溶解し、添加漏斗経由で１滴ずつ約３０分間にわたって加えた。冷却浴を取り除き、反応を３時間撹拌した。フラスコを氷／水浴で冷却しながら３８ｍＬの０．５Ｍ ＨＣｌを滴下添加した。ＴＨＦ層はそのままにし、水性層を７５ｍＬの酢酸エチルで２回洗浄した。ＴＨＦと酢酸エチル層を合わせ、約２０ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、２５０ｍＬフラスコに移した。溶媒を真空下回転蒸発によって除去し、６の粗製物を得た。エタノール（３０ｍＬ）と撹拌棒を加えた。内容物を撹拌しながら３０ｍＬの脱イオン水中８．０ｇのＮａＯＨの溶液をゆっくり加えた。フラスコに還流冷却器を備え付け、アルゴン雰囲気下に置いた。反応を一晩還流し、その後室温に冷却した。脱イオン水（６０ｍＬ）を加え、該混合物を、２５ｍＬずつの酢酸エチルとヘキサンの２：１混合物で２回抽出した。水性層を濃ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、次いで７５ｍＬずつの酢酸エチルで３回抽出した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空下回転蒸発によって除去し、１０ｇの生成物７を得た（収率３９％）。材料はそれ以上精製せずに使用した。
Figure 0005563673
４−メチル−４−（メチルジチオ）ペンタン酸（８）：メルカプトペンタン酸７（６．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬフラスコ中で５０ｍＬの脱イオン水に溶解した。溶液を磁気撹拌しながら、炭酸ナトリウム（６．４ｇ、６０ｍｍｏｌ）を過剰の泡立ちを起こさないような速度で該酸に加えた。フラスコに１００ｍＬ添加漏斗を備え付け、それにガラス蒸留した１００％エタノール３０ｍＬ中に溶解したメチルメタンチオールスルホネート（７．５ｇ、６０ｍｍｏｌ）溶液を入れた。フラスコを氷／水浴で冷却し、該系をアルゴン雰囲気下に維持した。メチルメタンチオールスルホネート溶液をなるべく迅速に、しかし過剰の泡立ちを起こさずにフラスコに滴下添加した。冷却浴を取り除き、反応混合物をさらに３時間撹拌した。溶媒を残り約２０ｍＬになるまで真空下回転蒸発によって除去した。その後、１０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム及び３０ｍＬの脱イオン水を加えた。該混合物を分液漏斗中で２５ｍＬずつの酢酸エチルで３回洗浄した。水性層を５Ｍ ＨＣｌで約ｐＨ２に調整し、１２０ｍＬずつの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、飽和ＮａＣｌと１ＭのＨＣｌが４：１の比率で成る溶液２０ｍＬで洗浄した。次に、有機層を１４ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を真空下回転蒸発によって除去し、５．４ｇの生成物８を得た（収率７０％）。該材料はそれ以上精製せずに次のステップに利用できる。
Figure 0005563673
ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：２１７．０、実測値：２１７．１
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−メチル−４−（メチルジチオ）ペンタノエート（９）：メチルジチオペンタン酸８（３．０ｇ、１５ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの塩化メチレンに溶解し、磁気撹拌しながらＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．６５ｇ、２３ｍｍｏｌ）、次いで１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ、４．４ｇ、２３ｍｍｏｌ）を加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下で２時間撹拌した。反応混合物を１２５ｍＬ分液漏斗に注ぎ入れ、４０ｍＬの酢酸エチルを加え、該溶液を２０ｍＬずつの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で２回、１
２ｍＬの飽和塩化ナトリウムで１回洗浄した。有機層を１４ｇの無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空下回転蒸発によって除去し、４．０ｇの生成物９を得た（収率９０％）。これをそれ以上精製せずに使用した。
Figure 0005563673
ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：３１４．０、実測値：３１４．１
Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチル−４−メチルジチオ−１−オキソペンチル）−Ｌ−アラニン（１０）：Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（２．８５ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌棒を備えた１２５ｍＬフラスコで、ジメトキシエタンと脱イオン水１：１の溶液５０ｍＬ中に溶解した。トリエチルアミン（６．９ｇ、３６ｍｍｏｌ）を加え、溶液を激しく撹拌しながら、同一溶媒混合物４０ｍＬ中に溶解した９（５．４４ｇ、１８ｍｍｏｌ）を約５分間かけて１滴ずつ加えた。２時間後、反応混合物を真空下回転蒸発によって約４０ｍＬに濃縮し、次いで１０ｍＬの脱イオン水と１Ｍ ＨＣｌを加えてｐＨを約２とした。該混合物を分液漏斗に注ぎ入れ、５０ｍＬずつの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、次いで７ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を８．０ｇの無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空下回転蒸発によって除去した。残渣を最少量の酢酸エチルに取り、シリカ上クロマトグラフィーで精製した（シリカ：４０μｍのフラッシュ級、シリカ床：２４×３．０ｃｍ、移動相：ヘキサン：酢酸エチル：酢酸５０：４８：２）。所望の生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を真空下で除去した。残留酢酸を、残渣を最少量の酢酸エチルに溶解し、撹拌しながらヘキサンを迅速ではあるが１滴ずつ添加して生成物を沈殿させることによって除去した。ヘキサンは、ＴＬＣ分析で上清中に生成物がもはや検出されなくなるまで加えた。沈殿物を４時間真空乾燥して２．２ｇの生成物１０を得た（収率５１％）。
Figure 0005563673
ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：３０２．１、実測値：３０２．０。
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メチルジチオ−１−オキソペンチル）メイタンシン（Ｌ−ＤＭ４−ＳＭｅ、４ｅ）。メイタンシノール（１１、２５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）及びＮ−メチル−Ｎ−（４−メチル−４−メチルジチオ−１−オキソペンチル）−Ｌ−アラニン（１０、４２．０ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）の３ｍＬジクロロメタン中溶液をアルゴン雰囲気下で磁気撹拌しながら、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、５７．１ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の０．６７ｍＬジクロロメタン中溶液を加えた。１分後、ジエチルエーテル中１ＭのＺｎＣｌ２溶液（０．０３ｍＬ、０．０３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで５ｍＬの酢酸エチルを加え、混合物を粗いろ紙を通して真空ろ過した。ろ液を２ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液、次いで１ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を２ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。そして溶媒を真空下で除去し、残渣をジクロロメタンとメタノールの混合物を用いてシリカクロマトグラフィーで精製し、未反応のメイタンシノールを除去した。
所望生成物含有画分を合わせ、溶媒を真空下で除去してジアステレオマー４ｅと４ｆの混合物を得た。残渣を最少量の酢酸エチルに取り、５０ｃｍ×２５０ｃｍ、１０μｍのＤｉａｚｅｍ（登録商標）ＣＮカラム上で、移動相にヘキサン、２−プロパノール及び酢酸エチルの比率６８：８：２４の混合物を用いて精製した。流速は１１８ｍＬ／分であった。これらの条件下で、所望生成物４ｅはリテンションタイム１１分で溶出した。所望でないジアステレオマー４ｆのリテンションタイムは１９分であった。所望生成物含有画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して１２．０ｍｇの生成物４ｅを得た（収率３６％）。
Figure 0005563673
高分解能ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）理論値：８２６．３１７４、実測値：８２６．３１５０。
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（Ｌ−ＤＭ４、４ｂ）。上記ジスルフィド４ｅ（１２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を１：１の酢酸エチル：メタノール１．０ｍＬ中に溶解した。次にジチオトレイトール（１８ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．５０ｍＬ中溶液を加えた。該溶液をアルゴン雰囲気下で３時間磁気撹拌し、次いで２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを加え、該混合物を２ｍＬずつの酢酸エチルで３回抽出した。有機層を合わせ、１ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、１ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、残渣を最少量の酢酸エチル中に取り、５０ｃｍ×２５０ｃｍ、１０μｍのＤｉａｚｅｍ（登録商標）ＣＮカラム上で、移動相にヘキサン、２−プロパノール及び酢酸エチルの比率７０：８：２２の混合物を用いて精製した。流速は２２ｍＬ／分であった。所望生成物４ｂはリテンションタイム１０分で溶出した。純４ｂ含有画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して１１ｍｇの４ｂを得た（収率９７％）。
Figure 0005563673
高分解能ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：８０２．３１０１、実測値：８０２．３１１６。
実施例２
メイタンシノイド４ａの合成
４−メチルジチオ−ペンタン酸（１３）：４−メルカプトペンタン酸（１２、１６．６ｇ、１２４ｍｍｏｌ）の溶液を５００ｍＬフラスコで３５０ｍＬの脱イオン水に溶解した。該溶液を磁気撹拌しながら、炭酸ナトリウム（１９．７ｇ、１８６ｍｍｏｌ）を過剰の泡立ちを起こさないような速度で該酸に加えた。フラスコに２５０ｍＬの添加漏斗を備え付け、それにガラス蒸留した１００％エタノール２２０ｍＬ中に溶解したメチルメタンチオールスルホネート（２３．４ｇ、１８６ｍｍｏｌ）溶液を入れた。フラスコを氷／水浴で冷却し、該系をアルゴン雰囲気下に維持した。メチルメタンチオールスルホネート溶液をなるべく迅速に、しかし過剰の泡立ちを防止する速度でフラスコに滴下添加した。冷却浴を取り除き、反応混合物をさらに２時間撹拌した。溶媒を残り約２５０ｍＬになるまで真空下回転蒸発によって除去した。その後、３０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び５０ｍＬの脱イオン水を加えた。該混合物を分液漏斗中で２００ｍＬずつの酢酸エチルで３回洗浄した。水性層を５Ｍ ＨＣｌで約ｐＨ２に調整し、４００ｍＬずつの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、次いで飽和ＮａＣｌ溶液と１ＭのＨＣｌの４：１混合物６０ｍＬで洗浄し、次に５０ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、最後に溶媒を真空下回転蒸発によって除去し、１０．２ｇの生成物１３を得た（収率４５％）。該材料はそれ以上精製せずに次の反応に使用した。
Figure 0005563673
ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：２０３．３、実測値：２０３．２
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−メチルジチオ−ペンタノエート（１４）：４−メチルジチオ−ペンタン酸（１３、０．７５ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）を７．０ｍＬの塩化メチレンに溶解し、磁気撹拌しながらＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５２６ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）、次いで１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（０．８７７ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）を加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下で２．５時間撹拌し、次いで２０ｍＬの酢酸エチルを含有する６０ｍＬ分液漏
斗に注ぎ入れた。得られた溶液を１５ｍＬずつの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で２回、５ｍＬの飽和塩化ナトリウムで１回洗浄した。有機層を８ｇの無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空下回転蒸発によって除去し、１．１５ｇの生成物１４を得た（収率８７％）。これをそれ以上精製せずに次の反応に使用した。
Figure 0005563673
ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：３０４．１、実測値：３０４．０
Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−１−オキソペンチル）−Ｌ−アラニン（１５）：Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（０．６４ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌棒を備えた１２５ｍＬフラスコで、ジメトキシエタンと脱イオン水１：１混合物８ｍＬ中に溶解した。トリエチルアミン（０．８４１ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を加え、フラスコを激しく撹拌しながら、１４（１．０ｇ、３．６ｍｍｏｌ）の同一溶媒混合物８ｍＬ中溶液を約５分間かけて１滴ずつ加えた。２時間後、反応混合物を真空下回転蒸発によって約３ｍＬに濃縮し、次いで１５ｍＬの脱イオン水と１Ｍ ＨＣｌを加えてｐＨを約２とした。該混合物を６０ｍＬ分液漏斗に注ぎ入れ、１５ｍＬずつの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、３ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、次いで８．０ｇの無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、最後に溶媒を真空下回転蒸発によって除去した。残渣を最少量の酢酸エチルに取り、シリカクロマトグラフィーで精製した（シリカ：４０μｍのフラッシュ級、シリカ床：２４×３．０ｃｍ、移動相：ヘキサン：酢酸エチル：酢酸５０：４８：２）。所望生成物１５を含有する画分を合わせ、溶媒を真空下で除去した。残留酢酸を、残渣を最少量の酢酸エチルに溶解し、撹拌しながらヘキサンを迅速ではあるが１滴ずつ添加して生成物を沈殿させることによって除去した。ヘキサンは、ＴＬＣ分析で上清中に生成物がもはや検出されなくなるまで加えた。沈殿物を真空乾燥して０．６０ｇの生成物１５を得た（収率６２％）。
Figure 0005563673
ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：２８８．１、実測値：２８８．１。
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチルジチオ−１−オキソペンチル）メイタンシン（Ｌ−ＤＭ３−ＳＭｅ、４ｃ）：メイタンシノール（２５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）及び１５（４２．０ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）の３ｍＬジクロロメタン中溶液をアルゴン雰囲気下で磁気撹拌しながら、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、５７．１ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の０．６７ｍＬジクロロメタン中溶液を加えた。１分後、ジエチルエーテル中１ＭのＺｎＣｌ２（０．０３ｍＬ、０．０３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで５ｍＬの酢酸エチルを加え、混合物を粗いろ紙を通して真空ろ過した。ろ液を２ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液、次いで１ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を２ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで溶媒を真空下で除去した。残渣をジクロロメタンとメタノールの混合物を用いてシリカクロマトグラフィーで精製し、未反応のメイタンシノールを除去した。所望生成物含有画分を合わせ
、溶媒を真空下で除去してジアステレオマー４ｃと４ｄの混合物を得た。残渣を最少量の酢酸エチルに取り、５０ｃｍ×２５０ｃｍ、１０μｍのＤｉａｚｅｍ（登録商標）ＣＮカラム上で、移動相にヘキサン、２−プロパノール及び酢酸エチルの６８：８：２４混合物を用いて精製した。流速は１１８ｍＬ／分であった。所望生成物４ｃはリテンションタイム１１分で溶出し、所望でないジアステレオマー４ｄのリテンションタイムは１９分であった。所望生成物含有画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して１２．０ｍｇの生成物４ｃを得た（収率３６％）。
Figure 0005563673
ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：８３４．３、実測値：８３４．３。
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）メイタンシン（Ｌ−ＤＭ３、４ａ）：Ｌ−ＤＭ３−ＳＭｅ（４ｃ、１２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を酢酸エチルとメタノールの１：１混合物１．０ｍＬ中に溶解した。次にジチオトレイトール（１８ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．５０ｍＬ中溶液を加えた。該反応溶液をアルゴン雰囲気下で３時間磁気撹拌し、次いで２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍＬを加え、該混合物を２ｍＬずつの酢酸エチルで３回抽出した。有機層を合わせ、１ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、次いで１ｇの無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、残渣を最少量の酢酸エチル中に取り、５０ｃｍ×２５０ｃｍ、１０μｍのＤｉａｚｅｍ（登録商標）ＣＮカラム上で、移動相としてヘキサン、２−プロパノール及び酢酸エチルの７０：８：２２混合物を用いて精製した。流速は２２ｍＬ／分であった。所望生成物はリテンションタイム１０分で溶出した。純生成物含有画分を合わせ、溶媒を真空下で除去して１１ｍｇの生成物４ａを得た（収率９７％）。
Figure 0005563673
ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋）理論値：７８８．３、実測値：７８８．３。
実施例３
メイタンシノイド４ｇ、ｈの合成（図３ｃ）
Ｒ−１，３−ジ−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−ブタン（１７）：Ｒ−（−）−１，３−ブタンジオール（１６、２．００ｇ、２２．２２ｍｍｏｌ）の、乾燥ピリジン（４０ｍＬ）及び乾燥トルエン（６０ｍＬ）混合物中溶液をアルゴン下０℃でｐ−トルエンスルホニルクロリド（１２．７０ｇ、６６．８４ｍｍｏｌ）で処理した。０℃で５分間、次いで室温で２時間撹拌した後、混合物を真空下で蒸発させ、酢酸エチル中に再溶解し、０．１ＭのＮａＨＣＯ３水溶液、次いで飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を蒸発させた。シリカゲル上クロマトグラフィーにより１：２（ｖ／ｖ）の酢酸エチル／ヘキサンで溶離して精製し、６．５１ｇ（７４％）の標記生成物１７を得た。Ｒｆ＝０．４０（１：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）；
Figure 0005563673
ＭＳ：４２０．９９（Ｍ＋Ｎａ）＋、４２１．９３（Ｍ＋１＋Ｎａ）＋。
Ｓ−４−Ｏ−エチルキサンチック−ペンタンニトリル（１８）：Ｒ−１，３−ジ−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−ブタン（１７、４．８０ｇ、１２．０６ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）中溶液をＮａＣＮ（０．６５）で処理した。アルゴン下室温で１８時間撹拌後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、冷たい１．０ＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、水及び１．０ＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．０）で順に洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、次いで蒸発させて２．６３ｇの粗Ｒ−３−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−ペンタンニトリルを得た。ＭＳ：２７５．８０（Ｍ＋Ｎａ）＋、２７６．７５（Ｍ＋１＋Ｎａ）＋。生成物はそれ以上精製せずにそのまま使用した。
粗Ｒ−３−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−ペンタンニトリル（２．６３ｇ）のエタノール（１５ｍＬ）中溶液に、エタノール（５０ｍＬ）中Ｏ−エチルキサントゲン酸カリウム
（４．５５ｇ）を加えた。アルゴン下で一晩撹拌後、該混合物を濃縮し、酢酸エチルで希釈し、短シリカカラムを通してろ過した。溶離液を濃縮し、シリカゲル上クロマトグラフィーにより１：４（ｖ／ｖ）のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離して精製し、１．５４ｇ（６３％、２段階）の標記生成物１８を得た。Ｒｆ＝０．４０（１：４ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）；
Figure 0005563673
ＭＳ：２２６．５１（Ｍ＋Ｎａ）＋、２４２．５１（Ｍ＋Ｋ）＋。
Ｓ−（＋）−４−メチルジチオ−ペンタン酸（１９）：Ｓ−４−Ｏ−エチルキサンチック−ペンタンニトリル（１８、１．９５ｇ、９．６１ｍｍｏｌ）の、エタノール（１０ｍＬ）と水（１５０ｍＬ）の混合物中溶液に、５．０ｇのＮａＯＨを加えた。反応混合物をアルゴン下で一晩還流した。該混合物を室温に冷却し、水（１５０ｍｌ）で希釈し、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した（２×１００ｍｌ）。水性層をＨ３ＰＯ４でｐＨ２．５〜３．０に酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した（６×７５ｍｌ）。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固して粗Ｓ−４−メルカプトペンタン酸を得た。この粗生成物をそれ以上精製せず次のステップにそのまま使用した。
粗Ｓ−４−メルカプトペンタン酸（１．２ｇ）の、エタノール（５０ｍＬ）と０．５Ｍ
ＮａＨ２ＰＯ３、ｐＨ７．０（７５ｍＬ）の混合物中溶液に、５乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）中メチルメタンチオールスルホネート（１．４７ｇ、１１．６５ｍｍｏｌ）を０℃で４５分間かけて滴下添加した。アルゴン下０℃で３０分間の撹拌、次いで室温で２時間の撹拌後、混合物を濃縮し、ジクロロメタンで抽出した（２×５０ｍｌ）。水性層をＨ３ＰＯ４でｐＨ２．５〜３．０に酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した（４×１００ｍｌ）。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上クロマトグラフィーで１：１００：４００のＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離して精製し、１．４３ｇ（８３％）の標記生成物１９を得た。Ｒｆ＝０．３２（１：１００：４００ ＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）；
Figure 0005563673
ＭＳ：２０２．９２（Ｍ＋Ｎａ）＋、２０３．９１（Ｍ＋１＋Ｎａ）＋；［α］＝４１．３５（ｃ＝２、ＣＨ３ＯＨ）。
Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（Ｓ）−メチルジチオ−１−オキソペンチル］−Ｓ−アラニン（１５ａ）：Ｓ−（＋）−４−（メチルジチオ）−ペンタン酸（１９）を化合物１４で前述した方法によってＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル２０に転化した。化合物１５で前述した手順によってＮ−メチル−Ｌ−アラニンとの反応により１５ａを得た（収率６２％）。
Figure 0005563673
ＭＳ：（Ｍ＋Ｎａ）理論値：２８８．１、実測値：２８８．１
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−（Ｓ）−メチルジチオ−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ３−ＳＭｅ、４ｇ、ｈ）：４ｃの合成で前述したようにメイタンシノール（１１）をジクロロメタン中のＤＣＣと塩化亜鉛を用いて１５ａと結合させた。Ｎ−メチル−Ｓ−アラニル部分（４ｇ、Ｓ，Ｓ）及びＮ−メチル−Ｒ−アラニル部分（４ｈ、Ｒ，Ｓ）を持つ２種類のジアステレオマー混合物を得た。該ジアステレオマーをＫｒｏｍａｓｉｌシアノカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）上ＨＰＬＣで、ヘキサン：酢酸エチル：２−プロパノール（６８：２４：８、ｖ／ｖ／ｖ）による無勾配溶離を用い、流速１ｍＬ／分で分離した。これらの条件下で、異性体４ｇ（Ｓ，Ｓ）は２４．５分で溶離した。質量スペクトル：ｍ／ｚ ８３４．２（Ｍ＋Ｎａ）＋。他の異性体４ｈ（Ｒ，Ｓ）のピークはよく分離し、３４．６分で溶離した。ＭＳ：ｍ／ｚ ８３４．２（Ｍ＋Ｎａ）＋。
実施例４
メイタンシノイド４ｋ、ｌの合成（図３ｄ）
Ｓ−１，３−ジ−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−ブタン２２：Ｓ−（−）−１，３−ブタンジオール（２１、２．００ｇ、２２．２２ｍｍｏｌ）の、乾燥ピリジン（４０ｍＬ）及び乾燥トルエン（６０ｍＬ）混合物中溶液をアルゴン下０℃でｐ−トルエンスルホニルクロリド（１２．７０ｇ、６６．８４ｍｍｏｌ）で処理した。０℃で５分間、次いで室温で２時間撹拌した後、混合物を真空下で蒸発させた。残渣を酢酸エチル中に再溶解し、０．１ＭのＮａＨＣＯ３水溶液、次いで飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上クロマトグラフィーにより１：２の酢酸エチル／ヘキサンで溶離して精製し、６．２５ｇ（７１％）の標記生成物２２を得た。Ｒｆ＝０．４０（１：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）；
Figure 0005563673
ＭＳ：４２０．９９（Ｍ＋Ｎａ）＋。
Ｒ−４−Ｏ−エチルキサンチック−ペンタンニトリル（２３）：Ｓ−１，３−ジ−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−ブタン（２２、６．２５ｇ、１５．７０ｍｍｏｌ）の６０乾燥ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）中溶液をＮａＣＮ（０．８５ｇ）で処理した。反応混合物をアルゴン下室温で１８時間撹拌した。次に反応混合物を酢酸エチルで希釈し、冷たい１．０ＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、水及び１．０ＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．０）で順に洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて３．６２ｇの粗Ｓ−３
−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−ペンタンニトリルを得た。生成物はそれ以上精製せずにそのまま使用した。
粗Ｓ−３−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−ペンタンニトリル（３．６２ｇ）のエタノール（５０ｍＬ）中溶液に、エタノール（１００ｍＬ）中Ｏ−エチルキサントゲン酸カリウム（５．７２ｇ）を加えた。アルゴン下で一晩撹拌後、該混合物を濃縮し、酢酸エチルで希釈し、シリカゲルの短カラムを通してろ過した。溶離液を濃縮し、残渣をシリカゲル上クロマトグラフィーにより１：４のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離して精製し、２．０ｇ（６２％、２段階）の標記生成物２３を得た。Ｒｆ＝０．４０（１：４ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）；
Figure 0005563673
ＭＳ：２２６．５１（Ｍ＋Ｎａ）＋、２４２．５１（Ｍ＋Ｋ）＋。
Ｒ−（−）−４−メチルジチオ−ペンタン酸（２４）：Ｒ−４−Ｏ−エチルキサンチック−ペンタンニトリル（２３、２．０ｇ、９．８５ｍｍｏｌ）の、エタノール（１０ｍＬ）と２００ｍＬの水の混合物中溶液を、ＮａＯＨ（６．０ｇ）で処理した。反応混合物をアルゴン下で一晩還流した。該混合物を水（１５０ｍｌ）で希釈し、１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した（２×１００ｍｌ）。水性層をＨ３ＰＯ４でｐＨ２．５〜３．０に酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した（６×７５ｍｌ）。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固して粗Ｒ−４−メルカプトペンタン酸を得た。この粗生成物をそれ以上精製せず次のステップにそのまま使用した。
１．６０ｇの粗Ｒ−４−メルカプトペンタン酸の、エタノール（５０ｍＬ）と０．５Ｍ
ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０（７５ｍＬ）の混合物中溶液に、乾燥ＴＨＦ（７ｍＬ）中メチルメタンチオールスルホネート（１．９６ｇ、１５．５３ｍｍｏｌ）を０℃で４５分間かけて滴下添加した。反応混合物をアルゴン下０℃で３０分間、次いで室温で２時間撹拌した。該混合物を濃縮し、ジクロロメタンで抽出した（２×５０ｍｌ）。水性層をＨ３ＰＯ４でｐＨ２．５〜３．０に酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した（４×１００ｍｌ）。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上クロマトグラフィーで１：１００：４００のＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離して精製し、１．６５ｇ（９３％）の標記生成物２４を得た。Ｒｆ＝０．３２（１：１００：４００ ＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）；
Figure 0005563673
ＭＳ：２０２．９（Ｍ＋Ｎａ）＋、２０３．９（Ｍ＋１＋Ｎａ）＋；［α］＝−３９．１６（ｃ＝２、ＣＨ３ＯＨ）。
Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（Ｒ）−メチルジチオ−１−オキソペンチル］−Ｓ−アラニン（１５ｂ）：Ｒ−（＋）−４−メチルジチオ−ペンタン酸（２４）を化合物１４で前述した方法によってＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル２５に転化した。化合物１５で前述した手順によってＮ−メチル−Ｌ−アラニンとの反応により１５ｂを得た。
ＭＳ：ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｎａ）：理論値：２８８．１、実測値：２８８．１
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−（Ｒ）−メチルジチオ−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ３−ＳＭｅ、４ｋ、ｌ）：４ｃの合成で前述したようにメイタンシノール（１１）をジクロロメタン中のＤＣＣと塩化亜鉛を用いて１５ｂと結合させた。Ｎ−メチル−Ｓ−アラニル部分（４ｋ、Ｓ，Ｒ）及びＮ−メチル−Ｒ−アラニル部分（４ｌ、Ｒ，Ｒ）を持つ２種類のジアステレオマー混合物を得た。該ジアステレオマーをＫｒｏｍａｓｉｌシアノカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）上ＨＰＬＣで、ヘキサン：酢酸エチル：２−プロパノール（６８：２４：８、ｖ／ｖ／ｖ）による無勾配溶離を用い、流速１ｍＬ／分で分離した。これらの条件下で、異性体４ｋ（Ｓ，Ｒ）は２３．９分で溶離した。質量スペクトル：ｍ／ｚ ８３４．２（Ｍ＋Ｎａ）＋。他の異性体４ｌ（Ｒ，Ｒ）のピークはよく分離し、３３．７分で溶離した。ＭＳ：ｍ／ｚ ８３４．２（Ｍ＋Ｎａ）＋。
実施例５ａ
メイタンシノイド及び抗体−メイタンシノイド複合体のインビトロ細胞毒性
ＫＢ（ＡＴＣＣ ＣＣＩ−１７）細胞株はヒト上皮由来である。ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３０）細胞株はヒト乳腺がんから樹立された。ヒト結腸腫瘍細胞株ＣＯＬＯ ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）及びＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ３８）、ヒト黒色腫細胞株Ａ−３７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１９）、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９６）及びヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＬ−２４０）は全てメリーランド州のＡＴＣＣから入手した。細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）及び５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）を補給したＬ−グルタミン入りダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビル）中で成長させた。細胞は、６％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下３６〜３７．５℃で維持された。
実施された細胞毒性試験はクローン原性アッセイを使用した。試験細胞株を６穴培養皿にウェル当たり１０００細胞の定数で播き、平板培養した。細胞は、様々な濃度（０〜３ｎＭ）の各種メイタンシノイド（遊離又は抗体との複合体）と共に７２時間インキュベートした。次に培地をプレートから吸引し新鮮な培地と取り替えた。培養物を播種後合計７〜１０日間成長及びコロニー形成させた。次に培養物を固定し、１０％ホルマリン／ＰＢＳ中０．２％のクリスタルバイオレットで染色し、コロニーを計数した。非処理細胞（培地のみ）のコロニー形成率は、計数したコロニー数を播種した細胞数で割って決定した。薬物に暴露された細胞の生存画分は、薬物に暴露されたウェル中のコロニー数を対照ウェル中のコロニー数で割って決定した。
本発明の新規メイタンシノイドのインビトロ細胞毒性測定結果を図４に示す。障害されたジスルフィド結合を持つ新規メイタンシノイド４ｃ、ｅは、試験した細胞株ＳＫ−ＢＲ−３及びＡ−３７５の両方に対して非常に細胞毒性が高く、ＩＣ５０値が７×１０−１２Ｍ〜２．５×１０−１１Ｍの範囲である。このように、ジスルフィド部分を持つ炭素上へのアルキル置換基の組込みは高い細胞毒性能を保存する。本発明の立体障害されたチオール含有メイタンシノイド４ａは、従前の対応する非障害メイタンシノイド１よりも３０〜５０倍強力である。従って、チオール部分を持つ炭素上へのアルキル置換基の組込みは効力を大きく増強する。
本発明のメイタンシノイドの抗体複合体のインビトロ試験の結果を図４ｃ及び４ｄに示
す。２つの新規メイタンシノイド４ａ又は４ｂとヒト結腸腫瘍に指向するｈｕＣ２４２抗体との連結は、標的細胞の抗原特異的殺滅をもたらした。このように、複合体は抗原陽性ＣＯＬＯ ２０５細胞に対して非常に効力が高く、ＩＣ５０値が１．１〜１．３×１０−１１Ｍの範囲である。これに対し、複合体は抗原陰性Ａ−３７５細胞に対しては１００〜２００倍も細胞毒性が弱く、本発明の新規メイタンシノイドは、立体障害されたジスルフィド結合を有し、高い標的特異的細胞毒性を示す複合体を製造することを示している。
実施例５ｂ
メイタンシノイド４ａ又は４ｂを用いるｈｕＣ２４２抗体の細胞毒性複合体の製造（方法Ａ、図５ａ、ｂ）
ｈｕＣ２４２抗体（８ｍｇ／ｍＬ）の水性緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩）（ｐＨ６．５）中溶液を、７〜１０倍モル過剰ＳＰＤＰ［スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、３ａ］、又はＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ、３ｂ）と共に２時間インキュベートした。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルろ過カラムを通過させて精製した。抗体濃度は、抗体の公知吸光係数ε２８０ｎｍ＝２１７，５６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて吸光光度法的に決定した。
修飾抗体を水性緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩）（ｐＨ６．５）中で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで１．５〜２．５モル過剰のジメチルアセトアミド中ＤＭ３又はＤＭ４のいずれかで処理した（ＤＭＡの最終濃度３％ｖ／ｖ）。反応混合物を室温で１８時間インキュベートした。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルろ過カラムを通過させて精製した。複合体濃度は、抗体ε２８０ｎｍ＝２１７，５６０Ｍ−１ｃｍ−１及びε２５２ｎｍ＝８０，０６２Ｍ−１ｃｍ−１；ＤＭ３又はＤＭ４、ε２８０ｎｍ＝５，７００Ｍ−１ｃｍ−１及びε２５２ｎｍ＝２６，７９０Ｍ−１ｃｍ−１の公知吸光係数を用いて吸光光度法的に決定した。得られた複合体はモノマー性で、抗体１分子当たり平均３．２〜３．５個のＤＭ３又はＤＭ４分子を含有していた。
実施例５ｃ
メイタンシノイド４ａ又は４ｂを用いるｈｕＣ２４２抗体の細胞毒性複合体の製造（方法Ｂ、図５ｃ）
ｈｕＣ２４２抗体（８ｍｇ／ｍＬ）の水性緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩）（ｐＨ６．５）中溶液を、７〜１０倍モル過剰ＳＭＣＣ［スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、２６］と共に２時間インキュベートした。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルろ過カラムを通過させて精製した。抗体濃度は、抗体の公知吸光係数ε２８０ｎｍ＝２１７，５６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて吸光光度法的に決定した。
修飾抗体を水性緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩）（ｐＨ６．５）中で２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで１．５〜２．５モル過剰のジメチルアセトアミド中ＤＭ３又はＤＭ４のいずれかで処理した（ＤＭＡの最終濃度３％ｖ／ｖ）。反応混合物を室温で１８時間インキュベートした。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルろ過カラムを通過させて精製した。複合体濃度は、公知吸光係数（抗体ε２８０ｎｍ＝２１７，５６０Ｍ−１ｃｍ−１及びε２５２ｎｍ＝８０，０６２Ｍ−１ｃｍ−１；ＤＭ３又はＤＭ４、ε２８０ｎｍ＝５，７００Ｍ−１ｃｍ−１及びε２５２ｎｍ＝２６，７９０Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて吸光光度法的に決定した。得られた複合体はモノマー性で、抗体１分子当たり平均３．２〜３．５個のＤＭ３又はＤＭ４分子を含有していた。
実施例５ｄ
メイタンシノイド４ａ又は４ｂを用いるｈｕＣ２４２抗体の細胞毒性複合体の製造（方法Ｃ、図５ｄ）
ｈｕＣ２４２抗体（８ｍｇ／ｍＬ）の水性緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩）（ｐＨ６．５）中溶液を、７〜１０倍モル過剰ＳＩＡＢ［Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、２７］と共に２時間インキュベートした。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルろ過カラムを通過させて精製した。抗体濃度は、抗体の公知吸光係数ε２８０ｎｍ＝２１７，５６０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて吸光光度法的に決定した。
実施例６
ｈｕＣ２４２−メイタンシノイド複合体のＨＴ−２９異種移植片に対するインビボ効能
５週齢の雌ＳＣＩＤマウス（２０匹）の右脇腹に、０．１ｍＬの無血清培地中ＨＴ−２９ヒト結腸がん細胞（１．５×１０６細胞／マウス）を皮下接種した。腫瘍を１１日間成長させ、平均サイズ１００ｍｍ３にした。次に動物を無作為に４群に分けた（各群５匹）。第一の群はｈｕＣ２４２−ＤＭ１複合体（ＤＭ１の用量７５μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を静脈内投与された。第二の群はｈｕＣ２４２−ＤＭ３複合体（ＤＭ３の用量７５μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を静脈内投与された。第三の群はｈｕＣ２４２−ＤＭ４複合体（ＤＭ４の用量７５μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を受けたが、第四の群の動物は対照として働き、１〜３群と同じ処置スケジュールでＰＢＳを投与された。
腫瘍サイズは週２回測定し、腫瘍容積は、式：腫瘍容積＝１／２（長さ×幅×高さ）を用いて算出した。動物の体重も週２回測定した。結果を図７に示す。対照群のマウスの腫瘍は３５日間で約１０００ｍｍ３のサイズに成長した。ｈｕＣ２４２−ＤＭ１による処置では、腫瘍成長が１８日間遅延したが、本発明のメイタンシノイド４ａ及び４ｂで製造した複合体は著しく有効で、それぞれ腫瘍成長遅延を２８日間及び３６日間に延長した。
実施例７
ｈｕＣ２４２−メイタンシノイド複合体のＣＯＬＯ ２０５異種移植片に対するインビボ効能
５週齢の雌ＳＣＩＤマウス（２０匹）の右脇腹に、０．１ｍＬの無血清培地中ＣＯＬＯ
２０５ヒト結腸がん細胞（１．５×１０６細胞／マウス）を皮下接種した。腫瘍を１１日間成長させ、平均サイズ１００ｍｍ３にした。次に動物を無作為に４群に分けた（各群５匹）。第一の群はｈｕＣ２４２−ＤＭ１複合体（ＤＭ１の用量７５μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を静脈内投与された。第二の群はｈｕＣ２４２−ＤＭ３複合体（ＤＭ３の用量７５μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を静脈内投与された。第三の群はｈｕＣ２４２−ＤＭ４複合体（ＤＭ４の用量７５μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を受けたが、第四の群の動物は対照として働き、１〜３群と同じ処置スケジュールでＰＢＳを投与された。
腫瘍サイズは週２回測定し、腫瘍容積は、式：腫瘍容積＝１／２（長さ×幅×高さ）を用いて算出した。動物の体重も週２回測定した。結果を図８に示す。対照群のマウスの腫瘍は２４日間で約９００ｍｍ３のサイズに成長した。ｈｕＣ２４２−ＤＭ１による処置では、腫瘍成長が２０日間遅延したが、本発明のメイタンシノイド４ａで製造した複合体はかなり有効で、４５日間持続する完全腫瘍退縮をもたらした。本発明のメイタンシノイド４ｂで製造した複合体による処置はなおさらに有効で、処置動物全ての治癒をもたらした。
実施例８
ＭＹ９−６−メイタンシノイド複合体のＨＬ−６０異種移植片に対するインビボ効能
５週齢の雌ＳＣＩＤマウス（２０匹）の右脇腹に、０．１ｍＬの無血清培地中ＨＬ−６０ヒト骨髄性白血病細胞（１．５×１０６細胞／マウス）を皮下接種した。腫瘍を１２日間成長させ、平均サイズ１００ｍｍ３にした。次に動物を無作為に４群に分けた（各群５匹）。第一の群はＭＹ９−６−ＤＭ１複合体（ＤＭ１の用量２００μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を静脈内投与された。第二の群はＭＹ９−６−ＤＭ３複合体（ＤＭ３の用量２００μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を静脈内投与された。第三の群はＭＹ９−６−ＤＭ４複合体（ＤＭ４の用量２００μｇ／ｋｇ、ｑｄ×５）を静脈内投与されたが、第四の群の動物は対照として働き、１〜３群と同じ処置スケジュールでＰＢＳを投与された。
腫瘍サイズは週２回測定し、腫瘍容積は、式：腫瘍容積＝１／２（長さ×幅×高さ）を用いて算出した。動物の体重も週２回測定した。結果を図９に示す。対照群のマウスの腫瘍は迅速に成長し２１日間で約１６００ｍｍ３のサイズになった。ＭＹ９−６−ＤＭ１による処置では、腫瘍成長が５日間遅延したが、本発明のメイタンシノイド４ａ及び４ｂで製造した複合体は著しく有効で、腫瘍成長遅延を２０日間以上に延長した。
実施例９
メイタンシノイドＤＭ４（４ｂ）を用いるｈｕＭｙ９−６抗体の細胞毒性複合体の製造
８ｍｇ／ｍＬの濃度のｈｕＭｙ９−６抗体の溶液を、６．５モル過剰ＳＳＮＰＢ［スルホスクシンイミジル４−（５’−ニトロ−２’−ピリジルジチオ）ブチレート］とともに、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸を含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）（緩衝液Ａ）中で５％エタノールとともに２時間インキュベートした。修飾抗体を緩衝液Ａ中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルろ過カラムを通過させて精製し、精製抗体の濃度を、２８０ｎｍにおける抗体の吸光係数を用いて吸光光度法的に決定した。修飾抗体を緩衝液Ａで４．９ｍｇ／ｍＬに希釈し、１．７倍モル過剰のＤＭ４と室温で１８時間インキュベートした。ＤＭ４はジメチルアセトアミド中のストック溶液として反応混合物に加えた（ジメチルアセトアミドの最終濃度３％ｖ／ｖ）。抗体−薬物複合体をＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを通過させて精製した。複合体濃度は、抗体とＤＭ４の公知吸光係数（抗体、ε２８０ｎｍ＝２０６，４６０Ｍ−１ｃｍ−１、ε２５２ｎｍ＝７２，２６１Ｍ−１ｃｍ−１；ＤＭ４、ε２８０ｎｍ＝５，７００Ｍ−１ｃｍ−１、ε２５２ｎｍ＝２６，７９０Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて吸光光度法的に決定した。得られた抗体−薬物複合体は、抗体１分子当たり平均３．６個のＤＭ４分子を含有していた。生化学的分析から、抗体は複合体化後９４％以上モノマーのままであり、フローサイトメトリーによる測定で非修飾抗体に匹敵する結合親和性を有していることが示された。共有結合的に連結されていない抗体を伴う薬物（遊離薬物）の量をＨＰＬＣ分析で測定したところ、全連結薬物の１％未満であることが分かった。
実施例１０
ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４複合体のインビトロ選択性及び効能
ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４の、ＣＤ３３発現細胞（ＨＬ−６０）及びＣＤ３３陰性Ｎａｍａｌｗａ細胞に対する細胞毒性をクローン原性アッセイ、すなわち殺細胞活性を処置後成長できるコロニー数の定量化によって決定するアッセイを用いて試験した。ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４は、ＣＤ−３３陽性ＨＬ−６０ヒト腫瘍細胞に対してインビトロで強力な殺細胞活性を示す（図１０）。ＣＤ３３陰性ヒトＮａｍａｌｗａ細胞に対する著しい細胞毒性は観察されず、ＣＤ３３依存性細胞毒性は、抗ＣＤ３３抗体すなわち複合体のｈｕＭｙ９−６による特異的な標的化によるものであることを示していた。
実施例１１
ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４複合体の、ＳＣＩＤマウスにおけるＨＬ６０ヒト腫瘍異種移植片に対するインビボ効能
インビボにおけるｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４の効能を、ヒトＨＬ−６０腫瘍異種移植片を
持つＳＣＩＤマウスで測定した。ＨＬ−６０細胞を皮下注射し、腫瘍を平均サイズ１００ｍｍ３に成長させた。ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４複合体を１日１回５日間、図１１に示した用量で静脈内投与した。用量は複合体中のμｇＤＭ４として表されている。これは１μｇのＤＭ４当たり抗体約６７μｇの抗体用量に対応する。腫瘍容積は治療効果の目安として測定され、マウスの体重は治療による毒性を示すためにモニタされた。ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４は、ヒトＨＬ−６０細胞異種移植片の腫瘍成長遅延の延長を、ほとんど毒性を起こさない用量で誘導した（図１１）。ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４の効能をｈｕＭｙ９−６−ＤＭ１のそれとも比較した。思いがけずｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４はｈｕＭｙ９−６−ＤＭ１より効果的であることが分かった。ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４は動物を完全寛解（ＣＲ）の状態に約６０日間保ったが、ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ１で処置された動物は約２０日間のＣＲの後再発した。
実施例１２
メイタンシノイドＤＭ４（４ｂ）を用いるｈｕＢ４抗体の細胞毒性複合体の製造
２０ｍｇ／ｍＬの濃度のｈｕＢ４抗体の溶液を、８倍モル過剰のＳＳＮＰＢ［スルホスクシンイミジル４−（５’−ニトロ−２’−ピリジルジチオ）ブチレート］とともに、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸を含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）（緩衝液Ａ）中で５％ジメチルアセトアミドとともに１．５時間インキュベートした。修飾抗体を緩衝液Ａ中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルろ過カラムを通過させて精製し、精製抗体の濃度を、２８０ｎｍにおける抗体の吸光係数（１９９，５６０Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて吸光光度法的に決定した。修飾抗体を緩衝液Ａで８ｍｇ／ｍＬに希釈し、１．７倍モル過剰のＤＭ４と周囲温度で３時間インキュベートした。ＤＭ４はジメチルアセトアミド中のストック溶液として反応混合物に加えた（ジメチルアセトアミドの最終濃度３％ｖ／ｖ）。抗体−薬物複合体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム及びＳｅｐｈａｄｅｘ Ｓ３００｛いずれもＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中で平衡化｝を通過させて精製した。複合体濃度は、抗体（ε２８０ｎｍ：１９９，５６０Ｍ−１ｃｍ−１、ε２５２ｎｍ：６７，８５０Ｍ−１ｃｍ−１）及びＤＭ４（ε２８０ｎｍ＝５，７００Ｍ−１ｃｍ−１、ε２５２ｎｍ＝２６，７９０Ｍ−１ｃｍ−１）の公知吸光係数を用いて吸光光度法的に決定した。得られた抗体−薬物複合体は、抗体１分子当たり平均４．０個のＤＭ４分子を含有していた。生化学的分析から、抗体は複合体化後９８％以上モノマーのままであり、フローサイトメトリーによる測定で非修飾抗体に匹敵する結合親和性を有していることが示された。共有結合的に連結されていない抗体を伴う薬物（遊離薬物）の量をＨＰＬＣ分析で測定したところ、全連結薬物の約２％であることが分かった。
実施例１３
ｈｕＢ４−ＤＭ４複合体のインビトロ選択性及び効能
ｈｕＢ４−ＤＭ４の、ＣＤ１９陰性細胞株（Ｃｏｌｏ ２０５）と比較したＣＤ１９発現細胞（Ｒａｍｏｓ）に対する細胞毒性をＭＴＴアッセイ、すなわち殺細胞活性を、複合体による処置後に残存する生細胞数を定量化することによって決定するアッセイを用いて試験した。生細胞数は、細胞を生体染料のＭＴＴとインキュベートした後、吸光光度定量によって測定する。ｈｕＢ４−ＤＭ４は、ＣＤ１９陽性Ｒａｍｏｓヒト腫瘍細胞に対してインビトロで強力な殺細胞活性を示す（図１２）。ＣＤ１９陰性細胞に対する著しい細胞毒性は観察されず、ＣＤ１９依存性細胞毒性は、抗ＣＤ１９抗体すなわちｈｕＢ４による特異的な標的化によるものであることを示していた。
実施例１４
ｈｕＢ４−ＤＭ４複合体の、ＳＣＩＤマウスにおけるＲａｍｏｓヒト腫瘍異種移植片に対するインビボ効能
インビボにおけるｈｕＢ−ＤＭ４の効能を、樹立されたヒトＲａｍｏｓ腫瘍異種移植片を持つＳＣＩＤマウスを用いて測定した。Ｒａｍｏｓ細胞を皮下注射し、腫瘍を平均サイ
ズ１００ｍｍ３に成長させた。ｈｕＢ４−ＤＭ４複合体を図１３ａに示した用量で１回注射として静脈内投与した。用量は複合体中のμｇＤＭ４として表されている。これは１μｇのＤＭ４当たり抗体約４４μｇの抗体用量に対応する。治療効果の目安として腫瘍容積を測定し、治療による毒性を示すためにマウスの体重をモニタした。５０μｇ／ｋｇを超える用量でｈｕＢ４−ＤＭ４は、全ての動物で腫瘍の完全退縮をもたらす。１００ｍｇ／ｋｇ処置群では約３５日間、二つの高用量群では５５日間を超えても動物に測定可能な疾患は見られないままである。これらの処置は、処置動物の体重変化で判断する限り、あったとしても極めて少ない毒性しか起こさなかった（図１３ｂ）。
従前のメイタンシノイドの構造を示す図である。 本発明のいくつかのメイタンシノイドの構造を示す図である。 本発明の代表的メイタンシノイドの合成スキームを示す図である。 本発明の代表的メイタンシノイドの合成スキームを示す図である。 本発明の代表的メイタンシノイドの合成スキームを示す図である。 本発明の代表的メイタンシノイドの合成スキームを示す図である。 本発明の新規メイタンシノイドのインビトロ効力を示すグラフである。 本発明の新規メイタンシノイドのインビトロ効力を示すグラフである。 本発明の新規メイタンシノイドのインビトロ効力を従前のものと比較するグラフである。 本発明の新規メイタンシノイドのインビトロ効力を従前のものと比較するグラフである。 細胞結合剤と本発明のメイタンシノイドとの複合体の製造スキームを示す図である。 細胞結合剤と本発明のメイタンシノイドとの複合体の製造スキームを示す図である。 細胞結合剤と本発明のメイタンシノイドとの複合体の製造スキームを示す図である。 細胞結合剤と本発明のメイタンシノイドとの複合体の製造スキームを示す図である。 本発明の細胞結合剤−メイタンシノイド複合体のインビトロ効力を示すグラフである。 ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片に対する、本発明のｈｕＣ２４２−メイタンシノイドのインビボ抗腫瘍効果を従前のメイタンシノイドのｈｕＣ２４２複合体と比較したグラフである。 ＣＯＬＯ ２０５ヒト結腸腫瘍異種移植片に対する、本発明のｈｕＣ２４２−メイタンシノイドのインビボ抗腫瘍効果を従前のメイタンシノイドのｈｕＣ２４２複合体と比較したグラフである。 ＨＬ６０前骨髄球骨髄性白血病異種移植片に対する、本発明のＭＹ９−６−メイタンシノイドのインビボ抗腫瘍効果を従前のメイタンシノイドのＭＹ９−６複合体と比較したグラフである。 複合体ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４の、標的ＨＬ−６０細胞及び非標的Ｎａｍａｌｗａ細胞に対するインビトロ細胞毒性評価の結果を示すグラフである。 ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＨＬ−６０異種移植片腫瘍に対する複合体ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４のインビボ効能の評価と、従前のメイタンシノイドのｈｕＭｙ９−６複合体（ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ１）のそれとの比較を示すグラフである。 複合体ｈｕＢ４−ＤＭ４の、標的Ｒａｍｏｓ細胞及び非標的Ｃｏｌｏ ２０５細胞に対するインビトロ細胞毒性評価の結果を示すグラフである。 ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＲａｍｏｓ異種移植片腫瘍に対する複合体ｈｕＢ４−ＤＭ４のインビボ効能の評価を示すグラフである。 試験期間中の動物の体重変化を示すグラフである。

Claims (5)

  1. 以下の式：
    Figure 0005563673
     ［式中、ｗは１〜１０である］で表される、メイタンシノイド−細胞結合剤複合体。
  2. 有効量の請求項１に記載のメイタンシノイド−細胞結合剤複合体、その製薬学的に許容しうる塩又は溶媒和物、及び製薬学的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
  3. 細胞結合剤が結合し得る細胞に細胞死を誘導するための医薬組成物であって、請求項１に記載のメイタンシノイド−細胞結合剤複合体を含む、前記医薬組成物。
  4. 腫瘍を治療するための、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣、又はリンパ器官のがんを治療するための、請求項３に記載の医薬組成物。
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