JP5414087B2 - 運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法及び評価用キット、物質のスクリーニング方法、並びに、マーカーとしての使用 - Google Patents

Description

本発明は、運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法及び評価用キット、物質のスクリーニング方法、並びに、マーカーとしての使用に関し、さらに詳細には、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液におけるマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価する運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法、当該方法に用いる評価用キット、当該方法を用いて所望の運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法、並びに、マーカーとしての使用に関する。

近年の健康志向の増大に伴い、運動に対する関心が高まっている。継続的・習慣的な運動が疾病予防や健康維持に有用であることは、経験的に明らかである。また、運動機能に関係する食品素材としてホエイタンパク質（whey protein）が知られており、ホエイタンパク質を含有する筋強化剤や筋肉疲労改善剤が開発されている（特許文献１，２）。

ホエイタンパク質と運動機能との関係については、動物を用いて科学的に調べられている。例えば非特許文献１には、ホエイタンパク質の摂取はカゼイン摂取、大豆タンパク質摂取に比べてトレッドミル運動負荷ラットの肝臓グリコーゲン含量を有意に増加させた旨が記載されている。また、そのメカニズムとして、グリコーゲン構成に関わる糖転移酵素の変動の可能性が示唆されている。また非特許文献２には、ホエイタンパク質を摂取させたラットはカゼインを摂取させたラットに比べて、水泳運動負荷ラットの肝臓及び筋肉中のグリコーゲン含量を有意に増加させた旨が記載されている。さらに非特許文献３には、ホエイタンパク質を摂取させたラットはカゼインを摂取させたラットに比べて、水泳運動負荷ラットの肝臓及び筋肉における脂肪酸合成を促進させた旨が記載されている。これらの結果は、ホエイタンパク質の摂取と継続的な運動とを組み合わせが、より高い運動機能の向上効果や維持・回復効果を生じさせることを示している。すなわち、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物においては、運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等）が特に高い状態となる。

一方、運動機能と相関する体液中のマーカー物質に関する報告は見当たらず、ホエイタンパク質のような物質の摂取と継続的な運動との組み合わせによりもたらされる運動機能の変動（向上、維持、回復など）を反映するマーカー物質についても知られていない。もしそのようなマーカー物質が特定されれば、ホエイタンパク質と同様の作用を有する物質のスクリーニング等に有用である。

特開２００２−６５２１２号公報 特開２００４−１８２６３０号公報 モリフジ（Morifuji）ら，エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディシン（Experimental Biology and Medicine），２００４年，第２３０巻，第１号，ｐ２３−３０ モリフジ（Morifuji）ら，ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ニュートリション（British Journal of Nutrition），２００５年，第９３巻，第１号，ｐ４３９−４４５ モリフジ（Morifuji）ら，ニュートリション（Nutrition），２００５年，第２１巻，第１０号，ｐ１０５２−１０５８

本発明の目的は、運動機能や筋肉の状態を反映するマーカー物質を特定し、該マーカー物質を指標とした運動機能の向上効果や維持・回復効果を有する物質のスクリーニングに有用な一連の技術を提供することにある。

上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の濃度測定は質量／電荷比を指標とする方法で行い、前記被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価することを特徴とする運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ａ３）は配列番号７〜９で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ａ４）は配列番号１０〜１４で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチンに特異的な抗体に対する反応性を有し、
マーカー物質（Ａ７）は配列番号１５〜２１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。

本発明は物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法に係るものであり、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）は、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物の体液中で有意に増減するタンパク質であり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するものである。本発明によれば、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を容易かつ高精度に評価することができる。なお、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。

ここで「運動機能の向上効果」とは、正常レベルにある運動機能をさらに向上させる効果をいう。物質が有する運動機能の向上効果を評価することにより、例えば、運動機能のさらなる向上を目指すアスリートに適した食品素材等のスクリーニングを行うことができる。また「運動機能の維持効果」とは、運動機能の低下を抑えて正常レベルに維持しようとする効果をいう。物質が有する運動機能の維持効果を評価することにより、例えば、運動機能の低下を予防したい高齢者に適した食品素材等のスクリーニングを行うことができる。また「運動機能の回復効果」とは、低下した運動機能を正常レベルに戻そうとする効果をいう。物質が有する運動機能の回復効果を評価することにより、例えば、リハビリテーションによって運動機能の回復を目指す負傷者に適した食品素材等のスクリーニングを行うことができる。そして「運動機能の向上・維持・回復効果」とは、運動機能の向上効果、維持効果、及び回復効果のうちの少なくとも１つの効果を指すものとする。

ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約５２８０」、「約１３７００」、「約４７１００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約５２８０は概ね５２８０±０．２％、約１３７００は概ね１３７００±０．２％、約６４７１００は概ね４７１００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が運動機能の向上・維持・回復効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ４）、及び（Ａ７）の濃度はより高値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、及び（Ａ５）の濃度はより低値を示す。

請求項２に記載の発明は、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）及び（Ａ７）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の濃度測定は質量／電荷比を指標とする方法で行い、前記被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価することを特徴とする運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ａ３）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ａ４）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ａ７）はβ２−グリコプロテイン１又はその修飾体である。

アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチン、及びβ２−グリコプロテイン１はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法によればマーカー物質（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、（Ａ７）の解析が容易である。

「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。

同様の課題を解決するための請求項３に記載の発明は、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価することを特徴とする運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｂ２）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｂ４）β２−グリコプロテイン１又はその修飾体。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法は、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）は、ホエイタンパク質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中で有意に増減するタンパク質であり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するものである。本発明によれば、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を容易かつ高精度に評価することができる。さらに、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチン、及びβ２−グリコプロテイン１はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本発明においても、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。

（Ｂ１）〜（Ｂ４）に属するマーカー物質は、いずれも主に血液中に存在する。被験物質がホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｂ２）及び（Ｂ４）の濃度はより高値を示し、（Ｂ１）及び（Ｂ３）の濃度はより低値を示す。

本発明においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱離も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。

請求項４に記載の発明は、前記基準値は、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。
（Ｉ）前記被験物質を摂取させずに運動負荷をかけた動物から採取した体液における前記マーカー物質の濃度、
（ＩＩ）運動負荷をかけずに前記被験物質を摂取させた動物から採取した体液における前記マーカー物質の濃度。

かかる構成により、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。

請求項５に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。

かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価することができる。

請求項６に記載の発明は、前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。

かかる構成により、機能性食品の開発を目的として、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価することができる。

請求項７に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。

請求項８に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項７に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。

請求項９に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項７又は８に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法である。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。

請求項１０に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法によって被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価し、当該評価結果に基づいて所望の運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。

本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の各マーカー物質および上記（Ｂ１）〜（Ｂ４）に属する各マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、所望の運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の各マーカー物質および上記（Ｂ１）〜（Ｂ４）に属する各マーカー物質は、いずれもホエイタンパク質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中で有意に増減するタンパク質であり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するものである。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、所望の運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被験物質が食品素材の場合は、運動機能の向上・維持・回復効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。

請求項１１に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする運動機能の向上・維持・回復効果の評価用キットである。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。

請求項１２に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１１に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価用キットである。

かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。

運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される（請求項１３）。

請求項１４に記載の発明は、動物の体内に存在する下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の少なくとも１つのタンパク質の、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の検出は質量／電荷比を指標とする方法により行う、運動機能の変動を反映するマーカーとしての使用である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ａ３）は配列番号７〜９で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ａ４）は配列番号１０〜１４で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチンに特異的な抗体に対する反応性を有し、
マーカー物質（Ａ７）は配列番号１５〜２１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。

請求項１５に記載の発明は、動物の体内に存在する下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の少なくとも１つのタンパク質の、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の検出は質量／電荷比を指標とする方法により行う、運動機能の変動を反映するマーカーとしての使用である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ａ３）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ａ４）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチン又はその修飾体であり、
マーカー物質（Ａ７）はβ２−グリコプロテイン１又はその修飾体である。

請求項１６に記載の発明は、動物の体内に存在する下記（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つのタンパク質の、運動機能の変動を反映するマーカーとしての使用である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｂ２）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｂ４）β２−グリコプロテイン１又はその修飾体。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法によれば、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を容易かつ高精度に評価することができる。

本発明の物質のスクリーニング方法によれば、所望の運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質を容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法は３つの様相を含む。１つの様相では、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の濃度測定は質量／電荷比を指標とする方法で行い、前記被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価する。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
さらに、
マーカー物質（Ａ３）は配列番号７〜９で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ａ４）は配列番号１０〜１４で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチンに特異的な抗体に対する反応性を有し、
マーカー物質（Ａ７）は配列番号１５〜２１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。

これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、ホエイタンパク質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中で有意に増減し、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するものである。被験物質がホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ４）、及び（Ａ７）（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）の濃度はより高値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、及び（Ａ５）（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）の濃度はより低値を示す。

ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ａ３）、（Ａ４）、及び（Ａ７）は、それぞれアポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ａ２、及びβ２−グリコプロテイン１と同定され得る。また、マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチンに特異的な抗体に対する反応性を有する。すなわち、他の様相では、下記（１）、（２）、（３）、及び（５）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ３）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ４）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ａ７）はβ２−グリコプロテイン１又はその修飾体である。

本発明の他の様相では、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価する。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｂ２）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｂ４）β２−グリコプロテイン１又はその修飾体。

タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。

「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。

例えば、シグナル配列が切断された後のアポリポタンパク質Ｃ１(配列番号１，マウス由来）のＮ末端アミノ酸配列は「Ａｌａ−Ｐｒｏ」から始まるが、これら２つのアミノ酸は切断され得ることが報告されている（Oleg Chertov et al., Proteomics, Vol. 4, No. 4, 2004）。このようなＮ末端の２アミノ酸が欠損したアポリポタンパク質Ｃ１の断片は「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」に含まれる。

同様に、シグナル配列が切断された後のアポリポタンパク質Ａ２(配列番号２，マウス由来）は７８アミノ酸からなるが、これのＮ末端側７０アミノ酸（配列番号３）からなるタンパク質断片は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。

トランスサイレチン（transthyretin；プレアルブミンとも呼ばれる）は血漿タンパク質の一種であり、分子量約１万４千のサブユニット４個からなる複合タンパク質である。マウス由来およびヒト由来のトランスサイレチンのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４と５に示すとおりであり、システイン残基を１つ有している。この唯一のシステイン残基のチオール基（−ＳＨ）は修飾可能であり、システイン残基への修飾の種類が異なる複数種のトランスサイレチンの修飾体が知られている（例えば、リム（Lim）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry），２００３年，第２７８巻，ｐ４９７０７−４９７１３；リム（Lim）ら，プロテイン・サイエンス（Protein Science），２００３年，第１２巻，ｐ１７７５−１７８５；ゲリック（Gericke）ら，ビー・エム・シー・キャンサー（BMC Cancer），２００５年，５：１３３）。具体的には、システイン残基にスルホン基、システイン、ホモシステイン、システイニルグリシン、又はグルタチオンが付加されたトランスサイレチンの修飾体が知られている。例えばこれらのトランスサイレチンの修飾体が本発明におけるマーカー物質になり得る。なお、本明細書においてはトランスサイレチンのサブユニットについても単に「トランスサイレチン」と呼ぶこととし、複合体とサブユニットとを特に区別しない。

β２−グリコプロテイン１（β2-glycoprotein1；アポリポタンパク質Ｈとも呼ばれる）についても、その修飾体には上記で例示した各修飾体が含まれる。マウス由来のβ２−グリコプロテイン１のアミノ酸配列を配列番号６に示す。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法では、（Ａ１）〜（Ａ７）の各マーカー物質並びに（Ｂ１）〜（Ｂ４）に属する各マーカー物質の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。

動物に運動負荷をかける方法としては、通常の生活で行われる運動以上の負荷がかけられる方法であれば特に限定はなく、例えば、トレッドミルを用いることができる。運動負荷をかける時間や頻度についても特に限定はなく、負荷の内容等によって適宜選択すればよい。例えば、１回あたり数分〜数十分の運動負荷を１日に１回以上与え、これを１週間あたり５日以上実施することが挙げられる。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法では、動物の体液におけるマーカー物質の濃度を基準値と比較する。好ましい実施形態では、当該基準値が下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）である。
（Ｉ）前記被験物質を摂取させずに運動負荷をかけた動物から採取した体液における前記マーカー物質の濃度、
（ＩＩ）運動負荷をかけずに前記被験物質を摂取させた動物から採取した体液における前記マーカー物質の濃度。
被験物質が運動機能の向上・維持・回復効果を有する場合、動物の体液におけるグループ１に属するマーカー物質の濃度は（Ｉ）、（ＩＩ）より高い値を示し、グループ２に属するマーカー物質の濃度は（Ｉ）、（ＩＩ）より低い値を示す。なお（Ｉ）と（ＩＩ）の基準値はどちらか一方のみを使用してもよいし、併用してもよい。

基準値は予め設定することもできる。例えば、運動機能の向上・維持・回復効果を有する既知物質（例えば、ホエイタンパク質）を用いて事前に動物実験を行い、その蓄積されたデータを元にマーカー物質ごとの基準値（固定値）を決定することができる。すなわち、各種の臨床検査で設定されている基準値（カットオフ値など）と同様の取り扱いが可能である。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法において使用する動物としては特に限定はなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法における被験物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。

イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。

質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。

電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。

クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。

好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。

イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。

金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ａｌ³⁺、Ｆｅ³⁺、Ｇａ³⁺等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。

抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。

疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。

本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。

一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。

本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法によって被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価し、所望の運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。

本発明の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、所望の運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。

〔キットの構成例〕
・弱陽イオン交換基板：１枚
・強陰イオン交換基板：１枚
・基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
・基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
・各マーカー物質の標準品：各適量

以下に、本発明によって被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価する具体的手順の一例を挙げる。この例では、４群のマウスを用い、体液として血液、マーカー物質の測定にＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを採用する。

マウスを４群に分け、以下の条件で飼育する。
第１群（ＳＣ）：運動負荷なし（Ｓ）＋対照食摂取（Ｃ）
第２群（ＴＣ）：運動負荷あり（Ｔ）＋対照食摂取（Ｃ）
第３群（ＴＰ）：運動負荷あり（Ｔ）＋被験物質含有食摂取（Ｐ）
第４群（ＳＰ）：運動負荷なし（Ｓ）＋被験物質含有食摂取（Ｐ）
対照食は運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質（例えば、ホエイタンパク質）を一切含まず、運動機能の向上・維持・回復効果を有さないことがわかっている成分（例えば、カゼイン）のみで構成する。被験物質含有食は、被験物質を含有する以外は対照食と基本的に同じ組成とする。第２群と第３群にはトレッドミルによる運動負荷を継続的にかける。

一定期間飼育後の各群のマウスから血液を採取し、血漿サンプルを調製する。界面活性剤等で変性処理をした後、強陰イオン交換カラムにアプライし、ｐＨ９．０、ｐＨ５．０、ｐＨ３．０の各バッファー、並びに有機溶媒で順次溶出して分画する。

ｐＨ９．０の溶出画分を弱陽イオン交換基板にスポットし、次いでｐＨ３．０のバッファーで洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ３）、（Ａ５）、及び（Ａ７）が基板上に捕捉される。また、ｐＨ３．０の溶出画分を弱陽イオン交換基板にスポットし、次いでｐＨ３．０のバッファーで洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ２）及び（Ａ４）が基板上に捕捉される。また、有機溶媒の溶出画分を強陰イオン交換基板にスポットし、次いでｐＨ９．０のバッファーで洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ１）が基板上に捕捉される。各基板をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供し、生じたイオンピークから各マーカー物質の濃度を算出する。

マーカー物質ごとに第１群〜第４群の濃度値を横に並べ、増減パターンを解析する。「第１群−第２群−第３群−第４群」の値について、グループ１に属するマーカー物質の場合は「低−低−高−低」のパターンを示したときに、グループ２に属するマーカー物質の場合は「高−高−低−高」のパターンを示したときに、当該被験物質は運動機能の向上・維持・回復効果を有すると評価する。なお第２群と第４群の値は、それぞれ上記した（Ｉ）と（ＩＩ）の基準値に相当する。この際、いずれか１つのマーカー物質を指標としてもよいし、複数のマーカー物質を指標としてもよい。

以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．動物の飼育と体液試料の調製
８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス（日本エスエルシー社）を予備飼育し、４群に分けた。各群の個体数は７以上とした。

〔各群の飼育条件〕
第１群（ＳＣ）：運動負荷なし（Ｓ）＋対照食摂取（Ｃ）
第２群（ＴＣ）：運動負荷あり（Ｔ）＋対照食摂取（Ｃ）
第３群（ＴＰ）：運動負荷あり（Ｔ）＋ホエイタンパク質含有食摂取（Ｐ）
第４群（ＳＰ）：運動負荷なし（Ｓ）＋ホエイタンパク質含有食摂取（Ｐ）

〔飼料等〕
・対照食：ＡＩＮ９３
・ホエイタンパク質含有食（明治製菓株式会社製）：対照食に含まれるカゼインをホエイタンパク質に置換した組成を有する。
・水と飼料は自由摂取

〔飼育期間〕
・４週間
〔明暗、室温〕
・明時：８時〜２０時，暗時：２０時〜８時
・室温：２２±２℃

〔運動負荷〕
トレッドミル運動負荷を採用した。飼育１週目は１５ｍ／分で１５分間、傾斜なしの条件から始め、徐々にスピードと運動時間を上げて慣れさせた。飼育２週目から飼育終了までは２２ｍ／分で３０分、傾斜なしの条件で運動負荷を与えた。頻度は１日に１回、１週間あたり５日とし、２日以上の休息期間が生じないようにした。

飼育終了後に各群のマウスから血液を採取した。採取した血液から血漿を調製し、体液試料とした。

２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
各体液試料２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。

得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出した。これらの情報を元にして以下の手順Ｓ１〜Ｓ４にてピークを絞り込んだ。

Ｓ１：運動マウス同士を比較した場合にホエイタンパク質摂取により発現量が増減したピークを選抜した。具体的には、第２群（ＴＣ）と第３群（ＴＰ）との間でイオン強度に有意差（ｐ＜０．０５）があるピークを選抜した。この段階で５７個の候補ピークが選抜された。
Ｓ２：５７個のピークから運動により（ａ）の増減が抑制されたピークを除去した。具体的には、第１群（ＳＣ）と第２群（ＴＣ）との間でイオン強度に有意差（ｐ＜０．０５）があるマーカーを除去した。これにより、４３個の候補ピークに絞られた。
Ｓ３：４３個の候補ピークからアーティファクト（２価イオン、ノイズ等）を除去した。これにより、２２個の候補ピークに絞られた。
Ｓ４：２２個の候補ピークから、ホエイタンパク質を摂取したマウス同士を比較した場合に運動により発現量が増減したピークを選抜した。具体的には、第３群（ＴＰ）と第４群（ＳＰ）との間でイオン強度に有意差（ｐ＜０．０５または０．１）があるマーカーを選抜した。これにより、７個の候補ピークが最終的に選抜された。
なお、最終的に選抜されたピークの増減パターンは、いずれも第３群のみが高値または低値を示し、第１群、第２群および第４群の間ではあまり差がないものであった。

３．マーカー物質（Ａ１）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５２８０（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第２群および第４群で低値を示し、第３群で高値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。

ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７７４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００９
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．６６７
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．１８４
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第４群）：０．５０６
ｐ値（第１群ｖｓ第４群）：０．９１８
ＲＯＣ面積（第３群ｖｓ第４群）：０．７３５
ｐ値（第３群ｖｓ第４群）：０．０３１

以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５２８０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ１））が、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物の体液中で有意に増減するものであり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するマーカーとなり得ることが分かった。これにより、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ１）の濃度を指標として、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果の評価が行なえることが示された。例えば、被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５２８０のピークを生じるタンパク質の濃度が第１群〜第４群にかけて「低−低−高−低」のパターンを示したとき、当該被験物質はホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する、と評価することができる。

４．マーカー物質（Ａ２）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が６８２９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第２群および第４群で高値を示し、第３群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。

ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８１０
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０１０
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．６３９
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．２２５
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第４群）：０．５３６
ｐ値（第１群ｖｓ第４群）：０．５３７
ＲＯＣ面積（第３群ｖｓ第４群）：０．６５８
ｐ値（第３群ｖｓ第４群）：０．０８９

以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６８３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ２））が、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物の体液中で有意に増減するものであり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するマーカーとなり得ることが分かった。これにより、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ２）の濃度を指標として、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果の評価が行なえることが示された。例えば、被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６８３０のピークを生じるタンパク質の濃度が第１群〜第４群にかけて「高−高−低−高」のパターンを示したとき、当該被験物質はホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する、と評価することができる。

５．マーカー物質（Ａ３）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７０１１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第２群および第４群で高値を示し、第３群で低値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。

ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８１０
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００３
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．５８３
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．５６４
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第４群）：０．７３２
ｐ値（第１群ｖｓ第４群）：０．０５７
ＲＯＣ面積（第３群ｖｓ第４群）：は０．６８４
ｐ値（第３群ｖｓ第４群）：０．０３９

以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７０１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ３））が、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物の体液中で有意に増減するものであり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するマーカーとなり得ることが分かった。これにより、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ３）の濃度を指標として、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果の評価が行なえることが示された。例えば、被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７０１０のピークを生じるタンパク質の濃度が第１群〜第４群にかけて「高−高−低−高」のパターンを示したとき、当該被験物質はホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する、と評価することができる。

６．マーカー物質（Ａ４）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が７９２４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第２群および第４群で低値を示し、第３群で高値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。

ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７１４
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０３５
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：は０．６１１
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．４８８
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第４群）：０．５４２
ｐ値（第１群ｖｓ第４群）：０．６４３
ＲＯＣ面積（第３群ｖｓ第４群）：０．７６０
ｐ値（第３群ｖｓ第４群）：０．０１９

以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７９２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ４））が、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物の体液中で有意に増減するものであり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するマーカーとなり得ることが分かった。これにより、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ４）の濃度を指標として、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果の評価が行なえることが示された。例えば、被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７９２０のピークを生じるタンパク質の濃度が第１群〜第４群にかけて「低−低−高−低」のパターンを示したとき、当該被験物質はホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する、と評価することができる。

７．マーカー物質（Ａ５）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−ＨＪ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３６７８（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第２群および第４群で高値を示し、第３群で低値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。

ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８９９
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００１
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．６６７
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．２２５
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第４群）：０．７８０
ｐ値（第１群ｖｓ第４群）：０．０２７
ＲＯＣ面積（第３群ｖｓ第４群）：０．６８４
ｐ値（第３群ｖｓ第４群）：０．０８１

以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ５））が、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物の体液中で有意に増減するものであり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するマーカーとなり得ることが分かった。これにより、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ５）の濃度を指標として、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果の評価が行なえることが示された。例えば、被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が第１群〜第４群にかけて「高−高−低−高」のパターンを示したとき、当該被験物質はホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する、と評価することができる。

８．マーカー物質（Ａ６）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−ＨＪ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３８８１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第２群および第４群で高値を示し、第３群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。

ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８１０
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００３
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．６３９
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．２４８
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第４群）：０．７８０
ｐ値（第１群ｖｓ第４群）：０．０２１
ＲＯＣ面積（第３群ｖｓ第４群）：０．７６０
ｐ値（第３群ｖｓ第４群）：０．０１９

以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３９００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ６））が、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物の体液中で有意に増減するものであり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するマーカーとなり得ることが分かった。これにより、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ６）の濃度を指標として、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果の評価が行なえることが示された。例えば、被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３９００のピークを生じるタンパク質の濃度が第１群〜第４群にかけて「高−高−低−高」のパターンを示したとき、当該被験物質はホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する、と評価することができる。

９．マーカー物質（Ａ７）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−ＨＪ）を行なった場合に、質量／電荷比が４７０９５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第２群および第４群で低値を示し、第３群で高値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。

ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７８６
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００９
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．５００
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．９５４
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第４群）：０．６５５
ｐ値（第１群ｖｓ第４群）：０．１３６
ＲＯＣ面積（第３群ｖｓ第４群）は０．７６０
ｐ値（第３群ｖｓ第４群）は０．０１５

以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４７１００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ７））が、運動負荷をかけると共にホエイタンパク質を摂取させた動物の体液中で有意に増減するものであり、継続的な運動とホエイタンパク質摂取との併用によってもたらされる運動機能（運動能力、運動パフォーマンス等)の変動（向上、維持、回復など）を反映するマーカーとなり得ることが分かった。これにより、被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ７）の濃度を指標として、被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果の評価が行なえることが示された。例えば、被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４７１００のピークを生じるタンパク質の濃度が第１群〜第４群にかけて「低−低−高−低」のパターンを示したとき、当該被験物質はホエイタンパク質と同様の運動機能の向上・維持・回復効果を有する、と評価することができる。

１．マーカー物質（Ａ３）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて精製度を確認した。

回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図８に結果を示す。図８中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７．０ｋＤａのバンド（図８の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図９のａ）。

あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７．０ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１２７９．７０」、「１２９９．７１」、及び「１０４２．５３」のペプチドはそれぞれ配列番号７〜９で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。既報のアポリポタンパク質Ｃ１のアミノ酸配列は配列番号１に示すとおりである。

なお、図９に示すように、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析においてマーカー物質（Ａ３）よりも小さい質量（約６．８ｋＤａ）を示すピークも検出された（図９のｂ）。これら２種のタンパク質は性質が非常に似ていること、並びに、質量の値の比較から、ピークｂのタンパク質はアポリポタンパク質Ｃ１（配列番号１）のＮ末端の２アミノ酸（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損した「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」であると考えられた。アミノ酸配列から計算される質量は、ピークａが６９９３Ｄａ、ピークｂが６８２５Ｄａであった。

２．マーカー物質（Ａ４）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理し、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）にてカラムを順次洗浄した後、溶出バッファー（３３．３％ イソプロパノール，１６．７％ アセトニトリル，０．１％ ＴＦＡ）にて溶出した。溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。

回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、２次元電気泳動（１次元目：Immobiline DryStrip（ＧＥヘルスケア社）ｐＨ４−７，７ｃｍ；２次元目：ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ２Ｔ（ＤＲＣ社））に供した。結果を図１０に示す。分離された約７．９ｋＤａのバンド（図１０の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。マーカー物質（Ａ４）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１１）。

あらためて同様の条件で２次元電気泳動を行って約７．９ｋＤａのバンド（図１０の矢印）を切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも５個のピークが検出され、それらの精密質量は「３２３９．４５」、「３４５４．６２」、「２８３２．４６」、「１８３１．９９」、及び「１１９３．６７」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「３２３９．４５」、「３４５４．６２」、「２８３２．４６」、「１８３１．９９」、及び「１１９３．６７」のペプチドは、それぞれ配列番号１０〜１４で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。さらに、アポリポタンパク質Ａ２（配列番号２、７８アミノ酸、等電点４．９４、分子量８７３６）のＮ末端側７０アミノ酸に相当するタンパク質断片の予想される等電点が５．１３、分子量が７９２５であり、これらの値がマーカー物質（Ａ４）の物性とよく一致した。これにより、マーカー物質（Ａ４）はアポリポタンパク質Ａ２の断片（配列番号３）と最終的に同定された。

３．マーカー物質（Ａ５）と（Ａ６）の同定
Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）を実施例１と同様にして変性処理とカラム精製に供し、４つの画分を得た。画分１（ｐＨ９．０、素通り）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後、抗ヒトトランスサイレチン抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングを行った。図１２に結果を示す。図１２中、レーン１はヒトトランスサイレチン標品（陽性対照）、レーン２はサンプル５０μＬ相当、レーン３はサンプル１００μＬ相当、である。その結果、レーン２，３において約１３．７ｋＤａのバンドが反応した。

図１３（ａ）に実施例１の第３群（ＴＰ）の画分１、図１３（ｂ）に本実施例で調製した画分１のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果をそれぞれ示す。これらのイオンピークのパターンはよく似ており、マーカー物質（Ａ５）に相当する約１３．７ｋＤａのピークと、マーカー物質（Ａ６）に相当する約１３．８ｋＤａのピークが検出された。

トランスサイレチンには、システイン残基への修飾の種類が異なる種々の修飾体が存在することが知られている。各分子量の値から、マーカー物質（Ａ５）は非修飾のトランスサイレチン、マーカー物質（Ａ６）はＳＰＡが結合した修飾トランスサイレチンであると考えられた。

４．マーカー物質（Ａ７）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（５ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）１．５ｍＬを２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清１．０ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理した。さらに平衡化バッファー２．５ｍＬを加えて希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でカラムを洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で２段階に分けて溶出した。溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。

ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）（１ｍＬ)を５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）にて平衡化した。前記溶出画分２ｍＬを５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）で５倍希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０，７０，８０，９０，又は１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する各５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）にてカラムを順次洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）にて溶出した。回収した溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。

回収した画分の一部をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（５ｋＤａカット；ミリポア社）にて脱塩および濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ポリアクリルアミドゲル使用）を行った。結果を図１４に示す。図１４中、レーン４〜６が回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約４７ｋＤａのバンド（図１４の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１５）。

あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約４２ｋＤａのバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも７個のピークが検出され、それらの精密質量は「２３０６．０８」、「１８２２．９０」、「１５４５．８２」、「１８７６．８３」、「１１０５．６０」、「１３２５．６３」、及び「１０３８．５４」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「２３０６．０８」、「１８２２．９０」、「１５４５．８２」、「１８７６．８３」、「１１０５．６０」、「１３２５．６３」、及び「１０３８．５４」のペプチドはそれぞれ配列番号１５〜２１で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「β−２−グリコプロテイン１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。既報のβ２−グリコプロテイン１のアミノ酸配列は配列番号６に示すとおりである。

質量／電荷比が５２８０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が６８２９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が７０１１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が７９２４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が１３６７８（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が１３８８１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が４７０９５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 マーカー物質（Ａ３）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 マーカー物質（Ａ３）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。 マーカー物質（Ａ４）の精製過程で行った２次元電気泳動の結果を示す写真である。 マーカー物質（Ａ４）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。 実施例２で行ったウエスタンブロッティングの結果を表す写真である。 （ａ）は実施例１の第３群（ＴＰ）の画分１をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に供した結果を表すイオンピーク図、（ｂ）は実施例２で調製した画分１をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に供した結果を表すイオンピーク図である。 マーカー物質（Ａ７）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 マーカー物質（Ａ７）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。

Claims (16)

1. 被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の濃度測定は質量／電荷比を指標とする方法で行い、前記被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価することを特徴とする運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
   （Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
   さらに、
   マーカー物質（Ａ３）は配列番号７〜９で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
   マーカー物質（Ａ４）は配列番号１０〜１４で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
   マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチンに特異的な抗体に対する反応性を有し、
   マーカー物質（Ａ７）は配列番号１５〜２１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
2. 被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）及び（Ａ７）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の濃度測定は質量／電荷比を指標とする方法で行い、前記被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価することを特徴とする運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
   （Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
   （Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
   さらに、
   マーカー物質（Ａ３）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
   マーカー物質（Ａ４）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体であり、
   マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチン又はその修飾体であり、
   マーカー物質（Ａ７）はβ２−グリコプロテイン１又はその修飾体である。
3. 被験物質を摂取させると共に運動負荷をかけた動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度を基準値と比較することにより、前記被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価することを特徴とする運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
   （Ｂ１）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
   （Ｂ２）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
   （Ｂ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
   （Ｂ４）β２−グリコプロテイン１又はその修飾体。
4. 前記基準値は、下記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
   （Ｉ）前記被験物質を摂取させずに運動負荷をかけた動物から採取した体液における前記マーカー物質の濃度、
   （ＩＩ）運動負荷をかけずに前記被験物質を摂取させた動物から採取した体液における前記マーカー物質の濃度。
5. 前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
6. 前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
7. 前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
8. 前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項７に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
9. 前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項７又は８に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法によって被験物質が有する運動機能の向上・維持・回復効果を評価し、当該評価結果に基づいて所望の運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
11. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする運動機能の向上・維持・回復効果の評価用キット。
12. 前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１１に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価用キット。
13. 運動機能の向上・維持・回復効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の運動機能の向上・維持・回復効果の評価用キット。
14. 動物の体内に存在する下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の少なくとも１つのタンパク質の、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の検出は質量／電荷比を指標とする方法により行う、運動機能の変動を反映するマーカーとしての使用。
    （Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
    さらに、
    マーカー物質（Ａ３）は配列番号７〜９で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
    マーカー物質（Ａ４）は配列番号１０〜１４で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、
    マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチンに特異的な抗体に対する反応性を有し、
    マーカー物質（Ａ７）は配列番号１５〜２１で表される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
15. 動物の体内に存在する下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ５）、及び（Ａ７）の少なくとも１つのタンパク質の、ただしマーカー物質（Ａ１）と（Ａ２）の検出は質量／電荷比を指標とする方法により行う、運動機能の変動を反映するマーカーとしての使用。
    （Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５２８０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６８３０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０１０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９２０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４７１００のイオンピークを生じるタンパク質、であり、
    さらに、
    マーカー物質（Ａ３）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体であり、
    マーカー物質（Ａ４）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体であり、
    マーカー物質（Ａ５）はトランスサイレチン又はその修飾体であり、
    マーカー物質（Ａ７）はβ２−グリコプロテイン１又はその修飾体である。
16. 動物の体内に存在する下記（Ｂ１）〜（Ｂ４）の少なくとも１つのタンパク質の、運動機能の変動を反映するマーカーとしての使用。
    （Ｂ１）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
    （Ｂ２）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
    （Ｂ３）トランスサイレチン又はその修飾体、
    （Ｂ４）β２−グリコプロテイン１又はその修飾体。