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JP5254949B2 - 一体型の核酸アッセイ - Google Patents

一体型の核酸アッセイ Download PDF

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JP5254949B2 JP2009500496A JP2009500496A JP5254949B2 JP 5254949 B2 JP5254949 B2 JP 5254949B2 JP 2009500496 A JP2009500496 A JP 2009500496A JP 2009500496 A JP2009500496 A JP 2009500496A JP 5254949 B2 JP5254949 B2 JP 5254949B2
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ウェイン エル． ブレイドフォード，
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マーク ココリス，
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Description

（関連出願に対する相互参照）
本願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／７８２，６４９号および２００６年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／８４４，８１１号の利益を主張し、これらの仮出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、分子生物学および医学の一般的分野、より具体的には、臨床試料から核酸を抽出、増幅、および検出するための一体型マイクロ流体カートリッジに関係する。
（関連技術の説明）
臨床検査診断のアッセイ法には、常量法から微量法への目覚ましい変化があり、標本の必要量がミリリットル単位からマイクロリットル単位に減少し、アッセイ時間が、時間単位から分単位に短縮することも可能になった。
これらの進歩は、一部は、材料と製造法が向上したこと、微量規模での物質移動および熱伝導が迅速になったこと、および検出感度が向上したことによるものであるが、技術革新へのたゆまざる努力を表してもいる。
マイクロ流体装置の技術は、依然として、競争的研究の焦点となっているが、より安全に流体を取り扱いたいという需要は置き去りにされたままである。これらの装置を臨床診断に適応させるには、例えば、試料の汚染などによる疑陽性を防止および検出し、作業者を生体有害物質による被曝から保護するための特別な機構が必要である。理想的には、作業者が被曝せずに、試料の調製、抽出、および分析を途切れなく一体化する一回使い切りの装置が必要とされる。
ＰＣＲ（米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号、および第４９６５１８８号；これらはすべて参考として本明細書中に援用される）は、クローニングすることなく試料中の標的核酸配列の濃度を上昇させるために利用され、適当な順方向および逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに足りる標的配列の情報、一般的には１０から３０塩基対の長さの情報が入手できることだけが必要である。実際には、モル過剰のプライマー対を、所望の標的すなわち「鋳型」を含む試料に加える。この２種類のプライマーは、それぞれ、鋳型の５’側および３’側の配列に相補的である。まず、この混合液を加熱して、二本鎖標的を変性すなわち「融解」させた後、冷却して、アニールすなわち「ハイブリダイズ」させて、混合されたプライマー／標的ハイブリッドを形成させる。ハイブリダイゼーション後、適当なポリメラーゼがプライマー／標的ハイブリッドに結合して、プライマーの３’−ＯＨ末端に塩基を付加しながら、一本鎖の鋳型に沿ってプライマーを「伸長」させて、相補鎖を形成する。順方向と逆方向のプライマーが両方とも存在すれば、元の二本鎖標的と全く同じコピーが作られる。変性、ハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼ伸長の各工程を、数対数単位で標的のコピー数を「増幅」するのに必要な回数繰り返すことができ、それを検出するのに役立つ。コピー数の極限は、（これを認識しておくことが重要であるが）生成物に取り込まれるプライマーのモル量によって制限されるだけである。
ＰＣＲが発見された後、他の異なった増幅法が記載された。例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」という名称でＭａｌｅｋに付与された米国特許第５１３０２３８号、すなわちＮＡＳＢＡ法［ｖａｎ Ｇｅｍｅｎら、１９９３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４３：１７７−１８８も参照］；「Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ」という名称でＡｕｅｒｂａｃｈに付与された米国特許第５３５４６６８号；「Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」という名称でＢｕｒｋｅｎｍｅｙｅｒに付与された米国特許第５４２７９３０号、すなわちＬＣＲ法［欧州特許第３２０３０８号；およびＳｃｈａｃｈｔｅｒら、１９９４．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：２５４０−２５４３も参照］；「Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」という名称でＷａｌｋｅｒに付与された米国特許第５４５５１６６号、すなわちＳＤＡ法［Ｗａｌｋｅｒ Ｊら、１９９３．ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３：１−６；Ｌａｇｅ ＪＭら、２００３．Ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １３：２９４−３０７；Ｄｅａｎ ＦＢ ２００２．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ ＮＡＳ ９９：５２６１−６６；またはＤｅｔｔｅｒ ＪＣ ２００４．Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８０：６９１−６９８］、転写介在増幅法［Ｐｆｙｆｆｅｒら、１９９６．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏ ３４：８３４−８４１参照］；これらはすべて参考として本明細書中に援用される。これらのプロトコールは、臨床アッセイにおいて様々な利点をもつが、分子生物学の実験では、依然としてＰＣＲ法が主要な装置である。
ＰＣＲが導入されてからほどなく、この新しい増幅法で使用するための半自動装置が作られた。最初に市販されたサーマルサイクラーは、Ｃｅｔｕｓ社に付与された米国特許第５０３８８５２号に基づいて製造された。
１９９０年には、ユタ大学（米国特許第６７８７３３８号）が、試料と試薬をガラス製の毛細管に取り込ませ、シールをしてオーブン内に入れ、オーブンのドアを開けたり閉めたりして温度を周期変化させる方法を開示した。
その後、ペンシルバニア大学（（米国特許第５４９８３９２号、第５５８７１２８号、第５９５５０２９号、および第６９５３６７５号）が、ＰＣＲを行うために微細加工されたシリコンベース装置を開示した。詳細抜きで構想されたのは、試料中の細胞または微生物の核酸を迅速に増幅させるための一群の小型で、大量生産される、一般的には一回使用の使い捨て可能な「チップ」であった。この装置は、試料注入用ポート、「中規模の」流動システム、および一つ以上の反応用チャンバー内の温度を制御する手段を含んでいた。開示された加熱および冷却手段は、電気抵抗器、レーザーおよびコールドシンクを含んでいた。チップ外ポンプを用いて、流体の流れを制御し、試薬を送達した。プリント回路、チップ上にあるセンサー、および分析物をトラップして濃縮するための事前分析用結合手段が示唆された。共通の流路は、分析チャンネルとしても働くが、細胞溶解廃液（細菌または血液の細胞溶解液など）を開口ベントまたはチップ外部位に移動させるために用いられた。
チャンバー、および少なくとも１つの断面の寸法がおよそ０．１μｍから５００μｍである流路もつ分析装置が開示された。５μＬ以下の反応容積が予想された。
単位複製配列を検出するための手段は、蛍光性インターカレート色素によって視覚的に、または、流体力学的測定によって、非特異的にＤＮＡ：ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせること、蛍光プローブまたは反磁性（または常磁性）ビーズへのＤＮＡ結合、およびゲル電気泳動を含んでいた。
いろいろな意味で現在の装置を予測していたが、ペンシルバニア大学の装置は、シリコンチップに限定され、試料および試薬のポートは、外部にある注射器ポンプを用いていた。細胞溶解後残渣が、増幅前にＰＣＲチャンバーを経てチップから排出されるため、作業者を生体に有害な試料または廃棄物から隔離するための明らかな仕組みは用意されていなかった。この設計および方法では、一回使い切りアッセイ用装置またはキットとして、乾燥した試薬を予めオンボードで取り込んでおくことができないため、それとは反対の表示があったとしても、ポンプの注入口用ポートと排出用ポートを共用することは、明らかに、許容できない交差汚染のリスクをもたらす。
米国特許第５２３４８０９号では、血液または排泄物などの生体試料を、二酸化ケイ素や親水性のカチオン性固体などの固体基質の存在下でカオトロピック剤によって処理することを含む、核酸の精製法が開示されている。それ以前の出版物で、カオトロピック剤と固体基質を用いて、アガロースの塊から核酸を精製することが報告されていた。固相の性質に応じて、その後にＴＥで核酸が溶離できるか否かが決まった。できなければ、核酸はＰＶＤＦ膜にトラップされているため、固体基質上で直接ＰＣＲを行うことができた。このトラップおよび溶離工程には、約４５分かかると報告された。しかし、この引用された時間には、単位複製配列を検出する時間が含まれていなかった。核酸のトラッピング、増幅、およびＰＣＲ単位複製配列の検出をまとめて一つの工程で行う装置は開示されていなかった。興味深いことに、シリカフィルターパッドから溶離された濾液に対してＰＣＲを行うことは請求されていなかった。多重オンボード検出用チャネルは提供されていなかった。
米国特許第５９８９８１３号では、側方流動分析に使用するため、それぞれビオチンおよびジゴキシゲニンに結合している順方向プライマーおよび逆方向プライマーの存在下で、標的核酸配列を増幅させることによって、単位複製配列が調製されている。これらの単位複製配列は、ストレプトアビジンをもつ粒子に結合し、ジゴキシゲニンに対する抗体の存在下で凝集する。側方流動によって、二機能性の単位複製配列複合体が、繊維性基質から排除された捕獲凝集物として検出される。その他の固体は、その分析においては妨害物である。側方流動方式の別の変法では、アビジン結合体が膜の中に入りこみ、検出用ストリップに遭遇するまで移動する。着色された粒子が検出用ストリップに蓄積したものを検出する。これらのアッセイは、材料における流速、粒子の大きさ、および孔の寸法、ならびに拡散に対する層状障壁（ｌａｍｉｎａｒ ｂａｒｒｉｅｒ）に依存する。多重式オンボード検出に役立つものは提供されなかった。
それ以来、ＰＣＲ熱サイクリングのその他の設計および方法が導入され、特許付与されてきた。Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃに付与された米国特許第６２１０８８２号は、熱サイクル反応用の非接触性の加熱および冷却を行うための手段を記載していた。Ｃａｌｉｐｅｒに付与された米国特許第５９６５４１０号は、ジュール加熱、すなわち、電流が反応容器のバッファーを通ることによる熱サイクルを行うための手段を記載していた。Ｃａｌｉｐｅｒの米国特許出願第２００４００８１９９７号は、ポリメラーゼを加える前に、まずプライマー、ｄＮＴＰ、および標的核酸配列（鋳型）を混合し、変性させ、さらに再アニールさせるＰＣＲ反応（いわゆる「ホットスタート」ポリメラーゼ反応）を記載していた。ホットスタートＰＣＲは、早くから、生成物の収量および特異性を向上させることが示唆されていた（Ｄ’Ａｑｕｉｌａら，１９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：３７−４９；Ｃｈｏｕら，１９９２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０：１７１７−１７２３；Ｋｅｌｌｏｇｇら，１９９４．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：１１３４−１１３７）。
マイクロ流体装置上の温度を調節するための別のシステムが米国特許第６５４１２７４号に記載されている。この特許は、複数の貯留容器を本体にもつ反応装置システムに係るものである。熱交換器および循環ポンプが、温度を調節するために貯留容器に連結されている。マイクロ流体装置上の温度を調節するための既存の装置のその他の例には、米国特許第６０１８６１６号に記載されているような放射熱、米国特許第６０２０１８７号に記載されているような温度調節ブロック、およびいまだに米国特許庁に出願されているその他の累積的改良が含まれる。
Ｂｉｏｍｅｔｒａに付与された米国特許第５７１６８４２号には、ＰＣＲのためにさまざまな温度で加熱素子の中を動き回る蛇行直線流マイクロチャネルをもつ反応装置が記載されていた。Ｓｅｎｔｒｏｎの米国第２００１／００４６７０１号には、蛇行チャネルにおけるＰＣＲ用の粒状試薬に結合したプライマーを使用し、その後、単位複製配列を回収するために吸収促進Ｈろ過を行うことが記載されている。米国特許第５２７０１８３号には、さまざまな加熱連結管の回りに巻かれた反応用チャンバーが記載されている。
米国特許出願第２００３００８３０８号において、ＣａｌＴｅｃｈは、その発明に係る循環型チャネルの回りに反応混合液を循環させることによって熱サイクルを行うことができるように、多数の温度ゾーンをもつ「回転式マイクロ流体チャネル」を記載している。この出願は、「制御チャネルに加えられた作動力に反応して、実質的に円形の流路に屈曲するか、それから引っ込めることができる弾性体膜の切片によって、弾性体材料の内側に形成され、流路から分離されている」補助的チャネルの使用についても記載している（第９段落、図３Ａ、３Ｂ）。これらの弾性体素子は、「隔離用バルブ」と名付けられているが、正空気圧下で流体チャネルに再び作用することによって、装置内の容積移送型ポンプとしても作用し、それにより、弾性体素子が可逆的に変形して、一連のプランジャー型蠕動ポンプ素子の形で、流体チャネルの中に突き出していった。熱サイクルを行うための加熱は、ペルティエ素子、抵抗加熱器、熱交換器、またはインジウムスズ酸化物素子を用いて行った。ポリメラーゼを、円形流路の一分節の中で加熱素子と接触しないように固定することによって、熱不安定性ポリメラーゼを用いることが示唆された。
提案された検出手段は、具体的ではないが、その当時知られていた蛍光プローブ（例えば、「分子指標」または「ＲＦＲＥＴ」タグとして）、発色団、放射性同位体、化学発光標識、質量標識、酵素結合オリゴマー標識によって標的をタグ付けすること、またはゲル電気泳動によることなどがあった。反応溶液のキャパシタンスを測定することによる検出法も開示されていた。
Ｆｌｕｉｄｉｇｍの米国特許出願第２００５００１９７９２号には、別の弾性体バルブが記載されていた。その他の詳細については、Ｆｌｕｉｄｉｇｍの米国特許出願第２００２０１９５１５２号に記載されている。空気圧式バルブは、流体チャネルを圧縮するプラテンを弾性体本体の中に取り込むよう改変されていて、チャネルを閉めたり、絞ったりした。出口のない流路からなる装置であって、反応用チャンバーとして働き、製造時に試薬とともに予め搭載される装置も提唱されていた。
Ｍａｔｈｉｅｓの米国特許出願第２００６００７３４８４号には、空気圧式連結管の制御下にある、単一のチャネルまたは高密度ネットワークのマイクロ流体装置が記載されていた。この方法は、標的病原体の免疫アフィニティー捕捉した後、溶解して、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して検出することを含んでいた。空気圧によって切り替え可能な調節バルブは、ガラス製の流体層と空気圧式連結管層（任意でビア層が間に置かれている）の間に挟まれたＰＤＭＳ弾性膜からなり、真空を適用してチャネルを開いたり、圧力を加えてチャネルを閉じたりするために利用されていた（米国特許出願第２００６００７３４８４号の図１Ｃ参照）。また、同様の構造物が、試薬を分注するためのポンプとしても使用されていた（米国特許出願第２００６００７３４８４号の図５Ｃ参照）。［また、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｈ． Ｇｒｏｖｅｒａら．２００３．Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖａｌｖｅｓ ａｎｄ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｐｕｍｐｓ ｆｏｒ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｇｌａｓｓ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ： Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ ８９（３）：３１５−３２３も参照。］シラン弾性体がこれらの装置のガラス板に結合するため、ＰＤＭＳ膜が特に好適であった。
Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓに共同譲渡された米国特許出願第２００５０１２９５８２号には、チャネル、バルブ、ポンプ、流量センサー、混合用チャンバー、および光学的検出装置をもつ、化学的および生化学的なアッセイを行うためのマイクロ流体装置が記載されており、その全体が参考として本明細書中に援用される。改良された温度遷移が開示され、通常のサーマルサイクラーよりも４倍速くＰＣＲを行うことが可能になった。最大１７Ｃ／ｓｅｃという温度遷移速度が、適当なプラスチック基板および寸法を選択することによって示された。
マイクロ流体アッセイ方式での核酸および抗体のバイオアッセイ法の開発法に関連する、共同譲渡された特許および特許出願には、米国特許第６７４３３９９号（「Ｐｕｍｐｌｅｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」）、第６４８８８９６号（「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ」）、米国特許出願第２００５／０１０６０６６号（「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｉｄ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」）、第２００２／０１６０５１８号（「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ」）、第２００３／０１２４６１９号（「Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」）、第２００３／０１７５９９０号（「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｄｅｖｉｃｅ」）、第２００５／００１３７３２号（「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｓ，Ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ，Ｂａｃｔｅｒｉａ Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ」）、米国特許出願第２００７／００４２４２７号「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｌａｍｉｎａｒ Ｆｌｏｗ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔｒｉｐ」、および非公開文献「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｉｘｉｎｇ Ｃｉｒｃｕｉｔ」、「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ」、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｍｉｘｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ａｐｐａｒａｔｕｓ」、「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ」、および「Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｒｅａｃｔａｎｔｓ」などがあり、これらはすべてその全体が参考として本明細書中に援用される。
マイクロ流体装置およびそれらの構成要素のその他の具体例が、米国特許第５７２６７５１号；第５７２４４０４号；第５７１６８５２号；第５７４７３４９号；第５７４８８２７号；第５９２２２１０号；第５９３２１００号；第５９７４８６７号；第５９７１１５８号；第５９７２７１０号；第５９４８６８４号；第６００７７７５号；第６１７１８６５号；および第６３８７２９０号に記載されているであろう（これらの全体が参考として本明細書中に援用される）。
特許文献１には、多重ＰＣＲを利用して、多数の標的エキソンにおける遺伝的エラーを検出することが記載されている。当時の標準的な方法によって精製されたｇＤＮＡを調製した後、ＰＣＲを行ない、アガロースゲル電気泳動またはサザンブロット法によって検出を行った。遺伝子解析に対する簡易化された一体型マイクロ流体的アプローチは予期されていなかった。
特許文献２は、参考として本明細書中に援用されるが、臨床試料中の感染体を検出するために多重ＰＣＲを利用することが記載されている。この方法の主な教示内容は、塩析されたタンパク質からＤＮＡを抽出するために用いられる高塩バッファーである。そして、ＰＣＲを行う前に、フェノール：クロロホルム抽出物によってさらにＤＮＡを精製した。最後に、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００サーマルサイクラー（Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲを行った。このプロトコールは、完了するまでに約１日かかると記載されていた。オンボードでの多重検出に役立つものは提供されていなかった。
Ａｐｐｌｅｒａに付与された特許文献３には、混合プライマープールを予備的増幅（１標的当たり１０００コピー以下）するために使用し、次に、単一の標的特異的なプライマー対を使用する、その後の「ブースト」サイクルと名付けられた第２段階の増幅を行うために反応混合液を別々の並列した反応用マイクロウェルに分注することを含む２段階アッセイ法が記載されている。増幅後、別々の分析チャンネルにおいて検出を行った。一体型で一段階の抽出、増幅および検出を含むマイクロ流体装置は予期されていなかった。オンボードでの多重検出に役立つものは提供されていなかった。
したがって、試料の処理、核酸の捕捉、標的配列の増幅、および陽性結果の検出を行うことができる一体型で一段階のマイクロ流体アッセイ用装置に対する需要が充足されないままになっている。結果を、遅延を最小に、リアルタイムで送達可能な装置が必要とされている。この需要は、感染性疾患との闘いにおいて特に明らかである。すなわち、そこでは、再診断という選択肢なしに患者を評価および治療しなければならず、病原体の迅速な同定結果が、異常発生をリアルタイムで監視および制御するために利用され、生体有害性試料を取り扱う特別な施設を利用することができず、熟練した微生物学者がいない所で検査を行わなければならず、また、より複雑な診断サービスに費用をかけることが禁止されている。
多数の結果を並行して、例えば、ユーザーフレンドリーな可視検出用チャンバーの中に検査パネルの結果が表示されると使いやすさが向上するであろう。
米国特許第５，５８２，９８９号明細書 米国特許第５，５８２，９８９号明細書 米国特許第７，０８７，４１４号明細書
（発明の要旨）
全身性の懈怠感をもつ、または胃腸炎や下痢のような特徴のない症候群の患者、または鼻水やリンパ節炎で始まる呼吸器症候群の患者に直面した医師は、一般的に、何を処方すべきかを決定するに当たって、疫学的および統計的な検討を頼りにする。しかし、旅行者が一晩のうちに世界の反対側から到着する世の中では、これらの検討はしばしば役に立たない。
胃腸炎、下痢、赤痢、またはコレラ様症状を生じさせる病原因子は、特に、それらの経路の早期に表れた場合には、臨床的に混同される可能性があり、臨床検査が必要となることがある。原因病原体の鑑別診断が、適正な治療を処方する上で非常に重要であるかもしれない。
例えば、（莢膜抗原マーカーおよび鞭毛抗原マーカーに照らして）Ｏ１５７Ｈ７血清型であることが多い腸管出血性大腸菌によって起きる下痢は、細胞傷害性抗生物質によって治療するのが最善ではないかもしれない。なぜなら、細菌が溶解するときに、その結果として放出される毒素の塊が宿主を苦しめることがあるからである。
呼吸器系病原体は、臨床検査では重複するような症状を示す。原因病原体の鑑別診断が、適正な治療を処方する上で非常に重要であるかもしれない。
例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を殺菌性抗生物質で積極的に治療することに失敗すると、心筋に対する永久的な損傷をもたらす可能性がある。データによって、寿命の短縮および心臓に関連した疾病率と死亡率の増加が、特に幼児期に治療されなかった「連鎖球菌性咽頭炎」に関係していることが確定的に示されている。抗生物質を利用できない第三世界における数多くの調査で、若年期における心臓疾患の有病率が、人口の３０％、さらには７０％にも上ることがある。
したがって、感染症が拡大する危険を低下させようとする努力の中で、本発明者らは、分子生物学の特効薬である「抽出、増幅、検出」に導かれて、衛生的でコンパクトで使いやすく、少量の試料で足り、かつ医療現場においてリアルタイムで複数の微生物またはウイルスの鑑別臨床診断を可能にするマイクロ流体装置を設計した。
このプロジェクトの一つの目標は、マイクロ流体装置の中での試料の調製、増幅、および標的検出の間に置く繋ぎ目のないインターフェイスを開発することであった。驚いたことに、このアッセイプロトコールのすべての工程は、核酸の抽出から増幅、検出に至るまでを、カードに似た、一回使い切りの内蔵型カートリッジにおいて約４分間で行うことができる。
その他の実施形態は、検査パネルからの結果など、多数の結果をユーザーフレンドリーなビジュアル化された形で表示するオンボード型「多重検出用チャンバー」を含む。
開示された一回使い切りのマイクロ流体装置は、複数のマイクロ流体チャネル、バルブ、フィルター、ポンプ、液体障壁、オンボード型試薬貯留容器、およびその他の素子が、試料から核酸を抽出し、推定標的核酸配列を増幅し、ユーザーが利用できる方式でアッセイ結果を検出する流体サブ回路の組み合わせになるように構成されたものを利用する。
増幅産物のゲル電気泳動では混乱しているか決定的ではない結果となって、確認のためにサザンブロットを必要とする臨床試料からの病原体が、本明細書記載の方法によって、数分間で簡単に同定される。
最新の実施形態では、プロテイナーゼによる予備処理またはフェノール：クロロホルム沈殿、およびそれらに付随する遠心分離を行うことなく、長さが４ｃｍ以下のマイクロチャネルの中で抽出が行われている。
また、マイクロ流体装置の方式に、解析すべき標本の危険性に対処する改良を加えて、過去の装置の短所を克服したものも開示されている。選択された実施形態では、本発明者らは、使い捨て可能で一回で使い切る装置の中で標本を取り扱い抽出するための一体的方法であって、標本を装置の中に挿入またはピペット分注し、内側をシールした後、それ以上、作業者が標本に触れることなくアッセイを行う方法を実証する。オンボード型の廃棄物隔離および汚染除去も提供されている。
本発明の別の態様において、本発明者らは、増幅用プライマーセットの５’尾部へのペプチジル結合体が、ポリメラーゼ依存型増幅プロトコールにおいて、一般的に利用可能であり、さらに強固であって、驚くべきことに、増幅後も完全な抗原性と結合一貫性とを維持していることも明らかにする。本発明者らは、ペプチジルハプテンを結合した増幅用プライマーに特異的な固定抗体、例えば、モノクローナル抗体は、プライマーでタグ付けされた標的単位複製配列を捕捉する。別のアフィニティーリガンドでタグ付けされた別のプライマーを用いることによって、標的特異的検出複合体を用いる方法を簡単に設計できる。オリゴペプチドは、これまで、ＰＣＲ増幅、または別の増幅プロトコールにおけるプライマーとして使用されたことはなく、多重標的検出用プロトコールにおける混合ＰＣＲ産物をタグ付けしたり識別したりする手段として使用されたこともない。このように、これらの複合体は、本質的には、ペプチジル−プライマー単位複製配列ライブラリーを調べる手段として役立つ。意外にも、この方法は、プライマーをタグ付けする従来法よりも幅が広く、各単位複製配列をユニークなペプチドハプテンでタグ付けし、対応する抗体を用いてそれを固定する工程によって、本質的に無数の単位複製配列を同時に分離および検出することを可能にする。本明細書に例示されている磁気ビーズアッセイ法は、本発見の一つの実施形態である。
（発明の詳細な説明）
以下の詳細な説明には、例示目的で多くの具体的で詳細な説明が含まれるが、当業者は、以下の詳細に対する数多くの変更および改変も本発明の範囲内に含まれることが理解できよう。したがって、後述する本発明の例示的実施形態は、請求の範囲に記載された発明に対する一般性を損なうことなく、およびそれを限定することなく提示されるものである。
以下の定義は、本明細書および請求の範囲を解釈するための補助となるよう提供されている。研究が参照されて引用されており、それに含まれる定義が、部分的または全体的に、本明細書に記載された定義と矛盾する場合、そこで用いられている定義は、本明細書に記載された定義を補完することはありうるが、それに優先することも、それを修正することもない。
１．定義
検査試料：代表的な生体試料には、例えば、血液、血清、血漿、軟膜、唾液、傷からの浸出液、膿、肺およびその他の呼吸器の吸引液、鼻腔の吸引液および洗浄液、副鼻腔ドレナージ、気管支洗浄液、痰、中耳および内耳の吸引液、嚢胞吸引液、脳脊髄液、大便、下痢便、尿、涙、乳腺分泌物、卵巣内容物、腹水、粘液、胃液、消化器内容物、尿道分泌物、滑液、腹膜水、胎便、膣液もしくは膣分泌物、羊水、精液、陰茎分泌物などがあり、これらを検査することができる。例えば、咽頭、扁桃腺、歯肉、鼻道、膣、尿道、直腸、下部結腸、および眼の粘膜拭き取り検体など、粘膜分泌物および上皮の代表物である拭き取り検体または洗浄液からのアッセイも、あらゆる種類の組織標本のホモジネート、溶解物、および分解物として許容される。哺乳動物細胞が許容される試料である。生理的溶液以外にも、水、産業廃棄物、食品、ミルク、空気ろ過物（ａｉｒ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ）などの試料も検査試料である。実施形態によっては、検査試料を本装置内に直接置くこともあるが、別の実施形態では、解析前処理を想定していることもある。
バイオアッセイ標的分子：または「対象とする検体」、または「標的分子」は、核酸、タンパク質、抗原、抗体、炭水化物、細胞成分、脂質、受容体リガンド、薬剤などの低分子を含むことができる。標的核酸は、遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子の調節配列、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｃＤＮＡなどを含み、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であってもよい。核酸標的には、多型性、欠失、および２つ以上のスプライス配列がある。複数の標的ドメインは単一分子で存在する場合があり、例えば、１つの免疫原が複数の抗原決定基を含んでいることもある。抗体は、可変領域、定常領域、および抗体を固定化する上で有用なＦｃ領域を含む。
病原体：感染症または伝染病に関係する生物体。
発病状態：健康でないこと、すなわち、病気、虚弱、罹患状態、または罹患する可能性に関連する遺伝的形質を特徴とする、哺乳動物宿主の状態。
核酸：本明細書において、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含むが、これらに限定されない、任意の長さの多量体型ヌクレオチドを含むものとして使用される。比較的短い核酸ポリマーは、しばしば、「ポリマー」または「プローブ」として用いられる。この定義は、メチル化またはキャップされている可能性のある、天然の由来源からの核酸を含み、また、置換型または誘導体化された核酸塩基を含んでいたり、ペプチド骨格に基づいていたりする合成型のものも含む。核酸は、通常、アデノシン、グアニン、チミン、およびシトシンの多量体、ならびにそれらの「デオキシ」型であるが、ウラシルおよびキサンチンなど別のピリミジン、スペーサー、またはデオキシイノシンなどのユニバーサル塩基も含んでいてもよい。デオキシ核酸は、相補配列の有無、およびｐＨ条件、塩濃度、温度、ならびにホルムアミド、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、およびｎ−メチルピロリジノンなど、一定の有機溶媒の有無に応じて、一本鎖または二本鎖になりうる。
「標的核酸配列」または「鋳型」：本明細書において、「標的」という用語は、ポリメラーゼによるアッセイにおいて増幅され、検出される、生体試料中の核酸配列を意味する。「標的」分子は、試料中に「スパイク」として、または未同定検体として存在することができ、合成されたか、または生物体本来のものであるＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡからなることも可能である。「生物体」は哺乳動物に限定されない。標的核酸配列は、増幅過程で相補配列を合成するための鋳型である。ゲノム標的配列は、慣例により５’末端から３’末端に向かって並べられた、塩基の順序を記載することによって示される。
レポーター、「標識」または「タグ」は、物理学的、化学的、電磁気的、およびその他の関連した解析技法によって測定することができる、生体分子または生体分子を修飾したものを意味する。検出可能なレポーターの例には、放射性同位体、蛍光プローブ、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、着色粒子、ＱＤｏｔ（量子ドット）、スピン標識、化学発光性分子、電気化学的活性分子、酵素、補助因子、核酸プローブに結合した酵素、および酵素基質などがあるが、これらに限定されない。レポーターは、バイオアッセイにおいて試薬として用いられ、しばしば、別の分子に共有結合しているか、固相上に吸着されているか、または特異的親和結合によって結合されている。
リガンド：リガンド結合性分子によってリガンドのある一部を立体化学的に認識するか、それに「フィット」するリガンドに、特異的親和性をもって結合する別の分子（すなわち、「アンチリガンド」またはリガンド結合分子）が存在する任意の分子。リガンド分子と結合分子との間の力は、一般的には、ファンデルワールス力、水素結合、疎水結合、および静電結合である。リガンド結合は、一般的には共有結合ではないため、「架橋結合」および「誘導体化」とは区別される。本明細書において、「リガンド」という用語は、「ペプチジルハプテン」ではない結合部分のためだけに用いられる。
ペプチジルハプテン：これは、ペプチド断片である、ハプテンのサブクラスを意味する。本明細書において、ペプチジルハプテンは、双尾型単位複製配列を捕捉するための手段として、ペプチド断片に対する相補的抗体とともに用いられる。
ハプテンは、抗体によって認識される「分子キー」であり、免疫原性担体と結合して脊椎動物に導入されると、ハプテンは、そのハプテンまたはエピトープに特異的な抗体の形成を誘発する。これらの分子キーは立体化学的特異性をもち、通常、担体上に露出しており、担体よりも分子量が小さい。説明に役立つ実例には、天然タンパク質の低分子誘導体、ＲＮＡループ−ステム構造、ジゴキシゲニンなどの薬剤またはステロイド、ムコペプチドを装飾する炭水化物側鎖、およびジフテリアの毒素またはトキソイドのような、非天然タンパク質の短鎖ペプチドまたはヘリックスなどがある。ジペプチドや脂質でも、適当な免疫原性担体上に結合すると、抗体反応を生じさせることができ、免疫原にではなく、このジペプチドまたは脂質それ自体に特異的なアフィニティー捕捉抗体を、抗血清内の非特異抗体を吸着させて排除することによって、またはリンパ球選択によってモノクローナル抗体を調製することによって産生させることができる。ハプテンは、それ自体では免疫原性がないが、非常に精緻に方向づけられた免疫特異性を有し、非常に限られた相補的抗体によって認識される。
本明細書においては、短鎖ペプチドが、その強い化学作用、プライマー標識としての酵素との適合性、および本質的に無限の免疫特異性があるために、ペプチジルでタグ付けした単位複製配列のライブラリーを作成するために用いられているとおり、単位複製配列をタグ付けするのに好適なハプテンである。
捕捉剤：または「アフィニティー捕捉剤」は、親和結合対の相補的パートナーの一般名称であり、一般的に、リガンドまたはハプテンを固相と結合させることによって捕捉するために用いられる。アフィニティー結合対は、例えば、ストレプトアビジン：ビオチン、抗体：抗原、ハプテン：抗体、および抗原：抗体などであり、アフィニティー結合対のどちらか一方が補足剤であってもよい。
検査用パッド領域−本明細書において、「検査用ストリップ」、または「検査用フィールド」、または単に「検査用パッド」は、アフィニティー捕捉剤によって占められている領域またはゾーンである。この領域はナノ分子レベルで三次元的であり、通常、液体の流路内で基質の表面上に形成される。検査用パッドは、アッセイエンドポイントが観察または測定される、アッセイ内地点であり、そのため、光学窓を備えた検出用チャンバー内に置かれていよう。
異種捕捉または固定：これは、アフィニティー結合対を用いて、固相表面、粒子、または多孔性の吸着物質上で分析物または検出複合体を濃縮することを意味する。異種または固相上への捕捉は、固定された抗原、抗体、アビジン、ニッケル−ＮＴＡ、レクチン、またはその他のリガンド／受容体系などの捕捉剤によって行うことができる。本明細書において、異種捕捉剤によって形成される分子複合体が「固定レポーター複合体」である。そのような複合体は、非共有結合および協同的結合によって安定化される。
固定化：機器内のさだめられた位置または表面、例えば、検査用パッドなどにおいて、分析物を捕捉して濃縮する働きをする試薬からアッセイを構築することができる。本明細書において「固定する」または「固定された」という用語は、分析物とアフィニティー捕捉試薬との結合が、アッセイ条件下で有効に不可逆的であることを表している。
プローブ：「プローブ」は、室温で安定的な二重らせんを形成するのに十分な相補性を有する相補的塩基対合によって、標的核酸と結合することができる核酸である。プローブは、レポーター基で標識することができる。プローブに結合させることができる適当な標識には、放射性同位体、蛍光プローブ、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光性分子、電気化学的活性分子、酵素、補助因子、および酵素基質などがあるが、これらに限定されない。プローブの配列、長さ、およびハイブリダイゼーション条件を選択するための手段は当業者に一般的に周知されている。
増幅：本明細書において、「増幅」という用語は、核酸配列の濃度を、その初期濃度と比較して上昇させる結果となる「鋳型依存的処理工程」を意味する。「鋳型依存的処理工程」とは、「プライマー」分子の「鋳型依存的伸長」を含む処理工程である。「プライマー」分子は、標的配列の既知の部分と相補的な核酸の配列を意味する。「標的依存的伸長」は、新たに合成された核酸鎖の配列が、標的核酸とプライマーとの相補的塩基対合ルールによって検出される、ＲＮＡまたはＤＮＡの核酸合成である。
単位複製配列は、従来技術の増幅手段による二本鎖ＤＮＡ産物を意味し、これにはＤＮＡおよびＲＮＡの鋳型から形成された二本鎖ＤＮＡ産物が含まれる。
双尾型単位複製配列は、第１のプライマーがペプチドハプテンまたはエピトープに結合し、第２のプライマーがアフィニティーレポーター、標識または「リガンド」に結合している、タグ付きプライマー対が共有結合的に取り込まれる、従来技術の増幅手段による二本鎖ＤＮＡ産物を意味する。本明細書において、双尾型単位複製配列は「ヘテロ−二機能性」つなぎ鎖として機能し、個体基板上で分子検出複合体を形成する。
プライマー：これは、本明細書において、適当なポリメラーゼおよび補助因子の存在下で鋳型指向性ＤＮＡ合成の開始点として働くことができる一本鎖のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合体である。プライマーは、通常、長さが少なくとも７ヌクレオチド、より一般的には、長さが１０から３０ヌクレオチド、またはそれよりも長い。「プライマー対」という用語は、増幅されるＤＮＡ鋳型の５’末端の相補配列にハイブリダイズする５’「順方向」または「上流」プライマー、および増幅される配列の３’末端にハイブリダイズする３’「逆方向」または「下流」プライマーを含む、一組のプライマーを意味する。いずれのプライマーも５’および３’末端を持っていること、およびプライマー伸長は、常に５’から３’の方向に生じることに留意されたい。したがって、５’末端、またはその近くに化学的結合があっても、適当なポリメラーゼによるプライマー伸長を阻害することはない。プライマーは、「第１のプライマー」および「第２のプライマー」とも呼ばれるが、これは、「順方向」プライマーおよび「逆方向」プライマーの実体が互換的なプライマー対を示している。ネスティッド増幅では、さらに別のプライマーを用いることができる。
好適な実施形態において、第１のプライマーは、特定の抗体によって認識されるペプチドハプテンまたはエピトープに結合した、単一特異的またはクラス特異的なオリゴヌクレオチドである。また、第２の「プライマー」は、５’末端またはその近くでハプテンや、ビオチン、ジゴキシン、多糖体、フィコエリトリン色素、蛍光プローブ、アフィニティー結合剤、抗体のＦｃ断片、ＮＴＡなどのニッケルキレート剤、レクチンなどに結合しているオリゴヌクレオチドである。ハイブリダイズして合成開始地点なるように設計されている、鋳型上の配列と「実質的に相補的」になるよう、プライマーを選択することができる。
ポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸、またはデオキシヌクレオシド三リン酸を取り込んで、プライマー分子の３’ヒドロキシル末端を伸長させるという機能によって定義される酵素である。ポリメラーゼに関する一般的な考察については、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆを参照のこと。ポリメラーゼの例には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、「クレノウ」断片、Ｔａｑ−ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼ、および逆転写酵素などがあるが、これらに限定されない。逆転写酵素の例には、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス由来のＨＩＶ−１逆転写酵素、テロメラーゼ、モロニーマウス白血病ウイルス由来のＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、およびトリ骨髄芽球症ウイルス由来のＡＭＶ逆転写酵素などがある。
逆転写酵素は、ポリメラーゼ連鎖反応法をＲＮＡ標的に適用するために、研究において広く用いられていることに留意すべきである。従来のＰＣＲ法は、ＤＮＡに直接適用することしかできないが、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写酵素を用いることによって、ＲＮＡ標的をＰＣＲ解析することが可能である。この技術は、まとめて逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法と呼ばれる。
（核酸に関して）相補的とは、ハイブリダイズして二重らせんを形成することができる、２本の一本鎖核酸配列を意味する。２本の相補鎖の二重らせん内の塩基対の一致は、必ずしも絶対的というわけではない。ハイブリダイゼーション選択性は、アニーリング温度、塩濃度、および溶媒の関数であり、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの配列全体にわたり、わずか５５％の同一性しかない場合でも、通常、低ストリンジェンシー下なら生じる。ストリンジェンシーは、当技術分野で周知の方法によって強化することができる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）参照。プライマーのハイブリダイゼーションに関して、「完全に相補的」なプライマーは、プライマーの全長にわたって完全に相補的な配列をもち、ミスマッチが全くない。「ミスマッチ」とは、プライマー内の塩基が、それと並列された標的核酸内の塩基と相補的でない部位を意味する。
（免疫結合に関して）相補的とは、免疫特異的な抗体：免疫原または抗体：ハプテンの結合を意味する。
磁気マイクロビーズは、少なくとも１つの寸法、例えば、視直径または円周が、ミクロンまたはナノメートル単位のものである、「ナノ粒子」、「ビーズ」、または「マイクロスフィア」、もしくは当技術分野において別の名称で知られているものを意味する。そのような寸法の上限は６００μｍであるが、一般的には、視直径は２００ｎｍ未満であり、１〜５０μｍまたは５〜２０ｎｍであるかもしれないが、それに限定されない。そのような粒子は、例えば、Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４（α−Ｆｅ結晶系）、α’−ＦｅＣｏ、ε−コバルト、ＣｏＰｔ、ＣｒＰｔ３、ＳｍＣ０５、ニッケルおよびニッケル合金、Ｃｕ２ＭｎＡｌ、α−ＦｅＺｒ、Ｎｄ２Ｆｅ１４Ｂ、ＮｏＴｉなどの常磁性体または超常磁性体から構成されているか、そのコアを多数含んでいるか、その顆粒部位を含んでいるであろう。好適なのは、ヘマタイト（Ｆｅ２Ｏ３）や磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）などの酸化鉄、および他の金属との合金になっている酸化鉄とのさまざまな混合物からなる強磁性化合物またはセラミックス化合物の材料と定義されているフェライトである。通常用いられる、これらの物質は、磁区よりも小さな寸法を有する粒子であり、そのような材料を含み、市販されていることがよく知られている、ポリマーラテックス（総称的に）、シリカなどの結合剤を用いて粒子、ビーズまたはマイクロスフィアに成型することができる。
特に好適なものは、磁気によるバイオセパレーション用に市販されている、直径が５０ｎｍ〜１００ｎｍであるＦｅ３Ｏ４ナノ粒子である。これらの粒子は、磁場に引きつけられるが、磁場の除去後に残留磁気を保持しないことを意味する、「超常磁性」である。したがって、対象とする生体材料にタグ付けされている、縣濁された超常磁性粒子は、磁場を用いて基質から取り除くことができるが、それらは、磁場を除いた後、集塊を形成しない（すなわち、懸濁されたままである）。ニッケルおよびコバルトのマイクロビーズも対象となる。これらのビーズは、ヒスチジンを含むペプチドと反応することが可能である。
常磁性ビーズは、磁束線に沿って自ら整列するという特性をもち、磁束密度が低い領域から磁束密度が高い領域に引きつけられる。
磁気マイクロビーズは複合材料であってもよいことを認識すべきである。そのようなビーズは、更に、結合剤とともに集塊となった他の微粒子またはナノ粒子を含んでもよい。ＲＦ−タグ、ＱＤｏｔ、アップコンバート型（ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）蛍光プローブ、コロイドゾルおよび粘土などとの複合体を本発明で使用することが考えられる。磁気ビーズは全部が磁性物質で形成されている必要はなく、磁性物質および非磁性物質を両方とも含むことができる。
マイクロビーズ自体がコロイド状で発色性を持っていてもよく、あるいは、発色性のある別のコロイド状金属粒子と組み合わせることができる。さまざまに修飾されたマイクロビーズの混合懸濁液を用いることができる。
マイクロビーズは決して単純な物品ではない。それらを、洗浄剤などの界面活性剤を用いて改変して、磁性流体のように、それらのレオロジー特性を制御することができる。マイクロビーズの表面は、免疫親和剤、抗体、酵素、色素、蛍光色素、蛍光クエンチャー、オリゴマー、ペプチドヌクレオマー（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｏｍｅｒ）などの生物活性分子を吸着または共有結合させることによって、より具体的には、例えば、ストレプトアビジンまたは一本鎖ＤＮＡオリゴマーでコーティングすることによって改変することができる。これら及びその他の蓄積された先行技術は、それらの範囲を全部記載することなく、その全体が本明細書中に援用される。というのは、先行技術の当業者に容易に理解されるように、本明細書において対象とするマイクロビーズが、その少なくとも１つの常磁性成分からなることを認識すること以外に関する限り、本発明の原理を理解するためにすべてを記載する必要はないからである。
マイクロビーズに適した基質には、ＳＯ３、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、グリシジル（ＣＯＣ）、ＯＨ、Ｃｌ、トシル、アルデヒド、およびスルフヒドリルから選択される官能基を任意で有する、ポリスチレン、ジビニルベンゼン、ポリビニルトルエン、ポリエステル、ポリウレタンなどがある。粒子は、しばしば、０．３μｍから５μｍ、またはそれ以上の範囲にある。１００ｎｍのラテックス粒子、および１、５、２０、５０、または１００μｍがまとめて市販されている。シリカは、基質としてか、またはカプセルとして用いることができる。誘導体化シランはＯＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨなどを含む。粒子は、しばしば、０．５から３μｍの範囲にある。また、デキストランも基質として用いることができる。粒子は、しばしば、２０から５０ｎｍの範囲にある。また、粒径約２５０ｎｍのシリカ強化型マイクロビーズとしてのシランとともに多糖体を用いることができる。アガロース基質およびセルロースの基質は、１〜１０μｍの粒子を含み、官能基を導入するために活性化させることができる。ゼラチンおよびアルブミンなどのタンパク質粒子が、長い間、磁性マイクロスフィアに用いられてきた。これらは、リガンドまたは標識とのアミン結合、カルボキシル結合、ヒドロキシル結合、およびスルフヒドリル結合のために、容易に活性化される。リポソームは、化学的に誘導体化するのはいくらか困難であるが、磁性粒子を作製するのに用いられてきた。剥き出しの酸化鉄、およびその他の常磁性金属粒子も知られており、スルフヒドリル基およびキレート剤を添加して誘導体化させることができる。これらの粒子は、しばしば５〜３００ｎｍの大きさである。一定のタイプの粒子集団は、大きさが均一であることが知られており、一方、他の集団では、不均質性を抑えるか、選択することが可能である。
このようなマイクロビーズは容易に調製することができる。例えば、約２０％〜６０％のマグネタイトを含むカルボキシル修飾マイクロビーズは、水中に（マグネタイト）／スチレン／ジビニルベンゼンの磁性流体混合物を分散させ、また、モノマーを乳化重合させて、直径約１μｍのマクロビーズのポリマー基質の中にマグネタイトを閉じ込めることによって作製される。マグネタイトはそのようにして固体ビーズ全体に分散される。マイクロビーズを合成して改変するためのその他の従来技術による方法が広く知られている。
また、本発明を実施するのに適したマイクロビーズは、Ｂａｎｇ’ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮ）およびＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＰＡ）などの販売業者、また、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｅａｄｓ（Ｗｅｓｔ Ｗａｒｗｉｃｋ ＲＩ）など、特殊改変マイクロビーズの数多くある供給業者から購入することができる。このようなマイクロビーズの商標名は、広範には列挙しないが、登録商標Ｅｓｔａｐｏｒ超常磁性体マイクロスフィア、商標ＣＯＭＰＥＬ均質磁性体マイクロスフィア、登録商標Ｄｙｎａｂｅａｄｓ商標ＭｙＯｎｅマイクロスフィアなどがある。コバルト常磁性体マイクロビーズが、Ｄｙｎａｂｅａｄ’ｓ ＭｙＯｎｅ ＴＡＬＯＮとして販売されている。ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓのＢｉｏＭａｇ Ｐｌｕｓマイクロビーズは不規則な形をしているため、アフィニティー化学のための表面積がより広い。
マイクロビーズの集団が、一般的にアッセイ標的の集団をアッセイするのに用いられる。本明細書において、集団は、何らかの要素または特性を共有する一連のメンバーを意味する。例えば、ビーズの集団は、ビーズが共通のタグ、例えば、アビジンコート、またはバーコードなどを共有するという点で類似しているかもしれない。アッセイ標的を含む核酸の集団は、単に、標的核酸配列を共有しているか、あるいは共通のタグを含んでいるかもしれない。抗体の集団は、共通の特異性を共有しているかもしれない。等々である。
常磁性および超常磁性は、本発明の目的に関して、機能的に同義であると理解される。これらの材料は、マイクロビーズに加工されると、外部磁場が存在する場合には、それに反応する特性を持つが、外部磁場が解除されると直ちに残留磁気を消散させるため、容易に再懸濁され単分散の状態を保つが、磁場近くに置かれると、固く凝集し、単に磁場を取り除くだけで、この工程を完全に元に戻すことができる。
磁場：これは、磁石の２つの極またはコイルの２つの面の間の磁束線によって規定される容量である。電磁石および駆動回路を用いて、磁場および局所的な磁場を発生させることができる。また、永久磁石を用いることも可能である。好適な永久磁性材料は、ＮｄＦｅＢ（ネオジミウム−鉄−ボロンＮｄ２Ｆｅ１４Ｂ）、フェライト（ストロンチウムフェライトまたはバリウムフェライト）、ＡｌＮｉＣｏ（アルミニウム−ニッケル−コバルト）、およびＳｍＣｏ（サマリウムコバルト）などである。磁場内部の磁力は磁束線に従う。磁力は、磁束密度が最も高い所で最大になる。磁場は、ほとんどの固体および液体を透過する。移動磁場には、以下の２つのベクトルがある：磁場の移動方向に向いたもの、および磁束線の方向に向いたもの。
試薬：酵素など、反応において用いられる任意の化学剤または生化学剤を意味する。試薬は、それ自体をモニターすることができる単剤（例えば、それが加熱されるにつれてモニターされる物質）、または２つ以上の薬剤の混合物を含むことができる。試薬は、生きているもの（例えば、細胞）または生きていないものであってもよい。核酸増幅反応用の試薬の例には、バッファー、金属イオン（例えば、マグネシウム塩）、キレート剤、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型、ヌクレオチド三リン酸、標識、色素、ヌクレアーゼ阻害剤などが含まれるが、これらに限定されない。酵素反応用の試薬は、例えば、基質、色素原、補助因子、共役酵素、バッファー、金属イオン、阻害剤、および活性剤などである。試薬が全部、反応体であるとは限らない。
洗剤：陰イオン、陽イオン、双性イオンおよび非イオン性の界面活性剤などである。
確実性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）：これは、アッセイ条件の範囲にわたり、アッセイフォーマットが、実施中の変動、材料の置換、および干渉に対して相対的に許容性があることを意味する。確実性は、一般的に、陽性の結果によって生じる検出シグナルの強度とともに増大する。確実性は、アッセイの難しさおよび複雑さと負の相関関係がある。
特異性：アッセイが、標的バイオマーカーの真の陽性シグナルを、あらゆるバックグラウンドシグナル、間違ったシグナル、または干渉シグナルから確実に区別できる能力を意味する。
感度：陰性を陽性からそれ以上確実に区別できないという、アッセイで検出できる下限を意味する。
安定性：保存中に、例えば、活性、濃度、分解、粘性、ｐＨ、または粒子成分などのパラメータで測定した組成変化が、時間とともに１０％を超えるものは不安定であると言われる。変化が１０％以下である場合は安定性を示している。安定性を測定する期間は、その組成物の利用目的によって決められる。高温で安定性が促進されることが、実際に測定されるよりも長期間安定していると推定する手短な方法であると考えられる場合がある。
「エンドポイント」：本明細書において「エンドポイント」または「データポイント」は、定量的または定性的なアッセイの「結果」の簡単明瞭な表現として用いられ、反応物が一定のプラトーまたはレベルに到達する安定的エンドポイントを意味し、また、時間の関数として（すなわち、傾斜的に）反応物または産物が出現する率または消失する率をデータポイントとする反応速度も意味する。
マイクロ流体カートリッジ：流体構造およびマイクロ流体の寸法をもつ内部チャネルを有する「装置」、「カード」、または「チップ」。これらの流体構造は、例えば、チャンバー、バルブ、ベント、ビア、ポンプ、インレット、ニップル、および検出手段を含むことができる。通常、マイクロ流体チャネルは、約５００μｍよりも小さく、一般的には約０．１μｍから約５００μｍの少なくとも１つの内部断面寸法をもつ流体の通路であるが、本発明者らは、その範囲の上限を６００μｍにまで広げる。というのは、本明細書において使用されているビーズ懸濁液の巨視的特性が、マイクロ流体の流動様式に、特に、それが流路の制約に関係している場合には、劇的効果を与えるからである。したがって、本明細書における定義では、マイクロ流体チャネルは、少なくとも１つの内部断面寸法が６００μｍよりも小さい流体通路である。マイクロ流体の流動様式は、ポアズイユ流、すなわち「層」流を特徴とする。粒子体積率（φ）、および粒子の直径に対するチャネルの直径の割合（Ｄ／ｄ）は、流動特性に対して測定可能な効果をもつ（例えば、Ｓｔａｂｅｎ ＭＥら、２００５，Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ ｆｌｏｗ ｉｎ ｎａｒｒｏｗ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｉｎｔｌ Ｊ Ｍｕｌｔｉｐｈａｓｅ Ｆｌｏｗ ３１：５２９−４７、およびそこで引用されている参考文献を参照）。
マイクロ流体カートリッジは、さまざまな材料から、レーザーステンシル加工、エンボス加工、スタンピング、射出成形、マスキング、エッチング、および三次元ソフトリソグラフィーなどの技術を用いて製造することができる。さらに、接着用中間層を用いて、または、例えば、延伸ポリプロピレンを加圧処理するなど、接着層なしの熱接合技術によって、ラミネート加工されたマイクロ流体カートリッジが製造される。ラミネート加工されたマイクロ流体カートリッジと、成型されたマイクロ流体カートリッジとでは、微細構造が異なりうる。
マイクロ流体チャネル：「マイクロチャネル」とも呼ばれる、さまざまな長さをもつが、断面の１つの寸法が５００μｍよりも小さな流体チャネルである。マイクロ流体チャネル内でのマイクロ流体の流動挙動は、高度に非理想的で層状であり、末端から末端への、または断面領域における圧力低下よりも、壁の湿潤性、粗度、液体粘性、接着性、および凝集性に依存することがある。マイクロ流体の流動様式は、しばしばチャネルにおける「仮想の液体壁」の存在に関係する。しかし、より大きなチャネルでは、アッセイのリンス工程において重要になりうるように、１０ｐｓｉ以上の圧力水頭によって、乱流のような遷移流動様式が生じることがある。
押出成形によって形成された層で構築されたマイクロチャネルは、より丸みを帯びたチャネルの外形、およびそれぞれの「ビア」上で同じ半径を有することができる。射出成形された部分の内部チャネルの表面もいくらか滑らかである。マイクロ流体様式における表面効果は深甚であるため、これらチャネルの流動特性は重大な意味をもつ。表面張力および粘度が表面粗度効果（ｓｕｒｆａｃｅ ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ ｅｆｆｅｃｔ）を構成する。チャネルの最狭の寸法が、流れに最も大きな効果を及ぼす。その結果、横断面が長方形または円形のチャネル内の流れは、対角線幅または直径によって制御され、一般的には、この挙動を利用できるように設計が変えられる。流れの方向にテーパーを減少させると、直径のウィッキング効果を２００ミクロンよりも小さくすることができる。逆に、チャネルを開放してバルブを形成させることによって、圧力が加えられない限り流れを止めることができる。チャネル内のビアは、方向性のある流れを向上させるよう設計することができ、一種の固体チェックバルブとすることができる。
マイクロ流体ポンプ：例えば、流体の動きを強制するためのバルブ、ベロー、ダイヤフラム、またはバブルを含み、ポンプの下部構造が、１ミリよりも小さい厚さまたはそのたの寸法を持つ。このようなポンプには、どちらも出願人に譲渡されている、Ｗｅｉｇｌに付与された米国特許第６７４３３９９号、およびＳａｌｔｓｍａｎの米国特許出願第２００５／０１０６０６６号に記載されている機械的に活性化される再循環ポンプなどがある。このようなポンプは、ロボットによって操作することも、手動で操作することもできる。電気浸透ポンプも提供される。このようなポンプは、マイクロ流体装置を利用するアッセイ法において、可溶化した試薬および試料の流れを推進するために、外部駆動装置の代わりに用いることができる。
ベローポンプ：これは、弾性体ダイヤフラムによって冠状部に２分割されて、流体で繋がっていない第１および第２のハーフチャンバーを形成する、しばしば円筒状をした空洞部として形成されている装置である。このダイヤフラムは、第１のハーフチャンバーに接続した空気圧パルス発生装置によって調節されている。上方からの正圧によってダイヤフラムが膨らみ、第２のハーフチャンバーの内容物を置換して、負のゲージ圧（吸引力）によってダイヤフラムが引っ込み、第２のハーフチャンバーが膨張して流体を吸い込む。ハーフチャンバーによって、ダイヤフラムの実効面積は、正圧下での容積置換量および吸引圧下での容積置換量の少ない方であるため、第１および第２のハーフチャンバーがダイヤフラムの上下の容積とほぼ対称または等しいときに最適となることを理解すべきである。第２のハーフチャンバーは流体のインポートおよびアウトポートに接続している。流体のインポートおよびアウトポートは、個別のポートであっても単一のポートであってもよいが、いずれにしても、バルブによって制御されている。上記したように、空気圧パルス発生装置は、通常、バルブがついたマイクロチャネルによって、第１のハーフチャンバーに空気圧で連結している。完全な装置においては、空気圧によって作動するようプログラムすることが可能である。すなわち、このパルス発生装置で用いられるプログラム可能な空気圧ロジックは、シグナルに応じてダイヤフラムを作動させる機能、およびシグナルに応じてバルブを開閉させる機能という２つの機能がある。パルス発生装置がカートリッジに取り付けられていない場合には、ニップルまたは流入口、空気圧式連結管、およびソレノイドバルブを備えている。
使用に際し、陰圧をダイヤフラム加えると（または、受動的に、流体が、第２のベローポンプによって押し込まれると）、注入口バルブを介して、流体がベローポンプの第２のハーフチャンバーに入る。そして、正圧をダイヤフラムに加えると、チャンバーの流体内容物が、排出バルブを通って排出される。同様に、正圧および陰圧によるシグナルが、バルブの開閉を制御する。一連の正圧および陰圧によるシグナルをダイヤフラムに供給することによって、流体をベローポンプチャンバーに出入りするよう動かすことができる。この流体運動は、同調バルブロジックを適用することによって方向性をもつようになって、ポンプ作用をもたらす。
対になったベローポンプ、すなわち、「二重ベローポンプ」は、注入口バルブと排出口バルブが閉じた後、２つのベローチャンバーの間を往復する流れが形成させるための圧力作動式の第１のダイヤフラムおよび受動式の第２のダイヤフラムとともに構成されている場合には、流体中でビーズまたは粒子の懸濁液を混合することができる。往復する流れは、両方のダイヤフラムを、交互空気圧パルスまたは反転空気圧パルスで同調して作動させるによって得ることもできる。同様に、多様なベローポンプを連続して流体接続して、混合機能を行わせることができる。
流体バルブ：少なくとも１つの寸法が５００μｍよりも小さい、中位分類に属するさまざまな水圧式、機械式、空気圧式、磁気式、および静電式のアクチュエーター型流量制御装置が含まれる。この分類の代表的なフラップバルブが米国特許第６４３１２１２号に記載されている。また、チェックバルブも含まれる。上位分類のバルブは、流路および制御チャネルを交差させ、制御チャネル内の作動力に反応して流路の中に偏向するか、流路から引っ込むことができる弾性体膜によって分離される構造物を意味する。下位分類のマイクロ流体バルブの記載がある特許は、米国特許第５９７１３５５号、第６４１８９６８号、第６５１８９９号、第６６２０２７３号、第６７４８９７５号、第６７６７１９４号、第６９０１９４９号、および米国特許出願第２００２／０１９５１５２号、および第２００５／０２００５８１６号などである。これらのうちいくつかは、本出願人に共同譲渡されているが、これらはすべて、参考として本明細書中に援用される。
チェックバルブ：これは一方向バルブである。微小型のボールスプリングバルブ、フラップバルブ、およびフリップフラップバルブがチェックバルブである。
受動型遮断バルブ：水につかると膨張するマイクロ流体チャネル内の湿潤性の挿入片または被覆であり、マイクロチャンネルを閉じてどちら側にも流れないようにする。同じように、マイクロチャネルの壁上の環状の疎水性物質からなる「表面張力バルブ」が、試薬の流れを遅らせたり止めたりすることが開示されている。また、マイクロ流体チャネルの直径のテーパーを広げることによって、ストップフローを達成することもできる。
自給式：チャネルが湿潤性で、通常、チャネルを刺激しなくても、毛細管流動が始まるよう、ある材料から製造されているか、または処理されているマイクロ流体チャネルを示している。
ビア：層から構築されている積層装置の特徴である、上下を問わず１つの基質層から別の基質層への流体経路を提供する、マイクロチャネル内の段階。
「空気ポート」：外部サーボ機構によるプログラム可能な制御下に置かれた空気圧式連結管のアームを意味する。空気圧式連結管には、正または負のゲージ圧がかかっていてもよい。±５から１０ｐｓｉｇの作動圧で十分であることが分かっている。
絞りバルブ：締め付けられると、水頭圧力をマイクロ流体装置内に発生させて、混合を促進するのに役立つ微小「ベイスティング」装置であって、例えばポリウレタンから成る場合がある。
ピロー：変形可能な球形嚢から形成されているオンボード型試薬パック、例えば、任意には、制御された時間にバッグを破ってその内容物を放出させるための空気圧作動式装置に封入されているマイラー樹脂のマイクロバッグ。安定性を考慮すると、金属と樹脂の共積層体が好ましい。
ブリスターパック：変形可能な（あるいは弾性の）ダイヤフラムの下にある、オンボード型試薬パック。ダイヤフラムを加圧することによって試薬を送達するために用いられ、金属製シェブロンのような「鋭利なもの」を並置して、ダイヤフラムにかかる圧力によって「ピロー」が破壊されるようにすることができる（ピローの項を参照）。これらを、チェックバルブまたは閉鎖可能なベントとともに用いて、方向性のある流体の流れおよび試薬の送達を生じさせることができる。弾性ダイヤフラムは、例えば、ポリウレタン、ポリシリコン、およびポリブタジエン、ならびにニトリルから容易に得られる（弾性体の項を参照）。変形可能な非弾性ダイヤフラムは、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、マイラー、ポリプロピレン、ポリカーボネート、またはナイロンを用いて作られる。変形しやすいフィルム用に適したその他の材料には、パラフィルム、ラテックス、箔、およびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などがある。変形しやすいフィルムを選択する際の主要な要因には、降伏点および変形緩和係数（弾性係数）などがある。
これらの装置を用いて、マイクロ流体装置の内容物を外部環境から隔離し、かつ使用者が流体の内容物に被曝しないように保護しつつ、流体の送達または受け入れを行うことが可能になる。
隔離または「隔離された」：本明細書において、「順方向隔離」は、使用者が感染因子または毒素で汚染されている可能性のある臨床材料に被曝しないよう保護することを意味する。「逆方向隔離」は、偽陽性をもたらす可能性がある核酸などによる、偽の外来性汚染からアッセイ装置を保護することを意味する。
一回使い切り：試料を一回だけ導入する必要があるまたは許容する、マイクロ流体の装置、カード、またはカートリッジを意味し、このアッセイは、次に、内蔵式の密閉系の中で行われる。このような装置は、任意で、試料ポートを塞いだりロックしたりするための装置、およびこの装置の内容物およびアッセイ終了後に出る廃棄物を殺菌するためのオンボード型手段を含む。一つの実施形態において、装置は、特別な注意を払うことなく、使用後に廃棄することができる。
廃液用チャンバーまたは「パック」：排出された試料、洗浄液、および廃棄試薬を隔離するための貯蔵容器となる空洞またはチャンバーである。一般的には、ウィッキング材料も含む（ウィックの項参照）。廃棄物パックは、マイクロ流体装置の本体に封止するように付着している弾性隔離膜の下でシールすることもできる。この内部膜は、吸湿性材料が膨張するについて膨張し、それによって、廃棄物を封じ込める。隔離膜の外側の空洞は、廃棄物が含まれ隔離されるように、大気に放出される。廃棄物パックは、任意では、乾燥または液体状の殺菌剤を含んでいてもよい。
ウィック：マイクロ流体ポンプの代わりに、またはこれと連携して、毛細管湿潤によって流体の流れを推進させるために用いられる吸湿性材料である。吸湿性の芯は、一般的には、天然または合成の繊維ウェブを含み、また、しばしば、通常、「ハイドロゲル」、「超吸収」材料、または「親水コロイド」材料と呼ばれる一定の吸収性のゲル化物質も含む。材料は、紙、スポンジ、おむつ材、Ｃｏｎｔｅｃ−Ｗｉｐｅなどである。乾燥剤、例えば、硫酸カルシウム、シリカゲルなどを、単独または吸湿材料と組み合わせて用いることもできる。
トラップ：ベントから廃棄物貯留容器を更に隔離するダムを有する流体トラップ。
ベント：内部空洞部と外気とを通気する孔。「衛生装置」または「隔離用ベント」も、気体に対しては透過性であるが、疎水性かつ耐湿性であるフィルター素子を含む。任意には、これらのフィルター素子は直径０．４５ミクロン以下の孔を有する。これらのフィルターは、順方向および逆方向で隔離する機能を有する。この型および構造のフィルター素子も、例えば、バルブまたはベローポンプを、これを調節する空気圧式連結管から隔離するために内部に設置してもよい。
検査フィールド：マイクロ流体を用いたアッセイにおける、光学窓など、アッセイのエンドポイントを観察または測定し、任意には、検査用パッドを含む検出用チャンバーである場所を意味する。
核酸標的捕捉アセンブリは、固相核酸アフィニティー結合基質と、この結合基質をマイクロ流体装置内の流体通路に設置する手段との組み合わせを意味する。結合基質には、通常、フィルター、ビーズ、フリット、流動床、および固体表面などがある。材料は、シリカ、シリカ誘導体、アルミナ、ジルコニア、ラテックス処理ビーズなどである。設置するための手段は、マイクロ流体チャネル内にビーズを直接沈着させるような単純なものでも、チャネルの流体通路内にフィルター膜またはフリットを取り付けることによるような、より複雑なものであってもよい。フィルター膜は、層の切欠き部に挿入したり、適当な位置に接着したり、フィルタープラグのような形で適当な位置に適合させたり、あるいは組立済みの筐体の中に入れて適当な位置に圧着させることができる。フリットは、通常、適当な位置に圧着させるかエッチングする。
弾性体：通常、弾性体は、力を加えると変形するが、力を取り去ると元の形に戻る。弾性体材料によって示される弾性はヤング率で表すことができる。本明細書に開示されているマイクロ流体装置で用いられる弾性体材料は、一般的に、ヤング率が約１Ｐａ〜１ＴＰａであり、別の例では、約１０Ｐａ〜１００ＧＰａであり、さらに別の例では約２０Ｐａ〜１ＧＰａであり、なおさらに別の例では約５０Ｐａ〜１０ＭＰａであり、また、一定の例では約１００Ｐａ〜１ＭＰａである。これらの範囲外のヤング率を有する弾性体材料も、具体的な用途の必要性に応じて利用することができる。
本明細書記載のいくつかのマイクロ流体装置は、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロフェン、ポリイソブチレン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ニトリル、ポリウレタン類、およびポリシリコン類などの弾性重合体から製造される。ＧＥ ＲＴＶ６１５、ビニル−シラン架橋（型）シリコン弾性体（ファミリー）、ならびにＢｉｓｃｏ Ｓｉｌｉｃｏｎｓ（Ｅｌｋ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）から入手可能なポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）膜であるＨＴ−６１３５膜およびＨＴ−６２４０膜が、選択された用途において有用である。材料の選択は、一般的には、実際の用途に必要とされる具体的な材料特性（例えば、耐溶剤性、硬度、気体透過性、および／または温度安定性）に依存する。マイクロ流体装置の構成要素を製造するのに用いることができる更なる弾性体材料が、Ｕｎｇｅｒら、２０００ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１１３−１１６に記載されている。本発明の装置の弾性体には、ダイヤフラムとして用いられるものがあり、その伸縮性および弛緩性に加えて、その多孔性、不透過性、耐薬剤性、およびその湿潤特性ならびに不動態化特性についても選択される。別の弾性体は、その熱伝導度について選択される。Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ Ｐａｒｋｅｒ Ｃｈｏｍｅｒｉｃｓ Ｔｈｅｒｍａｇａｐ材料６１−０２−０４０４−Ｆ５７４（０．０２０”厚）は、１．６Ｗ／ｍ−０Ｋの熱伝導率を提供するのに５から１０ｐｓｉの圧力しか必要としない軟性弾性体（＜５ＳｈｏｒｅＡ）である。
弾性を欠く、変形しやすいフィルムも、本発明のマイクロ流体装置において用いられる。
側方流動アッセイ：透過膜などの繊維質層に粒子含有流体を塗布し、粒子および粒子凝集体を材料の中に入れ、それを通って移動させながら、クロマトグラフィー特性を観察することによって、粒子の集合、凝集、または結合を検出する、従来型のアッセイ法の一種を意味する。粒子の凝集塊が透過するのは妨げられるが、単体粒子は繊維の間を透過する。同様に、単体粒子は、アフィニティー結合剤で処理された繊維層のゾーン内に塊として蓄積することができる。本明細書に記載されている装置および方法は側方流動アッセイではない。
「従来の」とは、本発明が関係する先行技術において知られていることを指定する用語である。
「約」および「通常」は、不正確さをぼかす表現であって、変化がわずかで明白であり、あるいは同じ効用または機能を有する場合には、「大体」の意味で「ほぼ」、「およそ」、または「ほとんど」という状態を記載しており、更に、標準、ルール、または限度に対する明らかなマイナーな例外が存在することを示している。
本明細書において、「ある機能のための手段」が記載されている場合、発明の範囲は、図面だけに示されている方式に限定されず、本明細書に記載されている、その機能を実行するための全ての手段、および出願時に当技術分野において周知されていたその他すべての手段も含むものと理解されるべきである。「先行技術の手段」は、いくつかの例を参照して本明細書で引用されている技術分野において蓄積された知識など、出願時に当業者に知られているような、その機能を行うためのすべての手段を包含する。
抽出手段：装置のさまざまな引用された要素、例えば、生体試料由来の標的核酸を捕捉するための固体基質、フィルター、フィルタープラグ、ビーズベッド、フリット、またはカラムを意味し、いくつかの例を参照して本明細書で引用されている技術分野において蓄積された知識を含む。
例えば、重合させるための手段は、ポリメラーゼならびにその補助因子および基質、例えば、逆転写酵素およびＴＡＱポリメラーゼとして記載されている、さまざまな種類の分子機械装置を意味し、いくつかの例を参照して本明細書で引用されている酵素学において蓄積された知識を含む。
増幅手段：熱サイクル的または等温的な手段などがある。最初の熱サイクル技術は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、ならびにＩｎｎｉｓら、（”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ，１９９０）に詳細に記載されている（ＰＣＲと称される）ポリメラーゼ連鎖反応法であった。ポリメラーゼ連鎖反応法は、当技術分野においてよく知られている。手短にいえば、ＰＣＲにおいては、標的配列の向かい合う相補鎖上の領域と相補的な２種類のプライマー配列を調製する。過剰量のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼとともに反応混合物に加える。標的配列が試料中に存在すれば、プライマーは標的に結合し、ポリメラーゼによって、ヌクレオチドを付け足されて、マーカー配列に沿ってプライマーが伸長される。反応混合物の温度を上げたり下げたりすることによって、伸長したプライマーが鋳型から解離して、反応産物を生成し、過剰量のプライマーが鋳型および反応産物に結合し、この過程が繰り返される。蛍光性インターカレート剤を加えることによって、リアルタイムでＰＣＲ産物を検出することができる。
１つの等温的手法がＬＡＭＰ法（ＤＮＡのループ介在等温増幅法）であり、Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．らＮｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２０００ ２８：ｅ６３に記載されている。
鎖置換増幅（ＳＤＡ）法は、鎖の置換および合成、すなわちニックトランスレーションする（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２：１６９１−１６９６）を何回も繰り返すことを含む、核酸の等温増幅を行う別法である。修復連鎖反応（ＲＣＲ）法と呼ばれる類似の方法は、増幅の対象となる領域全体にわたって、いくつかのプローブをアニールさせ、続いて、４種類の塩基のうちの２種類だけしか存在しない中で修復反応を行う。残りの２種類の塩基は、容易に検出するためのビオチン化誘導体として付加することができる。ＳＤＡ法においても同様の方法が用いられる。サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）法を用いて、標的特異的配列も検出することができる。ＣＰＲ法では、非特異的ＤＮＡの３’側配列および５’側配列ならびに特異的ＲＮＡの中央の配列を有するプローブを、試料中に存在するＤＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションと同時に、この反応液をＲＮａｓｅＨで処理すると、分解後に放出される特有の産物であると同定されたプローブの産物。最初の鋳型が別のサイクリングプローブにアニールすると、この反応が繰り返される。
別の核酸増幅法が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法である。まず、逆転写酵素を用いてＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作成し、それから、得られたｃＤＮＡ上でＰＣＲ法を行う。
別の増幅法が、欧州特許第３２０３０８号に開示されているリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）法である。ＬＣＲ法では、２つの相補的プローブ対を調製し、標的配列の存在下で、それぞれの対を、標的の反対側の相補鎖に結合させて、それらが隣接するようにする。リガーゼの存在下では、２つのプローブ対が連結して１つのユニットを形成するであろう。ＰＣＲ法におけるように、温度サイクルによって、結合しているライゲートユニットが標的から離脱して、過剰量のプローブ対をライゲートさせるための「標的配列」として働く。米国特許第４，８８３，７５０号が、プローブ対を標的配列に結びつけるためのＬＣＲ法に類似した方法を記載している。
また、本発明における更に別の増幅法として、Ｑβレプリカーゼを用いてもよい。この方法では、標的の複製配列に相補的な領域をもつ、ＲＮＡの複製配列を、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で試料に加える。ポリメラーゼは、その後検出することができる複製配列をコピーする。
英国特許出願第２ ２０２ ３２８号、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に記載されている、さらに別の増幅法を本発明に従って使用することができる。前者の出願では、「修飾」プライマーを、ＰＣＲ様で鋳型および酵素依存型の合成に使用する。これらのプライマーは、捕捉成分（例えば、ビオチン）および／または検出成分（例えば、酵素）で標識して修飾することができる。後者の出願では、過剰量の標識プローブを試料に加える。標的配列が存在する中で、プローブが結合して、触媒的に切断される。切断後、標的配列は、元のまま遊離して過剰量のプローブによって結合される。標識プローブは切断されると、標的配列が存在するというシグナルが伝えられる。
その他の核酸増幅手順は、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）法および３ＳＲ法（Ｋｗｏｈら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：１１７３；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ出願公開ＷＯ８８／１０３１５）など、転写による増幅システム（ＴＡＳ）を含む。ＮＡＳＢＡ法では、臨床試料の標準的なフェノール／クロロホルム抽出、熱変性、溶解バッファーによる処理、およびＤＮＡおよびＲＮＡを単離するためのミニスピンカラム、またはＲＮＡの塩化グアニジウム抽出によって増幅させるために核酸を調製することができる。これらの増幅技術は、標的特異的な配列をもつプライマーをアニールすることを含む。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅＨで分解されるが、二本鎖ＤＮＡ分子は再び熱変性される。どちらの場合も、第２の標的特異的なプライマーを加え、一本鎖ＤＮＡを十分な二本鎖にし、続いて重合させる。そして、二本鎖ＤＮＡ分子を、Ｔ７またはＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼによって何度も転写させる。等温サイクル反応では、ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡへと逆転写すると、次に、この一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換し、それから、Ｔ７またはＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼを用いて、もう一度逆転写する。得られた産物は、不完全なものであろうと完全なものであろうと、標的特異的な配列を示す。
Ｄａｖｅｙら、欧州特許第３２９ ８２２号は、本発明に従って用いることができる、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）を繰り返し合成することを含む核酸増幅工程を開示している。ｓｓＲＮＡは、第１のプライマーオリゴヌクレオチド用の鋳型であり、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。そして、このＲＮＡは、得られたＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖から、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡとの二本鎖中のＲＮＡに特異的なリボヌクレアーゼである）の作用によって取り除かれる。得られたｓｓＤＮＡは、鋳型との相同領域の５’側に、（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列も含む、第２のプライマーの鋳型となる。そして、このプライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＤの大きな「クレノウ」断片など）によって伸長させると、プライマー間に元のＲＮＡの配列と同じ配列をもち、更に、一方の末端にプロモーター配列をもつ二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子が得られる。このプロモーター配列を適当なＲＮＡポリメラーゼが用いて、ＤＮＡの数多くのＲＮＡコピーを作ることができる。そして、これらのコピーは、非常に急速な増幅を引き起こすサイクルに再び入ることができる。酵素を適切に選択すると、サイクルごとに酵素を加えることなく、この増幅を等温的に行うことができる。この処理工程は周期的な性質をもつため、出発配列を、ＤＮＡかＲＮＡの形になるよう選ぶことができる。
Ｍｉｌｌｅｒらは、ＰＣＴ出願公開ＷＯ８９／０６７００において、プロモーター／プライマー配列を標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）とハイブリダイズさせ、その後、この配列の数多くのＲＮＡコピーを転写することに基づく核酸配列の増幅スキームを開示している。このスキームは周期的ではない、すなわち、得られたＲＮＡ転写物から新たな鋳型を生じさせない。その他の増幅法には、「ＲＡＣＥ法」および「片側ＰＣＲ法」（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｉｎ：“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９０；Ｏｈａｒａら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：５６７３−５６７）などがある。
また、得られた「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列をもつ核酸の存在下で２種類（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドをライゲートさせ、それによって、ジ−オリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法を、本発明の増幅工程で用いることができる。Ｗｕら、（１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０）。
検出装置：本明細書において、エンドポイント、すなわち、アッセイの結果を表示するための装置を意味し、検出チャネルおよび検査用パッド、ならびに検出エンドポイントを評価するための手段を含んでいてもよい。検出エンドポイントは、検査フィールド内を観察者が目視することによって、または、分光光度計、蛍光光度計、照度計、光電子増倍管、光ダイオード、比濁計、光子計数器、電圧計、電流計、ｐＨメーター、静電容量センサー、高周波トランスミッター、磁気抵抗計（ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｏｍｅｔｅｒ）、またはホール効果装置を備えた機械によって評価される。含浸色をもつか、回折率の高い磁気性の粒子、ビーズおよびマイクロスフィアを用いて、アッセイのエンドポイントの視覚的または機械強化された検出を促進することができる。カバープレート内の拡大レンズ、光学フィルター、有色液、および標識を用いて、アッセイ結果の検出および解釈を向上させることができる。また、磁気性の粒子、ビーズおよびマイクロスフィアを検出するための手段は、当技術分野において周知されているように、発色団およびフルオロフォアなどの色素、高周波タグ、プラズモン共鳴、スピントロニクス、放射性標識、ラマン散乱、化学発光、または誘起モーメントなど、包埋型または被覆型の「標識」または「タグ」を含むが、これらに限定されない。自己会合に依存する独特な発色性シグネチャーを有するコロイド粒子も、検出可能なエンドポイントをもたらすと期待されている。ＺｎＳでコーティングされたＣｄＳｅなどのＱＤｏｔで、磁気ビーズ上に装飾されているもの、または、任意にてゾルゲル微粒子基質になっているか、または逆エマルジョンに調製されている、ＱＤｏｔおよび常磁性Ｆｅ３Ｏ４微粒子のアマルガムが、本発明のアッセイの感度を高め、それによってより小型の検査用パッド、およびより大型のアレイを可能にする便利な方法である。蛍光消光検出エンドポイントも期待されている。酵素結合免疫アッセイ法に関連したさまざまな基質および生成物発色団も当技術分野でよく知られており、検出シグナルを増幅して、アッセイ法の感度を高めるための手段を提供する。検出系は、任意で、定性的、定量的、または半定量的である。その簡便さから、視覚的検出法が好ましいが、検出手段は、視覚的検出法、機械的検出法、手動的検出法、または自動的検出法を含むことができる。
加熱および冷却のための手段：液体が充満したチャンバーを熱サイクルさせるためのいくつかの手段が先行技術に記載されている。これら先行技術の手段には、通常、サイクルの冷却過程で熱を逃がすためのヒートシンクに連結した、電気抵抗素子などの対流性および伝導性の発熱体、熱風、レーザー、赤外線照射、ジュール加熱、ＴＥＣ素子またはペルティエ素子、ヒートポンプ、吸熱反応体などが含まれる。加熱手段には、高周波磁場によって操作される磁気ビーズの運動による加熱も含まれる。
熱サイクル用の加熱装置および冷却装置は、変温式および定温式という２種類に分類される。定温式装置は、反応中、比較的一定の温度を保ち、熱サイクルには、少なくとも２つの反応チャンバーが必要である。変温式加熱装置は、少なくとも２つの設定値の間で温度を変化させるために、熱サイクルのための反応チャンバーが１つだけで済む。加熱素子を組み合わせることも可能である。ペルティエ素子は、定温式および変温式の用途に用いることができる。ウォーターバスは、熱サイクルのための変温式温度調節にうまく適合しない。
通常、加熱手段および冷却手段は、液体内容物と熱交換が行われるよう、流体成分と界面を接している。ＰＣＲ法では、熱交換が行われるマイクロ流体のチャネルまたはチャンバーを形成する関連要素が「ＰＣＲ流体および温度界面アセンブリ」の部分と呼ばれている。
隔離手段：不透過性のカートリッジ本体、気体透過性の疎水性ベント装置、廃棄物チャンバー内の吸水性パッド、廃棄物チャンバー内の殺菌剤、空気圧式作動装置をブリスターパックから分離する弾性体膜、吸気圧によって作動する弾性体膜を有するバルブ、前記試料注入ポート内の吸気圧、前記試料注入ポート内のゴム引きニップル、試料注入ポートを覆うスナップロック式の密閉装置、オンボード型試薬パック、および一回使いきり試料ポートなどである。
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、明細書および以下の特許請求の範囲の全体にわたって、「含む」という語およびその変形、例えば、三人称単数形の「含む」および「含んでいる」などは、非限定的で包括的な意味に、すなわち「などであるが、それらに限定されない」と解釈されるべきである。
本明細書全体を通して、「一つの実施形態」または「実施形態」と言う場合、その実施形態に関連して記載された具体的な特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれていることを意味する。よって、本明細書を通して、さまざまな箇所に「一つの実施形態において」または「実施形態において」という語句が見られても、それら全部が同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、具体的な特徴、構造、または特性を、いずれか適当な方法で組み合わせて１つ以上の実施形態にすることも可能である。
２．詳細な説明
本発明のアッセイ法は、抽出、増幅、および検出という３つの工程を有する。本明細書で開示されるマイクロ流体装置は、単一の装置に組み込まれた、これらの機能に対応する３つの流体サブ回路から構成されている。
ここで図面を参照すると、図１は、試料処理および核酸抽出のためのマイクロ流体サブ回路１００の概略図である。例えば、大便、尿、全血または血漿などの試料は、液体、固体、またはそれらの混合物であろう。一つの実施形態では、液体試料を、液体試料ポートの中にピペッティングするか、吸い込ませる。別の実施形態では、試料をまず流体化させてから、液体試料ポートの中に導入する。別の実施形態においては、対象とする材料を含むスワブを、装置内のチャンバーに挿入し、次にスワブの首を折り取って、装置を密封する（図２７のようにする）。必要であれば、前処理することも想定内である。
試料を装置の中に導入した後、本発明の一体型装置では、残りのアッセイ工程は、自動化または半自動化されている。この装置は、密封された後は、作業者が生体有害物質に被曝するのを防ぐ安全装置を含む。
液体輸送を行うために、任意で、ベローポンプおよびそれに結合したチェックバルブを利用する。毛細管作用またはウィッキングを利用してもよい。
植物性、粘液性、および不要な粒子状物質を除去するために、流体化させた試料を、任意にて、例えば、ポリプロピレン製繊維でできたデプスフィルターで事前ろ過してから、溶解バッファーと混合し、標的核酸内容物を結合していた残渣および混入物から遊離させる。任意では、プレフィルターを用いて、血液の細胞性成分および血漿成分を分離することもできる。
溶解バッファー用ポーチ内の溶解バッファーは、核酸と付着分子の間の結合を低下させるために、界面活性剤と一緒にカオトロピック剤を含み、また、洗浄前に核酸が分解するのを抑制するために、任意で、ＥＤＴＡなどのヌクレアーゼ阻害剤およびキレート剤を含む。
本発明者らは、４．５Ｍグアニジンチオシアネート（ＧＳＣＮ）を、サルコシンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤と併用し、弱酸性バッファーとともに用いて、核酸がＰＣＲに適するものとなるよう、全血から十分量のヘモグロビンを取り除いた。この方法は、大便でもうまく行く。グラム陰性細菌が、この処理で溶解する。
マイクロスケールで試料と溶解バッファーを混合するには工夫が必要である。生化学法を微小規模流体反応装置に適合させるには、新たな工学技術が必要とされてきた。我々の経験では、例えば、本発明のマイクロ流体装置において好適な混合機構は、達成可能な直線流速度で期待される拡散路の長さに近づくよう、チャネルの１つの横断面の寸法を短縮することである。通常、これは、層状または成形された装置において、マイクロ流体チャネルの幅を一定に保ちつつ、チャネルの深さを約７５ミクロン（３ｍｉｌ）から約２５ミクロン（１ｍｉｌ）に減らすことで行われる。このような実施によって、マクロ分子操作可能なヘッド部、または通常、±１０ｐｓｉｇ以下の吸気圧（ΔＰ）で、マイクロチャネルの予測可能な長さにわたって高分子と溶質が適切に混合されることが確実になる。空気圧式作動装置は、溶解用チャンバーと溶解バッファー用ポーチとの間で液体が逆流できるように設けられている。弾性体膜によって、順方向および逆方向への隔離が確実になる。
次に、溶解物は、核酸に対して非特異的で可逆的なアフィニティーをもつ核酸標的捕捉アセンブリを通過する。標的捕捉物質は、一般的にはヒドロキシル基にも富む、通常、電気的陽性の親水性物質である。適当な標的捕捉物質が米国特許第５２３４８０９号に記載されており、これは、その全体が参考として本明細書中に援用される。標的捕捉物アセンブリは、例えば、シリカなどの物質からなる繊維基質またはフィルターであるシリカ表面、シリカ床または酸化アルミニウムビーズ、誘導体化ジルコニウムのフリットプラグ（ｆｒｉｔｔｅｄ ｐｌｕｇ）などであってもよく、マイクロ流体装置の寸法、静水圧、および流速に適合している。ビーズは、粗末でも微細でもよいが、一般にサイズが均一であることが好ましい。線維は必要とされる表面積体積比、流速、および許容可能な圧力低下を得るための必要に応じて、粗末でも微細でもよく、緩く包装されていても、きつく包装されていてもよい。マイクロ流体チャンバーの壁に繊維製パッドを密着させる手段には、切り込みまたはほぞ穴構造、封止剤としてのガスケットまたは接着剤、可塑性溶媒（ｐｌａｓｔｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ）または音波溶接、圧着（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｉｔ）、または、すべての流体がフィルター床を通って排出されるように、スナップ式で正しい位置に置くことができる包装済みのモジュール構造などがある。膜フィルターについては、支持リブをレーザーで微細加工することができる。
核酸標的捕捉アセンブリから溶解物を、バルブの制御下で廃棄するために排出した後、残留物を、溶媒洗浄ポーチからの洗浄用試薬でリンスし、この洗浄用試薬も、バルブの制御下で廃棄するために排出する。洗浄用試薬は、無水エタノール、水中、アセトン中７０％から９５％のエタノール、またはアセトン、エタノール、任意にはバッファーとの水混合液から構成されることが可能である。溶媒は、ホイルを敷いた「ブリスターパック」の中にオンボードで保存するが、このブリスターパックは、空気圧による制御下でプログラムされた時間に破裂するため、内容液は、核酸標的捕捉アセンブリ残留物を洗浄して廃液となる。洗浄用試薬は、核酸を沈殿させる一方で、脂質、ＥＤＴＡ、およびＰＣＲ増幅に適合しない塩類を取り除く。洗浄が完了したら、滅菌フィルターを通った気流の下で標的捕捉物質を短時間乾燥させて、残留したエタノールまたはアセトンを除去する。
十分に洗浄した後、溶離バッファー用ポーチからの溶離バッファーによって、核酸残留物を標的捕捉構成物から溶出させる。「スラグ溶出」は、チャンバーダイヤフラムを使用することによって回収を最適にする一処理手順であり、その結果、溶離バッファーは、図２に示される増幅用サブ回路の中に通過して行く前に、標的捕捉構成物の上を往復して流れる。
この処理によって、初期の処理手順の短所であった中間単離（または精製）の必要なしに、直ちにＰＣＲで使用することができる核酸が得られる。標的核酸を含む溶離バッファーを直接用いて、試薬および酵素を含む無水「ＰＣＲ用混合物」を再水和して、ＰＣＲを開始させる。その他の増幅手段も考えられる。
意外にも、標的捕捉アセンブリ内での溶離によって、高分子量のゲノムＤＮＡがよりＰＣＲに適した断片に剪断され、低コピー数の標的を検出する上で、さらなる利点となる。また、処理工程が完全に密閉装置内で行われるため、試料投入後に汚染されるリスクが本質的になくなる。
溶出液そのものを、増幅サブ回路において無水ＰＣＲ用混合物を再水和するための溶媒として用いることによって、標的配列をそれ以上希釈しないですむ。
したがって、溶離バッファーが、意図的に、ＰＣＲ用バッファーとして使用される。溶離バッファーは、二官能性になるよう設計されており、これまで微量スケールでは試されたことがないやり方で、試料調製とＰＣＲ増幅を切れ目なしに統合するのである。
増幅
ＰＣＲによる増幅は、当技術分野において周知されているように、変性、アニーリング、および伸長の繰り返しである。
次に、ここで図２を見ると、空気圧制御の下、連動式バルブによって核酸溶出液が、マイクロ流体チャネルを通って、増幅のために１つ以上のチャネルまたはチャンバーの中に輸送される。増幅用サブ回路のこの部分が、「ＰＣＲ流体および温度界面装置」２００を構成しており、熱交換と混合が最適化されるように設計されている。増幅用チャネルまたはチャンバーの中では、溶出液が、予めスポットされている無水ＰＣＲ用混合物を再水和するために使用される。ＰＣＲ用混合物は、ポリメラーゼ活性の必要に応じて、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどから選択された最適な濃度のマグネシウム塩、最適なｐＨのバッファー、および界面活性剤を含む。乾燥試薬は、任意で、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーの融解曲線に適合する塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含む。同時に、対照用増幅チャネル（試料を入れない）内の試薬および対照用鋳型を、溶離バッファー用チャンバーから直接流れてくる溶離バッファーで再水和する。この陰性対照用チャンバーを用いて、装置内における核酸混入をチェックする。
我々の経験では、ＰＣＲ用試薬を再水和するのに混和する必要はない。加熱によって、増幅用のチャネルまたはチャンバーの中で対流による混合が起き、試薬と基質をしっかりと溶解して分配する。増幅用サブ回路の不動態化は、前処理によって、適当な不動態化物質を乾燥ＰＣＲ混合物に取り込むことによって行うことができる。
図２の実施形態は、ＰＣＲ流体および温度界面アセンブリの各アームの中に２つのチャンバーを含む。これらは、ＰＣＲプロトコールにおける熱サイクルさせるための別々の温度要件に関係している。後続の例では、別の構成が図示されている。
図２に描かれているようなアッセイ用装置は、固定温度制御による、増幅用のチャネルまたはチャンバーと熱的接触している２つのＴＥＣブロックを必要とする。一方のブロックは、二本鎖鋳型を融解し、プライマーを解離させるためのチャンバーとして作用するベローポンプに結合しており、もう一方は、アニーリングおよびポリメラーゼ伸長させるためのチャンバーとして作用するベローポンプに結合している。温度ブロックの調節は、通常、デバイス外で操作され、空気圧の調節と一体化されている。加熱および冷却のためのその他の手段は当技術分野において周知されている。
温度は、ＰＣＲ流体および温度界面アセンブリの設計に応じて、固定されていても、上下されるものであってもよい。固定温度ステーションをもつアッセイ用装置が考えられている。それぞれが異なった固定温度をもつ２つまたは３つの温度ステーションによる熱サイクルは、ＰＣＲ反応混合液に温度ステーションの間の往復を繰り返させるか、または、循環流体流によって、変性、アニーリング、および伸長を行う。単一のステーションによる温度サイクリングも想定されている。
天然型ＴＡＱポリメラーゼによる最適なプライマー伸長温度は約７２℃であるが、切り離された７２℃でのインキュベーションが用いられない場合でも、ＰＣＲ熱サイクルにおいて伸長も生じることが知られていることに留意すべきである。アニーリング用チャンバーの温度は、塩濃度とプライマー配列に応じて、２０℃〜８５℃に設定することができるが、より好適には、５０〜８０℃、もっとも好適には、５５〜７５℃に設定することができ、また、変性用チャンバーは、二本鎖鋳型およびプライマーを完全に融解および解離させるために、通常、約９５℃に、好適には９６〜１００℃に設定されている。１分未満の完全なサイクルが容易に行われる。３０秒よりも短いサイクル時間が日常的に実際に行われてきた。
連動式の空気圧制御下にあるバルブを用いて、ＰＣＲ流体から、図３の検出用サブ回路へと流れを方向づける。したがって、空気圧制御素子には２つの主要な種類があることが理解できよう。これらは、外部にある制御可能な空気圧式作動連結管に接続するための空気圧式相互接続装置を、両方ともが備えたダイヤフラムを含む。２つの種類の空気圧制御素子は、構造において、液体注入口、液体排出口、および空気圧式相互接続装置から液体を分離している弾性体ダイヤフラムを含む点で類似しているが、バルブが、液体注入口と液体排出口を分離するダムを含むという点、およびダイヤフラムが引き延ばされるとチャンバーを満たして液体を追い出し、吸気圧によってチャンバーから空気圧式相互接続装置のなかに引っ込められると、液体を吸い込むようにするためにベローチャンバーが開くという点で異なる。このように、２種類の素子とも、自動化されたアッセイの工程を制御するために働く。空気圧式制御素子は、制御を簡易化するために連動式にすることができ、または、バルブロジックおよび空気圧式相互接続回路の設計によって、別々に操作できるようにすることもできる。このように、空気圧式相互接続回路は、しばしば複雑で、詳しい設計および実験が必要となる。
磁気捕捉ビーズによる検出
ここで、図３の概略図を見ると、検出用サブ回路３００が示されている。増幅産物は、まず、マグ混合用チャンバー内で磁気捕捉ビーズと混合される。これらのビーズは、使用時までマグビーズ貯留容器チャンバーに保存されている。ビーズは、アビジンまたはその他の捕捉剤で被覆されている。例えば、アビジンは、ビオチン結合プライマーおよび双尾型単位複製配列を捕捉する。抗ジゴキシゲニンは、ジゴキシゲニン結合プライマーおよび双尾型単位複製配列を捕捉する。
磁気捕捉ビーズは、一般的には、乾燥状態で保存され、増幅産物と混合する前に、再水和および洗浄バッファー用ポーチから来る再水和および洗浄用バッファーによって再構築される。ビーズを結合した捕捉剤は過剰量になっているため、伸長しなかったリガンド標識プライマーにも、伸長したリガンド標識プライマーにも、ビーズが結合する。再水和および混合は、バルブの制御下で行われる。
アッセイ法で好適な磁気ビーズのサイズは、約０．０１から５０ミクロン、より好ましくは０．５から１０ミクロン、および最も好適には０．８から２．８ミクロンの平均直径である。均一なサイズのビーズが好適である。例えば、Ｄｙｎａｌ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ（Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）、Ｂａｎｇ’ｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮ）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＰＡ）、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｅａｄｓ（Ｗｅｓｔ Ｗａｒｗｉｃｋ ＲＩ）、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ ＴＮ）、およびＡＧＯＷＡ（Ｂｅｒｌｉｎ ＤＥ）から適当なビーズを入手することができる。
磁気捕捉ビーズと増幅産物を混合した後、反応混合液を、図３に示すような検出用チャンバーの中に移す。流れの制御は、ベローポンプによって油圧式で提供されるか、または、磁場で（常磁性の）ビーズを移動させることによって操作される。検出用チャンバーは、図５および２６について説明されているように、単位複製配列上のペプチドハプテンタグに対する抗体によって被覆されている検査用パッド３０１を含む。検査用パッドストリップを含む検出用チャンバーの選択された実施形態のさらなる説明が、図２１および２２に記載されている。検出用チャンバーは、一般的には、検出結果を目視または機械で観察するための光学窓を備えている。
陰性対照反応において何らかの単位複製配列が検出されると、アッセイが無効になり、装置または試薬が汚染されていることが分かるため、任意で、陰性対照として別に検出用のチャネルまたはチャンバーが提供される。陽性対照も提供することができる。
検出用のチャネルまたはチャンバーの中で、磁気捕捉ビーズおよび捕捉された単位複製配列を、任意でリンスして廃液にした後、規定された配置をもつ検査用パッド３１０のアレイ、ストリップ、または基質に接触させる。マスクによって画定されたプラスチックの領域を低圧気体プラズマ処理することによって、例えば、ポリスチレン上に、装置を組み立てる前に捕捉抗体を固定するために検査用パッドを処理した後、抗体を塗布して乾燥させた。
好適な実施形態において、ビーズが、磁場によって、検査用パッドの表面に向かうと、抗体または捕捉剤のすぐ近くで出会うことになる。これによって、ハプテンと抗体の間の結合相互作用が促進されるため、長時間インキュベートする必要なしに非常に急速に結合が起きる。いったん結合すると、磁場が消え、すぐに検査用パッドを洗浄して、残留する未結合粒子を除去する。
実際には、増幅してからデータが提示されるまでの時間は４分未満である。磁場は、適宜、永久磁石および電磁石を含む。
別の好適な実施形態において、核酸単位複製配列を検出するための磁気ビーズ捕捉によって、複数の検査用パッドをもつ検出用ステーションの設計が可能になる。捕捉用のチャンバーまたはチャネルは、さまざまなハプテン：抗ペプチジルハプテン抗体対によって、または別のリガンド：捕捉剤対によって、「多重検出フォーマット」内で、それぞれがアドレス可能な検査用パッドのパネル（図２１参照）を含むことができる。検出結果を多重表示することによって、使用者にとっての利便性が向上する。
図４は、試料抽出用サブ回路１００、標的増幅用サブ回路２００、およびシグナル検出用サブ回路３００という３種類のマイクロ流体サブ回路がどのように単一のマイクロ流体カード４００に統合されているかを図示している。空気圧式制御シークエンスが流体を移動させるのに利用されている。空気圧シグナルがバルブに送られるか、またはダイヤフラムを直接上げたり下げたりすると、試料を隔離したままの状態で、流体に正圧または陰圧が伝わる。
また、図４には、それぞれがＰＣＲ混合物の中に１つ以上の別々のプライマー対をもつ増幅用チャネルの数を増やして、検出用ステーションで真の多重検出を行うために再結合することが可能であることも示されている。いくつかの実施形態では、６４個以上の増幅用チャネルが提供される。より好適には、１６個以下のチャネルで、必要とされる鑑別診断を行い、検出結果を目視によって利用可能な形で呈示するように選択される。バルブおよびポンプは、コマンド論理を単純化するために空気圧式連結管上で連動する。別の実施形態では、多数の試料を１つのカードで解析することができる。
通常、好適なマイクロ流体カートリッジは、以下の要素から構成されている：
ａ．試料注入ポート、核酸標的捕捉アセンブリチャンバー、溶解バッファー用チャンバー、洗浄試薬用チャンバー、溶離バッファー用チャンバー、再水和バッファー用チャンバー、ベント型廃液用チャンバー、ＰＣＲ流体および温度界面アセンブリ、マグ混合装置チャンバー、マグビーズ貯留容器、および検出用チャンバーを含み、さらに、
ｂ．試料ポートと溶解用チャンバーとを流体とバルブによって相互連結している第１のマイクロチャネル、
ｃ．溶解用チャンバーを核酸標的捕捉アセンブリチャンバーに、流体によって相互連結している第２のマイクロチャネル、
ｄ．溶解用チャンバーを溶解バッファーポーチチャンバーに、流体とバルブによって相互連結している第３のマイクロチャネル、
ｅ．核酸標的捕捉アセンブリチャンバーを洗浄バッファーチャンバーに、流体とバルブによって相互連結している第４のマイクロチャネル、
ｆ．核酸標的捕捉アセンブリチャンバーと溶離バッファーチャンバーとを、流体とバルブによって相互連結している第５のマイクロチャネル、
ｇ．核酸標的捕捉アセンブリチャンバーと少なくとも１つのＰＣＲ流体および温度界面アセンブリとを、流体とバルブによって相互連結している第６のマイクロチャネル（複数の並列アセンブリは図４に示されている）、
ｈ．少なくとも１つのＰＣＲ流体および温度界面アセンブリと、少なくとも１つのマグ混合装置チャンバーとを、流体とバルブによって相互連結している第７のマイクロチャネル、
ｉ．少なくとも１つのマグ混合装置チャンバーと再水和バッファー用チャンバーとを流体とバルブによって相互連結している第８のマイクロチャネルであって、第６のマイクロチャネルが、再水和バッファー用チャンバーとマグ混合装置チャンバーの間に置かれた磁気ビーズ貯留容器をさらに含むマイクロチャネル、
ｊ．マグ混合装置チャンバーと少なくとも１つの検出用チャンバーとを、流体とバルブによって相互連結している第９のマイクロチャネル、
ｋ．核酸標的捕捉アセンブリチャンバーとベント型廃液用チャンバーとを、流体とバルブによって相互連結している第１０のマイクロチャネル、
ｌ．検出用チャンバーとベント型廃液用チャンバーとを、流体とバルブによって相互連結している第１１のマイクロチャネルを含み、かつ、
ダイヤフラム式バルブおよびベローチャンバーを含む複数の内部空気圧式制御素子であって、外部の制御可能な空気圧作動連結管に接続するための空気圧式相互接続回路を備えた複数の内部空気圧式制御素子をさらに含む一体型マイクロ流体カートリッジ。
軽微な等価の改変、例えば、第４と第５のマイクロチャネルの相互連結（すなわち、それによって、溶解バッファーと溶離バッファーが、核酸標的捕捉アセンブリチャンバーへの経路を共有する）は、装置の性能に機能的な効果を与えないであろう。同様に、第１０と第１１のマイクロチャネルは、廃液用チャンバーへの入り口を共有することができる。ＰＣＲ流体および温度界面アセンブリのレイアウトを大きく変えることも可能であり、後述されている。これらは、カートリッジ上に界面反応用チャンバーをもつ単一または複数の界面を含む。明らかに、例えば、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成させるときに使うための、核酸捕捉物アセンブリと増幅アセンブリとの間に置かれるチャンバーなど、他のマイクロチャネルおよび機能性を加えることもできる。その他の明らかな改変には、ＰＣＲ流体および温度界面アセンブリの多温度界面を除去することにより、等温増幅プロトコール用のカートリッジを再構成することが含まれる。
より一般的には、本カートリッジは、以下の手段を含む：
ａ．生体試料から核酸を抽出するための手段、
ｂ．単位複製配列を合成するための手段、
ｃ．単位複製配列を検出するための手段、ただし、
生体試料から核酸を抽出するための手段は、固相によって生体試料から核酸を抽出するための流体サブ回路を含み、単位複製配列を合成するための手段は、機械的な混合素子をもたずに、単位複製配列を合成するための流体サブ回路を含み、かつ、単位複製配列を検出するための手段は、１個の一体型使い捨て部材の中に検出用チャンバーと光学窓をもつ流体サブ回路を含み、また、１個の一体型部材の流体工学を、ダイヤフラム式バルブおよびベローチャンバーを含む複数の空気圧式制御素子であって、外部の制御可能空気圧作動連結管に接続するための空気圧式相互接続回路を備えた複数の空気圧式制御素子によって制御することができる。
自動化または半自動化された構成において、マイクロ流体カートリッジは、装置の中に挿入される（図示せず）。この装置は、マイクロ流体カートリッジの複数のバルブ素子およびベローダイヤフラムを接続し、制御するための空気圧式相互接続ポートおよび回路をもつ、カートリッジ外の空気圧作動型連結管を含む。この装置は、バルブ素子およびダイヤフラム素子の空気圧式作動を制御するよう設計されたバルブ論理プログラミングを用いるマイクロプロセッサによって稼働する。この装置は、さらに、磁気マイクロビーズ試薬を操作するために、任意で、オフデバイスの磁場を有し、磁石が、任意で、可動式の台車に取り付けられている。
陽性標的シグナル分子検出複合体が図５に描かれている。図５の分子検出複合体５００は、検査用パッド５０２の上に固定されている常磁性ビーズ５０１を図示している。ビーズと捕捉抗体５０３の間のつなぎは、双尾型単位複製配列５０４で構成されているが、説明のため、この場合には、ペプチジルハプテン６でタグ付けされている第１プライマー５０６と、ビオチン５０８でタグ付けされている第２プライマー５０７を持っている。常磁性ビーズは、結合アビジン５０９で被覆されている。
図示されているように、検査用パッド３０１上に固定されている抗体が、双尾型単位複製配列を捕捉する。ビオチンリガンドが、アビジン被覆ビーズによって捕捉され、次に、磁気ビーズまたはその他のレポーター基が検査用パッド上に固定される。数マイクロリットルの試薬に存在するような十分な数の固定ビーズがあれば、検査用パッドが目に見えて着色される結果になる。当業者には自明であろうが、磁気ビーズは、各検査用パッド上に固定されたときに検出できるようにするため、ＱＤｏｔｓ、色素、ＲＦＩＤなどの標識補助剤を用いて調製することができる。
このように、ビオチンの尾部をもつプライマーで第１の末端を標識され、ペプチジルハプテンの尾部をもつプライマーで第２の末端を標識されている単位複製配列が、検査用パッドにつながれると、「陽性検出結果」がもたらされる。磁場が解除された後、磁気ビーズがつながれている、これらの検査用パッドは、その種類のペプチジルハプテン尾型単位複製配列について陽性の結果を示している。磁気ビーズがつながれていない検査用パッドは、ペプチジルハプテンでタグ付けされた各単位複製配列について、陰性の結果を示している。ペプチジルハプテンの種類は分かっているのであるから、抗体は非常に特異性が高いのであるから、また、検査用パッドは、特定のプライマー配列を検出する役割になっているのであるから、検出できた事は、検査用パッドに対応する特定の核酸配列の陽性結果と解釈することができ、推論することによって、病原体または発病状態の診断となる。
磁気ビーズを用いた陽性検出結果は、図６に示すように、簡単に目視にて検出されるため、本実施形態の医療現場で使用するアッセイ装置またはキットにとって顕著な利点となる。
陰性対照では、一般的には、汚染されていなければ双尾型単位複製配列は存在しないはずであるから、すべての分析物に対応する検査用パッドは発色しないままである。陽性対照として、既知の鋳型を増幅用チャンバーの中に、陽性対照として取り込むことができる。抗ペプチジルハプテン抗体によって区別が可能であるため、陽性対照を内部対照とすることも可能である。
図６は、並列検出チャンバーに置かれた複数の検査用パッドストリップの写真である。各ストリップは、以下の腸内の病原体または感染因子について選択されたプライマー対から生成したさまざまな単位複製配列による結合結果を表している：チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（Ｓａｌ））、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（Ｃａｍｐ））、Ｓｔｘ−１（志賀毒素１）、Ｓｔｘ２（志賀毒素２）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｓｈｉｇ））、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７Ｈ７（１５７Ｈ７と表記される）、および陽性対照として非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。陽性反応は、器具を使用しなくても明瞭に目視することができる。
図６に示されている検出ステーションは、光学窓の中に並行して置かれた７つの垂直な多重検出チャネルから構成されている。各チャネルは、７つの検査用パッドストリップを含み、各検査用パッドは約２×０．５ｍｍである。検出チャネルの斜視図が図２１に示されている。この写真で明らかなことは、図５に描かれた分子構造の形で検査用パッドに結合した磁気ビーズの集団によってもたらされた視覚的な明瞭さである。
さらに、本発明に係る一体型で自動式のマイクロ流体装置の設計には、個々のマイクロ流体の要素または部材を開発および改善することが必要であった。これらは、マイクロ流体チャネル、チャンバー、バルブ、バルブツリー（ｖａｌｖｅ ｔｒｅｅ）、フィルター、捕捉用フィルター、隔離用フィルター、空気圧式連結管、ブリスターパック（試薬ポーチ）、廃液隔離用チャンバー、衛生ベント、ベローチャンバー、ベローポンプ、熱交換界面、インライン混合装置、オンカード配線、光学窓、検査用パッド、および乾燥試薬のマイクロチャネルへの蒸着などがある。また、プログラム可能な界面要素には、空気圧式制御連結管、光学走査装置、および磁気ビーズ用の可動式アンダーキャリッジも含まれる。
マイクロ流体チャネルは、好適には、長方形の断面をもつ。壁の粗さは、製造方法によって決まる。好適な製造方法は、流体および空気圧式回路を含む層を構築するために薄板を積層すること、レーザーまたはその他の裁断装置でステンシル裁断することを含む。射出成形によって形成された層から構築されたマイクロチャネルは、より丸みを帯びたチャネルの外形、およびそれぞれの「ビア」上で同じ半径を有することができる。射出成形された部分の内部チャネルもいくらか滑らかさが強い。
マイクロ流体の流動様式では、結合溶媒の仮想壁が、固体基質上に立ち上がるが、仮想壁の厚さは、流体接触表面を不動態化することによって、一部を薄くすることができる。
図７は、バルブ中の２つのビアの間にある相互接続ポートを開閉するための空気圧式制御ダイヤフラムに依存する、本発明の装置の空気圧式オン−オフバルブの平面図と断面図である。ダイヤフラムは、一般的には、２つの流体ビアの間のダムの上に載っている弾性素材であって、真空によって引っ張られると、テントのように大きく広がって、流体がその下を流れることができるようになる。逆に、正圧下では、ダイヤフラムは、ビアの口に押しつけられて、流体の流れを阻止する。ダイヤフラムの上方では、ビアが、装置の別の層に内蔵されている空気圧式相互接続によって、バルブをマイクロ流体チャネルに連結させるが、この相互接続は、アッセイを制御するために用いられる複合空気圧式連結管のアームに相互接続するために作動中はプラグをつながれている。
図７ＢおよびＣは、図７Ａのオン−オフバルブの断面図であり、その動き方を示している。インレットおよびアウトレットビアの上に置かれた弾性体ダイヤフラムが流体の流れを制御する。この実施形態では、ダイヤフラムが引っ張り上げられると、流体が、ダムを越えて入り口から出口に流れる。ダイヤフラムが押さえつけられると、流体の流れが中断する。ダイヤフラムは、両面接着層によって、プラスチック製の層の間の適当な位置に保持されている。
図８は、流体を分配するためのバルブの配列を図示している。バルブツリーの流体側、および側枝になっている空気圧式制御装置は、通常、それぞれ、ダイヤフラムの上と下の別々の層に内蔵されている。
バルブおよびポンプに圧力および真空を適用するためのプログラム命令は、装置を操作するためのバルブ論理を設計することを必要とし、その結果、各装置は、実際に機械的発明として自立したものとなる。オフデバイスのマイクロプロセッサは、装置の空気圧による操作を制御するための命令セットを用いてプログラムされる。マイクロプロセッサ、結合しているソレノイド、および正および負の空気圧の供給源は、オフデバイスで、マイクロ流体装置を挿入する関連解析機器上に置かれている。
図９は、衛生フィルターを、バルブの中のダイヤフラムを制御する空気圧チャネルとともにインラインで有する改変されたオン−オフバルブの平面と断面を図示している。この実施形態においては、ダイヤフラムが機能しなくなった場合に、装置の流体内容物によって空気圧連結管が汚染されるのを避けられる。図９Ｂは部分図であるが、疎水性膜の下側に流体トラップを含んでいる。これらの膜は、気流は許容されるが、水性液はフィルターのところで止まってしまうため、滅菌処理に使用される。フィルター膜の孔径は、０．４５ミクロンであってもよく、滅菌処理に有効であろう。
図１０は、輸送中および使用前にオンボードで試薬を保存するために用いられる試薬ポーチを含むブリスターパックの断面図を描いたものである。試薬は、製造時に充填され、空気圧制御下、アッセイの間に正しい順番で放出される。試薬ポーチと空気ポートの間にある変形可能な膜によって、給気中に入り込んだ物質によって装置が汚染される可能性を防止できる。空気の圧力が、変形可能な膜の上に蓄積すると（図１０Ａ、Ｂ、Ｃの順で）、試薬ポーチにかかる下向きの圧力によって、試薬ポーチの凸部が、ポーチの下側に挿入されたシムの開口部を通るようにさせられる。このポーチは、開口部に突き出す場所以外は、接着剤でシムに接着されている。裁断用の刃またはシェブロンが開口部に存在するため、空気圧によってポーチが変形して、刃先と接触するようになり、それによりポーチが破裂して試薬内容が放出される。
これらの装置の設計全体にわたって、汚染された廃液が装置の外に出ないよう、二重の保護が提供されている。図１１で説明されているように、廃液隔離用貯蔵容器に流入した流体廃棄物は、まず、繊維質で吸水性のパッドに接触する。パッドが膨張するにつれて、パッドを外側のベントから隔離している弾性体ダイヤフラムまたは変形性フィルムが動く。変形性フィルムがうまく機能しない場合には、ベントビアに取り付けられている疎水性フィルターが流体の漏れを止める。
パッドは、使い捨ておむつなどの吸水性製品で見られるような材料と同じ材料でできている。吸水性の芯には、一般的に、不織性であってもよい繊維ウェブ、天然繊維または合成繊維のエアレイド（ａｉｒｌａｉｄ）ウェブ、またはそれらの混合物がある。このような吸水性製品で使用される繊維ウェブは、大量の廃体液を貯蔵するために、通常、「ハイドロゲル」、「超吸収性」、または「親水コロイド性」の素材と呼ばれる一定の吸収性ゲル化物質もしばしば含む。これらの材料は、毛細管力または浸透力、または両方を組み合わせた力によって吸水する（米国特許第４６１０６７８号および第５９０６６０２号参照、これらは、参考として本明細書中に援用される）。繊維性材料からなる吸水性のおむつまたはパッドを、任意で、乾燥剤により処理する。繊維性パッドは、一般的にはセルロース性である。乾燥剤は、硫酸カルシウム、石こう、塩化カルシウム、およびシリカゲルなどである。
液体試薬がマイクロ流体アッセイチャネルに導入されるにつれて置き換わる空気はすべて、疎水性で、気体には透過性であるが液体は透過させないフィルターを備えた衛生ベントを通って装置から排出されるため、作業者は、生体有害物質による被曝から防御される。
グアニジウム塩、アルコール、および界面活性剤は、廃液用チャンバーの中では殺菌剤として機能する。殺菌剤を、上記したもの併用することもできる。適切に設計されれば、この装置は、特別な注意を要することなく、使用後廃棄することが可能である。
図２７のマイクロ流体装置の構造は、試料が一旦装置内に置かれると、作業者がその内容物に被曝することが防止できるよう工夫されている。この設計によって、医療または環境を検査するための一回使い切り型で使い捨て可能な装置が確保される。試料ポートを覆う任意の密閉固定装置は、試料を挿入して閉じた後、安全に取り扱うために溶解バッファーで洗い流す。
図１２Ａは、バルブ制御下に空気圧式作動チャネルを備えたベローチャンバーの概略図である。ベローチャンバーには、弾性体膜が備え付けられており、吸気圧下で、流体進入チャネルを介して流体を引き込む。図１２Ｂは、稼働中のベローチャンバーの２つの断面図を示している。上図では、空気ポートに向かう真空下で弾性体ダイヤフラムが引き上げられて、流体を装置の中に引き込んでいる。下図では、ダイヤフラムが押しつけられると、流体がチャンバー本体から押し出されている。また、ベローチャンバーは、ポンプとしても使用することができ、正圧の吸い込みヘッド圧力を送り込む。チェックバルブと組み合わせて使用すると、一方向性のポンプ流が生じる。
本発明者らは、これらのベローチャンバーを、ＰＣＲにおけるように反応用チャンバーとして使用できることを発見した。熱サイクリングは、ダイヤフラムが加圧状態と真空状態を交互に繰り返すと、流体がチャンバーからチャンバーを行ったり来たりするよう、流体によって相互接続され、別々に温度制御されている一対のベローチャンバーによって行うことができる。この交互の流れは、マイクロ流体装置上でのＥＬＩＳＡ反応に利用されたように、混合用装置としても利用することができる。
高い熱伝導率係数をもつ薄積層状フィルムからベローチャンバーの基部を形成することによって、本発明者らは、それらフィルムが、優れた熱交換装置を作り出し、小型パッケージの中で迅速な熱サイクルを可能にすることを発見した。好適な実施形態では、約１Ｗ／ｍ−°Ｋよりも高い熱伝導率を有するプラスチックフィルムによって装置の下側が熱源から分離されている
図１３は、本発明のＰＣＲ流体および温度界面アセンブリとして構成されている一対のベローチャンバーの平面図である。２つの固定温度界面を利用するが、その１つがそれぞれのベローチャンバーの下にあって、ＰＣＲ用の流体と温度の界面を形成している。１個のバルブだけが必要である。左側と右側にある空気圧作動装置の制御下で、流体がチャンバー間を行ったり来たりする。第１のチャンバーに進入した流体は、変性温度条件に遭遇する。第２のベローチャンバーに流れ込むと、温度は、プライマーとアニールさせるために低下している。ポリメラーゼを添加すると伸長が起き、変性条件、すなわち「融解」条件下で鎖が再び分離するまで伸長は続く。２つのダイヤフラムで圧縮と希薄化を交互に行うことによってサイクルが繰り返されて、チャンバー間で周期的な交互の流れが生じる。サイクルを必要回数行った後、増幅された物質がチャンバーから検出ステーションに排出される。
ＰＣＲ用の反応容器としての２つのベローチャンバーの操作を、図１４の断面図を参照して説明する。図Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに図示されているように、この処理には４つの工程と、１、２、および３と番号が付けられた３つのマイクロ流体要素がある。マイクロ流体要素１はバルブである。要素２および３はベローチャンバーである。ベローチャンバー３は終端である。すべての要素が流体で相互接続している。
工程Ａでは、バルブ１およびベロー２が陰圧下にあるため、このバルブは開いていて、流体が第１のベローチャンバーの中に引き込まれている。弾性体ダイヤフラムが、流体と空気圧連結管を分離していることに留意されたい。これは、試料をプライマー対と混合して変性するＰＣＲの第１工程に相当する。工程Ｂでは、バルブが閉じており、システムを密閉している。ベローチャンバー２は、正圧下で空になっており、ベローチャンバー３は、陰圧下で一杯になっている。これは、アニーリングと伸長に相当する。工程Ｃでは、第１回目の産物がベローチャンバー２に戻って来て、そこで再び鎖の分離が起こる。工程ＢとＣを必要なサイクル数繰り返す。その後、バルブ１を開き、ベローチャンバー２および３を加圧して、流体をチャンバーから排出させる。加熱することにより、対流混合が生じる。
図１５は、上記の変法を描いている。試料が左側から入る。ここで流体の正味の流れは左から右である。産物は、右側にある検出ステーションに排出される。２つのバルブが用いられる。上図と同じように、２つのベローチャンバーが、ＰＣＲ反応の流体および温度の界面として機能する。
図Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥに図示されているように、この処理には５つの工程と、１、２、３、および４と番号が付けられた４つのマイクロ流体要素がある。マイクロ流体要素１および４はバルブである。要素２および３はベローチャンバーである。ベローチャンバー２は、核酸の融解温度に相当する固定温度になっており、ベローチャンバー３は、ＰＣＲにおいてアニーリングおよび伸長に必要な温度に相当する固定温度になっている。すべての要素がマイクロチャネルにより流体で相互接続している。ＰＣＲ用流体の総容量は約５０μＬである。
工程Ａでは、バルブ１およびベロー２が陰圧下にあるため、このバルブは開いていて、流体が第１のベローチャンバーの中に引き込まれている。弾性体ダイヤフラムが、流体と空気圧連結管を分離していることに留意されたい。これは、試料をプライマー対と混合して変性するＰＣＲの第１工程に相当する。工程Ｂでは、バルブが閉じており、システムを密閉している。ベローチャンバー２は、正圧下で空になっており、ベローチャンバー３は、陰圧下で一杯になっている。これは、アニーリングと伸長に相当する。工程Ｃでは、第１回目の産物がベローチャンバー２に戻って来て、そこで再び鎖の分離が起こる。工程ＢとＣを必要なサイクル数繰り返す。工程Ｄでは、流体がベローチャンバー３に輸送される。そして、バルブ１３を開き、ベローチャンバー２および３を加圧して、ＰＣＲ流体から流体を排出させる。バルブ４から排出されるとき、図３および４に記載されているように、反応混合液を磁気ビーズと混合する。
図１７は、融解温度、伸長温度、およびアニーリング温度に相当する３種類の固定温度ステーションをもつ、３つのベローチャンバーという実施形態を示している。伸長させるのに好適な温度はアニーリング温度よりも高いため、別の反応容器で提供することができる。図１５におけるように、反応混合液は、高温側を横断することによって、ＰＣＲ用流体を排出させることなく、右側にあるアニーリング用チャンバーまたは容器から出て行く。
図１８は、３種類の固定温度ステーションをもつ、３重ベローチャンバーという実施形態を示している。この構成では、正圧と陰圧を正しく組み合わせてベローダイヤフラムに加圧することによって、流体が選択されたチャンバーへ方向性をもって流れるのを制御することができるため、ベローチャンバーの間にバルブを必要としない。ＰＣＲサイクルは、検査用流体が抽出（下）から、図の頂上に描かれている融解温度容器に直接入って来ると開始する。鎖を変性し、プライマー対および試薬を相互接続マイクロチャネル内で溶解し、乾燥した後、反応混合液をアニール用チャンバーに向かわせる。オンボード型ＲＴＤ、熱電温度計、またはレーザー温度測定法によって測定して、アニーリング温度に到達した後、反応混合液を、伸長温度用のチャンバーまたは容器に移して有効時間置き、このサイクルを繰り返す。サイクル時間は、通常、１分間よりも短い。すべてのチャンバーが相互接続されているため、融解からアニール、アニールから伸長、および伸長から融解までの流れはすべて、不適切な温度条件を通過することなしに生じる。必要なサイクル数を完了したところで、反応混合液を冷却すると、それが、バルブ付きのマイクロチャネル（左下）を通って検出装置に排出される前に、アニール用チャンバーの中で二本鎖産物が形成される。これらの処理工程はすべて、ベローおよびバルブのダイヤフラムに結合している空気ポートによって制御されている。
図１８記載の実施形態は、ＰＣＲ増幅の「ホットスタート」プロトコールに役立つ。標的ＤＮＡは、抽出サブ回路から増幅サブ回路に進入する。図１６のＰＣＲ流体工学法では、試料は、まず、マグネシウム塩、および増幅させるのに十分な量の核酸塩基の三リン酸を含む乾燥プライマーミックスと接触する。これらの試薬は、任意では、手動のスポッティングまたは自動式のプリンティング装置によって、その場で乾燥することができ、また、湿潤化、不動態化、および再水和化を促すために、例えば、ウシ血清アルブミン、トレハロース、またはＰＥＧ３０００などの基質を含むことも可能である。
プライマーを含む標的混合物は、バルブ論理制御下で、直ちに変性用チャンバーの中に向かわせる。ここで、標的ＤＮＡが遊離一本鎖鋳型に解離するため、反応混合液がアニール用温度に移送されると、適当な相補性をもつプライマー−標的ハイブリッドが形成される。次に、この混合液は、ポリメラーゼが乾燥した状態で置かれているプライマー伸長用チャンバーに進入する。ポリメラーゼが再水和化すると、プライマー伸長が開始する。これが、「ホットスタート」法で、生成物の収率と特異性が向上すると、以前から別の研究者によって示唆されている方法である（Ｄ’Ａｑｕｉｌａら、１９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：３７−４９；Ｃｈｏｕら、１９９２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０：１７１７−１７２３；Ｋｅｌｌｏｇｇら、１９９４．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：１１３４−１１３７）。
その他のＰＣＲ用流体工学的構成には、流体が円形の経路に沿って流れて行くと、熱サイクルされるようになっている、２つの温度ブロックにまたがる円形のマイクロチャネルなどがある。等温増幅プロトコールのための等温設計も考慮されている。
図１９は、マイクロ流体混合装置を図示している。マイクロ流体チャネルの中での乱流混合には制限がある。マイクロ流体流動様式における混合は、マイクロチャネルの高さを、対象分子の拡散経路の長さに近い寸法に短縮することで行うことが可能になる。一般的な溶質にとって、この寸法は、２５ミクロンの範囲（約１ｍｉｌ）である。したがって、図１９に示されているように、例えば、チャネル内で段階的に短縮することも、拡散混合を行うのに十分な寸法で流体流と接触させるために利用することができる。
図２０Ａは、例えば、マイクロチャネルなど、マイクロ流体装置の内部流体接触面を不動態化させる方法を図示している。適当な表面活性不動態化剤には、例えば、血清アルブミン、ポロキサマー、ポリビニルピロリジノン、ＰＥＧ化界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、およびこれらの混合物がある。場合によっては、シラン被覆を疎水性物質として使用する。また、例えば、「Ｔ」字型の所で、流体をＴ字の一方のアームだけに流体を向かわせるなど、疎水性材料をマイクロ流体の分岐点に適用して、水性溶液が通るのを阻止することも可能である。
図２０Ｂは、マイクロ流体装置の最終的に組み立てる前に、チャンバーまたは貯留容器の内側で再構成させるのに適した基質に磁気ビーズを沈着させる処理工程を示したものである。ビーズの再水和は、通常、再水和バッファーを用いて行われる。
図２０Ｃは、ＰＣＲ流体アセンブリの一部であるか、またはその近傍にある増幅チャンバーの中に、「ＰＣＲ混合物」が設置されていることを示している。乾燥混合物は、一般的には、プライマー、マグネシウム、ｄＮＴＰ、およびポリメラーゼを含み、任意で、界面活性剤を含む。溶離バッファーを用いて、ＰＣＲ混合物を再水和することができる。ＰＣＲ流体の対流熱による流体混合は、乾燥ＰＣＲ混合物の再構成に役立つ。同様に、別のチャンバーに、逆転写酵素およびその関連補助因子を乾燥試薬として置くことができる。その他の酵素または試薬もこの方法で使用することができる。
図２１は、その底が、マスクされ、抗体２１０３を固定するためにパッド２１０２が形成されるように処理されている、幅広のマイクロ流体チャネルの形状にされた検出用チャンバー２１００またはステーションを示している。このチャンバーの天井は、光学窓２１０４を形成している。２１０１における流体流量中で検出用チャネルに進入した磁気ビーズは、ビーズを抗体に近づけ、チャネルを通って移動させる磁力を受ける。初期の洗浄は、バッファーで洗浄しながら、チャンバーの天井または床に対してビーズを保持することによって行うことができる。ビーズを検査用パッド上に固定した後、遊離したビーズをチャンバーから除去し、エンドポイントを明瞭に見るのを助ける必要があるときは、さらなる洗浄を行うことができる。非結合のビーズと反応用材料は、磁気を利用して廃液に移動させるか、洗浄して廃液に移動させることができる。
図２２では、検査用パッドの配置を示している。検査用パッドは、本明細書に記載された方法の検出工程の特徴である。検査用パッド２２０１および２２０２は、例えば、アッセイを行うための陰性および陽性の検出領域を構成する。検査用パッド配列２２０３は、直線状のバンド型またはストリップ型の配列で、図２１に示したものと似ていなくもない。検査用パッド配列２２０４は、それぞれが独自の捕捉剤で処理される正方形の検査用パッドを長方形に配列したものである。検査用パッド配列２２０５は円形で、インクジェット印刷に適合させてある。検査用パッド配列２２０６は、容易に解釈できる半定量的エンドポイントを表示するために、勾配をつけた捕捉剤で処理される。
検査用パッドは、その内側に生物活性捕捉剤を固定している縁部が結合している領域を共通して持っている。すべてのリストではないが、捕捉剤は、抗体、抗抗体、抗ペプチジルハプテン抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、もしくは抗原などのタンパク質、または、アプティマー（ａｐｔｉｍｅｒ）、糖鎖抗原、ムコ多糖、もしくはオリゴマーなどの非タンパク質であってもよい。捕捉剤は、変性ウイルス抗原および微生物抗原を一般的に、ならびに細胞成分もしくは全細胞を一般的に含むことができる。
検査用パッドは、必ずしも不透過性の基質ではなく、性質が多孔性または繊維性のものであってもよいことに留意されたい。磁場における分析物の流体経路は、例えば、左右または前後に、検査用パッド領域を横切ったり、通過したりすることができる。分子レベルでの検査用パッドの構造は、二次元平面で表すこともできるが、本質的には三次元である。
検査用パッド用の固体基質には、オレフィン、またはその他の熱可塑性物質、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、酢酸ビニルと塩化ビニルの共重合体、およびポリアミドなど、ならびに、ガラスなどの無機物質などがある。ニトロセルロース、ナイロン、ヒドロゲル、およびポリエチレンなど、一定の繊維性または多孔性の支持体も、検査用パッドとして利用することができ、集合を容易にするために捕捉剤で前処理することができる。捕捉剤の結合を促進するために、架橋タンパク質が用いられることがある。乾燥させることでも、捕捉剤の不可逆的結合が促進される。これら以外の捕捉剤には、当技術分野において知られているようなプロトコールの変更が必要となるかもしれない。
捕捉剤を吸着させる前にプラスチックを前処理する好適な方法は、低圧気体プラズマ処理である。表面を純粋な酸素または窒素に暴露すると、活性型のヒドロキシル化およびカルボキシル化された基質層、または活性型のアミノ化およびニトロオキシル化された層がそれぞれ生じる。アルゴンを用いることもできる。一つの実施形態において、ポリスチレンプラスチックが、捕捉剤を固定するための基質として用いられる。マスキング、その後の気体プラズマ処理を用いて、検査用パッドとして指定された領域を活性化する。捕捉剤を塗布し、その場で乾燥し、マスクを除去する。抗体を捕捉剤として用いる場合は、手動または自動プリンターで塗布した後、乾燥およびブロッキングを行う。これら以外の捕捉剤には、当技術分野において知られているようなプロトコールの変更が必要となるかもしれない。
表面活性化技術が、Ｃｈａｎら（１９９６）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２４：１−５４において、およびＧａｒｂａｓｓｉら（１９９８）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｒｆａｃｅｓ−Ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ｐｐ．２３８−２４１）において、ならびに米国特許第６９５５７３８号に総説されているが、この特許文献は、ポリマー表面の親水化および官能基化について記載しており、その全体が参考として本明細書中に援用される。
検出用チャンバーの中で複数の捕捉用パッドを使用すると、結果の多重化、すなわち多重検出用チャンバー内で多重検出を行うことが可能になる。好適な実施形態では、視覚的に表示することが使用者にとって便利であるが、視覚的には区別できないほど小さなアレイ上の陽性結果を検出するための機器も想定されている。目に見えない検出結果を機器によって検出することも本発明の範囲に含まれる。
当然ながら、マイクロ流体装置は、任意で、ＲＦＩＤ、マイクロチップ、またはバーコード標識を、解析データの処理を補助するものとして含むことができる。
上記した実施形態を改変したものを以下に説明する。
図２３は、２つの相互接続している固定温度チャンバー、すなわち、左側にアニーリング用チャンバー（５０℃）、および右側に変性用チャンバー（９６℃）をもつ、任意選択的な二重増幅アセンブリを図示している。図１５にあるように、それぞれが、連続した自動化ベローチャンバーである。ポリウレタンの柔軟な弾性体ダイヤフラムを用いて、真空下および加圧下で流体を前後に引っ張る。一方のチャンバーに圧力を加えながら、もう一方のチャンバーに真空を適用すると、チャンバーからチャンバーへのほぼ定量的な流体の移動を行うことができる。相互接続したマイクロチャネル内で混合を行う。各チャンバー内で、定点で温度を調節することによって、それぞれの時間に流体が、一方のチャンバーから他方のチャンバーに移動してまた戻り、変性、アニーリング、および伸長のサイクルが完了する。
図２４は、連続してＰＣＲが行われるよう、２つの直列したＰＣＲ流体および温度界面アセンブリをもつ概略図を示している。アッセイ１（左側）における第１回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を、相互接続バルブを通ってアッセイ２（右側）に移送し、そこで、新鮮な試薬とプライマーを用いて、再びＰＣＲを行う。これは、例えば、非対称ＰＣＲ、すなわち、第１のプライマー対の産物を、次に、第１の反応の単位複製配列の３’末端の近くにある増幅配列から選択された少なくとも１つのプライマーからなるプライマー対によって増幅する半ネスティドＰＣＲを行うのに有用である。
本発明の双尾型単位複製配列は、第２回のＰＣＲの後に得られる。
第１回目の増幅で用いられたプライマーの一方だけがタグ付けされているが、第２回目のＰＣＲで使用される第３のネスティドプライマーが別のタグを持っている。その他の変法も可能である。
ここで、図２５を見ると、標的捕捉物アセンブリからの溶出後、「Ｔ」字の所で試料経路が分岐しているのが分かる。「ｃＤＮＡ合成用流体アセンブリ」が、分岐した一方のアームの中に置かれている。このオプションでは、２つの並行した経路が、異なった解析機能に用いられる。一方の経路は、試料のＤＮＡ含有量を分析するのに用いられ、ＲＮａｓｅで処理されているかもしれない。もう一方の分岐は、当業者に周知されているいくつかの先行技術のいずれかの方法であるが、通常は、逆転写酵素の一つを含む方法によって、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのマイクロ流体要素に対するものである。そして、このｃＤＮＡが、ＰＣＲによって解析されるのである。
図２６では、フィコエリトリン−アビジンレポーター複合体２６０１を含む分子検出複合体２６００が、抗体２６０３、および双尾型単位複製配列２６０４によって、固体基質２６０２につながっているところを示している。第１のプライマー２６０５は、固定された抗体２６０３に相補的なペプチジルハプテン２６０６に結合している。第２のプライマー２６０７は、ビオチン２６０８に結合しており、このビオチンを用いて、固体基質に免疫捕捉される前に、レポーター複合体２６０１を捕捉する（したがって、「フック」効果が避けられる）。
この図から、ユニークな分子検出複合体の変異体を容易に構築できることが分かる。簡単に入手することができ、かつ強い蛍光シグナルを有するため、ここでは、フィコエリトリン−アビジンレポーター複合体（２６０１）が選択された。しかし、数多くの他のレポーター基または粒子で代用することができる。
共通の要素は、第１プライマー上にペプチジルハプテンをもつ双尾型単位複製配列、検査用パッドなどの検出用表面に固定された相補的な抗ペプチジルハプテン抗体、および第２のプライマー上で相補的リガンドに結合している何らかの種類のレポーター基である。
免疫捕捉するために抗エピトープハプテンを使用すると、高度の抗体結合特異性と、第１プライマーに結合することができるペプチドであるペプチジルハプテンタグの無限に近い変異性を利用できる利点がある。これにより、結合プライマー対を用いた増幅によって単位複製配列のライブラリーを構築した後、これらのライブラリーをバイオアッセイで調べることが可能になる。
レポーター基には、蛍光プローブ、ビオチン、ジゴキシン、ペプチド、クエンチャー、タンパク質、ビーズ、粒子、マイクロスフィア、磁気マイクロビーズ、タンパク質などがある。
図２７は、患者をケアするための完全に内蔵型で独立型の一回使い切り解析装置の概念的な見取り図である。Ａでは、試料スワブが、試料ポートの中に挿入されている。Ｂ、Ｃ、およびＤでは、どのようにして試料が完全に隔離できるのかを説明するために、スワブの離脱用の切り込みを利用しているところが描かれている。スワブの柄を折り取った後、係止用のカバーをカバースライドの中にスライドさせて、試料ポートを密閉する。このカバーはロックされて、力と鋭利な道具がないと再度開くことができない。そして、ボタンを押して、アッセイを開始させる。手動式と自動式のものが想定されている。アッセイの最後に、検出結果が光学窓に表示される。検出結果は、本発明の分子構築物を含むが、それに限定されない。
任意では、係止カバーが正しい位置に置かれると、カバーの下側に殺菌剤が溢れるため、特別な注意をしなくても、装置を完全に使い捨てにできる。本発明者らは、鼻腔用スワブおよび直腸用スワブ、およびその他の生体標本を解析するために、この種の装置を考えている。
図２８は、図１〜４で使用されている図示記号の説明である。
温度制御
本アッセイ法の開発初期には、変温制御される単一のブロックＴＥＣが用いられた。この実施形態においては、ペルティエチップ（Ｐｅｌｔｉｅｒ ｃｈｉｐ）を用いて、ＰＩＤ制御装置の制御下で、適当な大きさのヒートシンクを往復する熱移動を制御する。増幅用のチャネルまたはチャンバーが迅速に反応するよう、マイクロ流体装置の熱質量と熱拡散障壁、およびそれに付いているヒートブロックを小さくして工夫した。そして、二重固定温度ブロックをＰＣＲプロトコールで使用した。増幅に必要とされる量が比較的少ないため、増幅用チャンバー内での混合は、流体の熱対流によって行われる。機械的な混合素子は必要ない。
本発明のその他の態様は、試料調製およびプライマー設計に関する。
試料調製
試料からの核酸抽出は、臨床アッセイ法を開発する上で非常に重要である。困難な標本には、大便と痰がある。血液も、ヘモグロビンが、増幅に用いられるポリメラーゼの活性を阻害するため、問題が多い。
しかし、本発明者らは、ａ）臨床試料を事前にろ過して、目に見える粒子を取り除き、ｂ）グアニジンチオシアネートなどのカオトロピック剤で標的病原体を溶解し、ｃ）核酸を捕獲し、ｄ）核酸捕獲部材上で連続洗浄した後、ｅ）増幅するため、ＰＣＲ流体アセンブリの中に直接溶出するための迅速な方法に成功した。この迅速法によって、驚くほど良好な結果が得られる。この方法は、クロロホルム：フェノール抽出、プロテイナーゼＫによる処理、遠心分離、およびその他のより複雑で時間がかかる、文献に記載されている先行技術による手段を使わない。
増幅混合液を、増幅サブ回路から検出サブ回路の中に直接移送すると、そこで、２から６分間のうちに、より好適には約４分間で結果が可視化される。これを行う際に、抽出用、増幅用、および検出用の流体サブ回路をマイクロ流体装置の中で結合させることによって、本発明者らは、試料調製、増幅、および診断結果の間に継ぎ目のないインターフェイスを開発した。合計のアッセイ時間、試料容量、試薬容量、手間、および費用が顕著に低下した。
増幅の最適化
試料中の微生物およびウイルス粒子を溶解するには、試料中のヌクレオカプシド、脂質、およびムコ多糖類を部分的に可溶化する必要があるかもしれない。任意の前処理には、メルカプトエタノール、またはｎ−アセチル−システインを用いてジスルフィド結合を破壊すること、組織試料について、凍結融解、またはｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザー、超音波処理、もしくはフレンチプレスなどの機械的な前処理だけでなく、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミドおよびｎ−メチルピロリジノンなどの「汎用溶媒」を核酸：タンパク質結合および核酸：脂質結合を破壊するために使用することなどが含まれる。ミニビーズ衝撃式ミルまたは超音波破砕装置も、グラム陽性の球菌、桿菌、または内生胞子に対して使用することができる。
溶解によって、通常、かなりの量のリボソームＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡからなる混合核酸が得られる。対象となる多くのウイルスはＲＮＡウイルスであろうが、大多数の細菌では、対象となる標的はプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。したがって、溶解物をＲＮａｓｅで処理すると（すなわち、結合および溶離について競合するｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを除去すると）、核酸標的捕捉アセンブリに結合するＤＮＡの量を最大にするのに役立つ。
通例のオープンリーディングフレーム（エキソン）ではなくイントロン配列を増幅することも可能であり、そうすることによって、プライマー結合についてｍＲＮＡと競合するのを避けることができる。
前述したように、ホットスタートＰＣＲは、プライマーの二量体化と非特異的増幅を抑制し、感度と増幅産生量とを向上させることが示唆されていた。これは、その後の増幅を支配する基礎となる初回の伸長反応において特に重要である。
また、多重増幅プロトコールについて示唆されていたのは、混合プライマープールによる初回増幅で単位複製配列のコピー数を約１０００以下にし、その後、反応混合液の等量液の増幅を、別々のチャンバーで各プライマー対を用いて行う２段階増幅法であった。検出は、本発明の方法によって多重化することができる。
別の増幅手段は、ペプチジルハプテン化されたプライマーを用いて、高コピー数の相補鎖を作製した後、二重鎖の標的配列の両方を合成するために、逆向きのハプテン化プライマーを加えて増幅を繰り返す非対称増幅を行うことである。最終結果は同じであり、二重単位複製配列は、一方の末端を１つのハプテンで、もう一方の末端をビオチンなどで標識されている。プライマーは、高濃度では互いに出会うことがないため、最低数のプライマー二量体しか形成されない。非対称増幅法の変法では、第２のプライマーから上流にある配列から選択された第３のプライマーが用いられ、第２のプライマーではなく、この第３のプライマーがペプチドハプテン化される。このＰＣＲの半ネスティド変法は、二重にタグ付けされたプライマー二量体の形成を抑制するのに役立つ。
好適なプライマーは、長さが１０から３０塩基であり、より好適なプライマーは、長さが１７〜２８塩基である。短いプライマーほど、非特異的増幅を生じさせるであろう。順方向プライマーと逆方向プライマーの配列間距離は、約７０から６００ｂｐであり、より好ましくは１００から３００ｂｐとなるはずである。プライマーの塩基組成は、４０から６０％のＧ＋Ｃ、より好適には、５０から６０％のＧ＋Ｃで、プリン基の塊が、特に３’末端にないものである。
核酸標的を単一式および多重式で増幅を行うための装置、器具、および方法をここで考察する。連動式のバルブ制御の下で、並列したＰＣＲ流体および温度界面アセンブリの中で簡単に行われる単一式増幅が好適な実施形態である。
単一式検出装置および多重式検出装置の両方がここでは想定されている。多重検出が好適な実施形態である。本明細書で開示されている手段の中では、多重検出を視覚化する手段が好ましいが、機械的手段、手動式の手段、および自動化検出法も想定されている。
アッセイ標的
さまざまな病原体の診断的検出が考えられる。血液で運ばれる病原体には、いくつか例を挙げると、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｏｓａ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、マルタ熱菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）ｐｅｓｔｉｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、鼠咬症スピロヘータ菌（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、黄疸出血性レプトスピラ菌（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｕｍ ｉｃｔｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、コクシエラ・バーネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、ハンタウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス（およびフラビウイルスグループのその他のウイルス）、西ナイルウイルス、Ｂ型日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１および２、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１および２、犬糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｍｉｔｉｓ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、熱帯性マラリア、マラリア、卵形マラリア、およびベルゲイなどがある。黒水熱の原因の熱帯性マラリア（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の定量的検出が、血液では重要であろう。
創傷および咬症の病原体には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、壊疽性筋膜炎の原因となる化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の血清型、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ペスト菌、炭疽菌、およびバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）などがある。
中枢神経系およびＣＦの病原体には、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、シフィリス（ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、ヘモフィルスインフルエンザ血清型Ｂ、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、Ｂ型日本脳炎などのウイルス性脳炎、ムンプス・ウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−２）、水痘帯状ヘルペスウイルス、および狂犬病ウイルスなどがある。
代表的な尿路病原体は、グラム陰性桿菌で占められおり、例えば、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、大腸菌、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、および偶発性のシュードモナス感染が含まれる。
一連の性感染症も想定されている。臨床的に対象となる病原体は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、パピローマウイルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）などである。
腸内病原体は、腸内細菌科、中でもサルモネラ属、シゲラ属、および大腸菌の一定の血清型などである。広範な寄生生物およびウイルスも病原性がある。
選択された病原体を、本発明の装置によって個別に検出することも、パネルで検出することも可能である。選択された病原体または発病状態を検出するためのキットが予期されている。
グラム陽性の球菌、グラム陽性の桿菌、酵母、および内生胞子の検出には、解析前にミニビーズ衝撃式ミル、超音波で、またはペプチドグリカナーゼまたはキチナーゼによって前処理する必要がある。亜急性細菌性心内膜炎の診断が想定されている。
別の実施形態において、血液または組織内の癌細胞を検出することが考えられている。哺乳動物細胞の溶解を、本発明のマイクロ流体カードに適合させるためのプロトコールが期待されている。プライマー対は、癌細胞遺伝子の配列から選択することができる。心臓系、免疫系、および血管系の発病状態を診察することも想定されている。
カートリッジは、特に、並行に稼働するアッセイパネルに適合されている。好適な実施形態では、オンボード式多重検出用チャンバーによって、多数の結果を同時に表示することが可能になる。
この種のアッセイ法においてペプチジルプライマーでタグ付けされた単位複製配列が、本発明の別の態様である。今では、多数の方法が、オリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーに結合した特異的ペプチドエピトープの製造に利用することができる（Ｃ．−Ｈ．ＴｕｎｇおよびＳ．Ｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．．，２０００，１１，６０５−６１８；Ｅ．ＶｉｖｅｓおよびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９７，３８，１１８３−１１８６；Ｒ．Ｅｒｉｔｊａ，Ａ．Ｐｏｎｓ，Ｍ．Ｅｓｃａｒｃｅｌｌａｒ，Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ，ならびにＦ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９１，４７，４１１３−４１２０；Ｊ．Ｐ．Ｂｏｎｇａｒｔｚ，Ａ．Ｍ．Ａｕｂｅｒｔｉｎ，Ｐ．Ｇ．Ｍｉｌｈａｕｄ、ならびにＢ．Ｌｅｂｌｅｕ，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２，４６８１−４６８８；Ｃ．−Ｈ．Ｔｕｎｇ，ＭＪ．ＲｕｄｏｌｐｈおよびＳ．Ｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９１，２，４６１−４６５；Ｊ．Ｇ．ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＳ．Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９８，２６，３１３６−３１４５；Ｓ．Ｓｏｕｋｃｈａｒｅｕｎ，Ｊ． ＨａｒａｌａｍｂｉｄｉｓおよびＧ．Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９８，９，４６６−４７５；Ｋ．Ａｒａｒ，Ａ．−Ｍ．Ａｕｂｅｒｔｉｎ，Ａ．−Ｃ．Ｒｏｃｈｅ，Ｍ．ＭｏｎｓｉｇｎｙおよびＭ．Ｍａｙｅｒ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９５，６，５７３−５７７；ならびに、天然型ライゲーション技術の使用例については、Ｄ．Ａ．ＳｔｅｔｓｅｎｋｏおよびＭ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｊ．Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．，２０００，６５，４９００−４９０８参照）。また、米国特許出願第Ｕ．Ｓ．２０００６／０２６３８１６号も参照。これは、その全体が参考として本明細書中に援用される。
この方法のペプチジルハプテンプライマーは、これらの化学法によって合成される。本発明者らは、本明細書において、これらのプライマーが、一般的に、ＰＣＲ法に、また、分子生物学的核酸増幅法に適合することを開示する。アッセイで使用するために、ペプチドでタグ付けされたプライマーを取り込んでいる単位複製配列をもつ増幅産物が、増幅プライマーセットの第２のプライマー上のリガンドに特異的なアフィニティー捕捉剤によってまず捕捉され、それによって磁気マイクロビーズに結合する。そして、単位複製配列−ビーズ複合体が、検査用パッド上のペプチド特異的抗体と相互作用し、ペプチジルハプテン単位複製配列分子複合体をもつそれらのビーズ複合体だけが、検査用パッドによって捕捉される（図示については図５および２６参照）。この方法によって、磁気ビーズ技術を用いた不均一結合アッセイ法（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）によるペプチジル−単位複製配列ライブラリーのスクリーニングが可能になる。莫大な免疫学的多様性がペプチドでタグ付けされたオリゴマーで可能になるため、本発明者らは、この種のライブラリーを調べる方法は、磁気ビーズの有無を問わず、分子生物学的アッセイ法に役立つ、これまで認識されてこなかったツールを提供するものと確信している。
これらの組成物は、通常、第１の末端および第２の末端をもつ双尾型単位複製配列を含む、病原体または発病状態を検出するための分子検出複合体であって、前記第１の末端が、ペプチジルハプテンに共有結合した第１のプライマーを含み、かつ前記第２の末端が、リガンドに共有結合した第２のプライマーを含み、また前記第１の末端が、リガンドに結合した、リガンド結合因子でコートされたレポーター基をさらに含み、かつ前記第２の末端が、ペプチジルハプテンに結合した抗ペプチジルハプテン抗体をさらに含み、前記複合体が、さらに検査用パッド上に固定されているが、ただし検査用パッドおよびリガンドが広く定義されている分子検出複合体であると説明されるであろう。
液体アレイなどでは、蛍光プローブ染色されたラテックスビーズを「検査用パッド」として使用できることに留意すべきである。蛍光プローブビーズにバーコードを付け、均一に標識されたビーズ集団をペプチジルハプテン特異的抗体で被覆することにより、双尾型単位複製配列または双尾型単位複製配列ライブラリーの混合集団を解析するために、ビーズライブラリーを合成することができる。そして、その結果生じる、双尾型単位複製配列によってつながれたビーズ対をもつアフィニティー結合複合体を、二重励起蛍光定量法を用いて選別するか定量的にアッセイすることができる。
本明細書に記載されている装置および器具は、通常、核酸標的のバイオアッセイの実施に合わせることができるため、本明細書に開示されている方法によるバイオアッセイを行うためのキットとして組み合わせることができる。
一般的な多重式核酸標的バイオアッセイ法は、以下の工程を有する：
１）第１の標的核酸配列の５’末端に対してハイブリダイゼーション特異性を有する第１のプライマーを選択して、ペプチジルハプテンを結合した第１のプライマーを合成する工程、
２）第１の標的核酸配列の３’末端に対してハイブリダイゼーション特異性を有する第２のプライマーを選択して、リガンドを結合した第２のプライマーを合成し、前記第１と第２のプライマーにプライマー対を形成させる工程、
３）複数の標的核酸配列の各々についてａ）およびｂ）の工程を反復して、プライマー対をプールする工程、
４）プライマー対プールの存在下で双尾型単位複製配列産物を合成する工程、
５）増幅混合産物をリガンド結合因子でコートされた磁気ビーズに接触させて、前記リガンド結合した第１のプライマーを含む双尾型単位複製配列産物を捕捉する工程、
６）増幅混合産物を、各検査用パッドが、固定化された抗ペプチジルハプテン抗体を含む複数の検査用パッドに接触させ、検査用パッド上の双尾型単位複製配列を分子検出複合体の形で捕捉する工程、
７）１つ以上の分子検出複合体を検出することによって、アッセイ結果が、複数の病原体または発病状態について陽性であるとスコアリングする工程。
本明細書に記載したような核酸検出法は、さまざまな手段による増幅を含むであろう。それらは、単一増幅法、多重増幅法、ネスティド増幅法、連続増幅法、および「ホットスタート」増幅法などである。
（実施例１）
Ａ）プライマーセットの調製
まず、逆方向プライマーを調製してＨＰＬＣで精製した。使用直前にｎ−末端ヒドラジンでペプチドを修飾した。オリゴヌクレオチドを、ホルムアミド中スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートで処理した後、ヒドラジンで誘導体化したペプチドと反応させて、ハプテンでタグ付けされたプライマーを形成させた。
以下のペプチジルハプテン標識プライマーを用いた。
Figure 0005254949
 相補的抗体の利用可能性に基づいて、これらのペプチドエピトープを選択した。また、代替的なペプチド結合化学法を用いることもできる。順方向プライマーはすべて、ビオチンに結合していた。
Ｂ）常磁性マイクロビーズの調製
単分散ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）をＤｙｎａｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡから購入し、洗浄して、０．５Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ８）中８０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％ＢＳＡの溶液を５％（ｖ／ｖ）含む、０．９×ＰＢＳ、３０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００に使用直前に再懸濁した。
Ｃ）検査パッドの調製
マイクロ流体装置が、ステンシル裁断した積層板から構築されたが、これは、図９に図示された形の複数の検出用チャンバーを含んでいた。それぞれの検出用チャンバーは、マイクロ流体チャネルによって検出用チャンバーと流体で連結されている注入ポートおよび排出ポートを備えて作られていた。実験のために十分な検出チャネルを作った。
最終的に組み立てる前に、検査用チャンバー内の検査用パッドをマスクして、酸素ガスでプラズマ処理した。ペプチジルハプテン特異的な抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ ＮＪ）および陰性対照溶液を検査用パッド上に、検査パッド１つ当たり１μＬスポットし、その場において真空乾燥させた。各検出用チャンバーは、各プライマーセットおよび陰性対照に対応する１つの検査パッドを含んでいた。完成した装置を、０．９×ＰＢＳ、３０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび１％ＴｏｒｉｔｏｎＸ１００からなるブロッキング／洗浄溶液で処理して、未処理のプラスチック表面を不動態化した。ブロッキング溶液を使用直前に除去し、チャンバーを乾燥させた。
Ｄ）アッセイプロトコール：
腸内病原菌由来の既知のＤＮＡ試料を用いて、ＰＣＲを調製されたプライマーセット（上述）で３５サイクル行った。増幅には、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ試薬を用いた。増幅がうまく行ったことを、５％アガロースゲル電気泳動法によって確認した。そして、単位複製配列１０μＬを、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００および５ｍＭ ＴＲＩＳバッファー（ｐＨ８）を含む、約２０μＬのバッファーに５μＬのビーズ（上述）とともに再懸濁し、この溶液をまとめて検出用チャンバーに入れた。各単位複製配列産物は１つのプライマーセットに対応していたので、これを別々の検出用チャンバーに入れた。
まず、検出チャンバーの底に置かれた磁石でビーズを捕捉し、余分な溶液を除去した。次に、この磁石を用いて、検査パッドの全体にビーズペーストを塗布し、混合物を１分間インキュベートした。ウェルの底に置かれた磁石を用いて、ウェルをブロッキング溶液でゆっくり満たした。磁石をバッファーの流れに沿って動かして、検出用チャンバーの底層上にビーズフロントを作り出した。その後、磁石を検出用チャンバーの最上部まで移動させて、検査パッド領域から未結合ビーズを取り出した。未結合物質は、流動用バッファーに再懸濁してから洗浄して廃棄することができた。この検査用パッドを１倍容の新鮮なバッファーで洗浄した。鮮やかなオレンジ色の検査パッドの「ストライプ」が直ちに見えたため、相補的抗体を含む検査用パッドに対する、ハプテンでタグ付された単位複製配列の結合特異性を正確に反映していると判定した。検出チャンバーは、作製されたときに並列して配置されていたため、単位複製配列とビーズの混合物を全部処理すると、階段状のパターンが現れた。これは、各タグ付単位複製配列に、各検出用チャンバーの中の１つの検査パッドだけが結合したためである。
除去したところで、陽性検査結果が、具体的な検査ストリップの位置に対応する明るいオレンジ色のバンドとしてすぐに見えた。陰性検査ストリップおよび陰性対照は、半透明で未着色のままであった。結果は、染色された検査パッドの位置を、スポッティングに用いられた抗体のキーに合わせることによって容易に解読することができた。
（実施例２）
マイクロ流体装置内で以下のとおりにＰＣＲ増幅を行った。
マイクロ流体装置をステンシル裁断した積層板から構築した。最終的に組み立てる前に、ビオチンおよびハプテンをタグ付けしたプライマー対、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、ＴＡＱポリメラーゼ、ならびにＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＢＳＡ、ＰＥＧ、およびトレハロース、さらに塩化マグネシウムからなる基質を、増幅用のチャネルまたはチャンバー内に沈着させ、その場において真空下で乾燥させた。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）をスポットし、増幅用のチャネルまたはチャンバーに隣接しているチャンバー内で乾燥させた。抗体溶液を適用して、その場で乾燥させる前に、検出用チャンバー内の検査用パッド領域をステンシル処理（一般的な方法については図２１参照）し、さらに気体プラズマ処理した。抗体スポットをＳｔａｂｉｌＣｏａｔ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ ＭＮ）でブロックした。そして、この装置をＴｒｉｔｏｎＸ１００：ＢＳＡバッファーで処理して、未処理のプラスチック表面を不動態化した。
以下の試薬も調製した：
溶解バッファー
４．５Ｍ グアニジンチオシアネート
５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００
１％サルコシン
５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）
２０ｍＭ ＥＤＴＡ
洗浄試薬
無水エタノール
溶離バッファーＥ１１
１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
２０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）
５０Ｕ ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
再水和バッファー
１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００
０．５％ＮａＣｌ
１０ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン
５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）。
溶解バッファー、洗浄試薬、溶離バッファー、および再水和バッファーを等量にして、装置の指定されたチャンバー内の密閉されたブリスターパックに分注した。そして、この装置を完成させて、ＰＣＲ流体および温度界面アセンブリの下に置かれた可変温度ＴＥＣ加熱ブロックを有する空気圧式制御装置の中に置いた。
病原微生物を含むことが知られている下痢患者由来の臨床スワブ試料は、バイオセーフティーキャビネット内で手袋をして取り扱った。各直腸スワブは、４００μＬのＴＥとしっかり混合して内容物を可溶化させた。そして、フィルターを詰めたピペットの先端を用いて、約４００μＬのホモジネートをマイクロ流体装置の試料ポートに移し、試料ポートを閉めた。他の工程はすべて、一回使い切り装置内で行われ、作業者への暴露はなかった。
残りのアッセイ工程を自動化した。
オンボード型の衛生ベローポンプを用いて、試料を、レーザー加工されたプラスチック製のリブ上で支持されている、例えば、ポリプロピレン製のデプスフィルター要素からなるプレフィルターを通して引き出した。そして、バルブを用いて試料ポートを閉じた。次に、粗製濾液を溶解バッファーと混合し、核酸を捕獲するためにグラスファイバーフィルターに通し、フィルター残留物をエタノールで完全にすすいだ。０．４５ミクロンの疎水性膜のフィルターを介して通気するオンボード型の廃棄物貯蔵容器ですべてのリンス液を隔離した。次に、グラスファイバー膜上の核酸を、溶離バッファーで溶出させ、プライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、マグネシウム、バッファー、および界面活性剤を乾燥状態で含む反応用チャネルに入れた。そして、容量が約５０μＬの反応混合物を、ＰＣＲ流体および温度界面アセンブリの中で９５℃まで約１０秒間加熱して、試料中の二本鎖配列および二次構造を変性させた。加熱および冷却は、適当なヒートシンク上に置かれた、外付けのペルティエ素子によってもたらされ、ＰＩＤは、設定点から１℃以内で制御した。その直後、一回目のアニーリングおよび伸長のために、温度を約６０℃に戻して、約２０秒間継続した。熱サイクルを１８分間にわたって４０サイクル繰り返した。
抽出および増幅の後、再水和バッファーで再水和しておいたストレプトアビジン標識磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ，ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｌ）を混合するために、単位複製配列産物をマグ混合用チャンバーに移した。この混合物をゆっくりと混合しながらインキュベートした後、ＭａｇｎａＦｌｏｗチャンバーに移した。任意には、反応混合物を洗浄して、磁気ビーズをその場に保持しつつ、未反応のハプテン結合プライマーを除去することができる。Ｘ−Ｙステージに取り付けられた永久磁石を用いて、推定標的単位配列をもつ被覆ビーズを、検出用チャンバー内の捕捉抗体検査用パッドまたはアレイに接触させ、移動磁場を用いて、検査用パッドから非結合ビーズを取り除いて廃液に送り込んだ。プライマーおよび非特異的単位複製配列を、過剰量の再水和バッファーでチャンバーから洗い流し、再び、オンボード廃液装置の中に捨てた。
除去したところで、陽性検査結果が、具体的な検査ストリップの位置に対応する明るいオレンジ色のバンドとしてすぐに見えた。陰性検査ストリップは、半透明で未着色のままであった。増幅混合物を移してから、検出するまでの時間は約４分であった。各固定化抗体の同一性が分かっているため、結果を容易に解読することができた。今日までの最良の実施例では、増幅からデータ表示までの時間は４分未満である。
臨床試料を用いた試験稼動では、ＭａｇｎａＦｌｏｗ装置を用いたスクリーニングで４７個の便検体のうち４６検体で病原体が正しくスコアされた。培養によってサルモネラ菌を含んでいると以前から同定されていた１つの試料が、ＭａｇｎａＦｌｏｗによって腸管毒素原性大腸菌Ｏ１５７Ｈ１も含んでいると同定された（すなわち、二重感染）。この例について、カスタム合成によって以下のプライマー対を得て、当技術分野周知の方法によって化学的に結合させた。
Figure 0005254949
Figure 0005254949
 この実施例では、順方向プライマーはビオチンと結合していた。逆方向プライマーは、それに対して抗体が入手可能なペプチドハプテンと結合させた（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ ＮＪ）。ハプテンの共有結合は、オリゴマーの５’末端にあった。ペプチドは、結合させるためにアミノ末端で活性化した。
（実施例３）
実施例２の標的を抽出、増幅、および検出したアッセイの結果を図６に示す。
（実施例４）
ビオチン化プライマー対およびハプテンでタグ付けされたプライマー対を含む呼吸器パネルを設計する。プライマーを合成してから、装置の別の増幅用チャネルまたはチャンバーに置く。実施例２の手順に続いて、喉頭スワブ洗浄物を解析する。ミニビーズ衝撃式ミルを用いて、解析の前に試料を調製する。結果は、検出チャンバーに表示される。この産物をキットとしてパッケージする。
（実施例５）
ビオチン化プライマー対およびペプチジルハプテンのタグ付プライマー対を含む性感染症パネルを設計し、該プライマーを合成する。そして、これらのプライマーを、装置の個別の増幅用のチャネルまたはチャンバー内で沈着させる。実施例２の手順に従って、膣のスワブ、洗浄物を解析する。検出のエンドポイントが、検出用チャンバー内に表示される。この産物をキットとしてパッケージする。
（実施例６）
ビオチン化プライマー対およびペプチジルハプテンのタグ付きプライマー対を含む癌遺伝子パネルを設計し、プライマーを合成する。そして、プライマーを共通の増幅用チャネルまたはチャンバー内に沈着させる。ＰＣＲ増幅の後に、増幅産物を検出ステーション内で検出する。この産物をキットとしてパッケージする。
上記の説明は、具体的な事項を含むが、これらの具体的な事項は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではなく、むしろ本発明の実施形態を例示したものを解釈すべきである。すなわち、本発明についての前記説明は、図示および説明を目的とした例示である。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は、本発明に対してさまざまな変更および修正を加えて、発明の進歩性なしに、これをさまざまな用途および条件に適応させることができる。したがって、これらの変更および修正は、適切、正当に、以下の請求の範囲の等価物の範囲内に含まれることを意図するものである。よって、本発明の範囲は、提供された実施例によって決められるものではなく、添付された請求の範囲とその法的均等物によって決定されるべきものである。
図１は、マイクロ流体試料抽出用サブ回路の概略図である。 図２は、可変温度熱界面を用いたＰＣＲ増幅用マイクロ流体サブ回路の概略図である。 図３は、マイクロ流体標的検出用サブ回路の概略図である。 図４は、図１、図２、および図３のマイクロ流体抽出用、ＰＣＲ増幅用、および検出用のサブ回路を組み合わせた一体型装置の概略図である。 図５は、双尾型単位複製配列、および検査用パッド上に磁気捕捉用ビーズを固定していることを示す陽性検出結果の概略図である。 図６は、図４の装置を用いて得られる腸内病原体標的に関する解析データの写真である。 図７は、マイクロ流体チャネルにおける液体の流れを制御するための空気圧式連結管に接続された空気圧式バルブ素子の平面図と断面図である。 図８は、マイクロ流体バルブの分布図。 図９は、空気圧式連結管における衛生隔離用フィルターをもつ空気圧式バルブの平面図と断面図である。 図１０は、稼動中のブリスターパックの断面図である。 図１１は、衛生ベントを備えた廃棄物隔離用チャンバーの断面図である。 図１２は、弾性体ダイヤフラムを備えたベローチャンバーの平面図と断面図である。 図１３は、それぞれ独立して調節可能な固定温度熱界面をもつ２つの往復ベローポンプチャンバーを有する増幅サブ回路の平面図である。 図１４は、稼働中の図１３記載の装置の断面図である。熱サイクルが、それぞれ独立して調節可能な固定温度熱界面をもつ２つのチャンバーの間を行ったり来たりする流体の流れとして生じる。 図１５は、それぞれ独立して調節可能な固定温度熱界面、および通流をもつ２つの往復ベローポンプチャンバーを有する増幅サブ回路の平面図である。 図１６は、稼働中の図１５記載の装置の断面図である。熱サイクルが、それぞれ独立して調節可能な固定温度熱界面、および通流をもつ２つのチャンバーの間を行ったり来たりする流体の流れとして生じる。 図１７は、それぞれ独立して調節可能な固定温度熱界面、および通流をもつ３つの往復ベローポンプチャンバーを有する任意選択的な増幅サブ回路の平面図である。 図１８は、それぞれ独立して調節可能な固定温度熱界面、および通流をもつ３つの往復ベローポンプチャンバーを有する増幅サブ回路の任意選択的な実施形態の平面図である。変性チャンバーが、残りのベローチャンバーから離れており、いずれの２つのチャンバー間における流体も、もう１つのチャンバーからは独立していることに留意されたい。 図１９は、拡散する自由流路の長さに近い、最も狭い寸法をもつマイクロ流体インライン混合装置の正面図および断面図を示す。 図２０は、沈殿した乾燥試薬を含むマイクロ流体チャネル、貯留容器、およびチャンバーの断面図である。 図２１は、多重検出チャンバーおよび光学窓の平面図である。 図２２は、代表的な検査用パッド形状の平面図である。 図２３は、２つの固定温度界面を有する増幅サブ回路の概略図である。 図２４は、連続的ＰＣＲ反応に依存するアッセイプロトコール用の装置を示す概略図である。 図２５は、ＲＮＡの解析を提供する抽出および増幅用サブ回路の概略図である。 図２６は、離脱把手をもつスワブ用のシール可能な試料ポートをもつ一回使い切り用装置の概念モデルである。 図２７は、固体基質上にレポーター基を固定するための係留装置である双尾型単位複製配列を示す陽性検出結果のより一般的な概略図である。 図２８は、図１〜４で使用された図示記号の説明である。

Claims (12)

  1. （ａ）生体試料から核酸を抽出するための手段であって、生体試料から核酸を抽出するための第１の流体サブ回路を備え、前記第１の流体サブ回路が固相の核酸親和性結合基板をもつ、手段、
    （ｂ）単位複製配列を合成するための手段であって、単位複製配列を合成するための第２の流体サブ回路を備える、手段、および
    （ｃ）単位複製配列を検出するための手段であって、検出用チャンバーと光学窓とをもつ第３の流体サブ回路を備える、手段
    を含む一体型マイクロ流体カートリッジであって、
    前記第１、第２および第３の流体サブ回路が一個の一体型使い捨て部材の中に形成され、そして、前記第１、第２および第３の流体サブ回路が流体によって相互連結され、かつ、ダイヤフラム式バルブおよびベローチャンバーを含む複数の内部空気圧式制御素子によって制御することができ、そして、前記複数の内部空気圧式制御素子が、外部の制御可能空気圧式作動連結管に接続するための空気圧式相互接続回路を備える、一体型マイクロ流体カートリッジ。
  2. 請求項１に記載のマイクロ流体カートリッジであって、単位複製配列を合成するための前記手段が、
    （ａ）第２のベローチャンバーに流体によって相互接続している第１のベローチャンバー、
    （ｂ）第１のベローチャンバーおよび第２のベローチャンバーを異なった一定温度に保持する温度界面
    をさらに含み、ここで、各ベローチャンバーが、前記第１のベローチャンバーと前記第２のベローチャンバーとの間で液体を相互ポンピングするためのダイヤフラムをさらに含む、マイクロ流体カートリッジ。
  3. 以下の工程（ａ）〜（ｆ）：
    （ａ）前記第１のベローチャンバーの中で、ＤＮＡ鋳型、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファー、およびマグネシウム塩を含む反応混合液を作成する工程であって、第１の前記ベローチャンバーは二本鎖ＤＮＡの変性温度以上の一定の温度に保持されており、かつ第２の前記ベローチャンバーは、前記ＤＮＡ鋳型と前記プライマーのアニーリング温度以下の一定の温度に保持されている、工程
    （ｂ）核酸標的配列を前記第１のベローチャンバーの中に導入する工程、
    （ｃ）空気圧を前記第１のベローチャンバーの前記ダイヤフラムに適用して、前記反応混合液を前記第１のベローチャンバーから前記第２のベローチャンバーへ移動させる工程、（ｄ）空気圧を前記第２のベローチャンバーの前記ダイヤフラムに適用して、前記反応混合液を前記第２のベローチャンバーから前記第１のベローチャンバーへ移動させる工程、（ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）を多数の温度サイクルの間繰り返して、増幅産物を合成する工程、ならびに
    （ｆ）増幅産物を取り出す工程
    を含む、請求項２に記載のマイクロ流体カートリッジの中でＰＣＲを行う方法。
  4. 生体試料について核酸アッセイを行うための装置であって、前記装置は、以下：
    （ａ）前記核酸アッセイのための乾燥試薬および液体試薬を含むプラスチック製の使い捨てカートリッジ本体であって、前記カートリッジ本体が、以下：
    （ｉ）前記試料から核酸を抽出するための第１の流体サブ回路；
    （ｉｉ）単位複製配列産物を合成するための第２の流体サブ回路；
    （ｉｉｉ）前記単位複製配列産物を検出するための第３の流体サブ回路；
    （ｉｖ）衛生廃棄物回収用チャンバー；および
    （ｖ）前記第１、第２および第３の流体サブ回路を空気圧式に作動させるためのアームをもつ、空気圧式相互接続サブ回路
    を含む、カートリッジ本体と；
    （ｂ）前記核酸アッセイを制御するように構成されたマイクロプロセッサの制御下で、前記カートリッジ本体の前記空気圧式相互接続サブ回路に正および負の空気圧のプログラム可能なパルス列を供給するためのアームとソレノイドバルブとをもつ、カートリッジ外の空気圧作動型連結管
    とを含み、前記第１の流体サブ回路は、以下：
    （ａ）試料注入ポート；
    （ｂ）第１の流体チャネルによって前記試料注入ポートに、そして、第２の流体チャネルによって第２のベローポンプに、流体とバルブにより相互連結している、第１のベローポンプであって、前記第２のベローポンプは、前記サンプルに溶解バッファーをプログラム可能に混合するための壊れやすい溶解バッファー試薬パックを備え、そして、前記空気圧式相互接続サブ回路は、ダイヤフラムと前記第２のベローポンプ内の対向する鋭利なものとの間で前記溶解バッファー試薬パックを圧迫することによって、前記溶解バッファー試薬パックをプログラム可能に破壊するように構成される、第１のベローポンプ；および
    （ｃ）核酸を抽出するための、固相の核酸標的捕捉アセンブリであって、前記標的捕捉アセンブリは、前記第１のベローポンプに流体とバルブにより相互連結される、標的捕捉アセンブリ
    を備える、装置。
  5. 請求項４に記載の装置であって、前記第１の流体サブ回路は、さらに、以下：
    （ａ）前記標的捕捉アセンブリに流体とバルブにより相互連結している第３のベローポンプであって、前記第３のベローポンプは、前記標的捕捉アセンブリに洗浄用試薬をプログラム可能に送達するための、壊れやすい洗浄用試薬パックを含み、前記空気圧式相互接続サブ回路は、ダイヤフラムと前記第３のベローポンプ内の対向する鋭利なものとの間で前記洗浄用試薬パックを圧迫することによって、前記洗浄用試薬パックをプログラム可能に破壊するように構成される、第３のベローポンプ；ならびに
    （ｂ）廃液用チャネルによって前記標的捕捉アセンブリに、流体およびバルブにより接続される衛生廃棄物貯蔵容器
    を備える、装置。
  6. 請求項５に記載の装置であって、前記第１の流体サブ回路はさらに、以下：
    （ａ）前記標的捕捉アセンブリに流体とバルブにより相互連結している第４のベローポンプであって、前記第４のベローポンプは、前記標的捕捉アセンブリに溶離バッファーをプログラム可能に送達するための、壊れやすい溶離用試薬パックを含み、前記空気圧式相互接続サブ回路は、ダイヤフラムと前記第４のベローポンプ内の対向する鋭利なものとの間で前記溶離用試薬パックを圧迫することによって、前記溶離用試薬パックをプログラム可能に破壊するように構成される、第４のベローポンプ；および
    （ｂ）前記標的捕捉アセンブリを前記第２の流体サブ回路に相互連結して、核酸溶出液を増幅のために前記第２の流体サブ回路に運ぶための、第２の流体チャネル
    を備える、装置。
  7. 請求項６に記載の装置であって、前記第２の流体サブ回路は、以下：
    （ａ）マイクロチャネルによって流体により相互連結された第１および第２のベローポンプを備えるＰＣＲ流体および温度界面であって、前記ＰＣＲ流体および温度界面は、前記第１のベローポンプを前記核酸溶出液を変性させるための一定の温度に、そして、前記第２のベローポンプを前記核酸溶出液をアニーリングするための一定の温度に保持するように構成され、前記正および負の空気圧の前記プログラム可能なパルス列は、前記第１のベローポンプと前記第２のベローポンプとの間で前記核酸溶出液を相互ポンピングして、前記核酸溶出液を熱サイクリングさせるように構成される、ＰＣＲ流体および温度界面；
    （ｂ）前記核酸溶出液内で再構成させるためのプライマーを含む、乾燥ＰＣＲ混合液試薬；ならびに
    （ｃ）前記第２の流体サブ回路を前記第３の流体サブ回路にバルブにより相互連結して、前記第２の流体サブ回路の前記単位複製配列産物を検出のために前記第３の流体サブ回路に運ぶための、バルブを備える第３の流体チャネル
    を備える、装置。
  8. 前記乾燥ＰＣＲ混合液試薬が、前記核酸溶出液内で直接再構成される、請求項７に記載の装置。
  9. 請求項７に記載の装置であって、前記ＰＣＲ流体および温度界面の前記第１および第２のベローポンプが、加熱および冷却の手段によって前記一定の温度に保持され、前記加熱および冷却の手段は、前記温度界面と接する第１および第２の加熱および冷却ブロックを備え、前記第１のブロックは、前記第１のベローポンプと作動可能に接触し、そして、前記第２のブロックは前記第２のベローポンプと作動可能に接触する、装置。
  10. 前記第２のベローポンプが、乾燥ポリメラーゼを含む、請求項７に記載の装置。
  11. 流体的に前記標的捕捉アセンブリと前記ＰＣＲ流体および温度界面の前記第１および第２のベローポンプとの間に置かれたｃＤＮＡ合成チャンバーをさらに備える、請求項９に記載の装置。
  12. 請求項９に記載の装置であって、前記衛生廃棄物貯蔵容器が、廃棄物のための流入口、前記貯蔵容器内の吸水性パッド、および前記吸水性パッドを覆い、かつ、前記廃棄物貯蔵容器を通気するための外側のベントから前記流入口を分離するフィルムを備える、装置。
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