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CN105803534A - 集成样品制备系统和稳定的酶混合物 - Google Patents

集成样品制备系统和稳定的酶混合物 Download PDF

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CN105803534A
CN105803534A CN201610058616.3A CN201610058616A CN105803534A CN 105803534 A CN105803534 A CN 105803534A CN 201610058616 A CN201610058616 A CN 201610058616A CN 105803534 A CN105803534 A CN 105803534A
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CN
China
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nucleic acid
branch road
amplification
fragmentation
microfluidic card
Prior art date
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Application number
CN201610058616.3A
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English (en)
Inventor
M.W.埃舒
J.皮库里
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Aibis Biological Science Co Ltd
Original Assignee
Aibis Biological Science Co Ltd
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Publication date
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Abstract

提供了集成样品制备系统和稳定的酶混合物。具体而言，提供了微流体卡，其配置用于处理样品并产生适用于测序方法(例如下一代测序方法)或其它合适的核酸分析方法的DNA文库。亦提供了含有酶(例如在全基因组扩增中使用的酶)、BSA和糖的稳定的酶混合物。可将所述酶混合物冻干，并储存在室温数月而不显著损失酶活性。

Description

集成样品制备系统和稳定的酶混合物
本申请是国际申请日为2011年5月6日、国家申请号为201180033729.3（国际申请号为PCT/US2011/035597）、发明名称为“集成样品制备系统和稳定的酶混合物”的申请的分案申请。
本发明主张2011年5月6日提交的美国专利申请号13/102,520 (与本文同时提交)和2010年5月6日提交的美国临时申请61/331,910的优先权，其每一个的整体通过引用全部并入本文。
政府资助声明
本发明在合同号为HDTRA-1-07-C-0096的美国政府资助下完成。在本发明中美国政府具有一定的权利。
发明领域
本发明涉及集成样品制备和测序系统(integrated sample preparation andsequencing system)和稳定的酶混合物。具体而言，本发明提供配置用于处理样品并产生DNA文库的微流体卡(microfluidic card)，所述DNA文库适用于测序方法(例如下一代测序方法)或其它合适的核酸分析方法，其中可用DNA测序系统整合来自这些卡片的输出，这给测序系统提供自动化和集成的样品。本发明亦提供含有酶(例如在全基因组扩增中使用的酶)、BSA和糖的稳定的酶混合物。可将所述酶混合物冻干，在室温保存数月而无显著的酶活性损失。
背景
DNA测序需要大量提取的DNA用于制备测序文库。培养细胞、裂解细胞、提取DNA、使DNA片段化、连接接头和纯化测序模板的过程，是可能由有技能的研究技术人员花费数天来实施的多步骤过程。基于测序的检测的挑战是现有全基因组测序系统例如Roche 454，需要数天样品制备和数天测序。图1显示演示现在用于下一代测序技术的样品制备中涉及的冗长过程例如Roche 454方法的流程图。如该图所示，其对于例如样品预处理、细胞裂解、核酸提取和全基因组扩增(WGA)可花费一天时间。然后可花费1-5天生成DNA文库，这涉及以下步骤：DNA片段化；DNA末端修复；衔接子连接；片段固定；缺口修复；单链DNA分离；和乳液PCR滴定。最后，可花费1-4天来制备用于测序的样品，测序本身使用以下步骤：本体乳液PCR(bulkemulsion PCR)；破乳PCR(break emulsion PCR)；纯化PCR阳性珠粒；制备测序珠粒；和实施测序反应。
需要更快速并更容易实施的制备DNA测序文库的方法并需要用测序仪整合这些方法。
发明简述
本发明提供集成样品制备/核酸测序系统和稳定的酶混合物。具体而言，本发明提供微流体卡，其配置用于处理样品并产生适用于测序方法(例如下一代测序方法)或其它合适的核酸分析方法的DNA文库。本发明亦提供含有酶(例如在全基因组扩增中使用的酶)、BSA和糖的稳定的酶混合物。可将所述酶混合物冻干，并储存在室温达数月而无显著的酶活性损失。
在某些实施方案中，本发明提供包含以下的微流体卡：a)配置用于引入生物学样品的装载端口(loading port)；b)包含以下的片段化支路(sub-circuit)：i)配置用于消化核酸(例如扩增的核酸)以产生片段化的核酸的试剂混合物；和/或ii)配置用于使核酸机械上片段化以产生片段化的核酸的片段化组分；和c)与所述片段化支路可操作地连接的接头连接支路，其中所述接头连接支路包含：i)配置用于测序方法或其它方法的核酸接头；和ii)配置用于让所述核酸接头与所述片段化的核酸连接以产生核酸测序文库的连接酶混合物。
在某些实施方案中，本发明提供包含以下的微流体卡：a)配置用于引入生物学样品的装载端口；b)细胞裂解支路；c)核酸提取支路；d)核酸扩增支路，其中所述扩增支路包含：i)靶标序列特异性扩增，例如PCR；或ii)总核酸扩增支路，例如通过多重置换扩增的全基因组扩增；e)包含以下的片段化支路：i)配置用于消化核酸(例如扩增的核酸)以产生片段化核酸的试剂混合物；和/或ii)配置用于使核酸物理上片段化以产生片段化核酸的片段化组分；f)片段化核酸的末端补齐；g)与所述片段化支路可操作地连接的接头连接支路，其中所述接头连接支路包含：i)配置用于测序方法或其它方法的核酸接头；和ii)配置用于让所述核酸接头与所述片段化核酸连接以产生核酸测序文库的连接酶混合物；h)用于去除未连接的或部分连接的核酸的方法：i)这可用例如核酸外切酶的酶促方式实施和或ii)通过结合和洗脱提取或iii)通过用亲和标签作为生物素标记的连接产物来亲和分离；i)通过酶促或结合洗脱或亲和或尺寸排阻等来最终纯化文库；j)用测序系统整合。
在特定实施方案中，微流体卡进一步包含选自以下组的至少一个另外的支路：1)包含以下的裂解支路(例如与所述装载端口可操作地连接)：i)混合室和ii)裂解缓冲液(例如在密封包装中)；2)核酸提取支路(例如与所述裂解支路和废物室(waste chamber)二者可操作地连接)，其中所述核酸提取支路包含：i)配置以结合在裂解的样品中存在的核酸的核酸提取组分；ii)洗涤缓冲液(例如在密封包装中)；iii)洗脱缓冲液(例如在密封包装中)；和iv)泵组件(例如配置用于将洗脱缓冲液泵送到核酸提取组分以产生提取的核酸混合物)；3)包含稳定的酶混合物的扩增支路(例如与核酸提取支路可操作地连接)，其中所述稳定的酶混合物包含可用于对提取的核酸进行扩增以产生扩增的核酸的至少一种扩增相关的酶；和4)废物室；
在某些实施方案中，本发明提供包含以下的微流体卡：a)配置用于引入生物学样品的装载端口；b)包含稳定的酶混合物的扩增支路(例如与核酸提取支路可操作地连接)，其中所述稳定的酶混合物包含可用于对核酸进行全基因组扩增以产生扩增的核酸的至少一种扩增相关的酶。
在一些实施方案中，本发明提供包含以下的微流体卡：a)配置用于引入生物学样品的装载端口；b)废物室；c)与装载端口可操作地连接的细胞裂解支路，其中所述细胞裂解支路包含：i)混合室和ii)含有裂解缓冲液的第一密封包装；其中配置所述裂解支路以在混合室中用裂解缓冲液裂解生物学样品产生裂解的样品；d)与细胞裂解支路和废物室二者可操作地连接的核酸提取支路，其中所述核酸提取支路包含：i)配置以结合在裂解的样品中存在的核酸的核酸提取组分；ii)含有洗涤缓冲液的第二密封包装；iii)含有洗脱缓冲液的第三密封包装；和iv)泵组件，经配置用于将洗脱缓冲液泵送至核酸提取组分以产生提取的核酸混合物；e)与核酸提取支路可操作地连接的扩增支路，其中所述扩增支路包含稳定的酶混合物，其中所述稳定的酶混合物包含可用于对提取的核酸进行扩增以产生扩增的核酸的至少一种扩增相关的酶；f)与扩增支路可操作地连接的片段化支路，其中所述片段化支路包含：i)配置用于消化扩增的核酸以产生片段化核酸的试剂混合物和/或ii)配置用于使扩增的核酸机械上片段化以产生片段化核酸的片段化组分；和g)与片段化支路可操作地连接的接头连接支路, 其中所述接头连接支路包含：i)配置供测序方法使用的核酸接头(衔接子)和ii)配置用于让核酸接头与片段化核酸连接以产生核酸测序文库的连接酶混合物。
在某些实施方案中，所述至少一种扩增相关的酶包含可用于实施全基因组扩增(WGA)(例如多重置换扩增)或可用于实施PCR或用于实施转录介导扩增(TMA)的酶。在一些实施方案中，所述至少一种扩增相关的酶选自：Phi-29聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、无机焦磷酸酶或其任意组合。在某些实施方案中，所述扩增相关的酶与用于下一代测序(例如本文所述的下一代测序方法)的接头(衔接子)混合。在特定实施方案中，用于任何扩增步骤(例如PCR)的引物包含可用于下一代测序方法的接头(例如用于让扩增子与固体载体连接)。
在特定实施方案中，稳定的酶混合物进一步包括：i) BSA；ii)糖；和iii)至少一种选自以下的另外组分：无机盐、二价金属阳离子、缓冲剂、乳化剂和还原剂。在其它实施方案中，稳定的酶混合物进一步包含：i) BSA；ii)糖；iii)无机盐；iv)二价金属阳离子；v)缓冲剂；vi)乳化剂；和vii)还原剂。
在一些实施方案中，微流体卡进一步包含：h)与接头连接组分可操作地连接的纯化支路，其中纯化支路包含核酸纯化组分，其中核酸纯化组分包含经配置以与核酸测序文库上的接头杂交的锚定核酸序列。在其它实施方案中，微流体卡进一步包含经配置以允许用户取出至少部分核酸测序文库的出口。在某些实施方案中，片段化支路进一步包含：配置用于补齐片段化核酸末端的至少一类酶。在特定实施方案中，接头连接支路进一步包含：配置用于补齐核酸测序文库末端的至少一类酶。在其它实施方案中，稳定的酶混合物以干燥形式存在。在一些实施方案中，试剂混合物以干燥形式存在。
在其它实施方案中，泵组件包含波纹管(bellows)。在其它实施方案中，核酸提取组分包含膜。在另外的实施方案中，核酸提取组分包含过滤器。在特定实施方案中，微流体卡包含多个阀。在另外的实施方案中，配置卡以可操作地连接处理仪器并由其操作。在其它实施方案中，微流体卡进一步包含经配置以与处理仪器上的气动接口可操作地连接的多个通气口。在一些实施方案中，配置核酸接头用于选自以下的测序方法：ABI SOLID、ILLUMINASOLEXA、ROCHE 454、ION TORRENT、Lifetechnologies STARLITE和PACIFIC BIOSCIENCESSMRT测序。在另外的实施方案中，微流体卡进一步包含经配置以确定提取的核酸混合物是否需要扩增的传感器。
可用任何一类测序系统(例如作为可重复使用的卡或一次性卡)来整合本发明样品制备系统。在某些实施方案中，用包括HiSeq 2000、HiSeq 1000、HiScanSQ、基因组分析仪IIx、MiSeq在内的ILLIMINA SOLEXA测序仪整合本发明样品制备系统，其中可配置样品制备系统以与相关的Illumina软件例如PIPELINE 和/或CASAVA软件包一起工作。在其它实施方案中，用包括基因组测序仪 FLX系统和GS Junior系统在内的ROCHE 454测序仪整合本发明样品制备系统，其中可配置样品制备系统以与以下相关软件一起工作：GS Run Browser软件、GS De Novo Assembler软件、GS Reference Mapper软件、GS Amplicon VariantAnalyzer软件和GS FLX Titanium Cluster。在一些实施方案中，用包括Ion PersonalGenome Machine (PGM)测序仪在内的ION TORRENT测序仪整合本发明样品制备系统，其中可配置样品制备系统以与以下相关软件一起工作：DNASTAR® SeqMan® NGen®软件、Partek® Genomics Suite™软件、用于来自SoftGenetics 的Ion PGM平台的NextGENe®软件或Avadis NGS软件。在另外的实施方案中，用包括PacBio RS测序仪在内的PACIFICBIOSCIENCES测序仪整合本发明样品制备系统，其中可配置样品制备系统以与以下相关软件一起工作：RS remote软件、RS touch软件、Primary Analysis软件、SMRT Portal软件和SMRT View软件。
在一些实施方案中，本发明提供包含以下的系统：a)本文所述微流体卡；和b)经配置以接纳并运行微流体卡的处理仪器。在某些实施方案中，处理仪器包含选自以下的至少一种组件：压力储存器、真空储存器、至少一个泵、多个阀、至少一个加热器、气动接口和输入-输出计算机连接。在另外的实施方案中，处理仪器包含：压力储存器、真空储存器、至少一个泵、多个阀、至少一个加热器、气动接口和输入-输出计算机连接。
在一些实施方案中，本发明提供包含以下或基本上由以下组成或由以下组成的稳定的酶混合物：a)至少一类酶；b)牛血清白蛋白(BSA)；c)糖；和d)缓冲剂；和任选水。在某些实施方案中，稳定的酶混合物进一步包含至少一种选自以下的试剂或基本上由至少一种选自以下的试剂组成或由至少一种选自以下的试剂组成：无机盐；二价金属阳离子；乳化剂；和还原剂。
在特定实施方案中，本发明提供包含以下或基本上由以下组成或由以下组成的稳定的酶混合物：a)至少一类酶；b)牛血清白蛋白(BSA)；c)糖；d)无机盐；e)二价金属阳离子；f)缓冲剂；g)乳化剂；和h)还原剂。
在某些实施方案中，混合物进一步包含聚乙二醇(PEG) (例如PEG-8000或其它重量)。在其它实施方案中，稳定的酶混合物呈水性形式或呈冻干形式。在其它实施方案中，稳定的酶混合物允许酶在20-40℃储存达2个月后在20-25℃水合时保持其至少70%的活性(例如70% ... 75% ... 80% ... 85% ... 90% ... 95% ... 100%)。
在其它实施方案中，BSA在稳定的酶混合物中以0.05% - 3.0% (例如0.05% ...0.10% ... 0.5% ... 1.0% ... 2.0% ... 3.0%)的浓度存在。在其它实施方案中，糖以稳定的酶混合物的5-35% (例如5% ... 15% ... 25% ... 35%)的浓度存在。在其它实施方案中，糖为非还原性糖。在其它实施方案中，糖为二糖。在另外的实施方案中，糖为海藻糖。
在一些实施方案中，所述至少一类酶包含常温酶、热不稳定性酶或嗜热酶。在另外的实施方案中，所述至少一类酶包含聚合酶。在特定实施方案中，聚合酶为Phi-29聚合酶。在其它实施方案中，聚合酶为大肠杆菌(E. coli)聚合酶I。在另外的实施方案中，所述至少一类酶包含无机焦磷酸酶。在某些实施方案中，无机焦磷酸酶为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)无机焦磷酸酶。在另外的实施方案中，所述至少一类酶包含：Phi-29聚合酶、大肠杆菌DNa聚合酶I和酿酒酵母无机焦磷酸酶。
在某些实施方案中，无机盐在稳定的酶混合物中以1 mM - 25 mM (例如1 mM ...10 mM ... 17 mM ... 25 mM)的浓度存在。在其它实施方案中，无机盐为(NH4)2SO4。在某些实施方案中，二价金属阳离子在稳定的酶混合物中以1 mM - 30 mM (例如1 mM ... 10 mM... 20 mM ...或30 mM)的浓度存在。在特定实施方案中，二价金属阳离子为MgCl2。在其它实施方案中，缓冲剂以10 mM - 100 mM (例如10 mM ... 35 mM ... 75 mM ... 100 mM)的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲剂为Tris。
在特定实施方案中，乳化剂在稳定的酶混合物中以0.01% - 0.15% (例如0.01%... 0.1% ... 0.15%)的浓度存在。在一些实施方案中，乳化剂为吐温40、吐温20或吐温80。在另外的实施方案中，还原剂以1 mM - 10 mM (例如1 mM ... 5 mM ... 10 mM)的浓度存在。在某些实施方案中，还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。
在一些实施方案中，本发明提供用于稳定酶的组合物，所述组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：a)牛血清白蛋白(BSA)；b)糖；c)无机盐；和任选1)二价金属阳离子；2)缓冲剂；3)乳化剂；4)还原剂；和5) 水。
在其它实施方案中，本发明提供组合物，其包含大肠杆菌聚合酶I和牛血清白蛋白(BSA)或基本上由大肠杆菌聚合酶I和牛血清白蛋白(BSA)组成或由大肠杆菌聚合酶I和牛血清白蛋白(BSA)组成，其中组合物为冻干的组合物。在特定实施方案中，冻干的组合物允许大肠杆菌聚合酶I在20-40℃储存达至少1、2或3个月后在20-25℃水合时保留其至少70%的活性(例如70% ... 90% ... 100%)。
在某些实施方案中，本发明提供组合物，其包含无机磷酸酶和牛血清白蛋白(BSA)或基本上由无机磷酸酶和牛血清白蛋白(BSA)组成或由无机磷酸酶和牛血清白蛋白(BSA)组成，其中组合物为冻干的组合物。在一些实施方案中，冻干的组合物允许无机磷酸酶在20-40℃储存达2个月后在20-25℃水合时保留其至少70% (例如70% ... 90% ... 100%)的活性。
在其它实施方案中，本发明提供储存冻干的组合物的方法，所述方法包括：a)提供包含以下或基本上由以下组成或由以下组成的冻干的组合物：i)至少一类酶；ii)牛血清白蛋白(BSA)；iii)糖；iv)无机盐；v)二价金属阳离子；vi)缓冲剂；vii)乳化剂；和viii)还原剂；和b)在15-45℃储存温度下储存冻干的组合物达至少15天，以使至少一种酶在20-25℃水合时保留其至少70%的活性。在其它实施方案中，所述至少15天为至少30天 (例如至少30天 ... 60天 ... 90天 ... 120天 ...或更长)。在某些实施方案中，储存温度为20-25℃。在一些实施方案中，所述至少一种酶选自大肠杆菌聚合酶I、Phi-29聚合酶和无机焦磷酸酶。
在特定实施方案中，本发明提供产生稳定的酶组合物的方法，所述方法包括：a)提供：i)包含以下或基本上由以下组成或由以下组成的水性组合物：A)至少一类酶；B)牛血清白蛋白(BSA)；C)糖；D)无机盐；E)二价金属阳离子；F)缓冲剂；G)乳化剂；和H)还原剂；和ii)透析膜；和b)用透析膜将水性组合物透析到包含以下或基本上由以下组成的溶液中：i)所述糖；ii)所述无机盐；iii)所述二价金属阳离子；iv)所述缓冲剂；v)所述乳化剂；和vii)所述还原剂；c)冷冻水性组合物以产生冷冻的组合物；和d)让冷冻的组合物遭受高真空以经由升华去除水，由此产生冻干的组合物。
附图说明
图1显示演示现在用于下一代测序技术例如Roche 454方法的样品制备中涉及的冗长过程的流程图。
图2显示例示性注射成型微流体卡及可构成卡的各层。图2亦阐述首要的三条支路：细胞裂解、DNA提取和全基因组扩增。
图3显示例示性的具有各种标记支路的微流体卡，所述支路包括样品入口、DNA提取线路(circuit)和扩增线路，其包括冻干的酶(例如以下实施例1所述的酶)。
图4显示步骤1：使用微流体卡的样品制备过程。该图明确显示样品入口和混合室。
图5显示步骤2：裂解步骤。来自泡罩包的裂解缓冲液与来自样品的细胞一起流入混合室，以便裂解细胞。
图6显示步骤3，其中裂解的混合物通过捕获滤器然后通向废物室。然后让来自泡罩包的第一洗涤缓冲液通过过滤器，然后进入废物室。
图7显示步骤4，其中让第二洗涤液通过捕获滤器，然后通向废物室。然后空气干燥过滤器以去除洗涤缓冲液。
图8显示步骤5，其中来自泡罩包的洗脱缓冲液利用洗脱波纹管(elutionbellows)自过滤器去除纯化的核酸。洗脱波纹管将洗脱缓冲液缓慢泵送到过滤器。
图9阐述在本发明实施方案开发期间为评估裂解和提取步骤使用的三种参考样品(金黄色葡萄球菌(S. aureus)；蜡样芽胞杆菌(B. cereus)；和肺炎克氏杆菌(K.pneumoniae))。
图10显示用金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和肺炎克氏杆菌最终验证裂解和提取支路的结果。所显示的结果针对10,000 CFU的蜡样芽胞杆菌和肺炎克氏杆菌输入及新鲜生长的金黄色葡萄球菌培养物输入。
图11显示无污染的全基因组扩增试剂的生产。
图12显示步骤6，其中让纯化的核酸样品通过卡内含有试剂(包括稳定的酶混合物的冻干珠粒)的扩增支路。
图13显示例示性的含有卡内试剂(包括稳定的酶混合物的冻干珠粒)的微流体卡以及缓冲液包装配置。
图14显示现有技术的WGA酶混合物在储存期间不稳定，其在室温仅稳定5天。图14亦阐述在以下实施例I提供的冻干的扩增酶混合物的优势。
图15显示测试(在实施例1中)与Phi-29、聚合酶I和无机焦磷酸酶的相容性的多种赋形剂配方。
图16显示来自实施例1的结果，其表明BSA是稳定扩增酶的重要组分。
图17显示测试在酶稳定配方中的多种BSA水平(0.13%-1%终浓度)以及0.5% (终浓度) PEG-8000的加入，其如实施例1所述。
图18显示在Ibis配方33中冻干的酶储存在室温达4个月表现出等同于新鲜酶。
图19显示Ibis配方33中冻干的酶在40℃两个月后表现出等同于新鲜酶。
图20显示例示性微流体卡，其包括模制筒(含废物垫和液体试剂)、顶盖、层压底板和气动垫圈。
图21显示例示性缓冲液泡罩包的图像。图21阐述微流体卡的模制尖头可如何用于刺穿泡罩包并释放其储存的试剂。
图22显示用于与微流体卡对接并操作微流体卡的例示性的处理仪器的示意图。
图23显示与处理仪器一起工作的例示性的消耗性微流体卡的系统概况。
图24显示用物理或酶促手段使扩增的样品片段化的例示性的结果。
定义
本文所用短语"微流体卡"指这样的装置、筒(cartridge)或"卡"，其具有选择的内部通道、空隙或其它显微结构，所述其它显微结构具有至少一个大约0.1-500微米的维度。可用例如以下技术自各种材料制造微流体装置：激光模板印刷(laser stenciling)、压纹、冲压、注射成型、遮蔽(masking)、蚀刻和三维软平板印刷。进一步用粘合夹层或通过无粘合剂的热粘结技术(thermal adhesiveless bonding techniques)例如通过压力处理定向聚丙烯来制造层压微流体装置。层压和模制微流体装置的微架构可不同。在某些实施方案中，将本发明微流体卡设计为与提供控制接口和任选温度接口及磁接口的主机(hostinstrument)互相作用或与其“对接(dock)”。然而，卡通常含有实施测定所需的所有生物学试剂，仅需要施用一个或多个样品。这些卡通常为一次性的、单次使用的，通常以清洁特征制造以使在使用期间及处置时与生物危害材料接触的风险最小化。
本文所用术语"全基因组扩增"或"WGA"通常指这样的方法，其以非特异性方式(除非采用靶向WGA)扩增有限DNA样品，以便产生与原始样品不可区分但具有较高DNA浓度的新样品。理想的全基因组扩增技术将样品扩增到微克水平，但保持原始的序列表现。样品DNA可包括整个基因组或其部分。简并寡核苷酸引物PCR (DOP)、引物延伸PCR技术(PEP)和多重置换扩增(MDA)是全基因组扩增方法的实例。
本文所用术语"多重置换扩增"指基于非PCR的等温方法，所述方法基于随机六聚物退火(或在靶向方法中的非随机引物)以使DNA变性，接着在恒温时链置换合成。业已应用于小基因组DNA样品，导致合成具有有限序列表现偏倚的高分子量DNA。随着由链置换合成DNA，逐渐发生越来越多的引物引发(priming)事件，这形成高分支DNA结构网络。可通过例如Phi29 DNA聚合酶或通过Bst DNA聚合酶大片段催化反应。
详述
本发明提供集成样品制备系统和稳定的酶混合物。具体而言，本发明提供配置用于处理样品并产生适用于测序方法(例如下一代测序方法)或其它合适的核酸分析方法的DNA文库的微流体卡。本发明亦提供含有酶(例如在全基因组扩增中使用的酶)、BSA和糖的稳定的酶混合物。可冻干所述酶混合物并在室温储存数月而无显著的酶活性损失。
I.微流体卡和仪器
本发明提供用微流体卡将若干分子生物学过程/步骤整合到单一集成系统。然后可将集成的系统例如用于取样(例如临床、生物学、环境)并裂解细胞、提取核酸、扩增提取的核酸(例如全基因组扩增)、使扩增的核酸片段化、补齐DNA片段末端、连接接头和纯化处理过的核酸(例如适于测序的DNA测序文库)。集成过程显著减少处理时间、劳动(labor)，并通过使用自动化及集成到单独使用系统的质量控制试剂来改进该过程的一致性。
可将整个过程集成到含有实施该过程所需的所有试剂的单次使用的微流体卡上。在一些实施方案中，在卡内亦含有过程废物。可稳定试剂以使卡可在室温长时间储存。卡通常含有可将处理的结果(the resulting processed)移走的端口，并与各种各样的DNA测序技术一起使用，所述DNA测序技术例如Sanger测序、ABI SOLID、Illumina Solexa、Roche454、Ion Torrent、ABI Starlite、PacBio SMRT和其它核酸分析技术。
在某些实施方案中，采用由Micronics Inc.制造并在其专利出版物中阐述的微流体卡作为本发明的部分。将Micronics’ PanNAT™分子诊断平台阐述为能够处理独特筒的方便的电池和/或主要动力仪器(main powered instrument)，每一个筒都被设计为实施单个和/或多个核酸扩增测定。每一测定完全集成到包括所有必需试剂的一次性筒。仅需要少量生物学样品用于测定实施。在美国专利公开号20090325276中提供某些Micronics卡说明，其整体内容以如同本文完全提出一样通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明中采用的微流体卡如以下段落所述。
微流体卡由对应于独立测定模块的多个支路形成但集成到单一装置或两个或多个互相联系的装置。优选每一支路继而由微流体元件或组件组成。这些支路元件可包括微流体通道、三通、室(chamber)、阀、过滤器、固相捕获元件、分离过滤器、气动歧管(pneumatic manifolds)、泡罩包(blister pack)(例如含试剂袋)、废物隔离室(wastesequestration chamber)、清洁通风口、波纹管室(bellows chamber)、波纹管泵、光学窗口、测试垫和脱水试剂的微通道沉积物，所述脱水试剂任选包括缓冲剂、增溶剂和钝化剂。支路通常由塑料制成，并且可通过层压、通过模制和通过平板印刷或通过这些技术组合来制造。
卡装置通常为单一入口，意即在引入一个或多个样品后，密封装置以使任何潜在的生物危害永久地埋在卡中以便处置。然而，在某些实施方案中，卡具有用于移走所得DNA文库的出口。卡通常为自含式的，因为测定所需要的任何试剂都由制造商随该装置提供。应该理解，微流体装置任选可包括RFID、微芯片、条形码和帮助处理分析数据的标签，并且卡对接的主机任选为智能仪器，可将患者数据和测试结果传给网络。
亦命名为"微通道"的微流体通道为具有可变长度的流体通道，但横截面中的一维小于500 um。微流体通道中微流体的流体流动行为是高度非理想的层流，可能比起从这端到那端的压降或横截面积更依赖于壁的湿润性、粗糙度、液体粘度、粘附性和凝聚力。微流体的流动型态通常与通道中“虚拟液体壁(virtual liquid wall)”的存在有关。微流体通道由“三通”在流体上彼此连接或与其它过程元件连接。在微流体通道中形成阀，其可为止回阀、气动止回阀、夹阀(pinch valve)、表面张力阀等等，其按照惯例使用。
卡装置通常含有用于控制和流体操纵的上覆的气动歧管，但亦可使用电激活阀。通气口与气动歧管相连，通常激活波纹管泵。当阀被气动开启时，亦牵涉通气口。有时提供具有疏水分离过滤器(例如任何不渗透液体、渗透气体的滤膜)的通气口，其中在装置内流体渗漏是不希望且不安全的。通风口通常不直接与气动歧管连接，但起平衡其内的压力的作用。
反应室提供在微流体卡上，并且可为任何合适的形状，例如矩形室、圆形室、锥形室、螺旋形通道和用于实施反应的各种几何体。这些室可具有检查内容物的窗口，其如在检测室。废物隔离容器通常提供在微流体卡上。废物容器任选用清洁疏水膜通气。
图2显示例示性注射成型的微流体卡和可构成卡的各层。图2亦阐述首要的三支路：细胞裂解、DNA提取和全基因组扩增。
图3显示具各种标记支路的例示性微流体卡，包括样品入口、DNA提取线路和扩增线路，其包括冻干的酶(例如以下实施例1所述的酶)。
图4显示利用微流体卡的样品制备过程的步骤1。该图明确显示样品入口和混合室。
图5显示步骤2裂解步骤。来自泡罩包的裂解缓冲液与来自样品的细胞流向混合室，以使细胞裂解。
图6显示步骤3，其中让裂解的混合物通过捕获滤器然后通向废物室。然后让来自泡罩包的第一洗涤缓冲液通过过滤器，随后通向废物室。
图7显示步骤4，其中让第二洗涤液通过捕获滤器，然后通向废物室。然后空气干燥过滤器以去除洗涤缓冲液。
图8显示步骤5，其中来自泡罩包的洗脱缓冲液用洗脱波纹管从过滤器移出纯化的核酸。洗脱波纹管将洗脱缓冲液缓慢泵送经过过滤器。
图9阐述三种参考样品(金黄色葡萄球菌；蜡样芽胞杆菌；和肺炎克氏杆菌)，为了评估裂解和提取步骤在开发本发明实施方案期间使用它们。
图10显示用金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和肺炎克氏杆菌裂解和提取支路的最终验证结果。所示结果针对10,000 CFU的蜡样芽胞杆菌和肺炎克氏杆菌输入及新鲜生长的金黄色葡萄球菌培养物输入。
图11生产无污染的全基因组扩增试剂。在某些实施方案中，让用于WGA的试剂通过DNA吸收单元和0.2uM无菌过滤器。结果为纯化的试剂，其中阴性对照即使在12小时后也不产生DNA。
图12显示步骤6，其中让纯化的核酸样品通过扩增支路。在该路线中，可用某个区域实施全基因组扩增，在该区域纯化的样品与扩增缓冲液(其可与洗脱缓冲液一样)混合，加热到95℃，然后移到反应区域，在此处其与扩增酶在30℃混合。优选酶为冻干的扩增酶，其为稳定的酶混合物的部分，其如以下实施例1所述。
图13显示具有在卡内干燥的试剂(包括稳定的酶混合物的冻干珠粒)的例示性微流体卡以及缓冲液包装构造。
图14阐述现有技术WGA酶混合物在储存期间不稳定，且在室温仅稳定5天。图14亦阐述冻干的扩增酶混合物的优点，其在以下实施例1提供。
图20显示例示性微流体卡，其包括模制筒(含废物垫和液体试剂)、顶盖、层压底板和气动垫圈。
图21显示例示性缓冲液泡罩包的图像。图21阐述微流体卡上的模制尖头(moldedsharps)可如何用于刺穿泡罩包以释放其储存的试剂。
图22显示用于与微流体卡对接并操作微流体卡的例示性处理仪器的示意图。如该图所阐述，处理仪器包括运行仪器的处理器；可包括USB或以太网连接的输入-输出；为用户提供状态的LCD屏；和用于用户控制的触摸屏。处理仪器亦可包括气动系统，其含有空气泵、调节器、歧管、压力/真空储存器；和阀。处理仪器亦可包括带夹具的卡/筒接口、气动歧管和加热器。
图23显示与处理仪器工作的消耗性的微流体卡的例示性系统概貌。
图24显示用物理或酶学手段使WGA扩增的样品片段化的例示性结果。所述片段化可在步骤7中在微流体卡的片段化支路实施。可将扩增的样品移到片段化支路，然后用机械剪切(例如通过片段化支路中的孔口)或可经受限制性酶来片段化。可采用的片段化方法包括但不限于例如用限制性酶或切割引物切割。用限制性酶和切割引物的方法为本领域普通技术人员所熟知。然后可用酶例如Klenow片段补齐片段的末端。
在某些实施方案中，微流体卡中的下一支路是接头连接支路。在该支路，接头与片段化核酸末端连接。优选接头为在测序方法中使用的接头，例如在ABI SOLID、ILLUMINASOLEXA、ROCHE 454、ION TORRENT、ABI STARLITE和PACIFIC BIOSCIENCES SMRT测序中使用的接头。在以下进一步提供对这些测序技术及相关接头的说明。
II.全基因组扩增方法
在某些实施方案中，微流体卡具有在扩增支路中实施全基因组扩增(WGA)所必需、足够或有用的试剂。要注意的是，本发明不限于WGA作为扩增技术，因为可采用任何其它类型的适合的扩增技术(和相应试剂)，例如PCR或TMA，二者都为本领域熟知。
A.非靶标WGA
在很多研究领域，例如遗传诊断、癌症研究或法医学，缺少基因组DNA可为可对样品实施的基因测试类型和数量的严重限制因子。经设计以克服该问题的一个方法是全基因组扩增(WGA)。目标是以非特异性方式扩增有限的DNA样品，以产生与原始样品不可区分且具较高DNA浓度的新样品。典型的全基因组扩增技术的目标应是扩增样品到微克水平，同时维持原始序列表现。
在1992年首次阐述了全基因组扩增方法，其基于聚合酶链反应的原理。Zhang及同事(Zhang, L.等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 5847-5851，通过引用并入本文)开发了引物延伸PCR技术(PEP)，Telenius及合作者(Telenius等，Genomics. 1992,13(3):718-25，通过引用并入本文)设计了简并寡核苷酸引物PCR方法(DOP-PCR) Zhang等，1992)。
DOP-PCR为利用Taq聚合酶和半简并寡核苷酸(例如CGACTCGAGNNNNATGTGG (SEQID NO: 1)，例如其中N=A、T、C或G)的方法，所述半简并寡核苷酸在人基因组内在大约一百万个位点以低退火温度结合。第一个循环后接着以较高退火温度的很多循环，这允许对在第一步骤中加标签的片段进行扩增。
多重置换扩增(MDA，亦称为链置换扩增；SDA)为基于非-PCR的等温方法，其基于随机六聚体退火为变性的DNA，接着在恒温链-置换合成(Blanco等，1989, J. Biol. Chem.264:8935-40，通过引用并入本文)。其已经应用到小基因组DNA样品，导致合成具有有限序列表现偏倚的高分子量DNA (Lizardi等，Nature Genetics 1998, 19, 225-232；Dean等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 5261-5266；二者都通过引用并入本文)。随着通过链置换合成DNA，逐渐发生越来越多的引物引发事件，这形成超分支DNA结构网络。可通过Phi29 DNA聚合酶或通过Bst DNA聚合酶的大片段催化反应。Phi29 DNA聚合酶具有校正活性，这导致错误率比Taq聚合酶低100倍。
在一些实施方案中，多重置换扩增中采用的反应混合物包括多种聚合酶。在一些实施方案中，催化活性包括5'-3' DNA聚合酶活性、3'-5'核酸外切酶校正活性和DNA修复活性，例如，5' - 3'切除修复活性。各种聚合酶实例包括但不限于以下：Phi29、Klenow片段、T4聚合酶、T7聚合酶、BstE聚合酶、大肠杆菌Pol I、Vent、Deep Vent、Vent exo-、Deep Ventexo-、KOD HiFi、Pfu ultra、Pfu turbo、Pfu native、Pfu exo-、Pfu exo- Cx、Pfu cloned、PROOFSTART (Qiagen)、rTth、Tgo和Tfu Qbio。这些聚合酶为已知，且大部分可市购。
在其它实施方案中，在MDA反应混合物中包括其它非聚合酶或辅助蛋白，例如螺旋酶、促旋酶、T4G32和SSBP。在一些实施方案中，MDA反应混合物包括焦磷酸酶，其用于将焦磷酸盐转化为磷酸盐。在反应混合物中作为扩增反应的结果积聚焦磷酸盐(自加入的每一掺入三磷酸脱氧核苷酸产生一当量的焦磷酸盐，已知其抑制扩增反应)。在一些实施方案中，将约0.004单位的焦磷酸盐加到反应混合物中。
B.靶向WGA
在某些实施方案中，采用靶向全基因组扩增(TWGA)作为本发明部分。靶向WGA阐述于例如美国专利公开号20100035232中，其通过引用并入本文。
用于设计靶向全基因组扩增引物的靶标基因组
在一些优选实施方案中，选择一种或多种靶标基因组。靶标基因组的选择由分析目标决定。例如，若靶向全基因组扩增过程的期需结果为获得代表生物战生物例如炭疽杆菌(Bacillus anthracis) (其疑似存在于生物战攻击现场的土壤样品中)的基因组的核酸，则人们可以选择挑选炭疽杆菌基因组作为唯一的靶标基因组。在另一方面，若靶向全基因组扩增过程的期需结果为获得代表细菌组(例如潜在的生物战介质(biowarfare agents)的组)的核酸，则可选择多于一种靶标基因组，例如包含以下细菌的任何一种或全部的组：炭疽杆菌、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)、布鲁氏菌属(Brucella sp.)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)和大肠杆菌0157。同样，可选择不同基因组或基因组群作为用于其它目的的靶标基因组。例如，人基因组或线粒体DNA可以是土壤样品或可发生犯罪的其它样品环境中发现的共有基因组的靶标。因此，可施用目前方法和组合物，在背景基因组中选择性扩增人基因组(靶标)。其它实例可包括以下生物的基因组：引发呼吸性疾病的病毒群、引起脓毒病的病原体或已知污染家用品的真菌群。
用于设计靶向全基因组扩增引物的背景基因组
可基于某些生物体核酸的存在可能性来选择背景基因组。例如，可预期由人处理的土壤样品含有代表包括但不限于以下生物体的基因组的核酸：人(Homo sapiens)、原鸡(Gallus gallus)、蓝隐藻(Guillardia theta)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、酿酒酵母、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharmyces pom)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、兔脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)、Eremotheciumgossypii、平滑假丝酵母(Candida glabrata)、西方蜜蜂(Apis mellifera)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、疟蚊(Anophelesgambiae)和秀丽隐杆线菌(Caenorhabditis elegans)。这些基因组的任一个或所有都适合作为样品的背景基因组评估。实际上在任何特定样品中的生物体将基于每一样品的来源和/或环境而变化。因此，可基于实际上存在于样品中的生物体的身份来选择背景基因组。可用本领域普通技术人员所知的多种技术中的任何一种来测定样品组成。在又一实施方案中，可基于对样品中的一种或多种背景生物的实际鉴定并基于样品中任何一种或多种另外的背景生物的可能性来设计引物。
鉴别独特的基因组序列区段作为引物杂交位点
一旦确定了样品的靶标和背景基因组，下一步骤就是鉴定可用作引物杂交位点的靶标基因组内的基因组序列区段。特定靶向全基因组扩增效率取决于引物的有效利用。为了产生代表全基因组的扩增产物，在基因组长度范围内引物杂交位点应该具有适当间隔。优选引物杂交位点间的平均间隔距离为约1000个核碱基或更少。更优选平均间隔长度为约800个核碱基或更少。甚至更优选平均间隔长度为约600个核碱基或更少。最优选引物杂交位点间的平均间隔长度为约500个核碱基或更少。
本领域普通技术人员应认识到，有效引发全基因组扩增取决于若干因素，例如引物延伸所用的聚合酶的保真度和持续合成能力。若聚合酶具有高持续合成能力，则引物杂交位点间更长的平均间隔距离变得更可接受。这表明聚合酶与核酸模板紧密结合。这是靶向全基因组扩增所期需的特性，因为其使聚合酶能保持与模板核酸的结合，继续延伸正被合成的互补核酸链。具有高持续合成能力的聚合酶实例包括但不限于Phi29聚合酶和Taq聚合酶。例如，通过让聚合酶与DNA-结合蛋白共价连接，将蛋白质工程改造策略用于产生高持续合成能力的聚合酶(Wang等，Nucl. Acids Res., 2004, 32(3) 1197-1207，通过引用并入本文)。由于可获得具有改进的持续合成能力的聚合酶，对于靶向全基因组扩增，更长的平均间隔距离，甚至大大超过1000个核碱基可能是可接受的。
杂交灵敏度和选择性
为了靶向全基因组扩增的目的，引物杂交位点(基因组序列区段)长度和与其杂交的相应引物长度的选择，优选将平衡以下两个因素： (1)灵敏度，其表明特定引物与靶标基因组的结合频率；和(2)选择性，其表明特定引物以比与背景基因组杂交更高的频率与靶标基因组杂交的程度。通常较短的引物倾向于选择性较高而灵敏度较低，而对于较短的引物则反之亦然。优选长度为约5 -约13个核碱基的引物可用于靶向全基因组扩增；然而，也可使用落在该范围外的引物长度。人们应该认识到，该范围包含具有5、6、7、8、9、10、11、12和13个核碱基长度的引物。引物大小影响引物选择性和引物灵敏度之间的平衡。注意该平衡以确定每一样品的最佳引物长度。若可最佳维持样品的选择性和灵敏度，则长度小于5个核碱基或大于13个核碱基的引物亦有用。选择具有不同长度的多种引物提供靶标基因组序列间的广泛引发，同时亦提供引物与靶标基因组序列的优先结合(相对于背景基因组序列)。
选择阀值标准
在一些实施方案中，为了减少靶向全基因组扩增组中的总引物数，以便降低花费和引物组的复杂性，优选确定独特的总基因组序列区段的合适亚组。在一些实施方案中，确定独特基因组序列区段的合适亚组必需选择表明特定基因组序列区段的灵敏度和/或选择性的有用而实际的截止点的一种或多种阀值标准。所述标准实例包括但不限于所选择的事件的阀值频率(事件阀值的频率)和所选择的选择性比率(选择性比率阀值)。
在一些实施方案中，按照所述标准对独特的总基因组序列区段分等级是有用的。例如，按照事件频率对独特的总基因组序列区段分等级，其中#1级表明事件频率最大，而最低等级表明事件频率最低。然后可从各等级来选择事件的频率阀值。事件的频率阀值用作选择用于进一步分析的亚组成员和不再进一步分析的成员之间的分界线。
引物设计
设计为与所选基因组序列区段杂交的引物优选与基因组序列区段100%互补。在其它实施方案中，设计为与所选基因组序列区段杂交的引物为与基因组序列区段至少约70%-约100% (或其间的任何整数或分数)互补。一般而言，用于与所选核酸序列杂交的引物的设计为本领域技术人员所熟知，并且可通过市购计算机程序辅助。通常优选设计特定引物以使其与已分析并选择为引物杂交位点的基因组序列区段长度相同。然而，在某些情况下，相对于引物杂交位点改变引物长度可能有利。例如，若分析引物并发现其具有不利的熔化温度，则可获益于在5'或3'端延伸以产生与靶标基因组序列的亲和力改进的引物。可增加或减少引物长度。普通技术人员应认识到，引物长度的改变亦改变引物杂交位点，使得其不再与初始选择的基因组序列区段完全一样。在某些情况下，分析对应于特定长度改变的引物的杂交位点的基因组序列区段可能是有益的。这种分析可通过检查包括但不限于以下的数据来实施：事件频率和选择性比率，并且亦可通过实际体外检测长度改变的引物来实施。
在一些实施方案中，在其中设计与其相应的基因组序列区段小于100%互补的引物可能有利的情况下，对假定基因组序列区段的重新计算选择标准(例如事件频率和选择性比率)的互补性进行检查亦有利，所述假定基因组序列区段与这样的引物100%互补，所述引物与其相应的初始基因组序列区段具有小于100%的互补。如果该选择标准不利，考虑设计具有改进的选择标准的备选引物序列将有利。
III.测序技术
如上所述，本发明实施方案涉及对用微流体卡产生的DNA文库进行测序。本发明不受所采用的测序方法类型的限制。例示性测序方法如下所述。
核酸测序技术的阐明性非限制性实例包括但不限于链终止剂(Sanger)测序和染料终止剂测序。链终止剂测序使用经修饰的核苷酸底物利用DNA合成反应的序列特异性终止。通过使用在该区域与模板互补的短的放射性标记或其它标记的寡核苷酸引物，在模板DNA的特异性位点启动延伸。用DNA聚合酶、标准四种脱氧核苷酸碱基和低浓度的一条链终止核苷酸(最常用二脱氧核苷酸)来延伸寡核苷酸引物。在四个单独管中重复该反应，每一种碱基轮流作为二-脱氧核苷酸。通过DNA聚合酶有限掺入链终止核苷酸产生一系列相关DNA片段，所述片段仅在其中使用特定二-脱氧核苷酸的位点终止。对于每一反应管，通过在平板聚丙烯酰胺凝胶或填充粘性聚合物的毛细管中的电泳来按大小分离片段。当从凝胶顶部扫描到底部时，通过读出哪条泳道从标记引物产生显现标记来测定序列。
染料终止剂测序备选地标记终止剂。可通过用单独的荧光染料标记每一个二-脱氧核苷酸链-终止剂，在单个反应中实施完全测序，所述荧光染料在不同波长时发荧光。
业已出现称为“下一代测序”技术的一组方法(Voelkerding等，Clinical Chem.,55: 641-658, 2009；MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；每一个通过引用以其整体并入本文)作为Sanger和染料终止剂测序方法的备选方法。最近的方法阐述下一代测序技术用于全基因组从头测序以确定生物体的一级核酸序列的用途。另外，靶向重-测序(深度测序)使得可在野生型序列群体内进行敏感突变检测。一些实例包括最近的工作，其阐述对HIV药物抗性变体以及用于测定对抗-TK治疗药物的反应的EGFR突变的鉴定。阐述条形码引物序列的用途的最近的出版物允许在典型测序运行期间对多个样品同时测序，所述出版物包括例如：Margulies, M.等，“Genome Sequencing in Microfabricated High-Density Picolitre Reactors (在微制造的高密度Picolitre反应器中的基因组测序)”,Nature, 437, 376-80 (2005)；Mikkelsen, T.等， “Genome-Wide Maps of ChromatinState in Pluripotent and Lineage-Committed Cells (在多潜能性和谱系定型细胞中的染色质状态的基因组范围图谱)”, Nature, 448, 553-60 (2007)；McLaughlin, S.等，“Whole-Genome Resequencing with Short Reads: Accurate Mutation Discovery withMate Pairs and Quality Values(用短阅读重新测定全-基因组序列：具配对和质量价值的准确突变发现)”, ASHG Annual Meeting (2007)；Shendure J.等，“AccurateMultiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome(进化的细菌基因组的准确多重Polony测序)”, Science, 309, 1728-32 (2005)；Harris, T.等， “Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome (病毒基因组的单-分子DNA测序)”,Science, 320, 106-9 (2008)；Simen, B.等， “Prevalence of Low Abundance DrugResistant Variants by Ultra Deep Sequencing in Chronically HIV-infectedAntiretroviral (ARV) Naïve Patients and the Impact on Virologic Outcomes (通过在慢性HIV-感染抗逆转录病毒(ARV)幼稚患者中的超深度测序测定低丰度药物抗性变体的流行性及对病毒结果的影响)”，第16届国际HIV药物抗性研讨会，Barbados (2007)；Thomas, R.等，“Sensitive Mutation Detection in Heterogeneous Cancer Specimensby Massively Parallel Picoliter Reactor Sequencing(通过大规模并行皮升反应器测序在异质癌样本中的敏感突变检测)”, Nature Med., 12, 852-855 (2006)；Mitsuya, Y.等， “Minority Human Immunodeficiency Virus Type 1 Variants in Antiretroviral-Naïve Persons with Reverse Transcriptase Codon 215 Revertant Mutations(在具有逆转录酶密码子215回复突变的幼稚抗逆转录病毒人中的少数人免疫缺陷病毒1型变体)”,J. Vir., 82, 10747-10755 (2008)；Binladen, J.等， “The Use of Coded PCR PrimersEnables High-Throughput Sequencing of Multiple Homolog Amplification Productsby 454 Parallel Sequencing(通过454并行测序使用编码的PCR引物使得可进行多种同源扩增产物的高通量测序)”, PLoS ONE, 2, e197 (2007)；和Hoffmann, C.等， “DNA BarCoding and Pyrosequencing to Identify Rare HIV Drug Resistance Mutations(DNA条形码编码法和焦磷酸测序来鉴别罕见的HIV药物抗性突变)”, Nuc. Acids Res., 35,e91 (2007)，所有参考文献都通过引用并入本文。
与传统Sanger测序比较，下一代测序技术产生大量测序数据点。典型运行可易于在每次运行产生数十到数百兆碱基，且可能的日输出达到10千兆碱基范围。这说明比标准96孔板大了若干数量级，96孔板可在典型的多重运行中产生数百个数据点。少至一个核苷酸不同的靶标扩增子可容易地区别，即使是在存在来自相关物种的多个靶标时。这大大提高了准确基因分型的能力。用于产生共有序列的下一代序列比对软件程序可易于鉴别新的点突变，所述点突变可产生与药物抗性相关的新的株系。引物条形码编码的使用亦允许在单次测序运行中对不同患者样品进行多重测序。
下一代测序(NGS)方法与老的测序方法比较，享有大规模并行、高通量策略且较低花费目标的共有特征。NGS方法可大体上分为需要模板扩增和不需要模板扩增的方法。需要扩增的方法包括由Roche作为454技术平台(例如GS 20和GS FLX)市售的焦磷酸测序、由Illumina市售的Solexa平台和由Applied Biosystems市售的支持寡核苷酸连接和检测(Supported Oligonucleotide Ligation and Detection, SOLiD)平台。非扩增方法亦称为单-分子测序，其分别由Helicos BioSciences市售的HeliScope平台和由VisiGen andPacific Biosciences市售的新兴平台来例证。
在焦磷酸测序(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568；每一个通过引用以其整体并入本文)中，将模板DNA片段化，进行末端修复，连接到衔接子，并通过用含有与衔接子互补的寡核苷酸捕获单个模板分子来原位克隆扩增。将含有单模板类型的珠粒划分为油包水微泡区域，用称为乳液PCR的技术克隆扩增模板。扩增后破坏乳液，让珠粒沉积到皮滴定板(picotitre plate)的单个孔中，所述板在测序反应期间作为流动池(flow cell)起作用。在测序酶和发光报告物例如荧光素酶存在下，四种dNTP试剂的每一种的有序迭代引入发生在流动池。在将合适dNTP加到测序引物3’末端的事件中，导致产生ATP，这引起孔内爆发发光，其用CCD相机记录。达到大于或等于400个碱基的阅读长度是可能的，可实现1 x 106个序列阅读，这产生高达500百万个碱基对(Mb)的序列。
在Solexa/Illumina平台(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658,2009；MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号6,833,246；美国专利号7,115,400；美国专利号6,969,488；每一个通过引用以其整体并入本文)中，测序数据以较短长度阅读形式产生。在该方法中，末端修复单链片段化的DNA，以产生5'-磷酸化的钝端，接着Klenow-介导添加单个A碱基到片段的3'末端。A-添加促进加入T-突出衔接子寡核苷酸，其随后被用于捕获用寡核苷酸锚散布的流动池表面上的模板-衔接子分子。将锚用作PCR引物，但因为模板长度及其与其它邻近锚寡核苷酸的接近，PCR延伸导致“拱于(archingover)”与邻近锚寡核苷酸杂交的分子之上，以在流动池表面上形成桥结构。让这些DNA环变性并裂解。然后用可逆染料终止剂来测定正向链的序列。掺入的核苷酸序列通过掺入后荧光的检测来测定，且在下一dNTP添加循环之前移走每一种荧光剂和封阻剂(fluor andblock)。序列阅读长度介于36个核苷酸-超过50个核苷酸范围，且每一分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。
用SOLiD技术(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号5,912,148；美国专利号6,130,073；每一个通过引用以其整体并入本文)对核酸分子进行测序亦涉及模板片段化、与寡核苷酸衔接子连接、与珠粒附着和通过乳液PCR克隆扩增。此后，将含有模板的珠粒固定到玻璃流动池的衍生表面，并使与衔接子寡核苷酸互补的引物退火。然而，不是利用该引物进行3'延伸，反而是提供5'磷酸基团用于与探测探针(interrogation probe)连接，所述探针含有两个探针特异性碱基，接着6个简并碱基和四个荧光标记之一。在SOLiD系统中，探测探针具有在每一探针的3'末端的两个碱基和5'末端的四种荧光剂之一的16种可能组合。荧光颜色并由此每一探针的身份对应于特定颜色空间的编码方案。在多轮(通常7轮)探针退火、连接和荧光检测后，接着变性，然后用相对于初始引物偏离一个碱基的引物来进行第二轮测序。以该方式，可通过计算来重构模板序列，并探测模板碱基两次，这导致准确性提高。序列阅读长度平均为35个核苷酸，每一测序运行的总输出超过40亿碱基。
在某些实施方案中，采用纳米孔测序(参见例如Astier等，J Am Chem Soc. 2006年2月8日；128(5):1705-10, 通过引用并入本文)。纳米孔测序所基于的理论与当纳米孔浸入传导流体并对其施加电势(电压)时发生的事件有关：在这些条件下，可观察到由于通过纳米孔传导离子所致的微小电流，电流量对纳米孔大小极为敏感。若DNA分子通过(或DNA分子部分通过)纳米孔，则这可引起通过纳米孔的电流的数量级变化，藉此使得可测得DNA分子的序列。纳米孔可为在金属和/或非金属表面上制造的固态孔或基于蛋白质的纳米孔，例如α-溶血素(Clarke等，Nat. Nanotech., 4, 2009年2月22日: 265-270)。
Helicos BioSciences的HeliScope (Voelkerding等，Clinical Chem., 55:641-658, 2009；MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号7,169,560；美国专利号7,282,337；美国专利号7,482,120；美国专利号7,501,245；美国专利号6,818,395；美国专利号6,911,345；美国专利号7,501,245；每一个通过引用以其整体并入本文)是第一个商业化的单-分子测序平台。该方法不需要克隆扩增。将模板DNA片段化，在3'末端聚腺苷酸化，且最后的腺苷含有荧光标记。在流动池表面将变性的聚腺苷酸模板片段与聚(dT)寡核苷酸连接。由CCD相机记录捕获的模板分子的初始物理位置，然后裂解标记并洗掉。通过加入聚合酶和顺序添加荧光-标记的dNTP试剂来实现测序。掺入事件产生对应于dNTP的荧光信号，在每一轮dNTP添加之前由CCD相机捕获信号。序列阅读长度介于25-50个核苷酸范围，且每一分析运行的总输出超过10亿核苷酸对。其它新出现的单分子测序方法包括通过用VisiGen平台合成的实时测序(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；美国专利号7,329,492；美国专利申请序列号11/671956；美国专利申请序列号11/ 781166；每一个通过引用以其整体并入本文)，其中用荧光修饰的聚合酶和荧光接纳体分子对固定的、引发的DNA模板进行链延伸，这导致在添加核苷酸时产生可检测的荧光能量共振转移(FRET)。由Pacific Biosciences开发的另一实时单分子测序系统(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009；MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7:287-296；美国专利号7,170,050；美国专利号7,302,146；美国专利号7,313,308；美国专利号7,476,503；全部通过引用并入本文)利用直径50-100 nm的反应孔，包含大约20zeptoliter (10 x 10-21 L)的反应体积。用固定化模板、经修饰的phi29 DNA聚合酶和高局部浓度的荧光标记的dNTP实施测序反应。高局部浓度和连续反应条件使得可通过用激光激发、光波导和CCD相机进行荧光信号检测来实时捕获掺入事件。
在某些实施方案中，采用由Pacific Biosciences开发的使用零模式波导(zero-mode waveguide，ZMW)的单分子实时(SMRT) DNA测序方法或类似方法。用该技术在SMRT芯片上实施DNA测序，每一芯片含有数千零模式波导(ZMW)。ZMW是直径为数十纳米的孔，其在沉积在二氧化硅基底上的100nm金属膜中制造。每一ZMW成为纳米光子显现室(nanophotonic visualization chamber)，其提供恰好20 zeptoliter (10-21升)的检测体积。以该体积，单分子的活性可在数千标记的核苷酸背景中检测。
ZMW提供用于随着其通过合成实施测序来观察DNA聚合酶的窗口。在每一室内，让单个DNA聚合酶分子附着于底部表面，使得其永久位于检测体积内。然后以促进酶加速、准确性及持续合成能力的高浓度将磷连接的(Phospholinked)核苷酸(每一类用不同颜色荧光团标记)引入到反应溶液中。由于ZMW尺寸小，即使是以这些高的生物学相关浓度，检测体积也仅在少量时间内被核苷酸占据。另外，对检测体积的访问非常快，仅持续几微秒时间，这是由于携带核苷酸扩散的距离极短。该结果为极低背景。
随着DNA聚合酶掺入互补核苷酸，每一碱基在检测体积内保持数十毫秒，其比核苷酸扩散进出检测体积所花费的时间长数个数量级。在此期间，被占据的荧光团发射颜色对应于碱基身份的荧光。然后，作为天然掺入循环的部分，聚合酶裂解将荧光团保持在适当位置的键，染料扩散出检测体积。掺入后信号立即回到基线，该过程重复进行。
在未被妨碍且未中断的情况下，DNA聚合酶继续以每秒数十个碱基的速度掺入碱基。以这种方式，在数分钟内产生DNA的完全天然的长链。在SMRT芯片上所有数千个ZMW间同时并连续进行实时检测。PacBio研究者业已证明该方法具有产生数千核苷酸阅读长度的能力。
实施例
为了提供本发明的某些例示性实施方案，呈现以下实施例，所述实施例并非意欲限制其范围。
实施例1
稳定的酶混合物
本实施例阐述用于诸如全基因组扩增(WGA)等方法的稳定的酶混合物的开发。如图15所述，检测了很多赋形剂配方与Phi-29聚合酶I和无机焦磷酸酶的WGA的相容性。发现16种专利的稳定配方(称作赋形剂)对于成功稳定通常在WGA中使用的酶无用。发现了BSA是用于稳定这些酶的重要组分，其如图16所示。
已开发的一种优选的赋形剂称作"Ibis配方33 (Ibis Formula 33)"。如何制备该配方的说明如下。将8968 u/ml Phi-29聚合酶(Monserate)、180 u/ml聚合酶I (EpicentreBiotechnologies)、3.6 u/ml 无机焦磷酸酶(U.S. Biochemical)的混合物与含有以下物质的溶液以1:1混合：20%海藻糖、10 mM (NH4)2SO4、12 MgCl2、50 mM Tris pH 7.6、0.05%吐温40、4mM DTT和达到终浓度0.25%的水平的BSA(由于在透析期间体积变化，在透析过程中BSA浓度较高以便溶液可达到透析后正确的终体积)。在室温用30 KDa透析膜将该混合物在4小时内透析到含有 20%海藻糖、10 mM (NH4)2SO4、12 MgCl2、50 mM Tris pH 7.6、0.05%吐温40和4mM DTT的溶液中。
然后从透析膜移出透析的酶混合物，并且用含有20%海藻糖、10 mM (NH4)2SO4、12MgCl2、50 mM Tris pH 7.6、0.05% 吐温40和4mM DTT的溶液使其达到正确的终体积(在透析/稀释过程中稀释水平控制每一冻干单位存在多少酶)。然后将该溶液等分到合适体积中，冷冻，施加高真空以经由升华除去水，以产生冻干的组合物。
用上述的相同通用流程检测多种BSA水平(0.13%-1%终浓度)以及0.5% (终浓度)PEG-8000的加入。该检测结果示于图17中。
使用在本工作中开发的赋形剂，我们成功证明在冻干过程中保持了所有这三种酶的酶活性，并且这些酶的稳定性从室温(-25℃)下小于10天显著增加到40℃下超过2个月。当与新鲜(即储存在-20℃冰箱中直到使用)的酶混合物比较时，该配方亦提高总反应产率。室温储存的长期稳定性结果示于图18中。该图显示在Ibis配方33中冻干的酶当储存在室温达4个月时表现出与新鲜酶等同。图19显示用40℃加速老化达2个月的长期储存稳定性，其等同于室温储存大约6个月。图19显示Ibis配方33中冻干的酶表现出与在40℃下2个月后的新鲜酶等同。
实施例2
样品制备方法
本实施例阐述可例如用于微流体装置的各种样品制备方法。所述方法使得可利用单一通用缓冲液，这使将样品保留在单一管中成为可能。所述方法概要包括以下步骤：裂解和提取；全基因组扩增(或其它扩增方法)；DNA的片段化；末端补齐；连接；不完全产物的去除；和最终净化(clean-up)。以下阐述所述步骤中多个的某些细节。
i.例示性片段化方法
可用由以下构件组成的装置使扩增的样品(例如WGA样品)片段化：1)超声波仪组件：2.4兆赫的微型超声喷雾器Sonaer 241V；2)转换器：金包被的喷雾器晶体Sonaer 24AU；3)电源：24伏电源Sonaer ST624；和4)盖：机械加工的塑料以在超声波仪组件中产生外壳(enclosure)。用本方法超声可实施总共10分钟时间，且使用15秒开、15秒关的间隔的50%工作循环。
ii.优化连接反应速度
从初始条件优化连接速度，这使得可显著增加在30分钟内产生的最终产物的量。优化包括修饰的缓冲液组分或浓度和修饰的酶浓度。参数如下表1所示。反应条件为30℃、30分钟和65℃、10分钟。
表1
优化的重要参数包括：连接酶浓度、ATP浓度、PEG浓度，反应1分钟后焦磷酸钠的加入。优化条件导致显著增加30分钟后的最终产物。
iii.扩增缓冲液中的WGA酶有效补齐
检查条件以测试补齐效率。测试条件包括：反应时间、反应温度、dATP浓度、DTT浓度、PEG浓度、亚精胺浓度、聚赖氨酸浓度。所采用的参数示于下表2中。采用的反应条件为：37℃、5分钟；50℃、2分钟；和75℃、10分钟。
表2
所采用的分析方法为电子喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOF MS)。发现的(fond)一个重要参数是反应温度(这是重要参数，因为低于55℃观察到极少的A-拖尾，而高于55℃观察到明显的A-拖尾)、dATP浓度(增加dATP浓度增加A-拖尾)。结果发现100%的产物被合适地变钝，大约70%的末端为A-拖尾。
iv.核酸外切酶净化连接反应
用上表1所示“条件1”实施连接反应，用exo III和exo VII消化(具有稍微不同的发夹/插入序列)。以下所示发夹和插入物浓度为连接反应之前。连接反应期间大部分插入物转化为“最终产物”。所用条件示于表3中。反应条件为37℃、1小时和70℃、10分钟。
表3
应注意到WGA扩增引物包括在所有这些反应中，即使它们不是确定其是否可引起任何抑制(未观察到任何一个)的反应的部分。类似地，dNTP包括在反应(例如连接反应或外切酶消化)中，即使它们在确定其是否可引起任何抑制(未观察到任何一个)的反应中不需要。核酸外切酶降解非环状模板，这去除了除终产物外的任何DNA。
本说明书所提及的所有出版物和专利通过引用并入本文。对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明范围和精神的情况下，可对本发明所述方法和组合物进行各种修改和改变。尽管业已连同具体优选实施方案阐述本发明，但应该理解，要求保护的本发明不应该不适当地限于所述具体实施方案。事实上，对相关领域技术人员显而易见的是，用于实施本发明的所述方式的各种修改，意欲在所附权利要求书的范围内。

Claims (16)

1.一种产生核酸测序文库的方法，包含：
a) 将生物学样品引入微流体卡的装载端口；
b) 在所述微流体卡的核酸提取支路中自所述生物学样品中提取核酸；
c) 在所述微流体卡的扩增支路中对所述核酸进行扩增以产生扩增的核酸，所述扩增支路包含稳定的酶混合物；
d) 在所述微流体卡的片段化支路中对所述扩增的核酸进行片段化，以产生片段化的核酸；
e) 在所述微流体卡的所述片段化支路中对所述片段化的核酸的末端进行补齐，以产生包含补齐的末端的片段化的核酸；
f) 在所述微流体卡的接头连接支路中将包含所述补齐的末端的所述片段化的核酸与核酸接头连接，以产生所述核酸测序文库；
g) 在所述微流体卡的所述接头连接支路中对与所述核酸接头连接的所述片段化的核酸的末端进行补齐，以产生包含补齐的末端的核酸测序文库；和
h) 在所述微流体卡的纯化支路中对包含补齐的末端的所述核酸测序文库进行纯化，以产生纯化的核酸测序文库。
2.权利要求1的方法，其中所述微流体卡包含：
g)与所述装载端口可操作地连接的裂解支路，其中所述裂解支路包含：
i)裂解室，和
ii)裂解缓冲液。
3.权利要求1的方法，其中所述扩增支路包含酶，所述酶用于实施全基因组扩增(WGA)，聚合酶链反应(PCR)，或转录介导扩增(TMA)。
4.权利要求1的方法，其中所述扩增支路包含酶，所述酶选自：Phi-29聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I，无机焦磷酸酶或其任意组合。
5.权利要求1的方法，其中所述稳定的酶混合物包含：i)BSA；ii)糖；和iii)至少一种选自以下的另外组分：无机盐、二价金属阳离子、缓冲剂、乳化剂和还原剂。
6.权利要求1的方法，其中所述稳定的酶混合物包含：i)BSA；ii)糖；iii)无机盐；iv)二价金属阳离子；v)缓冲剂；vi)乳化剂；vii)和还原剂。
7.权利要求6的方法，所述BSA以0.05% - 3.0%的浓度存在，所述糖以5-35%的浓度存在，所述无机盐以1 mM - 25 mM的浓度存在，所述二价金属阳离子以1 mM - 30 mM的浓度存在，所述缓冲剂以10 mM - 100 mM的浓度存在，所述乳化剂以0.01% - 0.15%的浓度存在，和所述还原剂以1 mM - 10 mM的浓度存在。
8.权利要求2的方法，其中所述微流体卡包含废物室，所述废物室与所述裂解支路、所述核酸提取支路、所述扩增支路、所述片段化支路、和/或所述接头连接支路和所述纯化支路中的一个或多个可操作地连接。
9.权利要求1的方法，其中所述微流体卡包含用于使缓冲液和样品流过的处理仪器。
10.权利要求1的方法，包含提供一个或多个密封包装，所述密封包装包含所述裂解缓冲液、所述洗涤缓冲液、所述洗脱缓冲液、所述稳定的酶混合物、配置用于消化所述扩增的核酸的所述试剂混合物和所述连接酶混合物中的一种或多种。
11.权利要求2的方法，其中所述微流体卡的所述裂解支路、所述核酸提取支路、所述扩增支路、所述片段化支路、所述接头连接支路和所述纯化支路依次可操作地连接。
12.权利要求2的方法，其中所述提取支路包含洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，且其中所述洗涤缓冲液、所述洗脱缓冲液和所述裂解缓冲液是单一缓冲液。
13.权利要求1的方法，其中所述接头为核酸衔接子。
14.权利要求1的方法，其中所述生物学样品为人体样品、患者样品、生物战样品、环境样品、土壤样品或包含靶标基因组和背景基因组的样品。
15.一种对核酸进行测序的方法，包含：
a) 将生物学样品引入微流体卡的装载端口；
b) 在所述微流体卡的核酸提取支路中自所述生物学样品中提取核酸；
c) 在所述微流体卡的扩增支路中对所述核酸进行扩增以产生扩增的核酸，所述扩增支路包含稳定的酶混合物；
d) 在所述微流体卡的片段化支路中对所述扩增的核酸进行片段化，以产生片段化的核酸；
e) 在所述微流体卡的所述片段化支路中对所述片段化的核酸的末端进行补齐，以产生包含补齐的末端的片段化的核酸；
f) 在所述微流体卡的接头支路中将包含所述补齐的末端的所述片段化的核酸与核酸接头连接，以产生所述核酸测序文库；
g) 在所述微流体卡的所述接头支路中对与所述核酸接头连接的所述片段化的核酸的末端进行补齐，以产生包含补齐的末端的核酸测序文库；
h) 在所述微流体卡的纯化支路中对包含补齐的末端的所述核酸测序文库进行纯化，以产生纯化的核酸测序文库；
i) 自所述微流体卡的出口取出所述纯化的核酸测序文库；和
j) 将所述纯化的核酸测序文库引入测序系统。
16.权利要求15的方法，其中测序系统包含链终止剂测序、染料终止剂测序、 基于扩增的下一代测序、焦磷酸测序、支持寡核苷酸连接和检测(SOLiD)测序, 基于非扩增的下一代测序、单分子测序、纳米孔测序、通过合成的实时测序以及使用零模式波导(ZMWs)的单分子实时(SMRT)测序。
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