JP4558382B2 - アフィニティクロマトグラフィ用デバイス及びその製法 - Google Patents
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Description
本発明は、アフィニティクロマトグラフィ用デバイス及びその製法に関するものである。
分析分野に於いて、サンプリングから目的成分の抽出、濃縮等の工程には、夫々の目的成分に応じた分離、捕捉、精製等の所謂前処理が不可欠である。
特に、生物科学分野に於いては、生体試料の混合物の中から分析対象成分を分離するためには、所望物質の性質に対応した夫々の分離技術が必須要件である。
生物科学分野に於いて扱うサンプルは非常に低濃度、然も低溶量であることが多く、微量なサンプルに対して対応可能なツールが少なく、限られている。
その一例として、酵素カラムやアフィニティカラムを用いた多次元ＬＣ−ＭＳは利用が挙げられる。具体的には、Journal of Chromatography Ａ，1000（2003）413にあるように、ＬＤＨ（蛋白質）をオンラインでトリプシンカラムに送り、酵素消化させ、それをＣ１８固相を充填したトラップカラムにてトラップさせ、脱塩濃縮を行い分析カラムを経てＭＳにて検出する方式が提案されている。（非特許文献１参照）
特に、生物科学分野に於いては、生体試料の混合物の中から分析対象成分を分離するためには、所望物質の性質に対応した夫々の分離技術が必須要件である。
生物科学分野に於いて扱うサンプルは非常に低濃度、然も低溶量であることが多く、微量なサンプルに対して対応可能なツールが少なく、限られている。
その一例として、酵素カラムやアフィニティカラムを用いた多次元ＬＣ−ＭＳは利用が挙げられる。具体的には、Journal of Chromatography Ａ，1000（2003）413にあるように、ＬＤＨ（蛋白質）をオンラインでトリプシンカラムに送り、酵素消化させ、それをＣ１８固相を充填したトラップカラムにてトラップさせ、脱塩濃縮を行い分析カラムを経てＭＳにて検出する方式が提案されている。（非特許文献１参照）
この様な多次元ＬＣ−ＭＳの場合、液体を高圧下にて移動させるので、迅速な処理が可能である。
その反面、ポンプや専用バルブ等の使用により、高コストは避けられない。更に、試料は高圧にて処理されることになり、その影響を免れることは出来ない。又、測定にはシステム全体の検討、最適化が必要であり、長時間を要する。
その反面、ポンプや専用バルブ等の使用により、高コストは避けられない。更に、試料は高圧にて処理されることになり、その影響を免れることは出来ない。又、測定にはシステム全体の検討、最適化が必要であり、長時間を要する。
アフィニティクロマトグラフィを実施するフォーマットは種々あるが、カラムにビーズ材料を詰める方式が最も普及している。
この方式は、シリカゲル等のビーズ材料を母体に、所望の物質に対応した処理を施した充填剤をカラムに充填し、所望の物質を含有した液体をカラムに通し、ビーズに接触させ、その上に固定化させた捕捉物質に所望の物質を結合させるものである。
この方式は、ビーズをカラムやチップ、固相シリンジ等に充填して所望物質を含有した液体を流すものであり、捕捉用物質が該液体に接触する率が極めて高く効率的な捕捉が行われる利点がある。
この方式は、シリカゲル等のビーズ材料を母体に、所望の物質に対応した処理を施した充填剤をカラムに充填し、所望の物質を含有した液体をカラムに通し、ビーズに接触させ、その上に固定化させた捕捉物質に所望の物質を結合させるものである。
この方式は、ビーズをカラムやチップ、固相シリンジ等に充填して所望物質を含有した液体を流すものであり、捕捉用物質が該液体に接触する率が極めて高く効率的な捕捉が行われる利点がある。
この方法では、ビーズ等の充填剤をカラムやチップ、固相シリンジに充填する操作が不可欠である。この充填操作は、充填剤の充填状態によって、流量の変化、流通系路の偏重等が生じ易く、結果的に分析値のバラツキを招じ易く、困難な作業である。
又、この方式は、単位時間当たりの流体の流れに対する抵抗が大きい。ビーズ等の固相と流体の接液効率の向上を目指して固相粒子を小さく形成すると抵抗が更に大きくなる。この結果、単位時間当たりの流量が少ないため、流体の拡散時間も遅くなり、分析時間が長くかかることになる。
又、この方式は、単位時間当たりの流体の流れに対する抵抗が大きい。ビーズ等の固相と流体の接液効率の向上を目指して固相粒子を小さく形成すると抵抗が更に大きくなる。この結果、単位時間当たりの流量が少ないため、流体の拡散時間も遅くなり、分析時間が長くかかることになる。
更に、充填剤をチップや固相シリンジに充填した後に、リガンドを修飾することがあるが、通液性が悪く，流体の拡散が遅く、修飾操作は困難である。
殊に、リガンドとなるサンプルが希少な場合に、それに対応した少量のアフィニティ充填剤の調整は、即ち、少量の固相に対する修飾状態の調整は極めて困難である。従って、充填剤への所望物質の固定量を特定することは無理であること、このことは極少量の各所望物質に対応するアフィニティ充填剤の作成が至難であることを物語る。
そのため、サンプルをチップの先端に所望量固定することは困難であると云うことである。
殊に、リガンドとなるサンプルが希少な場合に、それに対応した少量のアフィニティ充填剤の調整は、即ち、少量の固相に対する修飾状態の調整は極めて困難である。従って、充填剤への所望物質の固定量を特定することは無理であること、このことは極少量の各所望物質に対応するアフィニティ充填剤の作成が至難であることを物語る。
そのため、サンプルをチップの先端に所望量固定することは困難であると云うことである。
又、微量サンプルに対するアフィニティツールとして、近年ピペットチップ先端部に吸着性分子を組込んだ多孔質の膜を固定したチップによるアフィニティクロマトグラフィが提案されている。（特許文献１参照）
これは従来公知のチップの端部に分離物を置くという考え方（特許文献２参照）が、二つのフリット間にカラム材料を置いたチップを提案しているのに対し、サンプル中の所望の成分量が少ない場合、大量のサンプルを通過させ処理に長い時間がかかる上、標的物質を取りこぼす可能性や収量が低くなる可能性がある。又、この問題に対応するため、固相の量を増大させることに対する反応時間が長くなるという欠点を解消しようとしたものである。
この構成は、ピペットチップの前方端部又はそれに隣接して、ピペットチップを横切って膜を設けること、この膜は織物、不織布等のメッシュのように多孔である。又、この膜は、化学的相互作用、疎水性結合、物理的吸着、電荷の相互作用により、流体中に存在している成分と結合したりして、成分を捕捉出来るように構成したり、捕捉用物質を組込んだりして構成する。（特許文献１参照）
これは従来公知のチップの端部に分離物を置くという考え方（特許文献２参照）が、二つのフリット間にカラム材料を置いたチップを提案しているのに対し、サンプル中の所望の成分量が少ない場合、大量のサンプルを通過させ処理に長い時間がかかる上、標的物質を取りこぼす可能性や収量が低くなる可能性がある。又、この問題に対応するため、固相の量を増大させることに対する反応時間が長くなるという欠点を解消しようとしたものである。
この構成は、ピペットチップの前方端部又はそれに隣接して、ピペットチップを横切って膜を設けること、この膜は織物、不織布等のメッシュのように多孔である。又、この膜は、化学的相互作用、疎水性結合、物理的吸着、電荷の相互作用により、流体中に存在している成分と結合したりして、成分を捕捉出来るように構成したり、捕捉用物質を組込んだりして構成する。（特許文献１参照）
これまでにも粒子担体への蛋白質の固定は数多く行われており、実際蛋白質固定化用の粒子担体も市販されている。そして、蛋白質を固定化したステンレスの空カラム等に自ら充填することにより、アフィニティカラムとして使用する。
しかしながら、充填操作はそれなりのスキルがあり、初心者が気軽にできるような簡便なものではない。又、充填操作は、充填剤が非常に少量の場合、つまり小容量対応のアフィニティーカラムを作ることは難しい。何故なら、固定化したいアフィニティーリガンドが非常に少量しか調整できない場合、充填剤への固定は困難であるためである。
しかしながら、充填操作はそれなりのスキルがあり、初心者が気軽にできるような簡便なものではない。又、充填操作は、充填剤が非常に少量の場合、つまり小容量対応のアフィニティーカラムを作ることは難しい。何故なら、固定化したいアフィニティーリガンドが非常に少量しか調整できない場合、充填剤への固定は困難であるためである。
又、微量サンプルに対するアフィニティツールとして多孔質体のポリマーマトリックス支持体内に吸着性粒子を包含させ、ピペット先端部に注型されたチップによるアフィニティクロマトグラフィが提案されている。（特許文献３参照）
これは、吸着性又は反応性物質として、或はサイズに基いた分離のための充填、非充填構造物を現場で種々の容積のハウジング中に媒質を付加するもので、ポリマー中に実質的な量の媒質の包含を可能にさせたものである。
この具体例として、ＰＶＤＦ溶液等に溶媒を用いて球状シリカを混合させてピペット先端部に充填させる工程等によりピペット先端に多孔質ポリマー支持体内にシリカ粒子等を含有させて所望成分を保持させるものである。
これは、吸着性又は反応性物質として、或はサイズに基いた分離のための充填、非充填構造物を現場で種々の容積のハウジング中に媒質を付加するもので、ポリマー中に実質的な量の媒質の包含を可能にさせたものである。
この具体例として、ＰＶＤＦ溶液等に溶媒を用いて球状シリカを混合させてピペット先端部に充填させる工程等によりピペット先端に多孔質ポリマー支持体内にシリカ粒子等を含有させて所望成分を保持させるものである。
上記のようにピペット等のハウジングに、流体中に存在する成分を結合する物質を有する膜や粒子、多孔質ポリマー中に取込んだ構造物を設けた構成のアフィニティクロマトグラフィの場合、少量の試料に対応して簡便に微量サンプルに対応する利点を有する。
これらの方式は膜は流体中に存在している成分と結合するため、その成分を捕捉するように、例えばその成分の特異的パートナーを組み込むとしているが、この製作工程は極めて困難な作業であり、且つ組み込んだパートナーの活性化を保持して有効に作用させることは至難である。
又、多孔質のポリマー支持体に捕捉された粒子を含み、粒子化学の適切な選択により容量１μｇ未満の試料の素材充填物に対する選択的な結合、溶離クロマトグラフィを含むあらゆる分離、精製操作を実施できるとしているが、所望粒径の選択によってもポリマー支持体の多孔質の孔部詳細を特定的に求めることは困難であり、計算上求められるものではなく、実証的に得ていくしかなく、極めて困難な作業であり、所望物質に対応して夫々定めていく外ない。
更に、図７、図８に示すように、ポリマー支持体の通孔はランダムにしか構成されないため、その通液性は特定されず、通液量は定まらない。
要するにこれらの方式は、試料の微量さに対応する固定量の特定は無理であり、アフィニティ充填剤の特定量の充填操作は無理である。特に、多孔質ポリマーの通孔の特定は出来ない点は重大である。
又、多孔質のポリマー支持体に捕捉された粒子を含み、粒子化学の適切な選択により容量１μｇ未満の試料の素材充填物に対する選択的な結合、溶離クロマトグラフィを含むあらゆる分離、精製操作を実施できるとしているが、所望粒径の選択によってもポリマー支持体の多孔質の孔部詳細を特定的に求めることは困難であり、計算上求められるものではなく、実証的に得ていくしかなく、極めて困難な作業であり、所望物質に対応して夫々定めていく外ない。
更に、図７、図８に示すように、ポリマー支持体の通孔はランダムにしか構成されないため、その通液性は特定されず、通液量は定まらない。
要するにこれらの方式は、試料の微量さに対応する固定量の特定は無理であり、アフィニティ充填剤の特定量の充填操作は無理である。特に、多孔質ポリマーの通孔の特定は出来ない点は重大である。
糖鎖解析を例にとって説明すると、蛋白質の糖鎖解析には、蛋白質消化、糖化ペプチドの回収、糖鎖の切出し等の前処理が必要になる。
先ず、生体試料の蛋白質を消化酵素であるトリプシンによる消化によって行うが、その際使用するトリプシンの量は試料中に含まれる蛋白質の約５０分の１から１００分の１量になるように添加して消化反応を行う。なぜならば、添加するトリプシンの量を増やすと、反応進行速度は増加するが、その後の実験に於いて生体試料以外の蛋白質が多量に含まれることは、望ましいことではないためである。そのため、少量のトリプシンによって消化反応を行うためには、通常２４時間など長い時間を要する。
先ず、生体試料の蛋白質を消化酵素であるトリプシンによる消化によって行うが、その際使用するトリプシンの量は試料中に含まれる蛋白質の約５０分の１から１００分の１量になるように添加して消化反応を行う。なぜならば、添加するトリプシンの量を増やすと、反応進行速度は増加するが、その後の実験に於いて生体試料以外の蛋白質が多量に含まれることは、望ましいことではないためである。そのため、少量のトリプシンによって消化反応を行うためには、通常２４時間など長い時間を要する。
この様にして得られた蛋白質の消化産物（ペプチド）の中から、糖鎖がついているペプチドを特異的に回収するためには、レクチンなどの糖蛋白質に対して親和性を有する蛋白質を固定化したビーズを用いたバッチ法による回収方法がある。
しかしながら、この方法に於いても、ビーズの回収操作には、結合、洗浄、溶出の各ステップに於いて遠心操作が必要である。又、粒子タイプでの回収操作では、液が入ってくる側と、液の抜ける側とは液抵抗における圧力の均一性がなく、細孔内部への液の接触が異なってしまう。そのため、吸着粒子とサンプルとの結合平衡に要する時間も１時間以上要する場合が通常である。
最後に回収した糖化ペプチドからの糖鎖の切出しであるが、この場合もトリプシンを用いた場合と同様に少量の酵素で、長時間かけて反応を行う必要がある。
この様に糖鎖解析に於いては前処理の段階で２〜３日要するのが現状である。
しかしながら、この方法に於いても、ビーズの回収操作には、結合、洗浄、溶出の各ステップに於いて遠心操作が必要である。又、粒子タイプでの回収操作では、液が入ってくる側と、液の抜ける側とは液抵抗における圧力の均一性がなく、細孔内部への液の接触が異なってしまう。そのため、吸着粒子とサンプルとの結合平衡に要する時間も１時間以上要する場合が通常である。
最後に回収した糖化ペプチドからの糖鎖の切出しであるが、この場合もトリプシンを用いた場合と同様に少量の酵素で、長時間かけて反応を行う必要がある。
この様に糖鎖解析に於いては前処理の段階で２〜３日要するのが現状である。
通常安定に充填剤へリガンドを固定する場合は、それなりのスケールで行うものであり、マイクロリットルオーダーのリガンド溶液を固定化することは難しい。特許文献１の例は、蛋白質固定化キットも最小容量は１ｍｌであり、マイクロリットルオーダーのアフィニティツールとしては用いることは出来ない。更に、例え少量の充填剤を調整できたしとても、カラムへの充填操作も少量に対応しなければならず、更に充填へのスキルが求められる。
通常、充填剤を固定化するタイプのピペットチップに於いて、多量のリガンドをピペット先端に固定化しようとする場合、充填剤を多量に固定化するか、粒子径を小さくすることによって達成することが考えられる。しかしながら、両方法では、溶液の拡散性の悪さとピペッティングにおける抵抗が上がるため、分析の長時間、再現性の悪化を招いてしまう。
本明細書に於いて、ピペッテイングとは、マイクロピペットなどを用いて液体を吸入、排出する行為である。
活性基は、モノリス構造体表面の官能基と固定化するリガンドの官能基を結合する物質であり、二価性試薬のことである。又、モノリス構造体に固定化され活性担体と云う。
又、リガンドとは、分析対象物質に親和性を持つ化学物質や蛋白質などである。
活性基は、モノリス構造体表面の官能基と固定化するリガンドの官能基を結合する物質であり、二価性試薬のことである。又、モノリス構造体に固定化され活性担体と云う。
又、リガンドとは、分析対象物質に親和性を持つ化学物質や蛋白質などである。
前述の如く、これら膜を用いたアフィニティデバイスでも充填剤を用いたカラムの構成の場合と同様その問題点は、大部分当て嵌まることになる。即ち通液量の確保、特に単位時間当たりの流量が少ないことは非常に大きく、流体の拡散時間も遅いため、分析時間がかかる点は免れない。この単位時間当たりの流量は、夫々の所望目的物に応じた膜のメッシュやポリマーの透過性の調整、粒子の径等、夫々のニーズに対応して変化してくるため、その調整は至難である。
然も、膜やポリマーは極めて薄く形成される必要があり、サンプルをチップ先端等に多量に固定することは困難である。又、膜厚を厚く形成すると流通抵抗が上がり、分析時間の延長に繋がってしまう。
前記の構成の場合、結局のところ、透過膜を使用するものであるが、それらの外径寸法、容量等は明らかにされているものの対応所望物質に対応する膜の構成は記載なく、目的物に対応して膜の構成を行うことは殆ど不可能である。
このため、目的物に対応した固相の選択、固相に固定するリガンドの適正量に対応した構成は各種の経験、実験等の成果を待たなければ求められなかったのである。
然も、膜やポリマーは極めて薄く形成される必要があり、サンプルをチップ先端等に多量に固定することは困難である。又、膜厚を厚く形成すると流通抵抗が上がり、分析時間の延長に繋がってしまう。
前記の構成の場合、結局のところ、透過膜を使用するものであるが、それらの外径寸法、容量等は明らかにされているものの対応所望物質に対応する膜の構成は記載なく、目的物に対応して膜の構成を行うことは殆ど不可能である。
このため、目的物に対応した固相の選択、固相に固定するリガンドの適正量に対応した構成は各種の経験、実験等の成果を待たなければ求められなかったのである。
上記課題を解決するため、本発明者らは、第１にピペットチップ等のデバイスの通液孔の一部に多連続孔を持ち、開放構造の一体型構造であって、試料の分子量に対応した細孔径を有するモノリス構造体あるいは、試料に適したコーティング材及び／又は化学修飾材を施して、細孔の表面を修飾・改質したモノリス構造体を固定させ、該モノリス構造体内にリガンドを固定するための試薬を有する反応液により、活性基を修飾させると共に、ピペッティングによりリガンド所望量を固定させて、サンプルの容量或いは濃度に対応して吸着可能としたことを特徴とし、第２に前記モノリス構造体にリガンドを固定するための試薬を有する反応液により、活性基を修飾させる際に、ピペッティングにより行うことを特徴とし、第３に前記モノリス構造体表面にポリアミンを修飾することにより、高分子蛋白質を固定することを特徴とし、第４にピペットチップ等のデバイスの通液孔の一部に多連続孔を持ち、開放構造の一体型構造であって、試料の分子量に対応した細孔径を有するモノリス構造体あるいは、試料に適したコーティング材及び／又は化学修飾材を施して、細孔の表面を修飾・改質したモノリス構造体を嵌合固定させると共に、ピペッティングにより前記モノリス構造体にリガンド固定のための試薬により活性基を選択的に修飾させると共に、ピペッティングにより活性担体に選択されるリガンドを固定化したことを特徴とし、第５にアフィニティクロマトグラフ用デバイスを用い、リガンドに結合した目的物質をピペッティングによりトラップあるいは溶出することを特徴とする。
今回発明者の提案したピペットチップ型アフィニティツールを用いると、これらの点を改善することが可能になる。
つまり、ピペットチップ先端にトリプシン等の酵素を高濃度に固定化することにより、サンプルである蛋白質に対する量比を増加させることが可能になるため、消化に要する時間を短縮することが可能になる。又、担体に酵素を固定化することが出来るため、酵素がサンプルに混入することも防止することができる。
又、粒子タイプの吸着剤とは異なり、液の流れるマクロ細孔表面にミクロ細孔があるので、全て単一な入り込みが生じる。そのため、結合平衡化に要する時間も短縮させることが可能である。
以上のことからこれまで２〜３日要していた前処理の時間を数回のピペッテイング、時間にして約１時間足らずで達成することが出来、大幅な前処理時間の短縮が可能になる。
つまり、ピペットチップ先端にトリプシン等の酵素を高濃度に固定化することにより、サンプルである蛋白質に対する量比を増加させることが可能になるため、消化に要する時間を短縮することが可能になる。又、担体に酵素を固定化することが出来るため、酵素がサンプルに混入することも防止することができる。
又、粒子タイプの吸着剤とは異なり、液の流れるマクロ細孔表面にミクロ細孔があるので、全て単一な入り込みが生じる。そのため、結合平衡化に要する時間も短縮させることが可能である。
以上のことからこれまで２〜３日要していた前処理の時間を数回のピペッテイング、時間にして約１時間足らずで達成することが出来、大幅な前処理時間の短縮が可能になる。
そこで本発明では、充填操作に関するスキルが求められず、更に少量（マイクロリットルオーダー）に対応したアフィニティツールを提供出来るものである。
又、モノリスを使用する場合、ミクロ細孔を小さくすることで、表面積を大きくすることが可能になる。然も、拡散性、ピペッティングも低下することはない。そのため、多量のリガンドを固定化することが可能である。
然も、１０回程度のピペッティングによりリガンド、活性基等の所望材を固定化することが出来る。
又、モノリスを使用する場合、ミクロ細孔を小さくすることで、表面積を大きくすることが可能になる。然も、拡散性、ピペッティングも低下することはない。そのため、多量のリガンドを固定化することが可能である。
然も、１０回程度のピペッティングによりリガンド、活性基等の所望材を固定化することが出来る。
又、ミクロ細孔を各自で選択可能なことから、以下のような利点がある。
例えば、ミクロ細孔を用いたサイズ排除を行うことが可能になる。生体試料成分の中から薬物代謝物などの低分子を特異的に回収したい場合、試料中に含まれる巨大な蛋白質などのマトリックスはターゲットである低分子の結合を阻害することがよくある。
本発明によれば、これらの巨大蛋白質に阻害されることなく低分子を回収することが可能になる。
実際、ミクロ細孔を小さくしたモノリスよりも、ミクロ細孔を大きくしたモノリスのほうが表面積は小さくなるにもかかわらず（ミクロ細孔が大きいほうが表面積が小さくなるのは、粒子充填剤に於いて粒子が大きいほうが表面積が小さくなることと理由は同じである。）、蛋白質の固定量又は結合量はミクロ細孔が大きいほうが巨大な蛋白質が結合した。
例えば、ミクロ細孔を用いたサイズ排除を行うことが可能になる。生体試料成分の中から薬物代謝物などの低分子を特異的に回収したい場合、試料中に含まれる巨大な蛋白質などのマトリックスはターゲットである低分子の結合を阻害することがよくある。
本発明によれば、これらの巨大蛋白質に阻害されることなく低分子を回収することが可能になる。
実際、ミクロ細孔を小さくしたモノリスよりも、ミクロ細孔を大きくしたモノリスのほうが表面積は小さくなるにもかかわらず（ミクロ細孔が大きいほうが表面積が小さくなるのは、粒子充填剤に於いて粒子が大きいほうが表面積が小さくなることと理由は同じである。）、蛋白質の固定量又は結合量はミクロ細孔が大きいほうが巨大な蛋白質が結合した。
本発明に於いて使用されるデバイスは、ピペットチップが適している。然しその形態はピペットチップに限られず、ウェル、多数のウェルの配列、プラスチックやガラスの筒状体等各種選択できる。その容量は限定されないが、マイクロピペットに接続して使用される点を考慮すると、０．００５〜５ｍｌ程度が好ましく、更に好ましくは０．０１〜１ｍｌである。
このデバイスたるピペットチップは、材料は特に限定されないが、プラスチック、ガラス、ステンレス等が用いられる。然し、耐熱性、耐薬品性を考慮に入れ選択し、更にＰＣＲ等の酵素反応、蛋白質消化反応等を阻害するものであっては好ましくない。プラスチック材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリエステル等が使用される。
このデバイスたるピペットチップは、材料は特に限定されないが、プラスチック、ガラス、ステンレス等が用いられる。然し、耐熱性、耐薬品性を考慮に入れ選択し、更にＰＣＲ等の酵素反応、蛋白質消化反応等を阻害するものであっては好ましくない。プラスチック材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリエステル等が使用される。
ピペットは、一端に使い捨てピペットチップを設ける通常の市販のマイクロピペットが適当であり、当該技術者に平常使用されるものである。ピペットチップの一端はピペットに嵌合して着脱自在とした型であり、テーパー上の嵌め合いが簡便であるが、クリンプ、熱収縮、エッチング等の処理をすることも可能である。
デバイス１は、筒状に形成され、一端にはピペット１０に嵌合する取付口５、他端には開口６を設け、その間に流体の通路や液溜めとなる通液孔２を有するピペットチップ３より構成される。通液孔２の一部には、モノリス構造体４を設置してある。通液孔２の一部とはピヘットチップ３の先端に設けた開口６、即ち通液孔２の先端であるか、通液孔２の内方の一部である。このデバイス１はピペットチップ或は単にチップとも云う。又、ピペットチップのモノリス構造体４に修飾剤を固定したものをチップと云うことも出来る。
デバイス１は、筒状に形成され、一端にはピペット１０に嵌合する取付口５、他端には開口６を設け、その間に流体の通路や液溜めとなる通液孔２を有するピペットチップ３より構成される。通液孔２の一部には、モノリス構造体４を設置してある。通液孔２の一部とはピヘットチップ３の先端に設けた開口６、即ち通液孔２の先端であるか、通液孔２の内方の一部である。このデバイス１はピペットチップ或は単にチップとも云う。又、ピペットチップのモノリス構造体４に修飾剤を固定したものをチップと云うことも出来る。
モノリス構造体４は、多連続孔を持ち、開放構造の一体型構造の多孔質体である。
モノリス構造体４はガラス、シリカ等の無機質又は無機物に有機物を含有するハイブリット体で、上面から下面まで貫通しているマクロ細孔を有する多孔質体である。又、有機物、例えばメタクリレート化合物や、ジビニルベンゼンなどのビニルポリマーを用いたモノリス構造体などがある。
この多孔質体は１〜１００μｍのマクロ細孔を有するものが好ましい。更にミクロ細孔０〜４００ｎｍを有するのが好ましい。（図５）この両方のマクロ細孔、ミクロ細孔を有する構成としては、一つはマクロ細孔の内壁に狭い細穴を分布して有する構成と、二つはマクロ細孔の孔部にミクロ細孔を平均的に分布して有する構造体を有する構成と考えられる。実施例に使用したのは、後者の構成である。
このモノリス構造体４は修飾すべき活性基やリガンドに応じ、或はサンプルに応じて又はその組合せに対応して選択でき、更にはマクロ、ミクロ細孔もそれらに対応して選択使用出来る。
モノリス構造体４はガラス、シリカ等の無機質又は無機物に有機物を含有するハイブリット体で、上面から下面まで貫通しているマクロ細孔を有する多孔質体である。又、有機物、例えばメタクリレート化合物や、ジビニルベンゼンなどのビニルポリマーを用いたモノリス構造体などがある。
この多孔質体は１〜１００μｍのマクロ細孔を有するものが好ましい。更にミクロ細孔０〜４００ｎｍを有するのが好ましい。（図５）この両方のマクロ細孔、ミクロ細孔を有する構成としては、一つはマクロ細孔の内壁に狭い細穴を分布して有する構成と、二つはマクロ細孔の孔部にミクロ細孔を平均的に分布して有する構造体を有する構成と考えられる。実施例に使用したのは、後者の構成である。
このモノリス構造体４は修飾すべき活性基やリガンドに応じ、或はサンプルに応じて又はその組合せに対応して選択でき、更にはマクロ、ミクロ細孔もそれらに対応して選択使用出来る。
サンプルとポアサイズの関連
今回使用したモノリス構造体の場合、ミクロ細孔のサイズが２０ｎｍのモノリスを用いた場合は分子量４０，０００以上の蛋白質の結合が低下する。そのため、分子量４０，０００以上の蛋白質を固定化する場合は、それ以上の（例えば４０ｎｍ）ミクロ細孔のサイズを用いたモノスリを用いることが推奨される。
又、ミクロ細孔を開けずにシングルポアモノリスを作成後、ポリアミン（分子量１０，０００程度）を修飾することによって、ミクロ細孔を作成することなく巨大な蛋白質を多量に固定化することも可能である。
因みに蛋白質の分子量の一例を挙げると次の通りである。
Trypsin 22900
ＩｇＧ 150000
ProteinＡ 104000
これらのモノリス構造体の構成の点については、特許文献４、同５、同６、同７に提案されている。
本発明に於いて使用されるモノリス構造体としては、そのいずれでも使用できる。
今回使用したモノリス構造体の場合、ミクロ細孔のサイズが２０ｎｍのモノリスを用いた場合は分子量４０，０００以上の蛋白質の結合が低下する。そのため、分子量４０，０００以上の蛋白質を固定化する場合は、それ以上の（例えば４０ｎｍ）ミクロ細孔のサイズを用いたモノスリを用いることが推奨される。
又、ミクロ細孔を開けずにシングルポアモノリスを作成後、ポリアミン（分子量１０，０００程度）を修飾することによって、ミクロ細孔を作成することなく巨大な蛋白質を多量に固定化することも可能である。
因みに蛋白質の分子量の一例を挙げると次の通りである。
Trypsin 22900
ＩｇＧ 150000
ProteinＡ 104000
これらのモノリス構造体の構成の点については、特許文献４、同５、同６、同７に提案されている。
本発明に於いて使用されるモノリス構造体としては、そのいずれでも使用できる。
本発明に使用できるモノリス構造体の製法を下記に示す。
先ず、約１００ｎｍ以上の巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゾルをゾルーゲル法によって作製し、そのバルク状ゲルを粉砕せずに様々な組成を持つ水溶液に浸漬することにより、巨大空孔の内壁が最大２０ｎｍ程度の狭い細穴分布を持った、二重気孔の多孔質体に変化させる。この方法によれば、従来の多孔体に於いて避け得なかった広い細穴系分布ではなく、所望する中心細孔径と狭い分布を持つ細孔構造を再現性よく与える、無機系多孔質体を作ることができる。つまりは、巨大空孔と細穴の２種類のポア、ダブルポア構造が実現する。
先ず、約１００ｎｍ以上の巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゾルをゾルーゲル法によって作製し、そのバルク状ゲルを粉砕せずに様々な組成を持つ水溶液に浸漬することにより、巨大空孔の内壁が最大２０ｎｍ程度の狭い細穴分布を持った、二重気孔の多孔質体に変化させる。この方法によれば、従来の多孔体に於いて避け得なかった広い細穴系分布ではなく、所望する中心細孔径と狭い分布を持つ細孔構造を再現性よく与える、無機系多孔質体を作ることができる。つまりは、巨大空孔と細穴の２種類のポア、ダブルポア構造が実現する。
先ず、水溶性高分子であるポリエチレンオキシド０．７０ｇを０．００１規定酢酸水溶液１０ｇに溶解し、この溶液にテトラメトキシシラン５ｍｌを撹拌下で加えて加水分解反応を行った。数分撹拌した後、得られた透明溶液を密閉容器に移し、４０℃の恒温槽中に保持したところ、約４０分後に固化した。
固化した試料を更に数時間熟成させ、０．１規定アンモニア水溶液中に、４０℃で１日毎に溶液を更新しながら３日間以上浸漬した。このとき、アンモニア水溶液のｐＨ値は約１０であった。この処理の後、ゲルを６０℃で乾燥し、１００℃／ｈの昇温速度で６００℃まで加熱した。これによって、非晶質シリカよりなる多孔質体を得た。
得られた多孔質体中には、中心孔径１．６μｍ（１６００ｎｍ）程度の揃った貫通孔が三次元網目状に絡み合った構造で存在していることが電子顕微鏡及び水銀圧入測定によって確かめられた。そして、その貫通孔の内壁に直径１０ｎｍ程度の細孔が多数存在していることが、窒素吸着測定によって確かめられた。
尚、アンモニア溶液浸漬の温度を２５℃或は６０℃に変化させた以外は、上記と同一条件で多孔質体を製造したところ、貫通孔の空孔分布は変わらないが、窒素吸着法によって図られる中心細孔系は夫々、約６ｎｍ或は１３ｎｍに変化した。
アンモニア溶液浸漬の温度が高いほど大きい細孔径が得られることが分かり、温度によるコントロールが可能であることも確認された。
固化した試料を更に数時間熟成させ、０．１規定アンモニア水溶液中に、４０℃で１日毎に溶液を更新しながら３日間以上浸漬した。このとき、アンモニア水溶液のｐＨ値は約１０であった。この処理の後、ゲルを６０℃で乾燥し、１００℃／ｈの昇温速度で６００℃まで加熱した。これによって、非晶質シリカよりなる多孔質体を得た。
得られた多孔質体中には、中心孔径１．６μｍ（１６００ｎｍ）程度の揃った貫通孔が三次元網目状に絡み合った構造で存在していることが電子顕微鏡及び水銀圧入測定によって確かめられた。そして、その貫通孔の内壁に直径１０ｎｍ程度の細孔が多数存在していることが、窒素吸着測定によって確かめられた。
尚、アンモニア溶液浸漬の温度を２５℃或は６０℃に変化させた以外は、上記と同一条件で多孔質体を製造したところ、貫通孔の空孔分布は変わらないが、窒素吸着法によって図られる中心細孔系は夫々、約６ｎｍ或は１３ｎｍに変化した。
アンモニア溶液浸漬の温度が高いほど大きい細孔径が得られることが分かり、温度によるコントロールが可能であることも確認された。
又、多孔質ガラスの製造法について一例を示す。
ＳｉＯ２ ５９．０、Ｂ２Ｏ３ ２５．０、ＺｒＯ２ ５．０、Ａｌ２Ｏ３ ３．０、ＣａＯ ３．０、Ｎａ２Ｏ ５．０各重量部を溶融し、直径２ｍｍのロッドを５４０℃にて７時間処理し、次いで７５０℃にて約３２時間処理して分相させた。相分離物を９０℃にて１Ｎ硫酸（酸（ｍｌ）／ガラス（ｇ）の比＝１７０）を用いて２日間酸処理し、その後０．５Ｎ−ＮａＯＨ（酸（ｍｌ）／ガラス（ｇ）の比＝１００）を用いて６時間アルカリ処理した。得られたガラスロッドを熱蒸留水で洗浄し、乾燥後、デシケーター中で保存した。得られたガラスロッドの細孔容積は、０．６ｍｌ／ｇであり、中心細穴直径３ミクロンであった。粒子径分布の測定は、水銀圧入法により測定した。得られた多孔質ガラス材を機械加工により柱状態に成型した。このマクロ多孔質ガラスに、テトラエトキシシランに塩酸を加え調整したゾルを含浸させた後に熟成させることにより、ミクロ細孔の多孔質シリカガラスを形成した。これに、ジメチル−ｎ−オクタデシルクロロシラン（ＯＤＳ）を用い疎水化処理を行った。
ＳｉＯ２ ５９．０、Ｂ２Ｏ３ ２５．０、ＺｒＯ２ ５．０、Ａｌ２Ｏ３ ３．０、ＣａＯ ３．０、Ｎａ２Ｏ ５．０各重量部を溶融し、直径２ｍｍのロッドを５４０℃にて７時間処理し、次いで７５０℃にて約３２時間処理して分相させた。相分離物を９０℃にて１Ｎ硫酸（酸（ｍｌ）／ガラス（ｇ）の比＝１７０）を用いて２日間酸処理し、その後０．５Ｎ−ＮａＯＨ（酸（ｍｌ）／ガラス（ｇ）の比＝１００）を用いて６時間アルカリ処理した。得られたガラスロッドを熱蒸留水で洗浄し、乾燥後、デシケーター中で保存した。得られたガラスロッドの細孔容積は、０．６ｍｌ／ｇであり、中心細穴直径３ミクロンであった。粒子径分布の測定は、水銀圧入法により測定した。得られた多孔質ガラス材を機械加工により柱状態に成型した。このマクロ多孔質ガラスに、テトラエトキシシランに塩酸を加え調整したゾルを含浸させた後に熟成させることにより、ミクロ細孔の多孔質シリカガラスを形成した。これに、ジメチル−ｎ−オクタデシルクロロシラン（ＯＤＳ）を用い疎水化処理を行った。
又、有機物のモノリス構造体の製造について記す。
液体クロマトグラフィーに取付けるに適した継ぎ手が両端末に備わっているステンレス鋼製間の１つの末端を、鋼製ナットストッパーで閉じ、この管を窒素パージした後、そのもう一方の末端をシリコンゴム隔壁で閉じた。４．８ｇのメタアクリル酸グリシジル、３．２ｇのジメタアクリル酸エチレン、１０．８ｇのシクロヘキサノール、１．２ｇのドデカノール及び０．０８ｇのアゾビスイソブチロニトリルを混合することによって、重合反応物を調整した。この混合物に窒素を２０分間バブリングすることによって、存在している如何なる酸素も除去した。この混合物の０．１ｍｌをその隔壁を通してその管の中に注入した後、熱電体で７０℃にしたオイルバスの中で加熱することにより、重合を開始した。７時間後、その管を浴から取り出し、放置して室温にまで冷却した後、その隔壁を取外すことでマクロ細孔ポリマーを得た。
液体クロマトグラフィーに取付けるに適した継ぎ手が両端末に備わっているステンレス鋼製間の１つの末端を、鋼製ナットストッパーで閉じ、この管を窒素パージした後、そのもう一方の末端をシリコンゴム隔壁で閉じた。４．８ｇのメタアクリル酸グリシジル、３．２ｇのジメタアクリル酸エチレン、１０．８ｇのシクロヘキサノール、１．２ｇのドデカノール及び０．０８ｇのアゾビスイソブチロニトリルを混合することによって、重合反応物を調整した。この混合物に窒素を２０分間バブリングすることによって、存在している如何なる酸素も除去した。この混合物の０．１ｍｌをその隔壁を通してその管の中に注入した後、熱電体で７０℃にしたオイルバスの中で加熱することにより、重合を開始した。７時間後、その管を浴から取り出し、放置して室温にまで冷却した後、その隔壁を取外すことでマクロ細孔ポリマーを得た。
又、ダブルポア構造をとらず、シングルポア構造を用いる場合もある。
一般的に高圧で使用できない固相抽出に於いては、移動相が流れる空間以外の小さなポアは分離に大きな影響を与えず、移動相空間だけを持つシングルポアの多孔質体で充分な場合がある。特に、微量成分におけるシングルポアの開放構造に於いては、空間の不均一が生じなくなるため、吸着、溶出による分離がスムーズに生じるようになる。高分子の分離に於いては、移動相の流れる空間以外に分子が入り込める大きさの異なるポアがあると、着脱がスムーズに起こり難く都合が悪い場合がある。
そのため、シングルポア構造は、蛋白質をはじめとする高分子の微量固相抽出には有用である場合がある。
一般的に高圧で使用できない固相抽出に於いては、移動相が流れる空間以外の小さなポアは分離に大きな影響を与えず、移動相空間だけを持つシングルポアの多孔質体で充分な場合がある。特に、微量成分におけるシングルポアの開放構造に於いては、空間の不均一が生じなくなるため、吸着、溶出による分離がスムーズに生じるようになる。高分子の分離に於いては、移動相の流れる空間以外に分子が入り込める大きさの異なるポアがあると、着脱がスムーズに起こり難く都合が悪い場合がある。
そのため、シングルポア構造は、蛋白質をはじめとする高分子の微量固相抽出には有用である場合がある。
又、マクロ細孔を持つ多孔質体内にミクロ多孔質体を作製するためのモノマーを含浸させ、予め加えていた触媒等を利用し、マクロ細孔内で充填され一体化した構造を持つ多孔質柱状体を作成することも出来る。この場合、ミクロ多孔質体を作成するためのモノマーとは、有機、無機どちらの材料でもよく、無機系であればテトラエトキシシランに塩酸などの触媒を加え、調整したゾルを含浸させた後、熟成させることにより、ミクロ細孔の多孔質体シリカガラスを形成させることが出来る。有機系の場合、各種の樹脂が選択でき、例えばアクリルアミドモノマーを含浸させた後、重合させることによりポリアクリルアミドゲル多孔質体を得ることが出来る。
マクロ細孔を持つ多孔質体の材質は、細孔の径を上記大きさに制御し得る材質であれば、特に制限されないが、多孔質セラミック、多孔質ガラスなどの無機質の多孔質体、例えば多孔質ガラスが望ましい。多孔質ガラスの例としては、組成がＮａＯ−Ｂ２Ｏ３−ＳｉＯ２−ＣａＯ系のものが挙げられ、Ａｌ１２Ｏ３、ＺｒＯ２、ＺｎＯ２、ＴｉＯ２、ＳｎＯ２、ＭｇＯ２など種々の酸化物を添加したガラスを用いて製造する場合もある。多孔質体ガラスは、例えばけい砂、硝酸、ソーダ灰及びアルミナを混合し、１２００〜１４００℃に溶融する。
これを８００〜１１００℃にて成型後、未分相珪ガラスを得、熱処理によりＳｉＯ２相とＢ２Ｏ３−Ｎａ２Ｏ−ＣａＯ相に分相させ、酸処理によってＳｉＯ２骨格を残した多孔質体を製造する。細孔系は、用途によって、熱処理時の条件を変化させることにより、０．１〜１０ミクロンの細孔分布の均一なものが用途に応じて製造可能である。
これを８００〜１１００℃にて成型後、未分相珪ガラスを得、熱処理によりＳｉＯ２相とＢ２Ｏ３−Ｎａ２Ｏ−ＣａＯ相に分相させ、酸処理によってＳｉＯ２骨格を残した多孔質体を製造する。細孔系は、用途によって、熱処理時の条件を変化させることにより、０．１〜１０ミクロンの細孔分布の均一なものが用途に応じて製造可能である。
多孔質セラミックの例としては、シリカ、アルミナシリケート質Ａ（硬磁器粒子を焼結したもの）、けい砂質、アルミナ質、アルミナシリケート質Ｂ（シャモット粒子を焼結したもの）、多孔質ムライト質、珪藻土質のものなどがある。多孔質セラミックは、例えば、一定範囲の粒子径の陶磁器粒子（硬磁器粉砕物、シリカ、アルミナ、シャモットなど）と気孔形成材、例えば結晶性セルロース（旭化成：アビセル）と適当な分散溶媒と、混合・成型・焼結して製造する。細孔径５００μｍ程度から０．１μｍ程度又はそれを超える範囲のもので、細孔分布の均一なものが用途に応じて製作可能である。
このように形成されたモノリス構造体４は通液孔２の固定すべき場所に合せた寸法に形成し、又、所望の吸着量、例えば先端に設ける場合１０μｌ、中間に設ける場合２００μｌ等の容量、に応じて厚さを選択して形成し、挿通固定させる。この固定に際し、モノリス構造体４をそのまま通液孔２に押込み、挿通させその壁面と摩擦力により、摺接固定させるのが一般的であるが、通液孔２壁面に段部、溝等の受止部を設けたり、加熱、超音波レーザー等所望の方法を用いて固定させることも可能である。いずれにしても壁面とモノリス構造体４間に通液可能とすることは阻止しなければならない。この際、モノリス構造体４の形状としては、通液孔２に対応して選択することが通常である。
モノリス構造体をアフィニティプロセスに使用するためには、そのモノリス構造体に修飾基を修飾させる必要がある。この多孔質体カラムの細孔には、分離試料に適したコーティング材及び／又は化学修飾材を適用して細孔の表面を修飾・改質し得る。例えば、コーティング材としては、ポリエチレングリコール、シリコンオイルなどが挙げられる。化学的修飾材としては、トリメチルクロロシラン（ＴＭＳ）、ジメチルｎ−オクチルクロロシラン、ジメチル−ｎ−オクタデシルクロロシラン（ＯＤＳ）などのアルキルクロロシラン、γ−アミノプロピルトリエトシキキランなどのアミノアルコシキキラン、そのほかエポキシシランなど各種シラン処理剤が挙げられる。又、柱状体は変形させてＵ字状又はコイル状のカラムとしてもよい。モノリス構造体はシリカ系を使用するのが多いが、リガンドを固定する場合、シリカを例えばアミノプロピルシランにより修飾し、この官能基とリガンドの官能基を二価性試薬を用いて架橋すると云うように二価性試薬による架橋を使用する。
この例は、アミノ基によりＤＳＳ、ＤＳＴを用いてトリプシン、ＰＮＧａｓｅを固定化し、又ＣｏｎＡ（glycoprotein）、ＩｇＧ（Immoaffinity）、ProteinＡ（ＩｇＧ）を固定するように使用される。
又、カルボキシル基、水酸基チオール基等も使用される。
シリカへのアミノ基導入と同様、他の修飾基の導入方法は既存の技術と同じである。
この例は、アミノ基によりＤＳＳ、ＤＳＴを用いてトリプシン、ＰＮＧａｓｅを固定化し、又ＣｏｎＡ（glycoprotein）、ＩｇＧ（Immoaffinity）、ProteinＡ（ＩｇＧ）を固定するように使用される。
又、カルボキシル基、水酸基チオール基等も使用される。
シリカへのアミノ基導入と同様、他の修飾基の導入方法は既存の技術と同じである。
二価性試薬としてはアミノ基修飾を行ったモノリスに対して反応させるＤＳＧ（Disuccinimidyl glutarate）、ＤＳＰ（Loman’s Reagent）、ＤＳＳ（Disuccinimidyl suberate）、ＭＢＳ（m−Maleimidobenzyl−N−hydroxysuccinimide ester）、ＢＡ３（Bis［Sulfoxsuccinimidy］suberate）に代表されるＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物、ＤＭＳ（Dimetheyl suberate）、ＥＤＣ（1−Ethyl−3−［3−Dimethylaminopropyl］carbodiimide Hydrochloride）に代表されるイミド化合物などがある。チオール基修飾を行ったモノリスに対して反応させる試薬としては、ＰＤＰＨ（3−［2−Pyridyldithio]propionyl hydrazide）、ＳＰＤＰ（N−Succinimydl（3−［2−pyridyldithio]propionate）、Sulfo−LC−SPDP（Sulfosuccinimidyl 6−［3’（2−pyridyldithio）−propionamide］hexanoate） に代表されるビピリジンスルフィド交換反応用試薬、ＢＭＨ（BisMaleimidohexane）、ＳＭＣＣ（Succinimidyl 4−［N−maleimidomethyl］−cyclohexane-carboxylate）に代表されるマレイミド化合物などがある。又、糖質に対する反応試薬として、ＰＤＰＨ（3−82−Pyridyldithio）propinyl hydrazide）やＫＭＵＨ（N−［k−Maleimidoundecanoic acid]hydrazide）を使用することも可能である。又、ＡＢＨ（p−Azidobenzoy hydrazide）、ＡＮＢ−ＮＯＳ（N−5−Azido−2−nitrodenzoloxysuccinimide）、ＡＳＢＡ（4−［p−Azidosalicylamido]butylamine）などの光架橋試薬を使用することも可能である。
生体内蛋白質で、ＤＮＡの転写や修復などに関わるものには、特定のＤＮＡ、ＲＮＡ配列を認識し、結合する能力を持つものがある。これらの蛋白質を簡便に特異的に回収するためにモノリス上にリガンドとして一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）を固定化して用いる。
固定方法としては、他の実施例と同様に、モノリス上に修飾した修飾基と、リガンドとして用いる任意の塩基配列を持つＤＮＡ（ＲＮＡ）に修飾した官能基（アミノ基やチオール基など）を、二価性試薬を用いて結合することにより、ＤＮＡ（ＲＮＡ）固定化チップを作製する。生体試料をこのチップでピペッテイングすることで、固定化したＤＮＡ（ＲＮＡ）配列に特異的に結合することの出来る蛋白質はアフィニティートラップされ、溶出操作により回収される。
固定方法としては、他の実施例と同様に、モノリス上に修飾した修飾基と、リガンドとして用いる任意の塩基配列を持つＤＮＡ（ＲＮＡ）に修飾した官能基（アミノ基やチオール基など）を、二価性試薬を用いて結合することにより、ＤＮＡ（ＲＮＡ）固定化チップを作製する。生体試料をこのチップでピペッテイングすることで、固定化したＤＮＡ（ＲＮＡ）配列に特異的に結合することの出来る蛋白質はアフィニティートラップされ、溶出操作により回収される。
又、塩基配列に依存したＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ（又はそれらの類似体）の水素結合による相補鎖の結合を利用し、標的配列を持つ核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）をトラップ、回収することができる。
例えば、モノリスにポリＴ（チミン）塩基配列のＤＮＡを固定化し、生体内から抽出したトータルＲＮＡをピペッティングすることにより、適当な温度、塩濃度等の条件下による洗浄、溶出操作を行うことにより、ポリＡ（アデニン）配列を持つＲＮＡを回収することが出来る。
例えば、モノリスにポリＴ（チミン）塩基配列のＤＮＡを固定化し、生体内から抽出したトータルＲＮＡをピペッティングすることにより、適当な温度、塩濃度等の条件下による洗浄、溶出操作を行うことにより、ポリＡ（アデニン）配列を持つＲＮＡを回収することが出来る。
リガンドとして使用可能な蛋白質としては、酵素としてはトリプシンのほかにも、臨床検査の対象となる酵素などがある。例えばそれは、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシターゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルドラーゼ、アミラーゼ、α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、炭酸デヒドラターゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンキナーゼ、クレアチニナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸ホスファターゼ、β−グルクロニターゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グアナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ロイシナミノペプチターゼ、リパーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシターゼ、５‘−ヌクレオチターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、パパイン、ＰＶ５０、西洋ワサビペルオキシターゼなどがある。
又、蛋白質の糖鎖解析を行う場合に使用する糖鎖をペプチドから切り離す酵素なども固定することが出来る。例えばそれは、グリコペプチターゼ、Ｎ−グリカナーゼ、エキソグリコシターゼ、β−ガラクトシターゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニターゼ、α−Ｌ−フコシターゼ、α−マノンシターゼ、シアリターゼなどがある。
又、酵素だけではなく、特定の物質、蛋白質に対して、親和性を示す結合蛋白質や低分子リガンド、ＤＮＡやＲＮＡの固定化も可能である。例えばそれは、レクチン（コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）やレンズマメレクチン（ＬＣＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、エンドウマメレクチン、コムギ胚レクチン（ＷＧＡ）、ヒママメレクチン（ＲＣＡ−１）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）など多数あり列挙できないが、レクチンと云う蛋白質は、ペプチドに結合した糖鎖の構造を認識して結合する蛋白質である。糖鎖の構造は、高マンノース型、混合型、複合型と呼ばれるものと、bisecting Ｎ−グリコシド型、シアル酸を持つ複合型、又、アシアロ化複合型、アシアロ化ムチン型など数多くのものがあり、それに対応したレクチンが存在する。）であったり、ＧＦＰやＧＦＰ結合蛋白質、蛋白質Ａ、蛋白質Ｇなどの抗体に対する結合蛋白質、抗体（逆に抗体に対する抗原を固定化することも可能）、アビジン、ストレプトアビジン、ヘパリン、ＧＳＴ蛋白質に対して結合する低分子リガンドであるグルタチオン、金属キレートリガンド分子を修飾して金属アフィニティクロマトグラフィとして使用することにより、Ｈｉｓ−タグ融合蛋白質などを結合させることも可能である。ｐ−aminobenzamidine を固定してセリンプロテアーゼを結合させ、サンプル内から除去するような蛋白除去キットなども作製可能である。他にも、酵素のインヒビター（トリプシンインヒビターや、基質類似物などのプロテアーゼインヒビター）を固定化することにより、特異的な酵素を吊り上げるためのチップを作成することも可能である。
又、酵素だけではなく、特定の物質、蛋白質に対して、親和性を示す結合蛋白質や低分子リガンド、ＤＮＡやＲＮＡの固定化も可能である。例えばそれは、レクチン（コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）やレンズマメレクチン（ＬＣＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、エンドウマメレクチン、コムギ胚レクチン（ＷＧＡ）、ヒママメレクチン（ＲＣＡ−１）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）など多数あり列挙できないが、レクチンと云う蛋白質は、ペプチドに結合した糖鎖の構造を認識して結合する蛋白質である。糖鎖の構造は、高マンノース型、混合型、複合型と呼ばれるものと、bisecting Ｎ−グリコシド型、シアル酸を持つ複合型、又、アシアロ化複合型、アシアロ化ムチン型など数多くのものがあり、それに対応したレクチンが存在する。）であったり、ＧＦＰやＧＦＰ結合蛋白質、蛋白質Ａ、蛋白質Ｇなどの抗体に対する結合蛋白質、抗体（逆に抗体に対する抗原を固定化することも可能）、アビジン、ストレプトアビジン、ヘパリン、ＧＳＴ蛋白質に対して結合する低分子リガンドであるグルタチオン、金属キレートリガンド分子を修飾して金属アフィニティクロマトグラフィとして使用することにより、Ｈｉｓ−タグ融合蛋白質などを結合させることも可能である。ｐ−aminobenzamidine を固定してセリンプロテアーゼを結合させ、サンプル内から除去するような蛋白除去キットなども作製可能である。他にも、酵素のインヒビター（トリプシンインヒビターや、基質類似物などのプロテアーゼインヒビター）を固定化することにより、特異的な酵素を吊り上げるためのチップを作成することも可能である。
例えば、リガンドに対応する捕捉物質の組合せを例示的に示せば、次の例が挙げられる。
プロテインＡ（蛋白質Ａ）−ＩｇＧ、ヘパリン−フィブロネクチン、ＦＧＦ、ＨＧＦ、コンカナバリンＡ−糖蛋白質、膜蛋白質、Procion Red―ＮＡＤＰ＋依存性酵素、ＭＭＰｓ、ＴＩＭＰｓ、Cibacron Blue−０ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋依存性酵素、インターフェロン、ゼラチン―ゼラナーゼ、フィブロネクチン、リジン―プラスミノーゲン、アルギニン―プロカリクレイン、プロトロンビン、p−aminobenzamidine（ベンザジミン）―セリンプロテアーゼ、金属キレート―ストロムライシン、Ｈｉｓタグ蛋白質、スプレプトアビジン−ビチオン、ビチオン化蛋白質、グルタチオン―ＧＳＴ（グルタチオンＳ―トランスフェラーゼ）融合蛋白質、カルモデュリン−ＡＴＰａｓｅ、プロテインキナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ポリヌクレオチド―相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、
プロテインＡ（蛋白質Ａ）−ＩｇＧ、ヘパリン−フィブロネクチン、ＦＧＦ、ＨＧＦ、コンカナバリンＡ−糖蛋白質、膜蛋白質、Procion Red―ＮＡＤＰ＋依存性酵素、ＭＭＰｓ、ＴＩＭＰｓ、Cibacron Blue−０ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋依存性酵素、インターフェロン、ゼラチン―ゼラナーゼ、フィブロネクチン、リジン―プラスミノーゲン、アルギニン―プロカリクレイン、プロトロンビン、p−aminobenzamidine（ベンザジミン）―セリンプロテアーゼ、金属キレート―ストロムライシン、Ｈｉｓタグ蛋白質、スプレプトアビジン−ビチオン、ビチオン化蛋白質、グルタチオン―ＧＳＴ（グルタチオンＳ―トランスフェラーゼ）融合蛋白質、カルモデュリン−ＡＴＰａｓｅ、プロテインキナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ポリヌクレオチド―相補的塩基配列を持つポリヌクレオチド、
エポキシ基結合シリカモノリスの調整
９０℃で乾燥したシリカモノリスを試験管に入れ、１０％グリドキシプロピルトリメトキシシランのトルエン溶液を加え、減圧、超音波した。試薬の溶液を除去後、減圧により乾燥させた後、ステンレス反応管に移し、二酸化炭素ガスで置換、２００℃で１５時間反応させた。モノリスをアセトン中、超音波し乾燥させた。
フェニルボロン酸結合シリカモノリスの調整
上記により得られたエポキシ基結合シリカモノリスを試験管に入れ、１０ｍｇ／ｍｌ ３−アミノフェニルポロン酸／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）溶液を２０ｍｌ加えた。減圧、超音波し、一晩放置した。
反応溶液を除去、水で超音波洗浄した後、アセトンに置換し、乾燥した。
９０℃で乾燥したシリカモノリスを試験管に入れ、１０％グリドキシプロピルトリメトキシシランのトルエン溶液を加え、減圧、超音波した。試薬の溶液を除去後、減圧により乾燥させた後、ステンレス反応管に移し、二酸化炭素ガスで置換、２００℃で１５時間反応させた。モノリスをアセトン中、超音波し乾燥させた。
フェニルボロン酸結合シリカモノリスの調整
上記により得られたエポキシ基結合シリカモノリスを試験管に入れ、１０ｍｇ／ｍｌ ３−アミノフェニルポロン酸／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）溶液を２０ｍｌ加えた。減圧、超音波し、一晩放置した。
反応溶液を除去、水で超音波洗浄した後、アセトンに置換し、乾燥した。
従来の糖鎖解析の消化反応のプロトコール例を説明し、以下の本発明実施例と対比する。
モノリス構造体４はマクロ細孔２０μｍ、ミクロ細孔平均１５ｎｍのアミノ基修飾したものを用いたデバイスを使用。
０．１ｍｇのオボアルブミンを５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液１ｍｌに溶解する。その溶液にトリプシンＡを１ｕｇを添加し、３７℃２４時間消化反応を行う。そのサンプルに対して、コンカナバリンＡを修飾したアガロースビーズ溶液を２００ｕｌ加え、４℃で１時間振とうすることにより、糖ペプチドを結合させる。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でビーズを洗浄後、遠心分離によりビーズを回収（２〜３回操作を行う。）、５００Ｍｍソルビトール溶液５００ｕｌを加え、糖ペプチドをビーズから遊離することにより回収する。そのサンプルに対してＮ−グリカナーゼを１ｍＵｎｉｔ加え２４時間３７℃で酵素消化を行う。このようにして糖鎖解析における前処理を行う。
Ｕｎｉｔとは、ある条件で単位時間当たりに生成する生成物の量を示し、例えば１ｍＵは、ｐＨ５．０、３７℃で１分間に１ｎｍｏｌの卵白アルブミンの糖ペプチド（この糖ペプチドも配列が決まっている。）から糖鎖を遊離する酵素量である。
以上これまでの糖鎖解析を図示化する。
蛋白質群
↓←トリプシン消化（３７℃２４ｈｒ）
ペプチド
↓←レクチンビーズ（４℃１ｈｒ）
糖化ペプチド
↓←ＰＮＧ（３７℃２４ｎｒ）＋レクチンビーズ（４℃１ｈｒ）＋脱塩（透析１ｈｒ）
糖鎖
これに対し本発明の方法、デバイスを使用してピペッティングによる糖鎖解析を行った図式。
蛋白質群
↓←トリプシンチップ（所望数ピペッテイング）
ペプチド
↓←レクチンチップ（所望数ピペッテイング）
糖化ペプチド
↓←ＰＮＧチップ＋レクチンチップｏｒポロン酸チップ＋ＯＤＳチップ
糖鎖
以上のような結果から大幅な処理時間短縮は明白である。
モノリス構造体４はマクロ細孔２０μｍ、ミクロ細孔平均１５ｎｍのアミノ基修飾したものを用いたデバイスを使用。
０．１ｍｇのオボアルブミンを５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液１ｍｌに溶解する。その溶液にトリプシンＡを１ｕｇを添加し、３７℃２４時間消化反応を行う。そのサンプルに対して、コンカナバリンＡを修飾したアガロースビーズ溶液を２００ｕｌ加え、４℃で１時間振とうすることにより、糖ペプチドを結合させる。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でビーズを洗浄後、遠心分離によりビーズを回収（２〜３回操作を行う。）、５００Ｍｍソルビトール溶液５００ｕｌを加え、糖ペプチドをビーズから遊離することにより回収する。そのサンプルに対してＮ−グリカナーゼを１ｍＵｎｉｔ加え２４時間３７℃で酵素消化を行う。このようにして糖鎖解析における前処理を行う。
Ｕｎｉｔとは、ある条件で単位時間当たりに生成する生成物の量を示し、例えば１ｍＵは、ｐＨ５．０、３７℃で１分間に１ｎｍｏｌの卵白アルブミンの糖ペプチド（この糖ペプチドも配列が決まっている。）から糖鎖を遊離する酵素量である。
以上これまでの糖鎖解析を図示化する。
蛋白質群
↓←トリプシン消化（３７℃２４ｈｒ）
ペプチド
↓←レクチンビーズ（４℃１ｈｒ）
糖化ペプチド
↓←ＰＮＧ（３７℃２４ｎｒ）＋レクチンビーズ（４℃１ｈｒ）＋脱塩（透析１ｈｒ）
糖鎖
これに対し本発明の方法、デバイスを使用してピペッティングによる糖鎖解析を行った図式。
蛋白質群
↓←トリプシンチップ（所望数ピペッテイング）
ペプチド
↓←レクチンチップ（所望数ピペッテイング）
糖化ペプチド
↓←ＰＮＧチップ＋レクチンチップｏｒポロン酸チップ＋ＯＤＳチップ
糖鎖
以上のような結果から大幅な処理時間短縮は明白である。
トリプシンの固定化
モノリス構造体４はマクロ細孔２０μｍ、ミクロ細孔平均１５ｎｍのアミノ基修飾したものを用いたデバイスを使用。アセトニトリルに溶解した１０ｍｇ／ｍｌＤＳＳ溶液１００ｕｌを１０回ピペッティングすることにより、アミノ基と反応させ、蛋白質を結合するための活性担体とした。その後、ＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ ＣａＣｌ２ ｐＨ７．８）に溶解したトリプシン溶液１００ｕｌを、１０回ピペッティングすることによってトリプシンを固定化した。モノリス上の残った活性基を不活性化するためにＴｒｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５）２００ｕｌによって１０回ピペッテイングを行った。
作製したトリプシン固定化チップを用いて蛋白質（還元アルキル化後のトランスフェリン又はβカゼイン各０．１ｍｇ／ｍｌ １００μｌ）の消化反応を行った。消化反応はサンプル溶液を２０回ピペッティングにより行った。得られた消化物をＭＳによって評価した。図９はＭＳによって検出されるトータルイオンクロマトグラムを示す。このチャートにより、サンプル内に含まれるサンプルの分子量が検出される。図９はサンプルを何も添加せず、移動相溶液のみを流した場合のクロマトグラムである。図１０はサンプルとして移動相溶液をトリプシン固定化チップにより２０回ピペッティングした時のクロマトグラムである。若し、トリプシンが固定相から切り離されている場合、トリプシンに由来したペプチドの分子量が検出されるはずだが、そのようなピークは確認されなかった。図１１はサンプルとしてβカゼイン（蛋白質０．１ｍｇ／ｍｌ １００ｕｌ）をピペッティングした時のクロマトグラムを示す。この場合βカゼインに由来した分子量のピークを確認することが出来た。これらのことから、トリプシンはピペットチップに安定に固定化出来ていることが示された。又トランスフェリンの分解についてのＨＰＬＣによって分析したクロマトグラムを図１２に示す。アセトニトリル線勾配は１０〜４０％を２０分にかけて行った。その結果、２０回のピペッティングによって９５％以上のトランスフェリンの消化を確認した。消化前のピークは５％以下に減少した。図１３には分解前のトランスフェリンのクロマトグラムを示す。
モノリス構造体４はマクロ細孔２０μｍ、ミクロ細孔平均１５ｎｍのアミノ基修飾したものを用いたデバイスを使用。アセトニトリルに溶解した１０ｍｇ／ｍｌＤＳＳ溶液１００ｕｌを１０回ピペッティングすることにより、アミノ基と反応させ、蛋白質を結合するための活性担体とした。その後、ＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ ＣａＣｌ２ ｐＨ７．８）に溶解したトリプシン溶液１００ｕｌを、１０回ピペッティングすることによってトリプシンを固定化した。モノリス上の残った活性基を不活性化するためにＴｒｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５）２００ｕｌによって１０回ピペッテイングを行った。
作製したトリプシン固定化チップを用いて蛋白質（還元アルキル化後のトランスフェリン又はβカゼイン各０．１ｍｇ／ｍｌ １００μｌ）の消化反応を行った。消化反応はサンプル溶液を２０回ピペッティングにより行った。得られた消化物をＭＳによって評価した。図９はＭＳによって検出されるトータルイオンクロマトグラムを示す。このチャートにより、サンプル内に含まれるサンプルの分子量が検出される。図９はサンプルを何も添加せず、移動相溶液のみを流した場合のクロマトグラムである。図１０はサンプルとして移動相溶液をトリプシン固定化チップにより２０回ピペッティングした時のクロマトグラムである。若し、トリプシンが固定相から切り離されている場合、トリプシンに由来したペプチドの分子量が検出されるはずだが、そのようなピークは確認されなかった。図１１はサンプルとしてβカゼイン（蛋白質０．１ｍｇ／ｍｌ １００ｕｌ）をピペッティングした時のクロマトグラムを示す。この場合βカゼインに由来した分子量のピークを確認することが出来た。これらのことから、トリプシンはピペットチップに安定に固定化出来ていることが示された。又トランスフェリンの分解についてのＨＰＬＣによって分析したクロマトグラムを図１２に示す。アセトニトリル線勾配は１０〜４０％を２０分にかけて行った。その結果、２０回のピペッティングによって９５％以上のトランスフェリンの消化を確認した。消化前のピークは５％以下に減少した。図１３には分解前のトランスフェリンのクロマトグラムを示す。
蛋白質Ａの固定化
モノリス構造体４はマクロ細孔２０μｍ、ミクロ細孔平均３５ｎｍのアミノ基修飾したものを用いたデバイスを使用。実施例１に於いて用いた蛋白質溶液をトリプシン溶液の代わりにリン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．８）に溶解した蛋白質Ａ溶液を用いる以外は全て同じ操作を行った。
作成した蛋白質Ａチップを用いてＩｇＧに対する結合能を評価した。０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ及びＢＳＡの試料１００ｕｌを、蛋白質Ａ固定化チップを用いて２０回ピペッティング後、溶液内に残存する各蛋白質量をＨＰＬＣを用いて検討した。チップに対して結合が見られると、夫々の蛋白質に由来したピークの減少が見られるはずである。その結果、蛋白質Ａを固定化したチップはＢＳＡに対して結合が見られなかった（図１4）が、ＩＧｇに対しては明白の結合能を示した。（図１５）
モノリス構造体４はマクロ細孔２０μｍ、ミクロ細孔平均３５ｎｍのアミノ基修飾したものを用いたデバイスを使用。実施例１に於いて用いた蛋白質溶液をトリプシン溶液の代わりにリン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．８）に溶解した蛋白質Ａ溶液を用いる以外は全て同じ操作を行った。
作成した蛋白質Ａチップを用いてＩｇＧに対する結合能を評価した。０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ及びＢＳＡの試料１００ｕｌを、蛋白質Ａ固定化チップを用いて２０回ピペッティング後、溶液内に残存する各蛋白質量をＨＰＬＣを用いて検討した。チップに対して結合が見られると、夫々の蛋白質に由来したピークの減少が見られるはずである。その結果、蛋白質Ａを固定化したチップはＢＳＡに対して結合が見られなかった（図１4）が、ＩＧｇに対しては明白の結合能を示した。（図１５）
フェニルボロン酸の固定化
モノリス構造体４はマクロ細孔２０μｍ、ミクロ細孔平均３５ｎｍのアミノ基修飾したものを用いたデバイスを使用。実施例２に於いて用いた蛋白質溶液の代わりにアセトニトリルに溶解した４アミノフェニルボロン酸溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いる以外は全て同様の操作を行った。
糖蛋白質であるトランスフェニリンに対する結合試験を行うために、ボロン酸固定化チップを２００ｕｌのアセトニトリルを３回ピペッテイングすることにより、吸入、排出し、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）２００ｕｌを１回ピペッティングすることにより、吸入、排出し、サンプル結合前のコンディショニングを行った。
次いで、０．２ｍｇ／ｍｌトランスフェリン溶液（５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）に溶解）をピペッティング２０回行いモノリス構造体に結合させた。
次に、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）２００ｕｌによる洗浄を２回行い、その後１００ｍＭ酢酸１００ｕｌをピペッティング１０回行うことでトランスフェリンの溶出を行った。
回収率はＨＰＬＣにより確認を行った。アセトニトリル線勾配は１０〜４０％を１０分にかけて行った。
その結果を図１６に結合反応を行う前のトランスフェリン溶液、図１７に結合後のトランスフェリン溶液のクロマトグラムを示す。ピペットチップに固定したモノリスへのトランスフェリンの結合により、溶液内のトランスフェリン濃度が減少することにより、結合後のトランスフェリンのピーク面積は減少した。その後、図１８に示すように酢酸溶液で溶出を行うことにより、トランスフェリンの回収を行うことが出来た。結合、洗浄溶出の操作が全てピペッティングによって行うことが可能であることが示された。
モノリス構造体４はマクロ細孔２０μｍ、ミクロ細孔平均３５ｎｍのアミノ基修飾したものを用いたデバイスを使用。実施例２に於いて用いた蛋白質溶液の代わりにアセトニトリルに溶解した４アミノフェニルボロン酸溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いる以外は全て同様の操作を行った。
糖蛋白質であるトランスフェニリンに対する結合試験を行うために、ボロン酸固定化チップを２００ｕｌのアセトニトリルを３回ピペッテイングすることにより、吸入、排出し、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）２００ｕｌを１回ピペッティングすることにより、吸入、排出し、サンプル結合前のコンディショニングを行った。
次いで、０．２ｍｇ／ｍｌトランスフェリン溶液（５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）に溶解）をピペッティング２０回行いモノリス構造体に結合させた。
次に、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）２００ｕｌによる洗浄を２回行い、その後１００ｍＭ酢酸１００ｕｌをピペッティング１０回行うことでトランスフェリンの溶出を行った。
回収率はＨＰＬＣにより確認を行った。アセトニトリル線勾配は１０〜４０％を１０分にかけて行った。
その結果を図１６に結合反応を行う前のトランスフェリン溶液、図１７に結合後のトランスフェリン溶液のクロマトグラムを示す。ピペットチップに固定したモノリスへのトランスフェリンの結合により、溶液内のトランスフェリン濃度が減少することにより、結合後のトランスフェリンのピーク面積は減少した。その後、図１８に示すように酢酸溶液で溶出を行うことにより、トランスフェリンの回収を行うことが出来た。結合、洗浄溶出の操作が全てピペッティングによって行うことが可能であることが示された。
大きいミクロ細孔を使用するときのメリットとして巨大な蛋白質の固定化が上げられる。
ミクロ細孔３５ｎｍモノリス（表面積約８０ｍ２／ｇ）及び１５ｎｍのモノリス（表面積２２０ｍ２／ｇ）を固定化したピペットチップに実施例１と同様にリン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２，２０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に溶解したコンカナバリンＡの固定化を行った。通常、表面積が大きいモノリスに於いて固定化量も増大することが期待される。この実施例の場合、表面積から換算して小さいミクロ細孔を用いた場合のモノリスが、大きいミクロ細孔を用いた場合に比べ、約３倍量の蛋白質を固定化することが可能であるはずが、実際は大きいミクロ細孔（３５ｎｍ）のモノリスのほうが２倍量のコンカナバリンＡをを固定化することが可能であった。
ミクロ細孔３５ｎｍモノリス（表面積約８０ｍ２／ｇ）及び１５ｎｍのモノリス（表面積２２０ｍ２／ｇ）を固定化したピペットチップに実施例１と同様にリン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２，２０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に溶解したコンカナバリンＡの固定化を行った。通常、表面積が大きいモノリスに於いて固定化量も増大することが期待される。この実施例の場合、表面積から換算して小さいミクロ細孔を用いた場合のモノリスが、大きいミクロ細孔を用いた場合に比べ、約３倍量の蛋白質を固定化することが可能であるはずが、実際は大きいミクロ細孔（３５ｎｍ）のモノリスのほうが２倍量のコンカナバリンＡをを固定化することが可能であった。
ピペッティングの回数
作製したピペットチップによる操作の迅速性を証明するため、実施例２に於いて固定化を行ったトリプシンチップを用いて消化に必要なピペティングの回数を検討した。サンプルにはβカゼイン（０．１ｍｇ／ｍｌ １００ｕｌ ５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）に溶解）を用い、ピペッテイングは室温（２５℃）で行った。
図１９はピペッテイングの回数を５回行った時のトータルイオンクロマトグラムを示す。図２０は１０回，図２１は２０回，図２２は５０回夫々ピペッティングしたときのトータルイオンクロマトグラムの結果を示す。
ピペッテイングの回数が５回の段階では、消化物としてペプチドの分子量の低分子量のペプチドに比べ、高分子量のペプチドが多い。そのため、５回のピペッテイングの回数では充分な消化反応が進行していないと考えられる。一方１０回、２０回、５０回のピペッティングによって得られたペプチドの分子量は、高分子量のペプチドに比べ低分子量のペプチドの量が増えており、消化反応の進行を確認できる。然も低分子量と高分子量のペプチドの量比は１０回、２０回、５０回のピペッティングを比較しても変化が見られなかった。そのため、消化反応に必要なピペッティング回数は、１０から２０回で充分であることが示された。ピペッティングに要する時間は１分程度であり、迅速なサンプル調整が可能であると考えられる。
作製したピペットチップによる操作の迅速性を証明するため、実施例２に於いて固定化を行ったトリプシンチップを用いて消化に必要なピペティングの回数を検討した。サンプルにはβカゼイン（０．１ｍｇ／ｍｌ １００ｕｌ ５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）に溶解）を用い、ピペッテイングは室温（２５℃）で行った。
図１９はピペッテイングの回数を５回行った時のトータルイオンクロマトグラムを示す。図２０は１０回，図２１は２０回，図２２は５０回夫々ピペッティングしたときのトータルイオンクロマトグラムの結果を示す。
ピペッテイングの回数が５回の段階では、消化物としてペプチドの分子量の低分子量のペプチドに比べ、高分子量のペプチドが多い。そのため、５回のピペッテイングの回数では充分な消化反応が進行していないと考えられる。一方１０回、２０回、５０回のピペッティングによって得られたペプチドの分子量は、高分子量のペプチドに比べ低分子量のペプチドの量が増えており、消化反応の進行を確認できる。然も低分子量と高分子量のペプチドの量比は１０回、２０回、５０回のピペッティングを比較しても変化が見られなかった。そのため、消化反応に必要なピペッティング回数は、１０から２０回で充分であることが示された。ピペッティングに要する時間は１分程度であり、迅速なサンプル調整が可能であると考えられる。
１ デバイス
２ 通液孔
３ ピペットチップ
４ モノリス構造体
５ 取付口
６ 開口
１０ ピペット
２ 通液孔
３ ピペットチップ
４ モノリス構造体
５ 取付口
６ 開口
１０ ピペット
Claims (5)
- ピペットチップ等のデバイスの通液孔の一部に多連続孔を持ち、開放構造の一体型構造であって、試料の分子量に対応した細孔径を有するモノリス構造体あるいは、試料に適したコーティング材及び／又は化学修飾材を施して、細孔の表面を修飾・改質したモノリス構造体を固定させ、該モノリス構造体内にリガンドを固定するための試薬を有する反応液により、活性基を修飾させると共に、ピペッティングによりリガンド所望量を固定させて、サンプルの容量或いは濃度に対応して吸着可能としたことを特徴とするアフィニティクロマトグラフィ用デバイスの製法。
- 前記モノリス構造体にリガンドを固定するための試薬を有する反応液により、活性基を修飾させる際に、ピペッティングにより行うことを特徴とする請求項１に記載のアフィニティクロマトグラフィ用デバイスの製法。
- 前記モノリス構造体表面にポリアミンを修飾することにより、高分子蛋白質を固定することを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のアフィニティクロマトグラフィ用デバイスの製法。
- ピペットチップ等のデバイスの通液孔の一部に多連続孔を持ち、開放構造の一体型構造であって、試料の分子量に対応した細孔径を有するモノリス構造体あるいは、試料に適したコーティング材及び／又は化学修飾材を施して、細孔の表面を修飾・改質したモノリス構造体を嵌合固定させると共に、ピペッティングにより前記モノリス構造体にリガンド固定のための試薬により活性基を選択的に修飾させると共に、ピペッティングにより活性担体に選択されるリガンドを固定化したことを特徴とするアフィニティクロマトグラフィ用デバイス。
- 請求項４に記載のアフィニティクロマトグラフ用デバイスを用い、リガンドに結合した目的物質をピペッティングによりトラップあるいは溶出することを特徴とするアフィニティクロマトグラフィ。
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