JP2012500651A - ゲノムdnaの精製のための簡単な負荷および溶離プロセス - Google Patents
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Abstract
【選択図】無し
Description
この出願は、2008年8月25日に出願された米国仮特許出願番号61/091,573に対して優先権を主張し;その開示をそのまま本明細書に援用する。
技術分野
この発明は概して生物学的試料からの核酸の分離および単離のための方法に関する。特に、本発明は他の構成要素を含む混合物からのゲノムDNAの精製のための簡単なクロマトグラフィー的プロセスに関する。
この30年間で、生物学的源からの核酸およびタンパク質の単離および精製のための向上した方法の開発においてかなりの努力があった。これは主に医学および生物科学における核酸およびタンパク質の適用の増大によるものである。血液、組織または培養細胞から単離されたゲノムDNAはいくつかの適用を有しており、それにはPCR、配列決定、遺伝子型決定、ハイブリダイゼーションおよびサザンブロッティングが含まれる。プラスミドDNAは配列決定、PCRにおいて、ワクチンの開発において、および遺伝子療法において利用されてきた。単離されたRNAは、ブロットハイブリダイゼーション、インビトロ翻訳、cDNA合成、およびRT−PCRを含む様々な下流の適用を有する。同様に、単離されたタンパク質はウェスタンブロット、DNA−タンパク質相互作用、酵素活性分析、タンパク質−タンパク質相互作用、および発現分析のために使用することができる。
1.分離媒体は堅固に取り付けられた結合基(ligand)構造を有し、望まれる核酸および不純物は、それに結合した状態になる、またはそれから脱着する異なる能力を有する。典型的にはその結合基構造は陰イオン交換基であり、分離はイオン交換に基づく、例えばイオン交換クロマトグラフィー(IEC)である(参考のため、米国特許出願US 2005/0267295において言及されているそれらを参照)。
異なる分離機能性を有する内側部分および外側表面層を有する分離媒体が以前に記述された。これらの媒体の一部は、吸着性マトリックス(出入り制限ビーズと呼ばれることもある)の内側部分の中へのより大きな分子の通過を妨げる遮蔽層(外層、ロック、リッド)を有する。これらの媒体はタンパク質、プラスミド、炭水化物、脂質等の分離のために使用することができることが提案されている:WO 1998/039094、WO 1998/039364、US 2005/0267295、米国特許第7,208,093号およびGustavsson P.-E. et al. Journal of Chromatography A, 1038: 131-140 (2004)。しかし、これらのいずれもゲノムDNAの精製のための簡単なプロセスを開示または教示していない。
本発明の目的はゲノムDNAの精製のための方法を提供することであり、その方法は、(a)操作の簡単さ、(b)増大したゲノムDNAの純度および収率、ならびに(c)関係する工程の数の減少に関して向上している。
本発明の第1観点は、異なる大きさを有するが同じ結合基構造に関して親和性を有する他の生体分子を含む試料からの、ゲノムDNAのための簡単な2工程のクロマトグラフィー的精製プロセスである。言い換えると、その方法は、大きさが異なるが共通の結合基構造に関して親和性を有する他の生体分子からのゲノムDNAの分離を意味する。
その外側表面層は反発構造、例えばゲノムDNAと同じ電荷を有する構造;疎水性構造等も含んでいてよい。反発構造は、その外側表面層を通る輸送における選択性を向上させる可能性がある。WO 1998/039364を参照。
試料は異なる源に由来することができ、様々な方法で調製することができる。それは血液試料、組織試料、培養細胞等に由来するものであってよい。それは未処理の細胞抽出物または細胞溶解物の形であってよい。それは粒子状物質、タンパク質、核酸の特定の画分を除去するための遠心分離、濾過、限外濾過、透析、沈殿等、濃縮、脱塩等を経た、処理された試料であってもよい。従って、任意ではあるが、次のことを行うのが慣習である:
(a)核酸を吸着剤上に捕捉する、および/または分画する前に、試料のタンパク質を沈殿させる、
(b)もしDNA画分を単離するのであれば、RNAを沈殿させる、または分解する、
(c)試料をイオン交換体等に適用する場合は、脱塩および/または希釈によりイオン強度を低下させる。
試料は典型的には水性である。
本発明は分離マトリックスとして異なる特性を有する2つの層で構成される多孔性のポリマー性粒子を利用する。特定の態様において、その粒子は中性の、すなわち電荷の無い、または非機能性外層を提供する。特定の好ましい態様において、その粒子は米国特許出願公開US 2005/0267295において記述されている方法に従って、あるいは米国特許第7,208,093号において記述されている方法に従って製造され、その開示をそのまま本明細書に援用する。
内側の細孔系の表面に結合している結合基は、クロマトグラフィーにおいて結合基として一般的に用いられるあらゆる周知の基、またはそれらの組み合わせ、例えば親和性基、疎水性相互作用基、イオン交換基、例えば負に荷電した陽イオン交換基もしくは正に荷電した陰イオン交換基等であることができる。従って、本文脈において、“結合(binding)”という用語はあらゆる種類の吸着または結合(coupling)を指す。従って、本方法の1態様において、その結合する基はイオン交換基である。特定の態様において、その陰イオン交換体はジエチルアミン(ANX)またはエチレンジアミン(EDA)である。
マトリックスのこの部分は、典型的には親和性吸着、例えばクロマトグラフィーの内部で一般的に利用されているものと同じタイプのものである。その内側部分はマクロ細孔およびミクロ細孔の両方を含んでいてよい。
外側表面層(シード(shied)、ロック)は、液体試料により浸透可能でなければならない。水性の液体に関して、これはその外側表面層が親水性ポリマーで構築されているべきであることを意味する。
本発明のプロセスを動かすための条件は、原則的に一般的に行われる吸着技法、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーに関するものと同じである。分離マトリックスの独特の構造のため、より小さい核酸分子(例えばRNA)およびタンパク質はそのマトリックスの内側部分に入るが、ゲノムDNAは入らない。ゲノムDNAは液相中に容易に集められる。好ましい方法において、分離マトリックスは充填床カラムの形であり、ゲノムDNAはすぐにカラムを出て素通り画分中に集められる。この方法はゲノムDNAの細胞性混入物からの分離および単離のための最も簡単なプロセスを提供する。そのプロセスは、完了するのに少なくとも30〜40分間かかる他の利用可能な方法と比較して、5〜10分間しかかからない。
結合基構造を注意深く選択することにより、マトリックスの内側部分と結合する特定の構成要素を溶離することができる。マトリックスからの脱着は、マトリックスと接触する液体のイオン強度を望まれる構成要素(単数または複数)が溶離されるまで増大させることにより成し遂げられる。特に、結合基構造が第一級、第二級または第三級アミン基のプロトン化された形である、および/または望まれる構成要素が核酸(例えばRNA)である場合、脱着は好ましくはpHを増大させることにより援助される。脱着のための代替法は、可溶性の結合基アナログ、すなわち望まれる構成要素への結合に関して結合基構造と競合することができる構造アナログを液体中に含ませることである。液体中の構造破壊化合物の存在は脱着を援助する可能性もある。これは特に、結合基構造が結合基構造の荷電した第一級、第二級または第三級窒素から2または3原子の距離の炭素原子において1個以上のヒドロキシル基またはアミノ基を含む場合に当てはめることができる。周知の構造破壊剤はグアニジンおよび尿素である。WO 1997/029825 (Amersham Pharmacia Biotech AB)も参照。従って、ある試料からのゲノムDNAおよび他の構成要素、例えばRNAまたはタンパク質の両方の単離のための簡単なプロセスも提供する。
下記で、本発明は実施例として記述されるであろう。しかし、本実施例は説明の目的でのみ与えられるのであって、添付した特許請求の範囲により定められる本発明を限定するものとして解釈されるべきでは無い。下記および本明細書中の他の箇所で与えられる全ての参考文献を本明細書に援用する。
ゲノムDNAの分離および精製のための簡単かつ効果的な方法を見つけようとして、我々は様々なマトリックスを試験した。それらの内の2種類は、いわゆるリッドビーズである。そのリッドビーズの1つのタイプはジエチルアミン(ANX)と結合しており、一方で他方のタイプはオクチルアミン(Octyl)と結合していた。そのビーズは米国特許第7,208,093号の実施例の節において開示されている方法に従って作られ、その開示をそのまま本明細書に援用する。
実施例2:細胞溶解物からのゲノムDNAの簡単な2工程精製
細胞溶解物からのゲノムDNAの精製に関してリッドビーズマトリックスを評価するために実験を行った。
230 260 280
画分2 0.1275 0.2625 0.1495
画分3 0.2547 0.4882 0.2729
画分4 1.6520 0.2087 0.1096
本明細書で言及された全ての特許、特許出願、および他の刊行された参考文献を、あたかもそれぞれを本明細書に個別に、かつ具体的に援用したかのように、本明細書にそのまま援用する。本発明の好ましい説明的な態様が記述されているが、当業者は、説明のためにのみ与えられ限定としてでは無い記述された態様以外により本発明を実行することができることを理解するであろう。本発明は下記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (9)
- ゲノムDNAおよび他の構成要素を含む試料溶液からゲノムDNAを精製するための方法であって、次のことを含む方法:
(i)ゲノムDNAおよび他の構成要素を含む前記の試料溶液を提供する;
(ii)前記の試料を分離マトリックスと接触させて前記の他の構成要素を結合させる;ならびに
(iii)精製されたゲノムDNAを含む液相を集める;
ここで、前記の分離マトリックスは次のものを有する物質である:
(a)実質的にゲノムDNAを吸着せず、より容易にその他の構成要素により浸透される外側表面層、ならびに
(b)内側部分、それは
・ゲノムDNAおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有し、ならびに
・その他の構成要素にとって出入り可能である。 - その試料溶液が澄んだアルカリ溶解物である、請求項1に記載の方法。
- その試料溶液がゲノムDNAを含む生体分子の混合物である、請求項1に記載の方法。
- その外側表面層が他の構成要素により浸透可能であるがゲノムDNAにより浸透可能では無い、請求項1に記載の方法。
- その結合基構造が正に荷電した基を含む、請求項1に記載の方法。
- その正に荷電した基が第一級、第二級および第三級アンモニウム基からなるグループから選択される、請求項5に記載の方法。
- その正に荷電した基が混合方式での陰イオン交換体である、請求項5に記載の方法。
- その外側表面層が本質的に結合基構造を持たない、請求項1に記載の方法。
- その分離マトリックスが充填されたクロマトグラフィーカラムの形であり、その集められる液相がカラムからの素通り画分である、請求項1に記載の方法。
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