JP4366097B2 - 還元酵素遺伝子及びその利用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元酵素をコードする遺伝子、該酵素及びそれらの利用等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルコールは、各種用途化合物の中間体等として有用な化合物であり、これまでに多くの製造方法が知られている。特にアルコールは、医農薬中間体等として有用な化合物であり、これまでに種々の製造方法が提案されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような光学活性アルコールの製造には天然物からの抽出、ラセミ体の光学分割又は不斉触媒による合成法等が使用されるが、一般的には製造が煩雑であり、結果として得られる製品は高価なものにならざるを得ない場合も存在している。そこで、安価な光学活性アルコールの製造法にも適しうる新たなアルコールの製造方法方法が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、アルコールの製造方法、特に光学活性アルコールの製造法にも適する方法について種々検討した結果、光学活性アルコールを製造するためにも利用可能なタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を見出し、これを反応触媒として利用することにより、アルコールを生産可能とし、また光学活性アルコールをも安価に生産するような製造方法を提供することが上記課題を解決するために極めて有効であると判断し、かつ多くの実験等を経ることにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有することを見出し、本発明に至った。
【０００５】
即ち、本発明は、
１．下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｇ）ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｈ）ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列；
２．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とする遺伝子；
３．前項１又は２記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
４．前項２記載の遺伝子又は前項３記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
５．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
６．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
７．前項１記載の遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体；
８．前項３記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
９．下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質（以下、本発明タンパク質と記載することもある。）
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｇ）ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｈ）ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列；
１０．ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項９記載のタンパク質、それを産生する微生物、前項４〜７記載の形質転換体又はそれらの処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法；
１１．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター；
１２．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１０記載の組換ベクター；
１３．前項１１又は１２記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
１４．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１５．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１６．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体；
１７．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質を反応系内に共存させること特徴とする前項１０記載のアルコールの製造方法；
１８．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１７記載のアルコールの製造方法；
１９．ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項１３〜１６記載の形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法；
２０．ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造するための触媒としての、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物の使用；
２１．ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物がライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749（国際寄託当局の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）であることを特徴とする前項１９記載の使用；
２２．ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749（国際寄託当局の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
まず、本発明遺伝子について説明する。
本発明遺伝子は、下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｇ）ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｈ）ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
尚、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡは、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを不斉還元して（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを優先的に生産する能力をも有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡである。当該ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより得られた形質転換体又はその処理物を、ケトン化合物に作用させることにより、容易に光学活性アルコールを製造方法することができる。
【０００７】
本発明遺伝子は、天然の遺伝子であってもよく、又は天然の遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された遺伝子であってもよい。天然の遺伝子を検索する場合には、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有する微生物を対象にすればよく、例えば、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物をその対象として挙げることができる。
【０００８】
これら微生物は、天然から分離してもよいし、菌株保存機関等から購入してもよい。
天然から分離する場合、まず、土壌を野外から採取する。採取された土壌を目菌水で懸濁させた後、当該懸濁液を、例えば、PY培地（Bacto Peptoneを５ｇ/L、Yeast Extractを５ｇ/Lの割合で水に溶解した後、ｐHを７．０に調整）等の微生物分離用固体培地上に塗布し、これを２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しい、例えば、PY培地等の微生物分離用固体培地に移植し、これをさらに２５℃で培養する。生育してきた菌について、SNEATH, (P.H.A.), MAIR, (N.S.) SHARPE, (M.E.) and HOLT, (J.G.):Bergey's manual of Systematic Bacteriorogy. Vol.2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore.等に記載される方法等に従って、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物であるかを同定することにより、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物を選抜すればよい。
つぎに、選抜されたライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から、当該微生物の２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力の有無を、例えば、後述の実施例に記載されるような方法に従って確認することにより、本発明に用いられるライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物を選抜すればよい。
【０００９】
尚、ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成１５年２月１２日）。菌学的性状は次のとおり。
１．コロニー形態（３０℃、４８時間）
（１）細胞形態：かん菌、０．６×１.０〜２．０μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：有
２．Nutrient Agar上でのコロニー形態
コロニーの色：黄色
コロニーの形状：円形
コロニーの周縁：全縁滑らか
コロニーの隆起：低凸状
３．生理学的性質
（１） カタラーゼ：陽性
（２） オキシダーゼ：陰性
（３） ＯＦテスト：陽性/陰性
４．１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749株からＰＣＲにより１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列約５００ｂｐを増幅し、塩基配列を解析した。得られた１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を使って、ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った結果、相同率９９．６％で、ライフソニア アクアティカ（Leifsonia aquatica）基準株の１６ＳリボゾームＤＮＡに対し、最も高い相同性を示した。更に、検索された上位５株のうち、４株がライフソニア（Leifsonia）で占められ、その相同率は９８％以上を示した。
以上の菌学的性質により、本菌はライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）と同定された。
【００１０】
本発明遺伝子は２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する還元反応を触媒する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有している。
【００１１】
本発明遺伝子において、配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、一文字表記：MAQYDVADRSAIVTGGGSGIGRAVALTLAASGAAVLVTDLKEEHAQAVVAEIEAAGGKAAALAGDVTDPAFGEASVAGANALAPLKIAVNNAGIGGEAATVGDYSLDSWRTVIEVNLNAVFYGMQPQLKAMAANGGGAIVNMASILGSVGFANSSGYVTAKHALLGLTQNAALEYAADKVRVVAVGPGFIRTRSWRQLFRRRAGVLQGKHALGRLGEPEEVASLVAFLASDAASFITGSYHLVDGGYTAQである。
【００１２】
本発明遺伝子において、前記（ｂ）にある「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された」や前記（ｃ）及び（ｅ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYXや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
前記（ｆ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法（具体的には、サザンハイブリダイゼーション法等）に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、（１）高イオン濃度下（例えば、６×SSC（１．５M NaCl、０．１５M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする））、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させることにより配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成した後、低イオン濃度下（例えば、2×SSC）で５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、（２）高イオン濃度下（例えば、６×SSC）、溶液中で６５℃にてハイブリッドを形成させることにより配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成した後、低イオン濃度下（例えば、0.1 X SSC）で65℃にて洗浄するような条件（「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度（例えば、温度を５０℃に設定した場合）は、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。このような洗浄ステップ後でも上記ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡという。
【００１３】
本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、以下のようにして調製することができる。
【００１４】
ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００１５】
ここで、前記ＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することになる。
【００１６】
該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるＤＮＡライブラリーを混合した反応液を94℃（5分間）に加熱した後、94℃(5分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持する条件が挙げられる。
【００１７】
なお、該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
【００１８】
また、前記ＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする５’末端側の約１４塩基程度以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００１９】
上記のようにして増幅されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）などが挙げられる。
【００２０】
また、本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
【００２１】
染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
【００２２】
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
【００２３】
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
【００２４】
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
【００２５】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００２６】
プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
【００２８】
該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
【００２９】
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００３０】
上記のようにして調製されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）等が挙げられる。
【００３１】
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
【００３２】
上述のようにして得られるＤＮＡが、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを優先して生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００３３】
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで該形質転換体の培養物をケトン化合物又はアルデヒド化合物に作用させる。反応生成物中の２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
【００３４】
本発明遺伝子を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子を宿主細胞に導入する。
【００３５】
ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができ、ペニシリウム・シトリナムにおいて本発明遺伝子の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
【００３６】
一般的には、宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる遺伝子を前述のようなベクターに組み込んでなる組換ベクターを宿主細胞に導入する。尚、ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
【００３７】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属及びAspergillus属に属する微生物等があげられる。
【００３８】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
【００３９】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
該形質転換体が本発明遺伝子を保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００４０】
次に本発明タンパク質について説明する。
本発明タンパク質は、下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｇ）ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｈ）ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
尚、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを不斉還元して（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを優先的に生産する能力をも有するタンパク質である。当該タンパク質を産生する形質転換体又はその処理物を、ケトン化合物に作用させることにより、容易に光学活性アルコールを製造方法することができる。
【００４１】
本発明タンパク質は、例えば、本発明遺伝子を保有する形質転換体を培養することにより製造することができる。
該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
【００４２】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４３】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４４】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４５】
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明タンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
【００４６】
本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃である。培地のｐHは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００４７】
本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養物から本発明タンパク質を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００４８】
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明タンパク質を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明タンパク質を含む画分を選抜するには、例えば、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。
【００４９】
次に、本発明におけるアルコールの製造方法について説明する。
該製造方法はケトン化合物又はアルデヒド化合物に、本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする。
【００５０】
ケトン化合物又はアルデヒド化合物は、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、tert−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、メチル ３−オキソブタノエート、エチル ３−オキサブタノネート、エチル ４−クロロアセトアセテート、メチル ４−ブロモー３−オキサブタノエート、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ３−オキソペンタノエート、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、４−アセチル安息香酸、D-(+)-グルコース等が挙げられる。
【００５１】
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
【００５２】
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
【００５３】
上記方法における反応は、例えば、水、ＮＡＤＨ、及びケトン化合物又はアルデヒド化合物を、本発明タンパク質あるいはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
【００５４】
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。
【００５５】
反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
【００５６】
反応液からのアルコールの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
【００５７】
本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
【００５８】
具体的な形態としては、例えば、本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明タンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明タンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００５９】
尚、本発明遺伝子を保有する形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明タンパク質の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００６０】
また、本発明のアルコールの製造方法はＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ+は、ＮＡＤ+を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
また、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また該酵素をもつ微生物又は該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。さらにまた、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
【００６１】
さらに、本発明のアルコールの製造方法では、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。
【００６２】
【実施例】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００６３】
実施例１ （本発明タンパク質の調製、本発明遺伝子の取得及びその解析）
（１）本発明タンパク質の調製
５Lジャーファーメンターに、培地（水に（NH4）2SO4を３ｇ/L、K2HPO4を３ｇ/L、NaClを１ｇ/L、MgSO4・７H2Oを０．２ｇ/L、DL-Phenylethyl Alcoholを２ｇ/L、Antifoam PE-H（和光純薬工業社製）を０．５ｇ/Lの割合で溶解した後、ｐHを７．０に調整したもの）３Ｌを入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。次いで、Bacto Peptoneを５ｇ/L、Yeast Extractを５ｇ/Lの割合で水に溶解した後、ｐＨを７．０に調整した培地中で培養（３０℃、１８時間、振盪培養）したライフソニア・エスピー（Leifsonia sp.）S−749株の培養液３０ｍｌを上記ジャーファーメンター内に加え、３０℃で４８時間、ジャーファーメンターを用いて培養した。その後、得られた培養液を遠心分離（８０００ｘｇ、１０分）することにより、沈殿として約５．０ｇの湿菌体を得た。
調製したライフソニア・エスピー（Leifsonia sp.）S−749株の湿菌体約１０．０ｇを、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）８０ｍｌに懸濁し、ULTRASONIC DISPUPTOR UD-200(TOMY社製)を用いて、OUTPUT８で氷冷しながら、計3分間、超音波破砕を行った。得られた破砕液を遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、遠心分離上清液（約８５ｍｌ）を得た。
得られた遠心分離上清（約８５ｍｌ）に、硫酸アンモニウムをその濃度が１４４ｇ/L（２５％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、遠心分離上清液（約９０ｍｌ）を得た。得られた遠心分離上清液（約９０ｍｌ）に硫酸アンモニウムを、その濃度が３９０ｇ/L（６０％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。得られた沈殿を２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌに溶解することにより、２２ｍｌの沈殿溶解液を得た。沈殿溶解液をDIALYSIS MEMBRANE SIZE８（WAKO製）に入れ、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）に対して、4℃で一晩透析を行った。透析後液をDEAE-TOYOPEARL（アマシャムファルマシアバイオテク社製）［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０Ｍ〜１．０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１８ｍｌ）を得た。
【００６４】
この溶出画分（１８ｍｌ）に、１．３Mになるように硫酸アンモニウムを加え、氷中で３０分間攪拌した後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。遠心分離上清液（２９ｍｌ）をBUTYL-TOYOPEARL（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）＋１．３M硫酸アンモニウムで平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（硫酸アンモニウム濃度１．３Ｍ〜０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（３１ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（３１ｍｌ）に硫酸アンモニウムをその濃度が４７２ｇ/L（７０％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。得られた沈殿を２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解することにより、約１ｍｌの沈殿溶解液を得た。この沈殿溶解液１ｍｌをDIALYSIS MEMBRANE SIZE８（WAKO製）に入れ、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）に対して、４℃で一晩透析を行い、透析液（約３ｍｌ）を得た。この透析液（約３ｍｌ）をCellulofine GCL-2000ｓｆ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を０．３ｍｌ/分の流速で流することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（９．７ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（９．７ｍｌ）をBioassistQ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０Ｍ〜０．８Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（１ｍｌ）をゲル濾過［カラム：TSK-GEL G3000SWXL（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動層：BIS-TRIS-PROPANEバッファー（20ｍＭ、ｐＨ7.0）］することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１ｍｌ：分子量約１１０，０００ダルトンの部分に相当）を精製酵素液として得た。
【００６５】
尚、クロマトグラフィー等で得られた溶出画分について、以下の操作により還元酵素活性を測定した。
２，２，２−トリフルオロアセトフェノン（２ｍM）及びＮＡＤＨ（０．２７ｍM）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）にクロマトグラフィー等により得られた溶出画分を加えて全量を１．５ｍｌとし、２５℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの消費量を計算して溶出画分の還元酵素活性を求めた。
【００６６】
（２）本発明タンパク質由来の部分ペプチドが有するアミノ酸配列の解析
上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された部分のゲルを切り取った。このゲルをジチオスレイトール及びヨウ化アセトアミドを用いて還元アルキル化し、トリプシンを処理した後、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペプチドをＨＰＬＣ（カラム：TSK gel ODS-80Ts QA、2.0mm×250mm（東ソー株式会社）、
溶媒A：0.1% TFA
溶媒B：0.09% TFA in 90% acetonitrile
流速：200μL/min
温度：室温
検出：210nm、280nm
グラジエント
0（min）―0（%）
2 ― 0
7 ― 10
82 ― 50
87 ― 100
92 ― 100
97 ― 0
分取：200μL/Fraction
分取した各画分をプロテインシークエンサー（Procise 494HT Protein Sequencing System）により決定した。
決定したアミノ酸配列のそれぞれを配列番号５（N末端アミノ酸配列（AQYDVADRSAIVTGG））、配列番号６（内部アミノ酸配列（IAVNNAGIGGEA））に示す。
【００６７】
（３）本発明遺伝子由来の部分塩基配列の解析
配列番号５で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号７（TFAR-F（CARTAYGAYGTIGCNGAHMG）、配列番号８（TFAR-R（CCDATICCNGCRTTRTTNAC）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ここで、塩基としてのＲはＧ又はＡ、ＹはＴ又はＣ、Ｉはイノシン、ＮはＡ又はＣ又はＧ又はＴ、ＨはＡ又はＣ又はＴ、ＭはＡ又はＣ、ＤはＡ又はＧ又はＴを意味している。
【００６８】
配列番号７、８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに、Lifsonia sp. DNAを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００６９】
[反応液組成]
Lifsonia sp. DNA １μl
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ） ２μｌ
プライマー（５０μＭ） 各２μｌ
１０×ＥＸ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２） ２μｌ
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ
超純水 １０．５μｌ
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００７０】
その後、ＰＣＲ産物を、pGEM-T Easy Vector System I (PROMEGA社製)にてライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli XL-1 Blue MRF'株を形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）培地に、得られた形質転換体を接種し培養した。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
【００７１】
プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、得られたＤＮＡの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社製）で解析することにより行った。プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号９に示す。
【００７２】
（４）本発明遺伝子の塩基配列の解析
Sau3A Ｉで部分分解したライフソニアDNAとBamH Iで切断したコスミドベクターpWE15のライゲーションを行った。
Gigapack Gold III（STRATAGENE社製）を用いてインビトロパッケージングを行った。
ファージをE.coli XL1-Blue MRF'に感染させ、アンピシリン入りのLBプレートで培養した後、集菌しアルカリSDS法によりコスミド抽出を行った。
コスミドをE.coli XL1-Blue MRF'に導入し、アンピシリン入りのLBプレートで培養した後、ナイロンメンブレンにブロッティングした。
標識プローブの調整、コロニーハイブリダイゼーションは、Alkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムバイオサイエンス株式会社）のプロトコルに従って行った。コロニーハイブリダイゼーションにおける条件は、プレハイブリダイゼーション75℃、ハイブリダイゼーション75℃、1次洗浄バッファー75℃であった。プローブに用いたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１０に示す。
検出はCDP-Star Detection reagentを用いて、X線フィルムに感光させることで行った。
プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、得られたＤＮＡの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社製）で解析することにより行った。
プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２に示す。
【００７３】
実施例２ （本発明ベクターの調製、本発明形質転換体の製造及び還元反応例（その１））
（１）Lifsonia sp. ＤＮＡの調製
ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749株を、滅菌したPY培地（ペプトン、酵母エキス各0.5％、pH7.0）１００ｍｌで３０℃、一晩培養した。この菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載の方法にしたがって染色体ＤＮＡを精製した。
【００７４】
（２）本発明ベクターの調製
配列番号２に示される塩基配列を基に配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００７５】
配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、Lifsonia sp. の染色体ＤＮＡを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００７６】
[反応液組成]
Lifsonia sp. 染色体ＤＮＡ １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ） ２μｌ
プライマー（５０μＭ） 各２μｌ
１０×ＥＸ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２） ２μｌ
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ
超純水 １０．５μｌ
【００７７】
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００７８】
その後、ＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びPstI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びPstI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲと記すこともある。）を取り出した。
【００７９】
これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli XL1-Blue MRF'を形質転換した。
【００８０】
（３）本発明形質転換体の調製及び還元反応例
得られた形質転換体を０．４ｍＭのＩＰＴＧ及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（４ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．０２gを得た。
前記湿菌体０．０２ｇに、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを１％、２-プロパノールを５％含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌを加え、３０℃で１８時間攪拌した。その後、反応液に５００μｌの酢酸エチルを加えたのち、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２，２，２−トリフルオロアセトフェノンの量に対して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールは４９．４％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの光学純度を測定したところ（Ｓ）体が９９ ％ｅ．ｅ．であった。
さらに該有機層を濃縮することにより、粗（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを得る。
【００８１】
（ガスクロマトグラフィー条件）
カラム：Cyclodextrine-β-236M-19 (０．２５ｍｍ×２５Ｍ, DF)
カラム温度：１４０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの標品と比較することにより決定した。
Retention time：Trifluoroacetophenone (2.3min)，
（Ｓ）−（＋）−α−(Trifluoromethyl)−benzyl alcohol(6.9min)，
（Ｒ）−（−）−α−(Trifluoromethyl)−benzyl alcohol (7.1min)
【００８２】
実施例３ （ケトン化合物又はアルデヒド化合物を原料とするアルコールの製造例（その１：本発明微生物を用いた還元反応例））
ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749株を、PY培地（ペプトン、酵母エキス各0.5％、pH7.0）で３０℃、一晩培養した。得られた培養液０．１ｍｌを下記組成のプレート培地に塗布し、スチレン飽和条件下（ダーラム管使用）で３０℃、３日間培養した。
【００８３】
［培養液組成］
(NH4)2SO4 0.3%
KH2PO4 0.3％
NaCl 0.1%
MgSO4・７H2O 0.02%
Agar Powder 1.5%
Yeast Extract 0.1%
Tap water
pH 7.0
【００８４】
プレート培地に、１枚当たり２ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えてスプレッダーで菌を掻きとった後、２ｍｌのエッペンチューブに入れ、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、１分間）した。上清を除いた菌体のペレットに、下記の反応液を１ｍｌ加え、Bio Shakerを用いて、３０℃、１８時間、静止菌体反応を行った。
【００８５】
［反応液組成］
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
３％ ２−プロパノール
２０ｍＭ ２，２，２−トリフルオロアセトフェノン
０．５ｍM ＮＡＤ＋
０．５ｍM ＮＡＤＰ＋
【００８６】
１ｍｌの酢酸エチルを加え、ボルテックスした後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。この有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析及び光学異性体分析を行ったところ、反応に用いた２，２，２−トリフルオロアセトフェノンの量に対して、α−（トリフルオロメチル）−ベンジルアルコールは１００％生成していることがわかった。また、α−（トリフルオロメチル）−ベンジルアルコールの光学純度を測定したところ（Ｓ）体が９９．９ ％ｅ．ｅ．以上であった。
さらに該有機層を濃縮することにより、粗α−（トリフルオロメチル）−ベンジルアルコールを得た。
【００８７】
（ガスクロマトグラフィー条件）
カラム：Cyclodextrine-β-236M-19 (０．２５ｍｍ×２５Ｍ, DF)
カラム温度：１４０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの標品と比較することにより決定した。
Retention time：Trifluoroacetophenone (2.3min)，
（Ｓ）−（＋）−α−(Trifluoromethyl)−benzyl alcohol(6.9min)，
（Ｒ）−（−）−α−(Trifluoromethyl)−benzyl alcohol (7.1min)
【００８８】
実施例４ （ケトン化合物又はアルデヒド化合物を原料とするアルコールの製造例（その２：本発明タンパク質を用いた還元反応例））
実施例１で得られた精製酵素液を用いて、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造した。その結果を下記した。
尚、還元活性は、以下のとおり測定した。
基質（２ｍM）及びＮＡＤＨ（０．２７ｍM）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）に精製酵素液を加えて全量を１．５ｍｌとし、２５℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの消費量を計算して還元酵素活性を求めた。
【００８９】
（結果）
化合物 ／ 濃度（ｍＭ） ／ 還元酵素活性（Ｕ／ｍＬ）の順に、プロピオンアルデヒド／ ２ ／ ２、ｎ−ブチルアルデヒド／ ２ ／ ８、ｎ−バレルアルデヒド／ ２ ／ １０８、ｎ−ヘキシルアルデヒド／ ２ ／ ８４４、ｎ−ペプチルアルデヒド／ ２ ／ ６１９、ｎ−デシルアルデヒド／ ２ ／３９４、２−オキソプロピオンアルデヒド／ ２ ／ ５、トランス−シンナムアルデヒド／ ２ ／ ２１２、４−ブロモベンズアルデヒド／ ２ ／ ４７、２−ニトロベンズアルデヒド／ ２ ／ ４８、３−ニトロベンズアルデヒド／ ２ ／ ２５、フェニルアセトアルデヒド／ ２ ／ ７、４−クロロベンズアルデヒド／ ２ ／ ２０、２−ペンタノン／ ２ ／ １４、２−ヘキサノン／ ２ ／ ８５、２−ヘプタノン／ ２ ／ １８８、２−オクタノン／ ２ ／ １２１、２−ノナノン／ ２ ／ ９０、３−ペンタノン／ ２ ／ ２、３−クロロ−２−ブタノン／ ２ ／ １２４、tert−ブチルアセトアセテート／ ２ ／ ４６６、４−ヒドロキシ−２−ブタノン／ ２ ／ ２１ヒドロキシアセトン／ ２ ／ ８、１，１−ジクロロアセトン／ ２ ／ ８８４、クロロアセトン／ ２ ／ １９５、ジヒドロキシアセトン／ ２ ／ ２、１，１−ジクロロアセトン／ ２ ／ ２、メチル ３−オキソブタノエート／ ２ ／ １０７、エチル ３−オキサブタノネート／ ２ ／ ２５３、エチル ４−クロロアセトアセテート／ ２ ／ ６６３、メチル ４−ブロモー３−オキサブタノエート／ ２ ／ １３５、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート／ ２ ／ ４１９、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン／ ２ ／ ４、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート／ ２ ／ ２、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート／ ２ ／ ４、メチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート／ ２ ／ ４、メチル ３−オキソペンタノエート／ ２ ／ １４、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン／ ２ ／ ８２、アセトフェノン／ ２ ／ ５、２’−ブロモアセトフェノン／ ２ ／ ２、３’−ブロモアセトフェノン／ ２ ／ １２４、４’−ブロモアセトフェノン／ ２ ／ ６３、２−クロロアセトフェノン／ ２ ／ ２、３’−クロロアセトフェノン／ ２ ／ ５７、４’−クロロアセトフェノン／ ２ ／ ４９、ベンジルアセトン／ ２ ／ ２８９、１−フェニル−２−ブタノン／ ２ ／ １０、ｍ−メトキシアセトフェノン／ ２ ／ ４２、３，４−ジメトキシアセトフェノン／ ２ ／ ２０、４’−メトキシアセトフェノン／ ２ ／ ３、２，３’−ジクロロアセトフェノン／ ２ ／ ２７、３，４−ジメトキシフェニルアセトン／ ２ ／ １６、シクロペンタノン／ ２ ／ １、４−アセチル安息香酸／ ２ ／ ２、D-(+)-グルコース／ ２ ／ １
【００９０】
実施例５ （アルコールを原料とするケトン化合物又はアルデヒド化合物の製造例（本発明タンパク質を用いた酸化反応例））
実施例１で得られた精製酵素液を用いて、アルコールからケトン化合物又はアルデヒド化合物を製造した。その結果を下記した。
尚、酸化活性は、以下のとおり測定した。
基質（１０ｍM）及びＮＡＤ＋（３ｍM）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）に精製酵素を加えて全量を１．５ｍｌとし、２５℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの生成量を計算して酸化酵素活性を求めた。
【００９１】
（結果）
化合物 ／ 濃度（ｍＭ） ／ 還元酵素活性（Ｕ／ｍＬ）の順に、１−ヘプタノール／ １０ ／ ７、１−オクタノール／ ５ ／ ４、２−プロパノール／ １０ ／ １２、（Ｒ）−２−ブタノール／ １０ ／ ３３、（Ｒ）−２−ペンタノール／ １０ ／ ８０、（Ｒ，Ｓ）−２−ペンタノール／ １０ ／ ３８、（Ｒ）−２−ヘキサノール／ １０ ／ ２７０、（Ｒ，Ｓ）−２−ヘキサノール／ １０ ／ １７９、（Ｓ）−（＋）−２−ヘプタノール／ １０ ／ ２０、（Ｒ）−（−）−２−ヘプタノール／ １０ ／ ４１５、（Ｒ，Ｓ）−２−へプタノール／ １０ ／ ２７７、３−ヘプタノール／ １０ ／ １１、（Ｓ）−（＋）−２−オクタノール／ ５ ／ ４、（Ｒ）−（−）−２−オクタノール／ ５ ／ １８１、シクロペンタノール／ １０ ／ ２、（Ｒ）−（＋）−１−フェニルエタノール／ １０ ／ １０、２−フェニルエタノール／ １０ ／ ２、シンナミル アルコール／ １０ ／ ６
【００９２】
実施例６ （本還元酵素遺伝子及び補酵素再生酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製：プラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲＳｂＧの構築）
（６−１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備
フラスコにＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）１００ｍｌを入れ、滅菌した。このようにして調製された培地に、Bacillus megaterium IFO12108株が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養した。
培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得た。
このようにして得られた洗浄菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属するマニュアルに記載される方法に従って染色体ＤＮＡを精製した。
【００９３】
（６−２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381-6385(1989)に記載された公知のBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを合成する。
配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（６−１）で精製された染色体ＤＮＡを鋳型にして実施例２（２−２）に記載させる反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、２種類の制限酵素（ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ）を加えることにより、当該ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を２重消化させる。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製する。
一方、実施例２で調製されるプラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲに２種類の制限酵素（ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させる。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
このようにして精製して得られる２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションする。得られるライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換する。
得られる形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子及び本補酵素再生遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲＳｂＧと記すこともある。）を取り出す。
また、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を鋳型として、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られるＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析する。
【００９４】
実施例７ （本還元酵素遺伝子及び補酵素再生酵素遺伝子を含有する形質転換体の調製）
実施例６で調製されるプラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲＳｂＧを用いてE．coli HB101を形質転換する。得られる形質転換体を０．４ｍＭのＩＰＴＧ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）のＺｎＣｌ２及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×３本）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
【００９５】
実施例８（（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの製造方法（その１））
５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌに、実施例７で調製される洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤ+１２ｍｇ及びグルコース２．５ｇを加える。この混合物に、さらに２４０ｍｇの２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で７．０に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液に酢酸エチル２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層に再度酢酸エチル２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を合一濃縮した後、これをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、クロロホルムを留去することにより、（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを得る。
【００９６】
実施例９ （本還元酵素を産生する微生物の取得方法）
（１）洗浄菌体の調製
市販の微生物又は土壌などから単離した微生物を滅菌ＬＢ培地（１０ｍｌ）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
（２）スクリーニング
１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）２０ｍｌに、上記（１１−１）で調製された洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤＰ+１２ｍｇ、ＮＡＤ+１２ｍｇ及びグルコース２．５ｇを加える。この混合物に、さらに一般式(1)で示される２，２，２−トリフルオロアセトフェノン２４０ｍｇを加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で６．５に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液に酢酸エチル２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層に再度酢酸エチル２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を合一濃縮した後、これをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、クロロホルムを留去することにより残渣を得る。得られる残渣に、２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールが含まれていることをガスクロマトグラフィーにて定性及び／定量分析により確認する。
【発明の効果】
本発明によれば、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造するために優れた触媒能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質、及びこれを利用したアルコールの製造方法等が提供される。
【００９７】
「配列表フリーテキスト」
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００９８】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元酵素をコードする遺伝子、該酵素及びそれらの利用等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルコールは、各種用途化合物の中間体等として有用な化合物であり、これまでに多くの製造方法が知られている。特にアルコールは、医農薬中間体等として有用な化合物であり、これまでに種々の製造方法が提案されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような光学活性アルコールの製造には天然物からの抽出、ラセミ体の光学分割又は不斉触媒による合成法等が使用されるが、一般的には製造が煩雑であり、結果として得られる製品は高価なものにならざるを得ない場合も存在している。そこで、安価な光学活性アルコールの製造法にも適しうる新たなアルコールの製造方法方法が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、アルコールの製造方法、特に光学活性アルコールの製造法にも適する方法について種々検討した結果、光学活性アルコールを製造するためにも利用可能なタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を見出し、これを反応触媒として利用することにより、アルコールを生産可能とし、また光学活性アルコールをも安価に生産するような製造方法を提供することが上記課題を解決するために極めて有効であると判断し、かつ多くの実験等を経ることにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有することを見出し、本発明に至った。
【０００５】
即ち、本発明は、
１．下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｇ）ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｈ）ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列；
２．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とする遺伝子；
３．前項１又は２記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
４．前項２記載の遺伝子又は前項３記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
５．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
６．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項４記載の形質転換体；
７．前項１記載の遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体；
８．前項３記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
９．下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質（以下、本発明タンパク質と記載することもある。）
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｇ）ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｈ）ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列；
１０．ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項９記載のタンパク質、それを産生する微生物、前項４〜７記載の形質転換体又はそれらの処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法；
１１．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター；
１２．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１０記載の組換ベクター；
１３．前項１１又は１２記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
１４．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１５．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項１３記載の形質転換体；
１６．前項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体；
１７．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質を反応系内に共存させること特徴とする前項１０記載のアルコールの製造方法；
１８．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項１７記載のアルコールの製造方法；
１９．ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項１３〜１６記載の形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法；
２０．ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造するための触媒としての、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物の使用；
２１．ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物がライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749（国際寄託当局の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）であることを特徴とする前項１９記載の使用；
２２．ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749（国際寄託当局の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
まず、本発明遺伝子について説明する。
本発明遺伝子は、下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｇ）ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｈ）ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
尚、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡは、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを不斉還元して（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを優先的に生産する能力をも有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡである。当該ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより得られた形質転換体又はその処理物を、ケトン化合物に作用させることにより、容易に光学活性アルコールを製造方法することができる。
【０００７】
本発明遺伝子は、天然の遺伝子であってもよく、又は天然の遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された遺伝子であってもよい。天然の遺伝子を検索する場合には、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有する微生物を対象にすればよく、例えば、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物をその対象として挙げることができる。
【０００８】
これら微生物は、天然から分離してもよいし、菌株保存機関等から購入してもよい。
天然から分離する場合、まず、土壌を野外から採取する。採取された土壌を目菌水で懸濁させた後、当該懸濁液を、例えば、PY培地（Bacto Peptoneを５ｇ/L、Yeast Extractを５ｇ/Lの割合で水に溶解した後、ｐHを７．０に調整）等の微生物分離用固体培地上に塗布し、これを２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しい、例えば、PY培地等の微生物分離用固体培地に移植し、これをさらに２５℃で培養する。生育してきた菌について、SNEATH, (P.H.A.), MAIR, (N.S.) SHARPE, (M.E.) and HOLT, (J.G.):Bergey's manual of Systematic Bacteriorogy. Vol.2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore.等に記載される方法等に従って、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物であるかを同定することにより、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物を選抜すればよい。
つぎに、選抜されたライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から、当該微生物の２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力の有無を、例えば、後述の実施例に記載されるような方法に従って確認することにより、本発明に用いられるライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物を選抜すればよい。
【０００９】
尚、ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成１５年２月１２日）。菌学的性状は次のとおり。
１．コロニー形態（３０℃、４８時間）
（１）細胞形態：かん菌、０．６×１.０〜２．０μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：有
２．Nutrient Agar上でのコロニー形態
コロニーの色：黄色
コロニーの形状：円形
コロニーの周縁：全縁滑らか
コロニーの隆起：低凸状
３．生理学的性質
（１） カタラーゼ：陽性
（２） オキシダーゼ：陰性
（３） ＯＦテスト：陽性/陰性
４．１６ＳリボゾームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列
ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749株からＰＣＲにより１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列約５００ｂｐを増幅し、塩基配列を解析した。得られた１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を使って、ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った結果、相同率９９．６％で、ライフソニア アクアティカ（Leifsonia aquatica）基準株の１６ＳリボゾームＤＮＡに対し、最も高い相同性を示した。更に、検索された上位５株のうち、４株がライフソニア（Leifsonia）で占められ、その相同率は９８％以上を示した。
以上の菌学的性質により、本菌はライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）と同定された。
【００１０】
本発明遺伝子は２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する還元反応を触媒する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有している。
【００１１】
本発明遺伝子において、配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、一文字表記：MAQYDVADRSAIVTGGGSGIGRAVALTLAASGAAVLVTDLKEEHAQAVVAEIEAAGGKAAALAGDVTDPAFGEASVAGANALAPLKIAVNNAGIGGEAATVGDYSLDSWRTVIEVNLNAVFYGMQPQLKAMAANGGGAIVNMASILGSVGFANSSGYVTAKHALLGLTQNAALEYAADKVRVVAVGPGFIRTRSWRQLFRRRAGVLQGKHALGRLGEPEEVASLVAFLASDAASFITGSYHLVDGGYTAQである。
【００１２】
本発明遺伝子において、前記（ｂ）にある「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された」や前記（ｃ）及び（ｅ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYXや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
前記（ｆ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法（具体的には、サザンハイブリダイゼーション法等）に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、（１）高イオン濃度下（例えば、６×SSC（１．５M NaCl、０．１５M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする））、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させることにより配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成した後、低イオン濃度下（例えば、2×SSC）で５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、（２）高イオン濃度下（例えば、６×SSC）、溶液中で６５℃にてハイブリッドを形成させることにより配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成した後、低イオン濃度下（例えば、0.1 X SSC）で65℃にて洗浄するような条件（「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度（例えば、温度を５０℃に設定した場合）は、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。このような洗浄ステップ後でも上記ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡという。
【００１３】
本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、以下のようにして調製することができる。
【００１４】
ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００１５】
ここで、前記ＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することになる。
【００１６】
該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるＤＮＡライブラリーを混合した反応液を94℃（5分間）に加熱した後、94℃(5分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持する条件が挙げられる。
【００１７】
なお、該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
【００１８】
また、前記ＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする５’末端側の約１４塩基程度以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００１９】
上記のようにして増幅されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）などが挙げられる。
【００２０】
また、本発明遺伝子のＤＮＡは、例えば、微生物またはファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
【００２１】
染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
【００２２】
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
【００２３】
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
【００２４】
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
【００２５】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００２６】
プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
【００２８】
該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
【００２９】
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明遺伝子のＤＮＡを調製することができる。
【００３０】
上記のようにして調製されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）等が挙げられる。
【００３１】
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
【００３２】
上述のようにして得られるＤＮＡが、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを優先して生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００３３】
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで該形質転換体の培養物をケトン化合物又はアルデヒド化合物に作用させる。反応生成物中の２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
【００３４】
本発明遺伝子を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子を宿主細胞に導入する。
【００３５】
ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができ、ペニシリウム・シトリナムにおいて本発明遺伝子の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
【００３６】
一般的には、宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる遺伝子を前述のようなベクターに組み込んでなる組換ベクターを宿主細胞に導入する。尚、ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
【００３７】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属及びAspergillus属に属する微生物等があげられる。
【００３８】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
【００３９】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明遺伝子又は本発明組換ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
該形質転換体が本発明遺伝子を保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００４０】
次に本発明タンパク質について説明する。
本発明タンパク質は、下記のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｇ）ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｈ）ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749から得られうるタンパク質のアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
尚、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを不斉還元して（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを優先的に生産する能力をも有するタンパク質である。当該タンパク質を産生する形質転換体又はその処理物を、ケトン化合物に作用させることにより、容易に光学活性アルコールを製造方法することができる。
【００４１】
本発明タンパク質は、例えば、本発明遺伝子を保有する形質転換体を培養することにより製造することができる。
該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
【００４２】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４３】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４４】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４５】
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明タンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
【００４６】
本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃である。培地のｐHは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００４７】
本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養物から本発明タンパク質を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００４８】
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明タンパク質を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明タンパク質を含む画分を選抜するには、例えば、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。
【００４９】
次に、本発明におけるアルコールの製造方法について説明する。
該製造方法はケトン化合物又はアルデヒド化合物に、本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする。
【００５０】
ケトン化合物又はアルデヒド化合物は、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、tert−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、メチル ３−オキソブタノエート、エチル ３−オキサブタノネート、エチル ４−クロロアセトアセテート、メチル ４−ブロモー３−オキサブタノエート、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ３−オキソペンタノエート、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、４−アセチル安息香酸、D-(+)-グルコース等が挙げられる。
【００５１】
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
【００５２】
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
【００５３】
上記方法における反応は、例えば、水、ＮＡＤＨ、及びケトン化合物又はアルデヒド化合物を、本発明タンパク質あるいはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
【００５４】
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。
【００５５】
反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
【００５６】
反応液からのアルコールの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
【００５７】
本発明タンパク質、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
【００５８】
具体的な形態としては、例えば、本発明遺伝子を保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明タンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明タンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００５９】
尚、本発明遺伝子を保有する形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明タンパク質の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００６０】
また、本発明のアルコールの製造方法はＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ+は、ＮＡＤ+を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
また、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また該酵素をもつ微生物又は該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。さらにまた、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
【００６１】
さらに、本発明のアルコールの製造方法では、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。
【００６２】
【実施例】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００６３】
実施例１ （本発明タンパク質の調製、本発明遺伝子の取得及びその解析）
（１）本発明タンパク質の調製
５Lジャーファーメンターに、培地（水に（NH4）2SO4を３ｇ/L、K2HPO4を３ｇ/L、NaClを１ｇ/L、MgSO4・７H2Oを０．２ｇ/L、DL-Phenylethyl Alcoholを２ｇ/L、Antifoam PE-H（和光純薬工業社製）を０．５ｇ/Lの割合で溶解した後、ｐHを７．０に調整したもの）３Ｌを入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。次いで、Bacto Peptoneを５ｇ/L、Yeast Extractを５ｇ/Lの割合で水に溶解した後、ｐＨを７．０に調整した培地中で培養（３０℃、１８時間、振盪培養）したライフソニア・エスピー（Leifsonia sp.）S−749株の培養液３０ｍｌを上記ジャーファーメンター内に加え、３０℃で４８時間、ジャーファーメンターを用いて培養した。その後、得られた培養液を遠心分離（８０００ｘｇ、１０分）することにより、沈殿として約５．０ｇの湿菌体を得た。
調製したライフソニア・エスピー（Leifsonia sp.）S−749株の湿菌体約１０．０ｇを、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）８０ｍｌに懸濁し、ULTRASONIC DISPUPTOR UD-200(TOMY社製)を用いて、OUTPUT８で氷冷しながら、計3分間、超音波破砕を行った。得られた破砕液を遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、遠心分離上清液（約８５ｍｌ）を得た。
得られた遠心分離上清（約８５ｍｌ）に、硫酸アンモニウムをその濃度が１４４ｇ/L（２５％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）することにより、遠心分離上清液（約９０ｍｌ）を得た。得られた遠心分離上清液（約９０ｍｌ）に硫酸アンモニウムを、その濃度が３９０ｇ/L（６０％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。得られた沈殿を２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌに溶解することにより、２２ｍｌの沈殿溶解液を得た。沈殿溶解液をDIALYSIS MEMBRANE SIZE８（WAKO製）に入れ、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）に対して、4℃で一晩透析を行った。透析後液をDEAE-TOYOPEARL（アマシャムファルマシアバイオテク社製）［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０Ｍ〜１．０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１８ｍｌ）を得た。
【００６４】
この溶出画分（１８ｍｌ）に、１．３Mになるように硫酸アンモニウムを加え、氷中で３０分間攪拌した後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。遠心分離上清液（２９ｍｌ）をBUTYL-TOYOPEARL（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）＋１．３M硫酸アンモニウムで平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（硫酸アンモニウム濃度１．３Ｍ〜０Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（３１ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（３１ｍｌ）に硫酸アンモニウムをその濃度が４７２ｇ/L（７０％飽和）になるまで徐々に加えた後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）した。得られた沈殿を２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解することにより、約１ｍｌの沈殿溶解液を得た。この沈殿溶解液１ｍｌをDIALYSIS MEMBRANE SIZE８（WAKO製）に入れ、２０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．０）に対して、４℃で一晩透析を行い、透析液（約３ｍｌ）を得た。この透析液（約３ｍｌ）をCellulofine GCL-2000ｓｆ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を０．３ｍｌ/分の流速で流することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（９．７ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（９．７ｍｌ）をBioassistQ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、塩化ナトリウムを溶解したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（塩化ナトリウム濃度０Ｍ〜０．８Ｍの濃度勾配）を移動層として溶出することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１ｍｌ）を得た。得られた溶出画分（１ｍｌ）をゲル濾過［カラム：TSK-GEL G3000SWXL（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［移動層：BIS-TRIS-PROPANEバッファー（20ｍＭ、ｐＨ7.0）］することにより、還元酵素活性を有する溶出画分（１ｍｌ：分子量約１１０，０００ダルトンの部分に相当）を精製酵素液として得た。
【００６５】
尚、クロマトグラフィー等で得られた溶出画分について、以下の操作により還元酵素活性を測定した。
２，２，２−トリフルオロアセトフェノン（２ｍM）及びＮＡＤＨ（０．２７ｍM）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）にクロマトグラフィー等により得られた溶出画分を加えて全量を１．５ｍｌとし、２５℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの消費量を計算して溶出画分の還元酵素活性を求めた。
【００６６】
（２）本発明タンパク質由来の部分ペプチドが有するアミノ酸配列の解析
上記操作により得られた活性画分（Ａ）をLaemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色し、染色された部分のゲルを切り取った。このゲルをジチオスレイトール及びヨウ化アセトアミドを用いて還元アルキル化し、トリプシンを処理した後、ゲルからペプチドを抽出した。抽出したペプチドをＨＰＬＣ（カラム：TSK gel ODS-80Ts QA、2.0mm×250mm（東ソー株式会社）、
溶媒A：0.1% TFA
溶媒B：0.09% TFA in 90% acetonitrile
流速：200μL/min
温度：室温
検出：210nm、280nm
グラジエント
0（min）―0（%）
2 ― 0
7 ― 10
82 ― 50
87 ― 100
92 ― 100
97 ― 0
分取：200μL/Fraction
分取した各画分をプロテインシークエンサー（Procise 494HT Protein Sequencing System）により決定した。
決定したアミノ酸配列のそれぞれを配列番号５（N末端アミノ酸配列（AQYDVADRSAIVTGG））、配列番号６（内部アミノ酸配列（IAVNNAGIGGEA））に示す。
【００６７】
（３）本発明遺伝子由来の部分塩基配列の解析
配列番号５で示されるアミノ酸配列を基に、配列番号７（TFAR-F（CARTAYGAYGTIGCNGAHMG）、配列番号８（TFAR-R（CCDATICCNGCRTTRTTNAC）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ここで、塩基としてのＲはＧ又はＡ、ＹはＴ又はＣ、Ｉはイノシン、ＮはＡ又はＣ又はＧ又はＴ、ＨはＡ又はＣ又はＴ、ＭはＡ又はＣ、ＤはＡ又はＧ又はＴを意味している。
【００６８】
配列番号７、８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーに、Lifsonia sp. DNAを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００６９】
[反応液組成]
Lifsonia sp. DNA １μl
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ） ２μｌ
プライマー（５０μＭ） 各２μｌ
１０×ＥＸ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２） ２μｌ
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ
超純水 １０．５μｌ
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００７０】
その後、ＰＣＲ産物を、pGEM-T Easy Vector System I (PROMEGA社製)にてライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli XL-1 Blue MRF'株を形質転換した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）培地に、得られた形質転換体を接種し培養した。培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
【００７１】
プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、得られたＤＮＡの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社製）で解析することにより行った。プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号９に示す。
【００７２】
（４）本発明遺伝子の塩基配列の解析
Sau3A Ｉで部分分解したライフソニアDNAとBamH Iで切断したコスミドベクターpWE15のライゲーションを行った。
Gigapack Gold III（STRATAGENE社製）を用いてインビトロパッケージングを行った。
ファージをE.coli XL1-Blue MRF'に感染させ、アンピシリン入りのLBプレートで培養した後、集菌しアルカリSDS法によりコスミド抽出を行った。
コスミドをE.coli XL1-Blue MRF'に導入し、アンピシリン入りのLBプレートで培養した後、ナイロンメンブレンにブロッティングした。
標識プローブの調整、コロニーハイブリダイゼーションは、Alkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムバイオサイエンス株式会社）のプロトコルに従って行った。コロニーハイブリダイゼーションにおける条件は、プレハイブリダイゼーション75℃、ハイブリダイゼーション75℃、1次洗浄バッファー75℃であった。プローブに用いたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１０に示す。
検出はCDP-Star Detection reagentを用いて、X線フィルムに感光させることで行った。
プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、得られたＤＮＡの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ABI社製）で解析することにより行った。
プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２に示す。
【００７３】
実施例２ （本発明ベクターの調製、本発明形質転換体の製造及び還元反応例（その１））
（１）Lifsonia sp. ＤＮＡの調製
ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749株を、滅菌したPY培地（ペプトン、酵母エキス各0.5％、pH7.0）１００ｍｌで３０℃、一晩培養した。この菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属のマニュアルに記載の方法にしたがって染色体ＤＮＡを精製した。
【００７４】
（２）本発明ベクターの調製
配列番号２に示される塩基配列を基に配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【００７５】
配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとをプライマーに、Lifsonia sp. の染色体ＤＮＡを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００７６】
[反応液組成]
Lifsonia sp. 染色体ＤＮＡ １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ） ２μｌ
プライマー（５０μＭ） 各２μｌ
１０×ＥＸ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２） ２μｌ
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ
超純水 １０．５μｌ
【００７７】
[反応条件]
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、94℃（5分間）に加熱した後、94℃(0.5分間)→55℃(0.5分間)→72℃（0.5分間）のサイクルを３０回行い、さらに72℃で10分間保持した。
【００７８】
その後、ＰＣＲ反応液に２種類の制限酵素（NcoI及びPstI）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化させ、次いで酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（NcoI及びPstI）により２重消化させ、酵素消化されたＤＮＡ断片を精製した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲと記すこともある。）を取り出した。
【００７９】
これらの酵素消化させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、得られたライゲーション液でE．coli XL1-Blue MRF'を形質転換した。
【００８０】
（３）本発明形質転換体の調製及び還元反応例
得られた形質転換体を０．４ｍＭのＩＰＴＧ及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（４ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３０℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体０．０２gを得た。
前記湿菌体０．０２ｇに、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを１％、２-プロパノールを５％含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌを加え、３０℃で１８時間攪拌した。その後、反応液に５００μｌの酢酸エチルを加えたのち、遠心分離し、有機層を得た。この有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析を行ったところ、反応に用いた２，２，２−トリフルオロアセトフェノンの量に対して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールは４９．４％生成していることがわかった。また、下記条件で有機層中の２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの光学純度を測定したところ（Ｓ）体が９９ ％ｅ．ｅ．であった。
さらに該有機層を濃縮することにより、粗（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを得る。
【００８１】
（ガスクロマトグラフィー条件）
カラム：Cyclodextrine-β-236M-19 (０．２５ｍｍ×２５Ｍ, DF)
カラム温度：１４０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの標品と比較することにより決定した。
Retention time：Trifluoroacetophenone (2.3min)，
（Ｓ）−（＋）−α−(Trifluoromethyl)−benzyl alcohol(6.9min)，
（Ｒ）−（−）−α−(Trifluoromethyl)−benzyl alcohol (7.1min)
【００８２】
実施例３ （ケトン化合物又はアルデヒド化合物を原料とするアルコールの製造例（その１：本発明微生物を用いた還元反応例））
ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749株を、PY培地（ペプトン、酵母エキス各0.5％、pH7.0）で３０℃、一晩培養した。得られた培養液０．１ｍｌを下記組成のプレート培地に塗布し、スチレン飽和条件下（ダーラム管使用）で３０℃、３日間培養した。
【００８３】
［培養液組成］
(NH4)2SO4 0.3%
KH2PO4 0.3％
NaCl 0.1%
MgSO4・７H2O 0.02%
Agar Powder 1.5%
Yeast Extract 0.1%
Tap water
pH 7.0
【００８４】
プレート培地に、１枚当たり２ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えてスプレッダーで菌を掻きとった後、２ｍｌのエッペンチューブに入れ、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、１分間）した。上清を除いた菌体のペレットに、下記の反応液を１ｍｌ加え、Bio Shakerを用いて、３０℃、１８時間、静止菌体反応を行った。
【００８５】
［反応液組成］
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
３％ ２−プロパノール
２０ｍＭ ２，２，２−トリフルオロアセトフェノン
０．５ｍM ＮＡＤ＋
０．５ｍM ＮＡＤＰ＋
【００８６】
１ｍｌの酢酸エチルを加え、ボルテックスした後、遠心分離（４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間）した。この有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析及び光学異性体分析を行ったところ、反応に用いた２，２，２−トリフルオロアセトフェノンの量に対して、α−（トリフルオロメチル）−ベンジルアルコールは１００％生成していることがわかった。また、α−（トリフルオロメチル）−ベンジルアルコールの光学純度を測定したところ（Ｓ）体が９９．９ ％ｅ．ｅ．以上であった。
さらに該有機層を濃縮することにより、粗α−（トリフルオロメチル）−ベンジルアルコールを得た。
【００８７】
（ガスクロマトグラフィー条件）
カラム：Cyclodextrine-β-236M-19 (０．２５ｍｍ×２５Ｍ, DF)
カラム温度：１４０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：１ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
尚、生成物の絶対立体配置は（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの標品と比較することにより決定した。
Retention time：Trifluoroacetophenone (2.3min)，
（Ｓ）−（＋）−α−(Trifluoromethyl)−benzyl alcohol(6.9min)，
（Ｒ）−（−）−α−(Trifluoromethyl)−benzyl alcohol (7.1min)
【００８８】
実施例４ （ケトン化合物又はアルデヒド化合物を原料とするアルコールの製造例（その２：本発明タンパク質を用いた還元反応例））
実施例１で得られた精製酵素液を用いて、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造した。その結果を下記した。
尚、還元活性は、以下のとおり測定した。
基質（２ｍM）及びＮＡＤＨ（０．２７ｍM）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）に精製酵素液を加えて全量を１．５ｍｌとし、２５℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの消費量を計算して還元酵素活性を求めた。
【００８９】
（結果）
化合物 ／ 濃度（ｍＭ） ／ 還元酵素活性（Ｕ／ｍＬ）の順に、プロピオンアルデヒド／ ２ ／ ２、ｎ−ブチルアルデヒド／ ２ ／ ８、ｎ−バレルアルデヒド／ ２ ／ １０８、ｎ−ヘキシルアルデヒド／ ２ ／ ８４４、ｎ−ペプチルアルデヒド／ ２ ／ ６１９、ｎ−デシルアルデヒド／ ２ ／３９４、２−オキソプロピオンアルデヒド／ ２ ／ ５、トランス−シンナムアルデヒド／ ２ ／ ２１２、４−ブロモベンズアルデヒド／ ２ ／ ４７、２−ニトロベンズアルデヒド／ ２ ／ ４８、３−ニトロベンズアルデヒド／ ２ ／ ２５、フェニルアセトアルデヒド／ ２ ／ ７、４−クロロベンズアルデヒド／ ２ ／ ２０、２−ペンタノン／ ２ ／ １４、２−ヘキサノン／ ２ ／ ８５、２−ヘプタノン／ ２ ／ １８８、２−オクタノン／ ２ ／ １２１、２−ノナノン／ ２ ／ ９０、３−ペンタノン／ ２ ／ ２、３−クロロ−２−ブタノン／ ２ ／ １２４、tert−ブチルアセトアセテート／ ２ ／ ４６６、４−ヒドロキシ−２−ブタノン／ ２ ／ ２１ヒドロキシアセトン／ ２ ／ ８、１，１−ジクロロアセトン／ ２ ／ ８８４、クロロアセトン／ ２ ／ １９５、ジヒドロキシアセトン／ ２ ／ ２、１，１−ジクロロアセトン／ ２ ／ ２、メチル ３−オキソブタノエート／ ２ ／ １０７、エチル ３−オキサブタノネート／ ２ ／ ２５３、エチル ４−クロロアセトアセテート／ ２ ／ ６６３、メチル ４−ブロモー３−オキサブタノエート／ ２ ／ １３５、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート／ ２ ／ ４１９、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン／ ２ ／ ４、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート／ ２ ／ ２、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート／ ２ ／ ４、メチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート／ ２ ／ ４、メチル ３−オキソペンタノエート／ ２ ／ １４、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン／ ２ ／ ８２、アセトフェノン／ ２ ／ ５、２’−ブロモアセトフェノン／ ２ ／ ２、３’−ブロモアセトフェノン／ ２ ／ １２４、４’−ブロモアセトフェノン／ ２ ／ ６３、２−クロロアセトフェノン／ ２ ／ ２、３’−クロロアセトフェノン／ ２ ／ ５７、４’−クロロアセトフェノン／ ２ ／ ４９、ベンジルアセトン／ ２ ／ ２８９、１−フェニル−２−ブタノン／ ２ ／ １０、ｍ−メトキシアセトフェノン／ ２ ／ ４２、３，４−ジメトキシアセトフェノン／ ２ ／ ２０、４’−メトキシアセトフェノン／ ２ ／ ３、２，３’−ジクロロアセトフェノン／ ２ ／ ２７、３，４−ジメトキシフェニルアセトン／ ２ ／ １６、シクロペンタノン／ ２ ／ １、４−アセチル安息香酸／ ２ ／ ２、D-(+)-グルコース／ ２ ／ １
【００９０】
実施例５ （アルコールを原料とするケトン化合物又はアルデヒド化合物の製造例（本発明タンパク質を用いた酸化反応例））
実施例１で得られた精製酵素液を用いて、アルコールからケトン化合物又はアルデヒド化合物を製造した。その結果を下記した。
尚、酸化活性は、以下のとおり測定した。
基質（１０ｍM）及びＮＡＤ＋（３ｍM）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）に精製酵素を加えて全量を１．５ｍｌとし、２５℃で２０秒間保温した後、３４０ｎｍの吸光度を測定した。３４０ｎｍの吸光度からＮＡＤＨの生成量を計算して酸化酵素活性を求めた。
【００９１】
（結果）
化合物 ／ 濃度（ｍＭ） ／ 還元酵素活性（Ｕ／ｍＬ）の順に、１−ヘプタノール／ １０ ／ ７、１−オクタノール／ ５ ／ ４、２−プロパノール／ １０ ／ １２、（Ｒ）−２−ブタノール／ １０ ／ ３３、（Ｒ）−２−ペンタノール／ １０ ／ ８０、（Ｒ，Ｓ）−２−ペンタノール／ １０ ／ ３８、（Ｒ）−２−ヘキサノール／ １０ ／ ２７０、（Ｒ，Ｓ）−２−ヘキサノール／ １０ ／ １７９、（Ｓ）−（＋）−２−ヘプタノール／ １０ ／ ２０、（Ｒ）−（−）−２−ヘプタノール／ １０ ／ ４１５、（Ｒ，Ｓ）−２−へプタノール／ １０ ／ ２７７、３−ヘプタノール／ １０ ／ １１、（Ｓ）−（＋）−２−オクタノール／ ５ ／ ４、（Ｒ）−（−）−２−オクタノール／ ５ ／ １８１、シクロペンタノール／ １０ ／ ２、（Ｒ）−（＋）−１−フェニルエタノール／ １０ ／ １０、２−フェニルエタノール／ １０ ／ ２、シンナミル アルコール／ １０ ／ ６
【００９２】
実施例６ （本還元酵素遺伝子及び補酵素再生酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製：プラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲＳｂＧの構築）
（６−１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備
フラスコにＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）１００ｍｌを入れ、滅菌した。このようにして調製された培地に、Bacillus megaterium IFO12108株が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養した。
培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得た。
このようにして得られた洗浄菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属するマニュアルに記載される方法に従って染色体ＤＮＡを精製した。
【００９３】
（６−２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381-6385(1989)に記載された公知のBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを合成する。
配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（６−１）で精製された染色体ＤＮＡを鋳型にして実施例２（２−２）に記載させる反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、２種類の制限酵素（ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ）を加えることにより、当該ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を２重消化させる。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製する。
一方、実施例２で調製されるプラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲに２種類の制限酵素（ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させる。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
このようにして精製して得られる２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションする。得られるライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換する。
得られる形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子及び本補酵素再生遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲＳｂＧと記すこともある。）を取り出す。
また、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を鋳型として、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られるＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析する。
【００９４】
実施例７ （本還元酵素遺伝子及び補酵素再生酵素遺伝子を含有する形質転換体の調製）
実施例６で調製されるプラスミドｐＴｒｃＴＦＡＲＳｂＧを用いてE．coli HB101を形質転換する。得られる形質転換体を０．４ｍＭのＩＰＴＧ、０．０１％（Ｗ／Ｖ）のＺｎＣｌ２及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×３本）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
【００９５】
実施例８（（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールの製造方法（その１））
５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）２０ｍｌに、実施例７で調製される洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤ+１２ｍｇ及びグルコース２．５ｇを加える。この混合物に、さらに２４０ｍｇの２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で７．０に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液に酢酸エチル２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層に再度酢酸エチル２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を合一濃縮した後、これをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、クロロホルムを留去することにより、（Ｓ）−２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを得る。
【００９６】
実施例９ （本還元酵素を産生する微生物の取得方法）
（１）洗浄菌体の調製
市販の微生物又は土壌などから単離した微生物を滅菌ＬＢ培地（１０ｍｌ）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
（２）スクリーニング
１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）２０ｍｌに、上記（１１−１）で調製された洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤＰ+１２ｍｇ、ＮＡＤ+１２ｍｇ及びグルコース２．５ｇを加える。この混合物に、さらに一般式(1)で示される２，２，２−トリフルオロアセトフェノン２４０ｍｇを加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で６．５に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液に酢酸エチル２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層に再度酢酸エチル２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を合一濃縮した後、これをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、クロロホルムを留去することにより残渣を得る。得られる残渣に、２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールが含まれていることをガスクロマトグラフィーにて定性及び／定量分析により確認する。
【発明の効果】
本発明によれば、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造するために優れた触媒能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、該タンパク質、及びこれを利用したアルコールの製造方法等が提供される。
【００９７】
「配列表フリーテキスト」
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００９８】
【配列表】
Claims (20)
- 下記のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする遺伝子。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列 - 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなることを特徴とする遺伝子。
- 請求項１又は２記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター。
- 請求項２記載の遺伝子又は請求項３記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
- 請求項１記載の遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体。
- 請求項３記載の組換ベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
- 下記のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列であって、かつ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを還元して２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列 - ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、請求項９記載のタンパク質、それを産生する微生物、請求項４〜７記載の形質転換体又はそれらの処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法。
- 請求項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を含むことを特徴とする組換ベクター。
- 請求項１１記載の組換ベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項１２記載の形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１３記載の形質転換体。
- 請求項１記載の遺伝子及び酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有する遺伝子を保有することを特徴とする形質転換体。
- 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素を反応系内に共存させること特徴とする請求項１０記載のアルコールの製造方法。
- ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、請求項１２〜１５の何れか一項に記載の形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法。
- ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造するための触媒としての、ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物の使用。
- ライフソニア（Leifsonia）属に属する微生物がライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749（国際寄託当局の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）であることを特徴とする請求項１８記載の使用。
- ライフソニア エスピー（Leifsonia sp.）S-749（国際寄託当局の受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）。
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