JP4268857B2

JP4268857B2 - 微生物によるｄ−グルコサミンの製造法

Info

Publication number: JP4268857B2
Application number: JP2003380975A
Authority: JP
Inventors: 哲也森; 雄一北; 将憲山口; 明宏友田; 保行手塚; 篤高橋
Original assignee: Hokko Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Hokko Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2003-11-11
Filing date: 2003-11-11
Publication date: 2009-05-27
Anticipated expiration: 2023-11-11
Also published as: JP2005143304A

Description

本発明は、Ｄ−グルコサミンの生産能を有する新規微生物および該微生物を用いるＤ−グルコサミンの製造方法に関する。Ｄ−グルコサミンは、医薬品、健康食品、食品等の分野で有用である。

Ｄ−グルコサミンは食品の中にごく少量含まれている栄養素で、体内でも軟骨細胞から作り出されるアミノ糖である。Ｄ−グルコサミンは、新しい軟骨の生成を促進し、変形関節症の進行を食い止め、場合によって治癒に向かう効果があるといわれている。

現在のＤ−グルコサミン製造方法の概要は次のとおりである。カニやエビなどの甲殻類の甲羅や殻を希酸で脱灰し、アルカリで除タンパク質後、キチンを得る。このキチンを濃塩酸もしくは濃フッ化水素酸、又は濃アルカリで加水分解し、脱色、ろ過、濃縮、洗浄、乾燥する（例えば、特許文献１、非特許文献１、２参照）。

また、その他の製造方法として、大腸菌又は酵母等の遺伝子組換え微生物を用いてＤ−グルコサミンを醗酵生産する方法がある（例えば、特許文献２、３、４参照）。
特開２００３−１８３２９６号公報特表２００２−５２００６７号公報国際公開第００／０４１８２号パンフレット国際公開第９８／３０７１３号パンフレット「オーガニックシンセセス(ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｅｓ)」、１９４６年、２６巻、ｐ.３６−３７「ジャーナルオブザケミカルソサイエティー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｅＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ）」、１９５８年、ｐ.２２１８‐２２２７

以上のようなカニやエビの甲羅や殻を分解してＤ−グルコサミンを作る方法では、高濃度の酸及びアルカリ溶液を使用するため多量の廃液が出る。また、甲羅や殻の重量の１０％程度のＤ−グルコサミンしか生産できないという問題点がある。また、原料は水産物であるため、漁獲量によって供給量が変動する。

遺伝子組換え微生物を用いる製造方法は、細菌（大腸菌）と酵母を用いるものであるが、遺伝子組換え微生物を用いた場合は、安全な食品の供給という点では問題がある可能性がある。

したがって、本発明の目的は、菌体外にＤ−グルコサミンを生産する能力を有する新規微生物、及びＤ−グルコサミン生産能を有する微生物を用いるＤ−グルコサミンの安定かつ安価で安全な製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者らにより土壌から分離された糸状菌がＤ−グルコサミンを生産することを初めて見出した。またこの糸状菌を用いて液体培養することにより、Ｄ−グルコサミンを培地中に高生産させ、かつ効率よく分離することに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のとおりである。
（１）Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌を培地で培養し、培地中にＤ−グルコサミンを生産・蓄積させ、これを採取することを特徴とするＤ−グルコサミンの製造方法。（２）Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌が不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する微生物であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌が分生子果不完全菌綱（Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（４）Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌がアスコキータ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属に属する微生物であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（５）Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌がアスコキータ・エスピー．（Ａｓｃｏｃｈｙｔａｓｐ．）ＡＢ５１８５株であることを特徴とする（４）に記載の方法。
（６）Ｄ−グルコサミンの生産能を有するアスコキータ・エスピー．（Ａｓｃｏｃｈｙｔａｓｐ．）ＦＥＲＭＰ−１９５７９株。

本発明のＤ−グルコサミンの製造法は、安定したＤ−グルコサミンの生産・供給を実現するものであり、Ｄ−グルコサミンを効率よく、安全で安価に製造することが可能となる。また、本発明の微生物は、上記Ｄ−グルコサミンの製造法に、好適に使用することができる。

次に、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤ−グルコサミンの製造法は、Ｄ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌を培地で培養し、培地中にＤ−グルコサミンを生産・蓄積させ、これを採取することを含む。

本発明の方法で用いられるＤ−グルコサミンの生産能を有する糸状菌としては、Ｄ−グルコサミンまたはその塩を産生する能力を有する微生物であればいかなる微生物でもよい。このような微生物として、例えば、Ｄ−グルコサミンの生産能を有し、かつ、不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する微生物が挙げられる。より具体的には、Ｄ−グルコサミンの生産能を有し、かつ、分生子果不完全菌綱（Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物が挙げられる。さらに具体的には、Ｄ−グルコサミンの生産能を有し、かつ、アスコキータ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属に属する微生物が挙げられる。

Ｄ−グルコサミンの生産能を有する微生物は、微生物を好適な培地、好ましくは液体培地で培養し、培養液中に蓄積されたＤ−グルコサミンの有無によって、検索することができる。培地中のＤ−グルコサミンの検出は、例えば、標準品のＤ−グルコサミンを用いたＨＰＬＣにより、行うことができる。

本発明に用いる微生物の具体的な例としては、本発明者らが神奈川県厚木市の土壌試料からＤ−グルコサミン生産能を有する微生物として新たに分離したＡＢ５１８５菌株がある。この菌株は、不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｍｙｃｏｔｉｎａ）、分生子果不完全菌綱（Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アスコキータ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）に属する糸状菌であり、本発明の方法に最も好適に用いられるＤ−グルコサミン生産菌の一例である。同菌株は、好適な条件で培養すると、Ｄ−グルコサミンを菌体外に生産する。
このＡＢ５１８５株の菌学的性質を以下に記載する。

（１）培養的・形態的性質
（ｉ）ＡＢ５１８５株をコーンミール寒天培地において２５℃で培養したとき、集落の直径は７日目で３４〜３６ｍｍに達する。集落は綿毛状を呈し、比較的薄い基底菌糸層を
有する。集落表面は淡灰緑色〜淡黒緑色を呈する。集落裏面は淡灰緑色〜淡黒緑色を呈する。

（ii）ポテト・デキストロース寒天培地上を用いて、２５℃で培養したとき、集落の直径は７日目で３６〜３８ｍｍに達する。集落はビロード状〜羊毛状を呈する。集落表面は中心部がやや茶色味のある灰白色を呈し、周囲は淡白色〜淡黄白色を呈する。裏面は中心部が黒緑色〜黒褐色を呈し、周囲は淡白色〜淡黄白色を呈する。

（iii）麦芽エキス寒天培地を用いて、２５℃で培養したとき、集落の直径は７日目で５２〜５４ｍｍに達する。集落はビロード状〜羊毛状を呈する。集落表面は中心部が淡灰緑色〜淡黒緑色を呈し、周囲は淡白色〜淡黄白色を呈する。裏面は中心部が黒緑色〜黒褐色を呈し、周囲は淡白色〜淡黄白色を呈する。

（iv）Ｖ−８ジュース寒天培地を用いて、２５℃で培養したとき、集落の直径は７日目で４４〜４６ｍｍに達する。集落はビロード状〜羊毛状を呈する。集落表面は淡灰白色〜淡灰緑色を呈する。集落裏面は淡黄褐色〜やや灰色味のある淡黄褐色を呈する。

ＡＢ５１８５株を、上記したポテト・デキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地又はＶ−８ジュース寒天培地上において、２５℃、暗黒下で培養すると、培養７日目〜１０日目頃から暗褐色〜暗黒色の分生子殻（ｐｙｃｎｉｄｉｕｍ）の形成がわずかに観察された。そこで、上記寒天培地上で２５℃、暗黒下で１０日間培養後、さらに２５℃、ブラック・ライト・ブルー蛍光灯（２０Ｗ）連続照明下で培養した結果、培養２０〜３０日後に上記寒天培地上で暗褐色〜暗黒色の分生子殻の形成が多数観察された。しかしながら、テレオモルフ（完全世代の特徴）の形成は認められなかった。

コーンミール寒天培地上における分生子殻は、暗褐色〜暗黒色を呈し、寒天培地中に埋生するか、または培地上に表在し、単生するかあるいはまれに集合して生じる。分生子殻は、球形〜亜球形で網目状の表面を呈し、直径は６０〜１２０μｍで、中央に孔口を有する。分生子は２細胞、無色、平滑の円筒形で、大きさが１０．０〜１５．０×２．０〜２．５μｍである。
Ｖ−８ジュース寒天培地上におけるＡＢ５１８５株の分生子殻は、コーンミール寒天培地上で形成される分生子殻と同様である。しかしながら、分生子殻で形成された分生子はコーンミール寒天培地上形成された分生子よりもやや大きく、２細胞、無色、平滑の円筒形で、大きさが１５．０〜２０．０×２．０〜２．５μｍである。

（２）生理学的性質
（ｉ）生育温度
麦芽エキス寒天培地を用いて、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃および４０℃の各温度で培養した結果、ＡＢ５１８５株は１０℃〜３０℃まで何れの温度でも生育し、５℃ではわずかな生育が認められた。３７℃および４０℃では生育しない。最適生育温度は２０〜２５℃付近と思われる。

（ii）生育ｐＨ
ｐＨを３、４、５、６、７、８、９および１０に調製した麦芽エキス液体培地を用いて、２５℃で培養した結果、ＡＢ５１８５株はｐＨ４〜１０まで生育し、ｐＨ３ではわずかな生育が認められた。最適生育ｐＨは、６〜８と思われる。

以上の菌学的性質から、ＡＢ５１８５株は、不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｍｙｃｏｔｉｎａ）、分生子果不完全菌綱（Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）に帰属すると認められ、本菌株の分類学上の位置をブライアン・シー・サットン著、「ザ・シーロマイセテス」、英国
コモンウエルス・マイコロジカル・インスティテュート刊行（１９８０年）（Ｂｒｉａｎ
Ｃ．Ｓｕｔｔｏｎ．（ＴｈｅＣｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ），ＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８０））に従って検索した。その結果、本菌株の特徴はアスコキータ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ属）の形態学的特徴によく合致した。したがって、本発明者らは、本菌株をアスコキータ属に属する微生物と同定した。しかしながら、アスコキータ属に属する菌株であってＤ−グルコサミンを菌体外に生産するものについては、これまで報告されたことがない。したがって、本発明者らはこれを新菌株とし、アスコキータ・エスピー．（Ａｓｃｏｃｈｙｔａｓｐ．）ＡＢ５１８５と命名した。なお、ＡＢ５１８５株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、平成１５年１１月６日に、ＦＥＲＭＰ−１９５７９号として受託されている。

アスコキータ・エスピー．ＡＢ５１８５株は、例えば、ポテト・デキストロース寒天培地のスラント上での保存、又は凍結乾燥保存により、安定に保存することができる。

以上、Ｄ−グルコサミン生産菌の一例であるＡＢ５１８５株について説明したが、一般的には糸状菌類はその菌学的性状が極めて変化しやすく、一定したものではない。菌類は、自然的あるいは通常行われている紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなど）を用いた人為的変異手段により変異することは周知の事実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も含め、糸状菌に属し、Ｄ−グルコサミンを生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。

アスコキータ属に属する糸状菌としては、アスコキータ・アエジロピス（A. aegilopis）、アスコキータ・アベナエ（A. avenae）、アスコキータ・ブラキポディ（A. brachypodii）、アスコキータ・ホルデイ（A. hordei）、アスコキータ・レプトスポラ（A. leptospora）、アスコキータ・スバルピナ（A. subalpina）等が挙げられる。

本発明の方法を実施するに当っては、糸状菌に属するＤ−グルコサミン生産菌を、用いる微生物に好適な培地、例えば、通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。本生産菌の培養には、微生物の培養に用いられる通常の培養方法が適用される。栄養源としては、使用される微生物が資化しうる炭素源、窒素源および無機塩などを程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。

用いる培地に含有される微生物が資化しうる炭素源としては、グルコース、シュークロース、ガラクトース、デキストリン、グリセロール、澱粉、水飴、糖蜜、動・植物油等を利用できる。また、窒素源としては、魚粉、大豆粉、小麦胚芽、コーンステイープリカー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素などを使用できる。そのほか必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することは有効である。また、使用するＤ−グルコサミン生産菌の発育を助け、Ｄ−グルコサミンの生産を促進するような無機物質および（または）有機物質を適当に添加できる。

アスコキータ・エスピー．ＡＢ５１８５株の生育に好適な培地としては、ポテト・デキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地、及びＶ−８ジュース寒天培地が挙げられる。また、Ｄ−グルコサミンの生産に好適な培地としては、実施例に示した培地の他、ＳＭＳＡ（改変）培地、peptone CZAPEK'S（改変）培地等が挙げられる。

Ｄ−グルコサミン生産菌の培養方法には、好気的条件下での培養法、特に通気下の深部液体培養法が最も適している。培養に適当な温度は、１０〜３０℃であるが、多くの場合１５〜３０℃で培養するのがよい。Ｄ−グルコサミンの生産は、用いた培地の種類や培養条件によって異なるが、振とう培養、タンク培養とも３〜１０日間の培養でその蓄積量が最高に達する。

培養物中に生産されたＤ−グルコサミンの蓄積量が最高に達した時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じてＤ−グルコサミンの単離を行うのがよい。具体的には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離等により、Ｄ−グルコサミンを培地から単離することができる。

Ｄ−グルコサミンを効率よく生産させる培養条件は、前記培地成分の組成、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、種母の培養時間、種母の接種量等を、使用する生産菌株の種類および外部条件等に応じて、適宜に調節あるいは選択して設定する。液体培養において発泡がある場合は、シリコーン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を単独または混合して適宜に培地に配合する。

本発明を実施例により更に具体的に説明する。

＜実施例１＞
グルコース（別滅菌）４.０％、硫酸アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、硫酸マグネシウム０．０１％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二カリウム０．１８％、ｐＨ無調整の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、アスコキータ・エスピー．ＡＢ５１８５株をスラントから一白金耳接種し、７日間、２７℃で、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養上清を以下に示す条件でＨＰＬＣで分析し、標準品のＤ−グルコサミンと比較した結果、Ｄ−グルコサミンを培地上清に含むことが確認された。上記培養により、０．５ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコサミンを含む培養液が得られた。

〔ＨＰＬＣ条件〕
カラム；Ｗａｋｏｓｉｌ５ＮＨ₂カラム（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
移動相；アセトニトリル：水＝８０：２０
流速；２ｍｌ／分
カラム温度；２０℃
検出；ＲＩ

以上のように、アスコキータ・エスピー．ＡＢ５１８５は、Ｄ−グルコサミンを菌体外に生産することが示された。

＜実施例２＞
グルコース３.０％、フルクトース１.０％、硫酸アンモニウム０．１％、酵母エキス０．４％、硫酸マグネシウム０．０１％、リン酸二水素カリウム０．０２％、リン酸水素二カリウム０．１８％、ｐＨ８．０の培地２.０Ｌを４Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、滅菌後、あらかじめ前培養したアスコキータ・エスピー．ＡＢ５１８５株を接種し、培養温度２７℃、攪拌回転数４５０ｒｐｍ、通気量２Ｌ/分で７日間培養を行った。

培養上清中のＤ−グルコサミンをＨＰＬＣで測定した結果、Ｄ−グルコサミン濃度は１．５ｍｇ／ｍｌであった。その培養液２．０Ｌの遠心上清を、活性炭２００ｍｌを充填したカラムに通過させた。その通過液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（ローム・ア
ンド・ハース社製、登録商標）Ｃ−２０（Ｈ⁺型）２００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後、このカラムに５００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄し、０．３Ｎ塩酸溶液２．０Ｌで溶出した。

溶出液を減圧下濃縮乾固し、これを蒸留水に溶解し、再び減圧下で濃縮乾固して塩酸を除去し、１．７ｇの固形物を得た。これを蒸留水に溶解した水溶液にエタノールを任意に添加し、結晶化操作を行なったところ、ほぼ純粋のＤ−グルコサミン塩酸塩が結晶様粉末として１．４ｇ得られた。このようにして得られた結晶様粉末のＮＭＲ分析を行なったところ、その¹Ｈ-ＮＭＲケミカルシフト値及び¹³Ｃ-ＮＭＲケミカルシフト値が、Ｄ−グルコサミンの文献値と一致した。

Claims

Ｄ−グルコサミンの生産能を有するアスコキータ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属に属する糸状菌を培地で培養し、培地中にＤ−グルコサミンを生産・蓄積させ、これを採取することを特徴とするＤ−グルコサミンの製造方法。
前記Ｄ−グルコサミンの生産能を有するアスコキータ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）属に属する糸状菌が、アスコキータ・エスピー．（Ａｓｃｏｃｈｙｔａｓｐ．）ＦＥＲＭＰ−１９５７９株であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
Ｄ−グルコサミンの生産能を有するアスコキータ・エスピー．（Ａｓｃｏｃｈｙｔａｓｐ．）ＦＥＲＭＰ−１９５７９株。